Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Активация мембран-связанных транскрипционных факторов SPT23 и MGA2 убиквитин-лигазами Nedd4 и Rsp5 в Saccharomyces cerevisiae

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Активация мембран-связанных транскрипционных факторов SPT23 и MGA2 убиквитин-лигазами Nedd4 и Rsp5 в Saccharomyces cerevisiae"

На правах рукописи

Щербик Наталья Валерьевна

АКТИВАЦИЯ МЕМБРАН-СВЯЗАННЫХ ТРАНСКРИПЦИОННЫХ ФАКТОРОВ вРПЗ и МСА2 УБИКВИТИН-ЛИГАЗАМИ Квр5 и N«№4

03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Кольцове - 2003

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте молекулярной биологии и биофизики СО РАМН (Новосибсрск, Россия) и в Институте рака и молекулярной биологии им. Фэлса при университете Тэмпл (Филадельфия, США).

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Мертвецов Н.П.; РЬ.О. Дэил Хейнс

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Дымшиц Г.М. кандидат биологических наук Гилева И.П.

Ведущая организация:

Институт цитологии и генетики СО РАН (Новосибирск)

Защита состоится « » ноября 2003 года в 11.30 часов на заседании диссертационного совета Д 208.020.01 при Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор» МЗ РФ по адресу. ГНЦ ВБ «Вектор», Кольцове Новосибирской области, 630559.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ ВБ «Вектор». Автореферат разослан « 3 » октября 2003 года.

Ученый секретарь диссертационного совета

лИ

^ \

Малыгин Э.Г.

sJÏT

Общая характеристика работы.

Актуальность темы. Модификация белков убиквитиновым пептидом регулирует множество клеточных процессов, таких как онкогенез (Isaksson, 1996), прогрессия клеточного цикла (Коерр, 1999; Craig, 1999), сигнальная трансдукция (Craig, 1999; Wilkinson, 1999), регуляция транскрипции (Hoppe, 2000; Finley, 2001), индукция иммунного ответа (Ghosh, 1998), презентация антигенов (Rock, 1999), инициируя белковую деградацию протеосомальным комплексом, известным как 26S протеосома. Помимо этого, нарушение убиквитин-зависимого протеолиза является одной из причин образования злокачественных опухолей (Joazeiro, 1999; Maxwell, 1999) и появления наследственных заболеваний (Lam, 2000; Kishino, 1997).

Однако, как становится ясно на сегодняшний день, убиквитинирование может регулировать активность белков в клетке без инициации де1радации. Было показано, что белковая модификация убиквитином вызывает активацию (Wang, 2001) или инактивацию (Kaiser, 2000) некоторых эукариотических белков. Недавно описанный

процесс Регулируемого_Убиквитин/протеосома-зависимого

Процессинга (РУШ, демонстрирует регулирующую роль убиквитинирования в процессе созревания некоторых транскрипционных факторов в клетках высших и низших эукариот (Hoppe, 2000). Однако механизмы, посредствам которых убиквитинирование регулирует экспрессию генов без инициации белковой деградации, изучены еще не достаточно. В этом ключе особая роль отводится убиквитин-лигазам, как факторам специфичности процесса убиквитинирования. Предполагается, что убиквитин-лигазы не только узнают и связывают белки-мишени, но и способны регулировать сам процесс присоединения молекул(ы) убиквитина к субстрату в четко определенном сайте, помечая таким образом белок для выполнения различных функций в клетке.

В частности, было показано, что дрожжевая убиквитин-лигаза Rsp5, относящаяся к классу Aecf-содержащих убиквитин-лигаз («hect» от Homology to Е6-АР Çarboxy Terminus, домен, впервые идентифицированный в структуре белка Е6-АР), активирует функциональную активность факторов SPT23 и MGA2 в регуляции транскрипции жизненно важного гена olel в клетках S. cerevisiae (Hoppe, 2000). Белковый продукт olel гена, мембранный фермент A9FAD (десатюраза жирных кислот), участвует в синтезе ненасыщенных жирных кислот, важных компонентов мембранных

структур клетки. Необходимо отметить, что нарушение регуляции и функции мембранных ферментов приводит к разнообразным генетическим расстройствам, включая дегенерирующие заболевания нервной системы, сердечно-сосудистой системы и ожирение.

Несмотря на ряд современных публикаций в престижной научной периодике, посвященных РУП, детальный механизм Язр5-зависимой активации 8РТ23 и МОА2 ещё не описан. Не известен также и механизм специфического узнавания и связывания факторов лигазой Язр5, хотя важная роль в этом процессе отводится ^УУ доменам фермента, ответственным за белок-белковые взаимодействия.

Таким образом, представленная работа актуальна в плане изучения новых функций "убиквитина в дополнение к изученной роли в процессе протеосомальной деградации белков. Новые сведения о том, какую роль убиквитинирование играет в активации мембранных белков и регуляции их активности, представляют новое и интересное направление молекулярной биологии клетки и изучения механизмов экспрессии генов.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является детальное изучение механизма Регулируемого Убиквитин/протеосомо-зависимого Процессинга (РУП) мембран-связанных транскрипционных факторов БРТ23 и МОА2 классом ИеМ-содержащих убиквитин-лигаз: дрожжевым белком Яэрб и его гомологом - человеческим ферментом №с!с14, в клетках высших и низших эукариот.

Задачи исследования:

1. Исследовать функциональную роль домена, входящего в состав убиквитин-лигаз Яйр5 и №сИ4, в регуляции РУП на примере транскрипционного фактора 8РТ23 в клетках пекарских дрожжей;

2. Используя дрожжевой белок 8РТ23 в качестве модельного субстрата убиквитин-лигазы человека Иес1<14, исследовать механизм РУП в клетках млекопитающих, что позволит сделать вывод об идентичности механизмов процессинга у высших и низших эукариот;

3. Определить, каким образом К.5р5-зависимое убиквитинирование мембран-связанных дрожжевых белков БРТ23 и МОА2 активирует их транскрипционную функцию в регуляции экспрессии жизненно важного дрожжевого гена о1е1.

Научная новизна работы.

1. Впервые предложена регуляторная функция первого WW домена /гесГ-содержащих убиквитин-лигаз Кес1<14 и Изр5 в процессе РУП мембран-связанных транскрипционных факторов в клетках высших и

низших эукариот. Предполагается существование белка ко-фактора. взаимодействующего с WW! доменом лигаз и регулирующего их специфичность по отношению к белку-субстрату.

2. Впервые показано, что убиквитин-лигаза Rsp5 не обязательна для поцессинга транскрипционных факторов SPT23 и MGA2, что предполагает существование альтернативного фермента, регулирующего этот процесс.

3. Продемонстрировано, что Rsp5 абсолютно необходима для увеличения SPT23/MGA2-зависимой транскрипции гена olel. Впервые предложен механизм активации транскрипционной функции SPT23 и MGA2 убиквитин-лигазой Rsp5: убиквитинированйе' мембран-связанной формы р120, входящей в состав димера р120/р90, приводит к деградации модифицированной молекулы 26S протеосомой и сегрегации процессированной, транскрипционно-активной формы фактора р90.

Практическая значимость работы. Детальное исследование механизмов регуляции экспрессии генов убиквитинированием позволит идентифицировать уникальные для дрожжевой клетки белки-мишени, что, в свою очередь, поможет в конструировании противогрибковых препаратов. С другой стороны, 1 понимание механизма(ов) убиквитин-лигазо-зависимой ' регуляции процесса модификации белков убиквитинированием в клетках млекопитающих поможет выявить причины тех молекулярных нарушений в клетке, которые приводят к возникновению злокачественных опухолей и генетических изменений, и помочь в разработке медикаментозного лечения больных.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на: FASEB conference on Ubiquitination and Intracellular Protein Degradation, Saxton River, VM, USA, 2001; FELS Institute Annual Research Day, Philadelphia, USA, 2002 и 2003.

Структура работы. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания использованных в работе материалов и методов, результатов и их обсуждений, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 120 страницах, включая 4 таблицы, 22 рисунков и списка цитируемой литературы (200 наименований).

Основное содержание работы Материалы и методы

В работе использовались следующие штаммы S. cerevisiae: InvSc ("Invitrogen", США); FY56 и FW1808fr.sp.5-¿i любезно предоставлены Dr. F. Winston (1999); PSY2340(пр14-1) и PSY2342 (RPN4A) любезно предоставлены Dr. P. Silver (2001); BY4869 0SPT23) и BY5968 (AMGA2) ("ResGen", США). Дрожжевые клетки поддерживались в YPD среде; трансформированные клетки выращивались в минимальной глюкозо- или галактозо- содержащей минус-среде с добавлением набора аминокислот и нуклеотидов ("Clontech", США) согласно Guthrie (1991). Олеиновая кислота готовилась в 10% NP-35 ("Sigma", США) и добавлялась в ростовую среду в конечной концентрации 1мМ. Трансформация клеток пекарских дрожжей LiAc методом проводилась с использованием стандартной методики Burke (2000).

Выделение РНК из дрожжевых клеток проводилось как описано в Schmitt (1990); из лимфоцитов человека - при помощи реагента RNAzol ("TelTest", США) по методике, предложенной фирмой. Трансформацию бактериальных клеток штамма XL-2 blue ("Stratagene", США) плазмидной ДНК, проводили по методике, рекомендованной фирмой. Для выделения плазмидной ДНК из клеток E.coli использовали метод щелочного лизиса (Гловер, 1989); для дополнительной очистки плазмидной ДНК использовали ионнообменные колонки фирмы "Qiagen", США. Выделение геномной и плазмидной ДНК из дрожжевых клеток проводили согласно Burke (2000) с использованием стекляннных гранул, размером 450-600нм в диаметре ("Sigma", США). Концентрацию нуклеиновых кислот определяли спектрофотометрически на спектрофотометре "Beckman DU640" (США). Разделение плазмидной ДНК в агарозном геле проводили элеюгрофоретически по стандартной методике Sambrook & Maniatis (1989). Элюцию ДНК из агарозного геля проводили при помощи набора "Gene clean" ("Bio 101", США) по методике, предложенной фирмой. Реакция обратной транскрипции проводилась как описано у Bull (1998) с использованием РНК человеческих лимфоцитов в качестве матрицы, oligo(dT)i0 в качестве праймера, 0.5мМ 4xdNTP, 10 единиц Обратной Транскриптазы Вируса Мышиной Лейкемии (RT MLV) ("Promega", США) в реакционном буфере, предложенном фирмой. Полимеразные цепные реакции (ПЦР) проводились с использованием термофильной полимеразы Tag ("Promega", США) или Pfii ("Stratagene", США), 0.5мМ 4xdNTP, ДНК-матрицы и специфических праймеров (синтезированных фирмой

"Genesis", США) на амплификаторе фирмы "Perkin Elmer". Температура и время отжига праймеров, денатурации и синтеза ДНК, а так же число циклов ПЦР, определялось с учетом праймеров и длины амплифицируемого ДНК фрагмента. Для получения экспрессионных плазмид, несущих ДНК последовательности исследуемых генов, использовались стандартные методики реакций рестрикции, дефосфорелирования и лигирования, как описано у Sambrook & Maniatis (1989).

Клетки E.coli штамма BNN132 ("АТСС", США) были инфицированы бактериофагом-помощником X, содержащим дрожжевой вектор YES, несущий фрагменты дрожжевой к ДНК библиотеки ("АТСС", №87276), согласно методике, предложенной фирмой. Для скрининга дрожжевой кДНК библиотеки, клетки одного литра дрожжевой культуры линии, экспрессирующей Nedd4WWl, были трансформированы ЗООмкг плазмидной кДНК библиотекой и высажены на агаризованные чашки, в условия индукции экспрессии генов. Плазмидная ДНК дрожжевых колоний была выделена, секвенирована и анализирована с использованием базы данных генома S. cerevisiae (http://genome-www.sianford.edu/Saccharomvces).

Выделение белков из дрожжевых клеток проводилось при помощи стеклянных гранул (450-600нм) согласно стандартной методике Burke (2000). Выделение белков из клеток млекопитающих проводилось как описано у Pan (1999). Электрофорез белков в денатурирующих условиях проводили по Laemmli (1970) с использованием 8% ПААГ. Разделенные в ПААГ белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану ("Amersham", США) и иммуноблотинг проводили как описано у Boyd (2000). При иммуноПреципитации белковых комплексов использовали иммунно-аффинную смолу protein-G sepharose ("Amersham", США), процедуру преципитации выполняли как описано у Boyd (2000). Иммунофлюоресцентное окрашивание белков выполнялась как описано у Burke (2000). В работе были использованы моноклональные антитела мыши: анти-FLAG (М5, "Sigma", США), анти-НА (12СА5, "Roche", Германия), анти-Ub и анти-сМус (9Е10, "Oncogene", США); поликлональные антитела кролика: aHTH-Nedd4 (ND2, любезный подарок Dr. S.Kumar) и анти-Каг2р (любезный подарок Dr.M.Rose); и вторичные антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена ("Amersham", США).

