Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гены ДНК-лигаз Т-четных бактриофагов

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Гены ДНК-лигаз Т-четных бактриофагов"

А - (»• ¿У ЧС*

- ■ • ;■ ««г!

"' 1

АКАДЕМИЯ НАУК СССР

ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ

На правах рукописи УДК 577.1

ЗИМИН Андрей Антонович ГЕНЫ ДНК-ЛИГАЗ Т-ЧЕТНЫХ БАКТЕРИОФАГОВ специальность 03.00.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата . биологических наук

Москва - 1988

Работа пополнена в Отделе молекулярной биологии и молекулярной генетики микроорганизмов Института биохимии и'физиологии микроорганизмов АН СССР

Научные руководители :

академик А.А.Баев

докт.Сися.наук В.И.Таняшин Официальные оппоненты:

профессор, докт.биап.наук Б.Ф.Поглазов

докт.биол.наук П.М.Рубцов

Ведущее учреждение - Институт молекулярной генетики АН СССР

Защита диссертации состоится 198^ г. час .рО мин.

на заседании специализированного совета ДО02.79.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте молекулярной биологии по адресу: 117984 , Москва , ул. Вавилова, 32

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Института молекулярной биологии АН СССР.

актуальность темы

Отдал

ЭЭЦояи

работа посвящена изучению генов ДНК-лигаз Т-четных бактериофагов. ДНК-лигаза - ключевой фермент репликации, рекомбинации и репарации. За прошедшие со времени открытая этого фермента два десятилетия интерес к нему у исследователей не ослабевает. Дополнительная необходимость исследования и клонирования генов этих ферментов вытекает из очень широкого применения ДНК-лигазы фага Т4 в экспериментах по генетической инженерии и синтезу генов.

Изучение связи структуры и функции фермента в настоящее время требует определения нуклеотидной последовательности его гена и может быть сильно облегчено дополнительным анализом гомологичного гена и его продукта. Исследование генов ДНК-лигаз фагов Т4 и Тб, а также создание систем суперпродукции ДНК-лигазы фага Тб является необходимым этапом структурно-функционального анализа фермента и направлено как на решение эволюционных и молекулярно-биологических вопросов, так и на обеспечение практики генно-инженерных работ.

ЦЕПЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Цель настоящей работы заключалась в сравнительном исследовании генов ДНК-лигаз Т-четных бактериофагов и в создании штаммов-продуцентов ДНК-лигазы фага Тб методами генной инженерии. В задачу исследования входило клонирование гена ДНК-лигазы фага Т4 в плазмиду, оптимизация методов гидролиза оксиметилцитозинсодержамей ДНК Т-четных фагов эндо-нуклеазами рестрикции, клонирование гена ДНК-лигазы фага Тб из такой сложномодифицированной ДНК, определение полных первичных структур данных генов, выявление степени гомологии ДНК-лигаз и их генов с помощью сравнительного анализа аминокислотных и нуклеотидных последовательностей и получение мтамма-суперпродуцента ДНК-лигазы фага Тб.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Основная часть,работы посвящена новому этапу в исследовании Т-четных бактериофагов - сравнительному изучению отдельных генов. В настоящей работе впервые был клонирован ген ДНК-лигазы фага Тб. Для клонирования данного гена Были исследованы и оптимизированы условия гидролиза оксиметилцитозинсодержащей ДНК фага Тб. Ген ДНК-лигазы фага Т4 был впервые клонирован в составе плазмидного вектора.

Впервые определены нуклеотидные последовательности генов ДНК-лигаз

1

бактериофагов Т4 и Т6. Выведены полные первичные структуры этих ферментов, состоящих из 487 аминокислот. Проведенный сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов ДНК-лигаз фагов Т4 и Тб выявил их большую гомолэгию. В генах имеется 41 нуклеотидная замена, а в ферментах - б аминокислотных взаимных замен. Все аминокислотные замены локализованы в центральной части последовательности. Обнаружено специфическое расположение замен в сравниваемых генах. Показана высокая консервативность регуляторных областей, но обнаружено различие в структуре перекрытия гена ДНК-лигазы с предшествующей ему открытой рамкой трансляции.

