Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Бактериофаг АР22, лизирующий клинические штаммы Acinetobacter baumannii: выделение и изучение молекулярно-биологических свойств

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Бактериофаг АР22, лизирующий клинические штаммы Acinetobacter baumannii: выделение и изучение молекулярно-биологических свойств"

На правах рукописи

Попова Анастасия Владимировна

БАКТЕРИОФАГ АР22, ЛИЗИРУЮЩИЙ КЛИНИЧЕСКИЕ ШТАММЫ АЫШТОВАСТЕК ВАиМЛ1ШГ. ВЫДЕЛЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

03.02.03 микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 3 ДЕК 2012

Оболенск- 2012

005057370

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Официальные оппоненты:

Павлов Виталий Михайлович, доктор биологических наук, Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии», заведующий лабораторией микробиологии туляремии

Сыкилинда Нина Николаевна - кандидат биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова» Российской академии наук, старший научный сотрудник лаборатории молекулярной биоинженерии

Ведущая организация:

Федеральное бюджетное учреждение науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защипы прав потребителей и благополучия человека

Защита состоится «21» декабря 2012 годав 11 ч на заседании диссертационного совета Д 350.002.01 при Федеральном бюджетном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» по адресу: 142279, Московская обл., Серпуховский район, п. Оболенск

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии»

Автореферат разослан ноября 2012 г.

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Воложанцев Николай Валентинович

Ученый секретарь диссертационного совета

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Проблема нозокомиальных инфекций (НИ) является одной из важнейших для современного здравоохранения и с каждым годом приобретает всё большую медицинскую и социальную значимость. Во многих странах наблюдается рост инфекционной заболеваемости в стационарах лечебных учреждений, что существенным образом связано с распространением штаммов микроорганизмов, устойчивых к различным антибактериальным препаратам.

Одним из возбудителей НИ является представитель группы неферменти-рующих грамотрицательных аэробных бактерий - Acinetobacter baumannii, играющий важную роль в инфекционной патологии у пациентов, находящихся на стационарном лечении. В отделениях реанимации и интенсивной терапии (ОРИТ), а также в ожоговых отделениях A. baumannii часто становится причиной развития госпитальных пневмоний, раневых инфекций (в том числе у больных с термическими поражениями), менингитов (при нейрохирургических вмешательствах и травмах спинного мозга), эндокардитов, перитонитов, абсцессов мозга и лёгких, урологических катетерных инфекций, постхирургических осложнений, бактериемии и септицемий (Metan et al., 2007; Rizos et al., 2007; Peleg et al. ,2008; Towner, 2009).

Клиническая значимость A. baumannii существенно выросла за последние 20 лет. В первую очередь это связано с тем, что для данного микроорганизма характерны механизмы резистентности, обеспечивающие устойчивость к подавляющему большинству антимикробных препаратов (Van Looveren et al., 2004; Peleg et al., 2008; Zavascki et al., 2010). Другими клинически значимыми особенностями A. baumannii являются: устойчивость к дезинфицирующим средствам, высушиванию, ультрафиолетовому облучению, толерантность к детергентам (Wendt et al., 1997; Webster et al., 1998; Towner, 2009). Высокая выживаемость на объектах внешней среды и способность персистировать в течение продолжительного периодав условиях больничного окружения увеличивает риск передачи этого микроба через медицинский персонал или предметы обихода (Catalano et al, 1999; de Oliveira & Damasceno, 2010).

На основании вышесказанного весьма актуальным является своевременное выявление A. baumannii, быстрая идентификация данного микроорганизма и, что особенно важно, поиск новых антибактериальных средств против инфекций, вызванных A. baumannii. Одним из возможных путей решения последней проблемы может быть применение литических фагов. К настоящему времени накоплено множество данных об эффективном использовании бактериофагов для лечения бактериальных инфекций, в том числе госпитальных, вызванных, например, P. aeruginosa или S. aureus (Merabishvffi et al., 2009; Kutter et al., 2010). Однако ни в нашей стране, ни за рубежом нет препаратов бактериофагов для контроля внутрибольничных А. ЬаитаппИ-инфекцт.

Это связано, в первую очередь, с отсутствием коллекций перспективных фагов, которые могли бы быть использованы для разработки лечебных препа-

ратов, а также с узким спектром антибактериальной активности известных ли-тических фагов, инфицирующих А. Ьаитаппи.

Цель исследования - выделение, молекулярно-генетическая характеристика и изучение биологических свойств вирулентного бактериофага, специфически инфицирующего и лизирующего широкий спектр клинических штаммов А. Ьаитаппи.

Задачи исследования:

1. Создание коллекции и молекулярно-генетическая характеристика клинических штаммов А. Ьаитаппи.

2. Поиск бактериофагов, лизирующих бактерии рода Ас1пе1оЬас1ег, в образцах клинического материала и пробах из окружающей среды.

3. Определение таксономического положения и изучение биологических свойств бактериофага, обладающего широким спектром литического действия по отношению к клиническим штаммам А. Ьаитаппи.

4. Визуализация специфического взаимодействия бактериофага с бактериальной клеткой и характеристика различных стадий инфекционного процесса с помощью атомно-силовой микроскопии.

5. Изучение генома бактериофага с широким спектром литического действия.

Научная новизна.

Впервые выделен литический бактериофаг АР22 семейства Муоутс1ае, инфицирующий широкий круг клинических штаммов А. Ьаитаппи (приоритет защищен патентом РФ № 2439151). Бактериофаг обладает выраженной видо-специфичностью, высокой скоростью адсорбции при взаимодействии с бактериальной клеткой и высокой урожайностью.

Впервые для бактериофагов, лизирующих А. Ьаитаппи, проведена визуализация специфического взаимодействия в системе «литический бактериофаг -бактериальная клетка» и изучены различные стадии инфекционного процесса методом атомно-силовой микроскопии.

Впервые определена полная нуклеотидная последовательность ДНК и получены данные о структуре генома бактериофага семейства МуоуИс?ае, лизирующего бактерии А. Ьаитаппи.

Практическая ценность работы.

Создана коллекция, включающая 130 идентифицированных и генетически типированных антибиотикоустойчивых штаммов А. Ьаитаппи, выделенных от больных крупных стационаров Европейской части России и Южного Урала в 2005-2010 гг.

Депонированы в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур («ГКПМ-Оболенск») ФБУН ГНЦ ПМБ под номерами В-7125 - В-7134 десять штаммов А. Ьаитаппи - представителей разных генетических групп (Федеральный уровень внедрения).

