Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение взаимодействия импортируемой в митохондрии дрожжевой лизинговой тРНК с предшественником митохондриальной лизил-тРНК-синтетазы

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение взаимодействия импортируемой в митохондрии дрожжевой лизинговой тРНК с предшественником митохондриальной лизил-тРНК-синтетазы"

На правах рукописи

СМИРНОВА Екатерина Васильевна

Изучение взаимодействия импортируемой в митохондрии дрожжевой лизиновой тРНК с предшественником митохондриальной лизил-тРНК-синтетазы

О

03.01.03 - Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2012

005015882

005015882

Работа выполнена на кафедре молекулярной биологии биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова и в Университете Страсбурга (Франция)

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

Кандидат биологических наук Каменский Петр Андреевич ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Колб Вячеслав Адамович, доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт белка РАН, ведущий научный сотрудник Новикова Людмила Александровна, доктор биологических наук, НИИ физико-химической биологии имени А.Н.Белозерского Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова, ведущий научный сотрудник

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (ИБХ)

2 2012 г. в /V"?.

Защита состоится ' Т''''-О 2012 г. в / 1 на заседании диссертационного совета Д.501.001.76 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские Горы, МГУ, Биологический факультет, ауд.389.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова

Автореферат разослан «¿^ У » ¿ил/^/ 2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, ■ И.А. Крашенинников

кандидат биологических наук 74.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Митохондрии обладают собственным геномом и системой синтеза белка, однако большинство генов в ходе эволюции перенеслось из митохондриаль-ного генома в ядерный. В связи с этим из цитоплазмы в митохондрии импортируется значительное число макромолекул: как белков, так и РНК. Количество импортируемых в митохондрии белков у всех организмов значительно превосходит количество белков, синтезируемых в митохондриальном мат-риксе (например, у человека в митохондриях синтезируется 13, а у S. cerevisiae — 9 белков из более чем тысячи необходимых для функционирования органелл). В то же время, количество импортируемых РНК значительно варьируется от вида к виду. Так, например, у простейших рода Tetrahy-тепа из 36 митохондриальных тРНК из цитоплазмы импортируется 26, у растения M. polymorpha импортируется 2 тРНК, а 27 закодировано в митохондриальном геноме, у дрожжей S. cerevisiae импортируется лишь одна лизино-вая тРНК. У млекопитающих тРНК в митохондрии не импортируются, однако показан импорт 5 S рРНК и РНК, входящих в состав РНКаз Р и MRP.

Несмотря на то, что у млекопитающих отсутствует конститутивный импорт тРНК, в их клетках есть все необходимое для осуществления этого процесса. Было показано, что производные импортируемой дрожжевой тРНК (тРЛ1) при экспрессии их генов в клетках человека начинают импортироваться в митохондрии млекопитающих и включаться в процесс трансляции. Это позволяет предполагать, что импорт тРНК в митохондрии у дрожжей и млекопитающих происходит по одному и тому же механизму. Значительное количество наследственных заболеваний человека ассоциировано с мутациями в митохондриальной ДНК. Эти мутации зачастую затрагивают гены тРНК. Импорт не мутированных тРНК из цитоплазмы и их включение в митохон-дриальную трансляцию позволил бы супрессировать такие мутации.

Импорт тРЛ 1 в митохондрии дрожжей является высокоспецифичным процессом. В определении его специфичности играет роль не только нуклеотид-ная последовательность импортируемой тРНК, но и структура белка-переносчика, которым является предшественник митохондриальной лизил-тРНК-синтетазы (preMsklp). Этот белок после импорта в митохондрии подвергается протеолитическому расщеплению, в результате которого он теряет сигнал митохондриальной локализации. После этого белок становится функциональным в качестве аминоацил-тРНК-синтетазы и выполняет свою основную функцию - аминоацилирует митохондриальную лизиновую тРНК (тРЛЗ). Ранее в нашей лаборатории было показано in vitro, что мутагенез определенных участков preMsklp расширяет набор импортируемых молекул. В нашей работе мы попытались определить степень вовлеченности этих участков в обеспечение импорта тРЛ1 в митохондрии, а также их роль в процессе определения специфичности импорта.

Цели работы:

1) Найти в составе белка preMsklp участки, обеспечивающие процесс импорта тРЛ1 в митохондрии дрожжей, определить, как мутагенез этих участков влияет на процесс импорта тРЛ1.

2) Выявить участок белка, отвечающий за определение специфичности импорта тРНК в митохондрии дрожжей.

Экспериментальные задачи:

1) Сравнить последовательность preMsklp с известной последовательностью лизил-тРНК-синтетазы Е, coli, найти участки, по которым отличается вторичная структура белков.

