Роль белковых факторов и РНК-белковых взаимодействий в импорте тРНК в митохондрии дрожжей

Брандина, Ирина Львовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль белковых факторов и РНК-белковых взаимодействий в импорте тРНК в митохондрии дрожжей
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Роль белковых факторов и РНК-белковых взаимодействий в импорте тРНК в митохондрии дрожжей"

На правах рукописи

БРАНДИНА Ирина Львовна

РОЛЬ БЕЛКОВЫХ ФАКТОРОВ И РНК-БЕЛКОВЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ В ИМПОРТЕ тРНК В МИТОХОНДРИИ ДРОЖЖЕЙ

03.00.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2005

Работа выполнена на кафедре молекулярной биологии Биологического факультета Московского Государственного Университета им. М.В.Ломоносова, г. Москва и в Институте Физиологии и Биохимии (Страсбург, Франция).

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

кандидат биологических наук, профессор

Крашенинников Игорь Александрович

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук, профессор

Добров Евгений Николаевич

доктор биологических наук профессор

Тер-Аванесян Михаил Давидович

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита состоится _2005 года в /С ч

на заседании Диссертационного Совета Д 501.001.76 при Московском Государственном Университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские Горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, ауд. 536.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова. Автореферат разослан £ G^c^Jï/^Lr 2005 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук

Н.О.Калинина

dMO&Jf

Тьзч^

Ц/7

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Митохондрии осуществляют широкий спектр функций, включая обеспечение клеток энергией за счет окислительного фосфорилирования Для митохондрий характерно наличие собственной ДНК и системы биосинтеза белка, однако большое число макромолекул импортируется в органеллы из цитоплазмы. Было показано, что в ряде случаев в митохондрии транспортируются не только белки, но также и тРНК. К настоящему времени импорт тРНК в митохондрии был обнаружен у простейших, у почкующихся дрожжей Saccharomyces cerevisiae, ряда растений и сумчатых млекопитающих Механизм переноса тРНК в митохондрии и его специфичность значительно отличается от вида к виду

В случае дрожжей S cerevisiae было показано, что из цитоплазмы в митохондрии импортируется два вида тРНК - тРНК^сии (Martin et al, 1979) и тРНК01" (Reinehardt et al, 2005) Импорт тРНК является высокоспецифичным процессом, так как одна из двух изоакцепторных лизиновых тРНК (тРНК^сии) направляется в митохондрии дрожжей, в то время как вторая (тРНК^иии) присутствует только в цитоплазме. Такое различие в локализации довольно близких тРНК может быть объяснено отличиями в структуре этих тРНК (Entelis et al, 1998). Следующий уровень селекции может быть опосредован белками, взаимодействующими с тРНК Ранее в нашей лаборатории было показано, что для импорта тРНК1узСии должна быть аминоацилирована с помощью цитоплазматической лизил-тРНК-синтетазы, затем необходимо ее взаимодействие с предшественником митохондриальной лизил-тРНК-синтетазы (Tarassov, Entelis et al 1995) Однако присутствия аминоацилированной импортируемой тРНК^сии и pre-Msk1p не достаточно для импорта этой тРНК в митохондрии, что говорит о необходимости дополнительных белковых факторов, направляющих ее импорт.

Данная работа была направлена на обнаружение белков, участвующих в импорте тРНК в митохондрии дрожжей и изучение их роли в этом процессе.

Во время выполнения данной работы в нашей лаборатории были получены данные, указывающие на участие гликолитического фермента - енолазы - в импорте тРНК (Н.Энтелис, неопубликованные данные). В данной работе была детально изучена роль енолазы в импорте тРНК в митохондрии дрожжей, охарактеризована митохондриальная локализация енолазы, а также других ферментов гликолиза Полученные данные расширяют представления об альтернативных функциях ферментов гликолиза и взаимодействии клеточных компартментов При выполнении данной работы были получены указания на роль убикивитин-протеасомной системы в импорте тРНК в митохондрии, что представляет собой новый пример разнообразия функций убиквитина в клетке

РОС. НАЦИОНАЛЬНА* I БИБЛИОТЕКА

Изучение механизма импорта тРНК в митохондрии представляет особый интерес не только как одна из актуальных проблем современной биологии, но имеет и прикладное значение Ряд наследственных болезней человека связан с мутациями в митохондриальных тРНК, приводящими к нарушениям функционирования органелл Показано, что импортируемая тРНК способна компенсировать нарушения митохондриальной трансляции в клетках человека (Ко1е5П||«л/а е1 а1, 2004) Понимание молекулярного механизма импорта тРНК необходимо для увеличения эффективности импорта ТРК1 в митохондрии человека

Цель и задачи исследования

Целью данной работы было исследование роли белковых факторов и РНК-белковых взаимодействий в импорте тРНК в митохондрии дрожжей

Для этого в ходе исследования предполагалось выполнить следующие задачи

1 Идентифицировать белковые факторы, потенциально участвующие в импорте тРНК в митохондрии дрожжей (так называемые факторы импорта) с использованием дву- и тригибридной систем в дрожжах

2 Изучить влияние выявленных факторов на импорт тРНК в митохондрии дрожжей.

3 Исследовать роль гликолитического фермента - енолазы дрожжей - в импорте тРНК.

4 Охарактеризовать митохондриальную локализацию енолазы в клетках дрожжей и идентифицировать митохондриальные белки, взаимодействующие с енолазой

Научная новизна и практическая ценность работы

В данной работе тригибридная система впервые использована для поиска белков, взаимодействующих с тРНК С использованием полногеномных скринингов идентифицированы белки, потенциально участвующие в импорте тРНК в митохондрии Впервые показано участие убиквитин-протеасомной системы в импорте тРНК в митохондрии Обнаружена митохондриальная локализация гликолитических ферментов В настоящей работе впервые доказана роль енолазы в импорте тРНК и описан состав макромолекулярных митохондриальных комплексов, включающих енолазу

Полученные результаты позволяют приблизиться к пониманию механизмов импорта тРНК в митохондрии дрожжей, что будет использоваться для оптимизации системы искусственного импорта тРНК в митохондрии человека для лечения ряда заболеваний, вызываемых точечными мутациями в митохондриальной ДНК

Апробация работы

Диссертация была апробирована на заседании кафедры молекулярной биологии Московского государственного университета им М.В.Ломоносова Материалы исследований, представленных в работе, докладывались или были представлены в виде стендовых сообщений на следующих международных конференциях- конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, Россия в 2005, 2002 и 2001 годах), на III и IV мировом конгрессах международной организации «Протеом Человека» (Пекин, Китай, 2004 г и Мюнхен, Германия, 2005 г), на XX научной конференции «тРНК» (Банц, Германия, 2003 г).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из глав. «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы исследования», «Результаты и их обсуждение» Работа завершается выводами и списком цитируемой литературы (271 ссылка). Работу иллюстрируют 53 рисунка, 10 таблиц и 3 приложения Общий объем диссертации 198 страниц

Основное содержание работы

Для дрожжей Saccharomyces cerevisiae было показано, что в митохондрии импортируется одна из двух цитоплазматических лизиновых тРНК - тРНК^'сии (далее ТРК1), тогда как вторая тРНК^иии (далее ТРК2) присутствует исключительно в цитоплазме При этом митохондрии содержат закодированную в митохондриальной ДНК tPHKLvVuu (далее ТРКЗ), которая способна узнавать оба лизиновых кодона В связи с этим, роль ТРК1 в митохондриях до сих пор остаётся загадкой, хотя есть экспериментальные данные, указывающие на то, что импортируемая тРНК способна участвовать в митохондриальной трансляции (Kolesnikova et al., 2000) Импорт тРНК в митохондрии происходит при участии минимум двух белков - цитоплазматической лизил-тРНК-синтетазы, аминоацилирующей ТРК1, и предшественника митохондриальной лизил-тРНК-синтетазы (далее pre-MSK1p) Присутствие этих двух белков необходимо, но не достаточно для импорта ТРК1 в изолированные митохондрии, значит существуют еще и другие белки, участвующие в импорте ТРК1

В данной работе проводился поиск белков, участвующих в импорте ТРК1 в митохондрии дрожжей, так называемых факторов импорта, и анализ их роли в импорте ТРК1. Стратегия поиска этих факторов основывалась на предположении, что они взаимодействуют либо с ТРК1, либо с ее переносчиком в митохондрии -pre-MSK1p Идентификация белков, связывающихся с pre-MSK1p, производилась

с применением двугибридной системы Белки, взаимодействующие с ТРК1, были обнаружены с помощью тригибридной системы

Поиск белков, взаимодействующих с рге-Мэк1р в двугибридной системе.

На первом этапе работы с помощью двугибридной системы в дрожжах мы осуществили поиск в библиотеке последовательностей «ДНК 5 cerevlsiae открытых рамок считывания (ОРС), продукты трансляции которых взаимодействуют с рге-Мэк1 В качестве белка-приманки использовали полноразмерный белок рге-МэкЧр или только его (Ч-концевой домен (1-258 а о) Последний был выбран в связи с тем, что ранее в нашей лаборатории было показано, что этот РНК-связывающий домен способен направлять импорт ТРК1 в изолированные митохондрии дрожжей В результате были идентифицированы пять белков, взаимодействовавших с рге-Мзк1р Р|11р, Мэк1р, 1_зЬ4р, Огв1, Ярп13р, и четыре - с 1М-концевым доменом рге-МэИр А1г1р, Ооа1р, Мйт1р, Беп1р Присутствие Мэк1р среди идентифицированных белков было ожидаемым, так как известно, что рге-МвИр функционирует в виде димера Роль остальных белков, идентифицированных при помощи двугибридной системы, в импорте тРНК анализировалась в дальнейших экспериментах

Поиск белков, взаимодействующих с импортируемой тРНК.

На следующем этапе мы осуществили поиск белков, с которыми взаимодействовала импортируемая лизиновая тРНК (ТРК1), с использованием тригибридной системы в дрожжах В результате скрининга библиотеки кДНК обнаружено 404 клона, содержащих ОРС, продукты трансляции которых взаимодействуют с ТРК1 в составе гибридной РНК. Для того чтобы исключить из рассмотрения белки, неспецифически взаимодействующие с РНК, проводили анализ взаимодействия найденных белков с РНК фага МЭ2 без гена ТРК1 Поскольку нельзя однозначно утверждать того, что белки, участвующие в импорте тРНК, взаимодействуют только с ТРК1, мы не исключали из рассмотрения белки, взаимодействующие как с ТРК1, так и с ТРК2 (неимпортируемой лизиновой тРНК) В результате было идентифицировано 2 белка, специфически взаимодействующих с ТРК1 (1_еи9р, Рпс1р)' 12 белков, связывающихся с ТРК1 и с ТРК2, и 14 белков - с ТРК1 и с РНК фага МБ2

Для дальнейшего функционального анализа были выбраны белки, представляющие собой интерес как потенциальные факторы импорта (табл 1)

Таблица 1. Потенциальные факторы импорта ТРК1 в митохондрии.

Название ОРС Приманка, юпользованная > скрининге, где обнаружена данная ОРС РНК, взаимод с ОРС в тригибрид ной системе Описание белка (в соответствии с базой данных ввО) Среда, на которой рост штамма с делецией гена замедлен

ALR1 N-Msk1p ТРК1, MS21 переносчик Мд(2+) через плазматическую мембрану _ 2

DOA1 N- Msklp ТРК1, TPK2.MS2 1 Убиквитин-зависимая деградация белков Глицерин37° С

DRS1 pre-Msk1 р, ТРК1, MS21 предполагаемая АТФ-зависимая РНК-хеликаза, участвующая в созревании бОБ рибосомальной субчастицы j

LEU9 ТРК1 а-изопропилмалат синтаза И, катализирует первую реакцию биосинтеза лейцина этанол 30°С, лактат 25°С

МТН1 N- Msklp ни одна из проверенн ых РНК Регулятор транскрипции в присутствии глюкозы _ j

PIL1 pre-Msk1p не определенс Ингибитор протеин-киназ РИк1р и РИк2р .3

PNC1 TPK1, pre-Msk1p Никотинамидаза _ 3

RPN13 pre-Msk1p ТРК1, ТРК2 Субъединица регуляторной частицы 19в протеасомы Глицерин 25°С галактоза 30°С

RPN8 pre-Msk1p, TPK1, TPK2 Субъединица регуляторной частицы 19Б протеасомы _2

SEN1 N- Msklp ТРК1, MS21 РНК-хеликаза, участвующая в процессинге тРНК, рРНК, мяРНК

N- Msklp - N-концевой домен pre- Msklp

1 - РНК фага MS2, без тРНК в составе гибридной РНК

2 - делеция гена летальна

3 - изменение фенотипа не обнаружено

Функциональный анализ роли потенциальных факторов импорта

Следующим шагом к пониманию роли потенциальных факторов импорта тРНК являлся функциональный анализ штаммов дрожжей, в которых

интересующие нас гены делетированы, кроме случаев, где делеция гена является летальной - ALR1, DRS1, RPN8 и SEN1 Данные штаммы были получены нами от компании «Euroscarf» (Франкфурт, Германия) Сначала мы проанализировали уровень дыхательной активности митохондрий путем анализа роста штаммов с делециями интересующих нас генов на средах с разными источниками углерода Известно, что если функции митохондрий нарушены, наблюдается нарушение роста штамма на средах с несбраживаемыми источниками углерода Это и было обнаружено для штаммов с делециями генов DOA1, LEU9 и RPN13 (Табл 1) Однако следует заметить, что отсутствие фенотипа еще не говорит о том, что данные белки не играют роли в импорте тРНК Роль импортируемой тРНК неизвестна и возможно, она является факультативной, то есть иметь значение для клетки при определенных условиях жизни, например, при стрессовых условиях

Далее мы проверили, связано ли нарушение дыхания митохондрий с нарушениями импорта тРНК Для этого было использовано два различных, но дополняющих друг друга подхода Первый включает в себя анализ количества ТРК1 в митохондриях, выделенных из штаммов с делециями генов-кандидатов, с использованием гибридизации по Нозерну Отсутствие загрязнения препарата митохондриальных тРНК цитоплазматическими тРНК проверяли путём гибридизации с олигонуклеотидом, комплементарным к ТРК2 Эффективность импорта ТРК1 определяли как соотношение сигнала при гибридизации с зондом, комплементарным к ТРК1 и сигналов при гибридизации с другими зондами, специфичными к митохондриальным тРНК, например, к ТРКЗ Второй подход состоит в реконструкции реакции импорта m vitro Для этого к изолированным митохондриям прибавляли радиоактивно-меченую ТРК1 в присутствии экстракта общеклеточных растворимых белков, направляющих импорт, или ЮР (от англ Impôt Directing Protein). Так можно определить, способны ли митохондрии, изолированные из штаммов с делециями кандидатов, импортировать тРНК, и могут ли общеклеточные растворимые белки, выделенные из этих же штаммов, направлять импорт тРНК in vitro (Табл 2).