Для Northern блотинга, Юмкг денатурированной РНК разделяли в 1.2% агарозном геле, содержащем формальдегид; РНК переносили на нейлоновую мембрану Hybond-N4" ("Amersham", США). Гибридизацию

с радиоактивным зондом проводили в Rapid-Hyb буфере ("Amersham", США), согласно методике, предложенной фирмой. Для мечения радиоактивного зонда проводили реакцию полимеризации фрагментом Кленова ("Roche", Германия) с использованием фрагмента ДНК, соответствующего полноразмерной последовательности olel гена (2 т.п.н.) в качестве матрицы, случайных праймеров, 50mkCi [<x32P]dCTP ("NEN Biotechnology", США) и ЮмкМ 3><dNTP. Эффективность мечения определялась на счетчике "Wallak" (США) по 32Р каналу.

Клетки легочной аденокарциномы человека HI299 ("АТСС", НТВ-85, США) выращивались в среде Игла MEM в модификации Дульбекко в присутствии 10% температуро-инактивированной бычьей сыворотки и 1% пенициллина ("Cellgro", США) в термостатируемом С02 (5%) инкубаторе при 37°С. Транзиентная трансфекция проводилась при помощи реагента липофектамин ("Invitrogen", США), согласно методике, предложенной фирмой. Обработка трансфицированных клеток ЮмкМ ингибитором протеосомы MG115 ("Calbiochem", США) проводилась как описано у Pan (1999).

Результаты в обсуждение Убиквитин-лигаза человека Nedd4, с нарушенной белок-связываюсцей функцией WW1 домена, вызывает смерть клеток пекарских дрожжей. Было обнаружено, что точечная аминокислотная замена центрального структурно важного тирозина в составе WW1 домена человеческой убиквитин-лигазы Nedd4 на аланин Tyr2o8—>Alamos (Nedd4WWl) (рис.1 А), обладает летальным эффектом на рост дрожжевых клеток. Данная мутация нарушает белок-связывающую функцию WW1, а не зависит от de novo приобретенной способности WW1 связывать новый белок-субстрат. Было показано, что экспрессия Nedd4, несущего делению всего WW1 домена (Nedd4AWWl), также как и Nedd4WWl, индуцирует токсичную активность этой человеческой убиквитин-лигазы в клетках 5. cerevisiae (рис. 1В верхняя панель). Результаты иммуноблотинга продемонстрировали, что деления WW1 домена, либо точечная мутация, введенная в последовательность WW1 домена, не влияют на уровень экспрессии белка Nedd4, по сравнению с диким типом убиквитин-лигазы (рис. 1В нижняя панель).

А.

С2 WW домены ('ys

_I_

'ppgwerrtdnfgrtXyvdhntrtttwkrp 1

1 ppgweíkqdergrsxwdhnsrtttwtkp1

Рисунок 1. А. Структурная организация hect-содержащих убиквитин-лигаз человека Nedd4 и Rsp5 из & cerevisiae. Снизу схемы приведены аминокислотные последовательности WW1 доменов лигаз; структурно важный тирозин подчеркнут. В. Верхняя панель: рост дрожжевых клеток, трансформированных пустым вектором-контролем V, Nedd4 дикого типа (wt), а также Nedd4 с точечной мутацией в WW1 домене (WW1), либо с делецией всего домена (Д WW1). Нижняя панель: йммуноблотинг с использованием антител Nd4, демонстрирует экспрессию убиквитин-лигазы Nedd4 дикого, либо мутантного типов, в клетках дрожжей.

Ко-экспрессия кДНК гена olel блокирует токсичный эффект Nedd4WWl. В поисках супрессора наблюдаемого летального фенотипа дрожжей, вызванного экспрессией Nedd4WWl, был проведен скрининг высококопийной экспрессионной кДНК библиотеки S. cerevisiae. В результате был идентифицирован жизненно важный ген olel, продукт которого - десагюраза жирных кислот A9FAD-катализирует образование ненасыщенных жирных кислот в клетках пекарских дрожжей. Было показано, что ко-экспрессия olel кДНК (рис.2А), либо присутствие ненасыщенных жирных кислот в ростовой среде (рис.2В), возобновляют рост дрожжевой линии, трансформированной Nedd4WWl.

Рисунок 2. Рост дрожжевых клеток, экспрессирующих летальную форму убиквитин-лигазы человека Nedd4WWl А. трансформированных рекомбинантной плазмидой. несущей olel кДНК, либо не несущей вставки (V); В. в отсутствие "-" или в присутствии "+"' 1мМ олеиновой кислоты.

В. V wt WW1 AWW1

оЫкДНК

в Nedd4WWl

олеиновая кислота - +

Убиквитин-лигаза человека Nedd4WVVl негативно доминирует над дрожжевой лигазой Иврэ в процессе регуляции экспрессии гена

olel. Согласно' литературным данным, убиквитин-лигаза пекарских дрожжей Rsp5 (близкий дрожжевой гомолог убиквитин-лигазы человека Nedd4) контролирует экспрессию olel гена с использованием механизма, известного как РУП: Регулируемый Убиквитин/протеосома зависимый Процессинг. На примере одного из факторов транскрипции olel гена - белка SPT23, был описан механизм РУП. Трансмембранный белок SPT23 с молекулярной массой 120кДа (р120) димеризован и связан с мембраной эндоплазматического ретикулума (ЭР). Предполагается, что при поступлении сигнала к синтезу олеиновой кислоты, убиквитин-лигаза Rsp5 маркирует убиквитином одну из молекул димера SPT23pl20/SPT23pl20, что служит сигналом для 26S протеосомы к частичной деградации убиквитинированной молекулы SPT23. В результате образуется молекула SPT23 с молекулярной массой 90кДа (SPT23p90), которая представляет собой зрелый транскрипционный фактор. В последствии SPT23p90 диссоциирует из димера SPT23pl20/SPT23p90, транслоцируется в ядро и приводят к увеличению транскрипции гена olel (Hoppe 2000, Rape 2001).

Было показано, что убиквитин-лигаза человека Nedd4, несущая мутацию в WW1 домене, будучи экспрессированной в дрожжевых клетках, ингибирует процессинг транскрипционного фактора SPT23 (рис. ЗА, дор. 1 и 2). В результате наблюдается накопление мембран-связанной, транскрипционно неактивной формы р120 и ингибирование образования активной формы фактора р90, что приводит к торможению транскрипции ole i гена и, соответственно, пониженному уровню olel мРНК (рис. ЗВ). Следовательно, при экспрессии убиквитин-лигазы человека Nedd4WWl в клетках пекарских дрожжей, наблюдается подавление активности природной формы фермента Rsp5 в регуляции процессинга транскрипционного фактора SPT23, что предполагает доминантно-негативную природу мутации, введенной в WW1 домен убиквитин-лигазы Nedd4.

Идентичное ингибирование процессинга SPT23 наблюдалось при экспрессии убиквитин-лигаз, Nedd4 и Rsp5 с нарушенной функцией катализа (рис.3, дор. 3 и 6). Согласно литературным данным, карбокси-концевой цистеин является каталитически-активным центром класса йесЛ-содержащих убиквитин-лигаз, поскольку именно этот аминокислотный остаток непосредственно вовлечен в процесс переноса молекулы убиквитина с убиквитин-конъюгирующего фермента Е2 на лизиновый остаток белка-субстрата. Точечная мутация каталитически-активного цистеина в структуре лигаз Nedd4 (Cysgé?-*А1а867) и Rsp5 (Cysy?«—+А1а77я) не нарушает узнавание и

связывание субстрата ферментом, однако делает невозможным процесс убиквитинирования SPT23, и, соответственно, процессии-. Подобная доминантно-негативная активность дрожжевой убиквитин-лигазы Rsp5 с нарушенной функцией катализа была описана ранее (Hoppe, 2ООО). Нами было показано, что делеция WW1 домена в структуре лигазы Rsp5 также вызывает ингибирование SPT23 (рис. 3, дор. 5), что говорит об идентичности механизмов регуляции РУП транскрипционного белка SPT23 ¿«.-¿-содержащими убиквитин-лигазами Nedd4 и Rsp5.

в.

Nedd4 wt WW1

Шштш gg-ргнк

Рисунок 3. А. Верхняя панель: иммуноблотинг убиквитин-лигаз Nedd4 и Rsp5 дикого типа и содержащих доминантно-негативные мутации в WW1 или hect доменах, экспрессированных в дрожжевых клетках. Нижняя панель: иммуноблотинг мембран-связанной и процессированной формы транскрипционного фактора SPT23 в дрожжевых линиях, экспрессиругощих Rsp5 и Nedd4 дикого и доминантно-негативного типов. В. Верхняя панель: Northern блотинг olel транскрипта в дрожжевых линиях, экспрессирующих убиквитин-лигазу человека дикого типа или с мутацией в WW1 домене. Нижняя панель: Фотография геля, окрашенного бромистым этидием, демонстрирует одинаковое количество рРНК в образцах.

Убиквитин-лигазы Nedd4WWl и RspSAWWl взаимодействуют с мембран-связанной формой SPT23. Наблюдаемая аккумуляция мембран-связанной формы SPT23 в дрожжевых линиях, экспрессирующих Nedd4WWl или Rsp5AWWl, может быть объяснена тем, что мутантные формы лигаз формируют комплекс с SPT23pl20, устойчивый (в силу доминантно-негативной активности ферментов) к воздействию природной убиквитин-лигазы Rsp5 дикого типа. Методом ко-иммунопреципитации было показано, что убиквитин-лигазы Nedd4 и Rsp5 взаимодействуют с мембран-связанной формой р120 транскрипционного фактора SPT23 (рис.4). Более того, нарушение белок-связывающей функции WW1 доменов Nedd4 и Rsp5 не нарушает, а напротив, усиливает связывание белка-субстрата.

SPT23

Nedd

Мембран-связанный SPT23

Процессированны й SPT23

Следовательно, WW1 домен hect-содержащих убиквитин-лигаз Nedd4 и Rsp5 не вовлечен во взаимодействие с предшественником транскрипционного фактора белком SPT23pl20. Полученные результаты коррелируют с опубликованными данными о том, что дрожжевая убиквитин-лигаза Rsp5 взаимодействует с SPT23 через свой WW3 домен (Hoppe at all., 2000).

Рисунок 4. Ко-ммунопреципитация мембран-связанного 8РТ23 и убиквитин-лигаз Nedd4 и Язр5 дикого типа и с мутацией WW1 домена из лизата клеток дрожжей.

Преципитация проводилась антителами, узнающими Ые<Ы4 или Яхр5, иммунокомплексы анализировались иммунобло-тингом с использованием антител к 8РТ23.

Убиквитин-лигаза человека N€<1(14 взаимодействует с вРТ23 через свои \V\V2 и WWЗ домены. Согласно литературным данным, структурные домены являются теми функциональными модулями /гес/-содержащих убиквитин лигаз, которые узнают и связывают белок-субстрат. Как известно, домены расположены в составе лигаз кластером и каждый WW домен, входящий в состав \\^-кластера, .обладает четко определенной функцией. Убиквитин-лигаза человека Nedd4 содержит четыре WW домена; причем WW1, WW2 и \V\V4 домены Nedd4 гомологичны \VWlj WW2 и WWЗ доменам дрожжевой убиквитин-лигазы Яэрб, соответственно (Нагуеу, 1999).