Исследование экспрессии гена 30 фага Тб под контролем промотора лактозного оперона кишечной палочки и под контролем левого промотора бактериофага лямбда были проведены впервые и позволили создать штаммы-суперпродуценты ДНК-лигазы фага Тб.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Полученные в диссертационной работе данные расширяют современные представления о структурной организации и молекулярной эволюции ключевого фермента генетических процессов - ДНК-лигазы. Результаты настоящей работы, а также сконструированные готазмиды и штаммы представляют несомненный практический интерес, так как разработанные в диссертации подходы могут быть использованы для клонирования любых гомологичных генов Т-четных бактериофагов с последующим получением штаммов-суперпродуцентов различных белков. С этой точки зрения представляет научный и практический интерес клонирование любых других гомологичных генов и исследование других белков Т-четных бактериофагов. Примером применения в практике молекулярно-биологических экспериментов гомологичных белков могут служить РНК-полимеразы фагов ТЗ и Т7, широко использующиеся для промсггорспецифичного синтеза мРНК. Успешное использование для клонирования модифицированной (оксиметилцитозинсодержащей) ДНК фага Тб открывает пути клонирования любых мутантных генов Т-четных бактериофагов, что расширяет возможности для генетического и молекулярно-бисшогическо-го анализа на таком удобном об'екте как фаг Т4.

йтаммы-суперпродуценты ДНК-лигазы фага Тб могут быть использованы не только для наработки этого фермента, но и для исследования регуляции экспрессии генов, для исследования роли этого фермента в развитии и эволюции фага. Можно считать, что в данной работе создана база для исследования ДНК-лигаз методами белковой инженерии. 2

АПРОБАЦИЯ

Материалы диссертации докладывались на Всесоюзной конференции "Генетическая инженерия" (Пущино,1'980), на 6-ом двустороннем симпозиуме СССР-Франция "Структура и функция белков и нуклеиновых кислот" (Цхалтубэ,'1'982), на Всесоюзной конференции "Метаболитические плазмиды бактерий" (Таллин,t982), на 3-ем двустороннем симпозиуме СССР-Италия "Макромолекулы в функционирующей клетке" (Siena, 1983)> на Всесоюзной конференции "Вирусы микроорганизмов и растений" (Ташкент, 1' 986), на Всесоюзной конференции "Новые направления в биотехнологии" (Пуиино, 1986).

ПУБЛИКАЦИИ.

Основное содержание диссертации отражено в 8 опубликованных работах.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация изложена на 1'27 страницах,состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения и выводов. Работа иллюстрирована 22 рисунками и 3 таблицами. Список цитируемой литературы состоит из 225 наименований-

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

•1'. Клонирование гена ДНК-лигазы фага Т4-

Для решения задач по структурно-функциональному исследованию ДНК-лигаз было необходимо клонировать гены этих ферментов в составе плазмидных и фаговых векторов. Для гена ДНК-лигазы фага Т4 эта задача была частично решена до начала наших исследований• Этот ген был клонирован в составе лямбда-Т4-рекомбинантов (Wí"l 1 aon,Murray,1979)• Рекомби-нант NM967 был любезно предоставлен Н.Муррей. Ген ДНК-лигазы фага Т4 был реклонирован в составе одного Нin'dIII-фрагмента в плазмидный вектор рIL203(Солонин и др. 1*979) с получением плазмиды рТРЬ2Т, в которой часть гена с1 фага лямбда была замещена геном 30 Фага Т4 (Рис.Т). Это позволило отбирать клоны по потере способности плазмид придавать клеткам Б.coli устойчивость к фагу лямбда сТ/26. Картирование плазмиды pTFL21-ресгриктазами EcoRI, HindITI и BglII - показало наличие в этой плазмиде

3

Рис. 1 .Схема конструиро -вания плазмида pTPL2t. PI, Рг, Pre, Prm - промоторы фага лямбда; его, N, cl - гены ф;»га лямбда Н - Hindlll, В -BamHI, Е - EcoRI.

гена 30 в такой ориентации, что транскрипция с собственного промотора данного гена направлена навстречу промоторам Prm и Pre фага лямбда.

2.Структура гена ДНК-лиi азы фага Т4.

Стратегия определения первичной структуры ДНК показана на рисунке 3- Определение первичной структуры проводили методом Максама и Гилберта (1-980) совместно с А.С.Краевым, М.В.Мироновой и К.Г.Скрябиным . Для определения первичной структуры кроме плазмида pTFL2t использовали плаэ-миду pL30(2), которая была любезно предоставлена Б.М.Трояновским.