Результаты, полученные гибридизацией по Нозерну и при импорте m vitro, кореллируют для большинства проанализированных штаммов Исключением из этого ряда являются штаммы с делециями генов DOA1 и RPN13, кодирующие белки, относящиеся к убиквитин-протеасомной системе. Табл. 2. Результаты импорта pre-Msk1p и ТРК1 в митохондрии штаммов с

делециями генов-кандидатов.

импорт относительно штамма дикого типа Amt hi Apil1 Aleu9 Apnci Arpnl 3 Adoal

pre-Msk1 р m vitro pre-Msk1 р/ Msklp 09 09 1 5 09 2.1 1,5

ТРК1 /л vitro 1.3 5.6 3.4 2 1.9 зависит

ЮР же 30°С 25°С 30°С 25°С от

указанных Gal Gly лактат Gal Gly темп.

штаммов роста

/л VIVO 0,9 2,4 1,8 1,9 20 3

ТРК1/ТРКЗ 30°С 30°С 25°С 25°С 25°С 30°С

Gly Gal лактат Gly Gly ва!

Роль убиквитин-протеасомной системы в импорте тРНК.

Убиквитин-протеасомная система (УПС) эукариот осуществляет деградацию полиубиквитинилированных субстратов, связанных с убиквитином либо через аминогруппу одного из лизинов субстрата (тогда убиквитин-протеинлигаза связана с 1Ч-концом субстрата, "М-концевое правило"), либо через М-концевую аминогруппу субстрата (11Р0 система) В итоге оба типа субстратов направляются для деградации в протеасому 26Б Среди потенциальных факторов импорта присутствовали три белка, относящихся к убиквитин-зависимой протеасомной системе деградации белков Ррп8, Ирп13 и Ооа1. Это позволило нам предположить существование взаимосвязи между УПС и импортом ТРК1.

А. Анализ штаммов дрожжей с делениями или мутациями генов УПС.

Ярп8 и Ррп13 являются неАТФазными субъединицами 19Б регуляторной частицы протеасомы. Ирп8 - эндопелтидаза, участвующая в регуляции ядерной и цитоплазмзтической протеасомной деградации белков Функция Ярп13 в настоящий момент неизвестна (\/еппа е1 а1, 2000) Фрагмент ОРС, кодирующий Ррп13р, был идентифицирован в скрининге с рге-МэМр в двугибридной системе, а Крп8р - с ТРК1 и ТРК2 в тригибридной После тестирования полноразмерных белков было обнаружено, что оба белка связывались с рте-МэИ р, с ТРК1, с ТРК2, и слабее с РНК фага МЭ2.

На следующем этапе изучения роли этих белков в импорте тРНК мы провели анализ штамма с делецией ИРЫ13, так как делеция ЯРЫ8 является летальной Мы показали, что штамм грп13 (здесь и далее штаммы с делециями генов обозначены курсивом) обладает замедленным ростом на среде с глицерином при 25°С и с галактозой при 30°С При анализе уровня импорта ТРК1 в штамме грп13 мы наблюдали увеличение импорта тРНК (табл.2). При импорте тРНК в митохондрии, изолированные из штамма грп13 с использованием общеклеточных белков того же штамма, мы также наблюдали повышенный импорт, что может указывать на негативную роль Ррп13 в импорте ТРК1

Следующим кандидатом на роль фактора импорта, относящимся к УПС, являлся Ооа1р, связывавшийся с Ы-концевым фрагментом рге-МэМр в двугибридной системе и со всеми тестированными РНК в тригибридной системе Роа1 - один из компонентов иРО-пути. Функция этого белка остаётся до конца невыясненной. В штамме с делецией 00А1 деградация иРй-субстратов

существенно замедлена, уровень свободного убиквитина снижен и было показано, что данный фенотип восстанавливался экспрессией дополнительных копий полиубиквитина Ubi4 (Johnson et al, 1995) В связи с этим, мы решили проверить эффективность импорта тРНК в штамме doal и в сконструированном нами штамме с повышенной экспрессией убиквитина - штамме Udo (от Ubi4 и AdoaP Штамм doal характеризовался замедленным ростом на среде, содержащей глицерин при 37°С, в то время как штамм Udo нормально рос в тех же условиях. При анализе импорта ТРК1 было замечено, что дрожжи штамма doal характеризовались повышенными значениями импорта ТРК1 в -3 раза по сравнению со штаммом дикого типа Экспрессия убиквитина в клетках Udo привела к снижению эффективности импорта ТРК1 до исходного уровня дикого типа Этот результат позволяет предположить существование взаимосвязи импорта ТРК1 с UFD-системой деградации Мы предполагаем два возможных механизма регуляции импорта ТРК1 при участии УПС Первым может являться деградация репрессоров импорта тРНК с участием UFD-системы Вторым может быть более косвенный эффект,являющийся следствием уменьшения уровня свободного убиквитина в штамме doal Известно, что УПС играет роль в митохондриальной локализации ряда белков (Zhuang et al, 1988, 1992), (Zoladek et al, 1997), возможно, в штамме doal уменьшение уровня свободного убиквитина в клетке приводит к увеличению моноубиквитинилирования белков (в противоположность полиубиквитинилированию), что приводит к изменению функции и/или локализации митохондриальных белков, и как следствие, к увеличению импорта тРНК.

Б. Влияние ингибирования протеолитической функции протеасомы 26S на эффективность импорта ТРК1 в митохондрии дрожжей

Для понимания роли УПС в импорте тРНК, далее мы анализировали эффект частичного ингибирования протеолитической функции протеасомы 26S на импорт ТРК1 Для этого мы использовали штаммы дрожжей, содержащих мутации в генах, кодирующих две каталитических ß-субчастицы протеасомы - ß4 (PRE1) или ß5 (PRE2), обладающих эндопептидазной активностью - расщепление по С-концу после нейтральных/гидрофобных аминокислот (Groll et al, 1999) Мы провели анализ митохондриальной активности в данных штаммах и обнаружили, что штаммы рге1-1 и штамм с двойной мутацией рге1-1/рге2-2, обладающие 5,5% и 4% протеолитической активности протеасомы относительно штамма дикого типа, практически не растут при 37°С То есть клетки, обладающие пониженной активностью протеасомы, хуже адаптируются к тепловому шоку и обладают также пониженной активностью митохондрий Чтобы проверить, ассоциирован ли такого рода фенотип с изменением уровня импорта ТРК1, мы провели гибридизацию по Нозерну митохондриальных тРНК, выделенных из клеток данных штаммов, инкубированных в течение 24 ч при 25°С, а затем еще 12 ч при 37°С (Рис 1)

В результате было обнаружено, что штаммы с пониженной каталитической протеасомной активностью обладают пониженным импортом ТРК1 Снижение уровня импорта не так значительно, как протеасомной активности, но, тем не менее, корреляция очевидна, что указывает на возможную регуляцию импорта ТРК1 за счет расщепления фактора импорта при участии УПС.

Штаммы дрожжей рпе1-1 рпэ2-2 ргеМ/рге 2-2

ТРК1

Митох тРНК1-*"

ТРК2 г 'г*'- ■ *" \

Соотношение сигналов ТРК1/ Мотох тРНКи" 0,96 0,3 0,4 0,2

Рис. 1. Анализ состава митохондриальных тРНК, выделенных из штамма дикого типа (УУСС4) и штаммов с мутациями каталитических субъединиц лротеасомы. Радиоавтограф фильтра после гибридизации по Нозерну с олигонуклеотидами, специфичными к различным тРНК.

Другим подходом, использованным для изучения роли УПС в импорте, была искусственная временная остановка протеолитической функции протеасомы 26Б и анализ ее влияния на импорт ТРК1 в митохондрии. Мв132 является конкурентным субстратным ингибитором 20Б каталитической частицы протеасомы и деубиквитинилирующих ферментов, которые необходимы для удаления остатков убиквитина с субстратов перед их расщеплением протеасомой и для поддержания уровня свободного убиквитина в клетке. Для экспериментов с Мв132 мы использовали штамм егдб с повышенной проницаемостью мембран Мы анализировали уровень импорта ТРК1 методом гибридизации по Нозерну после 3 ч роста на среде с М6132 (Рис.2) Было обнаружено, что в штамме егдб обработка Мв132 приводит к снижению эффективности импорта ТРК1 на 25% относительно необработанных клеток Для того, чтобы убедиться, что уменьшение импорта ТРК1 в митохондрии связано с остановкой функции УПС, мы измерили протеолитическую активность протеасомы в препарате растворимых общеклеточных белков, выделенных из штамма егдб до и после обработки МС!32 Было обнаружено, что при данных условиях обработки Мв132 эффективность протеасомы снизилась на 35% относительно необработанных клеток. Таким образом, мы наблюдали прямую корреляцию между активностью протеасомы в клетке и уровнем импорта ТРК1 в митохондрии Полученные данные подтверждают нашу гипотезу о существовании в клетках дрожжей системы регуляции митохондриального импорта тРНК, функционирующей при участии УПС

Рис. 2. Анализ эффективности импорта ТРК1 в митохондрии и лротеолитической активности протеасомы. Штамм егдб после инкубации с ингибитором протеасомы MG132 (обозначен черным цветом) по сравнению с необработанными клетками егдб (белый).

Анализ роли потенциальных факторов импорта тРНК

Одним из белков-кандидатов на роль фактора импорта являлся белок Pill р Роль фосфорилированного Pill р состоит в негативной регуляции систем устойчивости к тепловому шоку. При повышении температуры среды реакция фосфорилирования PiHp протеин-киназой Pkh2p ингибируется, PiHp становится неактивным и перестает ингибировать Pkh1p/Pkh2p В двугибридной системе PiHp взаимодействовал с pre-Msk1p, что косвенно может свидетельствовать о том, что pre-Msk1 регулируется PiHp Тогда можно предположить, что фосфорилированный PiHp ингибирует импорт тРНК. Таким образом, при делеции гена PIL1 следует ожидать увеличения импорта тРНК по сравнению с клетками дикого типа, что нами и было показано при анализе импорта ТРК1 гибридизацией по Нозерну (Рис.5).

Рис. 3. Анализ состава митохондриальных тРНК, выделенных из штамма дикого типа (YPH501) и штамма с делецией PIL1 (pill). Радиоавтограф фильтра после гибридизации по Нозерну с олигонуклеотидами, специфичными к различным тРНК

Следующим кандидатом на роль фактора импорта, выявленным нами в данной работе, был белок МОИ, участвующий в негативной регуляции транскрипции генов НХТ, кодирующих транспортеры глюкозы Показано, что наличие глюкозы в среде приводит к активации генов НХТ посредством репрессии МТН1

Мы обнаружили, что ММ взаимодействовал с 1М-концевым доменом рге-МэИ в двугибридной системе При проверке взаимодействий М1Ы с различными

yph501 pH

25 3d 25 30 t, "с

Ш m ш трк1

t*1 — тркз

1 1 65 24 Соотношение сигналов ТРК1/ТРЮ в штамме pill откошепьно YPH501

РНК в тригибридной системе было обнаружено, что Mth1 не связывался ни с одной из тестированных РНК Это говорит о том, что если Mth1 участвует в импорте тРНК, то его участие должно быть ограничено уровнем белок-белкового взаимодействия, и, возможно, его мишенью является pre-Msk1. Далее мы анализировали рост штамма mthl на средах с различными источниками углерода и никакого видимого фенотипа нами найдено не было. Однако при анализе эффективности импорта ТРК1 в митохондрии было обнаружено, что при смене источника углерода в среде с глицерина на галактозу в клетках дикого типа происходит уменьшение уровня импорта в два раза, а в штамме mthl этого не происходит (Рис 4) Таким образом, мы можем предположить, что в условиях изменения источника углерода в среде, когда происходит индукция гена МТН1, мы наблюдаем уменьшение импорта ТРК1 Однако клетки, не содержащие Mthl, не обладают способностью переключать импорт так, чтобы адаптироваться к изменениям в среде

mthl YPH501 Штамм дрожжей

Галактоза Глицерин Галактоза Глицерин Источник углерода 8 среда роста

ящт ТРК1

* '¿äitUr^ ааМЙГ; Г ТРКЗ

5.6 8,3 3,2 6,4 Соотношение сигнала ТРК1/ТРКЗ

1,9 0,9 1,8 1 Соотношение сигнала ТРК1Л"РКЗ в штамме ггЛМ относительно УРНБ01

Рис. 4. Анализ состава митохондриальных тРНК, выделенных из штамма дикого типа (YPH501) и штамма с делецией МТН1 (mthl). Радиоавтограф фильтра после гибридизации по Нозерну с олигонуклеотидами, специфичными к различным тРНК.

В настоящее время существуют указания на то, что одним из уровней регуляции Mthl при смене метаболических условий роста является его избирательная деградация при участии УПС (Flick et al, 2003) Возможно, Mthl является репрессором импорта тРНК, регулируемым при участии УПС

В качестве кандидатов на роль факторов импорта тРНК нами были выбраны также белки, специфически связывавшиеся с ТРК1 в тригибридной системе Рпс1 и Leu9 Рпс1 является никотинамидазой, чья экспрессия активируется в клетке в ответ на различные стрессовые условия (Frothingham et al, 1996) При анализе штамма рпс1 нами не было найдено дефектов роста на средах с разными источниками углерода Импорт ТРК1, проанализированный

гибридизацией митохондриальных тРНК по Нозерну, был выше в два раза, чем в диком типе (Рис 5) Таким образом, мы можем сделать вывод в возможном негативном эффекте Рпс1 р на импорт тРНК.

1_еи9 - это митохондриальная лиаза, осуществляющая синтез 2-изопропилмалата и гомоцитрата в ходе биосинтеза лейцина в митохондриях, и полностью импортирующаяся из цитоплазмы (СаваЬпе е{ а1., 2000) При анализе штамма /еи9 было замечено замедление роста на среде с лактатом при 25°С По результатам гибридизации митохондриальных тРНК штамма 1еи9 по Нозерну, было обнаружено, что импорт ТРК1 увеличен в 1,8 раза по сравнению со штаммом дикого типа (Рис 5) Эти данные свидетельствуют, что делеция гена 1ЕШ, как и РЫС1 приводит к увеличению уровня импорта тРНК в органеллы.

