Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выделение бактериофагов из бактерий Azospirillum lipoferum Sp59b и SR65 и их детекция методами электрофизического анализа

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Выделение бактериофагов из бактерий Azospirillum lipoferum Sp59b и SR65 и их детекция методами электрофизического анализа"

На правах рукописи

Макарихина Светлана Сергеевна

ВЫДЕЛЕНИЕ БАКТЕРИОФАГОВ ИЗ БАКТЕРИЙ АгОБРИИЬЬиМЫРОРЕШМ Бр59Ь И 81*65 И ИХ ДЕТЕКЦИЯ МЕТОДАМИ ЭЛЕКТРОФИЗИЧЕСКОГО АНАЛИЗА

03.02.03 - микробиология

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

7 НОЯ 2013

005537233

Саратов - 2013

005537233

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук (ИБФРМ РАН)

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, доцент Гулий Ольга Ивановна доктор биологических наук, профессор Игнатов Олег Владимирович

Богатырев Владимир Александрович,

доктор биологических наук, старший научный сотрудник, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук, лаборатория нанобиотехнологии, ведущий научный сотрудник

Щербаков Анатолий Анисимович

доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова»,

кафедра микробиологии, вирусологии и биотехнологии, профессор кафедры

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия имени П.А. Столыпина»

Защита состоится «4» декабря 2013 г. в 10:00 на заседании диссертационного совет Д 002.146.01 в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российско" академии наук по адресу: 410049, Саратов, проспект Энтузиастов, 13.

Автореферат диссертации размещен на официальном сайте Минобрнауки РФ и на сайте ИБФРМ РАН: http://ibppm.ru/dissertacionnvv-sovet/

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБФРМ РАН.

Автореферат диссертации разослан » ОКЯ их^А 2013 г.

И.о. Ученого секретаря диссертационного совета

доктор биологических наук О -— Л.П. Антонюк

Ведущая организация:

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Бактериофаги почвенных микроорганизмов привлекают внимание исследователей из-за их повсеместного распространения, многообразия и важной экологической роли (Clokie and Kropinski, 2009; Dwivedi et al., 2012). При этом большинство исследований основано на выделении бактериофагов из различных объектов окружающей среды, в том числе из почвы (Ashelford et al., 2002; Williamson et al., 2003, 2005; Helton et al., 2006; Srinivasiah et al., 2008; Romero-Suarez et al., 2012), и лишь незначительная часть работ посвящена выделению и характеристике бактериофагов, выделенных из бактериальных клеток (Boyer et al., 2008). Поэтому перспективным направлением исследований является выделение и изучение бактериофагов почвенных микроорганизмов.

Бактериофаги находят широкое применение в медицине для лечения бактериальных заболеваний, в генной инженерии для векторного переноса генетических элементов, являются удобной моделью для расшифровки генетического кода и понимания структуры гена, процессов мутагенеза, влияния различных факторов на передачу наследственной информации в живых системах (Стейниер и др., 1979). В природе бактериофаги играют важную роль в качестве фактора, регулирующего численность микробных клеток и в переносе генетической информации посредством трансдукции (Шестаков, 2007). Прогресс в изучении и использовании бактериофагов во многом определяется разработкой и внедрением новых методов их диагностики. В настоящее время разработано много методов индикации и исследования вирусных частиц, но их использование затруднено из-за сложности и малого числа существующих измерительных приборов. Поэтому актуальной является разработка новых экспресс-методов детекции бактериофагов, позволяющих получать точные результаты за короткое время в автоматическом режиме.

В последнее время электрофизические методы, такие как электрооптического и электроакустического анализа, все чаще находят применение для решения ряда задач в микробиологии и биотехнологии. Достоинствами метода электрооптического (ЭО) анализа является возможность анализа нативных клеток без их повреждения, возможность полной автоматизации и стандартизации процесса анализа, быстрота проведения анализа (около 10 мин), высокая чувствительность и небольшая погрешность измерений (в пределах 5%), что позволит использовать данный метод анализа для индикации вирусных частиц, в том числе, в полевых условиях.

Электроакустические методы анализа привлекают все большее внимание исследователей для анализа биоспецифических взаимодействий, поскольку характеризуются высокой чувствительностью, точностью измерений (в пределах 2%) и минимальным временем для проведения анализа. Поэтому перспективным направлением исследований является использование метода электроакустического анализа для решения вопросов детекции бактериофагов.

Поскольку бактериофагам присущи резко выраженные паразитические свойства, обуславливающие- возможность их существования и размножения только в культурах соответствующих видов микроорганизмов, размножение бактериофагов возможно только в живых клетках. Следовательно, изменения электрофизических параметров микробных клеток при их взаимодействии с бактериофагами являются тем маркером, который дополнительно позволяет судить о жизнеспособности клеток. В связи с этим при решении вопроса индикации бактериофагов дополнительно возникает задача детекции микробных клеток - хозяев бактериофагов. Поэтому актуальным направлением исследований является разработка новых методов детекции клеток - хозяев бактериофагов.

Цель работы - выделение и изучение бактериофагов из АгояртИит Нро/егит штаммов Эр59Ь и 81165, и разработка новых методов детекции бактериофагов и клеток азоспирилл с помощью методов электрооптического и электроакустического анализа микробных суспензий.

Для достижения поставленной цели в работе были сформулированы следующие задачи:

1. Выделить бактериофаги из клеток АгоярмПит Нро/егит штаммов 8р59Ь и 8Я65 и изучить их биологические свойства.

2. Исследовать возможность использования метода электрооптического анализа микробных суспензий для детекции бактериофагов на примере бактериофагов, выделенных из А. Нро/егит 8р59Ь и

3. Изучить возможность применения метода электроакустического анализа клеточных суспензий для детекции бактериофагов.

4. Показать возможность использования методов электрооптического и электроакустического анализа микробных суспензий для детекции бактериофагов в смеси бактериофагов и в присутствии посторонней микрофлоры.

5. Разработать методические подходы индикации бактерий АгоярМПит при их взаимодействии со специфическими антителами с помощью метода электроакустического анализа.

Научная новизна работы.

У клеток Аю.^р1гШит Нро/егит штаммов Бр59Ь и 81165 обнаружено явление лизогении. Впервые из клеток А. Нро/егит штаммов Бр59Ь и 8Я65 выделены бактериофаги ФА1-8р59Ь и ФА1-8Ы65. Представлена характеристика выделенных бактериофагов и определено их таксономическое положение - они относятся к семейству Рос1о\чг'к1ае.

Впервые на примере бактериофагов ФА1-8р59Ь и ФА1-8Я65, показана возможность детекции вирусных частиц с помощью методов электрооптического и электроакустического анализа. Впервые установлена возможность использования методов электрооптического и электроакустического анализа микробных суспензий для детекции бактериофагов в смеси бактериофагов и в присутствии посторонней микрофлоры.

Впервые использованы антитела, специфичные к микробным клеткам А. Нро/егит Бр59Ь и А. ЬгазИете 8р7, для детекции клеток азоспирилл с помощью метода электроакустического анализа клеточных суспензий.

Показана возможность использования метода электроакустического анализа суспензий клеток для детекции азоспирилл при их взаимодействии со специфическими антителами в присутствии посторонней микрофлоры.

Практическая значимость работы.

Выделение и изучение бактериофагов из клеток А. Нро/егит штаммов 8р59Ь и 81165 показало перспективы для их использования при разработке чувствительных методов детекции бактериофагов. Разработана методология детекции бактериофагов электрооптическим анализом клеточных суспензий.

Изучение бактерофагов, выделенных из бактерий рода АюхрпШит, позволяет проводить фаготипирование почвенных бактерий.

Предложен новый способ индикации бактериофагов с помощью метода электроакустического анализа клеточных суспензий.

Использование антител, специфичных к микробным клеткам А. Про/егит Бр59Ь и Л. Ьгаа'йете 5р7, показало возможности их применения для детекции клеток азоспирилл с помощью метода электроакустического анализа. Предложен новый подход для детекции микробных клеток с помощью электроакустического метода анализа.

Детекция клеток методом электроакустического анализа позволит проводить контроль численности клеток АгоБрЫИит при их использовании в качестве бактериальных удобрений.

