Механизм инфицирования бактериофага Т4: функциональная роль доменов продуктов генов 9 и 11

Вишневский, Александр Юрьевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Механизм инфицирования бактериофага Т4: функциональная роль доменов продуктов генов 9 и 11
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Механизм инфицирования бактериофага Т4: функциональная роль доменов продуктов генов 9 и 11"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ имени академиков М М. ШЕМЯКИНА и Ю А ОВЧИННИКОВА РАН

На правах рукописи

ВИШНЕВСКИЙ Александр Юрьевич

Механизм инфицирования бактериофага Т4: функциональная роль доменов продуктов генов 9 и 11

Специальность 03 00 03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических на> к

1 7 Ш 2007

Москва - 2007

003059763

Работа выполнена в лаборатории молекулярной биоинженерии Института Биоорганической Химии им академиков М М Шемякина и Ю А Овчинникова РАН

Научный руководитель

кандидат химических наук

Курочкина Лидия Петровна

Официальные оппоненты

доктор биологических наук, профессор

Доброе Евгений Николаевич

кандидат биотогических наук

Прилипов Алексей Генидиевич

Ведущая организация

Институт биохимии им А Н Баха РАН

Защита состоится 30 мая 2007 г в 10 часов на заседании Диссертационного совета Д 002 019 01 при Институте Биоорганической Химии им академиков М М Шемякина и Ю А Овчинникова РАН, по адресу 117997 ут Миклухо-Маклая, 16/10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института Биоорганической Химии им академиков М М Шемякина и Ю А Овчинникова РАН

Автореферат разослан "28" апреля 2007 г

доктор химических нау к

Ученый секретарь диссертационного совета,

В А Несмеянов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Вирусы бактерий (бактериофаги) явитись основными модельными объектами, изучение которых определите успешное развитие многих направтений мотекулярной биотогии Большинство основоиотагающих достижений, начиная с установления биологической роти ДНК, расшифровки генетического кода и кончая выяснением мотекулярных механизмов экспрессии генома, практически полностью связано с бактериофагами Их исстедование также играет важную роть при изучении структурно-функциональной организации биомочекул и механизмов сборки сложных надмотекулярных биотогических комптексов и вирусов (Wood et al, 1974, Hohn et al, 1974, Kaiser et al, 1974, Kikuchi and King, 1975, King and Laemli, 1971)

Классическим объектом мотекулярной биотогии на протяжении уже нескольких десятков тет является бактериофаг Т4 Частица Т4 состоит из капсида с геномной ДНК и сократимого хвоста, на дистальноч конце хвоста находится базальная птастинка, к которой присоединены хвостовые фибритлы На сегодняшний день - это одна из самых эффективных биоюгических мотеку тарных машин по доставке генетической информации в клетку Высокая эффективность инфицирования, равная 1, обустовлена стожной структурой аппарата инфицирования Базальная птастинка - контротьный центр инфекционности вируса - явтяется мутьтибетковой структурой и контролирует узнавание клетки-хозяина, прикрептение к ней вируса, сокращение хвостового чехла и введение геномной ДНК фага в бактерию В процессе инфицирования происходит структурная реорганизация базальной птастинки из формы гексагона в шеститучевую звезду

В нашей таборатории методами рентгеностру кту рного анализа были решены пространственные структуры ряда белков фага Т4 Сравнитетьно недавно на основе изображений криоэтектронной микроскопии реконструированы отдельные компоненты фаговой частицы с высоким разрешением капсид (Fokine et al, 2004), хвост (Kostyuchenko et al, 2004, 2005) и базальная пластинка (Kostyuchenko et al, 2003, 2005) В резутьтате реконструкции базальной птастинки в двух конформациях (гексагон и звезда) и постедующего встраивания белков с известной атомной структурой были потучены две модети, сравнение которых позвотило представить, как вирус инфицирует к тетку (Leiman et al, 2004, Kostyuchenko et al, 2005) Механистическое представтение процесса инфнцирования и потученные структурные данные явились основой для проведения направтенного мутагенеза отдетьных генов с целью более глубокого понимания принципов и уточнения деталей функционирования машины инфицирования фага Т4

Настоящая работа посвящена изучению прод>ктов генов (пг) 9 и 11 - структурных бетков базальной птастинки, прикрепляющих к ней длинные и короткие хвостовые фибршпы, соответственно Пг9 играет ключевою роль в инициации процесса инфицирования передает сигнал с д тинных хвостовых фибрилл на белки базальной пластинки, приводя к ее структурной реорганизации Кроме того, пг9 и пг11 явтяются хорошими модетячи дтя изучения фолдинга и отигомеризации сложных многодоменных белков Выяснение принципов укладки потипептидных цепей в нативную пространственную структуру является одной из самых актуальных проб чем молекулярной биологии и имеет важное практическое значение дчя биотехнологии и медицины

Цели и задачи работы

Целью настоящей работы явитось выяснение роти отдетьных доменов пг9 и пг11

в механизме инфицирования бактериофага Т4

Задачи исследования

1 Получить детеционные варианты пг11, а также мутанты пг9 с заменами отдетьных аминокислотных остатков

2 Изучить свойства точечных мутантов и разтичных К-концевых и С-концевых детеционных вариантов пг9 и пг11

3 Сконструировать векторы дтя ко-экспрессии потноразмерного пг9 и его делеционных вариантов с удаленным >1-концевым сегментом, М-, КМ- и С-доменами Изучить свойства прод) ктов ко-экспрессии

4 Провести мутагенез предполагаемых обтастей взаимодействия пг9 и пг11 с фибриллами

Научная новизна и практическая значимость работы

В настоящей работе показано, что беток базальной пластинки фага Т4 - пг9 -встраивается в нее своим 1Ч-доменом Доказано, что дтя передачи сигнала на базальиую пластинку в процессе инфицирования важна интактность Л-домена пг9 Получены дополните тьные доказатетьства того, что С-домен ответственен за тримеризацию пг9 Показано, что тримеризация пг9, скорее всего происходит пост-транстяционно С-концевые аминокислотные остатки С1п282, Ьу5283 и 11е284 играют важную роть в стабилизации тримера бетка Впервые дтя пг9 быти получены температуро-чувствитетьные мутации м>тации), втияющие на фочдинг и прочность ассоциации мономеров в тричере Более того, выявлена мутация, су прессирующая течпературо-чувствительный эффект ($/-чутаций Для пг11, в оттичие от пг9, первые 17 аминокистотных остатков (а о ) с 1Ч-конца не влияют на

отигочеризацию и функциональную активность белка Однако ботее протяженные делеции, вплоть до потного удаления N-концевого домена, хоть и не влияют на способность белков к тримеризации, приводят к потере их биологической активности за счет существенного нарушения структуры Было показано, что N-концевая область тримера nrll взаимодействует с центральной областью тримера nrlO т vitro Возможно, именно с этого взаимодействия двух белков начинается сборка базальной пластинки в процессе морфогенеза частицы фага Т4 т vivo