Рис. 5. Анализ состава митохондриальных тРНК, выделенных из штамма дикого типа (УРН501) и штаммов с делециями РЫС1 (рпс1) и /.£1/9 (1еи9). Радиоавтограф фильтра после гибридизации по Нозерну с олигонуклеотидами, специфичными к различным тРНК.

Штамм дрожжей рпс1 1еи9

Источник углерода в среде роста галактоза глицерин лактат

Температура роста °С 25 30 25 30

ТРК1 м,. ш Ж»

ТРКЗ -

ТРК1/ ТРКЗ 6,2 5,7 5,9 4,9

Соотношение сигнала в штамме с мутацией относ дикого типа 1 9 0,9 1,8 1,5

А1г1 является транспортером Мдг+ в эукариотических клетках (СгавсИор! е! а1, 2001) Делеция гена А1И1 летальна при обычных условиях роста (МасЭДаггтнс! е( а!, 1998), поэтому мы не проводили анализ штамма аИ Нами было показано физическое взаимодействие АИр с Ы-концевым доменом рге-МвМр в двугибридной системе Затем при проверке его связывания с тРНК в тригибридной системе никаких взаимодействий обнаружено не было Это говорит о том, что если А1г1р участвует в импорте тРНК, то это должно происходить на уровне белковых взаимодействий АИр содержит 2 предсказанных трансмембранных домена, и было показано, что по крайней мере часть А1г1 локализована в митохондриях (вгавсЬорГ е( а1, 2001) Кроме того, минорная фракция А1г1 подвергается убиквитинилированию Таким образом, на основании обнаруженного физического взаимодействия А1г1 с фрагментом рге-МэМр в двугибридной системе и его митохондриальной локализации мы можем предположить участие А!г1 в импорте ТРК1 Возможно, уровень импорта тРНК регулируется в зависимости от концентрации Мд2* в среде, и эта регуляция может быть опосредована рге-Мэк1р при участии А1г1 и УПС.

Хеликазы как потенциальные факторы импорта тРНК

В данной работе при скрининге библиотек нами были найдены 2 РНК-зависимые хеликазы - Drslp и Senlp Drslp необходима для созревания и сборки 60S рибосомальной субчастицы Senlp - это АТР-зависимая РНК-хеликаза, участвующая в процессинге тРНК, рРНК и мяРНК Мы обнаружили взаимодействие Drslp с ТРК1 и с pre-Msk1p, a Senlp, идентифицированная в двугибридном скрининге с N-концевым домен ом pre-Msk1p, в тригибридной системе связывалась более эффективно с ТРК1, чем с ТРК2 и с РНК фага MS2 Наличие сродства к РНК со стороны РНК-зависимых хеликаз Drslp и Senlp является ожидаемым, однако наличие физического взаимодействия обоих хеликаз с pre-Msk1p, являющимся необходимым элементом для переноса тРНК в митохондрии, является существенным указанием на то, что данные хеликазы могут играть специфическую роль в импорте Анализ мутантов с делециями генов DRS1 или SEN1 не представляется возможным, так как делеции этих генов являются летальными Ранее было показано, что мутации в гене SEN1 оказывают плейотропные эффекты, что существенно усложняет задачу анализа эффекта мутации на импорт В связи с этим, дальнейший анализ роли хеликаз в данной работе не проводился

Таким образом, нами было идентифицировано 10 потенциальных факторов импорта ТРК1 в митохондрии дрожжей. Мы показали, что делеция каждого из шести проанализированных генов приводит к увеличению эффективности импорта ТРК1 Это свидетельствует о негативной роли рассмотренных кандидатов в регуляции импорта ТРК1.

Енолаза как фактор импорта тРНК.

В нашей лаборатории было показано, что в импорте ТРК1 in vitro принимает непосредственное участие енолаза (Н Энтелис, неопубликованные данные) -фермент, осуществляющий предпоследнюю реакцию гликолиза В дрожжах S cerevisiae два изозима енолазы кодируются генами EN01 и EN02, незначительно отличающимися по первичной структуре Экспрессия двух изоформ зависит от условий роста дрожжей (McAlister et al, 1982)

В данной работе было показано, что присутствия двух рекомбинантных белков - pre-Msk1p и енолазы - достаточно для направления импорта ТРК1 в изолированные митохондрии дрожжей Эффективность такого импорта в присутствии pre-Msk1p и Епо2р составила 20% относительно импорта в присутствии экстракта общеклеточных растворимых белков, для pre-Msk1p и Епо1р - 5% (рис 6) Таким образом, была впервые реконструирована система импорта ТРК1 в изолированные митохондрии, что, однако, не отрицает существования в клетке дополнительных белковых факторов, участвующих в регуляции процесса импорта

- Без белков

- pre-Msk1p+Eno2p

- pre-Msk1p+Eno1p

- Белки штамма дикого типа

Рис. 6. Импорт Р32-ТРК1 в изолированные дрожжевые митохондрии. Реакция проходила при добавлении препарата общеклеточных белков или рекомбинантных белков' pre-Msk1p, Enolp и Епо2р. Радиоавтограф электрофореграммы РНК, выделенных из обработанных РНКазами митопластов

Затем мы обнаружили, что оба изозима енолазы одинаково связывают рге-Msklp в двугибридной системе, но в тригибридной системе Епо2р специфически взаимодействовала с ТРК1 с ббльшим сродством, чем Enolp Можно предполагать, что Епо2р направляет импорт ТРК1 в митохондрии за счет сильного и специфического сродства с импортируемой тРНК.

Недавно было получено несколько независимых доказательств того, что енолаза присутствует во фракции митохондриальных белков дрожжей (Zischka et al, 2003, Ohlmeier et a!., 2004, Prokisch et al., 2004, Grandier-Vazeille et al, 2001) Мы проанализировали локализацию енолазы в клетках дрожжей при помощи фракционирования и Western-гибридизации высокоочищенной фракции митохондрий В результате было показано, что ечолаза частично локализована на внешней митохондриальной мембране (Рис 7)

Acolp Tom70p Eno1/2p

CCtHLp

Осмотический шок Протеиназа К NaCI (200 mM) NajCOj (200 тМ) Тритон Х100 (10%)

ММ MOM

IMS

Рис. 7. Локализация митохондриальных дрожжевых белков. Western-гибридизация митохондриальных фракций внешних мембран (MOM), матрикса (ММ) и межмембранного пространства (IMS) с антителами к аконитазе (Асо1), белку внешней мембраны Тот70р и гемлиазе цитохромоксидазы 1 (CCIHLp)

Далее мы провели анализ локализации двух изоформ енолазы, полученных in vitro Для этого синтезировали радиоактивно-меченые белки в системе

сопряженной транскрипции-трансляции в присутствии 835-метионина Затем проводили импорт полученной Епо1р или Епо2р в изолированные митохондрии и фракционировали митохондриальные компартменты с последующей Western-гибридизацией Было показано, что Епо2р не импортировалась в органеллы, но связывалась с внешнемембранной фракцией митохондрий значительно более эффективно, чем Епо1р Это говорит о том, что Епо2р прочно связана с митохондриальными мембранами, а Епо1р удерживается там намного слабее Чтобы количественно оценить распределение енолаз в клетке, после импорта радиоактивно-меченых енолаз в изолированные митохондрии мы провели обработку последних карбонатом натрия с последующим центрифугированием в трехступенчатом градиенте плотности сахарозы Это позволило разделить свободную интегрированную во внешнюю мембрану и агрегированную с остатками мембран формы белков Значительная разница была замечена в локализации двух енолаз 3% Епо2р было найдено во фракции внешнемитохондриальных мембран, в то время как лишь следовые количества Епо1р были агрегированы с мембранами

Для проверки результатов локализации Eno2p in vivo мы создали гибридный белок, Eno2p-YFP, содержащий енолазу 2 и желтый флуоресцентный белок (YFP) на ее С-конце Клетки, содержащие зкспрессирующийся и функциональный белок, Eno2p-YFP были проанализированы при помощи конфокальной микроскопии Было обнаружено, что часть сигнала, соответствующего YFP-меченой енолазе, пересекалась с сигналом Митотракера, специфически связывающегося с заряженной поверхностью митохондрий То есть в клетках дрожжей часть енолазы 2 действительно связана с поверхностью митохондрий

Для подтверждения функциональной активности енолазы, связанной с митохондриями дрожжей, мы определяли ее энзиматическую активность При этом мы учитывали эффективность выделения митохондрий и степень их очистки от цитоплазматических белков Эффективность выделения митохондрий составила 9±3 % и определялась по энзиматической активности митохондриальных белков - цитохром-оксидазы с и цитрат-синтазы - в митохондриальной и постмитохондриальной фракциях Для определения степени загрязнения митохондрий цитоплазматическими белками мы измеряли активность алкогольдегидрогеназы в митохондриальной фракции дрожжей, и она составила 4% Данные значения вычитались из активности, измеренной для енолазы в митохондриальной фракции Таким образом, мы определили, что в клетках дрожжей 7 % энзиматически активной енолазы связано с митохондриальной фракцией Это значение сопоставимо с количеством енолазы, зафиксированной в митохондриальной фракции Arabidopsis - 3% (Giege, Heazlewood et al 2003)

Далее мы проверили присутствие остальных ферментов гликолиза в митохондриях дрожжей, а также клеток печени быка и в клетках человека линии HepG2 Было показано, что энзиматические активности практически всех гликолитических ферментов были зафиксированы в митохондриальных фракциях дрожжей и клеток печени быка.

Анализ митохондриальных белковых комплексов, содержащих енолазу.

Для того, чтобы опред?лить функциональное значение связывания енолазы с митохондриями, из митохондриальной фракции дрожжей в нативных условиях были выделены высокомолекулярные белковые комплексы, содержащие енолазу, Для этого нами были использованы два подхода: двумерный нативный электрофорез и иммунопреципитация с антителами к енолазе.

Двумерный нативный электрофорез по Шагеру и фон Ягову (далее BN-PAGE от англ. Blue-Native PoliAcrylamide Gel Electrophoresis) является широко используемым подходом для изучения комплексов митохондриальных белков (Schagger et al, 1995) Использование этого метода позволило нам разделить нативные комплексы митохондриальных белков после их солюбилизации Тритоном Х-100, и идентифицировать комплекс, содержащий енолазу, с использованием Western-гибридизации с антителами к енолазе Мы наблюдали три комплекса, содержащих енолазу (далее обозначенных как КСЕ), с размером 700 кДа, 520 кДа и 350 кДа (Рис 8) По результатам Western-гибридизации с антителами к альдолазе, было обнаружено, что только КСЕ2 с массой 520 кДа содержал два гликолитических фермента - и енолазу, и альдолазу Чтобы идентифицировать остальные белки, входящие в состав КСЕ2, после электрофоретического разделения белковых комплексов в первом направлении, полоска, соответствующая КСЕ2, вырезалась, обрабатывалась трипсином и полученные пептиды анализировались с помощью масс-спектрометрии MALDI-TOF или nanoLC-MS/MS (анализ выполнялся совместно с Кристель Гийер и Лабораторией Протеомного Анализа в Институте Молекулярной и Клеточной Биологии, Страсбург, Франция) Была проведена серия из четырех независимых экспериментов, и в результате нами было идентифицировано 15 белков (Таблица 3).

Рис. 8. Идентификация комплексов, содержащих енолазу.

\Л/ез1егп-гибридизация с антителами к енолазе, после разделения белков методом двумерного электрофореза

5% 1 направление ВЫ-РАвЕ^ 0<уо ЭОЭ ПААГ

Второй метод, использованный для определения митохондриальных белков, связывающихся с енолазой, - иммунопреципитация с антителами к енолазе с последующей идентификацией белков методами масс-спектрометрического анализа Выделенные дрожжевые митохондрии или фракцию, обогащенную внешними митохондриальными мембранами, солюбилизировали при использовании Тритона Х-100 Далее проводили реакцию иммунопреципитации с использованием антител к енолазе, иммобилизированных на Протеин-А Сефарозе После разделения продуктов реакции электрофоретически по системе Лэмли, белки визуализировали при помощи окрашивания нитратом серебра, полоски вырезали из геля и анализировали масс-спектрометрическим анализов МАШ1-ТОР Этот подход позволил нам идентифицировать 18 различных белков (Таблица 3) Присутствие енолазы в смеси элюированных белков проверяли методом Westeгn-гибpидизaции В качестве негативного контроля проводили иммунопреципитацию с использованием неспецифических антител, или с Протеин-А Сефарозой без добавления антител

При использовании двух методов - ВМ-РАвЕ и иммунопреципитации - нами было идентифицирован 21 белок, входящий в состав макромолекулярного митохондриального комплекса, содержащего енолазу Причем 12 из этих белков были обнаружены обоими методами (Таблица 3)

® ^ <ч У-

тШИШШШ

Таблица 3 Белки БассЬэготусез сегеу/я/еа, идентифицированные с использованием масс-спектрометрических методов, при описании комплексов, содержащих енолазу._____

Название белка Описание белка из базы данных SGD (www yeastgenome org) Локализация Число идентификаций а)

Иммуно прецип итания и , С Z < CÛ с Итого

VDAC 1 POR1 Митохондриальный порин MOM 1 3 4

ААС2 Основной ADP/ATP-переносчик внутренней митохондриальной мембраны MIM 4 3 7

MIR1 Митохондриальный переносчик неорганических фосфатов MIM 2 4 6

АТР1 Альфа субъединица F1-сектора митохондриальной F1-F0 АТФ синтазы, предшественник MIM 3 3 6

АТР2 Бета субъединица F1-сектора митохондриальной F1-F0 АТФ синтазы MIM 0 4 4

FBA1 Фруктозо-1,6-дифосфатальдолаза ЦТП 0 4Ы 4

EN01 Енолаза, катализирует первую реакцию, общую в гликолизе и глюконеогенезе ЦТП 1е' 4 б) 5

TDH3 Основная форма глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы КЛСТ, ЦТП 2 2 4

TDH1 Минорная форма глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы КЛСТ, ЦТП 2 0 2

TEF1 фактор элонгации трансляции альфа EF-1 ЦТП 3 0 3

RPC34 С34 субъединица РНК-полимеразы III Ядро 1 1 2

MOD5 2-изопентенилпирофосфат-тРНК-изопентилтрансфераза ЦТП, мм, Ядрышко, Я Дро 2 0 2