2) С помощью сайт-направленного мутагенеза создать мутантные версии preMsklp с делециями найденных участков.

3) Используя методы задержки в геле и in vitro импорта тРНК в митохондрии, определить, способны ли мутантные версии белка связывать tPJII и направлять ее импорт в изолированные митохондрии.

4) Создать штаммы дрожжей с заменой гена MSK1 на одну из его мутантных версий. Определить фенотипическое проявление мутаций в гене MSK1.

5) Выделить митохондрии из мутантных штаммов дрожжей и методом Норзерн-блот-гибридизации определить, какие из цитозольных малых РНК присутствуют в митохондриальном матриксе.

6) Подобрать условия гетерологической экспрессии гена MSK1 в клетках Е. coli, приводящей к синтезу белка в растворимой форме.

Научная новизна:

1) Впервые картирован участок белка preMsklp, являющийся критичным для направления импорта tPJII в митохондрии дрожжей.

2) Показано, что для эффективного направления импорта tPJII необходимо сохранение структуры этого участка. Полученные данные согласуются с предварительными данными о неканонической структуре комплекса preMsklp и тРЛ1.

3) Картированы участки, регулирующие процесс импорта тРЛ1.

4) Картирован участок, определяющий специфичность процесса импорта.

5) Впервые разработана методика, позволяющая синтезировать preMsklp в клетках Е. coli в растворимом виде.

Структура диссертации:

Диссертация состоит из четырех частей: 1) обзор литературы; 2) материалы и методы; 3) результаты и обсуждение; 4) приложения.

Работа содержит список цитируемой литературы ( /3^ссылок), ^ рисунков, j таблиц. Общий объем диссертации у/у страницы.

Апробация работы и публикации:

Результаты диссертации были представлены на регулярно проводящихся семинарах кафедры молекулярной биологии биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова, а также на международных конференциях: съезд общества ARCUS (Страсбург, Франция, 2008), международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов-2009 (Москва, Россия, 2009); 23-я международная конференция «тРНК» (Авейро, Португалия, 2010), 16-й ежегодный съезд членов научного общества «РНК» (Киото, Япония, 2011). По теме диссертации опубликовано 2 статьи.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовались культуры пекарских дрожжей S. cerevisiae: штамм W303 и его производные: WAM+pMRS (штамм с удаленным в геноме геном MSK1, этот ген находится в составе центромерной дрожжевой плазми-ды), WAM+pAshRS (штамм с удаленным в геноме геном MSK1 и с ортоло-гичным геном Ashbya gossypii в составе дрожжевой центромерной плазмиды) а также штаммы на основе WAM и WAM+pMRS с разнообразными мутант-ными версиями гена MSK1 - для исследования эффекта мутаций белка preMsklp in vivo\ штаммы бактерий Е. coli (штаммы XLIBlue, BL21 Rosetta) для молекулярного клонирования и гетерологичной экспрессии белков.

Клетки дрожжей растили при 30 или 37 °С на разнообразных средах в зависимости от цели исследования: селективных средах для поддержания внесенных мутаций, средах, содержащих несбраживаемые источники углерода (глицерин, лактат) для проведения тестов на функциональность митохондрий.

Выделение митохондрий и эксперименты по импорту тРНК в изолированные митохондрии проводили согласно оригинальным методикам, разработанным в нашей группе.

Состав РНК в митохондриях определяли методом Норзерн-блот-гибридизации.

Белки экспрессировали в клетках Е. coli: клетки индуцировали в логарифмической фазе роста 0,1-1 mM IPTG в течение 1-10 часов, затем клетки ли-зировали в фосфатном буфере, содержащем 100-500 мМ NaCl. Очистку белков проводили методом аффинной хроматографии на носителе с никелем (Ni-агарозе фирмы QiaGen) по стандартному протоколу производителя или с внесенными в него изменениями.

Эксперименты по измерению кругового дихроизма белков проводили при 22 °С на приборе JASCO J-810 в 0,1-см кювете.

Делеции в составе preMsklp вносились с применением набора QuikChange фирмы Stratagene.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Поиск участков preMsklp, являющихся ответственными за импорт tPJII в митохондрии дрожжей

preMsklp, как и другие аминоацил-тРНК-синтетазы класса IIb, состоит из двух доменов: каталитического С-концевого и N-концевого, отвечающего за первичное связывание тРНК (рис. 1А). Ранее в нашей лаборатории было показано, что N-концевой домен способен направлять специфический импорт tPJII в митохондрии, то есть может полностью заменять полноразмерный белок в данном процессе. Это говорит о том, что все детерминанты импорта tPJII в митохондрии находятся в составе N-концевого домена. Выравнивание последовательности preMsklp с последовательностью ЛизРС Е. coli, для которой известна кристаллическая структура, позволило смоделировать вторичную структуру preMsklp. Было найдено несколько участков, которые у этих двух белков отличались. Особенно интересными для дальнейшего рассмотрения участками нам показались элементы dl и d2, а также участки Н1-НЗ иН5-Н6 (рис. 1Б).