Как уже было показано/^^ домен обеих лигаз не участвует в связывании белка-субстрата БР'ПЗ, однако ингибирует РУП этого транскрипционного фактора. Более того, известно, что домен

ЯБр5 взаимодействует с 8РТ23, что делает высоковероятным участие карбокси-концевых WW доменов Nedd4 в выполнении функции связывания с субстратом 5РТ23. Была изучена функциональная роль карбокси-концевых WW доменов WWЗ и WW4) убиквитин-

лигазы человека в механизме РУП мембран-связанной формы БРТ23, а так же их способность связывать этот дрожжевой белок-субстрат. При

_SPT23_

' Nedd4 Rsp5 1 ,--^

^ J:

—Мембран-связанный

--«-•г- •»............v ' SPT23

. 1 2 3 и 4 5 иммунопреципитация Nedd4 Rsp5

I I

SPT23 иммуноблотинг

помощи метода сайт-направленного мутагенеза, были введены аминокислотные замены в последовательности WW2, и

\т2/3 доменов КесЫ4\У^У1 (Туг365->А1азб5, РЬе4з8-*А1а4з8, РЬе490—>'А1а49о и Туг365—>А1аз65/РЬе4з8-ч,А1а4з8, соответственно). Именно центральный тирозин (для и "УУ\У2) или фенилаланин (для \У\УЗ являются важными компонентами доменов при

формировании лиганд-связывающей структуры (8иЬо1, 1996; Маыаэ, 2000). Было продемонстрировано, что и ^УЗ домены, но не

WW4 домен, убиквитин-лигазы Nedd4 играют функциональную роль в механизме Nedd4WWl-зaвиcимoгo ингибирования РУП белка БРТ23 в дрожжевых клетках: нарушение белок-связывающей функции второго и третьего доменов Nedd4WWl устраняет доминантно-

негативную активность фермента по отношению к БРТ23 (рис. 5 А).

А.

8РТ23

В.

ЭРТ23

№ск14 -

^ сп ^

¿Г £ £ £ £ £

I

О?

Мембран-связанный

эртаз"

Процессированный -ЭРТ23

Ч''

о? £ к

£ £

■ N©¿(14

т 2

3 4 5

1 2 3 4 5 6

БРТ23 иммунопрецигоггация

Nedd4 иммуноблотинг

Рисунок 5. А. Верхняя панель: иммуноблотинг мутантных форм убиквитин-лигазы Nedd4, содержащих точечные аминокислотные замены в различных ЭД^ доменах, экспрессированных в дрожжевых клетках. Нижняя панель: иммуноблотинг мембран-связанной и проиессированной формы транскрипционного фактора 8РТ23 в дрожжевых линиях, экспрессирующих Nedd4WWl. 1\:еаё4\\г%'1/:, Неаа4\УАУ1/3. Nedd4WWl/4, Nedd4WWl/2/з', либо пустой вектор-контроль. В. Ко-иммунопреципитация БРТ23 и убиквитин-лигазы Nedd4, несущей мутации в различных АУЛУ доменах из лизата дрожжевых клеток. Преципитация проводилась антителами, узнающими 8РТ23, иммунокомплексы анализировались иммуноблотингом с использованием антител, узнающих Nedd4.

Высоковероятно, что WW2 и WWЗ домены убиквитин-лигазы Nedd4 выполняют функцию связывания с белком-субстратом. Действительно, методом ко-иммунопреципитации было показано, что человеческая убиквитин-лигаза Nedd4, несущая WW1 домен с нарушеной белок-связывающей функцией, будучи экспрессированной

в клетках пекарских дрожжей, узнает и связывает мембранную форму транскрипционного фактора SPT23 через свои WW2 и WW3 домены (рис. 5В).

Nedd4WWl и Nedd4c/a ингибируют РУП мембран-связанного субстрата SPT23 в клетках млекопитающих. Предполагается, что механизм РУП идентичен в клетках высших и низших эукариот. Особый интерес представляют убиквитин-лигазы, поскольку именно эти ферменты обеспечивают белок-субстрат специфической убиквитиновой модификацией, инициируя частичный протеолиз протеосомальным комплексом. Поэтому была исследована активность убиквитин-лигазы человека Nedd4 дикого типа, а так же содержащей доминантно-негативные мутации в WW1 (Nedd4WWl) и каталитическом (Nedd4C/A) доменах в клетках млекопитающих на примере процессинга модельного субстрата SPT23. С использованием метода транзиентной трансфекции был продемонстрирован аналогичный дрожжевому процессинг SPT23pl20 убиквитин-лигазой Nedd4wt, но не Nedd4WWl и Nedd4c/a в клетках легочной аденокарциномы человека Н1299 (рис.6, дор. 1,3,5, 7). Рисунок 6. Верхняя панель: Иммуноблотинг эндогенной (V), либо экзогенной убиквитин-лигазы Nedd4 дикого типа и содержащей доминантно-негативные мутации в WW1 или hect (С/А) доменах в клетках линии легочной аденокарциномы человека Н1299. Нижняя панель: иммуноблотинг мембран-связанной и

процессированной формы транскрипционного фактора SPT23 в клетках линии Н1299, экспрессирукяцей Nedd4 дикого и доминантно-негативного типов. Наличие "+" или отсутствие "-" ЮмкМ ингибитора 26S протеосомы пептидного альдегида MG115 в ростовой клеточной среде после трансфекции клеток.

Более того, было показано участие 26S протеосомы в регуляции РУП SPT23: в описанных транзиентных клеточных линиях Н1299, подверженных обработке протеосомальным ингибитором MG115,

_SP Г23

Г~у wt WW1 С/А I * -Nedd4

1 1 1 • r_L"; wr,,-

. + - + - + - + «— MGIID — Nedd4

2 3 4 5 6 7 8

Мембран-связанный "SPT23

- Процессированный SPT23

наблюдалось ингибирование процессинга SPT23pl20 с накоплением высокомолекулярного продукта (рис.6, дор. 2,4, 6, 8).

Убиквитин-лигаза Rsp5 и её человеческий гомолог Nedd4 не обязательны для РУП, однако абсолютно необходимы для активации транскрипционной функции SPT23 и MGA2. Согласно литературным данным, помимо SPT23, транскрипция жизненно важного гена olel может быть активирована при помощи близкого гомолога SPT23 - белка MGA2. Аналогично SPT23, MGA2 существует в форме мембран-связанного белка р120 и в транскрипционно-активной форме р90, причем MGA2pl20 и MGA2p90 способны димеризоваться при помощи IPT домена. До настоящего времени предполагалось, что MGA2pl20, аналогично SPT23pl20, подвергнут РУП с формированием транскрипционно активного MGA2p90. Однако роль убиквитин-лигазы Rsp5 в регуляции этого процесса изучена не была. Было показано, что при регуляции экспрессии olel гена SPT23 и MGA2 генетически комплементируют друг друга: гаплоидные штаммы с делецией по stp23 или mga2 аллелю проявляют фенотип дикого типа; дрожжи, несущие делеции обоих аллелей - не жизнеспособны, но могут выживать в присутствии олеиновой кислоты. Схожий клеточный фенотип наблюдался нами при экспрессии hect-c о держащих убиквитин лигаз (Nedd4 и Rsp5) с доминантно-негативными мутациями в WW1 и hect функциональных доменах. Более того, был продемонстрирован пониженный уровень olel транскрипта в Nedd4/Rsp5 -дефицитных клетках, что предполагает репрессию обоих факторов транскрипции.

Однако к удивлению было обнаружено, что при подавлении функционирования эндогенной убиквитин-лигазы Rsp5 путем ко-экспрессии доминантно-негативных форм ферментов Rsp5 и Nedd4 в клетках пекарских дрожжей, происходило образование процессированной молекулы транскрипционного фактора MGA2p90 (рис.7А). Более того, при продолжительной экспрессии Rsp5AWWl, Rsp5C/A (рис.7А), Nedd4WWl и Nedd4C/A (данные не приводятся), наблюдалось присутствие процессированной формы

транскрипционного фактора SPT23 - SPT23p90. Исследование функциональной активности сформированных MGA2p90 и SPT23p90 методом Northern блотинга выявило их некомпетентность в процессе увеличения транскрипции olel гена (рис.7В). Аналогичное образование MGA2p90 и SPT23p90 в отсутствие функциональной лигазы Rsp5 было продемонстрировано при 37°С в клетках дрожжевого штамма rsp5-l (рис.7С). Этот генетически-сконструированный штамм несет

температуро-чувствительную мутацию в гзр5 гене: при 25°С мутация «молчит» и экспрессируемая лигаза Г1зр5 функциональна; при 37°С мутация активна и Язр5 не функциональна.

а. с.

SPT23 MGA2 |-—-1 |- | wt rsp¡-l wt rspS-!

I-Ш-1 SPT23-------:-SPT23pl20

wt rsp5-I wt npS-1

SPT23pl20--------—~"MGA2pl20

SPT23p90---------MGA2p90 ш «мм. - ,_-MGA2pK20

m ' ' 1-1 1-1

»¡-okl

pPHK

Рисунок 7. А. Иммуноблотинг мембран-связанной (pi20) и продюсированной (p90) форм транскрипционных факторов SPT23 и MGA2 в дрожжевых линиях, экспрессирующих Rsp5 дикого типа и содержащей доминантно-негативные мутации в WW1 или hect (С/А) доменах в условиях продолжительной экспрессии белков (24 часа). В. Верхняя панель: Northern блотинг old транскрипта в дрожжевых линиях, описанных в А. Нижняя панелы Фоюграфия геля, окрашенного бромистым этидием, демонстрирует одинаковое количество рРНК в образцах. С. Иммуноблотинг SPT23 и MGA2 (р120 и р90) в дрожжевых линиях дикого типа (wt) и с мутацией в rsp5 гене (rsp5-l) при 25°С и 37°С.

Убиквитин-лигаза Rsp5 ответственна за мобилизацию SPT23p90 и MGA2p90 от мембраны ЭР в ядро дрожжевой клетки. Используя метод иммунофлюоресцентного окрашивания белков в дрожжевой клетке, было показано, что в присутствии функциональной эндогенной убиквитин-лигазы Rsp5, транскрипционные факторы MGA2 и SPT23 локализованы в ядре, на ядерной мембране и на мембране ЭР (рис.8А). Однако, в клетках с подавленной функцией Rsp5 (экспрессирующих доминантно-негативную форму фермента), исследуемые белки локализованы преимущественно на мембране ЭР (рис.8А).

fl

I

' Необходимо отметить, что SPT23pl20 и MGA2pl20, в отличие от

SPT23p90 и MGA2p90, обладают транс-мембранными доменами и остаются связанными с мембраной ЭР. Следовательно, убиквитин-лигаза Rsp5 вовлечена в мобилизацию SPT23p90 и MGA2p90 от мембраны ЭР в клеточное ядро.

1 Сегрегаза Cdc48ÜMM4pM вовлечена в мобилизацию SPT23p90 и

MGA2p90 от мембраны ЭР в ядро дрожжевой клетки. Согласно литературным данным, мобилизация транскрипционно-активной молекулы SPT23p90 в ядро дрожжевой клетки регулируется С шапероновым комплексом Cdc48 ЫШр14) называемым сегрегазой

(Hitchcock, 2001). Один из членов этого комплекса - белок ядерной оболочки NpI4, кодируется жизненно важным геном пр14, мутации f-' которого вызывают дефекты ядерно-цитоплазматического трафика

(DeHoratius, 1996). Предполагается, что белок Cdc48, взаимодействует 1 с убиквитинированной молекулой SPT23, находящейся в составе

димёра SPT23pl20/p90, сегрегирует (отделяет) её от немодифицированной молекулы, и переносит её от мембраны ЭР в клеточное ядро (Hoppe, 2001). Методом иммунофлюоресцентного окрашивания белков, была продемонстрирована функциональная активность сегрегазы Cdc48uai р14 в процессе локализации SPT23 и 1 MGA2 в дрожжевой клетке. В клетках температуро-чувствительного

(ts) штамма пр14-1, мутантного по пр14 аллелю, вьфащиваемых при температуре 30°С (пермиссивная температура: экспрессируемый NpI4 ' белок не функционален), наблюдалась аккумуляция обеих форм (р90 и

р!20) белков SPT23 и MGA2 на мембране ЭР (рис.8В).

Рисунок 8.

A. Иммунофлюоресцентное окрашивание ЭР'ПЗ и \fGA2, экспессированных в присутствии эндогенной лигазы Яэрг дикого типа (Клр5\>,1'), либо доминантно-негативной формы фермента (Кзр5С/А) в дрожжевых клетках штамма

\ дикого типа.