CIT1 Цитратсинтаза ММ 2 0 2 2

MDH1 Митохондриальная малатдегидрогеназа ММ 2 0

SDH2 Железосерный белок - субъединица сукцинатдегидрогеназы MIM 0 2 2

IDH1 Субъединица митохондриальной ЫАО(+)-зависимой изоцитратдегидрогеназы мм 0 2 2

PUT1 Импортируемая в митохондрии пролиноксидаза мм 1 1 2

NDE1 Митохондриальная внешняя NADH-дегидрогеназа MIM, IMS 1 1 2

NDI1 NADH: убихиноноксидоредуктаза MIM 3 0 3

RIP1 Убихинон-цитохромоксидаза с, железосерный белок Риске MIM 2 2 4

COR1 центральная субъединица комплекса убихинон-цитохром с редуктазы (Ьс1 комплекс) IMS 3 2 5

а) Число идентификаций из семи независимых экспериментов по иммунопреципитации и четырех BN-PAGE

б) Белок идентифицирован по результатам Western-гибридизации Локализация белка обозначена сокращениями

ЦТП - цитоплазма КЛСТ - клеточная стенка

IMS - межмембранное митохондриальное пространство

MIM - Митохондриальная внутренняя мембрана

ММ - Митохондриальный матрикс

MOM - Митохондриальная внешняя мембрана

Состав описанного нами комплекса согласуется с ранее высказанной гипотезой о топологической близости белков, участвующих в окислительном фосфорилировании, NADH-дегидрогеназ и ферментов митохондриального матрикса, таких как ферменты цикла Кребса и биосинтеза аминокислот (Grandier-Vazeille et al, 2001) (Рис 9) Функциональное значение КСЕ может состоять в транспорте синтезированного в гликолизе пирувата в митохондрии Также известно, что проницаемость митохондриального порина (VDAC1) зависит от уровня глюкозы и цитозольного NADH, образованного в гликолизе Возможно, что функция КСЕ, содержащего VDAC1, состоит также в ингибировании дыхания в присутствии глюкозы

Альтернативной функцией КСЕ может быть импорт ТРК1 в митохондрии Для проверки этой гипотезы мы анализировали присутствие тРНК в КСЕ, изолированном после иммунопреципитации, при помощи реакции обратной транскрипции с последующей ПЦР ((ЗТ-ПЦР) Мы обнаружили, что ТРК1 присутствовала в этом комплексе, в отличие от ТРК2 Кроме того, в составе КСЕ были идентифицированы несколько РНК-связывающих белков - глицеральдегид-

Рис. 9. Модель организации макромолекулярного комплекса, содержащего енолазу.

Белки, идентифицированные после двумерного электрофореза, обозначены темно-серым, после иммунопреципитации - белым, а обоими методами - светло-серым

3-фосфатдегидрогеназа, Rpc34p, Teflp и Mod5p. Все эти белки на том или ином этапе функционирования связываются с тРНК и, таким образом, могут потенциально участвовать в импорте ТРК1 Кроме того, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа была обнаружена нами ранее при скрининге библиотек кДНК в тригибридной системе, где она взаимодействовала как с ТРК1, так и с РНК фага MS2 Особый интерес в КСЕ также представляет белок Mod5p. Это тРНК-изопентенилтрансфераза, модифицирующая аденин в 37 положении цитоплазматических и митохондриальных тРНК, в том числе и ТРК1 Интересно, что механизм тройной локализации - в ядре, в цитоплазме и в митохондриях -белка Mod5p регулируется при участии УПС (Zoladek et al, 1997). Роль Mod5p в импорте ТРК1 нуждается в дальнейшей проверке

Таким образом, в данной работе доказано непосредственное участие енолазы в импорте и продемонстрирована ее локализация на поверхности митохондрий в составе высокомолекулярного комплекса, содержащего также другие ферменты гликолиза ВЫВОДЫ

1 Идентифицировано 9 белков, взаимодействующих с импортируемой в митохондрии дрожжей лизиновой тРНК и ее переносчиком - pre-Msk1p. и являющихся потенциальными факторами импорта ТРК1

2 Делеция каждого из шести проанализированных генов (DOA1, LEU9, МТН1, PILI, PNC1, RPN13) приводит к увеличению эффективности импорта лизиновой тРНК. Это может указывать на то, что они являются репрессорами импорта

3 Показана прямая корреляция между протеолитической функцией 26S протеасомы и эффективностью импорта тРНК в митохондрии дрожжей.

4 Доказано, что гликолитический фермент - енолаза 2 - частично локализован на внешней митохондриальной мембране дрожжей в составе макромолекулярного белкового комплекса, включающего также импортируемую лизиновую тРНК

5 Продемонстрировано, что енолаза 2 специфически взаимодействует с импортируемой лизиновой тРНК дрожжей и непосредственно принимает участие в ее импорте

6 Реконструирована система импорта лизиновой тРНК дрожжей в митохондрии из индивидуальных компонентов.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации Статьи

1 Brandina, I, Tarassov, I. Importation d'ARN dans les mitochondries (2003) Regard sur la Biochimie,4, pp. 37- 45

2 Entelis, N, Kolesnikova, О., Kazakova, H, Brandina, I., Kamenski, P., Krasheninnikov, IA & Tarassov, I (2002) Import of nuclear-encoded RNAs into yeast and human mitochondria' experimental approaches and possible biomedical applications Genetic Engineering■ Principles & Methods, Kluwer Academic/Plenum Publishers (U S.A.), 24, pp 191-215

3 Kolesnikova, О , Entelis, N , Kazakova, H , Brandina, I, Martin, R. P , Tarassov, I. (2002) Targeting of tRNA into mitochondria- the role of anticodon nucleotides Mitochondrion, 2 (1/2), pp 95-107

Тезисы

1 Brandina, I Entelis, N Krasheninnikov, IA,, Martin, RP, Tarassov I A glycolytic enzyme, enolase, participates in tRNA targeting into yeast mitochondria (2005) Proceedings of 4th World Annual Congress of Human Proteome Organisation, Munich, Germany, p.S 3.

2 Смирнов А В., Брандина И.Л, Тарасов И.А., Колесникова OA, Крашенинников И А. Влияние некоторых компонентов убиквитин-протеасомной системы на эффективность импорта тРНК в митохондрии S cerevisiae (2005) Тезисы докладов XII международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2005», МаксПресс, Москва, стр 200.

3 Brandina, I, Entelis, N, Krasheninnikov, I, Martin R.P, Tarassov I Yeast enolase as a part of macromolecular complexes on the outer mitochondrial membrane (2004) Molecular and Cellular Proteomics, 3 supp , p. 324

4 Brandina I., Tarassov I , Martin R P Genetic tool for search of proteins targeting tRNA into yeast mitochondria (2003) Proceedings of 20th tRNA Workshop, Banz, Germany, p 65.

5 Брандина И.Л Поиск белковых факторов импорта тРНК в митохондрии дрожжей с использованием дрожжевых дву- и тригибридной систем (2002) Материалы Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов», Выпуск 7, стр 15

6 Брандина И.Л. Цитоплазматическая тРНК, импортируемая в митохондрии дрожжей Saccharomyces cerevisiae, участвует в митохондриальной трансляции. (2001), Материалы Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов», Выпуск 6, Московский Университет, стр 13

№18 190

РНБ Русский фонд

2006-4 13347

Подписано в печать 28.09.2005 Формат 60x88 1/16. Объем 1.5 пл. Тираж 50 экз. Заказ № 115 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119992 г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к. 102

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Брандина, Ирина Львовна

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Импорт тРНК в митохондрии.

1.1. Импорт тРНК в митохондрии простейших.

1.1.1. Импорт тРНК в митохондрии Tetrahymena.

1.1.2. Импорт тРНК в митохондрии трипаносоматид.

1.1.2.а. Отряд Kinetoplastidae.

1.1.2.6. Отряд Leishmania.

1.1.3. Другие представители простейших.

1. 2. Импорт тРНК в митохондрии дрожжей.

1.3. Импорт тРНК в митохондрии растений.

1.4. Импорт тРНК в митохондрии животных.

2. Убиквитин-протеасомная система деградации белков.

2.1.Введени е.

2.2. Функции УПС в клетке.

2.3. Убиквитинилирующая система в S. cerevisiae.

2.4. 26S протеасома: строение и функционирование.

2.4.1.20S субчастица, или каталитическое ядро.

2.4.2. 19S регуляторная субчастица.

2.5.Где локализованы протеасомы в клетке?.

2.6. Узнавание полиубиквитиновых цепей.

2.6.7. Протеасомные субъединицы, узнающие полиубиквитиновые цепи.

2.6.2. ЕЗ и Е4 ферменты в направлении субстратов к протеасоме.

2.6.3. Доставка субстратов к протеасоме посредством Cdc48 и его кофакторовАЪ

2.6.4. Шапероны и их кофакторы в деградации белков.

2.7. UFD путь. "' '. DOA1 как компонент UFD-nymu.

2.8. Непротеолитическая роль убиквитина и убиквитин-связывающих белков в клетке

2.8.1. Образование моноубиквитинилированных белков.

2.8.2. Связывание моноубиквитинилированных белков с различными убиквитин-связывающими доменами.

2.8.3. Альтернативные функции убиквитина.

A. Убиквитин изменяет локализацию белков.

Б. Убиквитин влияет на функцию белков.

B. Убиквитин регулирует белок-белковые взаимодействия.

Г. Убиквитин влияет на наследование и морфологию митохондрий.

Д. Убиквитин участвует в митохондриальной локализации белков.

2.9. Индукция УПС и каскадов протеинкиназ в ответ на тепловой шок.

3. Енолаза - гликолитический фермент.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Материалы.

Реактивы.

Коммерческие наборы.

Антитела.

Приборы и оборудование:.

1. Штаммы микроорганизмов и линии клеток.

1.1. Штаммы Escherichia coli.

1.2. Штаммы Saccharomyces cerevisiae.

1.3. Линия клеток человека.

2. Условия выращивания организмов.

Дрожжевые питательные среды.

3. Генно-инженерные конструкции.

4. Генно-инженерные методы.

4.1. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

4.2. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции и дефосфорилирование.

4.3. Лигирование.

4.4. Обратная транскрипция и амплификация.

5. Определение нуклеотидной последовательности ДНК методом Сэнгера.

6. Трансформация клеток Е.coli.

7. Трансформация Saccharomyces cerevisiae плазмидной ДНК.

8. Трансформация Saccharomyces cerevisiae библиотекой кДНК.

9. Определение фенотипов штаммов дрожжей S. cerevisiae.

10. Исключение плазмиды, содержащей маркер URA3, из дрожжевых клеток.

11. Определение активности р-галактозидазы.

11.1. Определение активности р-галактозидазы с помощью иммобилизации клеток на нитроцеллюлозных фильтрах.

11.2. Определение активности р-галактозидазы с использованием раствора X-gal в 0.5% агаре.

12. Скрещивание дрожжей.

13. Выделение ДНК из клеток дрожжей.

14. Выделение митохондриальных РНК из дрожжей.

14.1.Выделение митохондрий.

14.2. Выделение митохондриальных РНК.

15. Выделение суммарных клеточных РНК из дрожжей.

16. Гибридизация по Нозерну.

17. Western-гибридизация.

18. Мечение тРНК для реакций импорта.

19. Проверка ам?юацилирования РНК методом перйодатного окисления и мечения с использованием РНК-лигазы.

20. Транспорт радиоактивно меченной ТРК1 в изолированные митохондрии.

20.1. Выделение белкового препарата, способного направлять импорт тРНК в изолированные митохондрии дрожжей.

20.2. Выделение митохондрий из клеток дрожжей.

20.3. Исследование импорта РНК в изолированные митохондрии.

21. Выделение митохондрий из клеток человека.

22. Выделение митохондрий из гепатоцитов быка.

23. Измерение активности протеасомы in vitro.

24. Локализация митохондриальных белков.

24.1. Получение 358-меченных белков.

24.2. Импорт 358-меченных белков в изолированные митохондрии дрожжей.

25. Локализация З53-меченых енолаз в митохондриальной фракции дрожжей.

26. Конфокальная микроскопия клеток дрожжей.

27. Определение энзиматической активности гликолитических ферментов.

28. Выделение фракции, обогащенной внешними мембранами митохондрий дрожжей

29. Двумерный нативный электрофорез по Шагеру и фон Ягову.

29.4. Western-гибридизация BN-PAGE.

30. Иммунопреципитация.

31. Методы масс-спектрометрического анализа.

31.1. Визуализация белков в ПААГ.

31.2. Расщепление белков трипсином в геле.

31.3. MALDI- TOF анализ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Поиск потенциальных факторов импорта тРНК с использованием дву- и тригибридных систем в дрожжах.

1.1. Поиск белков, взаимодействующих с pre-Msklp в двугибридной системе.

1.1.1. Метод двугибридной системы в дрожжах.

1.1.2. Скрининг библиотек кДНК для поиска белков, связывающих pre-Msklp.

1.2. Поиск белков, взаимодействующих с импортируемой тРНК.

1.3. Функциональный анализ роли потенциальных факторов импорта.

1.3.1. Роль убиквитин-протеасомной системы в импорте тРНК.

A. Возможная роль субъединицы протеасомы Rpnl3p в импорте тРНК.

Б. Doalp как фактор импорта и компонент UFD-пути.

B. Влияние остановки каталитической функции УПС на эффективность импорта ТРК1 в митохондрии дрожжей.

В.1. Анализ уровня импорта тРНК в митохондрии штаммов, дефектных по каталитической функции протеасомы.

В.2. Использование ингибитора протеасомы и цистеиновых протеиназ MG132.

1.3.2. Анализ роли других потенциальных факторов импорта.

A. Регулятор транскрипции Mthl.

Б. Ингибитор протеин-киназ - PILI.

B. Белки, специфически связывавшиеся с ТРК1 в тригибридной системе, - PNC1 и

LEU9.

Г. Транспортер магния - ALR1.

Д. РНК-зависимые хеликазы DRS1 и SEN1.

2. Новые функции енолазы как фактора импорта тРНК.

2.1. Анализ локализации енолазы в клетках дрожжей in vivo с использованием Western-гибридизации.

2.2. Локализация Епо2р, меченной YFP, в клетках дрожжей.

2.3. Енолаза, связанная с митохондриями, является функционально активной?. 149 3. Анализ митохондриальных комплексов, содержащих енолазу.