Метод электроакустического анализа был использован при выполнении работы по Госконтракту с Саратовским филиалом Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институтом радиотехники и электроники (СФИРЭ) им. В.А. Котельникова, г. Саратов от 29 июня 2010 г. (в рамках гранта РФФИ № 09-02-12442-офим «Исследование физических основ работы нового поколения многопараметрических акустоэлектронных датчиков для изучения и мониторинга биологических реакций в клеточных суспензиях», 2009-2010 гг.)

Метод электрооптического анализа был использован при выполнении работы «Разработка методологии и приборного обеспечения электрооптического анализа вирусов микроорганизмов» при поддержке Министерства образования Российской Федерации, соглашение № 8852 (2012-2013 гг.).

По результатам диссертации были изданы методические рекомендации по определению литической активности бактериофагов с помощью метода электрооптического анализа клеточных суспензий для студентов старших курсов и аспирантов, специализирующихся в области микробиологии, рекомендованные ученым советом ИБФРМ РАН (протокол № 9 от 25.09.2012 г.).

Материалы, представленные в диссертации, включены в программы лекций по биотехнологии и микробиологии, для студентов и аспирантов в ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова» и

ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского».

Основные положения, выносимые на защиту:

1. У микробных клеток А. Нро/егит штаммов Бр59Ь и 51165 обнаружено явление лизогении. Использование индуцирующего фактора - низкой температуры позволяет выделять бактериофаги из А. Нро/егит штаммов Бр59Ь и 81165.

2. Изменения электрооптических и электроакустических параметров микробных суспензий при их инфицировании специфическими бактериофагами применимы для детекции бактериофагов.

3. Метод электроакустического анализа микробных суспензий позволяет проводить детекцию бактерий азоспирилл с применением антител.

Апробация работы.

Основные положения работы были представлены на: 16-ой и 17-ой Международных Пущинских школах-конференциях молодых ученых «Биология -наука XXI века» (Пущине, 2012; 2013); 5-ой Всероссийской конференции молодых ученных «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2012); Международной научно-практической конференции «Биотехнология: реальность и перспективы в сельском хозяйстве» (Саратов, 2013); Международной научно-практической конференции «Бактериофаги: Теоретические и практические аспекты применения в медицине, ветеринарии и пищевой промышленности» (Ульяновск, 2013).

Работа выполнена в лаборатории физиологии микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук (ИБФРМ РАН) в соответствии с плановыми темами НИР «Исследование электрофизических свойств микробных клеток при их инфицировании бактериофагами» 2009-2012 гг. (№ гос. регистрации 01200904393, научный руководитель зав. лаб. д.б.н., профессор Игнатов О.В.).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 8 работ, из них 2 статьи в журналах, рекомендуемых ВАК.

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей объекты, материалы и методы исследований, результаты исследований и их обсуждение, а также заключения, выводов и списка использованных литературных источников, включающего 151 наименование, в том числе 88 зарубежных. Диссертация изложена на 160 страницах компьютерного текста, включающего 39 рисунков и 10 таблиц.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ ОБЪЕКТЫ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объекты исследований. В работе использовали микроорганизмы рода Аю.щгШит: А. Нро/егит штаммов Бр59Ь (УКМ 1519), 8Я65 и 1Ш20а,

A. brasilense штаммов Sp7 (ВКМ В-1547), Cd, Sp245, Jm6B2, Brl4, KR77, S17, S27, SR75, A. halopraeferans Au4 (DSM 3675), A. irakense штаммов KBC1 (CIP 103311), KA3, A. amazonense Aml4, Escherichia coli штаммов B-878 и XL-1, полученные из коллекции культур ИБФРМ РАН.

Микроорганизмы хранились при +4°С на чашках Петри с картофельным агаром (для клеток рода Azospirillum) и на чашках Петри с твердой питательной средой LB, содержащей 3% агар-агара (для клеток кишечной палочки). Микробные клетки пересевались каждые 2 недели.

Условия культивирования микробных клеток: культуры выращивали в 250 мл колбах Эрленмейера на жидкой среде LB следующего состава (г/л): NaCl (Becton, Dickinson and Company, Франция) - 10,0; пептон (Becton, Dickinson and Company, Франция) - 5,0; дрожжевой экстракт (DIFCO, США) - 5,0. Инкубирование клеток осуществляли на круговой качалке при интенсивности перемешивания 160 об/мин при температуре 30±1°С в течение 18 ч.

Методы. В ходе выполнения работы применяли традиционные методы культивирования микроорганизмов на питательных средах (Маниатис и др., 1984). Выделение бактериофагов проводили методами, предложенными (Маниатис и др., 1984) с помощью воздействия индуцирующего фактора - низкой температуры. Изучение биологических свойств выделенных бактериофагов осуществляли методами, предложенными: (Адаме, 1961; Мурадов и др., 1990; Гольдфарб, 1961; Ганюшкин, 1988; Пожарникова, 2006; Григорьева и др., 2007; Васильев и др., 2011). Электронно-микроскопический анализ фаговых частиц выделенных бактериофагов проводили на просвечивающем электронном микроскопе Libra 120 (Carl Zeiss, Германия) при ускоряющем напряжении 120 кВ. Контрастирование проводили уранилацетатом (1% УА в 50% метиловом спирте).

Инфицирование клеток бактериофагом проводили, как описано в работе (Bunin et al., 2004). Изучение электрооптических параметров суспензий клеток A. lipoferum штаммов Sp59b и SR65 с использованием выделенных бактериофагов проводили, как описано в работе (Bunin et al., 2004). Измерения электрооптических параметров проводили с использованием электрооптического анализатора ELOAnalyser (производства EloSystem GbR, Berlin, Germany). Исследование электроакустических параметров суспензий клеток A. lipoferum штаммов Sp59b и SR65 при их инфицировании бактериофагами проводили, как описано в работе (Зайцев и др., 2011).

В работе были использованы кроличьи поликлональные антитела против A. lipoferum Sp59b и Ат на соматический антиген A. brasilense Sp7, полученные по методике, описанной в работе (Матора и др., 1998). Антитела для работы любезно предоставлены сотрудником лаборатории иммунохимии ИБФРМ РАН (к.б.н., с.н.с. Бурыгин Г.Л.). Изучение электроакустичеких параметров суспензии клеток A. lipoferum Sp59b и A. brasilense Sp7 при взаимодействии со специфичными Ат проводили, как описано в работе (Гулий и др., 2013).

Кривые на рисунках строились по средним значениям, полученным в результате не менее 5 повторностей. Статистическую обработку результатов измерений проводили стандартным методом (Чарыков, 1984; Лакин, 1990). Для

статистической обработки экспериментальных данных также использовали пакет прикладных программ Microsoft Excel 2000.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Выделение и характеристика бактериофагов из Azospirillum lipoferum штаммов Sp 59b и SR65

Первоначально исследовали бактерии Azospirillum lipoferum штаммов Sp59b и SR65 на наличие в них профага. Результаты исследований свидетельствуют, что культуры A. lipoferum штаммов Sp59b и SR65 в опытах по выделению бактериофагов без воздействия на них индуцирующего фактора не проявили лизогенных свойств. Поэтому на следующем этапе для выделения бактериофагов из клеток A. lipoferum Sp59b и SR65 на культуры воздействовали индуцирующим фактором, при этом в качестве индуцирующего фактора использовали воздействие низкой температуры, как описано в работе (Маниатис и др., 1984). В результате из клеток A. lipoferum штамма Sp59b был выделен бактериофаг <E>A1-Sp59b, а из штамма SR65 - бактериофаг <I>A1-SR65 и изучены их биологические свойства. У культур A. lipoferum штаммов Sp59b и SR65 показано явление лизогении.

Характеристика бактериофагов ®A1-Sp59b и ®A1-SR65 Морфология негативных колоний

Для определения морфологии негативных колоний высевали исследуемые бактериофаги <DA1-Sp59b и «DA1-SR65 в разведении 10'7-10"9 на чашки Петри методом агаровых слоев по методу Грациа (Адаме, 1961; Мурадов и др., 1990; Григорьева и др., 2007). Для формирования газона на поверхности агара использовали клетки штаммов Sp59b и SR65 для каждого выделенного бактериофага, соответственно. Посевы культивировали в термостате при температуре 32°С, изучение морфологии негативных колоний проводили через 24-48 часов. Показано, что бактериофаг Î>A1-Sp59b на газоне штамма A. lipoferum Sp59b образует округлые, с ровным четким краем, прозрачные негативные колонии одного типа диаметром до 2 мм. Бактериофаг <£A1-SR65 на газоне клеток A. lipoferum SR65 образует полупрозрачные, овальные негативные колонии, с ровным четким краем, диаметром около 1 мм.