B. Иммуноокраска 8РТ23 и МОА2, экспессированных в а штамме пр14-1 при температуре 30°С.

А Клетей WT В- Клетки/рМ-У

Убиквитин-лигаза Rsp5 ответственна за поли-убиквитинирование мембран-связанной формы р120 белков SPT23 и MGA2. При изучении субстратных свойств белков SPT23 и MGA2 к убиквитин-лигазе Rsp5, было определено, что фермент взаимодействует исключительно с мембранной формой р120 белков SPT23 и MGA2 (данные не приводятся), находящейся в составе гетеродимера SPT23pl20/p90 и MGA2pl20/p90, соответственно. Исследование функций таких взаимодействий проводилось с использованием дрожжевого штамма пр14-1 (т.е. в условиях аккумуляции SPT23 и MGA2 на мембране ЭР). Было показано формирование поли-убиквитинированного белкового продукта с молекулярной массой > 120кДа, соответствующего SPT23pl20 и MGA2pl20, в присутствии эндогенной убиквитин-лигазы Rsp5 (рис.9А).

SPT23 MGA2

$ ¿f1 $ ¿т

b-, V» V4

\ ^ А #л#

^ Л ^ ^ ^ ^

в.

MÜA2 ARPN штамм

MGA2 штамм

ñzzsT

2 3 4 5 6 7 8

иммуноаресипитация SPT23 ||| MGA2 |

з й- 2 2 ° so«

Ю V

и О X С. = = 1

И

нммуноолотинг

]

поли-Ub MGA2pl20

иммуноолотинг ^

-j

MGA2

Ub

Ub SPT23 Ub MGA2

Рисунок 9. А. Иммуноблотинг иммуноочищенных SPT23 и MGA2 (мембранной р120 и процессированной р90 форм) с использованием ангител, узнающих убиквитин Ub (дор. 1, 2, 5 и 6); либо антител, узнающих р120 и р90 формы белков SPT23(flop. 3 и 4) и MGA2 (дор. 7 и 8) в клетках дрожжевого штамма прЫ-1, выращенного при пермиссивной температуре 30°С. В. Слева: Иммуноблотинг мембранной формы MGA2, экспрессированной в протеосомо-дефицитном штамме ARPN, при "+" или без "—" обработки ингабитором 26S протеосомы. Справа: Иммуноблотинг иммуноочищенной мембранной формы MGA2pl20, экспрессированной в клетках штамма дикого типа (WT), либо в клетках протеосомо-дефишпиого штамма ARPN, с использованием аитител, узнающих убиквитин Ub.

Эти результаты коррелируют с литературными данным о том, что предпочтительным субстратом сегрегазы

cdc48Ufdl/Npl4

в дрожжах

являются белки, модифицированные поли-убиквитином (Bays, 2002). При подавлении функции убиквитин-лигазы Rsp5 (экспрессией

доминантно-негативной лигазы Rsp5c/a) наблюдалось значительное, но не полное, ингибирование наблюдаемого процесса убиквитинирования. Зарегистрированный убиквитинированный сигнал в составе мембран-связанной формы р120 белков SPT23 и MGA2, является, вероятно, сигналом к процессингу. Эти данные подтверждают наше первоначальное предположение о том, что лигаза Rsp5 не обязательна для процессинга р120, что предполагает участие другой убиквитин-лигазы, выполняющей эту функцию.

Наблюдаемая убиквитиновая модификация мембранных форм исследуемых транскрипционных факторов является сигналом к деградации белка 26S протеосомальным комплексом. Это было показано на примере MGA2pl20 в экспериментах с использованием протеосомо-дефицитного штамма ARPN или при ингибировании функции протеосомы пептидными альдегидами (рис.9В).

Заключение

В представленной работе впервые было показано, что убиквитин-лигаза человека Nedd4 узнает и связывает мембранную форму р120 транскрипционного фактора SPT23 через свои WW2 и WW3 домены в клетках пекарских дрожжей (рис.1 ОЛ); способность же дрожжевой убиквитин-лигазы Rsp5 взаимодействовать с SPT23pl20 через WW3 домен была продемонстрирована ранее (Hoppe, 2000). Впервые было показано, что мутирование WW1 домена убиквитин-лигаз Rsp5 и Nedd4 не влияет на связывание ферментов с белком-субстратом SPT23, но при определенных условиях, ингибирует его процессинг. На основании полученных данных мы предполагаем, что WW1 домен йес/-содержащих убиквитин-лигаз Rsp5 и Nedd4 выполняет регуляторную функцию в реакции убиквитинирования некоторых субстратов. Мы предполагаем существование WW1 -связывающих белков ко-факторов в клетках высших и низших эукариот (рис.105), необходимых для выполнения ферментативной функции лигаз.

При изучении механизма активации транскрипции жизненно важного гена olel генетически-комплементарными

транскрипционными дрожжевыми факторами SPT23 и MGA2, была продемонстрирована функциональная роль убиквитин-лигазы Rsp5 в регуляции этого процесса. Впервые показано, что Rsp5 не обязательна для инициации процессинга SPT23 и MGA2, что предполагает существование альтернативного фермента, маркирующего SPT23 и MGA2 убиквитином для частичной протеосомальной деградации

(рис. ЮС). Однако, полученные данные демонстрируют, что убиквитин-лигаза 11зр5 абсолютно необходима для активации транскрипционной функции БРТ23 и МОА2. Было показано, что Б^рЗ инициирует поли-убиквитинирование мембран-связанных БРТ23р120 (МСА2р120), входящих в состав ЭР-локализованного димера 5РТ23р120/р90 (МСА2р120/р90) (рис. 100). Предполагается, что такая модификация дает сигнал сегрегазе Сёс48иг 1/ЫрМ к связыванию модифицированной убиквитином молукулы 8РТ23р120 (МвА2р 120), диссоциации её из димера и презентации протеосоме для деградации (рис.10£). В результате, процессированная форма БРТ23р90 (\lGA2p90) оказывается свободной, транслоцируется в ядро клетки и активирует транскрипцию о1е1 гена (рисЛОТ7).

Рисунок 10. Модель механизма активации мембран-связанных транскрипционных факторов 8РТ23 и МОА2 убиквитин-лигазами Язр5 и КесШ.

частичная деградация протеосомой

С

F

Е

сегрегация pl20-Ub из димера и деградация протеосомой ЭР:

Г

V.

-\ .., >»>»>. Y

CDC48CT1,,/Í,PL4 Ub*-

_/

сегрегация р90 из димера, транспорт в ядро и транс-актнваиия ole/

выводы

1. Установлено, что нарушение белок-связывающей функции WW1 домена hect-содержащей убиквитин-лигазы человека Nedd4 индуцирует токсичную активность фермента в клетках пекарских дрожжей.

2. Методом скрининга экспресс ионной кДНК библиотеки Saccharomyces cerevisiae была идентифицирована кДНК жизненно важного гена olel (кодирующего десатюразу жирных кислот), ко-экспрессия которой блокирует токсичный эффект, вызванный Nedd4WWl. Показано, что наличие ненасыщенных жирных кислот в ростовой среде позволяет дрожжам, экспрессирующим Nedd4WWl, выживать.

3. Доказано, что убиквитин-лигаза Nedd4 и её дрожжевой гомолог Rsp5, несущие домены с нарушенными белок-связывающими (WW1) и каталитическими функциями, обладают доминантно-негативной активностью в регуляции экспрессии olel гена в дрожжевых клетках. Выявлено, что Nedd4 и Rsp5 с мутациями в WW1 и каталитическом доменах ферментов, ингибируют Регулируемый Убиквитин/протеосома-зависимый Процессинг (РУГ1) мембран-связанной формы транскрипционного фактора гена olel - дрожжевого белка SPT23. Установлено, что это приводит к ингибированию формирования транскрипционно-активной формы SPT23 и снижению транскрипции olel гена в клетках пекарских дрожжей.

4. Показано, что первый WW домен убиквитин-лигаз Nedd4 и Rsp5 не вовлечен в связывание с молекулой субстрата — транскрипционным фактором SPT23. Определено, что WW2 и WW3 человеческой лигазы Nedd4 взаимодействуют в дрожжевых клетках, с непроцессированной, мембран-связанной формой SPT23

5. Продемонстрирована схожесть механизма РУП в клетках высших и низших эукариот на примере экспрессии дрожжевого белка SPT23 (использованного в качестве модельного субстрата убиквитин-лигазы человека Nedd4) в клеточной линии аденокарциномы легких человека. Показана активность протеосомального комплекса в процессе РУП SPT23.

6. Определено, что в условиях отсутствия функциональной убиквитин-лигазы Rsp5 в дрожжевой клетке (при продолжительной экспрессии доминантно-негативных форм лигаз Nedd4 и Rsp5, либо при использовании генетически

сконструированного штамма, несущего мутированный г эр 5 ген) формируются процессированные, но транскрипционно неактивные формы факторов, регулирующих транскрипцию о1е1 гена: белков БРТ23 и МОА2. Таким образом, показано, что убиквитин-лигаза пекарских дрожжей Ызр5, не обязательна для индукции РУП белков 8РТ23 и МОА2.

7. Показано, что убиквитин-лигаза Л5р5 ответственна за транслокацию процессированных форм БРТ23р90 и МОА2р9() от мембраны эндоплазматического ретикулума в клеточное ядро.

8. Показано, что убиквитин-лигаза Кяр5 модифицирует поли-убиквитинированием мембран-связанные формы белков 8РТ23р120 и МСА2р120, входящие в состав димеров БРТ23р120/ БРТ23р90 и МОА2р120/МСА2р90. Это маркирует молекулы белков для деградации протеосомалышм комплексом 268. Подобный убиквитин-зависимый протеолиз молекулы р120 нарушает стабильность димеров и приводит к транслокации активной формы р90 в ядро клетки.

9. Па основе полученных данных, предложен механизм активации транскрипционных факторов 8РТ23 и МвА2 убиквитин-лигазами Кэрб и №ё(14. Дрожжевой фермент ЯэрЗ, а так же его человеческий гомолог №ё<14, ответственны за маркировку поли-убиквитином мембран-связанной формы р120, входящей в состав димерар120/р90, белков 8РТ23 и МОА2. Подобная модификация убиквитином приводит к деградации белков 26Б протеосомой. В результате, процессированная форма 8РТ23р90 (МСА2р90) оказьшается свободной и транскрипционно активной. В работе впервые продемонстрирована регуляторная функция WW1 домена лигаз Изр5 и №(1<14 в процессе РУП транскрипционных факторов 8РТ23 и \1GA2.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Shcherbik N., Kumar S., Haines D.S. Substrate proteolysis is inhibited by dominant-negative Nedd4 and Rsp5 mutants harboring alterations in WW damain 1. // J. Cell. Science. 2002. V.l 15. № 5. P.1041-1048.

2. Gajewska B., Shcherbik N., Oficjalska D., Haines D.S., Zoladek T. hNEDD4, a human orthologue of RSP5 encoding ubiquitin-protein ligase, functions in yeast.// Current Genetics. 2003. V.43. №1. P. 1-10.

3. Shcherbik N., Zoladek T., Nickels J.T., Haines D.S. Rsp5 is required for ER bound Mga2pl20 polyubiquitination and release of the processed/tethered transactivator Mga2p90. // Current Biology. 2003. V. 13. P. 1227-1233.

Отпечатано на полиграфическом участке издательского отдела Института катализа им. Г.К. Борескова СО РАН 630090, Новосибирск, пр. Академика Лаврентьева, 5

Подписано в печать 30.09.2003 Заказ № 170

Формат 60x84 1/16 Бумага офсетная, 80 гр/м:

Печ.л. 1 Тираж 100

IÍ1 S 9 1 6

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Щербик, Наталья Валерьевна

Список принятых сокращений.

Введение.

Литературный обзор.

Материалы и методы.

Результаты и их обсуждение.

Выводы.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Щербик, Наталья Валерьевна

выводы

1. Установлено, что нарушение белок-связывающей функции WW1 домена йес/-содержащей убиквитин-лигазы человека Nedd4 индуцирует токсичную активность фермента в клетках пекарских дрожжей.

2. Методом скрининга экспрессионной кДНК библиотеки Saccharomyces cerevisiae была идентифицирована кДНК жизненно важного гена olel (кодирующего десатюразу жирных кислот), ко-экспрессия которой блокирует токсичный эффект, вызванный Nedd4WWl. Показано, что наличие ненасыщенных жирных кислот в ростовой среде позволяет дрожжам, экспрессирующим Nedd4WWl, выживать.