Полученные результаты позволяют дополнить существующие на сегодняшний день представления о механизме инфицирования бактериофага Т4

Апробация работы

Результаты работы были представлены на XIX зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, 7-9 февраля 2007 г , VIII чтениях, посвященных памяти академика Ю А Овчинникова, Москва, 25-27 октября 2006 г, XLVII научной конференции Московского физико-технического института, Москва, 23-27 ноября 2004 г, XVI зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, 9-12 февраля 2004 г

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ Структура н объем работы

Диссертация состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Малериалы и методы», «Результаты», «Обсуяедение», «Выводы» и «Список литературы» Работа изтожена на 111 страницах и включает 24 рисунка, 5 таблиц и список литературы, содержащий 137 ссылок

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Штаммы бактериофага Т4 и Е coh В работе использовали амбер-мутанты бактериофага Т4 Т4/9атЕ 17 и T4/UamN93, а также штаммы Е coli BL 21 (DE3) для экспрессии генов, клонированных в плазчиды, с промотора фага Т7 (Terzaghi et al, 1979), Top 10 для наработки и выделения потученных плазчид, Nova Blue (DE3) (Novagen, США) для экспрессии генов, клонированных в плазчиды, с промотора фага Т7, и для наработки и выделения полученных плазчид, Ве/1 в качестве непермиссивного хозяина для амбер-чутантов бактериофага Т4 при получении дефектных экстрактов и для наращивания

бактериофага Т4 (Epstein et al, 1963), CR63 в качестве перчиссивного хозяина для ачбер-мутантов бактериофага Т4 (Wilson et al, 1977)

Генетические методы При работе с бактериофагом Т4 применяли стандартные методы (Epstam et al, 1963) Титрование проводили по методу агаровых слоев Суспензии бактериофага Т4 получали методом лизиса в жидкой культуре

Приготовление дефектных частиц фага Т4 Клеточный экстракт, содержащий 9~-частицы фага (Т4/9ашЕ17) или 11~-частицы фага (Т4/1 lamN93), получали как описано ранее (Edgar and Wood, 1966)

Комплементация дефектных 9 или 11" -частиц m vitro К 20 мкл экстракта 9" или 1 Г-частиц фага Т4 добавляли 20 мкл тизата клеток, содержащих рекомбинантный белок (пг9 или nrl 1, соответственно), и инкубировали в течение 1 ч при 30° В процессе инкубации из реакционной смеси отбирали аликвоты по 5 мкл, разводили их в 1000 раз физиологическим раствором и титровали на газоне клеток Е coli CR63 При изучении влияния мутантов пг9 (или nrll) на комплементацию белка дикого типа экстракт дефектных частиц предварительно инкубировали в течение 60 мин при 30° с клеточными лизатами, содержащими мутантный белок, а затем добавляли белок дикого типа и инкубировали еще 60 мин

Трансформация клеток Е. coli Трансформацию Е coli осуществляли в соответствии с методом Inoue et al (1990)

Конструирование плазмид и другие генно-инженерные манипуляции Для клонирования плазчидных векторов использовали векторы pET19b, pET22b(+), pET23d(+) (Novagen, США) Реакции рестрикции и лигирования проводили согласно рекочендацияч фирм-изготовителей Фрагменты ДНК ачплифицировали методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) согласно (Sanger et al, 1977), выделяти и очищали с помощью набора QiaPCR Prep фирмы QiaGen (Германия) согласно инструкции фирмы-изготовителя Выделение и очистку плазчидной ДНК из клеток Е coli проводили с помощью набора QiaSpm Prep фирмы QiaGen (Германия) согласно инструкции фирмы-изготовителя Получение точечных и делеционных мутантов пг9 и nrl 1 проводили методом ПЦР с использованием олигонуклеотидных праймеров, в последовательности которых были введены случайные замены, а также замены для создания соответствующих сайтов рестрикции Правильность полученных конструкций проверяли секвенированиеч ДНК в соответствии с (Sanger et al, 1977)

Экспрессию рекомбинантных белков в клетках Е coli BL21(DE3), клонированных под промотор фагаТ7, осуществляли по методу Стадиера (Studierand Moffatt, 1986)

Очистку рекомбннантных белков проводили на ионообменной колонке с гидроксилаппатиточ (ГАП) («Вю-Rad», США), уравновешенную 10 мМ натрий фосфатным 6n фером, рН 7 8

Экстракты клеток, содержащих рекочбннантные белки, для анализа на растворимость, устойчивость к Дс-Na и последующего тестирования их в опытах по комплементации m vitro готовили согласно протоколу (Наврузбеков и др, 1999)

Аналитическую гель-фильтрацию очищенного nrll и его делеционных вариантов проводили на колонке Superóse 12 (FPLC, «Pharmacia Biotech», Швеция)

Белковый гель-электрофорез и нммуноблоттинг Этектрофорез белков в ПААГ проводили по методике, описанной Лэчмти (Laemmli, 1970) Гели окрашивали 0,3% KyMacciiR («Sigma», США) в растворе уксусная кислота/этанол/вода (13 6) Для электрофореза в неденатурирующих условиях использовали те же буферные растворы, но без добавлен™ Дс-Na и 2-меркаптоэтанола Перенос белков осуществляли на нитроцеллюлозную чечбрану (Towbin et al, 1979) Белки идентифицировали с помощью моноклональных антитет 1F11 на пг9, 2D2 на nrl 1 и поликлональной сыворотки на пгЮ

Основное содержание работы

Пг9 (288 ао, 30 7 кДа) и nrll (218 ао, 23 7 кДа) бактериофага Т4 являются коннекторами длинных и коротких хвостовых фибрилл, соответственно При инфицировании, когда по-крайней мере 3 длинные хвостовые фибриллы связываются с рецепторачи клетки-хозяина Е coh, сигнал от них передается на пг9, который запускает процесс инфицирования, передавая сигнал на другие белки базальной пластинки (пг7, пг8 и пгЮ) В результате этого происходит структурная реорганизация базальной пластинки, разворачиваются короткие фибриллы, которые необратимо связываются с клеткой, сокращается хвостовой чехол и ДНК вируса вводится в клетку Ранее в нашей лаборатории методами рентгеноструктурного анализа решены пространственные структуры пг9 (Kostyuchenko et al, 1999) и nrl 1 (Leiman et al, 2000)

Изучение продукта гена 9 бактериофага Т4 Мутагенез N-концевой области полипептнднон цепн пг9

Функционально активный пг9 является Дс-Ña-устойчивым гочотричероч и состоит из трех доменов N-дочен пг9 представляет coiled-coil структуру, сформированную тремя а-спиратячи и содержит три N-концевых сегмента (первые 19 ао) ид\щих антипараллельно а-спираляч и своими концами взаимодействующих со средним доменом (рис 1)

Дчя выяснения ф; нкциональйбй роли Ы-домевд в нашей, лаборатории был проведен, мутагене! М-концевого сегмента полипептидной цепи. Были получены варианты пг9 с делениями первых 2-х, 6-ти и 12-ти аминокислотных остатков (К.\2, МЛб и N^12, соответственно), а также получены мутанты с заменами второго, третьего и четвёртого N-концевых аминокислотных остатков пг9. Аминокислотная последовательность некоторых из мутантов, определенная ееквенированием ДНК соответствующего фрагмента гена 9, приведена в таблице I.