Первоначально определение структуры проводилось от сайтов ресгрик-таз: EcoRI, Hindlll и Bglll, которые были картированы ранее, а также проводилось картирование рестриктазами: BspHI, Kspl, Sau3AI и Alul (Рис.2.). Затем была составлена карта расположения сайтов мелкомепядах ресгриктаз в клонированном фрагменте, которую потом сопоставляли с первичной структурой. На заключительном этапе проводили определение первичной структуры ог сайтов ресгриктазы EcoRII с перекрытием сайтов рестриктаз EcoRI и Bglll. Таким образом была определена полная первичная структура фрагмента длиной Т993 пары нуклеотидов. 94$ последовательности было определено независимо для обеих комплементарных цепей.

Рис.2. Картирование фрагментов Е1 и Е2 рестриктазами: 1-5 - , 6-10 - Е2, 1 и 6 без рестриктазы, 2 и 7 - Alul, 3 и 8 -BspRI, 4 и 9 - Mspl, 5 и 10 - Sau3AI. Молекулярная масса ДНК-лигазы фага Т4 ранее была определена гель-электрофорезом в присутствии ДСН как 60000d (Knopf, 1-977) и 63000+5%d , а 4

1 234 5 678 910 BFB

Рис.3. Стратегия определения первичной структуры гена ДНК-ли-газы фага Т4 и физическая карта.

гель-фильтрацией нативного белка - как 68000+T0?d (Panet et al,?973). На секвенированном фрагменте обнаружена лишь одна свободная рамка трансляции для бежа ожидаемого размера, и ее направление совпадает с ранее установленным направлением транскрипции гена (Wilson et al,t^79). Данная открытая рамка считывания кодирует белок, состояний из 487 аминокислот, с вычисленной молекулярной массой 55230 d. Пслипептид содержит повышенное количество остатков основных аминокислот (лизин - 50, аспа-рагин - 22, глутамин - 15), что характерно для белков, взаимодействующих с ДНК. Анализ частот использования кодонов выявил , что редко используются кодоны, имеющие повторение двух или трех GC-пар. Особенно заметно преобладание кодонов, имеющих тимидин в третьем положении.

Область, предшествующая инициирующему кодону (524) содержит последовательности, характерные для регуляторных элементов трансляции и транскрипции. В положении 51*3-5Т9 находится последовательность AAGGA, комплементарная 3'-концу 16S РНК. В положении 455-464 обнаруживается так называемая последовательность "-35", в нашем случае TTGACT, и в положении 486-492 - последовательность "-ТО" - ТАТААТА. Наличие этих последовательностей позволяет предполагать, что они вместе с областью, кодирующей белок из 487 аминокислот, представляют собой ген 30 бактериофага Т4. Последовательность ДНК, предшествующая структурному гену, требует более подробного рассмотрения. Ранее было обнаружено (Murray et al, 1'979), что уровень экспрессии гена 30 в составе лямбда-Т4-рекомби-нангов зависит от наличия или отсутствия фрагмента Hindlll-EcoRI (0-340), расположенного перед промотором и структурным геном ДНК-лига-зы. Исследование экспрессии гена ДНК-лигазы фага Т4 в составе плазмид (Solonin et al, Т984) позволило оценить этот эффект количественно. Выло показано, что наличие вышеупомянутого фрагмента снижает экспрессию гена

5

30 как с собственного, так и с чужеродного промотора в 5-1*0 раз.

В области, предшествующей структурному гену, обнаруживаются еще две открытые рамки трансляции (Рис.4•)• Первая начинается с начала сек-венированного фрагмента и кодирует полипептид из, по крайней мере, 85 аминокислот (конец рамки ТАА в положении 256). Вторая рамка начинается в положении 258 и оканчивается кодоном TGA в положении 526. Она кодирует полипептид из 87 аминокислот. Таким образом, три рамки трансляции расположены в трех возможных фаза« так, что каждая последующая перекрывает предыдущую на несколько нуклеотидов.

ГЧ»МП-1.1 виас 1 - (•■»

TWtNSLflTIOM >

rnrmc 1

1-.-ц 1 ..и«.. \ ; .„.ч.л.____________1......ч...л..

гяппс а

i .--L.44...'-^-«-J-^-1-1-

ТТЛ..1—1. Ч1—1 чин.лш 4i "hf-ч. ..1

Рис.4. Рамки трансляции в области гена 30 фага Т4. При анализе последовательности на наличие протяженных рамок трансляции в обратном направлении таковых обнаружено не было (за исключением рамки в начале HindIII-Фрагмента). В области, предшествующей второй рамке трансляции (258-526), обнаруживаются регуляторные элементы трансляции (245-250 - AAGGA) и транскрипции (-185-1;90 - TTAAGC и 20б-21>7 -ТАТААТА)Наличие этих последовательностей перед открытой рамкой трансляции позволяет предполагать , что гену 30 фага Т4 предшествует какой-то неидентифицированный ген. Удаление области t-340, приводит к делеции предполагаемой регуляторной области этого гена и 5'-части структурной области .