3. Доказано, что убиквитин-лигаза Nedd4 и её дрожжевой гомолог Rsp5, несущие домены с нарушенными белок-связывающими (WW1) и каталитическими функциями, обладают доминантно-негативной активностью в регуляции экспрессии olel гена в дрожжевых клетках. Выявлено, что Nedd4 и Rsp5 с мутациями в WW1 и каталитическом доменах ферментов, ингибируют . Регулируемый Убиквитин/протеосома-зависимый Процессинг (РУП) мембран-связанной формы транскрипционного фактора гена olel — дрожжевого белка SPT23. Установлено, что это приводит к ингибированию формирования транскрипционно-активной формы SPT23 и снижению транскрипции olel гена в клетках пекарских дрожжей.

4. Показано, что первый WW домен убиквитин-лигаз Nedd4 и Rsp5 не вовлечен в связывание с молекулой субстрата — транскрипционным фактором SPT23. Определено, что WW2 и WW3 человеческой лигазы Nedd4 взаимодействуют в дрожжевых клетках, с непроцессированной, мембран-связанной формой SPT23

5. Продемонстрирована схожесть механизма РУП в клетках высших и низших эукариот на примере экспрессии дрожжевого белка SPT23 (использованного в < качестве модельного субстрата убиквитин-лигазы человека Nedd4) в клеточной линии аденокарциномы легких человека. Показана активность протеосомального комплекса в процессе РУП SPT23.

6. Определено, что в условиях отсутствия функциональной убиквитин-лигазы Rsp5 в дрожжевой клетке (при продолжительной экспрессии доминантно-негативных форм лигаз Nedd4 и Rsp5, либо при использовании генетически сконструированного штамма, несущего мутированный rsp5 ген) формируются процессированные, но транскрипционно неактивные формы факторов, регулирующих транскрипцию olel гена: белков SPT23 и MGA2. Таким образом, показано, что убиквитин-лигаза пекарских дрожжей Rsp5, не обязательна для индукции РУП белков SPT23 и MGA2.

7. Показано, что убиквитин-лигаза Rsp5 ответственна за транслокацию процессированных форм SPT23p90 и MGA2p90 от мембраны эндоплазматического ретикулума в клеточное ядро.

8. Показано, что убиквитин-лигаза Rsp5 модифицирует поли-убиквитинированием мембран-связанные формы белков SPT23pl20 и MGA2pl20, входящие в состав димеров SPT23pl20/ SPT23p90 и MGA2pl20/MGA2p90. Это маркирует молекулы белков для деградации протеосомальным комплексом 26S. i

Подобный убиквитин-зависимый протеолиз молекулы р120 нарушает стабильность димеров и приводит к транслокации активной формы р90 в ядро клетки.

9. На основе полученных данных, предложен механизм активации транскрипционных факторов SPT23 и MGA2 убиквитин-л и газами Rsp5 и Nedd4. Дрожжевой фермент Rsp5, а так же его человеческий гомолог Nedd4, ответственны за маркировку поли-убиквитином мембран-связанной формы р120, входящей в состав димера р120/р90, белков SPT23 и MGA2. Подобная модификация убиквитином приводит к деградации белков 26S протеосомой. В результате, процессированная форма SPT23p90 (MGA2p90) оказывается свободной и транскрипционно активной. В работе впервые продемонстрирована регуляторная функция WW1 домена лигаз Rsp5 и Nedd4 в процессе РУП транскрипционных факторов SPT23 и MGA2.

§18. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Модель механизма Nedd4/Rsp5-petyiupyeM020 убиквитинирования. Как уже было отмечено ранее, согласно литературным данным, WW3 домен Rsp5 абсолютно необходим для RspS-зависимой регуляции процессинга SPT23, благодаря предполагаемой функции связывания субстрата [5]. Однако на сегодняшний день, в литературе ещё нет строгих свидетельств того, является ли этот структурный модуль дрожжевой убиквитин-лигазы достаточным в обеспечении регуляторной функции фермента.

Если функция карбокси-расположенных WW доменов, входящих в состав WW кластера Лес/-содержащих убиквитин-лигаз заключается в связывании белков-субстратов, то функция первого домена на сегодняшний день ещё не определена. Согласно литературным данным, именно WW1 домен не вовлечен в связывание ни одного известного субстрата /гесг-содержагцих лигаз.

В этой работе мы показали важную роль, которую играет первый WW домен WW кластера /^/-содержащих убиквитин-лигаз (дрожжевой лигазы Rsp5 и человеческой лигазы Nedd4) в функционировании этого класса ферментов в дрожжевой клетке на примере регуляции процессинга транскрипционного фактора SPT23. Результаты t демонстрируют, что аналогично WW1 домену убиквитин-лигазы человека Nedd4, WW1 домен дрожжевого фермента Rsp5, не обязателен для связывания, однако необходим для убиквитин/протеосома-зависимого процессинга мембран-связанной формы SPT23 в клетках пекарских дрожжей.

Более того, на основе продемонстрированной идентичности наблюдаемых активностей убиквитин-лигаз дрожжей и человека дикой и мутантных форм, мы предполагаем универсальность механизма регуляции убиквитин/протеосомо-зависимого процессинга мембран-связанных субстратов функцией лигаз в клетках высших и низших эукариот.

Как известно на сегодняшний день, модификация SPT23 убиквитином в дрожжевой клетке несет по крайней мере три смысловые нагрузки:

1) убиквитинирование мембран-связанной формы SPT23/pl20 модифицирует этот белок для специфического 26S протеосомо-зависимого процессинга с формированием р90 (РУП) [5];

2) убиквитинирование одной из молекул в составе димера р120/р90 дает сигнал молекулярному шаперону (CDC48ufdi/NPL4) к связыванию и дестабилизации комплекса р120/р90, что приводит к транслокации р90 в клеточное ядро [167];

3) убиквитинирование отработавшего в ядре р90, дает сигнал протеосомальному комплексу к инициации деградации этого белка [22, 185].

Несмотря на то, что /г<?с/-содержащей убиквитин-лигазе Rsp5 отводится важная роль в регуляции экспрессии olel гена, непосредственное участие этого фермента в регуляции механизма РУП, ответственного за формирование транскрипционно-активного(ых) фактора(ов) транскрипции olel, ещё строго не доказано. Если убиквитин-лигаза Rsp5 - единственный фермент, контролирующий экспрессию olel гена, логично предположить существование различных регуляционных механизмов, контролирующих ту или иную активность Rsp5 по отношению к субстрату SPT23. Альтернативно можно предположить существование убиквитин-лигазы. принадлежащей к другому семейству ферментов ЕЗ, контролирующей один из этапов описанного механизма.

На основе полученных данных, мы постулируем, что WW1 домен убиквитин-лигазы Rsp5 (либо её человеческого гомолога Nedd4) выполняет роль регуляционного модуля. Мы предполагаем, что в клетках пекарских дрожжей WW1 домен лигаз Rsp5 и/или Nedd4 способен взаимодействовать с молекулой белка ко-фактора, необходимого для специфического поли-убиквитинирования белка-субстрата SPT23, дающего сигнат 26S протеосоме к осуществлению белкового процессинга (рисунок 21). Более того, мы предполагаем, что WW1 домен hect-содержащих убиквитин лигаз обладает аналогичной регуляторной функцией и в клетках высших эукариот, что, соответственно, подразумевает существование белка ко-фактора млекапитающих, высоко-гомологичного дрожжевому.

Белок ко-фактор может способствовать прикреплению инициирующей молекулы убиквитина на специфический сайт в последовательности SPT23; либо способен контролировать сборку мульти-убиквитиновой цепи специфичным для сигнала к процессингу образом; либо способствует изменению конформации SPT23 так, что протеосомный комплекс гидролизует пептидную связь в составе SPT23 в четко определенном месте, оставляя транскрипционно-активный участок фактора нетронутым.

Рисунок 21.

С2

WW домены 1 2 3 4 п п 0 11 субстрат SPT23 иь,

Рисунок 21. Модель Nedd4/Rsp5-perynHpyeMoro убиквитинирования мембран-связанной формы транскрипционного фактора SPT23

С2 домен - светло-зеленый квадрат; WW домены - желтые квадраты; hect домен - серый прямоугольник, содержит участок связавания (розовый прямоугольник) убиквитин-конъюгирующего фермента Е2 (зеленый круг), несущего активированную молекулу убиквитина (Ub). Каталитически активный цистеин Cys (черная полоска) образует ковалентную связь с молекулой убиквитина и переносит её с Е2 на белок-субстрат.

Карбокси-локализованные WW домены (WW2 и WW3 домены убиквитин-лигазы Nedd4 и WW3 домен убиквитин-лигазы Rsp5) взаимодействуют с белком-субстратом - мембран-связанной формы транскрипционного фактора SPT23 (зеленый прямоугольник). Первый WW домен Nedd4-подобных убиквитин-лигаз регулирует процесс переноса убиквитина на белок-субстрат при связывании молекулы белка ко-фактора (фиолетовый овал).

Дальнейшие детальные исследования картины убиквитинирования SPT23 в дрожжевых клетках при участии доминантно-негативной и дикой форм hect-содержащих убиквитин-лигаз поможет определить механизм регуляции процессинга мембран-связанных факторов транскрипции. С другой стороны, поиск и идентификация самого белка ко-фактора скринингом кДНК библиотеки Saccharomyces cerevisiae предоставит много интересной информации.

Модель, демонстрирующая роль убиквитин-лигазы RspS в процессе активации мембран-связанных транскрипционных факторов SPT23 и MGA2. Рисунок 22. р120/р120 р120/р90

CDC48UFD1/NPU

26S протеосома

-иь

Rsp5 (!)

26S протеосома

Ub ~ Ub -Ub ~ Ub -Ub -Ub '

Деградация pl20

Активация TpilHCXp Ш1Ш10ШК) й Актiianocmu p90

ЯДРО

ЭР

При изучении механизма активации транскрипции жизненно важного гена olel генетически-комплементарными транскрипционными факторами дрожжей SPT23 и MGA2, была продемонстрирована функциональная роль убиквитин-лигазы Rsp5 в регуляции этого процесса. Впервые показано, что Rsp5 не обязательна для инициации процессинга SPT23 и MGA2, что предполагает существование альтернативного фермента, маркирующего SPT23 и MGA2 убиквитином для частичной протеосомальной деградации. Однако, полученные данные демонстрируют, что убиквитин-лигаза Rsp5 абсолютно необходима для активации транскрипционной функции SPT23 и MGA2. Было показано, что Rsp5 инициирует поли-убиквитинирование мембран-связанных SPT23pl20 (MGA2pl20), входящих в состав ЭР-локализованного димера SPT23pl20/p90 (MGA2pl20/p90). Такая модификация дает сигнал сегрегазе Cdc48ufdl/NpI4 к связыванию модифицированной убиквитином молукулы SPT23pl20 (MGA2pl20), диссоциации её из димера и презентации протеосоме для деградации. В результате, процессированная форма SPT23p90 (MGA2p90) оказывается свободной, транслоцируется в ядро клетки и активирует транскрипцию olel гена (рис.22).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Щербик, Наталья Валерьевна, Новосибирск; Филадельфия

1. Craig K., Tyers M. The F-box: a new motif for ubiquitin dependent proteolysis in cell cycle regulation and signal transduction. // Prog.Biophys.Mol.Biol. 1999. V.72. № 3. P.299-328.

2. Wilkinson K. Ubiquitin-dependent signaling: the role of ubiquitination in the response of cells to their enviroment. // J. Nutr. 1999. V.129. №11. P.1933-1936.

3. Hoppe Т., Matuschewski K., Rape M., Schlenker S., Ulrich H., Jentsch S. Activation of a membrane-bound transcription factor by regulated ubiquitin/proteasome-dependent processing. // Cell. 2000. V.102. № 5. P.577-586.

4. Karin M., Ben-Neriah Y. Phosphorilation meets ubiquitination: the control of NFkB activity. // Annu.Rev.Immunol. 2000. V.18. P.621-663.i

5. Finley D. Signal transduction. An alternative to destruction. //Nature. 2001. V.412. № 6844. P.283-286.

6. Magnani M., Crinelli R., Bianchi M., Antonelli A. The ubiquitin-dependent ptoteolytic system and other potential targets for the modulation of nuclear factor-kB (NF-kB). // Curr. Drug Targ.1.2000. V.l. № 4. P.387-399.

7. Ghosh S., May M., Kopp E. NF-kappa В and Rel proteins: evolutionarily conserved mediators of immune responses. // Annu. Rev. Immunol. 1998. V.l6. P.225-260.

8. Rock K., Goldberg A. Degradation of cell proteins and the generation of MHC class I-presented peptides. // Annu. Rev. Immunol. 1999. V.l7. P.739-779.