Литическая активность бактериофагов <t>AI-Sp59b и OAI-SR65

Литическая активность бактериофагов оценивается по его способности вызывать лизис бактериальной культуры и выражается степенью максимального разведения, в котором испытуемый бактериофаг проявил свое литическое действие. Более точным методом оценки активности бактериофага является определение количества активных корпускул бактериофага в единице объема. Активность бактериофага ФА1-Эр59Ь составляла около 8,9x10 бляшкообразующих единиц (БОЕ) в 1 мл, а бактериофага Ï>A1-SR65 - достигала 1,6x109 БОЕ в 1 мл.

К основным биологическим свойствам бактериофага, имеющим важное практическое и теоретическое значение, отноеится диапазон литической активности - спектр лизиса гомологичных бактериофагу бактерий по серологической группе. Определение спектра литической активности проводили методом нанесения капель суспензии бактериофага на газон изучаемой культуры, как описано (Адаме, 1961; Ганюшкин, 1988). Изучение спектра литической активности бактериофагов <PA1-Sp59b и OA1-SR65 определяли по отношению к 16 штаммам бактерий рода Azospirillum: A. brasilense штаммов Sp7, Cd, Sp245, Jm6B2, Brl4, KR77, S17, S27, SR75, A. halopraeferans Au4, A. irakense штаммов KBC1 и KA3, A. lipoferum штаммов Sp59b, SR65 и RG20a, A. amazonense Aml4.

Результат считали положительным, если на месте нанесения бактериофага на газоне сплошного роста культуры образовывалась прозрачная зона лизиса с вторичным ростом фагорезистентных микроорганизмов, и, соответственно, результат считали отрицательным при отсутствии лизиса. Результаты исследований приведены в таблице 1.

Специфичность бактериофагов ФА1 -Sp59b и OAI-SR65

Необходимым условием для применения бактериофагов в микробиологических целях является отсутствие литического действия в отношении гетерологичных бактерий (специфичность). В качестве гетерологичных культур использовали бактерии родов Escherichia, Pseudomonas, Acinetobacter. Установлено, что изучаемые бактериофаги не вызывали лизис ни одной из испытуемых культур других видов бактерий. На основании полученных результатов можно сделать вывод о том, что бактериофаги <I>A1-Sp59b и OA1-SR65 не активны в отношении бактерий гетерологичных родов.

Температурная устойчивость бактериофагов ®AI-Sp59b и <BA1-SR65

Для изучения температурной устойчивости бактериофагов (J>AI-Sp59b и ФA1-SR65 суспензии вирусов подвергались воздействию высокой температуры от+50 до +90°С с шаговым интервалом в 10°С, при этом время воздействия составляло 30 мин, как описано (Адаме, 1961; Васильев и др., 2011). Устойчивость бактериофагов определяли посредством высева бактериальной культуры A. lipoferum штаммов Sp59b и SR65, смешанной с суспензией соответствующего бактериофага ФА1-Яр59Ь или fl>Al-SR65, методом двухслойного агара. Показано, что прогревание бактериофагов <PA1-Sp59b и <J>A1-SR65 до +70°С не оказало существенного влияния на их активность. Дальнейшее повышение температуры приводило к незначительной потере активности бактериофагов. Таким образом, можно сделать вывод, что изучаемые бактериофаги OAl-Sp59b и ®A1-SR65 являются термостабильными.

Устойчивость бактериофагов <t>AI-Sp59b и OA1-SR65 к воздействию

хлороформа

При изучении влияния хлороформа на активность бактериофагов ®A1-Sp59b

и i>Al-SR65 показано, что изучаемые бактериофаги проявили высокую

Таблица 1 - Спектр литической активности бактериофагов ФА1-8р59Ь и _ФАЬ8И65 на газоне культур бактерий рода АгозрИИит_

Вид Штамм Действие бактериофага

ФА1-8р59Ь ФА1-81165

А. ЬгахИепхе 8р7 - +

са - +

8Я75 - +

вр245 - -

Вг14 + +

КЯ77 + -

мбвг - -

817 + +

827 + -

А. Нро/егит 8р59Ь + +

1Ю20а + +

8Я65 + +

А. 1гакеюе КВС1 - +

КАЗ + -

А. ИаЬргае/егапя Аи 4 - +

А. ата!Опепзе Ат 14 - -

Примечание: «+» - наличие лизиса бактериальной культуры;

«-» - отсутствие лизиса бактериальной культуры.

устойчивость к воздействию хлороформа. Следовательно, возможно использование хлороформа для освобождения фаголизата от жизнеспособных бактерий. Поскольку исследуемые бактериофаги не инактивируются хлороформом, можно предположить отсутствие у этих вирусов липидсодержащих везикул.

Устойчивость бактериофагов ФА1-8р59Ь и ФА1-8Г165 в условиях различных

значений рН

Для изучения влияния разных значений рН буферного раствора на активность бактериофагов ФА1-8р59Ь и ФА1-ЯК65 использовали трис ЭДТА буферный раствор (ЮмМ ТпвНС1, 1мМ ЭДТА) со значениями рН: 5,5; 6,5; 8,5; 9,5, при этом время воздействия буферного раствора составляло 18-20 ч. Далее определяли активность исследуемого бактериофага по методу Грациа.

Показано, что щелочная и кислая среда буферного раствора незначительно влияли на снижение активности изучаемых бактериофагов. Исходя из полученных данных, можно сделать вывод, что бактериофаги ФА1-8р59Ь и ФА1-8Я65 обладают высокой устойчивостью к щелочной и кислой среде буферного раствора.

Активность бактериофагов <DA1-Sp59b и <DA1-SR65 при хранении

Изучаемые бактериофаги хранили в трис ЭДТА буферном растворе (pH 7,5-8,0) при температуре -4°С и проверяли способность лизировать культуру бактерий А. lipoferum штаммов Sp59b и SR65 по методу Грациа 1 раз в месяц на протяжении 13 месяцев. Установлено, что бактериофаг 0>A1-Sp59b сохраняет активность в течение 7 месяцев, при этом титр вирусных частиц за этот период снижался от 5,2х108 до 6,5><106 фаговых частиц/мл. Бактериофаг <t>Al-SR65 сохраняет активность в течение 12 месяцев, при этом титр данного вируса снижался от 6,4x108 до 4,5х105 фаговых частиц/мл.

Изучение морфологии фаговых частиц <DA1-Sp59b и ®A1-SR65 с помощью электронной микроскопии

Для определения систематического положения выделенных бактериофагов проводилось их электронно-микроскопическое исследование.

В результате исследований установлено, что вирусные частицы бактериофага ®A1-Sp59b имеют сферическую головку диаметром около 30 нм и короткий хвостовой отросток длиной до 10 нм (Рисунок 1). Вирусные частицы бактериофага <J>A1-SR65 состоят из сферической головки размером около 32 нм и короткого хвостового отростка размером до 9 нм.

В соответствии с морфологическими параметрами, бактериофаги <1>A1-Sp59b и OA1-SR65, согласно Международной классификации и номенклатуре вирусов относятся к семейству Podoviridae (Ackermann, 2007), а по классификации A.C. Тихоненко - ко II морфологической группе: «Фаги с аналогом отростка» (Тихоненко, 1968).

* Ш: &

Щ f

Рисунок 1 - Электронно-микроскопическое изображение бактериофага ФА1-8р59Ь. Масштаб 100 нм (увеличение 40 000)

Использование метода электрооптического анализа микробных суспензий для детекции бактериофагов

В последнее время методы электрооптического (ЭО) анализа все чаще находят применение для решения ряда задач в микробиологии и биотехнологии.

Методы электрооптического анализа микробных суспензий основаны на регистрации -изменения оптических свойств микробной суспензии под влиянием переменного электрического поля. Исследование основано на измерении зарядов, индуцированных электрическим полем, на границе клеточных структур. После взаимодействия зарядов на этой границе с электрическим полем меняется ориентация бактерий в окружающей среде, что приводит к изменению оптических свойств суспензии (Shchyogolev й а1., 1994).

На данном этапе исследований изучалась возможность использования метода ЭО анализа микробных суспензий для детекции бактериофагов, при этом в качестве модели использовали бактериофаги ФА1-8р59Ь и ФА1-81165.