Анализ полученных мутантных белков показал, что вес они растворимы и формируют Дс-Ма-устойчивые триме ры подобно белку дикого типа, которые легко детектировать в системе Лэммли без предварительной денатурации белков нагреванием. Однако, при анализе негретых образцов мутантных форм белка на Дс-Ма ПААГ наряду с основной полосой три мера, были выявлены полосы, мигрирующие медленнее На рисунке 2 представлена Электрофоретаческая картина для двух из полученных .мутантов (N¿12 и №8) в пг9 дикого типа.

Таблица I Аминокислотная последовательность вариантов пг9 с заменами в И-конвдвом ссгмектс (выделены изменённые аминокиегтотныг остатки).

пг9 Met-Phe-Ile-Gln-Glu-Pro-...

Nr 4 Met-Val-Ile-Leu-Glu—Pro- . , .

Nr7 Mot-Val-Ile-Arg-Glu-Pro-.,.

Mr 8 Met-Val-Thr-Leu-Glu-Pro-..■

Nrl3 Met-Asp-Thr-Pro-Glu-Pro-...

Nrl7 Met-Ala-Ile-Fro-Giu-Pro-.,.

Биологическая активность всех мутантов была проверена в тестах прямой комплементации in vitro. Оказалось, что все мутанты не восстанавливали инфекционноеть дефектных 9-частиц фага. В таблице 2 представлены результаты комплеметации для мутантов пг9 с заменами первых аминокислотных остатков. Для того чтобы проверить, встраиваются ли мутантные белки в базальную пластинку фага, была проведена конкурентная комплементация in vitro. Как видно из таблицы 2 (правый столбец), мутантные

Рисунок 1 Рентгеновская структура пгУ бактериофага Т4, выполненная с разрешением 2,3 А. Ы-, С- и средний домены обозначены буквами N. С и М. соответственно (Ко5(уие11епко е1а1.,т%

белки не оказывают влияния на комплементацию дефектных 9 -частиц белком дикого типа, следовательно они не встраиваются в базальн\ю пластинк\ Однако, мутант NA20 у которого полностью у дален N-концевой сегмент, сохраняет способность встраиваться в базальную пластинку, чо не восстанавливает инфекционность дефектных 9 -частиц фага при прямой комплементации т vitro (Наврузбеков et al, 1999) Более того, при анализе негретого препарата NA20 на Дс-Na ПААГ детектировалась только одна полоса тримера (рис 2)

Таблица 2 Титр инфекционных частиц фага Т4 в системе комплементации in vitro посте инк} бации дефектных 9~-частиц фага пг9 дикого типа и его N-концевыми му тантами

Варианты пг9 Титр фаговых частиц при прямой комплементации (бляшкообраз\'ющих частиц/мл) Титр фаговых частиц при конкурентной комплементации (бляшкообразующих частиц/мл)

Пг9 (7 5 ± 0,5) х Ю10 -

Отрицате льный контроль (2 1 ± 0,3) х 10® -

Nr4 (2 0 ± 0,2) х 108 (7 3 ± 0,3) х 10io

Nr7 (2 6 ± 0,4) х 108 (6 5 ± 0,5) х Ю10

Nr8 (2 1 ± 0,2) х 108 (7 1 ±0,5)х Ю10

Nrl3 (2 7 ± 0,5) х 108 (6 9 ± 0,6) х Ю10

Nrl7 (2 5 ± 0,2) х 108 (7 4 ± 0,2) х Ю10

nr9*FG (2 1 ±0,3) х 108 (7 5 ± 0,4) х Ю10

Свойства мутантов с нарушенными ТЧ-концевычи сегментами (делсционных вариантов N¿2, N46, N412 и полноразмерных мутантов с заменами) можно объяснить тем, что происходит нарушение взаимодействия 1Ч-концевого сегмента с а-спиралью и со средним доменом, в результате чего форчиру ются формы белка с подвижными М-концевыми сегментами, которые мы назвали конформеры Именно они мигрируют в гете медленнее нативного тримера Видимо, именно из-за разу порядоченных >1-концевых сегментов такие белки не могут встраиваться в базальную пластинку фага Мутанта КД20, у которого полностью отсутствует Ы-концевой сегмент, все же сохраняет компактную структуру 14-домена, что позволяет ему встраиваться в базальную пластинку Поскольку инфекционность дефектных частиц при этом не восстанавливается, можно предположить, что М-концевые сегменты играют важную функциональную роль в передаче сигнала при инфицировании Не исключено, что они нужны и для стабилизации структуры белка, необходимой дтя его нормального фу нкционирования Так, результаты связывания чоноклональных антител к разным доменам пг9 со всеми вышеперечисленными мутантами свидетельствует о том, что

мутации в N-коицевой области полипептидной цепи влияют не только на структуру N-домена, но и двух других (среднего и С-домена) (диссертация Жечаевой J1 В)

Мы проверили, могут ли замены в a-спирали, следующей за N-концевыч сегментом, приводить к нарушению компактности N-дочена С целью изменения структуры coiled-coil был получен мутант nr9*FG с точечными заменами Phe25—>Ile, Gly28—>Asp Данный мутантный белок являлся тричероч, устойчивыч к Дс-Na Однако, в тестах по комптеменгации in vitro nr9*FG не восстанавливат инфекционность дефектных частиц (табл 2) По результатам конкурентной комплементации белок не встраивался в базальную пластинку фага, что можно объяснить нарушением структуры N-дочена из-за ослабления взаимодействия между a-спиралями, формирующими coiled-coil структуру Действительно, компьютерное моделирование при помощи программы Modeller 8v2 (Salilab, США) показало, что у мутанта с заменачи Phe25—>11е и Gly28—>Asp а-спирати отклонялись от главной оси белка по меньшей мере на 5°