Рис. 1.А — вторичная структура preMsklp, предсказанная in silico. Стрелкой указана граница N- и С-концевого доменов. MLS — сигнал митохондриальной локализации. Б — выравнивание аминокислотных последовательностей белка preMsklp S. cerevisiae (верхняя строка) и ЛизРС (лизил-тРНК-синтетазы) Е. coli (нижняя строка). Н1-Н1 б - а-спирали, А1-А6, В1-В7, С1-С2 и D1—D2 - ß-элементы. Прямоугольниками выделены участки, которые по вторичной структуре существенно отличаются у preMsklp и LysRS; dl, d2 -аминокислотные последовательности, отсутствующие в ЛизРС Е. coli, но присутствующие в preMsklp.

Было высказано предположение, что именно эти участки необходимы для осуществления дополнительной функции preMsklp, отсутствующей у ЛизРС Е. coli, то есть импорта тРЛ1, и для определения специфичности этого процесса. Для проверки этой гипотезы было решено провести мутагенез описанных участков с целью изучения их влияния на импорт тРЛ1.

Мутагенез участков Н1-НЗ и Н5-Н6 и проверка влияния мутаций на импорт тРЛ1

Был проведен мутагенез, в результате которого были созданы генно-инженерные конструкции с мутантными версиями гена MSK1 (кодирующего preMsklp). Схема мутантных версий приведена на рис. 2.

г

MIS Н1 Н2 H26IS НЗ .. Н5 А6К Н6 В1к „ „ у\

preMsklp I-Н-N-^-Н-Н~~^>-Г~ТГ~|>-/\/\ул

preMsk1p{\N) HZ]-f\f\/S'

preMsk1p(.\H5) СИК^НИКИН=3-^-+-C>C=H=>^W

preMsk1p( ЛН6) Г=3-ОН=Н=Н=Н-^-C=H=>-

preMsk1p(;\H5-H6) I—И—н—и—И-И—У/--1--cf^X/X/^

preMskl р(ДН 1 -НЗ) LZl--НГГЬС^СГНГ^ЛУХ/4

Рис. 2. Схематическое изображение мутантных версий preMsklp, полученных в результате проведенного мутагенеза. MLS — сигнал митохондриальной локализации, С — С-концевой домен, в скобках указаны элементы, удаленные в белке. Все конструкции содержали 6 дополнительных остатков гистидина на С-конце (His-tag) для аффинной очистки белков

Эти мутантные версии были клонированы в векторы для гетерологич-ной экспрессии в Е. coli. Белки были очищены методом аффинной хроматографии с использованием никель-содержащего сорбента (никель-агарозы), после чего были проведены эксперименты in vitro по связыванию tPJII и по направлению импорта тРЛ1 в изолированные митохондрии. Оказалось, что только одна из мутантных версий (preMsklp(AHl-H3)) была способна образовывать детектируемый комплекс с тРЛ1, а также направлять ее импорт в митохондрии с эффективностью, близкой к таковой белка дикого типа (рис. 3).

Остальные мутантные версии не образовывали детектируемых комплексов с тРЛ1 и направляли ее импорт в митохондрии с эффективностью, значительно сниженной по сравнению с белком дикого типа. Таким образом, in vitro было показано, что делении в участке Н1-НЗ не оказывают значительного влияния на эффективность импорта тРЛ1, в то время как любые крупные делении в участке Н5-Н6 практически полностью блокируют импорт тРЛ 1.

ргемзюр{йж-нз). пм

<5 4' .

'-Ш1

Жш

Комплекс тРЛ1с preMsk1p(ÄH1-H3)

• Свободная тРЛ1

# #

^ „ ¿¡f ¡f ß

& л? лУ л?