9. Waterman H., Levkowitz G., Alroy I., Yarden Y. The RING finger of c-Cbl mediates desensitization of the epidermal growth factor receptor. // J.Biol.Chem. 1999. V.274. № 32. P.22151-22154.

10. Joazeiro C., Wing S., Huang H., Leverson J., Hunter Т., Liu Y. The tyrosine kinase negative " regulator c-Cbl as a RING-type, E2-dependent ubiquitin-protein ligase. // Science. 1999. V.286. № 5438. P.309-312.

11. Lam Y., Pickart C., Alban A., Landon M., Jamieson C., Ramage R., Mayer R., Layfield R. Inhibition if the ubiquitin-proteasome system in Alzheimer's disease. // Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 2000. V.97. № 18. P.9902-9906.

12. Kishino Т., Lalande M., Wagstaff J. UBE3A/E6-AP mutations cause Angelman syndrome. // Nat. Genet. 1997. V.15. № 1. P.70-73.

13. Matsuura Т., Sutcliffe J., Fang P., Galjaard R., Jiang Y., Benton C., Rommens J., Beaudet A. De novo truncating mutations in E6-AP ubiquitin-protein ligase gene (UBE3A) in Angelman syndrome. //NatGenet 1997. V.15. № 1. P.74-77.

14. Hicke L. Ubiquitin-dependent internalization and down-regulation of plasma membrane proteins. //Trends Cell Biol. 1999. V.9. № 14. P. 107-112.

15. Pickart C. Targeting of substrates to the 26S proteasome. // FASEB J. 1997. V.l 1. № 13. P.1055-1066.

16. Hochstrasser M. Ubiquitin-dependent protein degradation. // Annu.Rev.Genet. 1996. V.30. P.405-439.

17. Hershko A., Ciechanover A. The ubiquitin system. // Annu. Rev. Biochem. 1998. V.67. P.425-479.

18. Pickart C. Mechanisms underlying ubiquitination. // Annu. Rev. Biochem. 2001. V.70. № 70. ' P.503-533.

19. Pickart C. Ubiquitin enters the new millennium. // Mollecular Cell. 2001. V.8. № 3. P.499-504.

20. Laney J., Hochstrasser M. Substrate targeting in the ubiquitin system. // Cell. 1999. V.97. № 4. P .427-430.

21. Pickart C. Ubiquitin in chains. // Trends Biochem. Sci. 2000. V.25. № 11. P.544-548.

22. Spence J., Gali R., Dittmar G., Sherman F., Karin M., Finley D. Cell cycle-regulatedmodification of the ribosome by a variant multiubiquitin chain. // Cell. 2000. V.l 02. № I. P.67-76.

23. Hofmann R., Pickart C. Noncanonical MMS2-encoded ubiquitin-conjugating enzyme functions in assembly of novel polyubiquitin chains for DNA repair. // Cell. 1999. V.96. № 5. P.645-653.

24. Hawley-Nelson P., Vousden K., Hubbert N., Lowy D., Schiller J. HPV E6 and E7 proteins cooperate to immortalize human foreskin keratinocytes. // EMBO J. 1989. V.8. № 12. P.3905-3910.

25. Munger K., Phelps W., Bubb V., Howley P., Schlegel R. The E6 and E7 genes of the human papillomavirus type 16 together are necessary and sufficient for transformation of primary human keratinocytes. //J.Virol. 1989. V.63. № Ю. P.4417-4421.

26. Munger K., Werness В., Dyson N., Phelps W., Harlow E., Howley P. Complex formation of human papillomavirus E7 proteins with the retinoblastoma tumor suppressor gene product. // EMBO J. 1989. V.8. № 13. P.4099-4105.

27. Schefifner M., Werness В., Huibregtse J., Levine A., Howley P. The E6 oncoprotein encoded by human papillomavirus types 16 and 18 promotes the degradation of p53. // Cell. 1990. V.63. № 6. P.l 129-1136.

28. Scheffner M.? Munger K., Byrne J., Howley P. The state of the p53 and retinoblastoma genes in human cervical carcinoma cell lines. // Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 1991. V.88. № 13. P.5523-5527.

29. Crook Т., Wrede D., Vousden K. p53 point mutation in HPV negative human cervical carcinoma cell lines. // Oncogene. 1991. V.6. № 5. P.873-875.

30. Levine A., Momand J., Finlay C. The p53 tomour suppressor gene. //Nature. 1991. V.351. № 6326. P.453-456.

31. Huibregtse J., Scheffner M., Howley P. A cellular protein mediates association of p53 with the E 6 oncoprotein of human papillomavirus types 16 or 18. // EMBO J. 1991. V.10. № 13. P.4129-4135.

32. Scheffner M., Huibregtse J., Vierstra R., Howley P. The HPV-16 E6 and E6-AP complexfunctions as a ubiquitin-protein ligase in the ubiquitination of p53. // Cell. 1993. V.75. № 3. P.495-505.

33. Huibregtse J., Scheffner M., Howley P. Cloning and expression of the cDNA for E6-AP, a protein that mediates the interaction of the human papillomavirus E6 oncoprotein with p53. // Mol. Cell Biol. 1993. У.13. № 2. P.775-784.

34. Huibregtse J., Scheffner M., Howley P. Localization of the E6-AP regions that direct human papillomavirus E6 binding, association with p53, and ubiquitination of associated proteins. // Mol. Cell Biol. 1993. V.13. № 8. P.4918-4927.

35. Talis A., Huibregtse J., Howley P. The role of E6AP in the regulation of p53 protein levels in

36. Human Papillomavirus (HPV)-positive and HPV-negative cells. // J. Biol. Chem. 1998. V.273. № 11. P.6439-6445.

37. Nawaz Z., Lonard D., Smith C., Lev-Lehman E., Tsai S., Tsai M., O'Malley B. The Angelman syndrome-associated protein, E6-AP, is a coactivator for the nuclear hormone receptor superfamily. // Mol. Cell Biol. 1999. V.19. № 2. P. 1182-1189.

38. Huang L., Kinnucan E., Wang G., Beaudenon S., Howley P., Huibregtse J., Pavletich N. Structure if an E6AP-UbcH7 complex: insights into ubiquitination by the E2-E3 enzyme cascade. // Science. 1999. V.286. № 5443. P. 1321-1326.

39. Oda H., Kumar S., Howley P. Regulation of the Src family tyrosine kinase Blk through E6AP-mediated ubiquitination. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V.96. № 17. P.9557-9562.

40. Harris K., Shoji I., Cooper E., Kumar S., Oda H., Howley P. Ubiquitin-mediated degradation of4active Src tyrosine kinase. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V.96. № 24. P.13738-13743.

41. Kumar S., Talis A., Howley P. Identification of HHR23A as a substrate for E6-associatedprotein-mediated ubiquitination. // J.Biol.Chem. 1999. V.274. № 26. P.18785-18792.

42. Kuhne C., Banks L. E3-ubiquitin ligase/E6-AP links multicopy maintenance protein 7 to the ubiquitination pathway by a novel motif, the L2G box. //J.Biol.Chem. 1998. V.273. № 51. P.34302-34309.

43. Scheffiier M., Nuber U., Huibregtse J. Protein ubiquitination involving an E1-E2-E3 enzyme ubiquitin thioester cascade.// Nature. 1995. V.373. № 6509. P.81-83.

44. Wang G., Yang J., Huibregtse J. Functional domains of Rsp5 ubiquitin-protein Iigase. // Mol. Cell Biol. 1999. V.19. № 1. P.342-352.

45. Huibregtse J., Scheffner M., Beaudenon S., Howley P. A family of proteins structurally and functionally related to the ubiquitin-protein ligase. II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V.92. № 7. P.2563-2567.

46. Nuber U., Schwarz S., Kaiser P., Schneider R., Scheffner M. Cloning of human ubiquitin-conjugating enzyme UbcH6 and UbcH7 (E2-F1) and characterization of their interaction with E6-AP and Rsp5. // J. Biol. Chem. 1996. Y.271. № 5. P.2795-2800.

47. Kumar S., Kao W., Howley P. Physical interaction between specific E2 and Hect E3 enzymes determines functional cooperativity. // J. Biol. Chem. 1997. V.272. №21. P.13548-1554.

48. Rape M., Jentsch S. Taking a bite: proteasomal protein processing. // Nature Cell. Biol. 2002. V.4. № 5. P.E113-EI16.

49. Kumar S., Tomooka Y., Noda M. Identification of a set of genes with developmentally down- , regulated expression in mouse brain. // Biochem.Biophys.Res.Commun. 1992. V.185. № 3. P. 11551161.

50. Kumar S., Harvey K., Kinoshita M., Copeland N. Noda M., Jenkins N. cDNA cloning, expression analysis, and mapping of the mouse Nedd4 gene. // Genomics. 1997. V.40. № 3. P.435-443.

51. Staub O., Dho S., Henry P., Correa J., Ishikawa T. WW domains of Nedd4 bind to the proline-rich PY motifs in the epithelial Na+ channel deleted in Liddle's syndrome. // EMBO J. 1996. V.15. № 10. P.2371-2380.

52. Harvey K., Kumar S. Nedd4-like proteins: an emerging family of ubiquitin-protein ligases implicated in diverse cellular functions. // Trends Cell Biol. 1999. V.9. № 5. P. 166-169.

53. Rotin D., Staub O., Haguenauer-Tsapis R. Ubiquitination and endocvtosis of plasma membrane proteins: Role of Nedd4/Rsp5 family of ubiquitin-protein ligases. // J. Membr. Biol. 2000. V.176. № 1. P. 1-17.

54. Artavanis-Tsakonas S., Rand M., Lake R. Notch signaling: cell fate control and signal integration in development. // Science. 1999. V.284. № 5415. P.770-776.

55. Qiu L., Joazeiro C., Fang N., Wang H-Y., Elly C., Altaian Y„ Fang D., Hunter Т., Liu Y-C. Recognition and ubiquitination of Notch by Itch, a Hect-type E3 ubiquitin-ligase. // J.Biol.Chem. 2000. V.275. № 46. P.35734-35737.

56. Zhu H., Kavsak P., Abdollah S., Wrana J., Thomsen G. A SMAD ubiquitin ligase targets the BMP pathway and affects embryonic pattern formation. //Nature. 1999. V.400. № 6745. P.687-693.

57. Kavsak P., Rasmussen R., Causing C., Bonni S., Zhu H., Thomsen G., Wrana J. Smad7 binds to Smurf2 to form an E3 ubiquitin ligase that targets the TGFp receptor for degradation. // MoI.Cell. 2000. V.6. № 6. P.1365-1375.

58. Ikeda M., Ikeda A., Longan L., Longnecker R. The Epstein-Barr virus membrane protein 2A PY motif recruits WW domain-containing ubiquitin-protein ligases. // Virology. V.268. № I. P. 178-191.

59. Nishizuka Y. The molecular heterogeneity of protein kinase С and its implication for cellular regulation. //Nature. 1988. V.334. № 6184. P.661-665.

60. Clark J., Lin L., Kriz R., Ramesha C., Sultzman L., Lin A., MilonaN., Knopf J. A novel arachidonic acid-selective cytosolic PLA2 contains a Ca2+-dependent translocation domain with homology to PKC and GAP.//Cell. 1991. V.65.№ 6. P. 1043-1051.

61. Trahey M., Wong G., Halenbeck R., Rubinfeld В., Martin G., Ladner M., Long C., Crosier W., Watt K., Koths K., McCormick F. Molecular cloning of two types of GAP complementary DNAm from human placenta. // Science. 1988. V.242. № 4886. P. 1697-1700.

62. Rhee S., Suh P., Ryu S., Lee S. Studies of inositol phospholipid-specific phospholipase C. // Science. 1989. V.244. № 4904. P.546-550.

63. Sutton R., Davletov В., Berghuis A., Sudhof Т., Sprang S. Structure of the first C2 domain of synaptotagmin I: a novel Ca27phosphoIipid-binding fold. // Cell. 1995. V.80. № 6. P.929-938.

64. Essen L., Perisic O., Cheung R., Katan M., Williams R. Crystal structure of a mammalian phosphoinositide-specific phospholipase С delta. // Nature. 1996. V.380. № 6575. P.595-602.

65. Grobler J., Essen L., Williams R., Hurley J. C2 domain conformational changes in phospholipase C-delta 1. // Nat Struct. Biol. 1996. V.3. № 9. P.788-795.