A. Использование двумерного нативиого электрофореза.

Б. Использование иммунопреципитации с антителами к енолазе.

B. Сравнение и анализ результатов, полученных двумя методами.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль белковых факторов и РНК-белковых взаимодействий в импорте тРНК в митохондрии дрожжей"

Митохондрии осуществляют широкий спектр функций, включая обеспечение клеток энергией за счет окислительного фосфорилирования. Для митохондрий характерно наличие собственной ДНК и системы биосинтеза белка, однако большое число макромолекул импортируется в органеллы из цитоплазмы. Было показано, что в ряде случаев в митохондрии транспортируются не только белки, но также и тРНК. К настоящему времени импорт тРНК в митохондрии был обнаружен у простейших, ряда растений, сумчатых млекопитающих, а также у почкующихся дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Механизм переноса тРНК в митохондрии и его специфичность значительно отличается от вида к виду.

В случае дрожжей было показано, что из цитоплазмы в митохондрии импортируется два вида тРНК - тРНКЬусии (Martin et al., 1979) и тРНКс1п (Reinehardt et al., 2005). Импорт тРНК является высокоспецифичным процессом, так как одна из двух изоакцепторных лизиновых тРНК (тРНК yscаправляется в митохондрии дрожжей, в то время как вторая (тРНКЬу\>ии) присутствует только в цитоплазме. Такое различие в локализации довольно близких тРНК может быть объяснено отличиями в структуре этих тРНК (Entelis et al., 1998). Следующий уровень селекции может быть опосредован белками, взаимодействующими с тРНК. Ранее в нашей лаборатории было показано, что для импорта ТРК1 должна быть аминоацилирована с помощью цитоплазматической лизил-тРНК-синтетазы, затем необходимо ее взаимодействие с предшественником митохондриальной лизил-тРНК-синтетазы (pre-Msklp) (Tarassov et al., 1995b). Однако присутствия аминоацилированной ТРК1 и pre-Msklp не достаточно для импорта ТРК1 в митохондрии, что говорит о необходимости дополнительных белковых факторов, направляющих ее импорт, так называемых факторов импорта.

Данная работа была направлена на обнаружение белков, участвующих в импорте тРНК в митохондрии дрожжей и изучение их роли в этом процессе. При выполнении данной работы были получены указания на роль убикивитин-протеасомной системы деградации белков в импорте тРНК в митохондрии. Поэтому мы анализировали влияние различных компонентов этой системы на импорт ТРК1.

Во время выполнения данной работы в нашей лаборатории были получены данные, указывающие на участие гликолитического фермента - енолазы - в импорте тРНК (Н.Энтелис, неопубликованные данные). Также недавно было показано, что енолаза в комплексе с другими гликолитическими ферментами присутствует во фракции внешних мембран митохондрий Arabidopsis thaliana (Giege et al., 2003). Помимо этого известно, что гликолитические ферменты обладают радом альтернативных функций. Поэтому мы г А и к слит. (Ре Агентов предположили, что одной из функций • —т комплекса/могло бы быть участие в импорте тРНК в митохондрии. В связи с этим мы анализировали подробнее роль енолазы в импорте тРНК, ее митохондриальную локализацию в клетках дрожжей и осуществили поиск митохондриальных белков, образующих комплекс с енолазой.

Целью данной работы было исследование роли белковых факторов и РНК-белковых взаимодействий в импорте тРНК в митохондрии дрожжей.

Для этого в ходе исследования предполагалось выполнить следующие задачи:

1. Идентифицировать белковые факторы, потенциально участвующие в импорте тРНК в митохондрии дрожжей, так называемые факторы импорта, с использованием дву- и тригибридной систем в дрожжах.

2. Изучить влияние выявленных факторов на импорт тРНК в митохондрии дрожжей.

3. Исследовать роль гликолитического фермента — енолазы дрожжей - в импорте тРНК.

4. Охарактеризовать митохондриальную локализацию енолазы в клетках дрожжей и идентифицировать митохондриальные белки, взаимодействующие с енолазой.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Брандина, Ирина Львовна

выводы

1. Идентифицировано 9 белков, взаимодействующих с импортируемой в митохондрии дрожжей лизиновой тРНК и ее переносчиком- pre-Msklp, и являющихся потенциальными факторами импорта ТРК1.

2. Деления каждого из шести проанализированных генов (DOAI, LEU9, МТН1, PILI, PNC1, RPN13) приводит к увеличению эффективности импорта лизиновой тРНК. Это может указывать на то, что они являются репрессорами импорта.

3. Показана прямая корреляция между протеолитической функцией протеасомы 26S и эффективностью импорта тРНК в митохондрии дрожжей.

4. Доказано, что гликолитический фермент енолаза 2 частично локализован на внешней митохондриальной мембране в составе макромолекулярного комплекса, включающего импортируемую лизиновую тРНК дрожжей.

5. Продемонстрировано, что енолаза 2 специфически взаимодействует с импортируемой лизиновой тРНК дрожжей и непосредственно принимает участие в ее импорте.

6. Реконструирована система импорта лизиновой тРНК дрожжей в митохондрии из индивидуальных компонентов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Брандина, Ирина Львовна, Москва

1. Сойдла Т.Р. и Голованов Е.И. 1984 Возможная роль TPHKILys в узнавании участков пре-мРНК, имеющих регуляторное значение для сплайсинга. Молекулярная биология 18:277-285.

2. Энгельс Ф. "Диалектика природы", М., Политическая литература, 1987, с.259.

3. Adams, С.С., Jakovljevic, J., Roman, J., Harnpicharnchai, P. и Woolford, J.L., Jr. (2002) Saccharomyces cerevisiae nucleolar protein Nop7p is necessary for biogenesis of 60S ribosomal subunits. Rna, 8,150-165.

4. Adhya, S., Ghosh, Т., Das, A., Bera, S.K. и Mahapatra, S. (1997) Role of an RNA-binding protein in import of tRNA into Leishmania mitochondria. J Biol Chem, 272, 21396-21402.

5. Ahmadzadeh, M., Horng, А. и Colombini, M. (1996) The control of mitochondrial respiration in yeast: a possible role of the outer mitochondrial membrane. Cell Biochem Fund, 14,201-208.

6. Akashi, K., Hirayama, J., Takenaka, M., Yamaoka, S., Suyama, Y., Fukuzawa, H. и Ohyama, K. (1997) Accumulation of nuclear-encoded tRNA(Thr) (AGU) in mitochondria of the liverwort Marchantía polymorpha. Biochim Biophys Acta, 1350, 262-266.

7. Akashi, K., Sakurai, K., Hirayama, J., Fukuzama, H. и Ohyama, K. (1996) Occurence of nuclear-encoded tRNAIle in mitochondria of the liverwort Marchantía polymorpha. Curr. Genet., 30,181-185.

8. Alfonzo, J.D., Blanc, V., Estevez, A.M., Rubio, M.A. и Simpson, L. (1999) С to U editing of the anticodon of imported mitochondrial tRNA(Trp) allows decoding of the UGA stop codon in Leishmania tarentolae. Embo J, 18, 7056-7062.

9. Amerik, A., Swaminathan, S., Krantz, B.A., Wilkinson, K.D. и Hochstrasser, M. (1997) In vivo disassembly of free polyubiquitin chains by yeast Ubpl4 modulates rates of protein degradation by the proteasome. Embo J, 16,4826-4838.

10. Baumeister, W., Walz, J., Zuhl, F. и Seemuller, E. (1998) The proteasome: paradigm of a self-compartmentalizing protease. Cell, 92,367-380.

11. Ben-Neriah, Y. (2002) Regulatory functions of ubiquitination in the immune system. Nat Immunol, 3,20-26.

12. Bergmeyer H.U., G.K.G.M.V., 2nd edn. Academic Press, New York. (1974) Enzymes as Biochemical Reagents. Academic Press, New York.

13. Berry, M.D. h Boulton, A.A. (2000) Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase h apoptosis. JNeurosci Res, 60,150-154.

14. Bertolaet, B.L., Clarke, D.J., Wolff, M., Watson, M.H., Henze, M., Divita, G. h Reed, S.I. (2001) UBA domains of DNA damage-inducible proteins interact with ubiquitin. Nat Struct Biol, 8,417-422.

15. Bhattacharyya, S.N. h Adhya, S. (2004) tRNA-triggered ATP hydrolysis h generation of membrane potential by the leishmania mitochondrial tRNA import complex. J Biol Chem, 279, 11259-11263.

16. Bhattacharyya, S.N., Chatteijee, S. h Adhya, S. (2002) Mitochondrial RNA import in Leishmania tropica: aptamers homologous to multiple tRNA domains that interact cooperatively or antagonistically at the inner membrane. Mol Cell Biol, 22,43724382.

17. Bhattacharyya, S.N., Chatterjee, S., Goswami, S., Tripathi, G., Dey, S.N. h Adhya, S. (2003) "Ping-pong" interactions between mitochondrial tRNA import receptors within a multiprotein complex. Mol Cell Biol, 23, 5217-5224.

18. Bhattacharyya, S.N., Mukherjee, S. h Adhya, S. (2000) Mutations in a tRNA import signal define distinct receptors at the two membranes of Leishmania mitochondria. Mol Cell Biol, 20, 7410-7417.

19. Boer, P.H. h Gray, M.W. (1988) Transfer RNA genes h the genetic code in Chlamydomonas reinhardtii mitochondria. Curr Genet, 14, 583-590.

20. Borner, G.V., Morl, M., Janke, A. h Paabo, S. (1996a) RNA editing changes the identity of a mitochondrial tRNA in marsupials. Embo J, 15, 5949-5957.

21. Borner, G.V., Morl, M., Janke, A. h Paabo, S. (1996b) RNA editing changes the identity of a mitochondrial tRNA in marsupials. Embo J, 15, 5949-5957.

22. Boumans, H., Grivell, L.A. h Berden, J.A. (1998) The respiratory chain in yeast behaves as a single functional unit. J Biol Chem, 273,4872-4877.

23. Braun, B.C., Glickman, M., Kraft, R., Dahlmann, B., Kloetzel, P.M., Finley, D. h Schmidt, M. (1999) The base of the proteasome regulatory particle exhibits chaperone-like activity. Nat Cell Biol, 1,221-226.

24. Casalone, E., Barberio, C., Cavalieri, D. h Polsinelli, M. (2000) Identification by functional analysis of the gene encoding alpha-isopropylmalate synthase II (LEU9) in Saccharomyces cerevisiae. Yeast, 16, 539-545.

25. Cascio, P., Call, M., Petre, B.M., Walz, T. h Goldberg, A.L. (2002) Properties of the hybrid form of the 26S proteasome containing both 19S h PA28 complexes. Embo J, 21,2636-2645.

26. Cavarelli, J. h Moras, D. (1993) Recognition of tRNAs by aminoacyl-tRNA synthetases. Faseb J, 7, 79-86.

27. Chang, D.D. h Clayton, D.A. (1987) A mammalian mitochondrial RNA processing activity contains nucleus- encoded RNA. Science, 235, 1178-1184.

28. Charriere, F., Tan, T.H. h Schneider, A. (2005) Mitochondrial initiation factor 2 of Trypanosoma brucei binds imported formylated elongator-type tRNA(Met). J Biol Chem, 280, 15659-15665.

29. Chen, D.H., Shi, X. h Suyama, Y. (1994) In vivo expression h mitochondrial import of normal h mutated tRNA(thr) in Leishmania. Mol Biochem Parasitol, 64, 121-133.

30. Chiu, N., Chiu, A. h Suyama, Y. (1975) Native h imported transfer RNA in mitochondria. J Mol Biol, 99,37-50.

31. Chung, N., Jenkins, G., Hannun, Y.A., Heitman, J. h Obeid, L.M. (2000) Sphingolipids signal heat stress-induced ubiquitin-dependent proteolysis. J Biol Chern, 275,17229-17232.

32. Crane, D.I., Kalish, J.E. h Gould, S.J. (1994) The Pichia pastoris PAS4 gene encodes a ubiquitin-conjugating enzyme required for peroxisome assembly. J Biol Chem, 269, 21835-21844.

33. Crausaz Esseiva, A., Marechal-Drouard, L., Cosset, A. h Schneider, A. (2004) The T-stem determines the cytosolic or mitochondrial localization of trypanosomal tRNAsMet. Mol Biol Cell, 15,2750-2757.

34. Crespo, J.L., Helliwell, S.B., Wiederkehr, C., Demougin, P., Fowler, B., Primig, M. h Hall, M.N. (2004) NPR1 kinase h RSP5-BUL1/2 ubiquitin ligase control GLN3-dependent transcription in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem, 279,37512-37517.

35. Delage, L., Duchene, A.M., Zaepfel, M. h Marechal-Drouard, L. (2003) The anticodon h the D-domain sequences are essential determinants for plant cytosolic tRNA(Val) import into mitochondria. Plant J, 34,623-633.

36. Delley, P.A. h Hall, M.N. (1999) Cell wall stress depolarizes cell growth via hyperactivation of RHOl. J Cell Biol, 147, 163-174.

37. DeMarini, D.J., Winey, M., Ursic, D., Webb, F. h Culbertson, M.R. (1992) SEN1, a positive effector of tRNA-splicing endonuclease in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol, 12,2154-2164.

38. Di Fiore, P.P., Polo, S. h Hofmann, K. (2003) When ubiquitin meets ubiquitin receptors: a signalling connection. Nat Rev Mol Cell Biol, 4, 491-497.

39. Dieckmann, T., Withers-Ward, E.S., Jarosinski, M.A., Liu, C.F., Chen, I.S. h Feigon, J. (1998) Structure of a human DNA repair protein UBA domain that interacts with HIV-1 Vpr. Nat Struct Biol, 5,1042-1047.

40. Diekert, K., de Kroon, A.I., Kispal, G. h Lill, R. (2001) Isolation h subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods Cell Biol, 65,37-51.

41. Dietrich, A., Marechal-Drouard, L., Carneiro, V., Cosset, A. h Small, I. (1996a) A single base change prevents import of cytosolic tRNA(Ala) into mitochondria in transgenic plants. Plant J, 10,913-918.

42. Dietrich, A., Small, I., Cosset, A., Weil, J.H. h Marechal-Drouard, L. (1996b) Editing h import: strategies for providing plant mitochondria with a complete set of functional transfer RNAs. Biochimie, 78, 518-529.