Для исследований нами были выбраны напряженность электрического поля 17 В/см при времени приложения электрического поля 3 сек и набор дискретных частот 20; 40; 100; 200; 400; 900; 1400 и 2100 кГц. Электропроводность воды во всех случаях составляла 1,6 (18/т.

При исследовании изменений величины ЭО параметров клеточных суспензии А. Иро/егит штаммов 8р59Ь и 8Я65 при взаимодействии с бактериофагами ФА1-8р59Ь и ФА1-81165, соответственно, показано, что в исследуемом диапазоне частот регистрируются значительные изменения величины ЭО сигнала суспензии клеток после взаимодействия с изучаемыми бактериофагами. При этом значительное изменение величины ЭО сигнала суспензии клеток А. Иро/егит 8р59Ь происходит при внесении бактериофага ФА1-8р59Ь из расчета 5 фаговых частиц на клетку (Рисунок 1 (А)). Для микробных клеток А. Иро/егит 81165 и бактериофага ФА1-8Я65 получены аналогичные результаты (Рисунок 2(Б)).

(1) - контроль - клетки без добавления вируса; клетки А. Иро/егит с добавлением разного количества бактериофагов: 5 (2), 10 (3), 15 (4), 20 (5), 25 (6), 30 (7) фаговых частиц на клетку

Рисунок 2 - Зависимость величины ЭО-сигнала суспензии клеток А. Иро/егит 8р59Ь от количества бактериофагов ФА1-8р59Ь (А) и суспензии клеток А. Иро/егит 8Я65 от количества бактериофагов ФА1-8Я65 (Б)

При изучении динамики изменений ЭО параметров суспензии клеток А. Иро/егит 8р59Ь при их инфицировании изучаемым бактериофагом в суспензию клеток А. Иро/егит 8р59Ь (108 клеток/мл) вносили бактериофаг ФА1-8р59Ь, затем

А

Б

инкубировали в течение 1, 5, 10, 20, 30, 40 и 60 мин. Как видно из полученных данных (Рисунок 3), изменение величины ЭО сигнала суспензии клеток А. Нро/егит штамма 8р59Ь происходит уже через 1 мин после добавления бактериофага ФА1-8р59Ь, что, вероятно, связано с адсорбцией бактериофага на поверхности клетки. Изменения величины ЭО сигнала суспензии клеток после 5, 10, 20, 30, 40 и 60 мин от начала инфекции клеток бактериофагом фиксировались в пределах 5%.

Для микробных клеток А. Нро/егит штамма 81165 и бактериофага ФА1-8Я65 были получены аналогичные результаты.

3000

2

3

4

5

6 7

а о

10 100 1000 10000 Частота, кГц

(1) - контроль - клетки без добавления бактериофагов; клетки с добавлением бактериофага через: (2) - 5 мин, (3) - 10 мин, (4) - 20 мин, (5) - 30 мин, (6) - 40 мин от начала инфекции

Рисунок 3 - Динамика изменения величины ЭО-сигнала суспензии клеток A. lipoferum Sp59b при их инфицировании бактериофагом ФА1-8р59Ь

Одним из важных моментов в разработке нового метода детекции вирусных частиц является получение аналитического сигнала в присутствии мешающих факторов и, прежде всего, в присутствии других вирусных частиц. Поэтому на следующем этапе изучались изменения ЭО параметров суспензии клеток A. lipoferum штаммов Sp59b и SR65 при их инфекции бактериофагами ®A1-Sp59b и ®A1-SR65 в присутствии других вирусных частиц. При изучении взаимодействия бактериофага ®A1-Sp59b с микробными клетками A. lipoferum штамма Sp59b в качестве мешающих факторов были использованы бактериофаги ®Ab-Sp7 и ®Ab-SR75, выделенные из клеток A. brasilense Sp7 и A. brasilense SR75, соответственно, которые были описаны в работе (Караваева, 2012).

При изучении взаимодействия бактериофага OAl-SR65 с клетками A. lipoferum штамма SR65 в качестве мешающего фактора был использован бактериофаг М13К07 (Marvin et al., 1994). Как видно из представленных данных (Рисунок 4) при добавлении к суспензии клеток A. lipoferum указанных бактериофагов в присутствии таких мешающих факторов, как посторонние бактериофаги, происходит изменение величины ЭО сигнала, т.е. возможна детекция изучаемых бактериофагов с помощью метода ЭО анализа.

На следующем этапе изучалась возможность детекции бактериофагов в присутствии микробных клеток посторонних культур. Для этого к смешанной суспензии клеток A. lipoferum Sp59b, A. brasilense штаммов Cd, Jm6B2 и A. irakense КВС1 (в соотношении 1:1:1:1) добавляли бактериофаг ФА1-йр59Ь и

регистрировали изменение величины ЭО сигнала. При регистрации взаимодействия бактериофага ФА1-ЯГ165 с клетками А. Иро/етт 51165 в качестве* -"

А о л п л _ Б

4000 ¡ 3500 § 3000 3 2500 Í 2000 £ 1500

и

I 1000

1500 S о

8000 700(1 6000 5000 4000 3000 2000 1000 о

-Í--b

100 1000 10000 1и ,ии *»"" Частота, кГц Частота, кГц

клетки без добавления бактериофагов; 2 - клетки с добавлением смеси

1 - контроль бактериофагов

Рисунок 4 - Изменение величины ЭО-сигнала суспензии клеток A. lipoferum Sp59b при их взаимодействии со смесью бактериофагов OAl-Sp59b, OAb-Sp7 и <í>Ab-SR75 (А) и суспензии клеток A. lipoferum SR65 при их взаимодействии со смесью бактериофагов <T>A1-SR65 и М13К07 (Б)

балластных культур использовали клетки A. brasílense S27 и A. irakense КАЗ. Из представленных данных видно (Рисунок 5), что при добавлении изучаемых бактериофагов к суспензии клеток A. lipoferum в присутствии клеток других видов микроорганизмов происходит значительное изменение величины ЭО сигнала. В контрольных экспериментах при изучении неспецифического взаимодействия бактериофага it>AI-Sp59b с клетками A. brasilense штаммов Cd, Jm6B2 и A. irakense КВС1 и бактериофага OA1-SR65 с клетками А. brasilense S27 и А. irakense КАЗ, изменений величины ЭО сигнала не происходит.

Таким образом, впервые, на примере бактериофагов <1>A1-Sp59b и <DA1-SR65, показана возможность детекции бактериофагов с помощью метода ЭО анализа микробных суспензий.

3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

Чистота, кГц

Чистота, кГц

(1) - контроль - клетки без добавления бактериофага; (2) - клетки с добавлением бактериофага Рисунок 5 - Изменение величины ЭО-сигнала смешанной суспензии клеток А. Ирфгит 5р59Ь, А. ЬгаяИете штаммов Cd, 1т6В2 и А. макете КВС1 при их инфекции бактериофагом ФА1-8р59Ь (А) и смешанной суспензии клеток А. lipoferum SR65, А. Ьга5Иеюе 827 и А. макете КАЗ при их инфекции бактериофагом ФA1-SR65 (Б)

Детекция бактериофагов при помощи метода электроакустического анализа

Следующим этапом исследований являлось изучение возможности детекции бактериофагов при помощи метода электроакустического анализа с использованием клеток Azospirillum lipoferum. В качестве моделей использовали бактериофаги Í>A1-Sp59b и 0A1-SR65.

Принцип действия акустических методов анализа основан на регистрации биоспецифических реакций в жидкой суспензии, контактирующей с поверхностью пьезоэлектрика. При взаимодействии бактериальных клеток испецифических бактериофагов происходит изменение вязкоупругих свойств жидкости. При контакте суспензии со свободной поверхностью пьезоэлектрического резонатора с поперечным полем эти изменения приводят как к сдвигу его резонансной частоты, (Ballato et al., 1986; Hu et al., 2004; Pinkham et al., 2005; Wark et al., 2007), так и к изменению частотных зависимостей электрического импеданса (Zaitsev et al., 2012). Оказалось, что последний эффект является наиболее чувствительным для детекции бактериальных клеток в суспензии, и именно он использовался при проведении исследований. Для этого использовали резонатор с поперечным возбуждающим электрическим полем, разработанный в СФИРЭ им. В.А. Котельникова (г. Саратов), исследования проводились совместно с сотрудниками данного института в лаборатории физической акустики.

Резонансная частота измерений составляла 6-7 МГц, а информационным сигналом датчика служила частотная зависимость реальной части электрического импеданса, которая выражалась как R (Ом). Путем анализа изменений этой зависимости с помощью пьезоэлектрического резонатора с поперечным полем регистрировали изменения указанных выше физических параметров суспензии клеток A. lipoferum штаммов Sp59b и SR65 при их взаимодействии с разным количеством бактериофагов OAl-Sp59b и ®A1-SR65, соответственно. Из представленных данных видно (Рисунок 6), что наиболее существенные изменения электроакустических параметров суспензии клеток происходят при внесении исследуемых бактериофагов в количестве 5 вирусных частиц на клетку.

На следующем этапе определялось оптимальное время регистрации взаимодействия суспензии клеток A. lipoferum штаммов Sp59b и SR65 с изучаемыми бактериофагами путем записи аналитического информационного сигнала датчика. В результате исследований показано, что значительное изменение физических параметров суспензии клеток A. lipoferum наблюдается уже после 1 минуты взаимодействия клеток с изучаемыми бактериофагами ФА1-Sp59b и ®A1-SR65 (Рисунок 7). В качестве контроля использовался выходной сигнал датчика в присутствии суспензии клеток A. lipoferum Sp59b и SR65 без добавления вирусов. Таким образом, минимальное время, необходимое для взаимодействия микробных клеток A. lipoferum с исследуемыми бактериофагами составляет ~ 1-5 мин.

На следующем этапе работы изучалась возможность детекции бактериофагов с использованием электроакустического датчика в присутствии мешающих факторов, таких как другие вирусы. При изучении взаимодействия вирусных

1 — суспензия клеток без добавления бактериофага; суспензия клеток с добавлением бактериофага в количестве 5 (2), 10 (3), 15 (4), 20 (5), 25 (6) вирусных частиц на клетку.

Рисунок 6 - Частотные зависимости реальной части электрического импеданса резонатора для суспензии клеток А. Нро/егит 8р59Ь с бактериофагом ФА1-8р59Ь

1 - суспензия клеток А. Нро/егит без добавления вируса; суспензия клеток А. Нро/егит с бактериофагом после инкубации в течение 1 (2), 5 (3), 10 (4), 20 (5) 30 (6) минут.

Рисунок 7 — Частотные зависимости реальной части электрического импеданса резонатора для суспензии клеток А. Нро/егит Бр59Ь с бактериофагом ФА1-8р59Ь (А) и клеток А. Нро/егит 8Я65 с бактериофагом ФА1-5Я65 (Б)

частиц ФА1-8р59Ь с микробными клетками А. Нро/егит Бр59Ь в качестве мешающего фактора были выбраны бактериофаги ФАЬ-8р7 и ФАЬ-81175; при изучении инфицирования клеток А. Нро/егит 81165 бактериофагом ФА1-8Я65 использовался бактериофаг М13К07. В результате исследований показано (Рисунок 8), что при добавлении к суспензии клеток А. Нро/егит указанных бактериофагов в присутствии таких мешающих факторов, как посторонние бактериофаги, происходит изменение величины электроакустического сигнала, следовательно, возможна детекция изучаемых бактериофагов в присутствии посторонних вирусных частиц с помощью электроакустического анализа.

При проведении контрольных экспериментов по изучению неспецифического взаимодействия клеток А. Нро/егит штаммов 8р59Ь и 81165 с бактериофагами ФАЬ-8р7, ФАЬ-81175 и М13К07, установлено, что изменения электроакустических параметров суспензии клеток не происходят.

ФЛЬ-Яр7 и ФАЬ-5Я75; 3 - клетки с добавлением смеси бактериофагов ФА1-5р59Ь, ФАЬ-5р7 и ФАЬ-51175

Б: 1 - клетки без добавления бактериофагов; 2 - клетки с добавлением бактериофага М13К07; 3 - клетки с добавлением смеси бактериофагов ФА1-8К65 и М13К07

Рисунок 8 - (А) Частотные зависимости реальной части электрического импеданса резонатора для суспензии клеток А. Нро/егит Бр59Ь при их взаимодействии со смесью бактериофагов ФА1-8р59Ь, ФАЬ-8р7 и ФАЬ-5Я75; (Б) Частотные зависимости реальной части электрического импеданса резонатора

для суспензии клеток А. Нро/егит 8К65 при их взаимодействии со смесью бактериофагов ФА1-8Я65 и М13К07

Таким образом, показано, что электроакустический датчик позволяет разграничивать еитуации, когда происходит взаимодействие бактериальных клеток со специфическими бактериофагами от контрольных экспериментов, когда такое взаимодействие отсутствует.

Далее изучалась возможность детекции бактериофагов с использованием метода электроакустического анализа в присутствии посторонней микрофлоры. В качестве посторонней микрофлоры при индикации бактериофага ФА1-8р59Ь использовались бактерии А. ЪгсиИете штаммов Сс1, .Гт6В2 и А. ¡гакете КВС1; при детекции бактериофага ФА1-8Я65 в качестве балластных культур использовались клетки А. Ъгаз'йете ЪП и А. ¡гакете К АЗ. Из представленных данных видно (Рисунок 9), что при добавлении бактериофагов к суспензии клеток А. Нро/егит в присутствии клеток других микроорганизмов происходит значительное изменение величины электроакустического сигнала.

При проведении контрольных экспериментов по изучению неспецифического взаимодействия бактериофага ФА1-8р59Ь с клетками А. ЪгахИете штаммов Сс1, ,1т6В2 и А. iraken.se КВС1, а также при изучении взаимодействия бактериофага ФА1-5К65 с клетками А. ЬгазНете 827 и А. iraken.se КАЗ установлено, что изменения электроакустических параметров суспензий не происходят.

Таким образом, на примере бактериофагов ФА1-8р59Ь и ФА1-81165, впервые показана возможность детекции бактериофагов с помощью метода электроакустического анализа.

1 - контроль - суспензия клеток без добавления вирусов; 2 - суспензия клеток с добавлением бактериофагов

Рисунок 9 — Частотные зависимости реальной части электрического

импеданса резонатора для смешанной суспензии клеток А. Нро/егит Яр59Ь,

А. ЪгаьИете штаммов С<1, ,1т6В2 и А. ¡гакепяе КВС1 при взаимодействии с ФА1-8р59Ь (А) и смешанной суспензии клеток А. Про/егит 81165, А. ЬгазНете 827 и А. /гакете КАЗ при взаимодействии с ФА1-8Я65 (Б)

Исследование взаимодействия микробных клеток со специфическими антителами при помощи метода электроакустического анализа

Поскольку размножение бактериофага возможно только в живых клетках, находящихся в стадии деления (Адаме, 1961; Лабинская, 1978), регистрация изменения электрофизических параметров микробных "клеток при их взаимодействии с бактериофагом являются тем маркером, который дополнительно позволяет судить о жизнеспособности клеток. Решая вопрос индикации бактериофагов, дополнительно возникает задача детекции микробных клеток-хозяев бактериофагов.

Специфичные поликлональные антитела успешно используются для идентификации микроорганизмов (Во§а1угеу е1 а1., 1992; Оайсоупе е1 а1., 1997; Уа^Ьап е1: а1., 2001). Поэтому на данном этапе изучалась возможность использования метода электроакустического анализа для детекции бактериальных клеток с помощью специфичных антител на примере микробных клеток А. Иро/егит 8р59Ь и А. ЬгазНете 8р7.

Исследование взаимодействия микробных клеток А. Иро/егит вр59Ь со специфическими антителами при помощи метода электроакустического

анализа

Первоначально проводили исследования по детекции микробных клеток с помощью метода электроакустического анализа на примере клеток А. Нро/егит вр59Ь и антител, специфичных к клеткам А. Нро/егит 8р59Ь.

При определении минимального количества антител, необходимых для детекции клеток установлено, что значительные изменения электроакустических параметров суспензии клеток происходят при взаимодействия с Ат, при этом максимальное изменение физических параметров происходит при внесении антител в количестве 1,0 цг/мл.

При определении минимального количества детектируемых клеток с использованием изучаемых антител при помощи метода электроакустического анализа были проведены измерения при количестве клеток в ячейке 10б, 104, 103 и 102 клеток/мл. Показано, что для суспензии клеток А. Иро/егит 8р59Ь при количестве клеток в измерительной ячейке 103 клеток/мл внесение изучаемых антител в количестве 0,1 цг/мл, приводит к существенному изменению значений электроакустических параметров (Рисунок 10).

Рисунок 10 — Частотные зависимости реальной части электрического импеданса резонатора при взаимодействии клеток А. lipoferum Sp59b со специфическими антителами (количество клеток в ячейке 103 клеток/мл)

Таким образом, показано, что предел детекции клеток А. lipoferum Sp59b при их взаимодействии со специфическими антителами с использованием метода электроакустического анализа составляет 103 клеток/мл.

Для изучения возможности детекции клеток с помощью метода электроакустического анализа с использованием антител в присутствии посторонней микрофлоры, в качестве мешающего фактора использовали клетки Е. coli В-878. Как видно из полученных данных (Рисунок 11), при добавлении к суспензии клеток А. lipoferum Sp59b специфических антител в присутствии

1 — суспензия клеток без добавления антител; 2 — суспензия клеток с добавлением антител

Рисунок 11 - Частотные зависимости реальной части электрического импеданса резонатора со смешанной суспензией клеток А. lipoferum Бр59Ь и Е.соП В-878 (в соотношении 1:1) при взаимодействии с антителами

посторонней микрофлоры (клеток Е. coli В-878), происходит изменение электроакустических параметров-суспензии, которые регистрируются датчиком.

При проведении контрольных экспериментов по регистрации изменений электроакустических параметров суспензии клеток Е. coli В-878 при добавлении к ним антител, специфичных к клеткам A. lipoferum Sp59b, установлено, что изменений электроакустических параметров не происходит, т.е., антитела, специфичные к A. lipoferum Sp59b не взаимодействуют с бактериями Е. coli В-878.

Таким образом, впервые показана возможность детекции микробных клеток А. lipoferum Sp59b при их взаимодействии со специфическими антителами с помощью метода электроакустического анализа.

Исследование взаимодействия микробных клеток A. brasilense Sp7 со специфическими антителами при помощи метода электроакустического

анализа

Поскольку микробные клетки А. brasilense штамма Sp7 являются одним из наиболее изученных модельных объектов в исследованиях ассоциативного взаимодействия и играют важную роль в стимуляции роста растений, на данном этапе проводились исследования по регистрации изменений электроакустических параметров суспензии клеток А. brasilense Sp7 при их взаимодействии с О-специфическими антителами. Для этого проводились исследования по определению минимального предела детекции клеток с использованием антител с помощью метода электроакустического анализа. Показано, что электроакустические параметры суспензии клеток при внесении специфических антител, значительно отличаются от параметров контрольной суспензии клеток без добавления специфических антител. Определен нижний предел возможного определения микробных клеток, который составляет ~104 всл/мл при их

Рисунок 12 - Частотные зависимости реальной части электрического импеданса резонатора при взаимодействии клеток А. Ьга$Иете вр7 с антителами (количество клеток в ячейке 104 кл/мл) При проведении контрольных экспериментов по специфичности взаимодействия антител с клетками А. ЬгаяИете Яр7 с помощью электронно-микроскопического исследования установлено, что используемые антитела взаимодействуют с клетками азоспирилл, причем скопление маркера происходит

по всей поверхности клетки.

Также показана возможность детекции клеток А. brasilense Sp7 при их взаимодействии со специфичными антителами в присутствии посторонней микрофлоры (клеток Е. coli BL-Ril) с помощью электроакустического анализа.

Таким образом, впервые показана возможность использования антител, специфичных к микробным клеткам А. lipoferum Sp59b и А. brasilense Sp7, для детекции клеток азоспирилл с помощью метода электроакустического анализа.

Результаты проведенных исследований подтвердили актуальность, большую значимость и дальнейшую перспективность разрабатываемых подходов для применения в микробиологии и биотехнологии.

ВЫВОДЫ

1. Из микробных клеток Azospirillum lipoferum штаммов Sp59b и SR65 выделены бактериофаги <I>A1-Sp59b и ®A1-SR65 с применением индуцирующего фактора — низкой температуры. Литическая активность бактериофагов OAl-Sp59b и OAI-SR65 по методу Грациа составила 8,9х 10й и 1,6х109, соответственно. Бактериофаги <I>A1-Sp59b и ®A1-SR65 термостабильны, устойчивы к воздействию хлороформа, сохраняют высокую активность при изменении pH. При хранении бактериофага <t>Al-Sp59b в трис ЭДТА буферном растворе при температуре -4°С через 7 месяцев его активность составляет 6,5х 106 фаговых частиц/мл; активность бактериофага ФА1-SR65 при аналогичных условиях через 12 месяцев составляет 4,5 х 105 фаговых частиц/мл.

2. Установлено, что бактериофаги <DA1-Sp59b и «I>A1-SR65 в соответствии с морфологическими параметрами согласно Международной классификации и номенклатуре вирусов относятся к семейству Podoviridae, а по классификации A.C. Тихоненко к II морфологической группе: «Фаги с аналогом отростка».

3. На примере бактериофагов <t>Al-Sp59b и OA1-SR65 показана возможность использования метода электрооптического анализа для детекции бактериофагов. Установлено, что с помощью метода электрооптического анализа можно разграничивать специфическое и неспецифическое взаимодействие бактериофагов с микробными клетками. Определен нижний предел детекции бактериофагов, который составляет 106 фаговых частиц/мл, при этом время анализа составляет 5-10 мин.

4. Показана возможность детекции бактериофагов с помощью метода электроакустического анализа суспензии клеток, при этом нижний предел детекции бактериофагов составляет 106 фаговых частиц/мл, время анализа 1-5 мин.

5. Продемонстрирована возможность детекции бактериофагов методами электрооптического и электроакустического анализа микробных клеток в присутствии таких мешающих факторов, как посторонние бактериофаги и балластные микроорганизмы.

6. Установлено, что метод электроакустического анализа микробных суспензий позволяет идентифицировать микробные клетки азоспирилл, при этом нижний предел детекции составляет ~104 клеток/мл. На примере антител, специфичных к микробным клеткам А. lipoferum Sp59b и А. brasilense Sp7,

показана возможность детекции клеток азоспирилл с помощью метода электроакустического анализа в присутствии посторонней микрофлоры.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Гулий О.И., Зайцев Б.Д., Кузнецова И.Е., Шихабудинов A.M., Матора Л.Ю., Макарихина С.С., Игнатов О.В. Детекция микробных клеток с помощью электроакустического датчика // Микробиология. - 2013. Т. 82, вып. 2. С. 218227.

2. Макарихина С.С., Гулий О.И., Соколов О.И., Буров A.M., Павлий С.А., Сивко О.Н., Володин Д.Ю., Игнатов О.В. Выделение и характеристика бактериофага AzospiriJlum lipoferum штамма Sp59b // Известия Саратовского университета. Серия Химия. Биология. Экология. - 2013. Вып. 2- С. 56-60.

3. Гулий О.И., Караваева O.A., Макарихина С.С., Павлий С.А., Игнатов О.В. Детекция бактерий рода Azospirillum с помощью бактериофагов, выделенных из Azospirillum brasilense штаммов Sp7 и SR75 // Материалы международной научно-практической конференции «Бактериофаги: Теоретические и практические аспекты применения в медицине, ветеринарии и пищевой промышленности». -Ульяновск: УГСХА им. П.А. Столыпина. - 2013, т.1 - С. 49-53.

4. Макарихина С.С., Гулий О.И., Караваева O.A., Павлий С.А., Володин Д.Ю., Соколов О.И., Игнатов О.В. Исследование бактериофага почвенных бактерий Azospirillum lipoferum Sp59b II Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой: Материалы VI Всероссийской конференции молодых ученых. - Саратов, 2012. - С. 37.

5. Караваева O.A., Гулий О.И., Макарихина С.С., Павлий С.А., Володин Д.Ю., Игнатов О.В. Выделение бактериофагов из Azospirillum brasilense Sp7 и их применение для детекции азоспирилл // Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой: Материалы VI Всероссийской конференции молодых ученых. - Саратов, 2012. - С. 160.

6. Гулий О.И., Караваева O.A., Макарихина С.С., Павлий С.А., Володин Д.Ю., Сивко О.Н., Бунин В.Д., Игнатов О.В. Определение спектра литической активности бактериофагов с помощью метода электрооптического анализа клеточных суспензий // Биотехнология: реальность и перспективы в сельском хозяйстве: Материалы Международной научно-практической конференции. -Саратов: Издательство «КУБиК», 2013. - С. 183-184.

7. Гулий О.И., Зайцев Б.Д., Кузнецова И.Е., Шихабудинов A.M., Матора Л.Ю., Макарихина С.С., Караваева O.A., Игнатов О.В. Исследование взаимодействия микробных клеток с антителами при помощи резонатора с поперечным электрическим полем // Биология - наука XXI века: Тезисы 16-ой международной Пущинской школы-конференции молодых ученых. — Пущино, 2012.-С.223.

8. Гулий О.И., Макарихина С.С., Караваева O.A., Павлий С.А., Игнатов О.В. Определение микробных клеток Azospirillum с помощью метода электрооптического анализа клеточных суспензий // Биология - наука XXI века: Тезисы 17-ой международной Пущинской школы-конференции молодых ученых. - Пущино, 2013. - С. 331.

Подписано в печать 28.10.2013. Объем- 1 печ. л. Тираж 100. Заказ №989. Отпечатано с оригинал-макета в типографии «Техно-Декор» по адресу: 410012, г. Саратов, ул. Московская, 160. sar-print.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Макарихина, Светлана Сергеевна, Саратов

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ БИОХИМИИ И ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИЙ И МИКРООРГАНИЗМОВ РАН

На правах рукописи

04201450009

МАКАРИХИНА СВЕТЛАНА СЕРГЕЕВНА

ВЫДЕЛЕНИЕ БАКТЕРИОФАГОВ ИЗ БАКТЕРИЙ AZOSPIRILLUM 1ЛРО¥Е11иМ 8р59Ь и 8Я65 И ИХ ДЕТЕКЦИЯ МЕТОДАМИ ЭЛЕКТРОФИЗИЧЕСКОГО АНАЛИЗА

03.02.03 - микробиология 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: доктор биологических наук, доцент О.И. Гулий доктор биологических наук, профессор О.В. Игнатов

Саратов - 2013

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ 5

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Бактериофаги почвенных микроорганизмов 11

Глава 2. Методы детекции вирусных частиц 23

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 3. Объекты, материалы и методы исследований 37

3.1. Бактериальные штаммы и условия выращивания бактерий 37

3.2. Выделение и характеристика бактериофагов

3.2.1. Определение количества фаговых частиц 3 8

3.2.2. Определение морфологии негативных колоний 39

3.2.3. Определение диапазона литической активности и специфичности действия выделенных бактериофагов 39

3.2.4. Определение устойчивости выделенных бактериофагов к воздействию высокой температуры 40

3.2.5. Определение устойчивости выделенных бактериофагов к воздействию хлороформа 41

3.2.6. Определение устойчивости выделенных бактериофагов к изменению значений рН буферного раствора 41

3.2.7. Определение изменения активности бактериофагов при хранении 41

3.2.8. Изучение морфологии фаговых частиц с помощью электронной микроскопии 42

3.3. Электрооптический анализ клеточных суспензий с применением выделенных бактериофагов

3.3.1. Подготовка клеток к электрооптическому анализу 43

3.3.2. Проведение электрооптического анализа клеточных суспензий 43

3.4. Электроакустический анализ клеточных суспензий

3.4.1. Подготовка клеток к электроакустическому анализу 45

3.4.2. Проведение электроакустического анализа микробных суспензий 46

3.4.3 Антитела 48

3.4.4. Взаимодействие антиген-поликлональные антитела 48

3.4.5. Приготовление препарата для изучения взаимодействия клеток бактерий А. ЬгаяИете Бр7 с антителами при помощи электронной микроскопии 49 РЕЗУЛЬТАТЫ ИСЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 4. Выделение и характеристика бактериофагов из АгоБр^Шит Нро/егит штаммов 8р59Ь и 81165 5С

4.1. Выделение и характеристика бактериофага из АгозртИит Нро/егит 8р59Ь 51

4.2. Выделение и характеристика бактериофага из АгоБртПит Нро/егит штамма 8Я65 63 Глава 5. Использование метода электрооптического анализа микробных суспензий для детекции бактериофагов 75

5.1. Детекция бактериофагов с использованием клеток АгоБртИит Нро/егит 8р59Ь при помощи метода электрооптического анализа микробных суспензий И

5.2. Детекция бактериофагов с использованием клеток АгоБртПит Нро/егит. 8Я65 при помощи метода электрооптического анализа микробных суспензий 87 Глава 6. Использование метода электроакустического анализа микробных суспензий для детекции бактериофагов 98

6.1. Детекция бактериофага ФА1-8р59Ь с использованием клеток АгозртПит Нро/егит при помощи метода электроакустического

анализа 99

6.2. Детекция бактериофага ФА1-8Я65 с использованием клеток АгозрМИит Нро/егит штамма 8Я65 при помощи метода

электроакустического анализа 107 Глава 7. Исследование взаимодействия микробных клеток со специфическими поликлональными антителами при помощи

резонатора с поперечным электрическим полем 115

7.1. Исследование взаимодействия микробных клеток А Иро/егит Бр59Ь со специфическими поликлональными антителами при помощи резонатора с поперечным электрическим полем 116

7.2. Исследование взаимодействия микробных клеток А. ЬгаБПете Эр7 со специфическими поликлональными антителами при помощи резонатора с поперечным электрическим полем 126 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 135 ВЫВОДЫ 141 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ 143 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ЛИТЕРАТУРНЫХ ИСТОЧНИКОВ 145

ВВЕДЕНИЕ

Бактериофаги почвенных микроорганизмов привлекают внимание исследователей из-за их повсеместного распространения, многообразия и важной экологической роли (Clokie and Kropinski, 2009; Dwivedi et al., 2012). При. этом большинство исследований основано на выделении бактериофагов из различных объектов окружающей среды, в том числе из почвы (Ashelford et al., 2002; Williamson et al., 2003, 2005; Helton et al., 2006; Srinivasiah et al., 2008; Romero-Suarez et al., 2012), и лишь незначительная часть работ посвящена выделению и характеристике бактериофагов непосредственно из бактериальных клеток (Mayer et al., 1973; Boyer et al., 2008; Шабурова и др., 2009). Поэтому перспективным направлением исследований является выделение и изучение бактериофагов почвенных микроорганизмов.

Бактериофаги находят широкое применение в медицине для лечения бактериальных заболеваний, в генной инженерии для векторного переноса генетических элементов, являются удобной моделью для расшифровки генетического кода и понимания структуры гена, процессов мутагенеза, влияния различных факторов на передачу наследственной информации в живых системах (Стейниер и др., 1979). В природе бактериофаги играют важную роль в качестве фактора, регулирующего численность микробных клеток и в переносе генетической информации посредством трансдукции (Шестаков, 2007). Прогресс в изучении и использовании бактериофагов во многом определяется разработкой и внедрением новых методов их детекции. В настоящее время разработано 1лного методов индикации и исследования вирусных частиц, но их использование затруднено из-за сложности и малого числа существующих измерительных приборов. Поэтому актуальной является разработка новых экспресс-методов детекции бактериофагов, позволяющих получать точные результаты за короткое время в автоматическом режиме.

В последнее время электрофизические методы, такие как электрооптического и электроакустического анализа, все чаще находят применение для решения ряда

задач в микробиологии и биотехнологии. Достоинствами метода электрооптического (ЭО) анализа является возможность анализа нативных клеток без их повреждения, возможность полной автоматизации и стандартизации процесса анализа, быстрота проведения анализа (около 10 мин), высокая чувствительность и небольшая погрешность измерений (в пределах 5%), что позволит использовать данный метод анализа для индикации вирусных частиц, в том числе, в полевых условиях.

Электроакустические методы анализа привлекают все большее внимание исследователей для анализа биоспецифических взаимодействий, поскольку характеризуются высокой чувствительностью, точностью измерений (в пределах 2%) и минимальным временем для проведения анализа. Поэтому перспективным направлением исследований является использование метода электроакустического анализа для решения вопросов детекции бактериофагов.

Поскольку бактериофагам присущи резко выраженные паразитические свойства, обуславливающие возможность их существования и размножения только в культурах соответствующих видов микроорганизмов, размножение бактериофагов возможно только в живых клетках. Следовательно, изменения электрофизических параметров микробных клеток при их взаимодействии с бактериофагом являются тем маркером, который дополнительно позволяет судить о жизнеспособности клеток. В связи с этим при решении вопроса индикации бактериофагов дополнительно возникает задача детекции микробных клеток -хозяев бактериофагов. Поэтому актуальным направлением исследований является разработка новых методов детекции клеток-хозяев бактериофагов.

Цель работы - выделение и изучение бактериофагов из АгоБртИит Нро/егит штаммов Эр59Ь и 81165, и разработка новых методов детекции бактериофагов и клеток азоспирилл с помощью методов электрооптического и электроакустического анализа микробных суспензий.

Для достижения поставленной цели в работе были сформулированы следующие задачи:

1. Выделить бактериофаги из клеток Ахоэр^Шит Нро/егит штаммов 8р59Ь и 81165 и изучить их биологические свойства.

2. Исследовать возможность использования метода электрооптического анализа микробных суспензий для детекции бактериофагов на примере бактериофагов, выделенных из А. Нро/егит Бр59Ь и 81165.

3. Изучить возможность применения метода электроакустического аьализа клеточных суспензий для детекции бактериофагов.

4. Показать возможность использования методов электрооптического и электроакустического анализа микробных суспензий для детекции бактериофагов, в смеси бактериофагов и в присутствии посторонней микрофлоры.

5. Разработать методические подходы индикации бактерий АгоэртПит при их взаимодействии со специфическими антителами с помощью метода электроакустического анализа.

Научная новизна работы.

У клеток АгояртИит Нро/егит штаммов 8р59Ь и 81165 обнаружено явление лизогении. Впервые из клеток А. Нро/егит штаммов 8р59Ь и 8Я65 выделены бактериофаги ФА1-8р59Ь и ФА1-8Я65. Представлена характеристика выделенных бактериофагов и определено их таксономическое положение - они относятся к семейству Рос1оутс1ае.

Впервые на примере бактериофагов ФА1-8р59Ь и ФА1-8Я65, показана возможность детекции вирусных частиц с помощью методов электрооптического и электроакустического анализа. Впервые установлена возможность использования методов электрооптического и электроакустического анализа микробных суспензий для детекции бактериофагов в смеси бактериофагов и в присутствии посторонней микрофлоры.

Впервые использованы антитела, специфичные к микробным клеткам А. Иро/егит 8р59Ь и А. ЪгазИете 8р7, для детекции клеток азоспирилл с помощью метода электроакустического анализа клеточных суспензий.

Показана возможность использования метода электроакустического анализа суспензий клеток для детекции азоспирилл при их взаимодействии со специфическими антителами в присутствии посторонней микрофлоры.

Практическая значимость работы.

Выделение и изучение бактериофагов из клеток А. Иро/егит штаммов 8р59Ь и 81165 показало перспективы для их использования при разработке чувствительных методов детекции бактериофагов. Разработана методология детекции бактериофагов электрооптическим анализом клеточных суспензий.

Изучение бактерофагов, выделенных из бактерий рода АгоярггШит, позволяет проводить фаготипирование почвенных бактерий.

Предложен новый способ индикации бактериофагов с помощью метода электроакустического анализа клеточных суспензий.

Использование антител, специфичных к микробным клеткам А. Иро/егит 8р59Ь и А. ЪгазИете 8р7, показало возможности их применения для детекции клеток азоспирилл с помощью метода электроакустического анализа. Предложен новый подход для детекции микробных клеток с помощью электроакустического метода анализа.

Детекция клеток методом электроакустического анализа позволит проводить контроль численности клеток АгойртЫит при их использовании в качестве бактериальных удобрений.

Метод электроакустического анализа был использован при выполнении работы по Госконтракту с Саратовским филиалом Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институтом радиотехники и электроники им. В.А. Котельникова, г. Саратов от 29 июня 2010 г. (в рамках гранта РФФИ № 09-02-12442-офи_м «Исследование физических основ работы нового поколения многопараметрических акустоэлектронных датчиков для

изучения и мониторинга биологических реакций в клеточных суспензиях», 20092010 гг.)

Метод электрооптического анализа был использован при выполнении работы «Разработка методологии и приборного обеспечения электрооптического анализа вирусов микроорганизмов» при поддержке Министерства образования Российской Федерации, соглашение № 8852 (2012-2013 гг.).

По результатам диссертации были изданы методические рекомендации по определению литической активности бактериофагов с помощью метода электрооптического анализа клеточных суспензий для студентов старших курсов и аспирантов, специализирующихся в области микробиологии, рекомендованные ученым советом ИБФРМ РАН (протокол № 9 от 25.09.2012 г.).

Материалы, представленные в диссертации, включены в программы лекций по биотехнологии и микробиологии, для студентов и аспирантов в ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова» и ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского».

Основные положения, выносимые на защиту:

1. У микробных клеток А. Иро/егит штаммов 8р59Ь и 81165 обнаружено явление лизогении. Использование индуцирующего фактора - низкой температуры позволяет выделять бактериофаги из А. Нро/егит штаммов Бр59Ь и 81165.

2. Изменения электрооптических и электроакустических параметров микробных суспензий при их инфицировании специфическими бактериофагами применимы для детекции бактериофагов.

3. Метод электроакустического анализа микробных суспензий позволяет проводить детекцию бактерий азоспирилл с применением антител.

Апробация работы.

Основные положения работы были представлены на: 16-ой и 17-ой Международных Пущинских школах-конференциях молодых ученых «Биология -наука XXI века» (Пущино, 2012); 5-ой Всероссийской конференции молодых ученных «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2012); Международной научно-практической конференции «Биотехнология: реальность и перспективы в сельском хозяйстве» (Саратов, 2013); Международной научно-практической конференции «Бактериофаги: Теоретические и практические аспекты применения в медицине, ветеринарии и пищевой промышленности» (Ульяновск, 2013).

Работа выполнена в лаборатории физиологии микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (ИБФРМ РАН) в соответствии с плановыми темами НИР «Исследование электрофизических свойств микробных клеток при их инфицировании бактериофагами» 2009-2012 гг. (№ гос. регистрации 01200904393, научный руководитель зав. лаб. д.б.н., профессор Игнатов О.В).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 8 работ, из них 2 статьи в журналах, рекомендуемых ВАК.

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей объекты, материалы и методы исследований, результаты исследований и их обсуждение, а также заключения, выводов и списка использованных литературных источников, включающего 151 наименований, в том числе 88 зарубежных. Диссертация изложена на 160 страницах компьютерного текста, включающего 39 рисунков и 10 таблиц.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Бактериофаги почвенных микроорганизмов

Бактериофаги (фаги) (от др.-греч. «пожираю») — вирусы, избирательно поражающие бактериальные клетки. Эти вирусы получили свое название в соответствии с тем, что они «нападают» на бактерии-хозяева и избирательно «пожирают» их клетки (Ожерельева, 1989; Ковалева, 2009). Более чем полувековое использование бактериофагов в качестве удобных объектов исследований привело к многочисленным открытиям в областях молекулярной и структурной биологии, физиологии и эволюции микроорганизмов и вирусов, развитию физико-химических методов исследования микрообъектов (Фильчиков и др., 2009).

Бактериофаги широко распространены в природе и выполняют важную? роль в контроле численности микробных популяций, а также в переносе бактериальных генов, выступая в качестве векторных «систем» (Шестаков, 2007). Действительно, бактериофаги представляют собой один из основных подвижных генетических элементов. Посредством трансдукции они привносят в бактериальный геном новые гены. Было подсчитано, что за 1 секунду могут быть инфицированы до 1024 бактерий (ТейеПп е1 а1., 2005; Воуег е1 а1., 2008). Это означает, что постоянный перенос генетического материала распределяется между бактериями, обитающими в сходных условиях. Высокий уровень специализации, долгосрочное существование, способность быстро репродуцироваться в соответствующем хозяине способствует их сохранению в динамичном балансе среди широкого разнообразия видов бактерий в любой природной экосистеме. Когда подходящий хозяин отсутствует, многие фаги могут сохранять способность к инфицированию на протяжении десятилетий, если не будут уничтожены химическими веществами, либо экстремальными условиями внешней среды (Оийтап ^ а1., 2005). Приблизительный размер популяции фагов составляет более Ю30 фаговых частиц (8ий1е, 2005).

Бактериофаги встречаются в тех местах, где есть чувствительные к ним бактерии, в которых бактериофаг может размножаться. Чем богаче тот или иной субстрат (почва, вода, выделения человека и животных и т. д.) микроорганизмами, тем в большем количестве в нем встречаются соответствующие бактериофаги (Шестаков, 2007).

Бактериофаги различаются по химической структуре, типу нуклеиновой кислоты, морфологии и характеру взаимодействия с бактериями.

По размеру бактер