66. Perisic O., Fong S., Lynch D., Bycroft M., Williams R. Crystal structure of a calciumphospholipid binding domain from cytosolic phospholipase A2. // J.Biol.Chem. 1998. V.273. № 3. P.1596-1604.

67. Essen L., Perisic O., Lynch D., Katan M., Williams R. A ternary metal binding site in the C2 domain of phosphoinositide-specific phospholipase C-delta 1. // Biochemistry. 1997. V.36. № 10. P.2753-2762.

68. Ubach J., Zhang X., Shao X., Sudhof Т., Rizo J. Ca2+ binding to synaptotagmin: how many Ca2+ ions bind to the tip of a C2-domain? // EMBO J. 1998. V.17. № 14. P.3921-3930.

69. Rizo J., Siidhof T. C2-domain, structure and function of a universal Ca2+-binding domain. // J.Biol.Chem. 1998. V.273. № 26. P.15879-15882.

70. Plant P., Lafont F., Lecat S., Verkade P., Simons K., Rotin D. Apical membrane targeting of Nedd4 is mediated by an association of its C2 domain with annexin XIHb. // J. Cell Biol. 2000. V.149. № 7. P.1473-1483.

71. Plant P., Yeger H., Staub O., Howard P., Rotin D. The C2 domain of the ubiquitin protein ligase Nedd4 mediates Ca2+-dependent plasma membrane localization. // J. Biol. Chem. 1997. V.272. № 51. P.32329-32336.

72. Simons K., Ikonen E. Functional rafts in cell membranes. // Nature. 1997. V.387. № 6633. P.569-572.

73. Brown D., London E. Functions of lipid rafts in biological membranes. // Annu.Rev.Cell Dev. Biol. 1998. V.14. P.l 11-136.

74. Snyder P., Olson D., McDonald F., Bucher D. Multiple WW domains, but not the C2 domain, are required for inhibition of the epithelial Na+ channel by human Nedd4. // J.Biol.Chem. 2001. V.276. № 30. P.28321-28326.

75. Harvey K., Harvey N., Michael J., Parasivam G., Waterhouse N., Alnemri E., Watter D., Kumar

76. S. Caspase-mediated cleavage of the ubiquitin-ligase Nedd4 during apoptosis. // J. Biol. Chem.1998. V.273. № 22. P.13524-13530.

77. Morrione A., Plant P., Valentinis В., Staub O., Kumar S., Rotin D., Baserga R. mGrblO interacts withNedd4. //J. Biol. Chem. 1999. V.274. № 34. P.24094-24099.

78. Peruzzi F., Prisco M., Morrione A., Valentinis В., Bascrga R. Anti-apoptotic signaling of the insulin-like growth factor-I receptor through mitochondrial translocation of c-Raf and Nedd4. // J.Biol.Chem. 2001. V.276. № 28. P.25990-25996.

79. Bork P., Subol M. The WW domain: a signalling site in distrophin? // Trends Biochem. Sci. 1994. V.l9. № 12. P.531-533.

80. Hofmann K., Bucher P. The rsp5-domain is shared by proteins of diverse functions. // FEBS Lett. 1995. V.358. № 2. P.153-157.

81. Andre В., Springael J. WWP, a new amino acid motif present in single or multiple copies in various proteins including dystrophin and the SH3-binding Yes-associated protein YAP65. // Biochem.Biophys.Res.Commun. 1994. V.205. № 2. P.1201-1205.

82. Macias M., Hyvonen M., Baraldi E., Schultz J., Subol M., Saraste M., Oschkinat H. Structure of the WW domain of a kinase-associated protein complexed with a proline-rich peptide. // Nature. 1996. V.382. № 6592. P.646-649.

83. Kanelis V., Farrow N., Kay L., Rotin D., Forman-Kay J. NMR studies of tandem WW domains of Nedd4 in coplex with a PY motif-containing region of the epithelial sodium channel. // Biochem. Cell Biol. 1998. V.76. № 2. P.341-350.

84. Macias M. Gervais V., Civera C., Oschkinat H. Structural analysis of WW domains and design of a WW prototype. // Nature Struct. Biol. 2000. V.7. №5. P.375-379

85. Staub O., Rotin D. WW domains. // Structure. 1996. V.4. № 5. P.495-499.

86. Ranganathan R:, Lu P., Hunter Т., Noel J. Structiral and functional analysis of the mitotic rotamase Pinl suggests substrate recognition is phosphorylation dependent. // Cell. 1997. V.89. № 6. P.875-886.

87. Cahir McFarland E. and Thomas M.// J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P. 103-107.

88. Sudol M. Structure and function of the WW domain. // Prog. Biophvs. Molec. Biol. 1996. V.65. №'/2. P. 113-132.

89. Chen H., Sudol M. The WW domain of Yes-associated protein binds a proline-rich ligand that differs from the consensus established for Src homalogy 3-binding modules. // Proc.Natl.Acad.Sci. USA. 1995. V.92. № 17. P.7819-7823.

90. Farr Т., Coddrington-Lawson S., Snyder P., McDonald F. Human Nedd4 interacts with the human epithelial Na+ channel: WW3 but not WWI binds to Na+ channel subunits. // Biochem. J. 2000. V.345. № 3. P.503-509.

91. Kumar S., Tomooka Y., Noda M. Identification of a set of genes with developmentally down-regulated expression in the mouse brain. // Biochem.Biophys.Res.Commun. 1992. V.185. № 3. P.1155-1161.

92. Asher C., Chigaev A., Garty H. Characterization of interactions between Nedd4 and betta and gamma ENaC using surface plasmon resonance. // Biochem.Biophys.Res.Commun. 2001. V.286. № 5.P.1228-1231.

93. Kanelis V., Rotin D., Forman-Kay J. Solution structure of a Nedd4 WW domain-ENaC peptide complex. //Nat. Struct. Biol. 2001. V.8.№5. P.407-412.

94. Sudol M., Hunter T. NeW Wrinkles for an old domain. // Cell. 2000. V.103. P.l 001-1004.

95. Lu P., Zhou X., Shen M:, Lu K. Function of WW domains as phosphoserine- or phosphothreonine-binding modules. // Science. 1999. V.283. № 5406. P.l325-1328.

96. Lu P., Zhou X. Liou Y.? Noel J., Lu K. Critical role of WW domain phosphorylation in regulating phosphoserine binding activity and Pinl function. // J. Biol.Chem. 2002. V.277. № 4. P.23 81-2384.

97. Sudol M., Chen H., Bougeret C., Einbond A., Bork P. Characterization of a novel protein-binding module-the WW domain. //FEBS Lett. 1995. V.369. № 1. P.67-71.

98. ShcherbikN., Kumar S., Haines D. Substrate proteolysis is inhibited by dominant-negative Nedd4 and Rsp5 mutants harboring alterations in WW domain 1. // J. Cell Sci. 2002. V.l 15. № 5. P. 1041-1048.

99. Jolliffe С., Harvey К., Haines В., Parasivam G., Kumar S. Identification of multiple proteins expressed in murine embryos as binding partners for the WW domains of the ubiquitin-protein Iigase Nedd4. // Biochem. J. 2000. V.351. № 3. P.557-565.

100. Staub O., Gautschi I., Ishikawa Т., Breitschopf К., Ciechanover A. Regulation of stability and function of the epithelial Na+ channel (ENaC) by ubiquitination. // EMBO J. 1997. V.16. № 21. P.6325-6336.

101. Abriel H., Loffing J., Rebhun J., Pratt J., Schild L., Horisberger J., Rotin D„ Staub O. Defective regulation of the Na+ channel by Nedd4 in Liddle's syndrome. // J. Clin. Invest. 1999. V.103. № 5. P.667-673.

102. Dinudom A., Harvey K., Komwatana P., Young J., Kumar S., Cook D. Nedd4 mediates control of an epithelial Na+ channel in salivary duct cells by cytosolic Na+. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.1998. V.95. № 12. P.7169-7173.

103. Goulet C., Yolk K., Adams C., Prince L., Stokes J., Snyder P. Inhibition of the epithelial Na+ channel by interaction with PY motif deleted in Liddle's syndrome. // J.Biol. Chem. 1998. V.273. № 45. P.30012-30017.

104. Snyder P. Liddle's syndrome mutations disrupt с AMP-mediated translocation of the epithelial Na+ channel to the cell surface. // J. Clin. Invest. 2000. V.105. № 1. P 45-53.

105. Kellenberger S., Gautschi I., Rossier В., Schild L. Mutations causing Liddle syndrome reduce sodium-dependent downregulation of the epithelial sodium channel in the Xenopus oocytes expression system. // J. Clin. Invest. 1998. V.101. № 12. P.2741-2750.

106. Hubner M., Schreiber R., Boucherot A., Sanchez-Perez A., Poronnik P., Cook D., Kunzelmann K. Feedback inhibition of epithelial Na+ channels in Xenopus oocytes does not require G(0) or G(i2) proteins. // FEBS Lett. 1999. V.459. № 3. P.443-447.

107. Awayda M. Regulation of the epithelial Na+ channel by intracellular Na(+). // Am. J. Physiol.1999. V.277. № 2-1. P.C216-C224.

108. Abriel H., Horisberger J. Feedback inhibition of rat amiloride-sensitive epithelial sodiumchannels expressed in Xenopus laevis oocytes. // J. Physiol. 1999. V.516. № 1. P.31-43.

109. Murillas R., Simms K., Hatakeyama S., Weissman A., Kuehn M. Identification of developmentally expressed proteins that functionally interact with Nedd4 ubiquitin Iigase. // J. Biol. Chem. 2002. V.277. № 4. P.2897-2907.

110. Hamilton M., Tcherepanova I., Huibregtse J., McDonnell D. Nuclear import/export of hRPFl/Nedd4 regulates the ubiquitin-dependent degradation of its nuclear substrates. // J. Biol. Chem. 2001. V.276. № 28. P.26324-26331.

111. Pham N., Cheglakov I., Koch C., deHoog C., Moran M., Rotin D. The guanine nucleotide exchange factor CNrasGEF activates ras in response to cAMP and cGMP. // Curr.Biol. 2000. V.10. № 15. P.555-558.

112. Harvey K., Shearwin-Whyatt L., Fotia A., Parton R., Kumar S. N4WBP5, a potential target for ubiquitination by the Nedd4 family of proteins, is a novel Golgi-associated protein. // J.Biol.Chem. 2002. V.277. № 11. P. 9307-9317.

113. Bar-Sagi D., Hall A. Ras and Rho GTPases: family reunion. // Cell. 2000. V.103. № 2. P.227-238.

114. Ayllon V„ Rebollo A. Ras-induced cellular events. // MoI.Membr.Biol. 2000. V.17. № 2. P.65-73.

115. Pham N., Rotin D. Nedd4 regulates ubiquitination and stability of the guanine-nucleotide exchange factor CNrasGEF. // J.Biol.Chem. 2001. V.276. № 50. P.46995-47003.

116. Hummler E., Horisberger J. Genetic disorders of membrane transport. The epithelial sodium channel and its implication in human diseases. // Am.J. Physiol. 1999. V.276. № 3-1. P.G567-G571.

117. Matalon S., O'Brodovich H. Sodium channels in alveolar epithelial cells: molecular characterization, biophysical properties, and physiological significance. // Annu.Rev.Phvsiol. 1999. V.61. P.627-661.

118. Shi H., Asher C., Chigaev A., Yung Y., Reuveny E. Seger R., Garty H. Interaction of beta and gamma ENaC with Nedd4 can be facilitated by an ERK-mediated phosphorylation. // J.Biol.Chem. 2002. V.277. № 16. P.l3539-13547.

119. Malik В., Schlanger L., Al-Khalili О., Bao H., Yue G., Price S., Mitch W., Eaton D. Enac degradation in A6 cells by the ubiquitin-proteosome proteolytic pathway. // J.Biol.Chem. 2001. V.276. № 16. P. 12903-12910.

120. Springael J., Andre B. Nitrogen-regulated ubiquitination of the Gapl permease of Saccharomyces cerevisiae. // Mol.Cell Biol. 1998. V.9. № 6. P.1253-1263.

121. Springael J., Galan J., Haguenauer-Tsapis R., Andre B. NH4+ -induced down-regulation of the Saccharomyces cerevisiae Gaplp permease involves its ubiquitination with lysine-63-linked chains. // J.Cell Sci. 1999. V.l 12. № pt9. P.1375-1383.