43. Dietrich, A., Weil, J.H. h Marechal-Drouard, L. (1992) Nuclear-encoded transfer RNAs in plant mitochondria. Annu Rev Cell Biol, 8,115-131.

44. Doersen, С.J., Guerrier-Takada, С., Altman, S. и Attardi, G. (1985) Characterization of an RNase P activity from HeLa cell mitochondria. Comparison with the cytosol RNase P activity. J Biol Chem, 260,5942-5949.

45. Dorner, M., Altmann, M., Paabo, S. и Morl, M. (2001) Evidence for Import of a Lysyl-tRNA into Marsupial Mitochondria. Mol Biol Cell, 12, 2688-2698.

46. Entelis, N.S., Kieffer, S., Kolesnikova, O.A., Martin, R.P. и Tarassov, I.A. (1998) Structural requirements of tRNALys for its import into yeast mitochondria. Proc Natl Acad Sei USA, 95,2838-2843.

47. Entelis, N.S., Kolesnikova, O.A., Dogan, S., Martin, R.P. и Tarassov, I.A. (2001) 5 S rRNA и tRNA import into human mitochondria. Comparison of in vitro requirements. J Biol Chem, 276,45642-45653.

48. Entelis, N.S., Krasheninnikov, I.A., Martin, R.P. и Tarassov, I.A. (1996) Mitochondrial import of a yeast cytoplasmic tRNA (Lys): possible roles of aminoacylation и modified nucleosides in subcellular partitioning. FEBS Lett, 384,3842.

49. Entian, K.D., Meurer, В., Kohler, H., Mann, K.H. и Mecke, D. (1987) Studies on the regulation of enolases и compartmentation of cytosolic enzymes in Saccharomyces cerevisiae. Biochim Biophys Acta, 923,214-221.

50. Esseiva, A.C., Naguleswaran, A., Hemphill, А. и Schneider, A. (2004) Mitochondrial tRNA import in Toxoplasma gondii. J Biol Chem, 279,42363-42368.

51. Fields, S. и Song, O. (1989) A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature, 340,245-246.

52. Fisher, R.D., Wang, В., Alam, S.L., Higginson, D.S., Robinson, H., Sundquist, W.I. и Hill, C.P. (2003) Structure и ubiquitin binding of the ubiquitin-interacting motif. J Biol Chem, 278,28976-28984.

53. Fisk, H.A. и Yaffe, M.P. (1997) Mutational analysis of Mdmlp function in nuclear и mitochondrial inheritance. J Cell Biol, 138,485-494.

54. Fisk, H.A. и Yaffe, M.P. (1999) A role for ubiquitination in mitochondrial inheritance in Saccharomyces cerevisiae. J Cell Biol, 145,1199-1208.

55. Flick, K.M., Spielewoy, N., Kalashnikova, T.I., Guaderrama, M., Zhu, Q., Chang, H.C. и Wittenberg, C. (2003) Grrl-dependent inactivation of Mthl mediates glucose-induced dissociation of Rgtl from HXT gene promoters. Mol Biol Cell, 14,32303241.

56. Forte, M. (2004) VDAC function in a cellular context. Topics in Current Genetics., 8.

57. Frothingham, R., Meeker-O'Connell, W.A., Talbot, E.A., George, J.W. и Kreuzer, K.N. (1996) Identification, cloning, и expression of the Escherichia coli pyrazinamidase и nicotinamidase gene, pncA. Antimicrob Agents Chemother, 40, 1426-1431.

58. Galan, J.M., Moreau, V., Иге, В., Volln, С. и Haguenauer-Tsapis, R. (1996) Ubiquitination mediated by the Npilp/Rsp5p ubiquitin-protein ligase is required for endocytosis of the yeast uracil permease. J Biol Chem, 271,10946-10952.

59. Gallo, C.M., Smith, D.L., Jr. и Smith, J.S. (2004) Nicotinamide clearance by Pncl directly regulates Sir2-mediated silencing и longevity. Mol Cell Biol, 24,1301-1312.

60. Ghislain, M., Dohmen, R.J., Levy, F. и Varshavsky, A. (1996) Cdc48p interacts with Ufd3p, a WD repeat protein required for ubiquitin-mediated proteolysis in Saccharomyces cerevisiae. Embo J, 15,4884-4899.

61. Giege, P., Heazlewood, J.L., Roessner-Tunali, U., Millar, A.H., Fernie, A.R., Leaver,

62. C.J. h Sweetlove, L.J. (2003) Enzymes of glycolysis are functionally associated with the mitochondrion in Arabidopsis cells. Plant Cell, 15,2140-2151.

63. Gillman, E.C., Slusher, L.B., Martin, N.C. h Hopper, A.K. (1991) MOD5 translation initiation sites determine N6-isopentenyladenosine modification of mitochondrial h cytoplasmic tRNA. Mol Cell Biol, 11,2382-2390.

64. Glickman, M.H. h Ciechanover, A. (2002) The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway: destruction for the sake of construction. Physiol Rev, 82,373-428.

65. Glickman, M.H. h Raveh, D. (2005) Proteasome plasticity. FEES Lett, 579,32143223.

66. Glickman, M.H., Rubin, D.M., Fried, V.A. h Finley, D. (1998) The regulatory particle of the Saccharomyces cerevisiae proteasome. Mol Cell Biol, 18, 3149-3162.

67. Glickman, M.H., Rubin, D.M., Fu, H., Larsen, C.N., Coux, O., Wefes, I., Pfeifer, G., Cjeka, Z., Vierstra, R., Baumeister, W., Fried, V. h Finley, D. (1999) Functional analysis of the proteasome regulatory particle. Mol Biol Rep, 26,21-28.

68. Glover, K.E., Spencer, D.F. h Gray, M.W. (2001a) Identification h structural characterization of nucleus-encoded transfer RNAs imported into wheat mitochondria. J Biol Chem, 276,639-648.

69. Glover, K.E., Spencer, D.F. h Gray, M.W. (2001b) Identification h structural characterization of nucleus-encoded transfer RNAs imported into wheat mitochondria. J Biol Chem, 276,639-648.

70. Goldberg, A.L. (1972) Degradation of abnormal proteins in Escherichia coli (protein breakdown-protein structure-mistranslation-amino acid analogs-puromycin). Proc Natl Acad Sci USA, 69,422-426.

71. Goldberg, A.L. (2003) Protein degradation h protection against misfolded or damaged proteins. Nature, 426, 895-899.

72. Goswami, S., Chatteijee, S., Bhattacharyya, S.N., Basu, S. h Adhya, S. (2003) Allosteric regulation of tRNA import: interactions between tRNA domains at the inner membrane of Leishmania mitochondria. Nucleic Acids Res, 31, 5552-5559.

73. Gottlob, K., Majewski, N., Kennedy, S., Knel, E., Robey, R.B. h Hay, N. (2001) Inhibition of early apoptotic events by Akt/PKB is dependent on the first committed step of glycolysis h mitochondrial hexokinase. Genes Dev, 15,1406-1418.

74. Graier-Vazeille, X., Bathany, K., Chaignepain, S., Camougra, N., Manon, S. h Schmitter, J.M. (2001) Yeast mitochondrial dehydrogenases are associated in a supramolecular complex. Biochemistry, 40, 9758-9769.

75. Groll, M., Bajorek, M., Kohler, A., Moroder, L., Rubin, D.M., Huber, R., Glickman, M.H. h Finley, D. (2000) A gated channel into the proteasome core particle. Nat Struct Biol, 7,1062-1067.

76. Groll, M., Ditzel, L., Lowe, J., Stock, D., Bochtler, M., Bartunik, H.D. h Huber, R. (1997) Structure of 20S proteasome from yeast at 2.4 A resolution. Nature, 386,463471.

77. Groll, M., Heinemeyer, W., Jager, S., Ullrich, T., Bochtler, M., Wolf, D.H. h Huber, R. (1999) The catalytic sites of 20S proteasomes h their role in subunit maturation: a mutational h crystallographic study. Proc Natl Acad Sci USA, 96,10976-10983.

78. Gunther, T. (1993) Mechanisms h regulation of Mg2+ efflux h Mg2+ influx. Miner Electrolyte Metab, 19,259-265.

79. Haglund, K., Shimokawa, N., Szymkiewicz, I. h Dikic, I. (2002) Cbl-directed monoubiquitination of CIN85 is involved in regulation of lign-induced degradation of EGF receptors. Proc Natl Acad Sci USA, 99, 12191-12196.

80. Halestrap, A.P. h Brennerb, C. (2003) The adenine nucleotide translocase: a central component of the mitochondrial permeability transition pore h key player in cell death. Curr MedChem, 10, 1507-1525.

81. Hancock, K. h Hajduk, S.L. (1990) The mitochondrial tRNAs of Trypanosoma brucei are nuclear encoded. J Biol Chem, 265,19208-19215.

82. Hartmann-Petersen, R., Wallace, M., Hofmann, K., Koch, G., Johnsen, A.H., Hendil, K.B. h Gordon, C. (2004) The Ubx2 h Ubx3 cofactors direct Cdc48 activity to proteolytic h nonproteolytic ubiquitin-dependent processes. Curr Biol, 14, 824-828.

83. Heessen, S., Masucci, M.G. h Dantuma, N.P. (2005) The UBA2 domain functions as an intrinsic stabilization signal that protects Rad23 from proteasomal degradation. Mol Cell, 18,225-235.

84. Hicke, L. h Riezman, H. (1996) Ubiquitination of a yeast plasma membrane receptor signals its ligH-stimulated endocytosis. Cell, 84, 277-287.

85. Hoshikawa, C., Shichiri, M., Nakamori, S. h Takagi, H. (2003) A nonconserved Ala401 in the yeast Rsp5 ubiquitin ligase is involved in degradation of Gapl permease h stress-induced abnormal proteins. Proc Natl Acad Sci USA, 100, 11505-11510.

86. Hu, M., Li, P., Li, M., Li, W., Yao, T., Wu, J.W., Gu, W., Cohen, R.E. h Shi, Y. (2002) Crystal structure of a UBP-family deubiquitinating enzyme in isolation h in complex with ubiquitin aldehyde. Cell, 111, 1041-1054.

87. Huibregtse, J.M., Scheffner, M., Beaudenon, S. h Howley, P.M. (1995) A family of proteins structurally h functionally related to the E6-AP ubiquitin-protein ligase. Proc Natl Acad Sci USA, 92,2563-2567.

88. Janke, A., Xu, X. h Arnason, U. (1997) The complete mitochondrial genome of the wallaroo (Macropus robustus) h the phylogenetic relationship among Monotremata, Marsupialia, h Eutheria. Proc Natl Acad Sci USA, 94, 1276-1281.

89. Jenuwein, T. h Allis, C.D. (2001) Translating the histone code. Science, 293, 1074-1080.

90. Johnson, E.S., Ma, P.C., Ota, I.M. h Varshavsky, A. (1995) A proteolytic pathway that recognizes ubiquitin as a degradation signal. J Biol Chem, 270,1744217456.

91. Kaiser, C., Michaelis, S., Mitchell, A. (1994) Methods in yeast Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.

92. Kaminska, J., Kwapisz, M., Grabinska, K., Orlowski, J., Boguta, M., Palamarczyk, G. h Zoladek, T. (2005) Rsp5 ubiquitin ligase affects isoprenoid pathway h cell wall organization in S. cerevisiae. Acta Biochim Pol, 52,207-220.

93. Kang, R.S., Daniels, C.M., Francis, S.A., Shih, S.C., Salerno, W.J., Hicke, L. h Radhakrishnan, I. (2003) Solution structure of a CUE-ubiquitin complex reveals a conserved mode of ubiquitin binding. Cell, 113, 621-630.

94. Kaniak, A., Xue, Z., Macool, D., Kim, J.H. h Johnston, M. (2004) Regulatory network connecting two glucose signal transduction pathways in Saccharomyces cerevisiae. Eukaryot Cell, 3,221-231.

95. Kaplun, L., Ivantsiv, Y., Bakhrat, A. h Raveh, D. (2003) DNA damage response-mediated degradation of Ho endonuclease via the ubiquitin system involves its nuclear export. J Biol Chem, 278,48727-48734.

96. Kapushoc, S.T., Alfonzo, J.D., Rubio, M.A. h Simpson, L. (2000) End processing precedes mitochondrial importation h editing of tRNAs in leishmania tarentolae In Process Citation. J Biol Chem, 275, 37907-37914.

97. Kazakova, H.A., Entelis, N.S., Martin, R.P. h Tarassov, I.A. (1999) The aminoacceptor stem of the yeast tRNA(Lys) contains determinants of mitochondrial import selectivity. FEBS Lett, 442, 193-197.

98. Keil, R.L., Wolfe, D., Reiner, T., Peterson, C.J. h Riley, J.L. (1996) Molecular genetic analysis of volatile-anesthetic action. Mol Cell Biol, 16, 3446-3453.

99. Kenniston, J.A., Baker, T.A. h Sauer, R.T. (2005) Partitioning between unfolding h release of native domains during ClpXP degradation determines substrate selectivity h partial processing. Proc Natl Acad Sci USA, 102,1390-1395.

100. Kleinschmidt, J.A., Escher, C. h Wolf, D.H. (1988) Proteinase yscE of yeast shows homology with the 20 S cylinder particles of Xenopus laevis. FEBS Lett, 239, 35-40.

101. Kohler, A., Cascio, P., Leggett, D.S., Woo, K.M., Goldberg, A.L. h Finley, D. (2001) The axial channel of the proteasome core particle is gated by the Rpt2 ATPase h controls both substrate entry h product release. Mol Cell, 7, 1143-1152.

102. Kolesnikova, O., Entelis, N., Kazakova, H., Braina, I., Martin, R. P., Tarassov, I. (2002) Targeting of tRNA into mitochondria: the role of anticodon nucleotides. Mitochondrion, The official journal of the Mitochondria Research Society, 2,95-107.

103. Kolesnikova, O.A., Entelis, N.S., Mireau, H., Fox, T.D., Martin, R.P. h Tarassov, I.A. (2000) Suppression of mutations in mitochondrial DNA by tRNAs imported from the cytoplasm. Science, 289,1931-1933.

104. Kraemer, B., Zhang, B., SenGupta, D., Fields, S. h Wickens, M. (2000) Using the yeast three-hybrid system to detect h analyze RNA-protein interactions. Methods Enzymol, 328,297-321.

105. Krause, J., Hay, R., Kowollik, C. h Brdiczka, D. (1986) Cross-linking analysis of yeast mitochondrial outer membrane. Biochim Biophys Acta, 860, 690-698.