Данные по чутагенезу N-концевой обтасти полипептидной цепи пг9 свидетельствуют в пользу того, что белок встраивается в базальную пластинку N-доченоч Более того, мы видим, что любые изменения, вносимые в N-концевую область полипептидной цепи пг9, хоть и не влияют на формирование Дс-Ма-устойчивого тричера, но приводят к потере биочогической активности белка О необходимости интактного N-дочена для функционирования белка может свидетельствовать и высокая консервативность N-концевой последовательности для гомологов пг9 из других фагов Действитечьно, сравнение N-концевых последоватетьностей Т4 подобных фагов, таких как бактериофаг RB69 (номер доступа в Gene Bank ААР76069 1), RB49 (AAL15106 2), 44RR2-8t (AAQ81463 1), Aehl (AAQ17868 1), KVP40 (AAQ64413 1) и AR1 (AAN03606 1) показато высокую степень гомологии с пг9 бактериофага Т4

Ко-экспрессия пг9 и его делеционного варианта NA20

Для выяснения характера олигочеризации пг9 был получен вектор для ко-экспрессии почноразчерного пг9 и его делеционной формы NA20 Для этого фрагмент ДНК вектора, содержащий укороченный с 5' конца ген 9, был вырезан по сайтам BglII - Xhol и вставлен в вектор, содержащий полноразчерный ген 9 по сайтам BamHI - Xhol В полученной конструкции каждый ген 9 (и полноразчерный и кодирующий NA20) содержали свой Т7 промотор и последовательность Шайна-Дальгарно

Полученный вектор характеризовался высоким уровнем экспрессии обоих генов Дс-Na электрофорез негретого лизата клеток после экспрессии (ко-экспрессии двух генов) выявил 4 вида тримеров (рис 2) два из них соответствовали гочотричерач исходных белков

пг9 и N¿20, а два средних бьпи гетеротримерами Один из гетеротричеров состоят из двух потноразчерных цепей пг9 и одной у короченной NЛ20, а дру гои - из одной потноразчерной и двух укороченных цепей Смешивание же двух рекочбинантных бетков пг9 и N¿20 экспрессированных по отдетьности, не приводило к образованию гетеротричеров (данные не представлены)

________________ П|"9 гомотример

~~ ~~У пг9-Ыд20 (2 1)

' „^-гетеротример ч\пг9-ЫД20(1 2) \ гетеротример №Л20 гомотример

•<-пг9 мономер

NA12 Nr8 пг9 пг9 NA20 пг9-^Д20 гретый

Рисунок 2 Иччуноблоттинг рекочбинантных белков после разделения в 10% Дс-Na ПААГ негретых лизатов клеток Сравнение продуктов ко-экспрессии пг9 и NA20 с полноразчерныч пг9 и его чутантнычи вариантами NA12 и Nr8 Окрашивание моноклональным антителом 1F11 к пг9, которое \знаёт нативную и денатурированную формы бетка Стрелками вверху показаны продукты ко-экспрессии пг9 и NA20 Нижняя стрелка показывает на полосу, соответству ющую мономеру пг9

Интересно бы то выяснить, способны ли гетеротримеры восстанавливать инфекционность дефектных 9 -частиц фага в опытах по комплементации т vitro Поскольку разделить гочо- и гетеротримеры не удалось, опыты проводились на продуктах ко-экспрессии, а также смеси дв\х белков пг9 и NA20, экспрессированных по отдельности На рисунке 3 представлены кривые титрования дефектных 9 -частиц после добавления к ним пг9 (1) NA20 (4), смеси пг9 nNA20 (2), а также продуктов ко-экспрессии этих бетков (3)

Рисунок 3 Рост титра инфекционных частиц в системе комплементации in vitro в процессе инкубации 9-дефектных частиц фага Т4 с пг9 (1), смесью пг9 и NA20, экспрессированных по отдельности (2), и продуктами ко-экспрессии пг9 и NA20 (3) NA20 (или бу фер без белков) (4)

Титр дефектных 9"-частиц после добавления смеси пг9 и NA20 почти в 2 раза меньше по сравнению с титром частиц после добавления пг9 (положительный контроль) Укороченный гочотример NA20 встраивается в базальную пластинку фага, конкурируя с пг9, но к восстановлению инфекционности не приводит В случае ко-экспрессии пг9 и NA20 (смесь гомо- и гетеротримеров) титр составляет около 10% от положительного контротя, следовательно, гетеротримеры ведут себя подобно гочотричеру NA20, а именно, конкурируют с пг9 за встраиваемость в базальную пластинку По-видичочу в гетеротримерах для полноразчерной цепи сохраняется контакт N-сегмента с М-доченоч, и такая кочпактная структура чожет встраиваться в базальную пластинку Гетеротримеры не восстанавливают инфекционность дефектных 9"-частиц фага, а следовательно, они функционально не активны По-видичочу, из-за нарушения сиччетрии 3-го порядка в N-домене пг9, когда не хватает одного или двух N-концевых сегчентов, сигнал с длинных хвостовых фибрилл не передается дальше на белки базальной птастинки

Ко-экспрессия пг9 и его делецнонных мутантов NA54, NA167 и СД113

Следующич этапом нашей работы стало получение векторов для ко-экспрессии полноразмерного пг9 и его вариантов с более протяженными делециячи - NA54, NA167 и СА113 - с удаленнычи N, NM и С доченачи, соответственно Продукты ко-экспрессии разделяли в ПААГ в нативных условиях Дополнительные полосы наблюдались в случае ко-экспрессии пг9 с NA54 и NA167 (МС и С дочены, соответственно) (рис 4А, дорожки d и е)

Эти полосы вырезали из геля, прогревали в бу (]юри для образцов и разделяли в Дс-Na П -\АГ. Как видно из рисунка 4Б. дополнительные полосы являются гетеротримерами исходных белков (для гетеротримеров пг9 и NA 167 данные не представлены). Ко-окспрессия и г У и его делец ионного варианта СЛ113, у которого удапены 1!3 а.о. с С-конца, формирующие С-домен в тримере. не приводила к образованию гетерофимеров (рис 4 А. дорожка а). Таким образом, для формирования тримеранеобходим С-домен. а образование гетеротримеров при ко-экспрессии полноразмерного пг9 с его укороченными вариантами свидетельствует о том, что олигомеризацня белка происходит, по-видимому, пост-трапсляционно

A Б

Рисунок 4 Электрофорстичсский анализ в 8% нативном ПААГ (А) пг9 (с), а также продуктов его ко-экспрессии с СД113 (a). NA20 (b), NA54 (d) и NA 167 (е). Стрелками показаны полосы белков, которые были вырезаны из дорожки il прогреты в б^'фере для образцов с Дс-Na и нанесены на 12% Дс-Na ПААГ (Б) Номера дорожек на геле Б соответствуют пронумерованным волосам на геле А. Стрелками показаны мономерные формы пг9 и его делеционного мутанта N¿54.

С-концевыс делеционные варианты пг9,

Ранее в нашей лаборатории при экспрессии гена 9 с амбер-мутацией С226 была получена смесь рекомбинантных белков: СЛ7 (с делецией 7 а.о. с С-конца) и 9*(282) (с аминокислотной заменой Gln282) Показано, что удаление 7 а.о. с С-конца пГ9 приводит к нарушению олнгомеризации белка: укороченный фрагмент представляет собой нестабильный мономер, который полностью утрачивает биологическую активность (Жемаева и др., 2000).

b с d с

Для формирования стабильного тричера, устойчивого к Дс-Ыа, существенными оказались водородные и гидрофобные связи, которые формирует С-концевая обтасть одного мономера с другим мономером в тричере

СД7 СД6 СД5 СД4 I 1 1 1

N- Met- -Thr - Gin - Lys - líe - Gly - Val - Ala - Gin-С

1 281 282 283 284 285 286 287 288

Рисунок 5 С-концевой участок потипептидной цепи пг9 Стрелками показаны С-концевые ачинокистотные остатки делеционных вариантов

Gly285 (4-ая а о с С-конца) образует водородную связь с Thrl78 соседнего мономера. 11е284 (5-ая а о ) - гидрофобную связь с Thr205 соседнего мономера, a Gln282 (7-ая а о) образу ет две водородные связи с Leu203 и Thr205 соседнего мономера (Kostyuchenko et al, 1999) Наши данные по изучению делеционных вариантов пг9 (рис 5) свидетельствуют о том, что удаление 4-х а о с С-конца не влияет на стабильность тричера и его биотогическую активность (табл 3), следовательно, нарушение водородной связи чежду Gly285 и Thrl78 соседнего мономера при сохранении других межцепочечных контактов, не существенно для сборки и функционирования тримера

Таблица 3 Титр инфекционных частиц фага Т4 в системе комплементации in vitro после инкубации дефектных 9~-частиц фага с полноразчерным пг9 и его вариантами, укороченными с С-конца

Варианты пг9 Тилр инфекционных частиц (бляшкообразующих частиц/мл)

пг9 Положите тьный контроль (6,0 ± 0,5) х Ю10

Отрицательный контроль (2,1 ±0,1) х 108

СД4 (5,5 ± 0,2) х Ю10

СД5 (5,0 ± 0,4) х 10ю

СД6 (4,3 ± 0,2) х Ю10

Последовательное удаление 5-ти и 6-ти а о с С-конца хоть и не нарушает функциональных свойств бе лков, но приводит к тому, что их тричеры теряют у стойчивость к Дс-Ка, следовательно, гидрофобное взаимодействие 11е284 с 11е205 соседней полипептидной цепи необходимо для прочной ассоциации мономеров в тричере

Мутагенез С-ко hi 1с fio й области полннентидной цени пг9.

Поскольку удаление 6-ти С-концевых аминокислотных остатков (до ОI п 2 ü 2) не влияет на способность белка формировать тример, а удаление 7-ми а.о. (включая Gln2&2) полностью нарушает тримеризацию белка, можно предположить, что именно Glti282 является критичным для олигомеризации. Для проверки этого предположения был проведем мутагенез З1-концевой области гена 9 с помощью ПЦР с использованием прайме ров, содержащих случайные нуклеотидные замены. Сконструированы плазмнзные векторы для экспрессии мутантов с заменами Gin2K2 на дру гие аминокислотные остатки. Оказалось, что замены Gln282 на Ser, Cys, Не, Leu н Ala не влияли на формирование функционально активных гримеров, хотя все они были не устойчивы к Дс-Na (рис. 6). Таким образом, Gl п282 не является критичным для формирования три мера, а наряду с соседними С-концевы ми аминокислотными остатками (Lys2S3 и 11с284) влияет ка прочность взаимодействия мономерок втримерс

Ser Cys

баб а б М кДа

Рисунок 6. Электрофоретический анализ в 12% Дс-Na ПААГ негретых (а) и гретых (6) лизатов клеток после экспрессии пг9 и сто мутантов с заменами G'm282—»Aia, Glti2K2—Ser, Gln282—Cys, Gln282—lle и Gln282—Leu. обозначенных Ala. Sor. Cys, lie и Leu, соответственно. Стрелкой показан мономер пгУ, звездочкой обозначен его тример

Наряду с растворимыми точечными мутантами были обнару жены два нерастворимых Белки с заменой Gln282 на Pro или Arg в тех же условиях (37°С) экспрессировалиеь в виде тел включения При фракционировании лизата клеток белок присутствовал только во фракции осадка (рис. 7) Понижение температуры экспрессии до 25°С приводило к формированию растворимых форм белков, хоть и не устойчивых к Дс-Na. но функционально активных (данные не представлены). Следовательно, с понижением температуры белки успевали сворачиваться правильно и формировать биологически активные гримеры Таким

образом, Citn282, по-видимому, влияет не только на степень ассоциации полипептидных цепей в три мере, но и на фолдинг белка. Мы отнесли мутации Gln282^+Pro и Gln2S2—»Arg к так называемым /1'/-м\гтация\1 (temperature-sensitive folding) тсмпературо-чувствительным мутациям, влияющим на фолдинг.

Среди проанализированных мутантов пгУ с заменами Gln282 была найдена дополнительная мутация в полипепгидной цени - ¿и-мутацня (suppression), супрессирующая тсмпературо-чувствитсльный эффект замены Gln282—>Рго. Замена Glu 170 на Pro приводит к формированию растворимой формы белка при экспрессии при 37"С (рис. 7} Проверка su-мутанта в опытах по комплементации in vitro показала, что белок является функционально активным гримером, однако он не устойчив к действию Дс-Na

.SU-Pro Pro Arg пг9

сое ОС О

Рисунок 7. Эле ктрофоретич с с кий анализ в 12% Дс-Na ПААГ пг9 дикого типа и его мутантных форм с заменами Gln282-+Pro и Glnl70—»Pro: Gln2K2—»Pro; Gln282—»Arg, обозначенных sü-Pro, Pro и Arg, соответственно, после экспрессии при 37°С и фракционирования лизата клеток на супернатант (с) и осадок (о). Стрелкой показан мономер пг9

Как уже отмечалось выше, G!n282 образует в тримере водородные связи с Leu203 и 1te205 соседнего мономера. Исходя из структуры белка, можно предположить, что замена Gln282 на положительно заряженный Arg, а также Pro. может привести к изменению направления цепи, что в свою очередь мешает ее правильному фолдингу при 37°С и приводит к агрегации. Однако, полипептидные цепи успевают правильно свернуться и сформировать тример при 25°С. Gin 170 также образует водородные связи с аминокислотами соседнего мономера - Glul76 и L,ys277. Замена Gin 170 на положительно заряженный Arg, по-видимому, также приводит к изменению направления полипептидной цепи и препятствует образованию конформаций, вызванных заменой GIn282 и ведущих к образованию телец включения.

Хочется отметить, что хотя С-домек ответственен за тримеризацик», но небольшие делении или замены в С-конце все же не сказываются на функциональной активности белка, а лишь уменьшают прочность взаимодействия мономеров в тримере. Напротив, изменения, вносимые в N-концевую область пол и пептидной цепи пг9. хоть н не влияют на формирование стабильного. Дс-Налстойчиього тримера, -но приводят к потере биологической активности белка.

Ичучениепродукта гена 11 бактериофага Т4

Функционально активный пг I! является гом стримером и состоит из трех доменов, однако, в отличие от пгУ, его тример не устойчив к действию Дс-Na. По данным ре нтге неструктурно го анализа N-конце вой домен nrl 1 содержа три коротких а-епиральных участка разной длины, соединенных петлями (первые 10 а.о. полннептидной цепи в кристалле белка не упорядочены) (рис. 8) (Leiman t'l al., 2000) Первые две а-спирали не взаимодействуют между собой, тогда как наиболее протяженные а-спиралн мономеров (1264 а.о.) формируют в тримере структуру coiled-со И N-домен располагается внутри белка и окружён тремя средними «пальцевыми» доменами. С-домен nrll имеет более сложное строение hi сформирован как С-коицсвой областью полипептидной пепн, так и ее средним участком.

Получение делеционных фрагментов nrl 1.

Для выяснения роли N-Концевого домена nrll в формировании функционально активного тримера белка мы сконструировали плазмидные векторы для экспрессии делешюнных вариантов nrll: Nil 7, NA35. NA44. N Д63 и NA120. укороченных на 17, 35, 44. 63 и 120 а.о.. соответственно, с N-конца полипептиднон цели. Создан также вектор для экспрессии мутанта СД2К с делецией 28 а.о. с С-концевой области молекулы, формирующих 2 [}-тяжа Дтя всех подученных векторов характерен высокий уровень экспрессии, о чем свидетельствуют мажорные полосы соответствующих белков после разделения в Дс-Na ПААГ лизатов клеток BL21(DE3) (рис 9). Белки СД28 и Nil 20 экспресс провались в виде тел включения, а остальные N-кон не вые делеционные мутанты nrll были

Средние доиенм

Рисунок 8. Рентгеновская структура продукта гена II бактериофага Т4. выполненная с разрешением 2,0 A (Leiman et til., 2000)

растворимы Для дальнейшей работы белки N¿[7, N¿35. N¿44 и N¿63 были получены к препарата в пых количествах и очищены до гомогенного состояния на колонке с ГАП. уравновешенной ЮмМ ^-фосфатным б\гфером. рН 7.К.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 Рисунок 9. Электрофоретичеекий анализ в 15%-ной Дс-Na ПААГ рекомбинантных белков после экспрессии (а) и очистки (б): 3 - пг11,4- NA17. 5 -NA35. 6 - NA44. 7 - NA63. 8 -NAI20, 9 - СД28; 1 - белки-маркеры, 2 - лизат клеток E.coli до индукции

Тримеризацня делецнонных фрагментов nrll

Важно отметить, что nrl I. в отличие от пг9: не устойчив к действию Дс-Na. Поэтому для определения ол и го мерности укороченных вариантов nil 1 была проведена гель-фильтрация гомогенных препаратов ре комби н ант и ых белков. В качестве маркера использовали альбумин (молекулярная масса 67 кДа) и хн мотр и пси но ген А (молекулярная масса 25 кДа). близкие к расчётным массам тримера и мономера nrll. соответственно. Мутантные варианты nrll - NA17. NA44 и N ДбЗ - элю про вались с колэнки в объемах, соответствующих их тримерным формам (данные не представлены). Таким образом, делеции в N-концевой области молекулы, как и а случае пг9, не влияют на способность белка к тримеризации, поскольку за тримеризацию ответственен С-домен.

Биологическая активность мутангиых форм пг) I.

Как уже было показано ранее, ре комби нантный пг 11 способен встраиваться в II -частицы фага, придавая им инфекционкость (Курочкина и др.. 2000). Анализ на биологическую активность в системе комплементации in vitro был проведен и с делеционньгми вариантами пг] 1 NA17. NA35. NA44 и NA63 (табл. 4) Для мутанта NA17, как и в случае полноразмерного nrl 1, титр фага возрастал почти на три порядка по сравнению с

отрицательным контролем, что указывает на сохранение белком биологической активности Белки с более протяженными делениями 14-концевой области молеку лы (N435 N444, N463) не восстанавливали инфекционность дефектных частиц Более того, резуьгаты конкурентной комплементации с их участием показали, что мутанты N435, N444 и N463 не втияют на способность полноразмерного белка восстанавтивать инфекционность 11 "-частиц фага Это означает, что они не встраиваются в базальную пластинку фага По-видимому, при удалении от 35 до 63 а о с К'-конца происходят существенные изменения в структуре бел! ов, вследствие чего они теряют свою биологическую активность

Таблица 4 Титр инфекционных частиц фага Т4 при комплементации in vitro 11~-частиц фага полноразмерным nrl 1 и его делеционными вариантами

Рекочбинантный белок Титр фаговых частиц при прямой комплементации (бляшкообразующих частиц/мл) Титр фаговых частиц при конкурентной комплементации (бляшкообразу ющих частиц/мл)

(отрицате тьный контроть) (4,6 ± 0,2) х 108 _

потноразмерный nrll (по тожите тьный контроть) (1 7 ± 0,2) х 10й —

N417 (1,9 ± 0,5) ч 1011 —

N435 (4,5 ± 0 3) х 108 (1,3 ± 0,6) х 10й

N444 (4,1 ± 0,2) х 108 (1,4 ±0,5) х 10й

N463 (5,0 ± 0,3) х 10s (1,8 ±0 2) х 10й

Таким образом, в отличие от пг9, для которого точечные мутации или короткие делении N-концевого сегмента сказываются на функцианальной активности белка, для nrll деления даже 17 N-концевых аминокислотных остатков не влияет на биологическую активность белка Однако, делеции от 35 а о до полного удаления N-концевого домена приводят к полной потере мутантнычи белками их биологической активности

Образование комплексов пгЮ с делеционными вариантами nrll

В процессе морфогенеза фаговой частицы сборка базальной пластинки начинается с образования комплекса между пгЮ и nrl 1 (Phshker et al, 1983) В условиях т vitro эти белки также образуют комплекс Мы проверили способность рекомбинантного пгЮ и делеционных вариантов nrll формировать комплекс т vitro С этой целью экстракты клеток, содержащие рекомбинантные белки, смешивали в соотношении 1 1 и инкубировали в течение 1 ч при 4°, а затем анализировали с помощью электрофореза в неденатурирющих условиях (рис 10А) и последующего иммуноблоттинга (рис 10Б) ПгЮ образует комплекс только с

полноразмерным иг 11 и не образует комплекс нн с одним из делеционных вариантов (данные не представлены), в том числе и с nrll, укороченным на 17 ао. с N-конца. Поскольку мутант N..U7 сохраняет биологическую активность, свойственную пол но размер но му белку, но не образует комплекс с лгЮ, можно предположить, что именно этот участок молекулы иг! 1 и необходим для образования стабильного комплекса с пгЮ in vitro. Не исключено, что данное взаимодействие реализуется и при сборке клина базальной пластинки in vivo в процессе морфогенеза частицы Т4.