Депонирован в «ГКПМ-Оболенск» под номером РЬ42 охраноспособный бактериофаг АР22 (Федеральный уровень внедрения). Результаты изучения ли-тических свойств и геномного анализа бактериофага АР22 позволяют рекомендовать его для раз работки лечебных препарата в против А. Ьаитаппи-инфскцчй,

а также использовать для идентификации А. Ьаитаппи при бактериологическом анализе клинического материала.

Размещена в Европейской базе данных ЕМВЬ под номером НЕ806280 и базе данных СепВапк под номером МС_017984 полная нуклеотидная последовательность ДНК бактериофага АР22 (международный уровень внедрения).

Результаты диссертационной работы использованы в лаборатории молекулярной биоинженерии ФГБУН «Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова» РАН для клонирования, экспрессии и изучения пространственной структуры белка фибрилл и белка выростов хвостового отростка фага.

Положения, выносимые на защиту

1. На протяжении нескольких лет (с 2005 по 2010 гг.) в стационарах крупных городов России (Москва, Санкт-Петербург, Нижний Новгород, Челябинск) циркулируют две доминирующие генетически однородные группы бактерий А. Ьаитаппи, объединяющие 82 % клинических штаммов.

2. Бактериофаг АР22 принадлежит к семейству Муоу'тйае, является видо-специфическим, обладает широким спектром литической активности по отношению к клиническим штаммам А. Ьаитаппи, высокой скоростью адсорбции при взаимодействии с бактериальной клеткой и высокой урожайностью.

3. Геном бактериофага АР22 представлен двунитевой ДНК размером 46387 п.н., содержит89 потенциальных генов, среди которых идентифицированы гены, кодирующие структурные протеины, ферменты, ответственные за лизис бактериальной клетки-хозяина и компоненты системы репликации ДНК.

4. Атомно-силовая микроскопия является эффективным методом визуализации специфического взаимодействия литического фага АР22 с бактериальной клеткой, а также изучения особенностей структуры данного бактериофага, бактериальных клеток А. Ьаитаппи и формируемых ими клеточных агрегатов.

Работа выполнена в лаборатории молекулярной диагностики и генно-инженерных препаратов отдела молекулярной микробиологии ФБУН ГНЦ ПМБ в рамках отраслевой научно-исследовательской программы «Научные исследования и разработки с целью обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия и снижения инфекционной заболеваемости в Российской Федерации» (на 2011-2015 гг.); Гос. регистрационный № 01201172662 (тема № 045 «Разработкам исследование новых дезинфектантов, антимикробных и инсектицидных препаратов»).

Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена лично автором; результаты, описанные в отдельных главах получены в сотрудничестве с к.б.н. Воложанцевым Н. В., к.б.н. Жиленковым Е. Л., Мякининой В. П., к.б.н. Красильниковой В. М., к.б.н. Богуном А. Г., к.ф-м.н. Дубровиным Е. В., к.б.н. Платоновым М. Е., д.б.н. Игнатовым С. Г. и д.в.н. проф. Светочем Э. А.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены, доложены и обсуждены на восьми российских и международных конференциях: школе-конференции молодых учёных и специалистов научно-исследовательских организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека «Биобезопасность в современ-

ном мире», Оболенск, 2009 г. (III место на конкурсе устных докладов); the 12th SAC Seminar «Combating Global Infections», Иркутск, 2009 г.; XII Международном конгрессе МАКМАХ по антимикробной терапии, Москва, 2010 г. (I место на конкурсе постерных докладов); «Microbial Viruses: Genomics, Evolution and Applications in Ecology, Biotechnology and Medicine», Белфаст, Великобритания, 2011 г. (I место на конкурсе постерных докладов); E-MRS 2011 Spring Meeting, Ницца, Франция, 2011 г.; 19th Biennial Evergreen International Phage Biology Meeting, Олимпия, США, 2011 г. (II место на конкурсе постерных докладов); II Международном Конгрессе по внутрибольничным инфекциям, Москва, 2011 г.; the ЕМВО conférence «Viruses of Microbes», Брюссель, Бельгия, 2012 г.

План и аннотация диссертации обсуждены и одобрены на заседании Ученого совета ГНЦ ПМБ от 29 января 2009 г. (протокол № 1) с изменениями, утверждёнными на заседании Ученого совета ГНЦ ПМБ от 1 ноября 2012 г. (протокол № 9). Результаты исследований доложены на заседании межлабораторного семинара ГНЦ ПМБ (протокол № 25 от 26 октября 2012 г.).

Публикации. Основное содержание работы отражено в 12 научных публикациях, в том числе в 3 статьях в рецензируемых журналах из перечня ВАК и в одном патенте РФ.

Объём п структура диссертации. Диссертация изложена на 159 страницах машинописного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, две главы результатов исследований, обсуждение результатов, выводы и указатель литературы, включающий 26 работ отечественных и 260 - зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 20 рисунками и 8 таблицами.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

В работе использовали 130 штаммов A. baumannii, выделенных из клинического материала от госпитализированных больных (раневое отделяемое, тканевые биоптаты, мокрота, бронхоальвеолярный лаваж, плевральная жидкость, моча, желчь, кровь, содержимое дренажей, внутривенных катетеров) в стационарах различного профиля городов Челябинска (п = 89), Нижнего Новгорода (п = 20), Москвы (п = 12), Санкт-Петербурга (п = 9) в 2005-2010 гг., а также бактерии других геномовидов Acinetobacter: A. pittii (п = 2), A. genomospecies 10 (п = 2), A. johnsonii (n = 1), A. shindïeri (n = 1), A. Iwoffii (п = 6), A. anitratus (n = 4), A. calcoaceticus (n = 2) и бактерии других родов и семейств: Pseudomonas aeruginosa (n = 5), Escherichia coli (n = 3), Yersinia pseudotuberculosis (n = 3), Yersinia enterocolitica (n = 3), Klebsiella pneumoniae (n = 3), Klebsiella oxytoca (n = 3), Enterobacter cloacae (n = 3), Pasteurella multocida (n = 3) и Salmonella En-teritidis (n = 3), полученные из коллекции НИИ антимикробной химиотерапии СГМА г. Смоленска и «ГКПМ-Оболенск» ФБУН ГНЦ ПМБ.

Бактериальные культуры выращивали на жидких или плотных питательных средах Luria-Bertani (LB) и Nutrient Agar (Himedia Laboratories Pvt. Limited, Индия) при температуре 37 °C в течение 18-24 ч. Чувствительность к антибактериальным препаратам определяли дискодиффузионным методом в

соответствии с МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам».