106. Krogan, N.J., Lam, M.H., Fillingham, J., Keogh, M.C., Gebbia, M., Li, J., Datta, N., Cagney, G., Buratowski, S., Emili, A. h Greenblatt, J.F. (2004) Proteasome involvement in the repair of DNA double-stra breaks. Mol Cell, 16, 1027-1034.

107. Kumar, R., Marechal-Drouard, L., Akama, K. h Small, I. (1996) Striking differences in mitochondrial tRNA import between different plant species. Mol Gen Genet, 252,404-411.

108. Laforest, M.J., Delage, L. h Marechal-Drouard, L. (2005) The T-domain of cytosolic tRNAVal, an essential determinant for mitochondrial import. FEBS Lett, 579,1072-1078.

109. Lakshmanan, J., Mosley, A.L. h Ozcan, S. (2003) Repression of transcription by Rgtl in the absence of glucose requires Stdl h Mthl. Curr Genet, 44, 19-25.

110. Lam, Y.A., Lawson, T.G., Velayutham, M., Zweier, J.L. h Pickart, C.M. (2002) A proteasomal ATPase subunit recognizes the polyubiquitin degradation signal. Nature, 416, 763-767.

111. Lassie, M., Blatch, G.L., Kundra, V., Takatori, T. h Zetter, B.R. (1997) Stress-inducible, murine protein mSTIl. Characterization of binding domains for heat shock proteins h in vitro phosphorylation by different kinases. J Biol Chem, 212, 1876-1884.

112. LeBlanc, A.J., Yermovsky-Kammerer, A.E. h Hajduk, S.L. (1999) A nuclear encoded h mitochondrial imported dicistronic tRNA precursor in Trypanosoma brucei. J Biol Chem, 21 A, 21071-21077.

113. Li, K., Smagula, C.S., Parsons, W.J., Richardson, J.A., Gonzalez, M., Hagler, H.K. h Williams, R.S. (1994) Subcellular partitioning of MRP RNA assessed by ultrastructural h biochemical analysis. J Cell Biol, 124, 871-882.

114. Liakopoulos, D., Doenges, G., Matuschewski, K. h Jentsch, S. (1998) A novel protein modification pathway related to the ubiquitin system. Embo J, 17,2208-2214.

115. Lima, B.D. h Simpson, L. (1996) Sequence-dependent in vivo import of tRNAs into the mitochondrion of Leishmania tarentolae. RNA, 2,429-440.

116. Liu, K., Zhang, X., Lester, R.L. h Dickson, R.C. (2005) The sphingoid long chain base phytosphingosine activates AGC-type protein kinases in Saccharomyces cerevisiae including Ypkl, Ypk2, h Sch9. J Biol Chem, 280, 22679-22687.

117. Luders, J., DemH, J. h Hohfeld, J. (2000) The ubiquitin-related BAG-1 provides a link between the molecular chaperones Hsc70/Hsp70 h the proteasome. J Biol Chem, 275,4613-4617.

118. Lye, L.F., Chen, D.H. h Suyama, Y. (1993) Selective import of nuclear-encoded tRNAs into mitochondria of the protozoan Leishmania tarentolae. Mol Biochem Parasitol, 58,233-245.

119. Madura, K. (2002) The ubiquitin-associated (UBA) domain: on the path from prudence to prurience. Cell Cycle, 1,235-244.

120. Magalhaes, P.J., Hreu, A.L. h Schon, E.A. (1998) Evidence for the presence of 5S rRNA in mammalian mitochondria. Mol Biol Cell, 9,2375-2382.

121. Mahajan, R., Delphin, C., Guan, T., Gerace, L. h Melchior, F. (1997) A small ubiquitin-related polypeptide involved in targeting RanGAP 1 to nuclear pore complex protein RanBP2. Cell, 88, 97-107.

122. Mahapatra, S. h Adhya, S. (1996) Import of RNA into Leishmania mitochondria occurs through direct interaction with membrane-bound receptors. J Biol Chem, 111, 20432-20437.

123. Mahapatra, S., Ghosh, S., Bera, S.K., Ghosh, T., Das, A. h Adhya, S. (1998) The D arm of tRNATyr is necessary h sufficient for import into Leishmania mitochondria in vitro. Nucleic Acids Res, 26,2037-2041.

124. Mahata, B., Bhattacharyya, S.N., Mukheijee, S. h Adhya, S. (2005) Correction of translational defects in patient-derived mutant mitochondria by complex-mediated import of a cytoplasmic tRNA. J Biol Chem, 280, 5141-5144.

125. Marechal-Drouard, L., Guillemaut, P., Cosset, A., Arbogast, M., Weber, F., Weil, J.H. h Dietrich, A. (1990) Transfer RNAs of potato (Solanum tuberosum) mitochondria have different genetic origins. Nucleic Acids Res, 18, 3689-3696.

126. Marres, C.A., de Vries, S. h Grivell, L.A. (1991) Isolation h inactivation of the nuclear gene encoding the rotenone-insensitive internal NADH: ubiquinone oxidoreductase of mitochondria from Saccharomyces cerevisiae. Eur J Biochem, 195, 857-862.

127. Martin, R., Schneller, J.M., Stahl, A. h Dirheimer, G. (1979) Import of nuclear deoxyribonucleic acid coded lysine-accepting transfer ribonucleic acid (anticodon C-U-U) into yeast mitochondria. Biochemistry, 18,4600-4605.

128. Martin, R.P. h Dirheimer, G. (1983) Two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis in the study of yeast mitochondrial transfer RNA. Mol Biol (Mosk), 17,1117-1125.

129. Maurizi, M.R. (1998) Proteasome assembly: biting the hh. Curr Biol, 8, R453-456.

130. Mayor, T., Lipford, J.R., Graumann, J., Smith, G.T. h Deshaies, R.J. (2005) Analysis of polyubiquitin conjugates reveals that the RpnlO substrate receptor contributes to the turnover of multiple proteasome targets. Mol Cell Proteomics, 4, 741-751.

131. Maytal-Kivity, V., Reis, N., Hofmann, K. h Glickman, M.H. (2002) MPN+, a putative catalytic motif found in a subset of MPN domain proteins from eukaryotes h prokaryotes, is critical for Rpnl 1 function. BMC Biochem, 3,28.

132. McAlister, L. h HoIIh, M.J. (1982) Targeted deletion of a yeast enolase structural gene. Identification h isolation of yeast enolase isozymes. J Biol Chem, 257, 7181-7188.

133. McCammon, M.T., Hartmann, M.A., Bottema, C.D. h Parks, L.W. (1984) Sterol methylation in Saccharomyces cerevisiae. J Bacteriol, 157,475-483.

134. Morris, M.C., Kaiser, P., Rudyak, S., Baskerville, C., Watson, M.H. h Reed, S.I. (2003) Cksl-dependent proteasome recruitment h activation of CDC20 transcription in budding yeast. Nature, 423, 1009-1013.

135. Moskvina, E., Schuller, C., Maurer, C.T., Mager, W.H. h Ruis, H. (1998) A search in the genome of Saccharomyces cerevisiae for genes regulated via stress response elements. Yeast, 14,1041-1050.

136. Mukherjee, S., Bhattacharyya, S.N. h Adhya, S. (1999) Stepwise transfer of tRNA through the double membrane of Leishmania mitochondria. J Biol Chem, 274, 31249-31255.

137. Muratani, M. h Tansey, W.P. (2003) How the ubiquitin-proteasome system controls transcription. Nat Rev Mol Cell Biol, 4,192-201.

138. Neumann, S., Petfalski, E., Brugger, B., Grosshans, H., Wieln, F., Tollervey, D. h Hurt, E. (2003) Formation h nuclear export of tRNA, rRNA h mRNA is regulated by the ubiquitin ligase Rsp5p. EMBO Rep, 4,1156-1162.

139. Nie, J., McGill, M.A., Dermer, M., Dho, S.E., Wolting, C.D. h McGlade, C.J. (2002) LNX functions as a RING type E3 ubiquitin ligase that targets the cell fate determinant Numb for ubiquitin-dependent degradation. Embo J, 21, 93-102.

140. Niederacher, D. h Entian, K.D. (1991) Characterization of Hex2 protein, a negative regulatory element necessary for glucose repression in yeast. Eur J Biochem, 200,311-319.

141. Ohlmeier, S., Kastaniotis, A.J., Hiltunen, J.K. h Bergmann, U. (2004) The yeast mitochondrial proteome, a study of fermentative h respiratory growth. J Biol Chem, 279, 3956-3979.

142. Ozean, S. h Johnston, M. (1995) Three different regulatory mechanisms enable yeast hexose transporter (HXT) genes to be induced by different levels of glucose. Mol Cell Biol, 15,1564-1572.

143. Palleschi, C., Francisci, S., Zennaro, E. h Frontali, L. (1984) Expression of the clustered mitochondrial tRNA genes in Saccharomyces cerevisiae: transcription h processing of transcripts. Embo J, 3,1389-1395.

144. Pallotti, F. h Lenaz, G. (2001) Isolation h subfractionation of mitochondria from animal cells h tissue culture lines. Methods Cell Biol, 65,1-35.

145. Pancholi, V. (2001) Multifunctional alpha-enolase: its role in diseases. Cell Mol Life Sei, 58,902-920.

146. Phelps, A. h Wohlrab, H. (2004) Homodimeric mitochondrial phosphate transport protein. Transient subunit/subunit contact site between the transport relevant transmembrane helices A. Biochemistry, 43,6200-6207.

147. Phizicky, E.M. h Fields, S. (1995) Protein-protein interactions: methods for detection h analysis. Microbiol Rev, 59, 94-123.

148. Pickart, C.M. (2001) Mechanisms underlying ubiquitination. Annu Rev Biochem, 70, 503-533.

149. Pickart, C.M. (2004) Back to the future with ubiquitin. Cell, 116,181-190.

150. Polo, S., Sigismund, S., Faretta, M., Guidi, M., Capua, M.R., Bossi, G., Chen, H., De Camilli, P. h Di Fiore, P.P. (2002) A single motif responsible for ubiquitin recognition h monoubiquitination in endocytic proteins. Nature, 416,451-455.

151. Raasi, S., Orlov, I., Fleming, K.G. h Pickart, C.M. (2004) Binding of polyubiquitin chains to ubiquitin-associated (UBA) domains of HHR23A. JMol Biol, 341,1367-1379.

152. Rabinovich, E., Kerem, A., Frohlich, K.U., Diamant, N. h Bar-Nun, S. (2002) AAA-ATPase p97/Cdc48p, a cytosolic chaperone required for endoplasmic reticulum-associated protein degradation. Mol Cell Biol, 22,626-634.

153. Rapaport, D., Taylor, R.D., Kaser, M., Langer, T., Neupert, W. h Nargang, F.E. (2001) Structural requirements of Tom40 for assembly into preexisting TOM complexes of mitochondria. Mol Biol Cell, 12,1189-1198.

154. Rape, M., Hoppe, T., Gorr, I., Kalocay, M., Richly, H. h Jentsch, S. (2001) Mobilization of processed, membrane-tethered SPT23 transcription factor by CDC48(UFD 1/NPL4), a ubiquitin-selective chaperone. Cell, 107, 667-677.

155. Reed, G.H., Poyner, R.R., Larsen, T.M., Wedekind, J.E. h Rayment, I. (1996) Structural h mechanistic studies of enolase. Curr Opin Struct Biol, 6, 736-743.

156. Rich, A. h RajBhHary, U.L. (1976) Transfer RNA: molecular structure, sequence, h properties. Annu Rev Biochem, 45, 805-860.

157. Richly, H., Rape, M., Braun, S., Rumpf, S., Hoege, C. h Jentsch, S. (2005) A series of ubiquitin binding factors connects CDC48/p97 to substrate multiubiquitylation h proteasomal targeting. Cell, 120, 73-84.

158. Rinehart, J., Krett, B., Rubio, M.A., Alfonzo, J.D. h Soli, D. (2005) Saccharomyces cerevisiae imports the cytosolic pathway for Gln-tRNA synthesis into the mitochondrion. Genes Dev, 19,583-592.

159. Ripmaster, T.L., Vaughn, G.P. h Woolford, J.L., Jr. (1992) A putative ATP-dependent RNA helicase involved in Saccharomyces cerevisiae ribosome assembly. Proc Natl Acad Sci USA, 89,11131-11135.

160. Rivett, A.J. h Hearn, A.R. (2004) Proteasome function in antigen presentation: immunoproteasome complexes, Peptide production, h interactions with viral proteins. Curr Protein Pept Sci, 5,153-161.

161. Rodeheffer, M.S., Boone, B.E., Bryan, A.C. h Shadel, G.S. (2001) Namlp, a protein involved in RNA processing h translation, is coupled to transcription through an interaction with yeast mitochondrial RNA polymerase. J Biol Chem, 276, 86168622.

162. Rodriguez, M.S., Gwizdek, C., Haguenauer-Tsapis, R. h Dargemont, C. (2003) The HECT ubiquitin ligase Rsp5p is required for proper nuclear export of mRNA in Saccharomyces cerevisiae. Traffic, 4, 566-575.

163. Rogers, S., Wells, R. h Rechsteiner, M. (1986) Amino acid sequences common to rapidly degraded proteins: the PEST hypothesis. Science, 234,364-368.

164. Rotin, D., Staub, O. h Haguenauer-Tsapis, R. (2000) Ubiquitination h endocytosis of plasma membrane proteins: role of Nedd4/Rsp5p family of ubiquitin-protein ligases. JMembr Biol, 176,1-17.

165. Rouiller, I., DeLaBarre, B., May, A.P., Weis, W.I., Brunger, A.T., Milligan, R.A. h Wilson-Kubalek, E.M. (2002) Conformational changes of the multifunction p97 AAA ATPase during its ATPase cycle. Nat Struct Biol, 9, 950-957.

166. Rubio, M.A., Liu, X., Yuzawa, H., Alfonzo, J.D. h Simpson, L. (2000) Selective importation of RNA into isolated mitochondria from Leishmania tarentolae. Rna, 6,988-1003.

167. Rusconi, C.P. h Cech, T.R. (1996) Mitochondrial import of only one of three nuclear-encoded glutamine tRNAs in Tetrahymena thermophila. Embo J, 15, 32863295.

168. Russell, N.S. h Wilkinson, K.D. (2004) Identification of a novel 29-linked polyubiquitin binding protein, Ufd3, using polyubiquitin chain analogues. Biochemistry, 43,4844-4854.