122. Grenson M. Molecular Aspects of Transport Proteins. // D. Pont: Elsevier Science Publishers. ш 1992. P.219-245.

123. Beck Т., Schmidt A., Hall M. Starvation induces vacuolar targeting and degradation of the tryptophan permease in yeast. //J.Cell Biol. 1999. V.146. № 6. P.1227-1238.

124. Lucero P., Lagunas R. Catabolite inactivation of the yeast maltose transporter requires ubiquitin-ligase npil/rsp5 andubiquitin-hydrolase npi2/doa4. // FEMS MicrobioI.Lett. 1997. V.I47. № 2. P.273-277.

125. Riballo E., Herweijer M., Wolf D., Lagunas R. Catabolite inactivation of the yeast maltose transporter occurs in the vacuole after internalization by endocytosis. // J.BacterioI. 1995. V.l77. № 19. P.5622-5627.

126. Medintz I., Jiang H., Han E., Cui W., Michels C. The role of ubiquitin conjugation in glucose-induced proteolysis of Saccharomyces maltose permease. // J.BacterioI. 1996. V.l 78. №51. P.2245-2254.

127. Medintz I., Jiang H., Michels C. The role of ubiquitin cojugation in glucose-induced proteolysis of Saccharomyces cerevisiae maltose permease. // J.Biol.Chem. 1998. V.273. № 51. P.34454-34462.

128. Galan J., Haguenauer-Tsapis R. Ubiquitin Lys63 is involved in ubiquitination of a yeast plasma membrane protein. // EMBO J. 1997. V.16. № 19. P.5847-5854.

129. Galan J., Moreau V., Andre В., Volland C., Haguenauer-Tsapis R. Ubiquitination mediated by the Npilp/Rsp5p ubiquitin-protein ligase is required for endocytosis of the yeast uracil permease. // J.Biol.Chem. 1996. V.271.№ 18. P. 10946-10952.

130. Volland С., Urban-Grimal D., Geraud G., Haguenauer-Tsapis R. Endocytosis and degradation of the yeast yracil permease under adverse conditions. //J.Biol.Chem. 1994. V.269. № 13. P.9833-9841.

131. Lai K., Bolognese C., Swift S., McGraw P. Regulation of inositol transport in Saccharomyces cerevisiae involves inositol-induced changes in permease stability and endocytic degradation in the vacuole. // J.Biol.Chem. 1995. V.270. № 6. P.2525-2534.

132. Matejckova-Forejtova A., Kinclova O., Sychrova H. Degradation of Candida albicans Canl permease expressed in Saccharomyces cerevisiae. IIFEMS Microbiol.Lett. 1999. V.l76. № 1. P.257- 262.

133. Hicke L., Riezman H. Ubiquitination of a yeast plasma membrane receptor signals its ligand-stimulated endocytosis. // Cell. 1996. V.84. № 2. P.277-287.

134. Terrell J., Shih S., Dunn R., Hicke L. A function for monoubiquitination in the internalization of a G protein-coupled receptor. // Mol. Cell. 1998. V.l. № 2. P. 193-202.

135. Davis N., Horecka J., Sprague J. Cis- and trans-acting functions required for endocytosis of the yeast pheromone receptors.//J.Cell Biol. 1993. V.l22. № 1. P.53-65.

136. Roth A., Davis N. Ubiquitination of the PEST-like endocytosis signal of the yeast a-factor receptor. // J.Biol.Chem. 2000. V.275. №11. P.8143-8153.

137. Roth A., Davis N. Ubiquitination of the yeast a-factor receptor. // J.Cell Biol. 1996. V.l 34. № 3. P.661-674.

138. Egner R., Kuchler K. The yeast multidrug transporter Pdr5 of the plasma membrane is ubiquitinated prior to endocytosis and degradation in the vacuole. // FEBS Lett. 1996. V.378. № 2. P.177-181.

139. Egner R., Mahe Y., Pandjaitan R., Kuchler K. Endocytosis and vacuolar degradation of the plasma membrane-localized Pdr5 ATP-binding cassette multidrug transporter in Saccharomyces cerevisiae. II MoI.Cell Biol. 1995. V.15. №11. P.5879-5887.

140. Horak J., Wolf D. Catabolite inactivation of the galactose transporter in the yeast Saccharomyces cerevisiae: ubiquitination, endocytosis, and degradation in the vacuole. // J. Bacterid. 1997. V.179. № 5. P.1541-1549.

141. Gitan R., Eide D. Zinc-regulated ubiquitin conjugation signals endocytosis of the yeast ZRT1 zinc transporter. // Biochem J. 2000. V.346. № 2. P.329-336.

142. Gitan R., Luo H., Rodgers J., Broderius M., Eide D. Zinc-induced inactivation of the yeast ZRT1 zinc transporter occurs through endocytosis and vacuolar degradation. // J.Biol.Chem. 1998. V.273. № 44. P.28617-28624.

143. Kolling R., Hollenberg C. The ABC-transporter Ste6 accumulates in the plasma membrane in a ubiquitinated form in endocytosis mutants. // EMBO J. 1994. V. 13. № 14. P.3261-3271.

144. Schandel K., Jenness D. Direct evidence for ligand-induced internalization of the yeast alpha-factor pheromone receptor. // Mol.Cell Biol. 1994. V.14. №11. P.7245-7255.

145. Horak J. Yeast nutrient transporters. // Biochem. Biophys. Acta. 1997. V.1331. № 1. P.41-79.

146. Huibregtse J., Yang J., Beaudenon S. The large subunut of RNA polymerase II is a substrate of Rsp5 ubiquitin-protein ligase. // Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 1997. V.94. № 8. P.3656-3661.

147. Perry W., Hustad C., Swing D., O'Sullivan Т., Jenkins N., Copeland N. The itchy locus encodes a novel ubiquitin protein ligase that is disrupted in a 18H mice. // Nat.Genet. 1998. V.l8. № 2. P.143-146.

148. Rape M., Hoppe Т., Gorr I., Kalocay M., Richly H., Jentsch S. Mobilization of processed, membrane-tethered SPT23 transcription factor by CDC48(UFD1/NPL4), a ubiquitin-selective chaperone. // Cell. 2001. V.107. № 5. P.667-677.

149. Zhang S., Skalsky Y., Garfinkel D. MGA2 and SPT23 is required for transcription of delta 9 fatty acid desaturese gene, OLE1, and nuclear membrane integrity in Saccharomyces cerevisiae. II Genetics. 1999. V.l51. № 2. P.473-483.

150. Stukey J., McDonough V., Martin C. Isolation and characterization of OLE 1, a gene affecting fatty acid desaturation from Saccharomyces cerevisiae. II J.Biol.Chem. 1989. V.264. № 28. P. 1653716544.

151. Hitchcock A., Krebber H., Frietze S., Lin A., Latterich M., Silver P. The conserved Npl4 protein complex mediates proteasome-dependent membrane-bound transcription factor activation. // Mol. Cell Biol. 2001. V.12. № 10. P.3226-3241.

152. Tansey W. Transcriptional regulation: RUPture in the ER. // Nature Cell Biol. 2000. V.2I № 10. P.E175-E177.

153. Alberts В., Bray D., Lewis J., Raff M., Roberts K. and Watson J.// Molecular Biology of the ^ Cell, second edition. 1989. Garland Publishing, New York-London.

154. Kasanov J., Pirozzi G., Uveges A., Kay B. Characterizing class 1 WW domains defines key specificity determinants and generates mutant domains with novel specificities. // Chem Biol. 2001. V.8. № 3. P.231-241.

155. Stukey J., McDonough V., Martin C. The OLE1 gene of Saccharomyces cerevisiae encodes the delta 9 fatty acid desaturase and can be functionally replaced by the rat stearoyl-CoA desaturase gene. //J.Biol.Chem. 1990. V.265.№ 33. P.20144-20149.

156. Pan Y., Haines D. Identification of a tumor-derived p53 mutant with novel transactivating selectivity. // Oncogene. 2000. V.19. № 27. P.3095-3100.r

157. Macias M., Gervais V., Civera C., Oschkinat H. Structural analysis of WW domains and design of WW prototype. //Nat. Struct.Biol. 2000. V.7. № 5. P.375-379.

158. McDonough V., Stukey J., Martin C. Specificity of unsaturated fatty acid-regulated expression of the Saccharomyces cerevisiae OLE1 gene. // J.Biol.Chem. 1992. V.267. № 9. P.5931-5936.

159. Клонирование ДНК. Методы. Под ред. Д. Гловера// Москва, изд. «Мир». 1989.

160. Black P., Faergeman N., DiRusso С. Long-chain acyl-CoA-dependent regulation of gene expression in bacteria, yeast and mammals. // J. Nutr. 2000. V. 130. № 2S. P. 305S-309S.

161. Zhang S., Burkett Т., Yamashita I., Garfinkel D. Genetic redundancy between SPT23 and MGA2: regulators of Ту-induced mutations and Tyl transcription in Saccharomyces cerevisiae. // Mol. Cell Biol. 1997. V.17. № 8. P.4718-4729.

162. Conaway R., Brower C., Conaway J.W. Emerging roles of ubiquitin in transcription regulation.// Science. 2002. V.296. № 5571. P.l254-1258.

163. Kaiser P., Flick K., Wittenberg C., Reed S. Regulation of transcription by ubiquitination without proteolysis: Cdc34/SCF(Met30)-mediated inactivation of the transcription factor Met4. // Cell. 2000. V.102. № 3. P.303-314.

164. Brizzio V., Khalfan W., Huddler D., Beh C., Andersen S., Latterich M., Rose M. Genetic interaction between KAR7/SEC71, KAR8/JEM1, KAR5 and KAR2 during nuclear fusion in Saccharomyces cerevisiae. //Mol. Biol. Cell. 1999. V. 10. P. 609-626.

165. DeHoratius S., Silver P. Nuclear transport defects and nuclear enxelope alterations are associated with mutation of the Saccharomyces cerevisiae NPL4 gene. // Mol.Biol.Cell. 1996. V.7. № 11/P. 1835-1855.

166. Braun S., Matuschewski K., Rape M., Thorns S., Jentsch S. Role of the ubiquitin-selective CDC48(UFD 1/NPL4) chaperone (segregase) in ERAD of OLE 1 and other substrates. // EMBO J. 2002. V.21.№ 4. P.615-621.

167. Bays N., Hampton R. Cdc48-Ufdl-Npl4: Stuck in the middle with Ub. // Current Biology. 2002. V.12.*№ 10. P.R366-R371.

168. Fujimuro M„ Tanaka K., Yokosawa H., Toh-e A. Sonlp is a component of the 26S proteasome of the Saccharomyces cerevisiae. 11FEBS Lett. 1998. V.423. № 2. P.l 49-154.

169. Mannhaupt G., Schriall R., Karpov V., Vetter I., Feldmann H. Rpn4p acts as a transcription factor by binding to PACE, a nonamer box found upstream of 26S proteasomal and other genes in yeast. // FEBS Lett. 1999. V.450. № 1-2. P.27-34.

170. Xie Y., Varshavsky A. RPN4 is a ligand, substrate, and transcriptional regulator of the 26S proteasome: A negative feedback circuit. // Proc.Natl.Acad.Sci USA. 2001. V.98. № 6. P.3056-3061

171. Fleming J., Lightcap E., Sadis S., Thoroddsen V., Bulawa C., Blackman R. Complementary whole-genome technologies reveal the cellular response to proteasome inhibition by PS-341. // Proc.Natl.Acad.Sci USA. 2002. V.99. № 3. P.1461-1466.

172. Baldwin A.S., Jr.// Annu.Rev.Immunol. 1996. V. 14. P. 649-683.

173. Fan C, Maniatis T. Generation of p50 subunit of NF-kappa В by processing of pi 05 through an ATP-dependent pathway.//Nature. 1991. V. 354. P. 395-398.

174. Wang C., Deng L., Hong M., Akkaraju G., Inoue J., Chen Z. TAK1 is a ubiquitin-dependent kinase of MKK and IKK. //Nature. 2001. У.412. № 6844. P.346-351.

175. Chellappa R., Kandasamy P., Oh C., Jiang Y., Vemula M., Martin C. The membrane proteins, Spt23p and Mga2p, play distinct roles in the activation of Saccharomyces cerevisiae OLE1 gene expression. //J. Biol. Chem. 2001. V.276. № 47. P.43548-43556.

176. Schmitt M.E., Brown T.A., Trumpower B.L. A rapid and simple method for preparation of RNA from Saccharomyces cerevisiae. 1999 Nucleic Acid Research, 18, 3091-3092