Идентификацию штаммов A. baumannii проводили методом оценки полиморфизма длин рестрикционных фрагментов продуктов амплификации гена 16S рРНК A. baumannii с использованием праймеров SP2-16S (5'-gat cat ggc tea gat tga acg c-3') и ASP2 -16S (5'-gct acc ttg tta cga ctt cac cc-3') и эндонуклеазы рестрикции Alul, а также методом ПЦР с праймерами на видо-специфические для A. baumannii последовательности 6/яОха-5гп0Д°6ных генов (Woodford et al, 2006).

Генетическое типирование штаммов A. baumannii проводили методом ПЦР с произвольными праймерами (RAPD): Wil2 (5'-tac egatge а-3') (Williams et al., 1993) и 1247 (5'-aag age ccg t-3') (Akopyanz et al, 1992). Кластерный анализ для построения дендрограммы выполняли с помощью программного обеспечения Bionumerics 5.1 (Applied MathNV, Бельгия)с использованием метода Ward и коэффициента Cosine.

Выделение бактериофагов, лизирующих бактерии рода Acinet ob acter, из образцов клинического материала и проб из окружающей среды, а также наработку, очистку и концентрирование фаголизата проводили, как описано ранее (Popova et al., 2012).

Для изучения биологических свойств бактериофагов и параметров фаговой инфекции использовали методы, предложенные М. Adams (1959), с нашими модификациями (Popova et al., 2012; Dubrovin et al., 2012).

Электронно-микроскопическое исследование нативных фаговых частиц проводили методом негативного контрастирования фаговых препаратов (Brenner, 1959).

Приготовление образцов для визуализации специфического взаимодействия фага с бактериальной клеткой и их анализ методом атомно-силовой микроскопии осуществляли, как описано в работе Е. Dubrovin et al. (2012).

Возможное наличие профага в геномной ДНК фагорезистентных клонов A. baumannii определяли с помощью мультиплексной ПЦР с двумя парами праймеров, специфичных к ДНК бактериофага АР22: AP22A-f (5'-agt teg ttc tgc tgt ttg g-3') и АР22А-Г (5'-tcc tea аса tac caa ate g-3'); AP22B-f (5'-gtg ttc att teg ttc tet ca-3') и АР22В-Г (5'-cga cat ttc tea аса tea gc-3'). В качестве контроля прохождения реакции ПЦР использовали праймеры SP2-16S и ASP2-16S на ген 16S рРНК A. baumannii.

Электрофоретическое разделение фаговых белков проводили в денатурирующих условиях в 12 % полиакриаламидном геле по стандартному протоколу (Laemmli, 1970). Молекулярную массу белков определяли по сканированному изображению электрофореграмм с помощью программы PhotoCaptMW.

ДНК бактериофагов выделяли методом депротеинизации очищенных в градиенте хлористого цезия фаговых частиц с использованием лизирующей смеси, содержащей 0,5 % SDS, 20 мМ ЭДТА и 50 мкг/мл протеиназы К. ДНК экстрагировали смесью фенол/хлороформ (1:1) и переосаждали этиловым спиртом с ацетатом натрия. Гидролиз ДНК бактериофагов эндонуклеазами рестрикции проводили согласно инструкции производителя (Fermentas, Литва).

Секвенирование ДНК проводили по методу Сэнгера на приборах ABI PRISM 310 (Applied BioSystem, США) и MegaBace (Amersham Biosciences, США) с программным обеспечением Cimarron 3.12.

Для фрагментации фаговой ДНК использовали эндонуклеазы рестрикции HindIII, Dral и Rsal и обработку ультразвуком. Клонирование фрагментов фаговой ДНК в векторную плазмиду pUC19, приготовление компетентных клеток Е. coli DH5a и их химическую трансформацию рекомбинантной ДНК проводили согласно руководству Т. Маниатис и др. (1984). Селекцию клонов с реком-бинантными плазмидами осуществляли посевом на среду MacConky, содержащую ампициллин (100 мкг/мл). Секвенирование клонированных фрагментов фаговой ДНК проводили с использованием праймеров М13 forward (-21): 5'-tgt ааа acg acg gcc agt-3' и M13 reverse (-26): 5'-cag gaa аса get atg ac-3'. Расчет праймеров для секвенирования с матрицы нативной ДНК фага и секвенирова-ния ампликонов проводили с использованием компьютерной программы Vector NTI™ (Carlsbad, США).

Сборку, редактирование и анализ нуклеотидной последовательности фага АР22, а также сравнение нуклеотидных последовательностей проводили с помощью пакета программ DNASTAR™ (Madison, США) и Vector NTI™ (Carlsbad, США).

Открытые рамки считывания (ОРС), кодирующие возможные протеины, предсказывали с помощью биоинформационных программ GeneMark.hmm (http://opal.biology.gatech.edu/GeneMark) (Lukashin & Borodovsky, 1998) и Soft-Berry FGENE SB (http'//linuxl.softberry.com/berry.phtmI) (Mount Kisco, США).

Функциональную аннотацию генома фага АР22 проводили с помощью сравнения транслированных ОРС с известными белковыми структурами, представленными в международных базах данных, с использованием биоинформационного ресурса BLASTP (Altschul et al., 2005) и программного обеспечения HHP red (Söding et al., 2005).

Количественные значения экспериментов были представлены после их обр а-ботки с помощью статистических программ Windows Excel.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Молекулярно-генетическая характеристика антибиотикорезистентных штаммов A. baumannii

Для реализации цели диссертационной работы первоочередной задачей являлось создание представительной коллекции клинических штаммов A. baumannii, выделенных в разное время на географически разных территориях, а также их генетическая идентификация и типирование.

В коллекцию были включены 130 штаммов, выделенных отбольныхОРИТ, ожогового, терапевтического и урологического отделений, отделений плановой и экстренной хирургии разнопрофильных стационаров Челябинска, Нижнего Новгорода, Москвы и Санкт-Петербурга в 2005-2010 гг. Основными источниками выделения штаммов являлись раневое отделяемое (45 %), мокрота (18 %), отделяемое дренажей (13 %), смывы с объектов госпитальной среды (5 %) и др.

Выделенные штаммы были идентифицированы как А. Ьаитаппи на основании исследования культурально-морфологических и биохимических признаков, проведённого в локальных лабораториях, и данных молекулярно-генетического анализа.

Все генетически идентифицированные штаммы А. Ьаитаппи характеризовались устойчивостью к антибиотикам разных функциональных классов: амоксициллин-клавуланату, ампициллин-сульбактаму, амикацину, цефтазиди-му, цефепиму, ципрофлоксацину, левофлоксацину, за исключением цефоперазон-сульбактама, имипенема и меропенема.

Генетическую внутривидовую вариабельность исследуемых штаммов А. Ьаитаппи изучали методом ПЦР с произвольными праймерами (11АРВ).

На основании кластерного анализа ЯАРО-профилей 130 штаммов А. Ьаитаппи была построена дендрограмма, отражающая степень генетического родства исследуемых штаммов (рис. 1).

Г?АР О -ггр о фх 1ль

I I I 9 « I <

А

£1 -С

А2 А2 АЗ А4 А5 Аб В1 В2

вз

В4

62

1

1

45

3

Ч М, СП

ч

Ч, НН. М, СП

ч

кн

СП

Ч НН. М, СП

1

Рисунок 1 - Дендрограмма кластеризации штаммов А. Ьаитаппи. Для каждого генотипа (КАРБ-группы) отмечены: ЯАРВ-профиль штамма-представителя; 1 -буквенное обозначение генотипа; 2 - общее количество штаммов, входящих в генотип; 3 - место выделения штаммов: Ч — Челябинск, НН — Нижний Новгород, М -Москва, СП - Санкт-Петербург

При анализе дендрограммы было выявлено, что изучаемые штаммы входят в состав двух кластеров, условно обозначенных А и В (при степени гомологии более 90 %), каждый из которых включает по одной из двух доминирующих ЯАРО-групп (А1 и В1), объединяющих в целом 82 % (107 из 130) клинических штаммов А. Ьаитаппи, циркулирующих на протяжении нескольких лет в условиях больничного окружения в стационарах разных городов РФ. Наличие уникальных штаммов — представителей минорных ЯАРО-групп, по-видимому, является следствием генетических процессов, приводящих к постоянному формированию новых вариантов, что проявляется в генетической неоднородности госпитальной популяции А. Ьаитаппи.

Изучение бактериофага АР22, лизирующего клинические штаммы

А. Ьаитаппи

С целью поиска бактериофагов, специфически инфицирующих бактерии poдaЛcгиeto6acíer, проведён анализ более 1500 образцов клинического материала и смывов с различных объектов внутрибольничной среды и около 200 проб из окружающей среды (образцы воды и почвы). Кроме того, с использованием митомицина С (5 мкг/мкл) была проведена индукция профагов из разных клинических штаммов А. Ьаитаппи.

В результате было выделено девять фагов, взаимодействующих с представителями рода АстеюЬас1ег, из которых только один бактериофаг, получивший авторское название АР22, обладал широким спектром антибактериального действия по отношению к госпитальным штаммам А. Ьаитаппи. Данный бактериофаг выделен из клинического материала, полученного в ожоговом центре Научно-исследовательского института скорой помощи им. Н.В. Склифосовско-го (г. Москва).

На культуре чувствительных бактериальных штаммов А. Ьаитаппи бактериофаг АР22 формирует круглые прозрачные негативные колонии с ровными краями диаметром около 2-3 мм, окружённые непрозрачными ореолами, которые увеличиваются в размере с течением времени (рис.2).

Рисунок 2 - Зоны лизиса бактериального «газона» штамма A. baumannii 1053, формируемые фагом АР22 на плотной питательной среде: Л Морфология негативных колоний фага с ореолами; Б. Пятно лизиса бактериофага, окружённое ореолом (наверху: через 18 ч инкубации при температуре 37 °С, внизу - через 30 ч последующего хранения при температуре 4 °С)

С помощью электронной микроскопии препаратов фаговых частиц показано, что бактериофаг АР22 имеет головку икосаэдрической формы с расстоянием между противоположными апикальными вершинами, равным 63-65 нм, и сокращающийся хвостовой отросток длиной 85-90 нм. Аппарат адсорбции АР22 представлен базальной пластинкой диаметром 22-23 нм, и хвостовыми фибриллами, каждая из которых имеет длину 42-43 нм. Фибриллы хорошо заметны у частиц с сокращёнными хвостовыми отростками (рис. 3).

Рисунок 3 - Электронные микрофотографии фага АР22: А. Очищенный в градиенте CsCl препарат бактериофага АР22; Б. Интактная фаговая частица; В. Фаговая частила с сокращённым хвостовым отростком; Г. Фаговые частицы на поверхности бактериальной клетки A. baumannii 1053. Контрастирование 1 % уранштадетатом. Масштаб: 50 нм

В соответствии с морфологическими параметрами согласно Международной классификации и таксономии вирусов бактериофаг АР22 отнесен к семейству Myoviridae, морфотипу А1.

В серии экспериментов по определению спектра антибактериального действия и специфичности фага установлено, что бактериофаг АР22 лизиру-ет в общей сложности 68 % (89 из 130) клинических штаммов A. baumannii и не обладает литической активностью по отношению к представителям других ге-номовидов Acinetobacter, а также бактериям других родов и семейств. При этом исследуемый бактериофаг обладает более выраженной литической активностью по отношению к представителям доминантных RAPD-групп A. baumannii А! и В1, распространённых в нескольких крупных стационарах России в течение длительного промежутка времени (2005-2010 гг.), лизируя 82 % (88 из 107) штаммов данных групп.

Необходимо отметить, что бактериофаг АР22 обладает наиболее широким спектром литического действия из всех ранее описанных фагов, инфицирующих Л. baumannii.

К критическим параметрам, влияющим на литическую активность и стабильность бактериофагов при хранении, относится ряд физико-химических факторов, в том числе значение рН, а также наличие хлороформа, обычно используемого в качестве инактивирующего бактерии агента. В экспериментах по определению влияния физико-химических факторов на стабильность и литическую активность бактериофага АР22 установлено, что титр бактериофага не меняется в течение суток в случае инкубирования при значениях рН от 4 до 9. В то же время, экстремальные значения рН (рН 2 и рН 12) существен-

но влияют на стабильность фага, а, следовательно, и на его способность инфицировать бактериальную клетку.

При изучении устойчивости фага АР22 к воздействию хлороформа продемонстрировано, что обработка хлороформом от 30 мин до 24 ч не оказывает влияния на активность фага. При этом воздействие хлороформа на индикаторные бактериальные культуры А. Ъаитаппп в течение 15-30 мин вызывает инактивацию исследуемых штаммов, что позволяет использовать его для удаления из фаголизата жизнеспособных бактерий.

Параметры инфекционного процесса фага АР22 изучены в экспериментах по определению времени адсорбции и одиночного цикла размножения бактериофага. Показано, что исследуемый бактериофаг адсорбируется на клетке-хозяине штамма А. Ьаитаппи 1053 очень быстро: более 99 % фаговых частиц адсорбируются в течение 5 мин (рис. 4 А) независимо от присутствия в среде двухвалентных катионов. Константа скорости адсорбции составляет 1,53><10"7 мл/мин.