169. Salinas, T., Schaeffer, C., Marechal-Drouard, L. h Duchene, A.M. (2005) Sequence dependence of tRNA(Gly) import into tobacco mitochondria. Biochimie.

170. Schagger, H. (1995) Native electrophoresis for isolation of mitochondrial oxidative phosphorylation protein complexes. Methods Enzymol, 260, 190-202.

171. Schneider, A., Martin, J. h Agabian, N. (1994a) A nuclear encoded tRNA of Trypanosoma brucei is imported into mitochondria. Mol Cell Biol, 14,2317-2322.

172. Schneider, A., McNally, K.P. h Agabian, N. (1994b) Nuclear-encoded mitochondrial tRNAs of Trypanosoma brucei have a modified cytidine in the anticodon loop. Nucleic Acids Res, 22,3699-3705.

173. Schnell, J.D. h Hicke, L. (2003) Non-traditional functions of ubiquitin h ubiquitin-binding proteins. J Biol Chem, 278,35857-35860.

174. Schoenheimer, R. (1942) The dynamic state of body constituents.

175. Schuberth, C., Richly, H., Rumpf, S. и Buchberger, A. (2004) Shpl и Ubx2 are adaptors of Cdc48 involved in ubiquitin-dependent protein degradation. EMBO Rep, 5, 818-824.

176. SenGupta, D.J., Zhang, В., Kraemer, В., Pochart, P., Fields, S. и Wickens, M. (1996) A three-hybrid system to detect RNA-protein interactions in vivo. Proc Natl AcadSci USA, 93, 8496-8501.

177. Sherrer, R.L., Yermovsky-Kammerer, A.E. и Hajduk, S.L. (2003) A sequence motif within trypanosome precursor tRNAs influences abundance и mitochondrial localization. Mol Cell Biol, 23, 9061-9072.

178. Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, О. и Mann, M. (1996) Mass spectrometry sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. Anal Chem, 68, 850-858.

179. Shi, X., Chen, D.H. и Suyama, Y. (1994) A nuclear tRNA gene cluster in the protozoan Leishmania tarentolae и differential distribution of nuclear-encoded tRNAs between the cytosol и mitochondria. Mol Biochem Parasitol, 65,23-37.

180. Shih, S.C., Prag, G., Francis, S.A., Sutanto, M.A., Hurley, J.H. и Hicke, L. (2003) A ubiquitin-binding motif required for intramolecular monoubiquitylation, the CUE domain. Embo J, 22,1273-1281.

181. Shih, S.C., Sloper-Mould, K.E. и Hicke, L. (2000) Monoubiquitin carries a novel internalization signal that is appended to activated receptors. Embo J, 19,187198.

182. Sikorski, R.S. и Hieter, P. (1989) A system of shuttle vectors и yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genetics, 122,19-27.

183. Sirover, M.A. (2005) New nuclear functions of the glycolytic protein, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, in mammalian cells. J Cell Biochem, 95, 45-52.

184. Sloper-Mould, K.E., Jemc, J.C., Pickart, C.M. и Hicke, L. (2001) Distinct functional surface regions on ubiquitin. J Biol Chem, 276, 30483-30489.

185. Smith, C.J., Ley, A.N., D'Obrenan, P. и Mitra, S.K. (1971) The structure и coding specificity of a lysine transfer ribonucleic acid from the haploid yeast Saccharomyces cerevisiae alpha S288C. J Biol Chem, 246,7817-7819.

186. Sollner, Т., Rassow, J. и Pfanner, N. (1991) Analysis of mitochondrial protein import using translocation intermediates и specific antibodies. Methods Cell Biol, 34, 345-358.

187. Sonoda, J. и Wharton, R.P. (1999) Recruitment of Nanos to hunchback mRNA by Pumilio. Genes Dev, 13,2704-2712.

188. Springael, J.Y. и Иге, В. (1998) Nitrogen-regulated ubiquitination of the Gapl permease of Saccharomyces cerevisiae. Mol Biol Cell, 9, 1253-1263.

189. Srere, P.A. (1987) Complexes of sequential metabolic enzymes. Annu Rev Biochem, 56, 89-124.

190. Steinhilb, M.L., Turner, R.S. и Gaut, J.R. (2001) The protease inhibitor, MG132, blocks maturation of the amyloid precursor protein Swedish mutant preventing cleavage by beta-Secretase. J Biol Chem, 276,4476-4484.

191. Strous, GJ. и Govers, R. (1999) The ubiquitin-proteasome system и endocytosis. J Cell Sci, 112 (Pt 10), 1417-1423.

192. Suyama, Y. (1967) The origins of mitochondrial ribonucleic acids in Tetrahymena pyriformis. Biochemistry, 6,2829-2839.

193. Suyama, Y. и Eyer, J. (1967) Leucyl tRNA и leucyl tRNA synthetase in mitochondria of Tetrahymena pyriformis. Biochem Biophys Res Commun, 28, 746751.

194. Suyama, Y. и Hamada, J. (1978) The mitochondrial и cytoplasmic valyl tRNA synthetases in Tetrahymena are indistinguishable. Arch Biochem Biophys, 191,437443.

195. Suyama, Y., Jenney, F. и Okawa, N. (1987) Two transfer RNA sequences abut the large ribosomal RNA gene in Tetrahymena mitochondrial DNA: tRNA(leu) (anticodon UAA) и tRNA(met) (anticodon CAU). Curr Genet, 11, 327-330.

196. Tan, Т.Н., Bochud-Allemann, N., Horn, E.K. и Schneider, A. (2002a) Eukaryotic-type elongator tRNAMet of Trypanosoma brucei becomes formylated after import into mitochondria. Proc Natl Acad Sci USA, 99,1152-1157.

197. Tan, Т.Н., Pach, R., Crausaz, A., Ivens, А. и Schneider, A. (2002b) tRNAs in Trypanosoma brucei: genomic organization, expression, и mitochondrial import. Mol Cell Biol, 22,3707-3717.

198. Tarassov, I., Entelis, N. и Martin, R.P. (1995a) An intact protein translocating machinery is required for mitochondrial import of a yeast cytoplasmic tRNA. J Mol Biol, 245,315-323.

199. Tarassov, I., Entelis, N. и Martin, R.P. (1995b) Mitochondrial import of a cytoplasmic lysine-tRNA in yeast is mediated by cooperation of cytoplasmic и mitochondrial lysyl-tRNA synthetases. EmboJ, 14,3461-3471.

200. Tarassov, I.A. и Entelis, N.S. (1992) Mitochondrially-imported cytoplasmic tRNA(Lys)(CUU) of Saccharomyces cerevisiae: in vivo и in vitro targetting systems. Nucleic Acids Res, 20,1277-1281.

201. Thrower, J.S., Hoffman, L., Rechsteiner, M. и Pickart, C.M. (2000) Recognition of the polyubiquitin proteolytic signal. Embo J, 19, 94-102.

202. Tolerico, L.H., Benko, A.L., Aris, J.P., Stanford, D.R., Martin, N.C. и Hopper, A.K. (1999) Saccharomyces cerevisiae Mod5p-II contains sequences antagonistic for nuclear и cytosolic locations. Genetics, 151,57-75.

203. Traboni, C., Córtese, R. и Salvatore, F. (1980) Selective 32P-labelling of individual species in a total tRNA population. Nucleic Acids Res, 8,5223-5232.

204. Ursic, D., DeMarini, D.J. h Culbertson, M.R. (1995) Inactivation of the yeast Senl protein affects the localization of nucleolar proteins. Mol Gen Genet, 249, 571584.

205. Ursic, D., Himmel, K.L., Gurley, K.A., Webb, F. h Culbertson, M.R. (1997) The yeast SEN1 gene is required for the processing of diverse RNA classes. Nucleic Acids Res, 25,4778-4785.

206. Varshavsky, A. (2005) Regulated protein degradation. Trends Biochem Sci, 30, 283-286.

207. Varshavsky, A., Bachmair, A. h Finley, D. (1987) The N-end rule of selective protein turnover: mechanistic aspects h functional implications. Biochem Soc Trans, 15,815-816.

208. Voges, D., Zwickl, P. h Baumeister, W. (1999) The 26S proteasome: a molecular machine designed for controlled proteolysis. Annu Rev Biochem, 68,10151068.

209. Von der Haar, F. (1979) Purification of Aminoacyl-tRNA Synthetases. Methods in Enzymology, LIX, 257267.

210. Voos, W., von Ahsen, O., Muller, H., Guiard, B., Rassow, J. h Pfanner, N. (1996) Differential requirement for the mitochondrial Hsp70-Tim44 complex in unfolding h translocation of preproteins. Embo J, 15,2668-2677.

211. Wiebel, F.F. h Kunau, W.H. (1992) The Pas2 protein essential for peroxisome biogenesis is related to ubiquitin-conjugating enzymes. Nature, 359,73-76.

212. Wiedemann, N., Pfanner, N. h Ryan, M.T. (2001) The three modules of ADP/ATP carrier cooperate in receptor recruitment h translocation into mitochondria. Embo J, 20, 951-960.

213. Wilkinson, C.R., Seeger, M., Hartmann-Petersen, R., Stone, M., Wallace, M., Semple, C. h Gordon, C. (2001) Proteins containing the UBA domain are able to bind to multi-ubiquitin chains. Nat Cell Biol, 3, 939-943.

214. Wilkinson, K.D. (2000) Ubiquitination h deubiquitination: targeting of proteins for degradation by the proteasome. Semin Cell Dev Biol, 11,141-148.

215. Wilson, J.E. (2003) Isozymes of mammalian hexokinase: structure, subcellular localization h metabolic function. J Exp Biol, 206,2049-2057.

216. Wilson, T.E. (2002) A genomics-based screen for yeast mutants with an altered recombination/end-joining repair ratio. Genetics, 162, 677-688.

217. Winey, M. h Culbertson, M.R. (1988) Mutations affecting the tRNA-splicing endonuclease activity of Saccharomyces cerevisiae. Genetics, 118, 609-617.

218. Voet, M., Volckaert, G., Ward, T.R., Wysocki, R., Yen, G.S., Yu, K., Zimmermann, K., Philippsen, P., Johnston, M. h Davis, R.W. (1999) Functional characterization of the S. cerevisiae genome by gene deletion h parallel analysis. Science, 285, 901-906.

219. Witowsky, J.A. h Johnson, G.L. (2003) Ubiquitylation of MEKK1 inhibits its phosphorylation of MKK1 h MKK4 h activation of the ERK1/2 h JNK pathways. J Biol Chem, 278,1403-1406.

220. Wojcik, C. h DeMartino, G.N. (2003) Intracellular localization of proteasomes. Int JBiochem Cell Biol, 35, 579-589.

221. Wold, F. h Ballou, C.E. (1957a) Studies on the enzyme enolase. I. Equilibrium studies. J Biol Chem, 227, 301-312.

222. Wold, F. h Ballou, C.E. (1957b) Studies on the enzyme enolase. II. Kinetic studies. J Biol Chem, 227,313-328.

223. Wolf, D.H. h Hilt, W. (2004) The proteasome: a proteolytic nanomachine of cell regulation h waste disposal. Biochim Biophys Acta, 1695, 19-31.

224. Wolfe, D., Reiner, T., Keeley, J.L., Pizzini, M. h Keil, R.L. (1999) Ubiquitin metabolism affects cellular response to volatile anesthetics in yeast. Mol Cell Biol, 19, 8254-8262.

225. Wu, R. h Racker, E. (1959) Regulatory mechanisms in carbohydrate metabolism. III. Limiting factors in glycolysis of ascites tumor cells. J Biol Chem, 234, 1029-1035.

226. Xie, Y. h Varshavsky, A. (2001) RPN4 is a lign, substrate, h transcriptional regulator of the 26S proteasome: a negative feedback circuit. Proc Natl Acad Sci U S A, 98,3056-3061.

227. Yermovsky-Kammerer, A.E. h Hajduk, S.L. (1999) In vitro import of a nuclearly encoded tRNA into the mitochondrion of Trypanosoma brucei. Mol Cell Biol, 19,6253-6259.

228. Yoshionari, S., Koike, T., Yokogawa, T., Nishikawa, K., Ueda, T., Miura, K. h Watanabe, K. (1994) Existence of nuclear-encoded 5S-rRNA in bovine mitochondria. FEBS Lett,338,137-142.

229. Yuan, H. h Douglas, M.G. (1992) The mitochondrial F1 ATPase alpha-subunit is necessary for efficient import of mitochondrial precursors. J Biol Chem, 267, 14697-14702.

230. Zhang, X., Lester, R.L. h Dickson, R.C. (2004) Pillp h Lsplp negatively regulate the 3-phosphoinositide-dependent protein kinase-Iike kinase Pkhlp h downstream signaling pathways Pkclp h Ypklp. J Biol Chem, 279,22030-22038.

231. Zhaung, Z.P. h McCauley, R. (1989) Ubiquitin is involved in the in vitro insertion of monoamine oxidase B into mitochondrial outer membranes. J Biol Chem, 264, 14594-14596.

232. Zhuang, Z., Hogan, M. h McCauley, R. (1988) The in vitro insertion of monoamine oxidase B into mitochondrial outer membranes. FEBS Lett, 238,185-190.

233. Zhuang, Z.P., Marks, B. h McCauley, R.B. (1992) The insertion of monoamine oxidase A into the outer membrane of rat liver mitochondria. J Biol Chem, 267, 591596.

234. Zizi, M., Forte, M., Blachly-Dyson, E. h Colombini, M. (1994) NADH regulates the gating of VDAC, the mitochondrial outer membrane channel. J Biol Chem, 269,1614-1616.

235. Сердечно благодарю д-ра Ли Свитлова за возможность выполнения анализа активности гликолитических ферментов в его лаборатории, Оксфорд, Англия, а также за конструктивные замечания в обсуждении полученных результатов.

236. Я хочу поблагодарить Сильви Фриант за предоставленные штаммы дрожжей и ценные советы при планировании экспериментов.

237. Мне также приятно выразить благодарность всем сотрудникам кафедры молекулярной биологии Московского Государственного Университета и всему коллективу лаборатории РЯЕ2735 под руководством Р.Мартина за оказанную помощь, внимание и теплое отношение.

Информация о работе

Брандина, Ирина Львовна
кандидата биологических наук
Москва, 2005
ВАК 03.00.03

Диссертация

Роль белковых факторов и РНК-белковых взаимодействий в импорте тРНК в митохондрии дрожжей - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы