Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Импорт тРНК в митохондрии дрожжей: роль предшественника митохондриальной лизил-тРНК-синтетазы и функция импортируемой тРНК в митохондриальном матриксе

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Импорт тРНК в митохондрии дрожжей: роль предшественника митохондриальной лизил-тРНК-синтетазы и функция импортируемой тРНК в митохондриальном матриксе"

На правах рукописи

--000^5

КАМЕНСКИИ Петр Андреевич....... -

ИМПОРТ тРНК В МИТОХОНДРИИ ДРОЖЖЕЙ: РОЛЬ ПРЕДШЕСТВЕННИКА МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ ЛИЗИЛ-тРНК-СИНТЕТАЗЫ И ФУНКЦИЯ ИМПОРТИРУЕМОЙ тРНК В МИТОХОНДРИАЛЬНОМ

МАТРИКСЕ

03.00.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2007

003053825

Работа выполнена на кафедре молекулярной биологии Биологического факультета Московского государственного университета им. М. В. Ломоносова, г. Москва и в Университете Луи Пастера (г. Страсбург, Франция).

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

кандидат биологических наук, профессор

Крашенинников Игорь Александрович

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук, профессор

Колб Вячеслав Адамович кандидат биологических наук, старший научный сотрудник

Новикова Людмила Александровна

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита состоится «22» марта 2007 года в 10.00 ч. на заседании диссертационного совета Д 501.001.76 при Московском Государственном Университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские Горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, ауд. 536.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан «/^ » февраля 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук Н.О.Калинина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Большинство макромолекул, функционирующих в митохондриях, попадают в эти органеллы из цитоплазмы. Процесс импорта белков изучен достаточно полно, чего нельзя сказать о процессе импорта в митохондрии РНК. Феномен импорта тРНК в митохондрии наблюдается у простейших, растений, дрожжей, а также у сумчатых млекопитающих. Набор импортируемых молекул и механизмы этого процесса различаются для всех этих групп живых организмов. В случае почкующихся дрожжей ЗассЬаготусев сег^яШе было показано, что из цитоплазмы в митохондрии импортируется два вида тРНК - тРНК^сии и тРНК01". Импорт тРНК является высокоспецифичным процессом, так как одна из двух изоакцепторных лизиновых тРНК (тРНК^сии, далее - тРЛ1) направляется в митохондрии дрожжей, в то время как вторая (тРНК^иии, далее - тРЛ2) присутствует только в цитоплазме. Такое различие в локализации довольно близких тРНК может быть объяснено отличиями в структуре этих тРНК. Помимо этого, было показано, что в импорте тРЛ1 принимают участие три растворимых цитоплазматических белка. Первый из них - это цитоплазматическая лизил-тРНК-синтетаза (Кге1р), аминоацилирующая тРЛ1. Второй белок - это предшественник митохондриальной лизил-тРНК-синтетазы (ргеМвкЛр), который, как предполагается, является переносчиком тРЛ1 через митохондриальные мембраны. Наконец, третий белок - это гликолитический фермент енолаза. Ее функция в импорте тРНК в митохондрии дрожжей остается неясной.

Подавляющее большинство импортируемых тРНК других видов живых организмов необходимы для митохондриальной трансляции. В то же время, вопрос о функции тРЛ1 в митохондриальном матриксе дрожжей к настоящему моменту остается открытым. Предположение об участии тРЛ1 в митохондриальной трансляции подтверждается только косвенными экспериментами. Более того, митохондриальная лизиновая тРНК дрожжей (с антикодоном стпп^иии, далее тРЛЗ) способна узнавать оба лизиновых кодона (ААА и ААв) в процессе митохондриальной трансляции.

Изучение механизма импорта тРНК в митохондрии представляет особый интерес не только как одна из актуальных проблем современной биологии, но имеет и прикладное значение. Ряд наследственных болезней человека связан с мутациями в митохондриальных тРНК, приводящими к нарушениям функционирования органелл. Показано, что нарушения митохондриальной трансляции в клетках человека могут быть компенсированы при помощи искусственного импорта тРНК. Понимание молекулярного механизма импорта тРНК

необходимо для совершенствования стратегий лечения таких болезней при помощи импорта тРНК в митохондрии.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы являлось изучение формирования комплекса между тРЛ1 и preMsklp, и с использованием полученных данных, создание штамма дрожжей, в котором tPJII присутствовала бы исключительно в цитоплазме, и изучение фенотипического эффекта отсутствия тРЛ1 в митохондриях.

Для достижения поставленных целей были поставлены следующие задачи:

- оценить константу диссоциации комплекса тРЛ1-preMsklp в отсутствии и присутствии енолазы 2;

- определить, какие нуклеотиды тРЛ1 становятся защищенными от действия пуклеаз в результате взаимодействия с preMsklp;

- оценить эффективность импорта тРЛ1, направляемого различными мутантными версиями preMsklp in vitro и in vivo;

- в случае невозможности направления импорта тРЛ1 той или иной мутантной версией preMsklp, оценить эффективность митохондриалыюго дыхания и митохондриальной трансляции в клетках штамма дрожжей с соответствующей мутантной версией preMsklp;

- оценить эффективность митохондриального дыхания и митохондриальной трансляции в клетках штамма дрожжей, в которых ген preMsklp заменен на ортологичный ген грибов Ashbya gossypii.

Научная новизна и практическая ценность работы

В настоящей работе впервые измерена константа диссоциации комплекса тРЛ1-preMsklp. Продемонстрировано также, что енолаза облегчает формирование данного комплекса.

В данной работе впервые показана строгая корреляция между способностью мутантных и немутантных дрожжевых тРНК связываться с preMsklp и возможностью их импорта в митохондрии дрожжей.

Впервые подробно исследован комплекс импортируемой дрожжевой тРНК с preMsklp. Показано, что структура этого комплекса значительно отличается от структуры канонических комплексов аминоацил-тРНК-синтетаз класса 26 с соответствующими тРНК,

образование которых ведет к аминоацилироваяию. Продемонстрировано, что preMsklp защищает от действия нуклеаз практически все нуклеотиды импортируемой тРНК.

Впервые локализованы участки preMsklp, ответственные за направление импорта тРНК в митохондрии дрожжей.

В ходе данной работы впервые обнаружено, что N-концевой домен preMsklp способен направлять импорт тРНК в митохондрии как in vitro, так и in vivo. Впервые прямо показано участие импортируемой тРНК в митохондриальной трансляции и обнаружено, что это участие является необходимым для эффективной трансляции только при повышенной температуре роста. Также выявлена причина такого температуро-зависимого эффекта.

Полученные данные позволяют приблизиться к пониманию механизмов импорта тРНК в митохондрии дрожжей и могут быть использованы для разработки и совершенствования стратегий лечения наследственных заболеваний человека, вызываемых мутациями в генах митохондриальных тРНК.

Апробация работы

Диссертация была апробирована на заседании кафедры молекулярной биологии Биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова. Материалы исследований, выполненных в ходе работы, докладывались или представлялись в виде стендовых сообщений на следующих международных конференциях: конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, Россия в 2001 и 2004 гг), на VIII всемирном конгрессе научного общества «РНК» (Вена, Австрия, 2004 г), на XXI всемирном конгрессе научного общества «тРНК» (Бангалор, Индия, 2005 г), на VII французской конференции «Дрожжи: модели и свойства» (Париж, Франция, 2006 г).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы исследования», «Результаты и обсуждение». Работа завершается выводами и списком цитируемой литературы (177 ссылок). Работу иллюстрируют 57 рисунков, 6 таблиц и 2 приложения. Общий объем диссертации 135 страниц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В митохондрии пекарски к дрожжей Saccharomyces cereviaiae частично импортируется одна иг двух цитоплазматических лизиновых тРНК - тРЛ] (с антикодонои CUU). Втирая из ник (тРЛ2, с антикодоном UUU) функционирует исключительно в цягоплазме. Третья лизиновая тРНК дрожжей (тРЛЗ, антикодон cmnmjEJUU) закодирована в митохондриальном геноме и принимает участие в трансляции в органе л л ах, скязываясь с обоими лизиновыми кодонами мРНК - AAA и AAG.

В импорте tPJII в митохондрии принимают участие как минимум три растворимых цитоплазм этических белка Роль Krslp заключается в аминоацштировании тРЛ1, что является необходимым условием ее импорта, Ьелок preMsklp, как предполагается, является переносчиком тРЛ1 через митохондриальные мембраны; связывание о ним обязательно для импорта тРНК. Роль третьего белка, енолазы 2 (Епо2р), до настоящего момента оставалась

неясной.

Первой задачей данной работы являлось изучение формирования комплекса тРЛ1-picMsklp методом задержки в геле, а также возможной рош Епо2р в образовании этого комплекса. Мы выделили и очистили рекомбинантные белки, провели комплексообразование in vitro и разделили продукты реакции в неденатурирующем гюлиак рилами дном геле. Результаты этого эксперимента представлены »¡а рис. 1.

тРЛЦаа) тРЛЦда)

тРЛ2(аа)

тР-М ;

тРНК

[preMsklp] 50 100 200 300 100 200 300 100 200 300

Рис. 1 Радиоавтограф электрофорети ческого разделения комплекса меченной mPJII и preMsklp. Условные обозначения: тР-М - комплекс тРЛ ¡-preMsklp, аа-аминоацированная тРИК, да -деацшированная тРНК. Концентрации preMsklp указаны в нМ.

Как видно из рисунка, комплекс действительно образуется, и количество тРЛ1, вступающей во взаимодействие с белком, увеличивается с увеличением концентрация белка. При этом ни для деацилированной формы тРЛ 1, ни для тРЛ2, образования комплекса с ргсМкк1р не наблюдается, Кд данного комплекса составила 180±20 нМ, что в несколько рад больше Кд комплекса лизиновой тРНК с ЛизРС, результатом образования которого является аминоацилирование (30 нМ).

тРЛ1

[ргеМзМр] 20 40

После этого мы решили проверить предположение о том, что один и:) белков, специфически взаимодействующих с тРЛ 1 (но не с тРЛ2), Епо2р, принимает участие в образовании комплекса тРЛ I рг^л1>к 1 р. Для этого мы проделали эксперимент с добавлением в реакционную смесь различных концентраций ргеМ йк 1 р и Епо2р как вместе, так и по отдельности. Обнаружилось, что Епо2р образует комплекс с тРЛ1 (Кд Этого комплекса составляет 2,5±0,2 мкМ, данные не представлены). Этот комплекс значительно менее стабилен, чем комплекс тРЛ1-ргеМзк1р (Кд отличаются на порядок). Более того, б присутствии 50 нМ ргеМкк 1 р тРЛ1 высвобождается из комплекса с Епо2р и вступает во взаимодействие с ргеМзк1р, несмотря на то, что концентрация последнего в 20 раз меньше, чем Епо2р. Другими словами, Епо2р не только взаимодействует с тРЛ I сама по себе, но и облегчает взаимодействие тРЛ1 с р1сМзк1р. Чтобы убедиться в этом, мы провели следующую серию экспериментов по задержке в геле (см, рис. 2).

тР-М

Рис. 2. Радиоавтограф элек!профоретич еского разделения комплексов

меченной тРЛI с ргеММр в присутствии розничных

концентраций Епо2р. Условные обозначения: тР~М - комплекс тРЛ 1 ~preM.sk!р. Концентрации белков указаны в нМ.

тРЯ1

[ргеМзМр] 20 40 30 160 300 [Епо2р] 1400 1400 1400 1400 1400

Действительно, из рисунка видно, что при одних и тех же концентрациях в смеси ргеМзк1р образующийся комплекс гораздо стабильнее в случае, если в смеси также присутствует Епо2р. Кд данного комплекса в присутствии Епо2р составляет 40±5 нМ.

В ходе экспериментов, прово димых параллельно в пашей лаборатории, обнаружилось, что Епо2р частично ассоциирована с внешней митохондриальной мембраной, но для импорта тРЛ1 необходимо участие свободной цнтоплазматической формы этого белка. Помимо этого, известно, что мРНК ргеМзк1р синтезируется рибосомами, ассоциированными с митохондриалыю поверхностью. Исходя из этого, мы предполагаем, что Епо2р выступает в качестве переносчика тРЛ1 к поверхности митохондрий, где тРНК связывается с ргеМак) р, и данный комплекс импортируется в митохондрии.

160 300

тР-М

Далее мы решили проверить, во всех ли случаях сохраняется корреляция между способностью тРНК импортироваться в митохондрии и формированием стабильного комплекса тРНК с ргеМзк1р. В нашем распоряжении имелись плазмиды, содержащие гены нескольких мутантных версий тРЛ1 и тРЛ2. Мы использовали реакцию т vUтo Т7-гранскрипции для получения РНК, и затем проверяли последние в опытах по задержке в геле с ргеМзк!р (см. рис. 3).

Рис. 3. Радиоавтограф электрофоретического разделения комплексов меченного 77-транскршааа гена тРЛ1 (в де- или аминоацилированной форме) с ргеМ$к1р, Условные обозначения: тР-М- комплекс 1г1-ргс.М$к!р- Концентрации ргеМ$к!р указаны в нМ,

Из рисунка видно, что в случае Т7-гранскрипта гена тРЛ1, так же, как и для самой тРЛ1, только аминоацилированная его форма способна образовывать стабильный комплекс с ргеМ$к!р.

Данные для других тРНК и транскриптов, полученные в данной работе,

суммированы в таблице I.

описание Эффективность им порта, % от таковой для тРЛ1аа Кц, мкМ

тРЛ1 Цитоплазм этическая импортируемая тРНК'""! 100 (а а) 10 (да) 0.18 ± 0.04 (аа) >1 (да)

Т7-'фанскрипт гена тРЛ1 1Ш(аа) 10 (да) 0.28 ± 0.06 (аа) >1 (да)

тРЛ2 Цитоилазматич еская неймпортируемая тРНК"™ <Ъ (аа или да) >1 (аа ог ¡¡а)

1г7 Т7-траис крипт гена тРЛ ]; 6 нуклеотидов антнкодоновою стебля заменены на е оответствующне нуклеотиды из тРЛ2 <.*> (аа или да) > 1 (аа или да)

1г9 Г7-транскриит гена тРЛ!, <5 (аа или да) >1 (аа или да)

1г93 Т7-транскрнпт гена тРЛ2, А,2->С, с,3->и Не может быть аминоацнлироваи 85 0.25 ± 0.06

Из таблицы видно, что, действительно, только те тРНК и транскряпты, которые способны образовывать стабильный комплекс с ргеМвк 1 р, могуг импортироваться в митохондрии.

Далее мы решили исследовать структуру тР ПК-бел ков с го комплекса, приводящего к импорту тРНК в митохондрии, методом футпрянтияга. Мы обрабатывали РНКазами комплексы тРЛ1 с Кгз1р и ргеМзк 1, с ргеМяк!, а также свободные тРНК, Перед образованием комплекса с ргсМкк! тРЛ1 была предварительно аминоацилирована при помощи рекомбииантной Кгк1ра в то время как (ЮЗ импортируется в дсацилироваш-юй форме и не нуждается в предварительном аминоацилировании. Мы использовали несколько различных РНК аз для оценки не только защищенности нуклеотидов, но и влияния связывания с белком на вторичную структуру тР! !К.

После обсчета результатов (количественной оценки защищенносги/ввставленности нуклеотидов) для каждого нуклеотида тРНК была получена информация о его взаимодействии с белком. Результаты подсчета представлены на рис. 4 и5.

О ЕЛ

5'

ЕИ ЕЛ И 3'

Рис. 4. Анализ взаимодействия тРЛ1 с Кгя1р.

«нгикодоновыи

Н _ стебель О-стебел»»

Г1'!""!!!! 1 -----

¿эмтикодоновая

петля

1,||

ЩЩ - защищен белком

- "выстаапен" Сетом

- нет эффекта |____] - нет данных

□ □

5' Ш"

ЁО И 3'

Рис. 5. Анализ взаимодействия тРЛ1 с ргеМзМр

Для того, чтобы оценить достоверность метода футпринтинга, мы провели исследование комплекса тРЛ1 с Кгя 1 р. Действительно, этот комплекс организован, в целом, аналогично комплексам других аминоацил-тРНК-синтетаз класса 26 с соответствующими тРНК. Од 15ако комплекс тРЛ1 с ргеМакТр организован совершенно иначе: подавляющее большинство нуклеотидов тРЛ1 становятся защищенными от действия нуклеаз в результате взаимодействия с ргеМяк 1р. Судя по всему, можно говорить об «обволакивании» тРЛ1, так, что большая ее часть находиться как бы «внутри» ргеМзк 1 р Комплекс Ьг93 с ргеМяк1р организован практически так же, как и комплекс тРЛ1- ргеМак 1р (данные не представлены), несмо тря на то, что две эти тРПК сильно отличаются по нуклеотидной последовательности. По всей видимости, можно говорит!, о существовании отдельных нуклеотидов тРНК. определяющих возможность взаимодействия с ргеМзк 1 р. Существенной разницы в изменениях вторичной структуры тРНК, вызванных взаимодействием с КВДр или с ргеМвк1р, выявлено не было-

Следующей пашей задачей было обнаружение участков (структурных элементов) ргеМзк! р, необходимых для направления импорта тРНК в митохондрии дрожжей. ргеМйк1р является аминоацил-1 РНК-синтетазой класса 2Ь и состоит из двух доменов - N-концевого, участвующего в связывании антикодона тРНК, и С-конце во го, содержащего в своем составе активный центр, осуществляющий собственно амяноацилирование (рис. 6). Мы создали

пять генно-инженерных конструкций, представляющие из себя укороченные гены preMsk 1 р (см, рис. 7).

Рис 6. Вторичная структура preMsklp, предсказанная на основе сравнения с известной вторичной структурой лизил-тРНК-синтетазы Е.соИ. а-спирили обозначены прямоугольниками, р-элементы - стрелками.

h

1 f 1

л 1 д J

preMsklp preWsk-N

IZZb

1 ¡ísíbt-Hi СЭ

Рис. 7. Схематическое с-мп изображение генно-00™"1 инженерных конструкций, использовавшихся для получения N-концевого доменаргсМзк!р и четырех его укороченных вариантов, а-спирали обозначены прямоугольниками, р-зцементы - стрелками.

Рскомбинантные белки были экспрессированы к Е.соП, очищены и проверены в экспериментах по импорту гРНК в изолированные митохондрии дрожжей. Результаты этих экспериментов представлены на рис. 8.

Рис §. Радиофвтограф электрофоре!» ического разделения

митохондриачьиых РНК после импорта тРЛ1 и тРЛ2, направляемого укороченными версиями ргеМзк!р, в

изолированные митохондрии дрожжей.

#W4 ## & #ч # ##

■т-

ч<-

Nier

А5

Н4

A3

НЗ

Из рисунка видно, что наше предположение о том, что №концевой домен ргеМйИр способен направлять импорт тРНК « изолированные митохондрии дрожжей, подтвердилось. Импорт, направляемый этим белком, специфичен, то есть тРЛ 1 импортируется в

присутствии этого белка, а тРЛ2 - нет. Четыре более коротких версии белка также оказались способны направлять импорт тРНК в митохондрии, однако такой импорт был нсспецифичным (импортировались как тРЛ1, так и тРЛ2). Чтобы убедиться в этом, мы проверили несколько тРНК и транскриптов, в норме не импортирующихся, а также одну тРНК Е.соН и 5Б рРНК человека, Результаты этих экспериментов представлены на рис 9

Рис. 9. Рад иофвтограф злектрофоретического разделения митохондриаяьных ГНК после импорта РНК, направляемого укороченными версиями ргеМак1р, в изолированные митохондрии дрожжей.

Действительно, укороченные версии 1\!-концевого домен а ргеМяЫр направляют импорт всех проверенных в данных экспериментах РНК. В то же время, целый Ы-концевой домен ргеМ$к!р направляет импорт только тех тРНК и гран скриптов, которые способны к импорту в присутствии полнораамерного ргеМкИр, Таким образом, можно предположить, что участок ргеМзк1р, определяющий специфичность импорта тРНК в митохондрии, расположен в пределах трех структурных элементов - Н5, А6 и Н6, Такая гипотеза выдвигается на основании того, что в самой крупной из укороченных версий N-концевого домена ргеМ$к ] р недостает как раз этих трех структурных элементов целого Ы-конневого домена, и импорт, направляемый этой версией, уже неспецифичен. Также мы предполагаем, что неспецифический импорт РНК, направляемый укороченными версиями N-концевого домена ргсМйк 1р, является следствием («специфических РНК-свмзывающих свойств а-спиралей Н1-НЗ (из которых состоит самая короткая из укороченных версий Ы-концевого домена ргсМьк 1р).

Итак, М-концевой домен ргеМак 1 р специфически направляет импорт тРНК в изолированные митохондрии дрожжей. Каким же образом этот белок взаимодействует с тРЛ1? Мы провели эксперименты по футпринтингу соответствующего комплекса; их результаты представлены на рис. 10.

ьл гп

2 < х < л:

1:г93

ьа №

5Б рРНКН.Б Е.соИтРН^п

ШМШ

* я»

^ я? Ф * * ш

ЭКТИКОД ОНОВЫ й

стебал»

|1|Н

знтикод основа« петля

Щ - защищен белком - "выставлен* белком I - нет Эффекта 1 1 - нет данных

§

□ и!

□ и 1 аю!

5' ЕЛ

И

ю

и

3'

Рис. 10. Анализ взаимодействия тРЛ1 сИ-концевЫм доменом ргеМхк1р.

Можно пидсть, что N-№1 щепой домен ргеМ®к1р взаимодействует с тРЛ1 таким же образом, как и полноразмерный белок. Однако сложно представить, чтобы одна молекул!

белка с молекулярным весом около 35 кДа {имений такова масса М-концевого ДОМена ргеМьк 1 р) практически полностью «закрывала» бы собой одну молекулу тРНК С молекулярным весом около 21 кДа. В связи с этим, мы предполагаем, что Ы-концевой домен ргеМ$к!р взаимодействуем с тРЛ1 р виде днмера. Такое допущение представляется логичным, поскольку известно, что амищдаил-тЩК-синтетазы класса! 26 функционально активны в да мерной форме.

Важны ли обсуждаемые участки ргсМкк] р для направления импорта тРЛ1 в Митохондрии в контексте целого белка? Мы Сконструировал и несколько мутантных версий ргеМйк]р (см. рис. 11), выделили и очистили их и проверили в экспериментах по импорту тРИК в изолированные митохондрии. Результаты этих опытов представлены на рис. 12.

С-ьет».

рмычр Лщта^^/^^н;^«'1 Рис- II, Схематическое

____' АЛА изображение мутантных

ргеМ$к(АН6) ! р№МА(ДШ-Нб) I ртеМОДНЬШ) 2

обозначены прямоугольниками, [>-элементы - стрелками

i" /// // //////

Рис. 12. Радиофвтограф Шектрофоретического

разделения

§ » # f i

i I i 1 I

А! итохондриал ьных РНК после импорта тРЛ], направленного мутантчыми версиями pre Mi kip, в изолированные митохондрии дрожжей, Диаграмма

показывает эффективности

эффективность импорта тРЛ1

относительно

эффективности импорта, направляемого preMsklр без делений.

импорта

mPJIl

Kd,HM ISO

250

Из рисунка видно, что все мутантныс версии preMskl р, за исключением белка с делецией целого N-концевого домена, способны направлять импорт тРЛ1 в изолированные митохондрии дрожжей, Это подтверждает важность N-концевого домена для этого процесса. Однако при количественной оценке эффективности импорта оказалось, что только белок preMski(Hl-H3) направляет импорт тРЛ1 с эффективностью, сравнимой с таковой в случае использования preMsklp дикого типа. Остальные три белка показывают эффективность направления импорта около 30%. Эти результаты хорошо согласуются с результатами экспериментов по задержеке в геле {данные не представлены), в которых константа диссоциации для белка preMskA(Hl-M3) составила 250 нМ, в то время как комплексы тРЛ) с остальными мутантаЫМИ версиями preMsklp вообще не были детектированы. Таким образом, подтверждается важность участка Н5-116 для направления импорта тРЛ1.

Далее мы решили проверить, важны ли обсуждаемые участки preMsklp для направления импорта тРЛ1 от vivo. Для этого мы сконструировали несколько мутантных штаммов дрожжей, в каждом из которых reír MSK1 бьш заменен на одну из мутантных версий этого гена (см. рис. 11). Полученные штаммы были проверены на функциональность митохондрий путем исследования возможности их роста па средах, содержащих нссбраживаемыс источники углерода. Это было необходимо, поскольку preMsklp имеет как минимум две функции, связанные с митохондриями: направление импорта тРЛ1 и ами ноаци л и ровани е тРЛЗ в матрнксе митохондрий. Тест на дыхание митохондрий проводился, чтобы проверить, не затронули ли исследуемые делеции функцию аминоацилирования тРЛЗ. Дефект по ами ноаци ли рован ию хотя бы одной митохондрнальной тРНК ведет к частичной или полной остановке траис;[яции и, как следствие, к неспособности усваивать несбраживаемые источники углерода. Мы показали, что ни один из полученных нами штаммов не способен расти на среде с глицерином

(данные не представлены). Этому может быть три объяснения: либо мутантные версии ргсМяк! р не экспресс и руются в клетках дрожжей, либо все делении так или иначе нарушают способность мутантных белков аминоацилироватъ тРЛЗ, либо эти делении делают невозможным импорт тРЛ] в митохондрии. В последнем случае Егеобходимо дополнительно предположить, что митохондрии, не содержащие тРЛ 1, нефункциональны. Чтобы выяснить причину неработоспособности митохондрий мутантных штаммов, .мы провели Вестерн-блот апализ -'штата дрожжевых клеток при помощи антител к ргеШк 1 р. Помимо этого, мы выделили из мутантных штаммов «про-митохондрии» (то есть нефункциональные митохондрии), экстрагировали из них Р!!К и провели Норзерн-блот гибридизацию этих РНК с зондом, комплементарным тРЛ 1. Результаты этих экспериментов представлены на рис. 13.

0 ## * ^

Ш # # А* А*

/ # йГ ^ # / / / / # /

/ / # / / /

тип

тРНКмт[ВД тРЛ2

Норзерн-блот

"I Норзерн-блот

Норзерн-блот

@ргеМ5к1р

Рис 13. Результаты Норзерн-блот гибридизации РНК,

выделенных из «про-митохондрий» мутантных штаммов дрожжей, с зондами, ком пиементарным и

тРЛ1, митохочдрчаньн о и пейциновой тРНК и тРЛ2. Результаты Вестерн-блот гибридизации

пизатчв клеток

мутантных штаммов с антителами кргеШк1р.

бестерн-блсгг

Прежде всего, необходимо отмстить, что результаты Вестерн-блот гибридизации наглядно демонстрируют экспрессию всех мутантных белков в клетках соответствющих штамме и дрожжей.

Анализируя результаты Норзерн-блот гибридизации, нужно, а первую очередь, отмстить, что митохондриалыше гРНК в данных препаратах отсутствуют. Это лишний раз свидетельствует о том, что митохондрии данных штаммов нефункциональны. Однако, в случае штамма с белком ртеМакД(Н 1 -НЗ) тРЛ1 присутствует в «про-митохоадриях», (Это подтверждает результаты исследований ¡н шго). Отсюда можно сделать нывод, что в случае

этого штамма причина неспособности митохоидрий усваивать несбраживаемые источники углерода кроется в невозможности мутантпого белка аминоацилировать тРЛЗ. Таким образом, можно констатировать, что тРЛ1 неспособна функционально заместить тРЛЗ в митохоидриальной трансляции. Что же касается остальных мутантных штаммов, то в их случае остается два возможных объяснения неработоспособности их митохондрий: или все делеции нарушают аминоацилирование мутантпыми белками тРЛЗ, или же тРЛ1 (которая не импортируется в митохондрии этих штаммов) играет какую-либо важнейшую биологическую роль в митохондриальном матриксе.

Итак, в ходе данной работы мы получили несколько штаммов дрожжей, в которых тРЛ1 не импортируется в митохондрии. Все эти штаммы содержат нефункциональные органеллы. Однако, к сожалению, мы не может утверждать, что отсутствие митохондриалыгого дыхания является следствием только лишь остановки импорта тРЛ1. Возможно, мутантные версии preMsklp не способны также аминоацилировать тРЛЗ в матриксе митохондрий. В связи с этим, мы поставили перед собой цель получить штамм дрожжей, в котором аминоацилирование тРЛЗ проходило бы эффективно, но импорт тРЛ1 в митохондрии отсутствовал бы. Для этого мы заменили ген MSK1 в клетакх пекарских дрожжей на ген предшественника митохоидриальной лизил-тРНК-синтетазы флагеллярных дрожжей Ashbya gossypii (далее - AshRS). Мы выбрали именно этот организм, поскольку при выравнивании аминокислотных последовательностей preMsklp и AshRS обнаружилось, что N-концевые домены этих белков значительно отличаются друг от друга, тогда как их С-концевые домены очень похожи. Отсюда можно предположить, что AshRS будет способен аминоацилировать тРЛЗ в митохондриальном матриксе, но, возможно, окажется некомпетентен в направлении импорта тРЛ1, тем более, что все три лизиновых тРНК Ashbya gossypii очень сильно схожи с тРЛ1, тРЛ2 и тРЛЗ, соответственно.

Мы создали генно-инженерную конструкцию, в которой ген AshRS был клонирован в вектор pRS313. Помимо этого, мы получили генно-инженерную конструкцию для экспрессии N-концевого домена preMsklp в клетках дрожжей. Это было сделано для того, чтобы добавлением этой плазмиды восстановить импорт тРЛ1 в случае, если AshRS не будет способна его направлять. Но сначала требовалось проверить, действительно ли N-концевой домен preMsklp способен обеспечивать импорт тРЛ1 in vivo. Мы заменили в клетках дрожжей ген preMsklp дикого типа на ген, кодирующий только его N-концевой домен, выделили из клеток получившегося штамма «про-митохондрии» и проверили наличие в них тРЛ1 методом Норзерн-блот гибридизации. Результаты этих экспериментов представлены на рис. 14.

é

y'-.i Г\ ■

Jt-'

J y

Рис, 14. Результаты Иорзерн-блот _пп А гибридизации РНК, выделенных из «про-

митохондрий» мутантных штаммов дрожжей, с зондами, комплементарными тРЛ1, ТРНК ШеЙ) митохондриальной пейциновой тРНКи ЭДТ тРЛ2. №АМ - штамм с делецией гена

ргеММр в геноме, рМЯ5 - плазмида рЛ5313, несущая ген ргеМь'к1р дикого ТРЛ2 типа, - плазмида. несущая ген Ь1-

концевого домена ргеШЫр,

Действительно, N-кокцевой домен preMsk'p экспрессируется в клегках дрожжей и способен направлять импорт tPJII в митохондрии in vivo. Таким образом, плазм иду, несущую этот белок, можно использовать в качестве «спасителя» фенотипического эффекта отсутствия тРЛ1 в митохондриях (если он вообще имеет место). При этом в клетках штамма дрожжей с делецией гена preMsklp импорта тРЛ1 не наблюдается. Также результаты данного эксперимента подтверждают ранее сделанное наблюдение о том, что т?Л1 ис способна функционально замещать тРЛЗ в митохондриях (то есть, считывать кодоны АЛА при митохондриадьной трансляции).

После этого мы проверили способность расти на средах с глицерином, этанолом, или лактатом клеток штаммов дрожжей, содержащих либо только ген AshRS, либо ген AshRS и ген N-концсвого домена preMsklp, в составе шгазмид. Эксперимент проводился при двух температурах - 30°С и 37°С. Результаты этого опыта приведены на рис. 15.

зос j з?с

YPGly

YPD

Рис. 15, Результаты роста мутантных штаммов дрожжей на средах с глюкозой (УРО) и с глицерином (УРО!у) при 30°С или при 37°С. Клетки высевались на чашки в трех разведениях (сверху вниз): 0.1, 0.01 и 0.001 единиц оптической плотности при 600 нм. Обозначения: (УАМ- штамм №'303 с делецией генаргеШк!р в геноме, рАзЬВ& -плазмида, несущая ген предшественника мит охондриаяьной лизил-тРНК-син те тазы АзЬЬуа&ЩУРИ^рМЙЗ- плазмида, несущая ген Н-концевого домена ргеМзк1р.

Как видно из рисунка, при 30°С рост дрожжей на среде с глицерином не нарушается при замене гена preMsklp на ген AshRS. Это говорит о том, что AshRS способна амнноацилировать тРЛЗ ггри этой температуре. Добавление N-концевого домена preMsklp не оказывает значительного влияния на скорость роста. Однако, на 37°С клетки штамма WAM(pAshRS) растут значительно медленнее, чем клетки дикого типа. При этом скорость роста восстанавливается до нормальной с добавлением N-концевого домена preMsklp. Этому явлению может быть два объяснения. Возможно, AshRS действительно не способен направлять импорт тРЛ1 в митохондрии, и при 37°С ее отсутствие в митохондриальном матриксе делает нормальное функционирование митохондрий невозможным. Однако, существует и другое объяснение - AshRS неэффективно аминоацилирует тРЛЗ при 37°С, и добавление N-концевого домена preMsklp каким-то образом способствует аминоацилированию. Мы проверили уровень аминоацилированпости тРЛЗ в митохондриях мутангных штаммов и обнаружили, что он немного меньше, чем в клетках диког о типа, но не восстанавливается до нормального добавлением N-концевою домена preMsklp (данные не представлены), С другой стороны, тРЛ1 действительно отсутствует в митохондриях клеток, содержащих AshRS, и добавление N-концевого домена preMsklp восстанавливает этот дефект (см. рис. 16).

Рис. 16. Результаты Норзерн-блот гибридизации РНК. выделенных из митохондрий мутантных штамм/к дрожжей, росших при 30°С или при 37°С, с зондами, комплементарными тРШ, мытохондриапьной

лейцичовой тРНК и mPJ12. Количество тРЛ! в

митохондриях было

нормализовано относительно коли чества м итохондриачьн ых тРНК.

AshRS действительно не способен направлять импорт тРЛ1 в митохондрии, и этот факт является причиной нарушений митохондрнального дыхания (выражающихся в замедленном росте на среде с несбраживаемыми источниками углерода). При этом необходимо отметить, что тРЛ необходима для нормального функционирования митохондрий только при повышенной температуре роста клеток (37°С), тогда как при нормаль ной температуре (30°С) митохондрии клеток мутантного штамма сохраняют свою функциональность и без тРЛ1.

зос I ' 37С

тРЛ1

тРНКмт(Лей)ц

тРЛ!

I I I I

Какова же функция тРЛ1 в митохондриальном матряксе? Логично было бы предположить, что эта тРНК необходима для участия в митохондриальной трансляции. I [рямого доказательства участия тРЛ1 в м итохондри ал ьной трансляции до сих пор получено не было. Митохондриальный геном пекарских дрожжей кодирует всего 8 белков. Мы Провели анализ последовательностей мРНК, Кодирующих эти белки, и обнаружили, что всего лишь два ич них содержа! кодоны АЛО (которые должна распознавать тРЛ1): в мРНК белка \"аг1р два таких кодона, а в мРНК белка Сох2р - всего один. Мы провели электрофоретическое разделение продуктов митохондриальной трансляции исследуемых штаммов, росших при двух различных температурах. Результаты этого эксперимента представленье на рис. 17.

ЗОС

37С

Г г #

Весгврн-блот

/ //'

//// и

»22

( УаПр

% Щ '"—Сох1 р

[4 Сох2р

А» 4

Щ (я1р«чаа«1й; (.«рдомммг □ •да. «а» не

III I. I

Рис ¡7. Радиоавтограф

ектрофорети ческого разделения

мипюхондриалъных белков мутантиых штаммов, меченных J \S-Mem ионии ом. Результаты Вестерн-блот гибридизации

митохондриальных белков с антителами к Сох2р и к Су! Ь,

Итак, если клетки мугантных штаммов росли при 30°С, никаких изменений (как качественных, так и количественных) в картине митохолдриаяьной трансляции не наблюдается. Однако, при 37°С и клетках штамма дрожжей, содержащих ген АзЬГ<5 вместо гена prcM.sk! р, имеют место дефекты в митохондриальной трансляции. Во-первых, можно видеть значительное уменьшение (примерно в 2 раза по сравнению с диким типом) количества белков \'аг1р и Сох2р, то есть именно тех белков, в которых присутствуют кодоны для распознавания тРЛ 1. Во-вторых, наблюдается снижение общего уровня

трансляции, что может быть связано с недостаточным количеством митохондриальных матураз (в генах которых кодоны AAG присутствуют во множестве). Таким образом, можно заключить, что при 30°С тРЛЗ успешно заменяет тРЛ1 в митохондриальной трансляции, тогда как при 37°С этого почему-то не происходит, и количество митохондриальных белков, для трансляции которых необходима тРЛ1, заметно снижается. Результатом этого является ослабленное дыхание митохондрий и замедленный рост на средах с несбраживаемыми источниками углерода. Итак, функция тРЛ1 в митохондриальпом матриксе заключается в участии в митохондриальной трансляции при повышенных температурах.

Следующий вопрос, который встал перед нами, был вопросом о причинах неэффктивности тРЛЗ в считывании кодонов AAG при 37°С. Считается, что 5-метиламинометил-2-тио-модификация уридина в положении 34 (первом положении антикодона) тРЛЗ способствует узнаванию этой тРНК кодона AAG. Мы предположили, что при 37°С тРЛЗ становится гипомодифицированной по этому положению. Это можно проверить при помощи реакции удлиннения праймера (primer extension). Указанная модификация останавливает амплификацию ДНК в реакции обратной транскрипции на тРЛЗ по причине стерических затруднений, в то время как при отсутствии модификации, очевидно, амплификация не остановится. Мы выделили РНК из клеток разных штаммов, росших при различных температурах, и проанализировали препараты РНК в реакции удлиннения праймера с использованием дидезоксицитозина (чтобы остановить реакцию на

Рис. 18. Схема эксперимента по удлиннепию праймера. Исследуемая модификация в тРЛЗ отмечена звездочкой, первый гуанозип на пути удлиннения праймера - двумя звездочками. Именно на этом гуанозипе остановится реакция в случае отсутствия модификации уридина в положении 34, так как в реакционную смесь

добавляется дидезоксицитозин (длина продукта составит 25 нуклеотидов). В случае присутствия этой

модификации реакция

"p-TCCAAGCATGGGTTCC 16 олигоиутавотад остановится на уридине в

3îP-TC«A£»œGGTTGCttaa* 20 остановка та нукл, 34 ¥ положении 34 (длина продукта

32p-rcCAASCATGSGTTGCttaaaaffa(ddc) 25 нет остановки 20 нуклеотидов).

первом гуанозине, см. рис. ioj.

Результаты этого эксперимента представлены на рис, 19.

& Г Л, & 4у к4

отноинлышй уронена

Рис. 19. Радиоавтограф электрофорет и чес кого разделения продуктов

удлиняемая праймера в реакции обратной

транскрипции на

общеклеточной РНК

дрожжей и на Т7-транскрипте гена тРЛЗ.

Видно, что ири 30°С реакция останавливается на 34 нуклеотилс. Это можно объяснить только присутствием модификации, которая делает дальнейшее удлинненис цепи невозможным. Однако при 37°С реакция останавливается не полностью. По всей видимости, часть молекул тРЛЗ действительно не содержит вышеописанной модификации, следствием чего является продолжение удлинивши праймера и остановка реакции на первом гуанозине (поскольку в смеси присутствует дидезоксипнтозин).

Однако, требовалось еще показать, что обнаруженный нами эффект гипомодифицироватшости тРЛЗ является специфическим для нее (так как если бы это было не гак, что мы не наблюдали бы такого избирательного эффекта на митохондриадьную трансляцию). Дрожжевые митохондрии содержат еще одну тРНК, имеющую точно такую же модификацию уркдкна в положении 34 - иейциновую тРНК (рис. 56). Мы провели аналогичные эксперименты для этой тРНК и обнаружили, что при 37°С она не гипомодифицирована (данные не представлены). Таким образом, можно говорить об специфической модификации тРЛЗ.

выводы

1. Только те тРНК, которые способны образовывать стабильный комплекс с предшественником митохондриальной лизил-тРНК-синтетазы (preMsklp), импортируются в изолированные митохондрии дрожжей. Константа диссоциации таких комплексов составляет 180-250 нМ. Присутствие енолазы снижает константу дисоциации до 40 нМ.

2. Комплекс импортируемой лизиновой тРНК (tPJII) с цитоплазматической лизил-тРНК-синтетазой организован как типичный комплекс аминоацил-тРНК-синтетазы класса 26 с соответствующей тРНК, образование которого ведет к аминоацилированию. Комплекс тРЛ1 с preMsklp организован совершенно иначе: в этом комплексе подавляющее большинство нуклеотидов тРНК экранированы белком.

3. N-концевой домен preMsklp специфически направляет импорт тРНК в митохондрии дрожжей in vitro и in vivo и взаимодействует с тРЛ1 таким же образом, что и полноразмерный белок.

Участок preMsklp, определяющий специфический импорт тРНК в митохондрии, ограничен a-спиралями Н5 и Нб.

4. тРЛ1 участвует в митохондриальной трансляции. При 30°С митохондриальная лизиновая тРНК (с антикодоном UUU) полностью заменяет в этом процессе тРЛ1 (с антикодоном CUU), тогда как при 37°С митохондриальная лизиновая тРНК гипомодифицирована по U34 и неэффективно считывает кодоны AAG. Поэтому при данной температуре тРЛ1 необходима для нормального функционирования митохондрий.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

1. Mager-Heckel А.-М., Entelis N., Brandina 1., Kamenski P., Krasheninmkov I.A., Martin R.P., Tarassov I. (2007) The analysis of tRNA import into mammalian mitochondria. Methods Mol Biol, 372,235-253.

2. Каменский П.А., Виноградова E.B., Крашенинников И.А., Тарасов И.А. (2007) Направленный импорт макромолекул в митохондрии. Молек. биология, 41(2), 216-233.

3. Entelis N., Brandina I., Kamenski P., Krasheninnikov I.A., Martin R.P., Tarassov I. (2006) A glycolytic enzyme, enolase, is recruited as a cofactor of tRNA targeting toward mitochondria in Saccharomyces cerevisiae. Genes Dev, 20(12), 1609-1620.

4. Entelis N., Kolesnikova O., Kazakova H., Brandina I., Kamcnski P., Martin R.P., Tarassov I. (2002) Import of nuclear-encoded RNAs into yeast and human mitochondria: experimental approaches and possible biomedical applications. Genetic Engeneering: Principles and Methods, 24,191-213.

Тезисы

1. Kamcnski P., Entelis N., Jubenot V., Krasheninnikov I.A., Martin R.P., Tarassov l.A. The role of the precursor of mitochondrial lysyl-tRNA synthetase in tRNA import into yeast mitochondria (2006) Abstracts of 7th Conference "Lévures: Modèles et Outils", Paris, France, p.88.

2. Kamcnski P., Entelis N., Krasheninnikov I.A., Martin R.P., Tarassov l.A. Study of the mechanism of tRNA-LysRS interaction leading to tRNA import into yeast mitochondria (2005) Abstracts of the 21th Iternational tRNA Workshop, Bangalore, India, p. 128.

3. Каменский П.А., Крашенинников И.А. (2004) Неканоническое взаимодействие предшественника митохондриальной лизил-тРНК-синтетазы дрожжей с цитоплазматической импортируемой лизиновой тРНК. Тезисы докладов XI международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2004», секция «Биология», стр. 57.

4. Kamenski P., Entelis N., Krasheninnikov I.A., Martin R.P., Tarassov l.A. (2003) Studying RNA-protein interactions leading to import of a cytoplasmic tRNA into yeast mitochondria. Abstracts of the 8th Annual Meeting of the RNA Society, Vienna, Austria, p. 215.

5. Каменский П.А. (2001) Исследование предшественника митохондриальной лизил-тРНК-сиктетазы как фактора импорта тРНК в митохондрии дрожжей. Материалы международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов», выпуск 6, стр. 22.

Подписано в печать 15.02.2007 Формат 60x88 1/16. Объем 1.5 п.л. Тираж 75 экз. Заказ № 605 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119992 г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к. А-102

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Каменский, Петр Андреевич

Список используемых сокращений.

1. Введение.

2. Обзор литературы. Импорт макромолекул в митохондрии.

2.1. Импорт белков в митохондрии.

2.1.1. Сигнальные последовательности импортируемых белков.

2.1.2. Претранслокационное разворачивание предшественников митохондриаль-ных белков и их транспорт к митохондриалыюй поверхности.

2.1.3. Транслокационный комплекс внешней митохондриалыюй мембраны (ТОМ).

2.1.4. Встраивание белков во внешнюю мембрану митохондрий при помощи БАМ-комплекса.

2.1.5. Импорт белков в межмембранное пространство митохондрий.

2.1.6. Транслокационный комплекс внутренней митохондриалыюй мембраны Т1М23 и мотор транслокации.

2.1.7. Транслокационный комплекс внутренней митохондриалыюй мембраны Т1М22 и малые Тт-белки межмембранного пространства.

2.1.8. Экспорт белков из митохондриального матрикса.

2.2. Импорт РНК в митохондрии.

2.2.1. Импорт тРНК в митохондрии простейших.

2.2.2. Импорт тРНК в митохондрии растений.

2.2.3. Импорт тРНК в митохондрии дрожжей.

2.2.4. Импорт РНК в митохондрии млекопитающих.

2.3. Импорт ДНК в митохондрии.

3. Материалы и методы исследования.

3.1. Материалы.

3.1.1. Реактивы.

3.1.2. Коммерческие наборы.

3.1.3. Антитела.

3.1.4. Приборы и оборудование.

3.1.5. Штаммы микроорганизмов.

3.1.6. Питательные среды.

3.1.7. Генно-инженерные конструкции.

3.1.8. Олигонуклеотиды.

3.2. Методы.

3.2.1. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

3.2.2. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции и дефосфо-рилирование.

3.2.3. Лигирование.

3.2.4. Определение нуклеотидной последовательности ДНК методом Сэнгера.

3.2.5. Трансформация клеток E.coli.

3.2.6. Трансформация клеток Saccharomyces cerevisiae.

3.2.7. Определение фенотипов штаммов дрожжей S. cerevisiae.

3.2.8. Измерение поглощения кислорода клетками.

3.2.9. Исключение плазмиды, содержащей маркер URA3, из дрожжевых клеток.

3.2.10. Выделение ДНК из клеток дрожжей.

3.2.11. Выделение митохондрий из клеток дрожжей.

3.2.12. Выделение дрожжевых митохондриальных РНК.

3.2.13. Выделение суммарных дрожжевых тРНК в аминоацилированном состоянии.

3.2.14. Нозерн-блот гибридизация.

3.2.15. In vitro Т7-транскрипция.

3.2.16. Радиоактивное мечение тРНК.

3.2.17. Экспрессия рекомбинантных белков в клетках E.coli.

3.2.18. Очистка рекомбинантных белков методом аффинной хроматографии на колонках с никель-агарозой.

3.2.19. Вестерн-блот гибридизация.

3.2.20. Выделение белкового препарата, способного направлять импорт тРНК в изолированные митохондрии дрожжей.

3.2.21. Транспорт радиоактивно меченных тРНК в изолированные митохондрии дрожжей.

3.2.22. Митохондриальная трансляция in vivo.

3.2.23. Метод задержки в геле.

3.2.24. Футпринтинг.

4. Результаты и обсуждение.

4.1. Образование РНК-белкового комплекса, приводящего к импорту тРНК в митохондрии дрожжей.

4.2. Изучение структуры РНК-белкового комплекса, приводящего к импорту тРНК в митохондрии, методом футпринтинга.

4.3. Поиск участков ргеМзк1р, необходимых для направления импорта тРНК в митохондрии.

4.4. Создание штамма дрожжей, в котором тРЛ1 не импортировалась бы в митохондрии, и изучение фенотипического эффекта такого дефекта.

Выводы.

Благодарности.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Импорт тРНК в митохондрии дрожжей: роль предшественника митохондриальной лизил-тРНК-синтетазы и функция импортируемой тРНК в митохондриальном матриксе"

Митохондрии - это многофункциональные органеллы эукариотических клеток, обеспечивающие клетки энергией за счет окислительного фосфорилирования, участвующие в образовании железосерных кластеров, окислении жирных кислот, образовании некоторых аминокислот, а также играющие важную роль в апоптозе. Для митохондрий характерно наличие собственной ДНК и системы биосинтеза белка, однако большое число макромолекул импортируется в органеллы из цитоплазмы. Было показано, что в ряде случаев в митохондрии транспортируются не только белки, но также и тРНК. К настоящему времени импорт тРНК в митохондрии был обнаружен у простейших, ряда растений, сумчатых млекопитающих, а также у почкующихся дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Механизм переноса тРНК в митохондрии и его специфичность значительно отличается от вида к виду.

В случае дрожжей было показано, что из цитоплазмы в митохондрии импортируется два вида тРНК - тРНКЛизСии (Martin et al. 1979) и тРНКГлн (Rinehart et al. 2005). Детальные механизмы импорта тРНК, а также функции импортируемой тРНК в митохондриалыюм матриксе, остаются неясными. Импорт тРНК является высокоспецифичным процессом, так как одна из двух изоакцепторных лизиновых тРНК (тРНКЛизсии, далее тРЛ1) направляется в митохондрии дрожжей, в то время как вторая (тРНКЛизиии> тРЛ2) присутствует только в цитоплазме. Такое различие в локализации довольно близких тРНК может быть объяснено отличиями в структуре этих тРНК (Entelis et al. 1998). Помимо этого, в нашей лаборатории было показано участие трех растворимых цитоплазматических белков в импорте тРЛ1 в митохондрии. Прежде всего, тРЛ1 должна быть аминоацилирована с помощью цитоплазматической лизил-тРНК-синтетазы, затем необходимо ее взаимодействие с предшественником митохондриалыюй лизил-тРНК-синтетазы (preMsklp) (Tarassov et al. 1995b). Предполагается, что тРЛ1 импортируется в митохондрии, будучи связанной с этим белком. Однако присутствия аминоацилированной тРЛ1 и preMsklp не достаточно для импорта тРЛ1 в митохондрии, что говорит о необходимости дополнительных белковых факторов, направляющих ее импорт, так называемых факторов импорта. Один из таких факторов был недавно охарактеризован как гликолитический фермент енолаза (Entelis et al. 2006). Роль этого белка в процессе импорта тРНК в митохондрии остается неясной.

Вопрос о функции tPJII в митохондриальном матриксе к настоящему моменту остается открытым. Существует предположение, что тРЛ1 принимает участие в митохоидриальной трансляции. Однако, эта гипотеза подтверждена только косвенными экспериментами (Kolesnikova et al. 2000). Более того, митохондриальная лизиновая тРНК дрожжей (с антикодоном cmnmsUUU, далее тРЛЗ) способна узнавать оба лизиновых кодона (AAA и AAG) в процессе митохондриалыюй трансляции.

Целью данной работы являлось изучение формирования комплекса между тРЛ1 и preMsklp, и с использованием полученных данных, создание штамма дрожжей, в котором тРЛ1 присутствовала бы исключительно в цитоплазме, и изучение фенотипического эффекта отсутствия тРЛ1 в митохондриях.

Для достижения поставленных целей были сформулированы следующие экспериментальные задачи:

- оценить константу диссоциации комплекса тРЛ1-preMsklp в отсутствии и присутствии енолазы 2;

- определить, какие нуклеотиды тРЛ1 становятся защищенными от действия нуклеаз в результате взаимодействия с preMsklp;

- оцепить эффективность импорта тРЛ1, направляемого различными мутантными версиями preMsklp in vitro и in vivo;

- в случае невозможности направления импорта тРЛ1 той или иной мутантной версией preMsklp, оценить эффективность митохондриального дыхания и митохондриалыюй трансляции в клетках штамма дрожжей с соответствующей мутантной версией preMsklp;

- оценить эффективность митохондриального дыхания и митохондриалыюй трансляции в клетках штамма дрожжей, в которых геи preMsklp заменен на ортологичный ген грибов Ashbya gossypii.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Каменский, Петр Андреевич

5. ВЫВОДЫ

1. Только те тРНК, которые способны образовывать стабильный комплекс с предшественником митохондриалыюй лизил-тРНК-синтетазы (preMsklp), импортируются в изолированные митохондрии дрожжей. Константа диссоциации таких комплексов составляет 180-250 нМ. Присутствие енолазы снижает константу диссоциации до 40 нМ.

2. Комплекс импортируемой лизиновой тРНК (тРЛ1) с цитоплазматической лизил-тРНК-синтетазой организован как типичный комплекс аминоацил-тРНК-синтетазы класса НЬ с соответствующей тРНК, образование которого ведет к аминоацилированию. Комплекс тРЛ1 с preMsklp организован совершенно иначе: в этом комплексе подавляющее большинство нуклеотидов тРНК экранированы белком.

3. N-концевой домен preMsklp специфически направляет импорт тРНК в митохондрии дрожжей in vitro и in vivo и взаимодействует с тРЛ1 таким же образом, что и полноразмерный белок.

Участок preMsklp, определяющий специфический импорт тРНК в митохондрии, ограничен a-спиралями Н5 и Н6. Участки preMsklp, ограниченные a-спиралями Н5 и Н6 и a-спиралями HI и НЗ, необходимы для аминоацилирования зрелым белком митохондриальной лизиновой тРНК.

4. тРЛ1 участвует в митохондриальной трансляции. При 30°С митохондриальная лизиповая тРНК (с антикодоном UUU) полностью заменяет в этом процессе тРЛ1 (с антикодоном CUU), тогда как при 37°С митохондриальная лизиновая тРНК гипомодифицирована по U34 и неэффективно считывает кодоны AAG. Поэтому при данной температуре тРЛ1 необходима для нормального функционирования митохондрий.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор считает своим долгом выразить глубочайшую признательность и огромную благодарность своим научным руководителям, Игорю Александровичу Крашенинникову и Ивану Тарасову. Они всемерно помогали мне при постановке экспериментов, интерпретации результатов и написании статей и диссертации. Более того, по прошествии семи лет совместной работы я смело могу назвать их своими друзьями, с которыми мне всегда очень интересно проводить время и которые не раз приходили мне на помощь в трудную минуту. Эти же слова я хотел бы адресовать своим коллегам, Нине Энтелис, Робэру Мартэну и Ольге Колесниковой, без помощи и поддержки которых эта работа никогда не была бы сделана. Я очень признателен Ирине Брандиной, Ольге Каричевой и Александру Смирнову, которые, в числе прочих, создали в нашей лаборатории идеальный климат для приятной и эффективной работы. Я благодарю также студентов, делавших курсовые и дипломные работы (или их французские аналоги) в нашей лаборатории - Алину Корбут, Эстель Пфистер, Сэми Догана и Ванессу Жубено. Часть этой работы была сделана при их непосредственном участии. Я также хотел бы поблагодарить ученых, которые любезно делились со мной генно-инженерными конструкциями, антителами и методиками: Сильви Фриан, Убера Беккера, Александера Цаголофф, Хайке Ланг и Роланда Лилля. Я очень признателен коллективу кафедры молекулярной биологии за полученное мной великолепное образование. Также хотелось бы поблагодарить коллектив лаборатории молекулярной генетики, геномики и микробиологии Университета Луи Пастера, Страсбург, Франция, и в особенности - Анн-Мари Экель и Кати Рейбель, за помощь в работе и доброжелательное отношение. И в заключение я благодарю своих родителей и свою жену за все то, что они для меня сделали и продолжают делать.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Каменский, Петр Андреевич, Москва

1. Abe, Y., Shodai, T., Muto, T., Mihara, K., Torii, H., Nishikawa, S., Endo, T., and Kohda, D. 2000. Structural basis of presequence recognition by the mitochondrial protein import receptor Tom20. Cell 100(5): 551-560.

2. Adam, A., Endres, M., Sirrenberg, C., Lottspeich, F., Neupert, W., and Brunner, M. 1999. Tim9, a new component of the TIM22.54 translocase in mitochondria. Embo J 18(2): 313-319.

3. Ades, I.Z. and Butow, R.A. 1980. The products of mitochondria-bound cytoplasmic polysomes in yeast. J Biol Chem 255(20): 9918-9924.

4. Ahmed, A.U., Beech, P.L., Lay, S.T., Gilson, P.R., and Fisher, P.R. 2006. Import-Associated Translational Inhibition: Novel In Vivo Evidence for Cotranslational Protein Import into Dictyostelium discoideum Mitochondria. Eukaryot Cell 5(8): 1314-1327.

5. Akashi, K., Hirayama, J., Takenaka, M., Yamaoka, S., Suyama, Y., Fukuzawa, H., and Ohyama, K. 1997, Accumulation of nuclear-encoded tRNA(Thr) (AGU) in mitochondria of the liverwort Marchantia polymorpha. Biochim Biophys Acta 1350(3): 262-266.

6. Barrientos, A., Korr, D., and Tzagoloff, A. 2002. Shylp is necessary for full expression of mitochondrial COX1 in the yeast model of Leigh's syndrome. Embo J 21(1-2): 43-52.

7. Beddoe, T. and Lithgow, T. 2002. Delivery of nascent polypeptides to the mitochondrial surface. Biochim Biophys Acta 1592(1): 35-39.

8. Bhattacharyya, S.N. and Adhya, S. 2004. tRNA-triggered ATP hydrolysis and generation of membrane potential by the leishmania mitochondrial tRNA import complex. J Biol Chem 279(12): 11259-11263.

9. Bhattacharyya, S.N., Chatteijee, S., and Adhya, S. 2002. Mitochondrial RNA import in Leishmania tropica: aptamers homologous to multiple tRNA domains that interact cooperatively or antagonistically at the inner membrane. Mol Cell Biol 22(12): 43724382.

10. Bonnefoy, N., Chalvet, F., Hamel, P., Slonimski, P.P., and Dujardin, G. 1994. OXA1, a Saccharomyces cerevisiae nuclear gene whose sequence is conserved from prokaryotes to eukaryotes controls cytochrome oxidase biogenesis. J Mol Biol 239(2): 201-212.

11. Broadley, S.A., Demlow, C.M., and Fox, T.D. 2001. Peripheral mitochondrial inner membrane protein, Mss2p, required for export of the mitochondrially coded Cox2p C tail in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol 21(22): 7663-7672.

12. Brunei, C. and Romby, P. 2000. Probing RNA structure and RNA-ligand complexes with chemical probes In Process Citation. Methods Enzymol 318: 3-21.

13. Cavarelli, J., Rees, B., Ruff, M., Thierry, J.C., and Moras, D. 1993. Yeast tRNA(Asp) recognition by its cognate class II aminoacyl-tRNA synthetase. Nature 362(6416): 181-184.

14. Chang, D.D. and Clayton, D.A. 1987. A novel endoribonuclease cleaves at a priming site of mouse mitochondrial DNA replication. Embo J 6(2): 409-417.

15. Chatterjee, S., Home, P., Mukherjee, S., Mahata, B., Goswami, S., Dhar, G., and Adhya, S. 2006. An RNA-binding respiratory component mediates import of type II tRNAs into Leishmania mitochondria. J Biol Chem 281(35): 25270-25277.

16. Chen, D.H., Shi, X., and Suyama, Y. 1994. In vivo expression and mitochondrial import of normal and mutated tRNA(thr) in Leishmania. Mol Biochem Parasitol 64(1): 121-133.

17. Crausaz Esseiva, A., Marechal-Drouard, L., Cosset, A., and Schneider, A. 2004. The T-stem determines the cytosolic or mitochondrial localization of trypanosomal tRNAsMet. Mol Biol Cell 15(6): 2750-2757.

18. Curran, S.P., Leuenberger, D., Oppliger, W., and Koehler, C.M. 2002. The Tim9p-TimlOp complex binds to the transmembrane domains of the ADP/ATP carrier. EmboJ21(5): 942-953.

19. D'Silva, P.D., Schilke, B., Walter, W., Andrew, A., and Craig, E.A. 2003. J protein cochaperone of the mitochondrial inner membrane required for protein import into the mitochondrial matrix. P roc Natl Acad Sci USA 100(24): 13839-13844.

20. Davis, A.J., Alder, N.N., Jensen, R.E., and Johnson, A.E. 2006. The Tim9p/10p and Tim8p/13p Complexes Bind to Specific Sites on Tim23p during Mitochondrial Protein Import. Mol Biol Cell.

21. Davis, A.J., Sepuri, N.B., Holder, J., Johnson, A.E., and Jensen, R.E. 2000. Two intermembrane space TIM complexes interact with different domains of Tim23p during its import into mitochondria. J Cell Biol 150(6): 1271-1282.

22. Dekker, P.J., Ryan, M.T., Brix, J., Muller, H., Honlinger, A., and Pfanner, N. 1998. Preprotein translocase of the outer mitochondrial membrane: molecular dissection and assembly of the general import pore complex. Mol Cell Biol 18(11): 6515-6524,

23. Delage, L., Duchene, A.M., Zaepfel, M., and Marechal-Drouard, L. 2003a. The anticodon and the D-domain sequences are essential determinants for plant cytosolic tRNAVal import into mitochondria. Plant ./34(5): 623-633.

24. Delage, L., Dietrich, A., Cosset, A., and Marechal-Drouard, L. 2003b. In vitro import of a nuclearly encoded tRNA into mitochondria of Solanum tuberosum. Mol Cell Biol 23(11): 4000-4012.

25. Dietmeier, K., Honlinger, A., Bomer, U., Dekker, P.J., Eckerskorn, C., Lottspeich, F., Kubrich, M., and Pfanner, N. 1997. Tom5 functionally links mitochondrial preprotein receptors to the general import pore. Nature 388(6638): 195-200.

26. Dietrich, A., Marechal-Drouard, L., Carneiro, V., Cosset, A., and Small, I. 1996. A single base change prevents import of cytosolic tRNA(Ala) into mitochondria in transgenic plants. Plant ^ 10(5): 913-918.

27. Dietrich, A., Small, I., Cosset, A., Weil, J.H., and Marechal-Drouard, L. 1996. Editing and import: strategies for providing plant mitochondria with a complete set of functional transfer RNAs. Biochimie 78(6): 518-529.

28. Dietrich, A,, Weil, J.H., and Marechal-Drouard, L. 1992. Nuclear-encoded transfer RNAs in plant mitochondria. Annu Rev Cell Biol 8: 115-131.

29. Doersen, C.J., Guerrier-Takada, C., Altman, S., and Attardi, G. 1985. Characterization of an RNase P activity from HeLa cell mitochondria. Comparison with the cytosol RNase P activity. J Biol Chem 260(10): 5942-5949.

30. Donzeau, M., Kaldi, K., Adam, A., Paschen, S., Wanner, G., Guiard, B., Bauer, M.F., Neupert, W., and Brunner, M. 2000. Tim23 links the inner and outer mitochondrial membranes. Cell 101(4): 401-412.

31. Dorner, M., Altmann, M., Paabo, S., and Mori, M. 2001. Evidence for Import of a Lysyl-tRNA into Marsupial Mitochondria. Mol Biol Cell 12(9): 2688-2698.

32. Eilers, M., Hwang, S., and Schatz, G. 1988. Unfolding and refolding of a purified precursor protein during import into isolated mitochondria. Embo J 7(4): 1139-1145.

33. Entelis, N., Brandina, I., Kamenski, P., Krasheninnikov, I.A., Martin, R.P., and Tarassov, I. 2006. A glycolytic enzyme, enolase, is recruited as a cofactor of tRNA targeting toward mitochondria in Saccharomyces cerevisiae. Genes Dcv 20: 16091620.

34. Entelis, N.S., Kieffer, S., Kolesnikova, O.A., Martin, R.P., and Tarassov, I.A. 1998. Structural requirements of tRNALys for its import into yeast mitochondria. Proc Natl Acad Sci USA 95(6): 2838-2843.

35. Entelis, N.S., Kolesnikova, O.A., Dogan, S., Martin, R.P., and Tarassov, I.A. 2001. 5 S rRNA and tRNA Import into Human Mitochondria. Comparison of in vitro requirements. J Biol Chem 276(49): 45642-45653.

36. Entelis, N.S., Krasheninnikov, I.A., Martin, R.P., and Tarassov, I.A. 1996. Mitochondrial import of a yeast cytoplasmic tRNA (Lys): possible roles of aminoacylation and modified nucleosides in subcellular partitioning. FEBS Lett 384(1): 38-42.

37. Esseiva, A.C., Naguleswaran, A., Hemphill, A., and Schneider, A. 2004. Mitochondrial tRNA import in Toxoplasma gondii. J Biol Chem 279(41): 4236342368.

38. Fan, A.C., Bhangoo, M.K., and Young, J.C. 2006. Hsp90 functions in the targeting and outer membrane translocation steps of Tom70-mediated mitochondrial import. J Biol Chem 281(44): 33313-33324.

39. Foury, F., Roganti, T., Lecrenier, N., and Purnelle, B. 1998. The complete sequence of the mitochondrial genome of Saccharomyces cerevisiae. FEBS Lett 440(3): 325331.

40. Francin, M., Kaminska, M., Kerjan, P., and Mirande, M. 2002. The N-terminal domain of mammalian Lysyl-tRNA synthetase is a functional tRNA-binding domain. J Biol Chem 277(3): 1762-1769.

41. Fujiki, M. and Verner, K. 1993. Coupling of cytosolic protein synthesis and mitochondrial protein import in yeast. Evidence for cotranslational import in vivo. J Biol Chem 268(3): 1914-1920.

42. Funfschilling, U. and Rospert, S. 1999. Nascent polypeptide-associated complex stimulates protein import into yeast mitochondria. Mol Biol Cell 10(10): 3289-3299.

43. Gabriel, K., Milenkovic, D., Chacinska, A., Muller, J., Guiard, B., Pfanner, N., and Meisinger, C. 2007. Novel Mitochondrial Intermembrane Space Proteins as Substrates of the MIA Import Pathway. J Mol Biol 365(3): 612-620.

44. Gakh, O., Cavadini, P., and Isaya, G. 2002. Mitochondrial processing peptidases. Biochim Biophys Acta 1592(1): 63-77.

45. Garcia, M., Darzacq, X., Delaveau, T., Jourdren, L., Singer, R.H., and Jacq, C. 2007. Mitochondria-associated Yeast mRNAs and the Biogenesis of Molecular Complexes. Mol Biol Cell 18(2): 362-368.

46. Gatti, D.L. and Tzagoloff, A. 1991. Structure and evolution of a group of related aminoacyl-tRNA synthetases. J Mol Biol 218(3): 557-568.

47. Gavel, Y. and von Heijne, G. 1990. Cleavage-site motifs in mitochondrial targeting peptides. Protein EngA{\)\ 33-37.

48. Gentle, I., Gabriel, K., Beech, P., Waller, R., and Lithgow, T. 2004. The Omp85 family of proteins is essential for outer membrane biogenesis in mitochondria and bacteria. J Cell Biol 164(1): 19-24.

49. Gietz, R.D. and Woods, R.A. 2006. Yeast transformation by the LiAc/SS Carrier DNA/PEG method. Methods Mol Biol 313: 107-120.

50. Goswami, S., Dhar, G., Mukherjee, S., Mahata, B., Chatterjee, S., Home, P., and Adhya, S. 2006. A bifunctional tRNA import receptor from Leishmania mitochondria. Proc Natl Acad Sei USA 103(22): 8354-8359.

51. Habib, S.J., Waizenegger, T., Niewienda, A., Paschen, S.A., Neupert, W., and Rapaport, D. 2007. The N-terminal domain of Tob55 has a receptor-like function in the biogenesis of mitochondrial {beta}-barrel proteins. J Cell Biol 176(1): 77-88.

52. Hell, K., Herrmann, J.M., Pratje, E., Neupert, W., and Stuart, R.A. 1998. Oxalp, an essential component of the N-tail protein export machinery in mitochondria. Proc Natl Acad Sei USA 95(5): 2250-2255.

53. Hell, K., Herrmann, J., Pratje, E., Neupert, W., and Stuart, R.A. 1997. Oxalp mediates the export of the N- and C-termini of pCoxII from the mitochondrial matrix to the intermembrane space. FEBS Lett 418(3): 367-370.

54. Helm, M., Brule, H., Degoul, F., Cepanec, C., Leroux, J.P., Giege, R., and Florentz, C. 1998. The presence of modified nucleotides is required for cloverleaf folding of a human mitochondrial tRNA. Nucleic Acids Res 26(7): 1636-1643.

55. Herrmann, J.M. and Neupert, W. 2003. Protein insertion into the inner membrane of mitochondria. IUBMB Life 55(4-5): 219-225.

56. Hill, K., Model, K., Ryan, M.T., Dietmeier, K., Martin, F., Wagner, R., and Pfanner, N. 1998. Tom40 forms the hydrophilic channel of the mitochondrial import pore for preproteins see comment. Nature 395(6701): 516-521.

57. Huang, S., Ratliff, K.S., and Matouschek, A. 2002. Protein unfolding by the mitochondrial membrane potential. Nat Struct Biol 9(4): 301-307.

58. Isaya, G., Kalousek, F., Fenton, W.A., and Rosenberg, L.E. 1991. Cleavage of precursors by the mitochondrial processing peptidase requires a compatible mature protein or an intermediate octapeptide. J Cell Biol 113(1): 65-76.

59. James, A.M., Wei, Y.H., Pang, C.Y., and Murphy, M.P. 1996. Altered mitochondrial function in fibroblasts containing MELAS or MERRF mitochondrial DNA mutations. BiochemJ 318 (Pt 2): 401-407.

60. Karniely, S., Regev-Rudzki, N., and Pines, O. 2006. The presequence of fumarase is exposed to the cytosol during import into mitochondria. J Mol Biol 358(2): 396-405.

61. Kerscher, O., Sepuri, N.B., and Jensen, R.E. 2000. Timl8p is a new component of the Tim54p-Tim22p translocon in the mitochondrial inner membrane. Mol Biol Cell 11(1): 103-116.

62. Kerscher, O., Holder, J., Srinivasan, M., Leung, R.S., and Jensen, R.E. 1997. The Tim54p-Tim22p complex mediates insertion of proteins into the mitochondrial inner membrane. J Cell Biol 139(7): 1663-1675.

63. Kirino, Y., Goto, Y., Campos, Y., Arenas, J., and Suzuki, T. 2005. Specific correlation between the wobble modification deficiency in mutant tRNAs and the clinical features of a human mitochondrial disease. Proc Natl Acad Sei USA 102(20): 7127-7132.

64. Knox, C., Sass, E., Neupert, W., and Pines, O. 1998. Import into mitochondria, folding and retrograde movement of fumarase in yeast. J Biol Chem 273(40): 2558725593.

65. Koehler, C.M. 2004. New developments in mitochondrial assembly. Annu Rev Cell Dev Biol 20:309-335.

66. Koehler, C.M., Leuenberger, D., Merchant, S., Renold, A., Junne, T., and Schatz, G. 1999. Human deafness dystonia syndrome is a mitochondrial disease. Proc Natl Acad Sei USA 96(5): 2141-2146.

67. Koehler, C.M., Merchant, S., Oppliger, W., Schmid, K., Jarosch, E., Dolfini, L., Junne, T., Schatz, G., and Tokatlidis, K. 1998. Tim9p, an essential partner subunit of TimlOp for the import of mitochondrial carrier proteins. Embo J 17(22): 6477-6486.

68. Kolesnikova, O., Entelis, N., Kazakova, H., Brandina, I., Martin, R.P., and Tarassov, I. 2002. Targeting of tRNA into yeast and human mitochondria: the role of anticodon nucleotides. Mitochondrion 2(1-2): 95-107.

69. Kolesnikova, O.A., Entelis, N.S., Mireau, H., Fox, T.D., Martin, R.P., and Tarassov, I.A. 2000. Suppression of mutations in mitochondrial DNA by tRNAs imported from the cytoplasm. Science 289(5486): 1931-1933.

70. Komiya, T., Sakaguchi, M., and Mihara, K. 1996. Cytoplasmic chaperones determine the targeting pathway of precursor proteins to mitochondria. Embo J 15(2): 399-407.

71. Koulintchenko, M., Temperley, R.J., Mason, P.A., Dietrich, A., and Lightowlers, R.N. 2006. Natural competence of mammalian mitochondria allows the molecular investigation of mitochondrial gene expression. Hum Mol Genet 15(1): 143-154.

72. Koulintchenko, M., Konstantinov, Y., and Dietrich, A. 2003. Plant mitochondria actively import DNA via the permeability transition pore complex. Embo J 22(6): 1245-1254.

73. Krayl, M., Lim, J.H., Martin, F., Guiard, B., and Voos, W. 2007. A cooperative action of the ATP-dependent import motor complex and the inner membrane potential drives mitochondrial preprotein import. Mol Cell Biol 27(2): 411-425.

74. Laemmli, U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227(5259): 680-685.

75. Laforest, M.J., Delage, L., and Marechal-Drouard, L. 2005. The T-domain of cytosolic tRNAVal, an essential determinant for mitochondrial import. FEBS Lett 579(5): 1072-1078.

76. Lee, C.M., Sedman, J., Neupert, W., and Stuart, R.A. 1999. The DNA helicase, Hmilp, is transported into mitochondria by a C-terminal cleavable targeting signal. J Biol Chem 274(30): 20937-20942.

77. Li, K., Smagula, C.S., Parsons, W.J., Richardson, J.A., Gonzalez, M., Hagler, H.K., and Williams, R.S. 1994. Subcellular partitioning of MRP RNA assessed by ultrastructural and biochemical analysis .J Cell Biol 124(6): 871-882.

78. Liu, Q., D'Silva, P., Walter, W., Marszalek, J., and Craig, E.A. 2003. Regulated cycling of mitochondrial Hsp70 at the protein import channel. Science 300(5616): 139-141.

79. Ludewig, G. and Staben, C. 1994. Characterization of the PNT1 pentamidine resistance gene of Saccharomyces cerevisiae. Antimicrob Agents Chemother 38(12): 2850-2856.

80. Mahapatra, S., Ghosh, S., Bera, S.K., Ghosh, T., Das, A., and Adhya, S. 1998. The D arm of tRNATyr is necessary and sufficient for import into Leishmania mitochondria in vitro. Nucleic Acids Res 26(9): 2037-2041.

81. Mahata, B., Mukherjee, S., Mishra, S., Bandyopadhyay, A., and Adhya, S. 2006. Functional delivery of a cytosolic tRNA into mutant mitochondria of human cells. Science 314(5798): 471-474.

82. Mahata, B., Bhattacharyya, S.N., Mukherjee, S., and Adhya, S. 2005. Correction of translational defects in patient-derived mutant mitochondria by complex-mediated import of a cytoplasmic tRNA. J Biol Chem 280(7): 5141-5144.

83. Martin, R., Schneller, J.M., Stahl, A., and Dirheimer, G. 1979. Import of nuclear deoxyribonucleic acid coded lysine-accepting transfer ribonucleic acid (anticodon C-U-U) into yeast mitochondria. Biochemistry 18: 4600-4605.

84. Martinez-Caballero, S., Grigoriev, S.M., Herrmann, J.M., Campo, M.L., and Kinnally, K.W. 2007. Timl7p Regulates the Twin Pore Structure and Voltage Gating of the Mitochondrial Protein Import Complex TIM23. J Biol Chem 282(6): 3584-3593.

85. Meier, S., Neupert, W., and Herrmann, J.M. 2005. Conserved N-terminal negative charges in the Tim 17 subunit of the TIM23 translocase play a critical role in the import of preproteins into mitochondria. J Biol Chem 280(9): 7777-7785.

86. Mesecke, N., Terziyska, N., Kozany, C., Baumann, F., Neupert, W., Hell, K., and Herrmann, J.M. 2005. A disulfide relay system in the intermembrane space of mitochondria that mediates protein import. Cell 121(7): 1059-1069.

87. Mihara, K. and Omura, T. 1996. Cytosolic factors in mitochondrial protein import. Experientia 52(12): 1063-1068.

88. Moczko, M., Gartner, F., and Pfanner, N. 1993. The protein import receptor MOM 19 of yeast mitochondria. FEBSLett 326(1-3): 251-254.

89. Moczko, M., Dietmeier, K., Sollner, T., Segui, B., Steger, H.F., Neupert, W., and Pfanner, N. 1992. Identification of the mitochondrial receptor complex in Saccharomyces cerevisiae. FEBSLett 310(3): 265-268.

90. Mokranjac, D. and Neupert, W. 2005. Protein import into mitochondria. Biochem Soc Trans 33(Pt 5): 1019-1023.

91. Mokranjac, D., Popov-Celeketic, D., Hell, K„ and Neupert, W. 2005. Role of Tim21 in mitochondrial translocation contact sites. J Biol Chem 280(25): 2343723440.

92. Mokranjac, D., Paschen, S.A., Kozany, C., Prokisch, H., Hoppins, S.C., Nargang, F.E., Neupert, W., and Hell, K. 2003. Tim50, a novel component of the TIM23 preprotein translocase of mitochondria. EmboJ 22(4): 816-825.

93. Mokranjac, D., Sichting, M., Neupert, W., and Hell, K. 2003. Timl4, a novel key component of the import motor of the TIM23 protein translocase of mitochondria. Embo J 22(19): 4945-4956.

94. Mukherjee, S., Bhattacharyya, S.N., and Adhya, S. 1999. Stepwise transfer of tRNA through the double membrane of Leishmania mitochondria. J Biol Chem 274(44): 31249-31255.

95. Neupert, W. and Brunner, M. 2002. The protein import motor of mitochondria. Nat Rev Mol Cell Biol 3(8): 555-565.

96. Neupert, W. 1997. Protein import into mitochondria. Annu Rev Biochem 66: 863-917.

97. Nunnari, J., Fox, T.D., and Walter, P. 1993. A mitochondrial protease with two catalytic subunits of nonoverlapping specificities. Science 262(5142): 19972004.

98. Onesti, S., Miller, A.D., and Brick, P. 1995. The crystal structure of the lysyl-tRNA synthetase (LysU) from Escherichia coli. Structure 3(2): 163-176.

99. Paschen, S.A., Waizenegger, T., Stan, T., Preuss, M., Cyrklaff, M., Hell, K., Rapaport, D., and Neupert, W. 2003. Evolutionary conservation of biogenesis of beta-barrel membrane proteins. Nature 426(6968): 862-866.

100. Pfanner, N. and Geissler, A. 2001. Versatility of the mitochondrial protein import machinery. Nat Rev Mol Cell Biol 2(5): 339-349.

101. Pfanner, N., Craig, E.A., and Honlinger, A. 1997. Mitochondrial preprotein translocase. Annu Rev Cell Dev Biol 13: 25-51.

102. Rapaport, D. 2003. Finding the right organelle. Targeting signals in mitochondrial outer-membrane proteins. EMBO Rep 4(10): 948-952.

103. Rapaport, D., Neupert, W., and Lill, R. 1997. Mitochondrial protein import. Tom40 plays a major role in targeting and translocation of preproteins by forming a specific binding site for the presequence. J Biol Chem 272(30): 18725-18731.

104. Rehling, P., Brandner, K., and Pfanner, N. 2004. Mitochondrial import and the twin-pore translocase. Nat Rev Mol Cell Biol 5(7): 519-530.

105. Rep, M. and Grivell, L.A. 1996. MBA1 encodes a mitochondrial membrane-associated protein required for biogenesis of the respiratory chain. FEBS Lett 388(2-3): 185-188.

106. Rinehart, J., Krett, B., Rubio, M.A., Alfonzo, J.D., and Soll, D. 2005. Saccharomyces cerevisiae imports the cytosolic pathway for Gln-tRNA synthesis into the mitochondrion. Genes Dev 19(5): 583-592.

107. Roise, D. 1997. Recognition and binding of mitochondrial presequences during the import of proteins into mitochondria. J Bioenerg Biomembr 29(1): 19-27.

108. Rose, M.D., Winston, F., Hieter, P. 1990. Methods in yeast genetics. A laboratory course manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.

109. Rudinger, J., Puglisi, J.D., Putz, J., Schatz, D., Eckstein, F., Florentz, C., and Giege, R. 1992. Determinant nucleotides of yeast tRNA(Asp) interact directly with aspartyl-tRNA synthetase. Proc Natl Acad Sei USA 89(13): 5882-5886.

110. Ryan, M.T., Muller, H., and Pfanner, N. 1999. Functional staging of ADP/ATP carrier translocation across the outer mitochondrial membrane. J Biol Chem 274(29): 20619-20627.

111. Saint-Georges, Y., Hamel, P., Lemaire, C., and Dujardin, G. 2001. Role of positively charged transmembrane segments in the insertion and assembly ofmitochondrial inner-membrane proteins. Proc Natl Acad Sei USA 98(24): 1381413819.

112. Salinas, T., Duchene, A.M., Delage, L., Nilsson, S., Glaser, E., Zaepfel, M., and Marechal-Drouard, L. 2006. The voltage-dependent anion channel, a major component of the tRNA import machinery in plant mitochondria. Proc Natl Acad Sei USA.

113. Salinas, T., Schaeffer, C., Marechal-Drouard, L., and Duchene, A.M. 2005. Sequence dependence of tRNA(Gly) import into tobacco mitochondria. Biochimie 87(9-10): 863-872.

114. Saracco, S.A. and Fox, T.D. 2002. Coxl8p is required for export of the mitochondrially encoded Saccharomyces cerevisiae Cox2p C-tail and interacts with Pntlp and Mss2p in the inner membrane. Mol Biol Cell 13(4): 1122-1131.

115. Schneider, A. and Marechal-Drouard, L. 2000. Mitochondrial tRNA import: are there distinct mechanisms? Trends Cell Biol 10(12): 509-513.

116. Schneider, A. 1996. Cytosolic yeast tRNA(His) is covalently modified when imported into mitochondria of Trypanosoma brucei. Nucleic Acids Res 24(7): 12251228.

117. Schneider, A., Martin, J., and Agabian, N. 1994a. A nuclear encoded tRNA of Trypanosoma brucei is imported into mitochondria. Mol Cell Biol 14(4): 23172322.

118. Schneider, A., McNally, K.P., and Agabian, N. 1994b. Nuclear-encoded mitochondrial tRNAs of Trypanosoma brucei have a modified cytidine in the anticodon loop. Nucleic Acids Res 22(18): 3699-3705.

119. Schneider, A., Oppliger, W., and Jeno, P. 1994. Purified inner membrane protease I of yeast mitochondria is a heterodimer. J Biol Chem 269(12): 8635-8638.

120. Schneider, H.C., Berthold, J., Bauer, M.F., Dietmeier, K., Guiard, B., Brunner, M., and Neupert, W. 1994. Mitochondrial Hsp70/MIM44 complex facilitates protein import. Nature 371(6500): 768-774.

121. Schwartz, M.P. and Matouschek, A. 1999. The dimensions of the protein import channels in the outer and inner mitochondrial membranes. Proc Natl Acad Sei USA 96(23): 13086-13090.

122. Sherman, E.L., Go, N.E., and Nargang, F.E. 2005. Functions of the small proteins in the TOM complex of Neurospora crasssa. Mol Biol Cell 16(9): 41724182.

123. Shi, X., Chen, D.H., and Suyama, Y. 1994. A nuclear tRNA gene cluster in the protozoan Leishmania tarentolae and differential distribution of nuclear-encoded tRNAs between the cytosol and mitochondria. Mol Biochem Parasitol 65(1): 23-37.

124. Sirrenberg, C., Endres, M., Folsch, H., Stuart, R.A., Neupert, W., and Brunner, M. 1998. Carrier protein import into mitochondria mediated by the intermembrane proteins TimlO/Mrsl 1 and Timl2/Mrs5. Nature 391(6670): 912-915.

125. Sirrenberg, C., Bauer, M.F., Guiard, B., Neupert, W., and Brunner, M. 1996. Import of carrier proteins into the mitochondrial inner membrane mediated by Tim22. Nature 384(6609): 582-585.

126. Souza, R.L., Green-Willms, N.S., Fox, T.D., Tzagoloff, A., and Nobrega, F.G. 2000. Cloning and characterization of COX 18, a Saccharomyces cerevisiae PET gene required for the assembly of cytochrome oxidase. J Biol Chem 275(20): 14898-14902.

127. Strub, A., Rottgers, K., and Voos, W. 2002. The Hsp70 peptide-binding domain determines the interaction of the ATPase domain with Tim44 in mitochondria. EmboJ21(11): 2626-2635.

128. Sylvestre, J., Margeot, A., Jacq, C., Dujardin, G., and Corral-Debrinski, M. 2003. The role of the 3' untranslated region in mRNA sorting to the vicinity of mitochondria is conserved from yeast to human cells. Mol Biol Cell 14(9): 38483856.

129. Tan, T.H., Bochud-Allemann, N., Horn, E.K., and Schneider, A. 2002a. Eukaryotic-type elongator tRNAMet of Trypanosoma brucei becomes formylated after import into mitochondria. Proc Natl Acad Sei USA 99(3): 1152-1157.

130. Tan, T.H., Pach, R., Crausaz, A., Ivens, A., and Schneider, A. 2002b. tRNAs in Trypanosoma brucei: genomic organization, expression, and mitochondrial import. Mol Cell Biol 22(11): 3707-3717.

131. Tarassov, I. and Entelis, N. 1992. Mitochondrially-imported cytoplasmic tRNALys (CUU) of Saccharomyces cerevisiae: in vivo and in vitro targetting systems. Nucleic Acids Res 20: 1277-1281.

132. Waizenegger, T., Schmitt, S., Zivkovic, J„ Neupert, W., and Rapaport, D. 2005. Miml, a protein required for the assembly of the TOM complex of mitochondria. EMBO Rep 6(1): 57-62.

133. Waizenegger, Т., Habib, S.J., Lech, M., Mokranjac, D., Paschen, S.A., Hell, K., Neupert, W., and Rapaport, D. 2004. Tob38, a novel essential component in the biogenesis of beta-barrel proteins of mitochondria. EMBO Rep 5(7): 704-709.

134. Wiedemann, N., Kozjak, V., Chacinska, A., Schonfisch, В., Rospert, S., Ryan, M.T., Pfanner, N., and Meisinger, С. 2003. Machinery for protein sorting and assembly in the mitochondrial outer membrane. Nature 424(6948): 565-571.

135. Wiedemann, N., Pfanner, N., and Ryan, M.T. 2001. The three modules of ADP/ATP carrier cooperate in receptor recruitment and translocation into mitochondria. Embo J 20(5): 951-960.

136. Yamamoto, H., Esaki, M., Kanamori, Т., Tamura, Y., Nishikawa, S., and Endo, Т. 2002. Tim50 is a subunit of the TIM23 complex that links protein translocation across the outer and inner mitochondrial membranes. Cell 111(4): 519528.

137. Yasukawa, Т., Suzuki, Т., Ishii, N. Ohta, S., and Watanabe, K. 2001. Wobble modification defect in tRNA disturbs codon-anticodon interaction in a mitochondrial disease. Embo J 20(17): 4794-4802.

138. Yermovsky-Kammerer, A.E. and Hajduk, S.L. 1999. In vitro import of a nuclearly encoded tRNA into the mitochondrion of Trypanosoma brucei. Mol Cell Biol 19(9): 6253-6259.