Возможно , что снижение синтеза ДНК -лигазы фага Т4 объясняется не -гативным сопряжением трансляции этих двух рамок . Полисома , транслирую -щая первую рамку , может экранировать участок связывания рибосомы и или -циирующий кодон гена ДНК -лигазы фага Т4, что может снижать его экспрес -сию . В литературе имеются данные как о позитивной , так и о негативной регуляции трансляции при специфических перекрытиях рамок . Возможно , что разные типы перекрытия рамок трансляции могут приводить к совершен ■ но противоположным влияниям на экспрессию генов .

В секвенированном фрагменте обнаруживаются две последователь -ности , сходные с поздним промотором фага Т4' (Young,Kristensen, 1'983): 6

TATAAATCAATTC ******* *

TACAAATACTCTA ** ******* *

TATAAATActgtt

5№ -520 координаты по сггрук-f95 - 205 туре гена 30 поздний промотср фага Т4

Возможно, данные последовательности вовлечены в регуляцию экспрессии генов данной области в поздний период развития фага (например, в регуляцию с помощью антисмысловых РНК).

Таким образом, анализ структуры гена 30 фага Т4 показывает наличие структур, сходных с промоторами как ранних, так и поздних генов фага Т4. Имевшиеся ранее функциональные данные (Murray et al, Í979)» подтверждают лишь наличие промотора непосредственно перед данным геном. Роль остальных специфических последовательностей в экспрессии генов этой области может быть исследована как in vitro, так и in vivo с помощью плазмид, содержащих гены Т-четных фатов, которые были сконструированы в ходе данной работы.

3. Сравнение ДНК-лигаз фагов Т4 и Т7.

Сравнение первичной структуры ДНК проводили методами точечной матрицы и выравнивания. Программы для сравнения первичных структур были написаны в НИВЦ АН СССР Н.Н.Назиповой и М.А.Ройтбергом. Общий вид точечной матрицы приведен на рисунке б. Гомологичная ДНК-лигазе фага Т7 последовательность начинается со $20 аминокислоты фермента фага Т4. При

этом аминокислотные последовательности 225-325 и от 450 и до конца белка не обнаруживают достоверной гомологии с ДНК-лигазой фага Т7, хотя в двух других участках (1125-225 и 325-450) имеется 30? гомология.

Т7

/

/

/

/

т

, / г

74

Рис.6 .Сравнение ДНК-лигаз фагов Т4 и Т7 методом точечной матрицы (длина "окна" - 1'5, число совпадений - 5 ).

/

ё

о

Можно выделить определенные сильноконсервативные последовательности. Это последовательность NXGSGL (далее у Т4 - лизин, а у Т7 лизин -через две аминокислоты). Данная последовательность имеет сходство с участком связывания ATO (Higgins et al,t986). Консервативна и другая последовательность GXEGXIXK, которая уже другими авторами обсуждается как АТФ-связывающий полипептид при сравнении с первичной структурой дрожжевой ДНК-лигазы (Barker et al,t985)• Возможно, что обе последовательности играют определенную роль в связывании нуклеотидоз.

4. Картирование гена ДНК-лигазы фага Тб.

Для картирования гена ДНК-лигазы использовали ОМЦ ДНК, полученную путем инфекции gain мтамма E.coli CA7Í05 фагом Тб дикого типа. Данную ОМЦ ДНК гидродизовали рестриктазой EcoRI в низкосолевом и рестриктазой HindIII в среднесолевом буфере в присутствии органических веществ: да-метилсулв$сксида, глицерина и этилового спирта. Фрагменты ДНК, полученные таким путем, разделяли электрофорезом в геле агарозы и гибридизова-ли с пробой гена 30 фага Т4. Было обнаружено, что оптимальным для гидролиза ОМЦ ДНК фагов Т4 и Тб рестриктазой HindIII был буфер, содержащий по 1% каждого из вышеназванных органических веществ. Необходимо заметить , что практически невозможно получить полный гидролиз ОМЦ ДНК , да -же в случае EcoRI. На всех гелях и радиоавтографах обнаруживались фрагменты-продукты неполного гидролиза. В EooRI-гидрсшизате ОМЦ ДНК фага Тб были обнаружены три гибридизуюдихся фрагмента: 0,4; *,5; 4,5 тпн в отличие от 0,4; 0,5; 1>,5; 2,2 у фага Т4. Рестриктаза HindIII гадролизова-ла ОМЦ ДНК Т-четных фагов в меньшей степени, чем рестриктаза EcoRI. На фотографии геля агарозы заметно, что HindIII-гидролиз ОМЦ ДНК фага Тб прошел более полно, чем у фага Т4. С другой стороны, на радиоавтографе не видно HindIII-фрагмента размером 2 тпн в гидролизате ДНК фага Тб. в гидролизатах ОМЦ- и Ц-ДНК фага Т4 с пробой гена 30 гибридизуется фрагмент 2 тпн и Солее крупные фрагменты - продукты неполного гидролиза-Наименьший фрагмент ДНК фага Тб, гибридазуювдяйся с данной пробой, имеет размер ТО тпн. Данные по гибридизации HindIII- и EcoRI-фрагментов ОМЦ ДНК фага Тб были использованы при составлении физической карты этой области генома фага Тб и обеспечили подходы к клонированию гена.

5. Клонирование гена ДНК-лигазы бактериофага Тб.

Для клонирования гена ДНК-лигазы фага Тб был выбран лямбда-вектор Ш8Ч-'б, который ранее бьш с успехом использован для клонирования гомоло-8

<-- К Т4. о ->T61ig - ре-

<— О ридизации in situ фа-

комбинанты, К - контрольные фаги.

Рис.7 • Идентификация рекомбинантных бактериофагов путем гиб-

говых бляшек с пробой гена ДНК-лигазы фага

гичного гена из фага Т4 (Wilson,Murray,f979) • Смесью после лигирования трансформировали штамм E.coli Kt2 rglA rglB, который не ограничивает трансформацию с помощью ОМЦ ДНК фага Т6. Отбор рекомбинантных фагов проводили по делеционной инактивации гена lacZ, присутствующего в векторном фаге, на индикаторном газоне штамма E.coli ED8538 и соответствующей среде с красителями. Было отобрано 450 рекомбинантных фагов, которые переносили на нитроцеллюлозные фильтры и гибридизовали с пробой гена зо фага Т4. д фагов дали положительный ответ при гибридизации и несли один и тот же фрагмент ДНК длиной 4,5 тпн. Дополнительно фаги проверили блоттинг-гибридизацией их ДНК с той же пробой. Далее этот фрагмент реклонировали в pBR327 с получением плазмилы pTSL6.

EcoRI-фрагмент ДНК фага Т6 длиной 0,4 тпн, который по аналогии с фагом Т4 должен был содержать начало гена, очищали гель-электрофорезом из гидролизата ОМЦ ДНК фага Тб и клонировали в плазмиду pBR327. Из полученных клонов выделяли ДНК, гиролизовали ресгриктазой EooRI и исследовали как описано выше. Плазмида, содержащая данный фрагмент ДНК , бы -ла названа pTSLi.

6 .Тест спасения маркера и комплементация.

Генетическое содержание вставок ДНК в рекомбинантных плазмидах было определено с помощью теста спасения маркера. Для этих опытов испояь -

9

зовали амбер-мутанты фага Т4 по гену 30: Н39, Е605 и С259. Для мутантов Н39 и Е605 было известно положение мутации относительно ЕсоМ-сайтов. Мутация С259 была картирована в данной работе. Результаты теста спасения маркера представлены в таблице. По этим данным плазмида рТЭЬб содержит дистальную , а рТЗЫ1 - проксимальную части гена. Было также обнаружено , что мутация С259 находится в ЕеоМ-фрагменте 0,4 тпн.

ПЛАЗМИДЫ

рБЕ327

рТЭЬб

рГЭЬ^

фа™

Е605 Н39

С259

0,33 0,1*2 0,02 26,00 0,ТО 0,04 0,05 5,00 49,00

Рис.8. Схема конструирования плазмида рТЭХ.8. Утолщенной линией обозначен ген ДНК-лигазы фага Т6. Остальные обозначения те же, что и на рисунке 9.

ТАБЛИЦА 11. Числовые значения соответствуют отношению титра ам-бер-мутантов фага Т4 на аар°штамме, содержащем плазмида, к титру

на бесплазмидном (*10000).