Кривая одиночного цикла размножения (кривая репродукции) фага АР22 представлена на рис. 4 В. Длительность латентного периода (времени между инфицированием бактериальной клетки и выходом фагового потомства) для АР22 составляет 40 мин. Средний выход фаговых частиц (среднее число фагов в расчёте на одну инфицированную клетку) составляет около 240 частиц на одну бактериальную клетку, что свидетельствует о высокой урожайности фага АР22.

Время адсорбции (мин) Время фаговой инфекции (мин)

Рисунок 4 - Анализ инфекционного процесса бактериофага АР22: А Скорость адсорбции фага на клетках штамма A. baumannii 1053; В. Кривая одиночного цикла размножения фага на клетках штамма A. baumannii 1053: L — латентный период; BS -выход фаговых частиц

В процессе изучения динамики инфекционного процесса путем спек-трофотометрической детекции изменений, происходящих в ходе взаимодействия бактериофага АР22 с бактериальной клеткой, показано, что при значениях множественности инфицирования (MOI) 50 и 5 фаговых частиц на одну бактериальную клетку бактериофаг полностью лизирует жидкую культуру штам-

ма-хозяина через 60 мин после начала фаговой инфекции, в то время как при М01=0,5 лизис происходит через 2 ч (рис. 5)

1,75

1,25 ■

0,75 ■

0.25 •

0.00

...

л

baumannii -*-М<Я=50 -к- MOI=5 -«- М01=0,5

250

300

Рисунок 5

100 150 200

Время взаимодействия (мнв)

Кривые изменения оптической плотности для неинфипированной фагом бактериальной культуры A. baumannii 1053 и бактериальных клеток, инфицированных фагом при М01=50, 5 и 0,5

Для визуализации специфического взаимодействия фага АР22 и бактериальных клеток штамма-хозяина A. baumannii 1053 использовали метод атом-но-силовой микроскопии (АСМ), основанный на принципе механического сканирования образцов без применения предварительного напыления металлов и облучения фотонами и электронами.

При анализе АСМ-изображений контрольных образцов фаговых частиц, помещенных на поверхность слюды, установлено, что среднее значение диаметра головки бактериофага, оценивается как 62±1 нм, а длина хвостового отростка - 88±9 нм (рис. 6), что соответствует данным электронно-микроскопического исследования.

50 60 70 80 Height nm

Рисунок 6 - АСМ-анализ бактериофага АР22: А АСМ-изображение фага, нанесённого на слюду (режим прерывистого контакта, канал «высота»); В. Гистограмма распределения высот головок бактериофага, нанесённого на слюду

С помощью АСМ контрольных образцов бактериальных клеток A. baumannii 1053, выращенных в стационарных условиях при температуре

37 °С, установлено, что бактерии располагаются на поверхности слюды в виде агрегатов, состоящих из нескольких десятков клеток (типичные наблюдаемые агрегаты представлены на рис. 7 А, В).

Рисунок 7 - АСМ-анализ клеток A. baumannii: А АСМ-изображение нанесённых на слюду клеток A. baumannii, записанное по каналу «высота»; В. АСМ-изображение нанесённых на слюду клеток A. baumannii, записанное по каналу «отклонение», со вставкой, демонстрирующей увеличенный участок вокруг бактериальных агрегатов с экзополисахаридами и пилями; С. Профиль сечения вдоль линии с АСМ-изображения A; D. Увеличенный участок поверхности A. baumannii. Представленные АСМ-изображения получены при контактном режиме сканирования.

Наличие вокруг клеток относительно тонкого слоя предположительно внеклеточного матрикса (секретируемых экзополисахаридов) и густой сети окружающих клетки пилей (увеличенный фрагмент на рис. 7 В) дают основания предположить, что наблюдаемые агрегаты являются начальной стадией формирования биопленки или «протобиопленкой». В среднем, длина бактериальных клеток в составе агрегатов составляет 1-2 мкм, ширина - 0,75-1 мкм и высота -0,4-0,5 мкм.

В серии экспериментов по исследованию различных стадий литического цикла бактериофага АР22 и изучению морфологии бактериальных клеток A. baumannii, инкубированных с фагом АР22 при температуре 37 °С, установлено, что адсорбция фагов на поверхности бактериальных клеток A. baumannii наблюдается уже с первой минуты их совместной инкубации (рис. 8 А,В), что хорошо согласуется с данными эксперимента по определению времени адсорбции. Следует отметить, что с первых минут взаимодействия фага с бактериальными клетками происходит быстрое рассеивание протобиопленок. Это свидетельствует о том, что бактериофаг АР22 является эффективным дезагрегирующим фактором. Известно, что в большинстве случаев рассеивание биопленки опосредовано действием экзополисахарид-деградирующих ферментов, которые несут фаги (Sutherland etal., 2004). Очень быстрое рассеивание клеточных агре-

гатов А. Ьаитаппи при взаимодействии с бактериофагом АР22, наблюдаемое в наших экспериментах, также предполагает наличие фаговой экзополисахарид-деполимеразы, что подтверждается образованием ореолов вокруг негативных колоний бактериофага (см. рис. 2). Количество адсорбированных на бактериальную поверхность фагов существенно увеличивается в течение последующих 10 мин (рис. 8 С-Б). В отличие от фагов, помещенных на поверхности слюды, большинство бактериофагов, адсорбированных на поверхности бактерий, имеют пустую головку. Это указывает на то, что высвобождение ДНК происходит достаточно быстро или немедленно после фаговой адсорбции на клетке-хозяине.

/ ш Т _ -V ' - » > » ^ -<Г" & •

К ,()».

ГСЕ

ЕГЯ ® щ. у.. •

Рисунок 8 - АСМ-изображения клеток А. Ьаитаппи, инкубированных с фагом в

течение одной (А), трёх (С) и шести (Е) мин (контактный режим сканирования, канал «отклонение»); В, Э, Б - увеличенные трёхмерные изображения соответствующих бактериальных поверхностей

Взаимодействие фага АР22 с клетками А. Ьаитаппи в течение 15, 30 и 60 мин представлено на рис. 9. Через 15 мин после начала фаговой инфекции можно наблюдать высокую плотность адсорбированных на поверхности бактерий фаговых частиц, что указывает на наличие большого количества соответствующих рецепторов, и, начиная с 30 мин инкубации, существенные изменения формы клеток А. Ьаитаппи. Бактериальные клетки становятся неоднородными по своей длине, их высота варьирует от 70 до 200 нм (рис. 9 Б-1), что в 25 раз ниже, чем высота клеток, определённая на АСМ-изображениях контрольных клеточных образцов (рис. 7 А-С). Через 60 мин инкубации наблюдается разрушение бактериальных клеток, о чём можно судить по потере клетками

нормальной формы и по выходу из инфицированных клеток новых фаговых частиц (рис. 9 в-!).

Рисунок 9 - Записанные по каналу «отклонение» (А, Э) и «высота» (О) АСМ-изображения клеток А. Ьаитаппи, инкубированных с фагом в течение 15 мин (А), 30 мин (Б) и 60 мин (в) (контактный режим сканирования); В, Е, Н - профили сечения вдоль пунктирных линий с соответствующих АСМ-изображений; С .Б, I - увеличенные трёхмерные изображения соответствующих бактериальных поверхностей.

Таким образом, использование АСМ является эффективным подходом для визуализации инфекционного процесса и характеристики литического цикла бактериофага АР22.

Для того чтобы экспериментально продемонстрировать литическую природу фага проведен анализ фагорезистентных клонов А. Ьаитаппи. Частота образования устойчивых к данному фагу клонов, образующихся в зоне фаголи-зиса газона А. Ьаитаппи, составляет 10"6 на одну бактериальную клетку. Для того чтобы проверить, являются ли такие клоны фагорезистентными мутантами (например, адсорбционно-устойчивыми) или лизогенными вариантами со встроенным профагом, 50 очищенных трёхкратным пересевом фагоустойчивых клонов проверяли на способность подвергаться спонтанной или направленной индукции в присутствии различных концентраций митомицина С. Во всех случаях индукции бактериофагов не отмечено. Для более строгого доказательства отсутствия ДНК фага АР22 в составе суммарной ДНК фагорезистеных клонов была проведена мультиплексная ПЦР с двумя парами праймеров, специфичных к фаговой ДНК. В качестве контроля прохождения реакции использовали праймеры на ген 168 рРНК А. Ьаитаппи (рис. 10). В ходе проведенных экспе-

риментов фаговой ДНК в составе A. baumannii не выявлено.

1

Á

Рисунок 10 — Определение возможного наличия профага в геномной ДНК фаго-резистеитных клонов с помощью мультиплексной ПЦР: А. Устойчивые к бактериофагу АР22 клоны в зоне фаголизиса A. baumannii 1053; В. Электрофореграмма продуктов ПЦР с тремя парами праймеров (AP22A-Í -АР22А-Г и AP22B-Í - АР22В-г22, специфичных к фаговой ДНК, и SP2-16S — ASP2-16S на ген 16S рРНК A. baumannii), проводимой для определения возможного присутствия профага в геноме фагорезистентных клонов: Ph -бактериофаг АР22, 1, 2, 3 - фагорезистентные клоны, АЬ - штамм A. baumannii 1053, L - маркер молекулярных масс ЮОЬр Ladder (Fermentas, Литва)

При анализе белкового состава очищенного препарата бактериофага АР22 методом SDS-электрофореза в полиакриламидном геле выявлено четыре основных и три минорных структурных белка с молекулярными массами: 84,8; 67,2; 46,3; 31,3; 27,7; 23,1; 17,4 к Да, определёнными с помощью программы PhotoCaptMW (рис. 11).

— llfinkDi

— 66.2 kDa

— -15.0 kDa

— 35.0 kDa

— 25 0 kDa

— IS.4 kDa -HI kDa

Рисунок 11 - Электрофоретическое разделение белков бактериофага АР22 в 12 %

SDS-полиакриламидном геле, окраска Кумасси G-250; М - маркер молекулярной массы

геномной ДНК 50 фагоустойчивых клонов

Ph 1 2 L 3 Ab Ph

I MS 1 ^^п-АРгг-А

в I м

Н ^i^XS Щ -16S г RNA

Можно предположить, что мажорный белок с молекулярным весом около 31 кДа является основным структурным элементом головки бактериофага, а мажорные белки с молекулярными весами 46 и 17 кДа - основными компонентами хвостового отростка.

Рестрикционный анализ ДНК бактериофага АР22, проведённый с использованием 28 эндонуклеаз рестрикции, показал, что ДНК фага расщепляется ферментами HindllL Dral, Vspl, Sspl, TaqI, AM, Rsal, Hint! Mspl, Cfirl, EcoRI, частично гидролизуется EcoRV, PstI, Sail, Xmi, Smil, Clal, BamHI, PvuII, Bgin, EcoR91I, Ncol, Nhel и не гидролизуется ферментами Smal, Apal, NotI, Drall, Eco52I. Для определения размера генома фага АР22 проводили двойной и тройной гидролиз фаговой ДНК эндонуклеазами рестрикции Nhel и PstI, Smil и PstI, Smil и EcoRV, Nhel, EcoRV и PstI (рис. 12).

1 ; M 3 4 L ? 6 1 8 9 M 10 11 12

I-I6.Ó I |4<5.0|4ö ?|46 3|

Рисунок 12 - Электрофореграммы продуктов гидролиза ДНК фага АР22 ре-стрикционными эндонуклеазами Vspl (1), Sspl (2), Hindlll (3), Dral (4), Nhel (5), Smil (6), Pstl (7), EcoRV (8), Nhel и PstI (9), Smil и PstI (10), Smil и EcoRV (11), Nhel, EcoRV и PstI (12, рестрикционные фрагменты отмечены треугольниками); L - гидролиз ДНК фага X эцдонуклеазой Hindlll; М - маркер молекулярных масс 1-kb DNA Ladder (Fermentas, Литва). Сумма размеров рестрикционных фрагментов (для 9-12) указана в kb

Размер генома фага АР22, определённый на основании обработки рестрикционных профилей фаговой ДНК с помощью программного обеспечения Quantity One (Bio-Rad), составил 46,4 т.п.н.

Для определения полной нуклеотидной последовательности генома бактериофага АР22 проводили секвенировнание геномных библиотек (shotgun sequencing), полученных при клонировании в векторную плазмиду pUC19 фрагментов фаговой ДНК, образованных при ферментативном расщеплении ДНК эндонуклеазами рестрикции Hindlll, Dral и Rsal, а также при обработке фаговой ДНК ультразвуком. В результате клонирования было отобрано в общей сложности 224 клона, содержащих рекомбинантную ДНК со вставками ДНК бактериофага АР22 размером от 170 до 3800 п.н.

Несколько циклов секвенирования клонированных фрагментов ДНК фага позволили получить перекрывающиеся фрагменты, объединённые затем в более крупные контиги. Для объединения контигов в единую последовательность проводили прямое секвенирование генома фага, используя олигонуклеотидные праймеры, комплементарные 5'- и З'-концевым последовательностям ранее се-квенированных фрагментов и контигов фага, а также секвенирование отдельных ампликонов, наработанных в ПЦР с использованием тех же праймеров. В результате каждый нуклеотид в составе фаговой ДНК был прочитан как минимум три раза.

Проведённые эксперименты показали, что геном бактериофага представлен двухцепочечной кольцевой ДНК размером 46387 п.н. с Г-Ц составом 37,74 %.

С помощью биоинформационных программ GeneMark.hmm и Soft-Berry FGENE в геноме фага АР22 было выявлено 89 открытых рамок считывания (ОРС), кодирующих предполагаемые пептиды размером не менее 35 а.о., из которых 77 ОРС располагаются на прямой, 12 - на обратной цепях ДНК. ОРС организованы как минимум в 17 транскрипционных единиц, определённых с помощью биоинформационной программы GeneMark.hmm.

Установлено, что геном бактериофага АР22 имеет модульную организацию и включает гены, кодирующие структурные протеины (белок капсида, белки хвостового отростка, базальной пластинки, хвостовых фибрилл и выростов), ферменты, ответственные за лизис бактериальной клетки-хозяина (фаговый лизоцим - эндолизин и потенциальный холин) и компоненты системы репликации ДНК (рис. 13).

При сравнении аминокислотных последовательностей потенциальных белков фага АР22 с известными протеинами, определены возможные функции 25 % (22 из 89) из них; 60 % (54 из 89) ОРС кодируют гипотетические белки с неизвестными функциями, представленные в базах данных; а предполагаемые продукты 15 % ОРС (13 из 89) не имеют сходства с какими-либо фаговыми или бактериальными протеинами.

Показано, что 18 % (16 из 89) ОРС АР22 кодируют полипептиды, обладающие гомологией с протеинами Acinetobacter spp. с неизвестной функцией, 57 % (51 из 89) ОРС гомологичны фаговым протеинам.

Сравнительный геномный анализ выявил существенную гомологию между бактериофагом АР22 и фагом АВ1 (Yang et al., 2010), также инфицирующим A. baumanniv. гомология определена для 53 из 89 предполагаемых генов. Кроме того, по одному из предсказанных протеинов АР22 обладают гомологией с белками следующих бактериофагов: фага Staphylococcus 52А (ORF032), фага Salmonella El и фага Burkholderia ВсерСбВ (gp36).

Следует отметить, что в геноме фага АР22 не идентифицировано ни одного гена, кодирующего токсины или какие-либо известные факторы вирулентности. Кроме того, не выявлены гены, определяющие умеренный (лизогенный) путь развития бактериофага (в составе профага).

Таким образом, в результате проведённых экспериментов впервые определена полная нуклеотидная последовательность ДНК бактериофага семейства

Муоутйае, лизирующего бактерии А. Ьаитаппи. Аннотированная последовательность генома фага АР22 депонирована в Европейской базе данных ЕМВЬ под номером НЕ806280 и базе данных вепВапк под номером ЫС_017984.

Эндодезоксирибонуклеаза RusA белок, определяющий устойчивость к суперинфицированию ДНК-хелихаза ч

ДНК-СБЯзываыший

белок

ДНК-М-б-адеиин-метилтрансфераза

транскрипционный регулятор белок семейства ERF

дезоксиУТФ- J дифосфата:

эндолизин ХОЛ1Ш -

белок выроста хвостового тростка

белок фибрилл

J-подобный белок _/ базальной пластинки f

V-подобный белок базальной пластинки

■ Компоненты капсида и его сборка

■ Сборка хвоствого отростка и базальной пластинки ■ Лизис клетки-хозяина

малая субьедишща терминазы

I большая субьедишща терминазы

rf. у портальный протеин

(ЗВ^ белок, участвующий в ^ ^к^ морфогенезе головки

ТУ

оелок капсида

f- лилопротеин

■ белок, определяющий размер хвостового отростка

[ Метаболизм ДНК и нуклеотндиый обмен | Консервангивные протеины с неизвестной функцией Гипотепгческие протеины

Рисунок 13 - Геномная карта занных белковых продуктов

бактериофага АР22 с указанием функций предска-

В заключение стоит подчеркнуть, что к важнейшим характеристикам, необходимым для отбора литических фагов как оптимальных терапевтических агентов, можно отнести широту спектра литического действия, относительную простоту получения фага в высоком титре, быстрое размножение фага (минимальный латентный период, высокий урожай, отсутствие задержки лизиса), устойчивость к процедурам очистки от бактерий и некоторые другие признаки. В ходе проведенных исследований было установлено, что бактериофаг АР22 обладает всеми вышеперечисленными свойствами.

Таким образом, на основании данных микробиологического, геномного и биоинформационного анализов бактериофаг АР22 можно рассматривать в качестве потенциального компонента препарата для лечения инфекций, вызванных А. Ьаитаппи, и использовать для идентификации бактерий данного вида при бактериологическом анализе клинического материала.

ВЫВОДЫ

1. Создана коллекция, включающая 130 штаммов А. ЬаитаппИ, выделенных в периоде 2005 по 2010 гг. в крупных стационарах Европейской части России и Южного Урала.

2. Среди изученных штаммов выявлено 10 генетических групп, из которых две доминирующие группы объединяют 82 % (107 из 130) клинических штаммов А. ЬаитаппИ.

3. Выделено девять бактериофагов, инфицирующих бактерии рода Асте1оЬас1ег. Бактериофаг АР22 семейства МуохМйае с широким спектром антибактериального действия выделен из клинического материала, полученного в ожоговом центре.

5. Бактериофаг АР22 специфически инфицирует и лизирует 68 % (89 из 130) штаммов А. ЬаитаппИ, обладает высокой скоростью адсорбции к бактериям (более 99 % фаговых частиц адсорбируются в течение 5 мин) и высокой урожайностью - 240 фаговых частиц на одну инфицированную бактериальную клетку.

6. Методом атомно-силовой микроскопии изучена морфология фага АР22 и проведена визуализация его литического цикла. Установлено, что с первой минуты совместной инкубации данного фага и протобиопленок, формируемых А. Ьаитаппиь стационарныхусловиях роста, наблюдается рассеивание клеточных агрегатов и адсорбция фаговых частиц.

7. Определена полная нуклеотидная последовательность генома бактериофага АР22, представленного двунитевой ДНК размером 46387 п.н. с Г-Ц составом 37,74 %. В геноме выявлены 89 открытых рамок считывания и определены вероятные функции 22 из них.

8. В геноме фага АР22 не идентифицировано ни одного гена, кодирующего пептиды, подобные токсинам или каким-либо известным факторам вирулентности, представленным в международных базах данных, а также гены, определяющие умеренный путь развития фага.

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

а) статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК

1. Ponova, А. V. Isolation and characterization of wide host range lytic bacteriophage AP22 infecting Acinetobacter baumannii / A. V. Popova, E. L. Zhilenkov, V. P. Myakinina, V. M. Krasilnikova, N. V. Volozhantsev // FEMS Microbiol. Lett. -2012. - VoL 332. - N 1. - P. 40-46.

2. Dubrovin, E. V. Atomic force microscopy analysis of the Acinetobacter baumannii bacteriophage AP22 lytic cycle / E. V. Dubrovin, A, V. Popova, S. V. Kraev-skiy, S. G. Ignatov, Т. E. Ignatyuk, I. V. Yaminsky, N. V. Volozhantsev // PLoS ONE. - 2012. - Vol. 7. - N 10. - e47348.

3. Попова, А. В. Молекулярно-генетическая характеристика антибиотико-устойчивых штаммов Acinetobacter baumannii и оценка их чувствительности к бактериофагу АР22 / А. В. Попова, В. П. Мякинина, М. Е. Платонов, Н. В. Во-ложанцев // Мол. генетика, микробиол., вирусол. - 2012. - № 4. - С. 18-22.

б)патенты

4. Пат. № 2439151 С1 РФ, МПК C12N7/00, C12R1/19. Штамм бактериофага Acinetobacter baumannii АР22 для идентификации бактерий Acinetobacter baumannii при бактериологическом анализе клинического материала и для получения препарата против внутрибольничных А. Ьаитапт'/-инфекций / А. В. Попова, Н. В. Воложанцев, Е. JI. Жиленков, В. П. Мякинина, М. А. Попова, Т. Г. Спиридонова, Э. А. Светоч - заявлено 24.06.2010; опуб. 10.01.2012.

в) тезисы научных конференций

5. Попова. А. В. Изучение эффективности применения бактериофагов в комплексном лечении ожоговых больных / А. В. Попова, М. А. Попова, И. А. Худяков // Материалы школы-конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека «Биобезопасность в современном мире» (Оболенск, 21-22 апреля 2009 г.). - Оболенск, 2009. -С. 249-251.

6. Kuzhelnaya, Е. N. Multidrug Resistant Acinetobacter Nosocomial Strains Collected from Russian Hospitals in 2003-2008: Phenotypes of the resistance / E. N. Kuzhelnaya, A. V. Popova, N. K. Fursova, A. N. Kruglov, S. V. Sidorenko, E. A. Svetoch // Abstracts of the 12th SAC Seminar «Combating Global Infections» (Irkutsk, 21-25 September 2009). - P. 38.

7. Попова, А. В. Молекулярно-генетическое типирование и изучение устойчивости к антибактериальным препаратам нозокомиальных штаммов Acinetobacter baumannii / А. В. Попова, Е. Н. Кужельная, М. А. Попова, Н. В. Воложанцев, Н. К. Фурсова // Тезисы XII Международного конгресса MAKMAX/ESCMID по антимикробной терапии (Москва, 18-20 мая 2010 г.). Клин, микробиол. и антимикроб, химиотерапия. - 2010. — Т. 12. - № 2, прилож. 1.-С. 42-43.

8. Popova, А. V. Isolation and characterization of Myoviridae bacteriophage lytic for Acinetobacter baumannii / A. V. Popova, V. P. Myakinina, E. L. Zhilenkov, V. M. Krasilnikova, N. V. Volozhantsev // Abstracts of «Microbial Viruses: Geno-

mies, Evolution and Applications in Ecology, Biotechnology and Medicine» (Belfast, 19-20 April 2011).-P. 53.

9. Dubrovin, E. V. Use of atomic force microscopy for investigation of bacteriophage infection cycle / E. V. Dubrovin, A. V. Popova, S. V. Kraevsky, Т. E. Ignat-yuk, S. G. Ignatov, I. V. Yaminsky, N. V. Volozhantsev // Abstracts of «E-MRS 2011 Spring Meeting» (Nice, France, 9-13 May 2011). - P. 13.

10. Ponova, A. V. Characterization of Acinetobacter baumannii bacteriophage AP22 isolated from Russian hospital / A. V. Popova, E. V. Dubrovin, V. P. Mya-kinina, E. L. Zhilenkov, S. V. Kraevsky, Т. E. Ignatyuk, N. V. Volozhantsev // Program and abstracts of the 19th Biennial Evergreen International Phage Biology Meeting (Olympia, 7-12 August 2011). - P. 84.

11. Гончаров, A. E. Эпидемические клоны Acinetobacter baumannii в российских стационарах /А. Е. Гончаров, Л. П. Зуева, Н. В. Воложанцев, А. В. Попова, Т. Н. Суборова, А. П. Соломенный, Н. Р. Сагиева // Материалы II Международного Конгресса по внутрибольничным инфекциям (Москва, 23-24 ноября 2011 г.). Инфекционные болезни. - 2011. - Т. 9, прилож. 3. - С. 24-25.

12. Popova, А. V. Genomic organization of lytic Acinetobacter baumannii bacteriophage AP22 / A. V. Popova, A. G. Bogun, N. V. Volozhantsev // Program and abstracts of the EMBO conference «Viruses of Microbes» (Brussels, 16-20 July 2012).-P. 57.

Благодарности

Глубоко признательна научному руководителю моей кандидатской диссертации к.б.н. Воложанцеву Николаю Валентиновичу, а также моим соавторам и коллегам, принимавшим участие в планировании, проведении экспериментов и обсуждении их результатов.

Считаю своим долгом выразить искреннюю благодарность Поповой М. А. (Городская клиническая больница №6, Челябинск), Спиридоновой Т. Г. (НИИ скорой помощи им. Н. В. Склифосовского, Москва), Гординской Н. А. (Нижегородский НИИ травматологии и ортопедии Минздравсоцразвития России, Нижний Новгород), Гончарову А. Е. (Санкт-Петербургская государственная медицинская академия имени И. И. Мечникова, Санкт-Петербург), Фурсовой Н. К. (ФБУН ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии, Оболенск) и Эдельштейну М. В. (НИИ антимикробной химиотерапии, Смоленск) за предоставление бактериальных штаммов, клинических изолятов и образцов для проведения исследований.

Выражаю искреннюю признательность ведущей организации, официальным оппонентам и всем рецензентам настоящей работы за высказанные замечания, заданные вопросыи сделанные поправки, которые, по возможности, были учтены.

Приношу особую благодарность моей маме - врачу Поповой Маргарите Александровне и врачу Худякову Илье Александровичу, профессионализм, ответственность и энтузиазм которых побудили меня к выбору направления моей исследовательской деятельности.

Диссертация посвящена памяти Настоящего Ученого -

Юрия Николаевича Ковалева.

Подписано в печать:

16.11.2012

Заказ № 7865 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ra