Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Транскрипционные стратегии phiEco32-подобных бактериофагов

ВАК РФ 03.01.07, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Транскрипционные стратегии phiEco32-подобных бактериофагов"

на правах рукописи

Лавыш Дарья Геннадиевна

Транскрипционные стратегии рЫЕсо32-подобных бактериофагов

специальность (03.01.07) - молекулярная генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

3 1 ОКТ 2013

МОСКВА-2013

005536670

Работа выполнена в Лаборатории регуляции экспрессии генов мобильных элементов прокариот Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной генетики Российской академии наук и в Лаборатории молекулярной генетики микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биологии гена Российской академии наук.

Научный руководитель: Северинов Константин Викторович, доктор

биологических наук, профессор

Официальные оппоненты: Миронов Андрей Александрович,

доктор биологических наук, профессор, заведущий лабораторией биоинформатики, факультет Биоинженерии и Биоинформатики, Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский Государственный Университет им.М.В. Ломоносова"

Летаров Андрей Викторович, кандидат биологических наук, заведующий лабораторией вирусов микроорганизмов, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт микробиологии им. С.Н.Виноградского Российской академии наук

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук

Защита диссертации состоится ноября 2013 г. час. 00 мин. на заседании

диссертационного совета Д 002.037.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биологии гена Российской академии наук по адресу: г. Москва, ул. Вавилова дом 34/5, первый этаж.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук (ИМБ РАН), по адресу 119 991, г, Москва, ул. Вавилова, д.32.

Автореферат разослан октября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат фармацевтических наук

гских наук

^ хп С Грабовская Любовь Сергеевна

2

Общая характеристика работы

Актуальность работы. На сегодняшний день отсеквенировано около 1500 бактериофагов, геном которых представлен двухцепочечной ДНК. Геномы фагов очень быстро эволюционируют. Параллельно эволюционируют защитные механизмы бактерий. Изучение механизмов, которые используются бактериофагами для преодоления защитных клеточных функций и обеспечения экспрессии фаговых генов за счет систем клетки-хозяина не только расширяют наши знания о вирусах, но и позволяют получить данные о работе жизненно важных бактериальных ферментов и, в частности, о возможности их ингибирования. Данная работа посвящена исследованию механизмов регуляции транскрипции у недавно выделенной группы рЫЕсо32-подобных бактериофагов. На основании имевшихся к началу настоящей работы данных можно было предполагать, что в экспрессии генов всех рЫЕсо32-подобных фагов принимает участие закодированный в вирусном геноме сг-фактор. Белок gp36 - ст-фактор бактериофага phiEco32 был частично охарактеризован к началу данной работы1. В ходе нашей работы был охарактеризован белок gp47 - сг-фактор бактериофага 7-11, который является наиболее удаленным родственником фага phiEco32. Несмотря на то, что последовательности промоторов, узнавание которых обеспечивается gp47, отличаются от gp36-np0M0Tp0B, использованный в работе метод сравнительного анализа оперонной организации геномов бактериофагов позволил идентифицировать и охарактеризовать промоторы фага 7-11 и изучить динамику накопления мРНК, синтезированной с этих промотров.

В геномах бактериофагов группы phiEco32 произведен поиск генов, кодирующих ингибиторы хозяйской РНК-полимеразы. В геномах фагов, близкородственных phiEco32, обнаружен ген, кодирующий гомолог ранее охарактеризованного ингибитора транскрипции gp79 фага phiEco32. Для эволюционно более далеких фагов подгруппы 711 идентифицирован новый фактор, который, возможно, способствует диссоциации

1 Savalia D., Westblade L.F., Goel М., Florens L., Kemp Р., Akulenko N.. Pavlova O., Padovan J.C., Chait B.T., Washbum M.P., Ackermann H.-W., Hushegian A., Gabisonia Т., Molineux I., Severinov K. (2008) Genomic and proteomic analysis of phiEco32, a novel Escherichia coli bacteriophage. J. Mol. Biol. 377:774 -789

холофермента РНК-полимеразы, содержащей основную ст-субъединицу бактерий, тем самым стимулируя образование холофермента, содержащего ст-фактор фага. На основании полученных данных можно выдвинуть общие предположения о стратегии регуляции транскрипции у фагов рЫЕсо32-группы, количество известных представителей которой быстро увеличивается.

Цели работы. Основной целью данной работы являлось изучение транскрипционных стратегий рЫЕсо32-подобных бактериофагов. В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:

1) Идентифицировать и изучить динамику накопления транскриптов ранних ст?1)-зависимых промоторов бактериофага рЫР.со32 в ходе инфекции и изучить механизм переключения транскрипции со средних на поздние §р36-зависимые промоторы фага.

2) Провести биоинформатический анализ геномов всех известных на сегодняшний день рЫЕсо32-подобных фагов.

3) Изучить временную регуляцию экспрессии генов рЫЕсоЗ 2-подобно го бактериофага 7-11. Доказать функциональную активность ст-фактора, закодированного в геноме бактериофага 7-11, определить промоторную последовательность, узнаваемую холоферментом РНК-полимеразы, содержащим этот фактор, и провести поиск дополнительных факторов транскрипции, закодированных в геноме бактериофага 7-11.

Научная новизна. На основании ранее полученных данных и результатов данной работы, охарактеризован процесс регуляции транскрипции бактериальных и фаговых генов в ходе инфекции бактериофагом рЫЕсо32. Впервые охарактеризован сигма фактор §р47, закодированный в геноме бактериофага 7-11, и определены промоторы, узнаваемые холоферментом РНК-полимеразы, содержащим gp47. Идентифицированы ст70-промоторы бактериофагов рЫЕсо32 и 7-11. Получены данные, указывающие на то, что белок gp98 бактериофага 7-11, возможно, является анти-сигма-фактором и обеспечивает переключение ранней транскрипции на позднюю gp47-зaвиcимyю транскрипцию.

Практическая значимость работы. Полученные в данной работе результаты имеют в основном фундаментальное значение, однако некоторые из них могут найти и практическое применение. Результаты исследования расширяют представления о транскрипционных стратегиях бактериофагов, о промоторах альтернативных сг-факторов и механизмах взаимодействий белков бактериофагов с РНК-полимеразой бактерий. Охарактеризованные в данной работе белки в перспективе могут быть использованы для создания ингибиторов бактериальной РНК-полимеразы.

Публикации н апробация работы. Работа прошла апробацию на Ученом совете Института молекулярной генетики РАН. По теме диссертации опубликовано б печатных работ, включая 2 статьи в международных рецензируемых журналах. Результаты работы были представлены на 4 конференциях, в том числе на трех тематических международных конференциях "Microbial Viruses", "Viruses of Microbes" и "5th Congress of European Microbiologists (FEMS 2013)".

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 105 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературных данных, материалы и методы, результаты и обсуждение, выводы и список цитируемой литературы. Список литературы включает 185 источников. Работа содержит 26 рисунков и 4 таблицы.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Определение активности сг7"-зависимых промоторов в ходе инфекции бактериофагом

phiEco32

В нашей лаборатории было показано, что ранние РНК бактериофага phiEco32 синтезируются с 5-ой по 10-ую минуты инфекции. Мы предположили, что их синтез осуществляется с с7"-зависимых промоторов. Их поиск осуществляли программой Genome Explorer2, используя паттерн, описывающий -10 и -35 элементы ст™-промоторов. Последовательности, похожие на а70-промоторы, были обнаружены перед генами 37, 57,

2 Mironov АА, Vinokurova NP, Gel'fand MS. Software for analyzing bacterial genomes. Mol fíiol

(Mosk) 2000;34:253-262.

124 и 128. Для экспериментального подтверждения того, что эти последовательности являются о70-промоторами, тотальная РНК, выделенная из зараженных фагом phiEco32 клеток, была проанализирована методом удлинения праймера. В качестве праймеров использовали олигонуклеотиды, комплементарные участкам ДНК phiEco32, расположенных поблизости от предсказанных ст70-промоторов. В качестве контроля и для того, чтобы подтвердить предположение об ингибировании хозяйских генов в процессе инфекции, анализировали активность а70-промоторов, расположенных перед бактериальными генами отрХ и rpsU с использованием соответствующих праймеров. Продуктов удлинения праймеров, отжигающихся перед генами 57 и 37, обнаружено не было. Однако, был обнаружен продукт удлинения праймера, отжигающегося перед предсказанным промотором внутри гена 128 и три продукта удлинения праймера, отжигающегося перед предсказанными промоторами гена 124. Также были обнаружены продукты удлинения праймеров, специфичных к хозяйским генам. 5'-концы РНК, соответствующих всем обнаруженным продуктам реакции удлинения праймеров, находились на расстоянии около 10 нуклеотидов от -10 элементов предсказанных промоторов phiEco32, что подтверждает результаты предсказаний.

Динамика накопления транскриптов фага, синтезирующихся с идентифицированных ст70-промоторов, соответствует раннему классу, так как наибольшее количество РНК детектируется на 5-10 минутах инфекции, а во время средней и поздней стадий инфекции ст70-транскрипты как бактерии-хозяина, так и ранних генов фага не детектируются. Данные динамики накопления РНК ранних генов подтверждают данные, ранее полученные методом дот-гибридизации.

Таким образом, ранние гены phiEco32 транскрибируются ст70-холоферментом РНК-полимеразы как минимум с 4-х промоторов фага. На поздних стадиях инфекции происходит ингибирование активности ст70-промоторов как бактерии-хозяина, так и ранних промоторов фага.

2. Изучение регуляции активности средних и поздних ерЗб-зависимых промоторов бактериофага phiEco32

В геноме бактериофага phiEco32 присутствуют шесть промоторов, узнаваемых холоферментом РНК-полимеразы, содержащим а-фактор gp36, закодированный в геноме

бактериофага. Несмотря на то, что все эти промоторы имеют практически идентичный

консенсусный элемент TAATGTATA в -10 области, данные промоторы расположены и

перед средними, и перед поздними генами. Таким образом, возникает вопрос, как

достигается отличающийся временной профиль активности средних и поздних генов. В

ходе данной работы нами проведен детальный анализ временной экспрессии gp36-

зависимых генов бактериофага. На рисунке 1 (дорожки 1-5) показана динамика

накопления gp36-3aBHCHMbix средних и поздних транскриптов фага в ходе инфекции. Как

видно, продукты средних промоторов детектируются на 15-ой минуте инфекции, их

количество достигает максимума к 20 минутам, а затем резко уменьшается. Продукты

поздних промоторов детектируются с 20-ой минуты инфекции и продолжают

накапливаться до 30-ой минуты, когда начинается лизис зараженных клеток.

Рис. 1. СрЗб-зависимая транскрипция in vivo без/с добавлением хлорамфеникола.

Анализ транскрипции с промоторов Рб, Р,з, Ргб, Рад, Р58 и Р68| проводили методом удлинения праймера с использованием РНК, выделенной из инфицированных клеток (время инфекции указано над рисунком). Слева представлены данные без добавления хлорамфеникола, справа - с добавлением хлорамфеникола на 12 минуте инфекции. Слева от рисунка подписаны промоторы, соответствующие продуктам реакции удлинения праймера (зеленым -средние, красным - поздние). Анализ продуктов реакции проводили в 6% ПААГе, содержащем 8 М мочевину, с последующей радиоавтографией.

Мы предположили, что различную динамику средних и поздних промоторов может обеспечивать дополнительный транскрипционный фактор. На рисунке 1 (дорожки 2'-5') показана динамика накопления средних и поздних транскриптов phiEco32 в клетках, обработанных ингибитором трансляции хлорамфениколом на 12-ой минуте инфекции. Сравнение динамики транскриптов из обработанных и необработанных хлорамфениколом клетках показывает, что ингибирование синтеза средних белков приводило к продолжающемуся накоплению средних транскриптов. Динамика поздних транскриптов

время инфекции (мин.)

Ст

существенно не изменялась, однако количество этих транскриптов было ниже, чем в эксперименте без хлорамфеникола (скорее всего это обусловлено ингибированием синтеза белков репликации, т.е. меньшим количеством ДНК матриц для транскрипции). Таким образом, полученные данные указывают на то, что продукт одного из средних генов phiEco32 специфически ингибирует транскрипцию средних генов в поздний период инфекции.

3. Общая схема регуляции транскрипции генов в ходе инфекции бактериофагом phiEco32

На основании полученных в нашей лаборатории данных можно предложить следующую общую схему регуляции транскрипции генов бактериофага phiEco32. Ранние гены фага экспрессируются как минимум с 4-х промоторов, узнаваемых о70-холоферментом РНК-полимеразы. Далее синтезируется ингибитор с70-транскрипции - белок gp79 (продукт раннего гена). Скорее всего, именно он осуществляет ингибирование ст70-транскрипции как хозяйских генов, так и ранних генов фага1. Ген 36, скорее всего, экспрессируется с ранних а70-промоторов, а затем холофермент, содержащий gp36, транскрибирует свой собственный ген с промотора перед геном 40, а также другие средние гены с промотора, расположенного перед геном 68. Далее транскрипция средних gp36-3aBHCHMbix генов ингибируется за счет действия фактора, выявленного в ходе эксперимента с добавлением хлорамфеникола, после чего холофермент РНК-полимеразы, содержащий gp36, осуществляет транскрипцию только с поздних промоторов, расположенных перед генами 6, 13, 26 и 58. Вопрос о том, что обеспечивает более позднее включение поздних промоторов и в чем заключается дифференциальная чувствительность средних и поздних промоторов к ингибитору средней транскрипции остается открытым.

3. Сравненительный анализ организации геномов рЫЕсо32-подобных фагов

Геном бактериофагов 7-11 и phiEco32 представлен двухцепочечными ДНК. Размер генома бактериофага 7-11 составляет 89919 пн3 против 77554 пн у phiEco32. Бактериофаги phiEco32 и 7-11 инфицируют филогенетически близкие энтеробактерии - штамм Escherichia

3 Kropinski A.M., Litigohr E.J., Ackermann H.-W. (2011) The genome sequence of enterobacterial phage 7-11, which possesses an unusually elongated head. Arch Virol. 156(1): 149-51.

coli 55 и Salmonella enterica серовар Newport, соответственно. Сравнение генома бактериофагов 7-11 и ph¡Eco32 обнаруживает, что продукты 34 генов (20%) фага 7-11 гомологичны белкам бактериофага ph¡Eco32.

Все гены бактериофага 7-11, которые являются гомологами генов бактериофага phiEco32, расположены в том же порядке, что и соответствующие гены фага phiEco32. Первый кластер - это поздние гены, кодирующие структурные белки и белки упаковки ДНК, они экспрессируются в одном направлении и занимают около 1/3 генома у обоих фагов. Второй кластер — средние гены, среди которых находятся предсказанные гены ДНК-полимеразы, белков нуклеотидного обмена, а-субъединиц и др. Кластер ранних генов представлен генами, которые не имеют гомологов в базах данных. Средние и ранние гены транскрибируются в противоположном относительно кластера поздних генов направлении.

Во время проведения наших исследований бактериофагов phiEco32 и 7-11, были опубликованы геномы еще трех родственных бактериофагов:

(1) Бактериофаг NJ01 инфицирует энтеробактерию Serratia marcescens. Геном этого фага имеет длину 77448 пн. В геноме аннотировано 136 открытых рамок считывания4.

(2) Бактериофаг KBNP135 инфицирует штамм Е. coli КВР135. Геном этого фага имеет длину 77315 пн. В геноме аннотировано 115 открытых рамок считывания5.

(3) В базе данных геномов NCBI так же появился геном р1пЕсо32-подобного бактериофага, инфицирующего Cronobacter sakazakii, - vB_CsaP_GAP52 (далее - "GAP52"). Геном имеет длину 76631 пн. В геноме аннотировано 115 открытых рамок считывания.

На основании филогенетического анализа рЫЕсо32-подобных фагов мы сделали вывод, что phiEco32 и NJ01 являются близкими родственниками, а 7-11 и GAP52 формируют отдельную подгруппу названную нами "подгруппой 7-11". Бактериофаг KBNP135 занимает промежуточное положение, однако, основываясь на анализе продуктов генов фага, мы отнесли его к "подгруппе phiEco32". Результаты анализа геномов всех известных на сегодня phiEco32-

4 Li Y, Chen M, Tang F, Yao H, Lu C, Zhang W. (2012) Complete genome sequence of the novel lytic

avian pathogenic coliphage NJ01. J Virol. 86(24): 13874-5.

5 Nho SW, Ha MA, Kim KS, Kim TH, Jang HB, Cha IS, Park SB, Kim YK, Jung TS. (2012) Complete

genome sequence of the bacteriophages ECBP1 and ECBP2 isolated from two different Escherichia coli

strains. J Virol. 86(22): 12439-40.

подобных фагов представлены на рисунке 3. Гены отнесены к определенному временному классу, основываясь на экспериментальных данных для генов фага рЫЕсо32. Если ген не имеет гомолога, он не раскрашен. Гомологи между подгруппой рЫЕсо32 и 7-11 соединены линиями, проведенными между генами фагов. Как видно из рисунка 3, наиболее консервативной является зона поздних генов, а наиболее вариабельной - зона ранних генов.

Ук>»в=>Е=>«=> с

«Н4Я1 ¿ м^а^а

■•: я

«4« ♦ И«/""'" «а '

Рис. 3. Сравнение геномов рЫЕсо32-подобных бактериофагов. Схематично представлены геномы фагов рЫЕсо32 (N0 010324. П. Ш01 (N0 018835.1), КВМ>135 тс 018859.П. 7-11 ЛЧС 015938.П и вАР52 (N0 019402.П. Гены обозначены стрелками, идентифицированные в ходе данной работы ст70-промоторы и промоторы сигма факторов бактериофагов - флажками. Цвет генов соответствует предполагаемой стадии экспрессии данного гена, основываясь на данных для бактериофага рЫЕсо32. Гомологи внутри группы р^ЕсоЗг и внутри подгруппы 7-11 раскрашены в цвет, а гомологи 7-11 и рЖЕсо32 соединены линиями. Гены, кодирующие транскрипционные факторы, обозначены фиолетовым (дрЗб и его гомологи), розовым (др47 и его гомолог), и оранжевым (др79 и его гомологи).

4. Биоинформатический анализ транскрипционных стратегий рЫЕсо32-подобных

бактериофагов

Все рЫЕсо32-подобные бактериофаги кодируют ЕСЕ ст-фактор. Сигма факторы, кодируемые Ш01 и КВ№135, практически идентичны gp36 фага рЫЕсо32. В геноме рЫЕсо32-подобных бактериофагов №01 и КВКР135 идентифицируются последовательности, идентичные консенсусу §р36-промотора рЫЕсо32. Каждая из таких последовательностей находится перед генами, гомологичными первым генам средних или поздних оперонов рЫЕсо32 (таблица 1) и, следовательно, тоже играет роль gp36-пpoмoтopa в этих фагах. Все найденные промоторы очень консервативны. Удивительно, что варианты §р36-промотора рЫЕсо32 TAATGTAgA и аААТСТАТА встречаются именно перед гомологами генов 6 и 68, соответственно, во всех проанализированных геномах, что может указывать на их функциональное значение (однако данный полиморфизм не может обеспечивать функциональную разницу между средними и поздними промоторами фагов).

рИЕсозг промотор Ш01 промотор КВЫР135 промотор

рг 6 ТААТОТАдА рг 16 ТААТСТАдА рг 4 ТААТСТАдА

рг 13 ТААТСТАТА рг 22 ТААТСТАТА рг 11 ТААТСТАТА

рг 26 ТААТСТАТА рг 36 ТААТСТАТА рг 24 ТААТСТАТА

рг 40 ТААТОТАТА рг 49 ТААТСТАТА рг 35 ТААТСТАТА

рг 58 ТААТСТАТА рг 67 ТААТСТАТА рг 54 ТААТСТАТА

рг 68 аААТСТАТА рг 82 аААТСТАТА рг 66 аААТСТАТА

Таблица 1. Средние и поздние промоторы бактериофагов подгруппы рМЕсо32, узнаваемые холоферментом РНК-полимеразы, содержащим дрЗб рЫЕсоЗг, или соответствующий гомолог.

Цветом показаны принадлежность промотора к определенному временному классу: красный -позднему, зеленый - среднему.

Аминокислотная последовательность ст-фактора бактериофага 7-11 - белка gp47 сильно отличается от последовательности gp36 рЫЕсо32 и его ближайших родственников. Тем не менее §р47 может играть ту же роль в развитии фага 7-11, что gp36 - в развитии рЫЕсо32. Предсказанный сигма фактор бактериофага ОАР52 родственен §р47, однако их последовательности различаются друг от друга больше, чем последовательности §р36-подобных белков фагов рЫЕсо32 подгруппы.

В геномах фагов N101 и КВМР135 так же присутствует гены, кодирующие гомологи ингибитора ст70-транскрипции - gp79 (рисунок 3), однако подобных генов в геномах 7-11 и ОЛР52 не обнаруживается.

На основании проведенного сравнения, нами сделано предположение, что транскрипционная стратегия бактериофага 7-11 по ряду моментов отлична от ранее изученной

нами транскрипционной стратегии бактериофага phiEco32.

5. Идентификация ар47-промоторов бактериофага 7-11

На основании того, что пять из шести генов фага рЫЕсо32, перед которыми расположены gp36-пpoмoтopы, имеют гомологов в геноме фага 7-11, было выдвинуто предположение о том, что в некодирующих участках непосредственно перед этими генами фага 7-11 или перед первыми генами оперонов, в состав которых входят эти гены-гомологи, находятся яр47-промоторы, обеспечивающие среднюю и позднюю транскрипцию фага. Для проверки этого предположения, была предсказана оперонная структура предполагаемых средних и поздних генов 7-11 (таблица 2) и идентифицированы межгенные участки, в которых могли бы находиться промоторы.

phiEco32 7-11

гомолог оперон

gp06 gpOl 1-8 (/9)

gpl3 gpl2 8-15 9-15

gp26 - 16-24 (/30) 24-30

gp40 gp48 48-31

gp58 gp68 71-54 (/52/49) 81-54 (/52/49)

gp68 gp78 81-54 (/52/49)

Таблица 2. Предсказание оперонов для поздних и средних генов бактериофага 7-11. В скобочках указаны возможные альтернативные границы оперона.

Выбранные межгенные участки фага 7-11, указанные в таблице 2, не содержали мотивов, похожих на промоторные элементы известных бактериальных промоторов или gp36-промоторов. Для экспериментального подтверждения существования промоторов перед предсказанными оперонами поздних и средних генов 7-11 была выделена тотальная РНК из незаражеииой культуры Salmonella Newport, а также из зараженной культуры на 5-ой, 10-ой, и далее каждые 10 минут до 60-ой минуты инфекции, когда зараженные клетки начинали лизировать. Активность всех предполагаемых промоторов проверили методом удлинения праймеров. На рисунке 4 представлены результаты реакций удлинения тех праймеров, для которых удалось обнаружить продукты реакции удлинения. Как видно из рисунка, продукты

удлинения праймеров наблюдались в межгенных участках перед генами I, 8, 16 и 48. Кинетика накопления продуктов соответствовала позднему классу экспрессии (продукты накапливаются начиная с 40 минуты инфекции и присутствуют вплоть до конца инфекции).

суммарная РНК время после инфекции

(мин.)

праймер

К гену: 48 16 8 1 0 5 10 20 30 40 50 60

Рис. 4. Анализ экспрессии поздних генов бактериофага 7-11 во время инфекции Salmonella Newport.

Продукты РНК с предполагаемых др47-промоторов Р-,, Р8| Р16 и Р48 идентифицировали методом удлинения праймера с использованием РНК, выделенной из инфицированных клеток (время инфекции указано над рисунком). Слева нанесены продукты реакций удлинения индивидуальных праймеров, специфичных к различным генам 7-11 (продукты подписаны сбоку), на тотальной суммарной РНК, выделенной из зараженных клеток. Продукты реакций удлинения праймеров указаны стрелочками.

б. Определение консенсусной последовательности поздних промоторов 7-11

Для определения точек транскрипционного старта продукты реакции удлинения праймера на тотальной РНК, выделенной до инфекции и на 40-ой минутах инфекции, были нанесены рядом с соответствующими сиквенс-реакциями (рисунок 5). На основании выравнивания последовательностей перед 5'-концами определенных продуктов реакции удлинения праймеров удалось выявить консенсус, состоящий 2-х элементов: GTAA и СТА. Данный консенсус является слабым, что объясняет почему он не мог быть найден биоинформатически избыточно параметризированными программами поиска мотивов без дополнительной экспериментальной информации. Можно предположить, что данный консенсус соответствует последовательности, узнаваемой холоферментом РНК-полимеразы, содержащим gp47. В таком случае, стартовая точка транскрипции находится на расстоянии 6

пн от консенсус элемента СТА предполагаемых промоторов Pi, Ps, Pió и на 4 пн для промотора Р48.

О' 40" с Т A G 0" 40* с Т А в 0' 40' с Т А в

О1 40" с Т A G

В?

«■»»i

Fi

z-*^ - -в« *

jSgj

Йг

I ií

П Un é

í W

agtgtatcag tgtaatgtttt

tctttaatcag

ctactcctta agtaattttttaacaaaaccgc tacttaaatg tgtaagtattg tcacggattgi

-gctata

tagagtaatt tgtaaggctatgtaacaaaacg tactaga atagta

:actaatJtttatG ractaaa caatAta

Рис. 5. Стартовые точки транскрипции и консенсус промоторной последовательности поздних генов бактериофага 7-11.

(а) Продукты сиквенс-реакций и продукты реакции удлинения праймеров, полученные на тотальной РНК, выделенной на 0 и 40 минуте инфекции разделяли электрофорезом в 6% ПААГе, содержащем 8М мочевину с последующей визуализацией результатов с помощью фосфо им иджера.

(б) Консенсус промоторной последовательности, высота каждой буквы соответствует степени ее консервативности. Внизу приведены нуклеотидные последовательности перед стартами транскрипции генов 1, 8, 16, 48, красным отмечены стартовые точки транскрипции, выделены консенсусные элементы позднего промотора.

7. Ср47 является сг-фактором. обеспечивающим позднюю транскрипцию 7-11

Наиболее близкородственными белками для gp47 являются предсказанные а-субъединицы бактерий Planctomyces brasiliensis, Bacillus azotoformans и Vibrio alginolyticus. Интересно, что gp36 является более дальним гомологом gp47, чем белки из бактерий, указанных выше. Чтобы убедится в том, что gp47 действительно взаимодействует с РНК-

полимеразой, мы клонировали ген 47 в экспрессионный вектор рЕТ19Ь, наработали и очистили рекомбинантный белок gp47 с 6-ю гистидинами на С-конце. Методом нативного гель-электрофореза мы показали, что рекомбинантный белок gp47 действительно связывается с

Рис. 6. Транскрипция, обусловленная холоферментом РНК-полимеразы с белком др47, с участков ДНК перед генами 1, 8, 16 и 48 бактериофага 7-11.

Транскрипцию in vitro проводили в присутствии фермента РНК-полимеразы (core), ст70-холофермента РНК-полимеразы (а70+соге), а70-холофермента РНК-полимеразы с добавлением др47 (3 мкМ), др47-холофермента РНК-полимеразы с разной концентрацией др47 (3, 6 мкМ) и др47-холофермента с добавлением ингибитора а70-транскрипции фага phiEco32 - др79. Продукты разделяли электрофорезом в 6% ПААГе, содержащем 8М мочевину, с последующей визуализацией результатов с помощью фосфоимиджера.

Далее активность gp47 была проверена in vitro на матрицах ДНК, содержащих последовательности перед генами /, 8, 16 и 48. Как видно из рисунка 6 (дорожка 4), при добавлении gp47 к кор-ферменту РНК-полимеразы Е. coli наблюдалось появления ярких полос, соответствующих специфической инициации транскрипции. Далее были проведены реакции удлинения соответствующего праймера с РНК, синтезированной in vitro. Точки старта, определенные ранее для поздней РНК фага в зараженных клетках, совпадали со стартовыми точками, наблюдаемыми in vitro. Полученный результат не только подтверждает наше теоретическое предположение о наличии gp47-3aBHCHMoro промотора перед генами I, 8, 16 и 48, но и доказывает, что gp47 действительно является а-фактором, ответственным за позднюю транскрипцию фага.

8. Определение области плавления ар47-промотора

Мы проанализировали область плавления поздних промоторов 7-11 в присутствии

кор-ферментом РНК-полимеразы Е. coli.

о<е „*<• „>.<• „ /л

холофермента РНК-полиыеразы с gp47 методом перманганатного футпринта. Для всех исследованных промоторов область плавления ДНК включает в себя стартовую точку транскрипции, а также район консенсусной последовательности в районе -6.

р, ! Р, ■ * Р,

Рис. 7. Определение области плавления промоторов поздних генов фага 7-11 в присутствии сигма-фактора др47.

Продукты перманганатного футпринтинга на ДНК (-), на ДНК, инкубированной с РНК-полимеразой (core), и на ДНК, инкубированной с др47-РПК-полимеразой (соге+др47). Справа указана последовательность ДНК, красным отмечена область плавления (в соответствии с реакцией секвенирования). Продукты разделяли электрофорезом в 6% ПААГе, содержащем 8М мочевину с последующей визуализацией результатов с помощью фосфоимиджера.

9. Определение аффинности gp47 к РНК-полимеразе

Аффинность gp47 к РНК-полимеразе была проанализирована в опытах по конкуренции с флуоресцентно меченной сг7"-субъединицей за взаимодействие с кор-ферментом РНК-полимеразы. Так как в составе холофермента флуоресцентно меченный район ст7"-субъединицы находится рядом с сайтом связывания с рифампицином, флуоресценция а7"-субъединицы уменьшается при образовании холофермента (за счет тушения флуорофора рифампицином, черная кривая на рисунке 8). Как и ожидается, степень тушения флуоресценции а™-субъединицы зависит от взаимных количеств кор-фермента и а7"-субъединицы (красная кривая). Синяя кривая показывает, что если связанный с рифампицином кор-фермент прединкубировать с gp47, а потом добавить меченную а70-субъединицу, то тушения не наблюдается т.к РНК-полимераза уже связана с gp47. Даже после 1 часа

совместной инкубации о7"-субъединица не связывается с РНК-полимеразой. Если РНК-полимеразу-рифампицин добавить к прединкубированным о7"-субъединице и gp47, то тушение флуоресценции происходит (зеленая кривая), но оно не намного меньше, чем то, которое наблюдается при том же соотношении а7"-субъединицы и кор-фермента, но в отсутствии gp47 (красная кривая). Так как опыт по совместному связыванию проводился в условиях, когда концентрация gp47 была в 8 раз больше концентрации а70-субъединицы, можно сделать вывод о том, что формирование комплекса РНК-полимеразы с а70-субъединицей происходит быстрее, чем формирование комплекса gp47 с РНК-полимеразой. Однако, если комплекс с gp47 уже образовался, то а70-субъединица не способна вытеснить связанный gp47 (синяя кривая). Иными словами, фактор gp47 обладает высокой аффинностью к кор-ферменту РНК-полимеразы, однако, сам по себе не может конкурировать с ст70-субъединицей, что указывает на возможность участия дополнительного транскрипционного фактора, необходимого для переключения взаимодействия РНК-полимеразы с а7<1-субъединицей на взаимодействие с gp47.

смешивание:

-Ул-

1.5 нМ о70* + (1 нМ РНКПсоге+РифИ2 нм др47)

1.5 нМ а + (3 нМ РНКП соге-Фиф

~7 -

100 200 300 400 1 час

Время, секунды

Рис. 8. Определение аффинности др47 к РНК-полимеразе. Временная зависимость изменения сигнала флуоресценции при инкубации ст70-РНК-полимеразы с др47, описание эксперимента в тексте.

10. Идентификация а70-промоторов фага 7-11 Программой Genome Explorer2 в области предполагаемых ранних и средних генов

бактериофага 7-11 предсказаны сг70-промоторы, последовательности которых незначительно отличаются от консенсуса ст70-промотора. Они находятся перед генами 47, 58, 70, 99, 102, 119, 123, 147, и 151 (перед последним предсказываются 3 промотора) фага 7-11. Активность этих промоторов в процессе инфекции проверена реакцией удлинения праймера на РНК, выделенной из клеток Salmonella Newport на разных стадиях инфекции. Транскрипты идентифицированы для предсказанных ст70-промоторов перед генами 70, 99, 151. Перед геном 151 активны в наших условиях проведения инфекции 2 из 3-х предсказанных промотора. Все транскрипты начинают накапливаться на 5 минуте инфекции. Затем их количество сокращается. Исключение составляет лишь транскрипт с промотора, расположенного перед геном 70. По-видимому, данная мРНК очень стабильна и не подвергается деградации на поздних стадиях. Таким образом, ранняя транскрипция бактериофага 7-11 осуществляется как минимум с 4-х а70-промоторов.

11. Влияние gp98 на транскрипцию in vitro

Так как бактериофаг 7-11 не кодирует гомолога ингибитора ^"-транскрипции gp79, было выдвинуто предположение, что в геноме 7-11 закодирован негомологичный белок с аналогичной функцией. Все гены бактериофага 7-11, которые имеют гомологов в геноме бактериофага phiEco32, расположены в том же порядке относительно друг друга, что и гены phiEco32. Мы предположили, что аналог gp79 может быть закодирован в соответствующей области средних генов фага 7-11. Из кандидатов мы исключили те гены, которые имеют гомологов с генами фагов подгруппы phiEco32, а также гены, кодирующие белки весом более 10 кДа. Из оставшихся 2-х кандидатов — генов 98 и 100 - мы выбрали ген 98, т.к. перед геном 99 есть экспериментально подтвержденный су7"-промотор, который активен по 30 минуту инфекции, а белок, который влияет на <т70-транскрипцию должен быть ранним, т.к. ингибирование активности ранних <т"'-промоторов происходит начиная с середины инфекционного цикла.

Ген 98 был клонирован в экспрессионный вектор рЕТ19Ь, и его продукт, рекомбинантный белок gp98, наработан и очищен. Gp98 не влиял на gp47-TpaHCKpHnuHK) in vitro. Однако, gp98 ингибировал <т7"-транскрипцию после предварительной инкубации а7"-субъединицы с gp98 (рисунок 9). Обнаруженный эффект был не велик и нуждается в

дальнейшем исследовании. На данный момент, мы предполагаем, что §р98 мог бы являться анти-сигма-фактором бактериофага 7-11.

Рис. 9. Влияние др98 на а70-транскрипцию in vitro.

Столбик 1 - уровень транскрипции холоферментом РНК-полимеразы на промоторе Т7А1, столбик 2 - уровень транскрипции при предварительной инкубации кор-фермента с др98 с последующим добавлением ст70-субъединицы, столбик 3 - уровень транскрипции при одновременой инкубации др98, а70-субъединицы и кор-фермента, столбик 4 - уровень транскрипции при предварительной инкубации др98 с ст70.

12. Общая схема регуляции транскрипции генов в ходе инфекции бактериофагом 7-11

На основании полученных нами данных, можно предложить следующую схему регуляции транскрипции генов бактериофага 7-11. Ранние гены фага транскрибируются с начала инфекции до 20 минуты с по крайней мере четырех промоторов, узнаваемых а70-холоферментом РНК-полимеразы клетки-хозяина. Продукт ранних генов - белок gp98, вероятно, способствует вытеснению ст70-субъединицы из комплекса с РНК-полимеразой, что способствует образованию gp47-xoлoфepмeнтa. Белок gp47 является сигма фактором, который в комплексе с хозяйской РНК-полимеразой осуществляет транскрипцию с поздних промоторов 7-11, которые характеризуются консенсусной последовательностью: WGTAAKKNTWK-(11)-YRCTANW. По-видимому, отдельного среднего класса промоторов у 7-11 не существует. Нами был проведен поиск последовательностей, подобных консенсусу gp47-np0M0TOpa фага 7-II. в геноме фага GAP52. Последовательности, похожие на консенсус gp47-npoMoropa 7-11, найдены перед и в генах /. ///. ПО, 107. 106. 98, 96, 95, 92, 86, 80. 71, 59, 48, 46 и 10 GAP52. При этом непосредственно перед генами-гомологами генов, перед которыми находятся gp47-npoMOTopbi фага 7-11. таких последовательностей не обнаруживается (за исключением гена /). Таким образом, мы считаем, что сигма фактор фага GAP52 осуществляет транскрипцию с промоторов, отличных от консенсуса gp47-npoMOTOpoB.

Hü

0,0 1 2 3 4

выводы

1. Обнаружены и охарактеризованы четыре ст70-промотора бактериофага рЫЕсо32, с которых осуществляется -экспрессия ранних генов. Показано, что во время средней и поздней стадий инфекции бактериофагом рЫЕсо32 происходит ингибирование ранних промоторов фага и клетки-хозяина. Установлено, что в переключении экспрессии gp36-зависимых средних генов на поздние гены бактериофага рЫЕсо32 участвует дополнительный транскрипционный фактор.

2. Проведено сравнение всех известных на сегодняшний момент рЫЕсо32-подобных фагов. Определены промоторы, узнаваемые холоферментами, содержащими сигма субъединицы, закодированные в геномах рЫЕсо32-подобных фагов.

3. Определен консенсус поздних промоторов бактериофага 7-11. Охарактеризован сигма фактор бактериофага 7-11 — §р47, ответственный за транскрипцию поздних генов.

4. Обнаружены и охарактеризованы четыре а70-промотора бактериофага 7-11, с которых осуществляется экспрессия ранних генов. Показано, что активность ранних промоторов 7-11 ингибируется на поздней стадии инфекции.

5. Идентифицирован транскрипционный фактор gp98, который, возможно, является анти-сигма-фактором.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Публикации в журналах:

1) Pavlova, О., Lavysh, D., Klimuk, Е., Djordjevic, M., Ravcheev, D. A., Gelfand, M. S., Severinov, K., Akulenko, N. (2012) Temporal regulation of gene expression of the Escherichia coli bacteriophage phiEco32. J Mo! Biol, 416(3): p. 389-99.

2) Glukhov AS, Krutilina AI, Shlyapnikov MG, Severinov K, Lavysh D, Kochetkov V. V., McGrath J. W., de Leeuwe C., Shaburova О. V., Krylov V. N„ Akulenko N.V., Kulakov L.A. (2012) Genomic analysis of Pseudomonas putida phage tf with localized single-strand DNA interruptions. PLoSONE. 7: e51163.

Материалы конференций:

3) Lavysh D., Pavlova O., Akulenko N., Dorukhov S., Severinov K. "Transcription regulation of bacteriophage PhiEco32". p.66. International conference "Microbial Viruses: Genomics, Evolution and Applications in Ecology, Biotechnology and Medicine", 2011, Belfast, UK.

4) Лавыш Д.Г., Северииов K.B. "Изучение механизмов действия ингибиторов транскрипции бактериофагов phiEco32 и 7-11". Конференция "Молекулярная и клеточная биология: прикладные аспекты", 2012, Москва, ИБГ РАН.

5) Lavysh D., Severinov К. "Regulation of transcription of Salmonella Newport bacteriophage 7-11". International conference "Viruses of Microbes", 2012, Brussels, Belgium.

6) Lavysh D., Severinov K. "Identification of promoter sequences in the genome of phiEco32-Iike bacteriophage 7-11". FEMS Congress'13, 2013, Leipzig, Germany.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Лавыш, Дарья Геннадиевна, Москва

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт Молекулярной Генетики РАН

Транскрипционные стратегии р1иЕсо32-подобных

бактериофагов

Диссертационная работа на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности молекулярная генетика (03.01.07)

04201365356

На правах рукописи

Лавыш Дарья Геннадиевна

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Северинов К. В.

Москва, 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

Общая характеристика работы.......................................................4

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Транскрипция прокариот...................................................7

1.1.1 Структурно-функциональные особенности бактериальной РНК-полимеразы.................................................................8

1.1.2 Механизмы взаимодействия РНК-полимеразы с промоторами.....................................................................11

1.2 Классификация а-факторов прокариот.................................13

1.2.1 Семейство ст70-факторов...............................................14

1.2.2 Группа 2 о70-факторов..................................................16

Подгруппа а-факторов стационарной фазы..........................16

Подгруппа а-факторов цианобактерий................................17

Подгруппа а-факторов грамположительных бактерий с высоким G+C составом...............................................................18

1.2.3 Подгруппа альтернативных а70-факторов...........................18

Подгруппа а-факторов, участвующих в морфогенезе

флагеллы.....................................................................18

Подгруппа а-факторов внеклеточной функциональности......19

Подгруппа а-факторов, участвующих в споруляции............20

Подгруппа а-факторов теплового шока..............................23

1.2.4 Семейство а54-факторов................................................25

1.3 Транскрипция бактериофагов..........................................28

1.3.1 Сигма факторы бактериофагов и их промоторы............29

1.3.2 Транскрипционная стратегия бактериофага Bacillus suhtilis SPOl...........................................................................30

1.3.3 Транскрипционная стратегия бактериофага Escherichia coli Т4..............................................................................34

1.3.4 Транскрипционная стратегия бактериофага Bacillus anthracis Fah...........................................................................37

1.3.5 Транскрипционная стратегия бактериофага Escherichia coli phiEco32.....................................................................40

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ................................................44

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ........................................................54

3.1 Определение активности о70-зависимых промоторов в ходе инфекции бактериофагом phiEco32.........................................54

3.2 Изучение регуляции активности средних и поздних gp36-зависимых промоторов бактериофага phiEco32.........................56

3.3 Общая схема регуляции транскрипции генов в ходе инфекции бактериофагом phiEco32......................................................58

3.4 Морфологическое сравнение фагов phiEco32 и 7-11...............59

3.5 Сравнение организации геномов бактериофагов phiEco32

и 7-11..............................................................................60

3.6 Сравнение всех рЫЕсо32-подобных бактериофагов...............66

3.7 Биоинформатический анализ транскрипционных стратегийрЫЕсо32-подобных бактериофагов............................69

3.8 Отработка условий инфекции штамма Salmonella enterica серовар Newport бактериофагом 7-11.....................................72

3.9 Предсказание оперонной организации поздних и средних генов бактериофага 7-11.............................................................73

3.10 Идентификация поздних промоторов бактериофага 7-11.......74

3.11 Определение консенсусной последовательности позднего промотора фага 7-11...........................................................76

3.12 Продукт гена g47 является а-фактором бактериофага 7-11.....78

3.13 Определение области плавления gp47-np0M0T0pa................81

3.14 Определение аффинности gp47 к РНК-полимеразе..............82

3.15 Идентификация а70-промоторов фага 7-11..........................83

3.16 Поиск дополнительных транскрипционных факторов, закодированных в геноме бактериофага 7-11.............................84

3.17 Влияние белка gp98 бактериофага 7-11 на транскрипцию......86

3.18 Общая схема регуляции транскрипции генов в ходе инфекции бактериофагом 7-11 и предположения о регуляции транскрипции бактериофага GAP52...........................................................86

4. ВЫВОДЫ........................................................................88

5. СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ...........................89

6. СПСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫЙ АВТОРОМ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ............................................................104

7. БЛАГОДАРНОСТИ.........................................................105

Общая характеристика работы

Актуальность работы. Бактериофаги удивительно разнообразны в использовании различных механизмов и стратегий регуляции транскрипции своих генов в процессе инфекции бактериальной клетки. Регуляция экспрессии генов позволяет достичь высокого уровня выхода фаговых частиц. В развитии литических бактериофагов чаще всего выделяют 3 стадии инфекции: раннюю, среднюю и позднюю. На ранней стадии, как правило, происходит синтез фаговых белков, функция которых заключается в переключении системы транскрипции клетки-хозяина с экспрессии генов бактерии на экспрессию генов фага. Белки, необходимые для репликации фагового генома, синтезируются на средней стадии. На поздней стадии экспрессируются гены, кодирующие белки оболочки, упаковки ДНК и лизиса клеток.

Контроль экспрессии генов бактериофага осуществляется с помощью закодированных в геноме бактериофага разнообразных транскрипционных факторов, и/или собственной РНК-полимеразы и различия в последовательности промоторов генов разных временных классов. Транскрипционные факторы могут выполнять следующие функции: ковалентно модифицировать РНК-полимеразу клетки-хозяина, способствовать конформационным изменениям РНК-полимеразы, участвовать в распознавании промоторной области генов. На сегодняшний день существуют группы фагов, транскрипционная стратегия для которых хорошо изучена. К ним относится бактериофаг Т7, который кодирует свою собственную односубъединичную РНК-полимеразу, экспрессирующую средние и поздние гены во время инфекции. Другую стратегию используют Т4-подобные фаги, у которых транскрипция ранних генов осуществляется о70-холоферментом РНК-полимеразы и при этом синтезируются белки, изменяющие промоторную специфичность о70-субъединицы. Комплекс РНК-полимеразы с таким фактором начинает работать только на промоторах средних генов.

На средней стадии синтезируется собственный офактор, который при участии дополнительных фаговых белков обеспечивает узнавание поздних промоторов. Третья стратегия характерна для бактериофага лямбда. Этот фаг на всех стадиях использует а70-холофермент РНК-полимеразы клетки хозяина. Гены, принадлежащие к одному временному классу, кластеризованы и отделены друг от друга терминаторами, на которых происходит остановка транскрипции. На каждой предыдущей стадии синтезируются белки-антитерминаторы, позволяющие РНК-полимеразы не останавливаться на терминаторе и перейти к транскрипции генов следующей группы.

Кроме факторов, осуществляющих транскрипцию генов фага, в геноме бактериофагов часто закодированы ингибиторы бактериальной РНК полимеразы, изучение которых позволяют не только расширить наши знания о бактериальной РНК-полимеразе, но и , возможно, разработать новые белковые антибактериальные препараты.

Данная работа посвящена исследованию механизмов регуляции транскрипции рЫЕсо32-подобных бактериофагов.

Фаги данной группы имеют от 80 до 20% гомологичных продуктов генов, поэтому их все отнесли к филогенетической группе рЫЕсо32. На основании имеющихся данных можно предполагать, что в экспрессии генов всех рЫЕсо32-подобных фагов принимает участие закодированный в геноме а-фактор. Данный а-фактор охарактеризован только для бактериофага рЫЕсо32 ^р36). В ходе работы были получены сведения о работе наименее гомологичного gp36 фактора - о-фактора бактериофага 7-11 ^р47) и его промоторной специфичности. На основании полученных данных можно сделать предположения о регуляциях транскрипции остальных рЫЕсо32-подобных фагов. Так же в геномах бактериофагов группы рЫЕсо32 произведен поиск ингибиторов хозяйской РНК полимеразы. В геномах близкородственных фагов закодирован гомолог ранее охарактеризованного гена ёр79 фага рЫЕсо32, а для эволюционно более далеких фагов подгруппы 7-11 найден новый фактор, который, возможно, способствует диссоциации основной ст-субъединицы бактерий и ее замену на а-фактор фага. Таким образом, в ходе данной работы, экспериментально изучены механизмы транскрипции 2-х рЫЕсо32-подобных фагов и сделаны предположения о регуляции транскрипции еще 3-х рЫЕсо32-подобных фагов.

Цели работы. Основной целью данной работы являлось изучение транскрипционных стратегий рЫЕсо32-подобных бактериофагов. В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:

1) Идентифицировать и изучить динамику накопления транскриптов ранних а70-зависимых промоторов бактериофага рЫЕсо32 в ходе инфекции и изучить механизм переключения транскрипции со средних на поздние gp36-зaвиcимыe промоторы фага.

2) Провести биоинформатический анализ геномов всех известных на сегодняшний день рЫЕсо32-подобных фагов.

3) Изучить временную регуляцию экспрессии генов рЫЕсо32-подобного бактериофага 7-11. Доказать функциональную активность а-фактора, закодированного в геноме бактериофага 7-11, определить промоторную последовательность, узнаваемую холоферментом РНК-полимеразы, содержащим этот фактор, и провести поиск дополнительных факторов транскрипции, закодированных в геноме бактериофага 7-11.

Научная новизна. На основании ранее полученных данных и результатов данной работы, охарактеризован процесс регуляции транскрипции бактериальных и фаговых генов в ходе инфекции бактериофагом рЫЕсо32. Впервые охарактеризован сигма фактор gp47, закодированный в геноме бактериофага 7-11, и определены промоторы, узнаваемые холоферментов РНК-полимеразы, содержащим gp47. Получены данные, указывающие на то, что белок gp98 бактериофага 7-11, возможно, является анти-сигма-фактором и обеспечивает переключение ранней транскрипции на позднюю gp47-зaвиcимyю транскрипцию.

Практическая значимость работы. Полученные в данной работе результаты имеют в основном фундаментальное значение, однако некоторые из них могут найти и практическое применение. Результаты исследования расширяют представления о транскрипционных стратегиях бактериофагов, о промоторах альтернативных а-факторов и механизмах взаимодействий белков бактериофагов с РНК-полимеразой бактерий. Охарактеризованные в данной работе белки могут быть использованы для создания ингибиторов бактериальной РНК-полимеразы.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Транскрипция прокариот

Транскрипция - это процесс синтеза РНК с использованием матрицы ДНК, который осуществляется ДНК-зависимой РНК-полимеразой (РНКП). Фермент РНКП является очень консервативным, районы активного центра представлены одинаковыми последовательностями в прокариотических, эукариотичеких и археобактериальных РНКП (Lane et al., 2009). РНКП прокариот имеет размер ~150А в длину, ~115А в высоту и ~100А в ширину. Существует две формы РНКП: кор- и холофермент. Кор-фермент имеет относительную молекулярную массу около 400 кДа и состоит из пяти субъединиц: ai, а.2, Р, Р' и со. Кор-фермент РНКП - это каталитическая машина для синтеза РНК с матрицы ДНК. Однако кор-фермент РНКП не способен инициировать транскрипцию. Для узнавания специфических последовательностей ДНК (промоторов) кор-фермент РНКП должен провзаимодействовать с 70 кДа белком - а-субъединицей и образовать холофермент РНКП. ст-субъединица играет центральную роль в узнавании промоторов, плавлении ДНК и последующем уходе РНКП с промотора (Busby et al., 2009). Сам ст-фактор не способен самостоятельно взаимодействовать с промоторами (McClure, 1985).

Транскрипционный цикл РНКП можно разделить на три основных стадии: инициация, элонгация и терминация синтеза РНК. Инициация транскрипции - это мультистадийный процесс, в ходе которого сначала формируется закрытый комплекс -происходит распознавание холоферментом РНКП последовательности промотора. Затем происходит плавление короткого промоторного участка цепей ДНК вокруг стартовой точки транскрипции (от -12 до +2 пн). В результате этого матричная цепь ДНК экспонируется в районе транскрипционного старта. Такой комплекс с расплавленной ДНК называется открытым. Далее становится возможным инициация синтеза РНК. Первое время в присутствии нуклеотидов холофермент РНКП синтезирует короткие фрагменты длиной 2-12 пн, так называемые абортивные РНК продукты. Затем, когда длина транскрипта достигает 9-12 пн, а-субъединица диссоциирует из комплекса и начинается стадия элонгации: по мере скольжения кор-фермента по ДНК осуществляется синтез новой РНК (Darst et al., 2001). Кор-фермент

РНКП диссоциирует с ДНК, когда формируется терминатор на синтезированной РНК, или при взаимодействии с определенными белками (Record et al, 1996).

В зависимости от стадии роста, в клетке Е. coli присутствуют от 3000 до 13000 молекул РНКП. В любой отдельно взятый момент времени 24-79% (в зависимости от стадии роста бактерий) молекул РНКП осуществляют синтез РНК (Grigorova et al., 2006).

1.1.1 Структурно-функциональные особенности бактериальной РНК-

полимеразы

По своей форме кор-фермент РНКП напоминает клешню краба. Одна половинка "клешни" состоит из Р-субъединицы, вторая образована (3 '-субъединицей. Основание "клешней" состоит из гомодимера а-субъединиц. Субъединица ai взаимодействует преимущественно с |3-субъединицей, а аг - с (З'-субъединицей. Малая ю-субъединица взаимодействует только с (З'-субъединицей и, скорее всего, выполняет функцию стабилизации комплекса (Minakhin et al., 2001). Поперек всей молекулы между "клешнями" расположен главный канал РНКП - впадина шириной 25-27 А. Главный канал образуют 3 домена: домены (3-субъединицы (31 и (32 и домен "зажим" (clamp) (3'-субъединицы. В главном канале располагается ДНК в процессе транскрипции. Данные, полученные из структурных исследований показали, что "зажим" может сдвигаться на 30°, что позволяет ему переходить от закрытой к открытой конформации. Скорее всего, открытая конформации соответствует стадии инициации транскрипции, тогда ДНК входит в главный канал фермента. Закрытая конформация соответствует стадии элонгации (Darst et al., 2001; Cramer et al., 2001).

холофермент РНКП

¿п-смзывающий

домен застежка

подвижная заслонка

крышка

шип

подвижная заслонка

кор-фермент РНКП

/п-связывающий

домен застежка

(б)

РНК транскрипт

подвижная заслонка

ДНК

Рис. 1. Структура фермента РНК-полимеразы Т. ациаИсиз.

(а) общий вид кор-фермента и холофермента РНКП, в верхней части рисунка указано, какими цветами обозначены разные субъединицы РНКП, подписаны домены;

(б) схематичное изображение структуры элонгационного комплекса РНКП (по Оаге^ 2009).

Активный центр фермента расположен в глубине главного канала. В каталитическом центре РНКП присутствуют два иона Первый 1У^2'

хелатирован тремя аспартатами консервативного мотива МЛОРОвО района (3'-субъединицы. Второй - \lgll связан с РНКП гораздо слабее первого, он

хелатирован двумя аспартатами Р'-субъединицы и он становится частью активного центра в результате взаимодействия с субстратом (с НТФ или пирофосфатом) (Зояшюу е1 а1., 2003). Ионы стабилизируют пятивалентный интермедиат

фосфата, то есть непосредственно участвуют в катализе образования фосфодиэфирной связи ^ейг е1 а1., 1994). координирует З'-ОН конец РНК, а \TgIi оттягивает уходящую группу, обеспечивая разрыв связи между а- и Р-фосфатами НТФ (Уаг^ е1 а!., 2006).

подвижная заслонка

сайт связывания

НТФ

сайт связывания Оте-факторов

вторичным „.„„,„.

канал О-петля спираль

шип

В области активного центра главный канал соединяется со вторичным. Вторичный канал имеет ширину ~12А и, так как во время транскрипции главный канал полностью занят нуклеиновыми кислотами, скорее всего, вторичный канал служит для доставки нуклеотидов и для выхода абортивных РНК (Darst, 2004). Так же во вторичном канале находятся места связывания РНКП с элонгационными факторами GreA и GreB (Borukhov et al., 1993), с кофактором DksA (Kang et al., 1990) и с ингибитором транскрипции Termus thermophilus Gfhl (Hogan et al., 2002). В области активного центра вторичный канал отделен от главного канала длинной а-спиралью (3'-субъединицы, так называемой F-мостовой спиралью (F-bridge helix) и G-петлей (3'-субъединицы (trigger loop) (Darst et al., 2001).

В составе транскрипционного комплекса область ДНК длиной около 14 пн расплетена, образуется так называемый транскрипционный пузырь. По крайней мере, десять пар нуклеотидов двухцепочечной ДНК ниже транскрипционного пузыря также находятся в главном канале. Во время стадии закрытого комплекса в главном канале находится участок ДНК соответствующий позициям от -55 до +20 относительно стартовой точки транскрипции. Так как линейный размер РНКП не превышает 160А, что соответствует 50 пн ДНК, считается, что ДНК во время прохождения через РНКП притерпевает конформационные изменения - изгибается примерно на 90°. В главном канале РНКП образуется РНК-ДНК гетеродуплекс, он образован 8-9 нуклеотидами 3'-конца РНК-транскрипта и матричной цепью ДНК. РНК-ДНК гетеродуплекс помещается между каталитическим ионом Mgl