А Ь

Комплекс пгЮ - пг11 -пМС три мер -

пг11 тример ■ nr11Nül7 ■ тример

Рисунок 10 А. Элсктрофорсти чес кий анализ в нативном 10% Г1ДА1 рекомбинантных белков I - смесь N.Î17 и пгЮ, 2 смесь nrl 1 и пгК), 3 - полноразмерный nrl 1,4- NA17, 5 - пгЮ.

Б. Иммуноблогтинг рекомбинантньгч белков после разделения в нативном 10% ПААГ: I -смесь nrll и rjrlO; 2 - полноразмерный nrl 1: 3 - пгЮ. Окрашивание моноклонадьным антителом 2D2 к nrl 1 (I) и поликлональной сывороткой на пгЮ (11)

Локализация участка взаимодействия в молекуле ш 10 с nrll

Как было установлено ранее (Zhao ft al„ 2000), стех но метрическое соотношение белков в комплексе пгШ - nrl 1 составляет 3:3, причем пгЮ (602 ао.) так же, как и nrl 1, является тримером В отличие от nrll, рскомбинантный пгЮ формирует устойчивый к Дс-Na гример Как и у nrll, С-домсн пгЮ ответственен за три мер и за цию. Ранее в нашей лаборатории были получены делеционные варианты пгЮ, укороченные на 224, 314 и 395 а о с N-конпа полипептидной ценя (NA224, NA314 и NA395. соответственно) Анализ гретых и негретых препаратов после экспрессии мутантов NA224 и NA3 14 показал, что они. подобно полноразмерному игЮ. формируют устойчивые к Дс-Na гримеры. Однако, мутант NA395 (с

более протяженной делецией) ве образует устойчивый к Дс-Ма тример (данные не приведены). В данном случае, по-видимому, либо нарушается процесс тримеризации белка, либо формируется лабильный по отношению к Дс-Ма тример

Мы изучили способность вариантов пгЮ (N¿224, N¿314 и N¿395) взаимодействовать с полноразмерным нг11 в растворе. Смесь бе.лков после инкубации анализировали с помощью электрофореза в неденатурирющих условиях (рис. 11). Появление дополнительной полосы, соответствующей комплексу двух белков, наблюдается только для мутанта N¿224 (рис. 11, дорожка 2), тогда как в случае других вариантов пгЮ - N¿314 и N¿395 (рис 11, дорожки 3 и 4) - на геле присутствуют только полосы индивидуальных белков. Вероятно, за взаимодействие с щ-Ц отвечает центральная область ег 10 (225-315 а.с) Боке точные сведения об участках взаимодействия двух белков в растворе, а также к базальной пластинке фага будут получены после решения кристаллической структу ры комплекса пгШ-пг11

комплекс _ пгЮ - пгП

комплекс N¿224 - пгГГ

пг11 -

] 23 4 56789

Рисунок 11 Элскгрофоретический анализ в 10%ПААГ: I - пг11, 2 -смеси пг11 и N¿224, 3 -смеси пг11 и N¿314. 4 -смеси пг! I и N¿395, 5 - смеси пг! 1 и Шдноразмерного ПГ 10, 6 - N^224, 7 - N¿314, Я - 9 - по.торазмерпый

пгЮ

Заключение

Как показали результаты сайт-направленного мутагенеза, пг9 встраивается в базальную пластинку своим Ы-доченоч К С-дочену присоединяются длинные хвостовые фибриллы фага На поверхности С-дочена экспонированы три отрицательно заряженных кластера аминокислотных остатков (01и245-С1и-А5р-С1и248) в виде петель На основе расчетной модели базальной пластинки мы предположили, что именно эти участки полипептидной цепи ответственны за взаимодействие с длинными фибриллами Результаты проведенного нами мутагенеза не позволяют однозначно подтвердить или опровергнуть выдвинутое предположение По-видимому, области взаимодействия С-домена с фибриллами не ограничиваются этими петлями

Пг9 образует шарнир, при помощи которого осуществляется перемещение длинных фибритл на частице фага При кислом рН среды или низкой температуре фибриллы отходят в положение «вверх» и прижаты к чехлу и не способны взаимодействовать с рецепторами клетки Находясь внизу, фибриллы свободно осциллируют При инфицировании сигнал от длинных фибрилл после их взаимодействия с рецепторами клетки-хозяина передается на базальную пластинку как механическое напряжение и, возможно, меняет конформацию пг9 Структура этого белка способна к большим изменениям Установлено, что С-концевой домен пг9 при рН 7,5 по сравнению со структурой при рН 4,0 повернут на -20° относительно среднего домена и сдвинут на ~ ЗА (Стрелков С В , не опубликовано) Возможно, при передаче сигнала С-домен сильно меняет свою ориентацию относительно двух других доменов, приводя к повороту М-дочена в базальной пластинке Именно 1Ч-дочен пг9, скорее всего, вследствие изменения положения как «ключ в замке» передает сигнал на пг7 и пг8, а затем на пгЮ и в конечном счете - на пг11, вызывая его поворот вокруг оси третьего порядка, что позволяет коротким хвостовым фибритлам развернуться, достичь поверхности клетки и связаться с ЛПС-рецепторачи клетки При этом происходит трансформация базальной пластинки из формы шатра в плоскую звезду (Ьеипап а/, 2004) Пг11, возможно, непосредственно не участвует в передаче сигнала на короткие фибриллы, а при перестройке базальной пластинки изменяет свое положение под «механическим» воздействием дру гих белков

выводы

1) С помощью сайт-направленного мутагенеза установлено, что продукт гена 9 встраивается в базальную птастинку своим N-доченоч Доказано, что для передачи сигнала с длинных хвостовых фибритл на бетки базальной птастинки при инфицировании необходим интактный N-дочен прод> кта гена 9

2) Тримеризация продукта гена 9 происходит пост-транстяционно Установтено, что С-концсвые аминокислотные остатки (Gin 282, Lys283 и Ие284) играют важную роль в стабилизации тричера

3) Впервые дтя продукта гена 9 были получены температуро-чувствительные мутации, вчияющие на фочдинг белка Замены Gln282—>Рго и Gln282—»Arg приводят к формированию телец включения при 37°С, но растворимых и функционально активных белков при 25°С Обнаружена мутация (замена Glnl70—>Рго), с\ прессирующая температуро-чувствительный эффект замены Gln282—»Pro