эирТ штамме

Целый ген ДНК-лигазы фага Тб был собран на плазмида рВИ327 с получением плазмида рТвЬ8. Данная плазмида поддерживала рост амбер-мутантов фага Т4 по гену 30 да бессупресссрном штамме не за счет рекомбинации, а за счет комплементации, так как размножившиеся фаги оставались амбер-му-тантами. Этот опыт показал, что клонированный ген экспрессируется, и его продукт обеспечивает размножение амбер-мутантов фага Т4 по гену 30.

7.Экспрессия гена 30 фага Т6.

Для исследования экспресии гена ДНК-лигазы фага Тб и получения белка этот ген был реклонирован в риСТЭ с получением плазмида рТвЬТТ. При индукции изопропилтиогалактопиранозидом (ИПТГ) и лактозой в клетках, ТО

содержащих плазмиду pTSM*!', в отличие от контрольных клеток на ПААГ с ДСН даблюдалась дополнительная полоса, близкая по подвижности к ДНКгли-газе фага Т4. По денситометрической оценке в культуре, индуцированной ИПТР, данный фермент синтезируется в количестве Ф',5-2? от растворимого белка клетки. Индукция промотора лактозой была значительно менее эффективна. Из клеток , индуцированных ИПТГ, был выделен фермент, который лигмровал ДНК фага лямбда, гидролизованную рестриктазой HindTII.

Для повышения продукции данного фермента ген 30 фага Т6 был клонирован под контролем левого промотора фага лямбда (плазмида - pTSLg). Данная плазмида была перенесена в штамм E.coli DHI совместно с плаэми-дой pel/857, содержащей ген репрессора фага лямбда. Индукцию левого промотора фага лямбда в таком штамме проводили путем термотока (4jfc). Электрофорез в ПААГ с ДСН обнаруживал в клетках, подвергшихся термошоку увеличение количества ДНК-лигазы до 1-0 % от растворимого белка клетки. Таким образом, было показано, что ген 30 фага Тб может эффективно

репрессироваться под контролем промотора лактозного оперена К.coli и левого промотора фага лямбда. Созданные штаммы-продуценты могут быть использованы для получения данного фермента.

Рис.Э. Экспрессия гена ДНК-лигазы фага Тб в составе плазмиды pTSL9. 4 - без индукции, f - 3 - Pl -промотор индуцирован термошоком при 37° С - * и при 44° С - 2 и 3, 2 - одновременно путем добавления ИПТГ индуцирован lac - промотор, 5 - маркеры молекулярной массы.

8. Первичная структура гена ДНК-лигазы фага Тб.

Структуру гена 30 фага Тб определяли методом химической модификации (Maxam,Gilbert, Ф980).Эксперименты проводили совместно с А.В.Кали-маном и В. М- Крюковым- Были использованы плазмиды pTSL1', pTSL6, pTSL8 и pTSLtf. Стратегия определения первичной структуры базировалась на знании нуклеотидной последовательности гомологичного гена фага Т4, поэтому, в основном, структуру определяли от сайтов крупнощепящих рестрик-таз. Все сайты рееггриктаз, по которым на первом этапе проводили мечение ДНК, были перекрыты на втором этапе, большая часть структуры была определена независимо для обеих цепей (75$). Полная длина секвенирован-

1**

ного фрагмента ДНК - f656 нуклеотидов.

9. Сравнение структуры генов ДНК-лигаз фагов Т4 и Тб.

Сравнение секвенированного фрагмента ДНК с соответствующим фрагментом из генома Т4 обнаруживает 37 взаимных транзиций и 7 трансверсий■ Большинство транзиций и часть трансверсий затрагивает лишь третье положение в кодонэ, в структурной части гена 30 имеется 34 транзиции и 7 трансверсий; 34 нуклеотидные замены не изменяют смысла кодонов; 7 нук-леотидных замен (5 транзиций и 2 трансверсии ) приводят к 6 аминокислотным заменам. Две из этих аминокислотных замен можно интерпретировать как консервативные: глутаминовая на аспарагиновую в положении 246 и изолейцин на валин (290). Остальные четыре замены не являются консервативными (Landik et al,1'984 )• Все шесть замен вместе являются, вероятно, нейтральными, так как бессупрессорные штаммы E.coli, содержащие ген ДНК-лигазы фага Тб в составе рекомбинантной плазмиды, поддерживают рост амбер-мутантов фага Т4 по гену 30. С другой стороны, нельзя исключитьi что свойства данных ферментов могут иметь различия, так как молекулярная масса ДНК-лигазы фага Тб, вычисленная из структуры гена, составляет 55204 дальтона.