4) Первые 17 аминокислотных остатков продукта гена 11 не существенны для функциональной активности белка, однако, ответственны за взаимодействие с центральной областью тричера продукта гена 10 in vitro Выдвин}та гипотеза о том, что именно с этого взаимодействия двух белков начинается сборка базальной птастинки в процессе морфогенеза частицы фага Т4 т vivo Бочее протяженные N-концевые детеции продукта гена 11 (от 35 до 63 аминокислотных остатков) не влияют на тричеризацию бетков, но приводят к существенным нарушениям их структуры и потере биологической активности

Список опубликованных работ

1 Вишневский А Ю , Курочкина Л П , Сыкилинда H H, Соловьева H В , Шнейдер ММ, ЛейчанПГ, Месяижинов В В Функциональная роль амииокоицевого домена продукта гена 11 бактериофага Т4 Биохимия 2005, 70(10), 1111-1118

2 Lidia Р Kurochkma, Alexandr Vu Vishnevsky Lyuba V Zhemaeva, Nina N Sykihnda, Vadim V Mesyanzhmov Structure, stability, and biological activity of bactenophage T4 gene product 9 probed with mutagenesis and monoclonal antibodies J Struct Biol 2006, 154(2), 122-129

3 Сахарова О В , Вишневский А Ю "Конфорчационные изменения nrll"

XVI зимняя молодежная нау чная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, 9-12 февраля 2004 г (тезисы докладов и стендовых сообщений, стр 40)

4 Бигельдеев А Ю , Вишневский А Ю Курочкина Л П Месянжинов В В "Экспрессия и очистка де леционного варианта проду кта гена 10 бактериофага Т4" XLVII научная конференция Московского физико-технического института, Москва, 23-27 ноября 2004 г (тезисы докладов и стендовых сообщений, стр 37)

5 Вишневский А Ю , Курочкина Л П , Сыкилинда H H, Месянжинов В В "Изучение продукта гена 9 бактериофага Т4 - триггера процесса инфицирования" VIII чтения, посвященные памяти академика Ю А Овчинникова, Москва, 25-27 октября 2006 г (тезисы докладов и стендовых сообщений, стр 77)

6 Вишневский А Ю , Курочкина Л П "Роль карбоксиконцевого домена в фолдинге и олигомеризации продукта гена 9 бактериофага Т4" XIX зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, 7-9 февраля 2007 г (тезисы докладов стр 11)

Список сокращений

Е coli - Escherichia coli

Sil-мутации - супрессорные мутации (su - supressor)

Tsf - температуро-чу вствите льные му тации, влияющие на фо лдинг

(temperature-sensitive folding)

а о - аминокислотный остаток

ГАП - гидроксилаппатит

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

Дс-Na - додецилсутьфат натрия

кДа - килодальтон

ЛПС - липополисахаридные рецепторы ПААГ - полиакриламидный гель пг — проду кт гена

ПЦР - полимеразная цепная реакция ЭДТА - этилендиаминтетраацетат натрия

Подписано в печать 27 апреля 2007 г

Формат 60x90/16

Объем 1,5 п т

Тираж 75 экз

Заказ № 27040766

Оттиражировано на ризографе в ООО «УниверПринт» ИНН/КПП 7728572912Y772801001

Адрес 117292, г Москва, ул Дмитрия У тьянова, д 8, кор 2 Тет 740-76-47, 125-22-73 http //wavw uruverprint ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Вишневский, Александр Юрьевич

Список сокращений.

Введение.

Актуальность проблемы.

Цели и задачи работы.

Научная новизна и практическая ценность работы.

Обзор литературы.

Бактериофаг Т4.

Продукт гена 9.

Продукт гена 11.

Назальная пластинка бактериофага Т4.

Структурная реорганизация базальной пластинки при инфицировании.

Морфогенез базальной пластинки.

Фолдинг белка.

Две гипотезы механизма сворачивания полипептидной цепи.

Гипотеза нуклеации и роста.

Сворачивание с образованием кинетических интермедиатов.

Фолдинг белка в клетке.

Пост- и ко-трансляционный фолдинг.

Шапероны.

Роль рибосомы в ко-трансляционном фолдинге.

Ферменты, ускоряющие процесс сворачивания.

Изучение фолдинга хвостового шипа бактериофага Р22 Salmonella typhimurium.

Свойства хвостового шипа.

Термолабильные интермедиаты фолдинга и образование телец включения.

Температуро-чувствительные мутации, приводящие к нарушению фолдинга.

Супрессорные мутации.

Изучение рефолдинга белка in vitro.

Побочные интермедиа™ и тельца включения, исследуемые in vitro.

Формирование нативного тримера из телец включения.

Фолдинг БХШ определяет температуру инфицирования фага.

Временные дисульфидные связи в протримере.

Изучение хвостового шипа с помощью моноклональных антител.

Различие между путями фолдинга in vivo и in vitro.

С-домен необходим для тримеризации шипа.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Бактериальные штаммы.

Среды для выращивания бактерий и бактериофагов.

Приготовление компетентных клеток.

Трансформация компетентных клеток Е. coli плазмидной ДНК.

Экспрессия рекомбинантных белков в клетках Е. coli BL21(DE3).

Приготовление экстрактов клеток, содержащих рекомбинантные белки.

Амбер-мутанты фага Т4.

Приготовление дефектных частиц фага Т4.

Комплементация in vitro.

Выделение и очистка рекомбинантных белков.

Электрофорез белков в полиакриламидном геле.

Иммуноблоттинг.

Гель-фильтрация.

Векторы для клонирования.

Конструирование плазмидных векторов.

Выделение и очистка плазмидной ДНК.

Полимеразная цепная реакция.

Очистка фрагментов, амплифицированных с помощью ПЦР.

Клонирование фрагментов гена 11.

Клонирование гена 9* для экспрессии мутанта пг9*РО.

Конструирование векторов для ко-экспрессии пг9 и его делеционных вариантов 58 Конструирование плазмидных конструкций для экспрессии мутантов пг9 с заменами 01п282.

Конструирование плазмидной конструкции для экспрессии мутанта с заменой

ИпПО-» Рго.

Конструирование плазмидных конструкций для экспрессии мутантов пг9 с заменами в области 01и245-01и248.

Конструирование плазмидных конструкций для экспрессии мутантов пг11 с заменами в области Азп203-01п205.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

Комплементация дефектных частиц фага продуктами генов 9 и 11.

Изучение продукта гена 9 бактериофага Т4.

Мутагенез Ы-концевого сегмента пг9.

Мутант пг9*РО.

Ко-экспрессия пг9 и его делеционного варианта МД20.

Ко-экспрессия пг9 и его делеционных вариантов ЫА54, ЫА167 и СД113.

С-концевые делеционные мутанты пг9.