Все аминокислотные замены сосредоточены в районе 238-293 аминокислоты. Вероятно, данный район более вариабелен, чем вся остальная последовательность ДНК-лигазы Т-четного фага. Все трансверсии и одна транзи-ция по первому положению в кодоне, приводящие к заменам аминокислот, сосредоточены в районе 256-3'f3 кодона. Этот район сильно перекрывается

Т4

Тб

N п/п Аминокислотные замены

238 тирозин гистидин

244 аланин валин

246 глутаминовая аспарагиновая

248 аланин треонин

290 изолейцин валин

292 серин глицин

ТАБЛИЦА 2. Аминокислотные замены в ДНК-лигазах фагов Т4 и Тб.

Т2

ТА

4 ШЛТССйШ ИШАААОА СОШХАШ ТОААААААТ ЙГОГАаСКА АДШТСАТГ ЖОКккОС

Щ АСТЗШЗСА Ю5ШПШ ОтШССА (ХУГАССАСАв (ЖЯТКЖТ ЙАЙСПМКг АТСААТТСАТ

С -35 *4# ТГАШТАЙА (ЗСТОТАААСС АААСТСТААА (ШШШ - ТО Я)

г в

чвэ А^тяшмткятссшшш^

Й I 1 К I И 8 I и I В 3 ? м к Ч А I I Е К Я К И 9

А

264 (МТТСХЯтАССШУттаИ^^

в1ЬКВ1(Т81Т1311!1ЧГТ1КОРКР1!1А С А

348 А<та/иггттт(ттапшл^

Т (| 8 г С I 1 ? I I I) В 1 И I Н Т 1 И ! К 1 Т С I

А Т

432 (етттлаштАстсшюжшхйтаэтш^

АА1ЕЕ1,ТОУ1Т1>СК!СВПУЕУ1,НВУММЕ1> ТА С

5« ст^^то&ткюяис^^

1 Е С £ А 3 V г I А N И » Р (! 1 I Р м р 5 и 1 А 8 5

С Т А Т

600 тджтшААссштматтА^^

У1)ЕК01НКН1КРРАРАдЬКАБОАВСРАЕ

т а

684 шшжвгатштататетгаж^

УЕаВЕЬОВУНЬЬЗНАйНЕУЬа1|1)ЬЪКЕЕ

т с т в

768 тАТСАШТОАСШЖаАВСтаШи!^^

И К Н 1 А ЕА В « I Н Р И V Ь I И ! 1 V ! Н Е и

Т С А й С

852 ААШСЖ^С^шзтаоагп^^

ККЕРЕеЬВРЬУ1)АНРЕЯЗКУК1)РТЕУАЕ

У А Е А

Т А

936 тсАоашявдукттша^^

ЗНТАЗНС1АЯК31.КвТ13ЕКЕАС!СМКР,<5 А А Т Т С

юза

УЯ1)ГУРЬУЕУУСЬРАРЕ1>К:У1)УНКЗК1<В I э

Т А

1'!Ю4 сттлтшши^шАоттг^

(ЗМТЗОУВКУГЬХЕМРУУЯНЬВЕАКУХУК

А Т

1=168 МСТАТАТТСАССААООТтта^таИХЖААААтТ^

!СУ11^а1,Еа11ЬК!{:1БйЬУЕМАНЗКН1,У

с

1*272 ШТГГАААШСтат,1Ш(ЭДИААШТ^

КККЕУ1ПУ1)1,К1Та1УРНЕК1)РТКА00У

т в

Г356 АТГИГШЯШ&ОТОТООААт^

1ЬЕ8ЕССК1КУ!!АСЗСЬКВКА0УКЗНЕЬ

1-440 сштотшаттаоАшссАттт:^^

ВКТК1МЕЯдНУУ18К1ЬЕСЕСЯ0»ЬКЗВ

в А

^524 бОСШЛ(?ЮАТ1АССЯШАтШ!СЯЛШ1АЖ

8ЕТ1)УУК.ЬР1.Р1А1Е1.ЕЕПКТКА1}Т?ЕП

1608 титав!]штпшвА|^

V Е в 1 ? Н и Т 6 Ый

Рис.9. Первичная структура гена ДНК-лигазы фага Тб. Под аминокислотной и над нуклеотидной последовательностями напечатаны замены соответствующие гену и белку ДНК-лигазы фага Т4. "-10" и "-35" - последовательности промотора, также отмечен участок связывания рибосомы.

с районом замен аминокислот. Таким образом, данный район более вариабелен как у белка, так и у гена. До данного вариабельного района и после него встречаются лишь транзиции по третьему положению в кодоне. В районе, названном вариабельным, имеется лишь одна транзиция по третьему положению в кодоне. Пять из мести аминокислотных замен расположены двумя группами: три аминокислоты и две. При этом, внутри групп изменяющиеся аминокислоты чередуются с неизменяющимися. Возможно, что это - согласованные замены аминокислот, приводящие к внутригенной супрессии.

1-0. Сравнительный анализ регулятор них элементов.

Ни одна нуклеотидная замена не затрагивает ни промоторной последовательности (ранний промотор) перед геном ДНК-лигаэы , ни участка связывания рибосомы. Гену ДНК-лигазы фага Тб, как и гомологу из фага Т4, предшествует открытая рамка трансляции, которая у гена фага Тб короче на один кодон. В связи с этим структура перекрытия данных рамок трансляции у двух фагов разная: АТСА у фага Т4 и ТААТй у фага Тб. Наличие открытой рамки трансляции, перекрывающейся с геном ДНК-лигазы фага Т4, вызывало снижение экспрессии клонированного гена. Измененная структура перекрытия может оказать и другое влияние. Созданная в данной работе система эффективной экспрессии гена ДНК-лигазы фага Тб может быть использована для изучения сопряжения трансляции перекрывающихся рамок трансляции. Последовательность, сходная с поздним промотором фага Т4, присутствует и у фага Тб.

выводы

1.В составе гшаэмидного вектора клонирован ген ДНК-лигазы фага Т4.

2.В составе плазмидных'и фаговьк векторов клонирован ген ДНК-лигазы фага Т6.

3. Показана способность гена ДНК-лигазы фага Тб компенсировать мутации в гене 30 фага Т4 как за счет рекомбинации, так и за счет комплементации.

4. Созданы мтаммы-суперпродуценты ДНК-лигазы фага Тб, в которых для транскрипции гена 30 используются промотор лактозного оперона кишечной палочки и левый промотор бактериофага лямбда.

5. Определена полная первичная структура генов ДНК-лигаз фагов Т4

и Тб.

6. Путем сравнительного анализа структур генов полинуклеотидпигаз и аминокислотных-последовательностей их продуктов обнаружен вариабельный район аминокислотной последовательности ДНК-лигазы Т-четного фага.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ :

1. Краев A.C., Миронова М.В., Зимин A.A., Таняшин В.И., Бериташви-ли Д.Р., Александров A.A., Скрябин К.Г., Баев A.A. Ген ДНК-лигазы бактериофага Т4. В сб. тезисов шестого двустороннего симпозиума СССР-Франция "Структура и функция белков и нуклеиновых кислот". Цхалту-бо, 1982, с. 74-75.

2. Краев A.C., Миронова М.В., Зими" A.A., Танямин В.И., Бериташви-ли Д.Р., Александров A.A., Баев A.A. Ген ДНК-лигазы бактериофага Т4. В сб. тезисов Всесоюзной конференции "Метаболитические плазмиды бактерий", Таллин, 1982, с.118-119.

3. Краев A.C., Зимин A.A., Миронова М.В., Янулайтис A.A., Танямин В.И., Скрябин К.Г., Баев A.A. Ген ДНК-лигазы бактериофага Т4. Доклады АН СССР, 1983, том 270, с.1495 - 1500.

4. Krayev A.S., Mironova M.V., Zimin A.A., Tanyashin V.l., Skryabin K.G., Bayev A.A. Primary structure of the bacteriophage T4 ША-ligaae gene and adjacent regulatory region. Quad.de "La Ric.Seien.", 1984, Vol. T3t, p.33-40.

5. Зимин A.A., Крылов П.А., Таняшин В.И. "Клонирование гена ДНК-лигазы бактериофага Тб", Биотехнология, 1986, 4, с.12-23.

6. Калиман A.B., Зимин A.A., Назипова H.H., Краев A.C., Миронова М.В., Крюков В.М., Скрябин К.Г., Таняшин В.И., Баев A.A. Сравнительное изучение генов ДНК-лигаз бактериофагов Т4 и Тб, Доклады АН СССР, 1988, том 299, с. 737 - 742.

Т- I032S I4.04.8Sr. Зак. I0I6P Тир. 125 экз. Уч.-изд.л. - 1,0

Отпечатано на ротапринте в ОНТИ 1ЩБИ