ж ^ ^ ^

аг .¿Г ^ .¿J- .¿J-

^

□ 00

0.5

Рис. 3. А - результат эксперимента по задержке тРЛ1 в геле: авторадиограмма разделения продуктов реакг^и комплексообразования тРЛ1 с ргеМ$к1р(АН1-НЗ) в нативном ПААГ. Б - авторадиограмма разделения продуктов реакции импорта тРЛ1 в изолированные митохондрии дрожжей мутантными версиями ргеМзк1р. На нижней части рисунка представлен расчет эффективности направления импорта тРЛ1 в митохондрии разными мутантными версиями белка

Затем было проведено исследование влияния этих мутаций на импорт tPJTI в митохондрии in vivo. Для этого были созданы генно-инженерные конструкции на основе челночного вектора, в каждой из которых содержалась одна из мутантных версий гена MSK1 (кодирующего preMsklp). Были созданы штаммы дрожжей, в которых ген MSK1 был заменен на одну из его мутантных версий, после чего была проверена способность этих штаммов расти на средах с несбраживаемыми источниками углерода (скорость роста дрожжей на таких средах прямо коррелирует с функциональностью их митохондрий). После выделения митохондрий из клеток этих штаммов дрожжей было проверено наличие в них тРЛ1. Результаты представлены на рис. 4.

^ , # ^////V

ЭбООпт ^ ^ ^ ^ ^

YPD

YPGIy

/>VV>V ^ ^ ^ ^ ^ ^

тРЛ1 тРНКмт(Лей) тРЛ2

@preMsk1p |

Рис. 4. А - результаты роста мутантных штаммов дрожжей на среде со сбраживаемым (УРй, глюкоза) и несбраживаемым (УР&у, глицерин) источниками углерода при 30 °С. Ойбоопт — оптическая плотность взвеси клеток, нанесенной в каждом ряду. Б - результаты Норзерн-блот гибридизации малых РНК, выделенных из митохондрий мутантных штаммов дрожжей, с зондами к тРЛ1, митохондриальной лещиновой тРНК, неим-портируемой лизиновой тРНК (тРЛ2); нижняя панель - результаты Вестерн-блот анализа белков, выделенных из мутантных штаммов дрожжей, антитела к ргеМ$к1р. В названии дорожек в скобках указано, какой мутантный вариант ргеМ$к1р использован при создании этого штамма (рМК5- плазмида с полноразмерным геном).

Оказалось, что любая мутация приводит к полной нефункциональности

митохондрий: дрожжи не растут на среде с глицерином, в то время как их

рост на среде с глюкозой не затронут (рис. 4А), в митохондриях отсутствуют

11

митохондриальные тРНК, наличие которых является одним из свидетельств функциональности органелл. tPJTI импортируется в митохондрии только в случае делеции участка Н1-НЗ (рис. 4Б), что подтверждает данные, полученные in vitro. При этом мутантные белки синтезируются, что подтверждается результатами Вестерн-блот-анализа (рис. 4Б).

Возможно, что мутации белка в участке Н5-Н6 приводят к нарушению из вторичной и третичной структуры, что, в свою очередь, вызывает нарушения их функционирования. Чтобы подтвердить отсутствие нарушений в структуре белков мы провели исследование кругового дихроизма мутантных версий белка.

Полноразмерный preMsklp, а также три его мутантные версии preMsklp(AH5), preMsklp(AH6) и preMsklp(AH5-H6) были синтезированы в клетках Е. coli, очищены на никель-агарозе, после чего был измерен их круговой дихроизм. В результате эксперимента был получен график, представленный на рис. 5.

30000 20000

-20000

. -40000

preMsklp preMsk1p(AH5) preMsk1p(AH6) preMsk! р(ДН5-Н6)

195

220

240 длина

ВОЛНЫ, HM

Рис. 5. Результат измерения кругового дихроизма ргеМзк1р и его мутантных версий (ргеМэк!р(ЛН5), ргеМзк1р(АН6) и ргеМзк1р(АН5-Н6))

Поскольку спектры кругового дихроизма мутантных версий белка практически не отличаются от спектра немутированного белка, можно заключить, что структура белков не нарушается в результате мутагенеза. Это позволяет заключить, что участок Н5-Н6 preMsklp действительно критичен для импорта тР Л1.

Было решено провести более мелкий мутагенез участка Н5-Н6. Для этого были созданы конструкции в составе дрожжевых векторов, в которых отсутствовали N- или С-концевые половины каждой из спиралей Н5 или Н6 или же отсутствовал элемент ß-структуры А6. Схемы мутантных версий приведены на рис. 6.

с

MLS HI Н2 H2bis НЗ Н5 А6К HB ВК « л

preMsklp I И Н Н И И—-У/ II И ^У-1 Н~~^>-Ау/\/л

preMsk1p(.\H5N) Г~Н~Т-Г~Н-Н-Н—-У/--MZHZ^>4EZZHZ^>A/\/X

preMsk1p(.\H5C) I—И—И—Н—И-И—-ЯП—I j^V-l—t-r-N-Л^Л^Л

preMsk1p(;\A6) [—и—н—и—н—и—-/А-—«=□-1—нАЛ^А^Л

preMsk1p(AH6N) CIIHZZIHIZIHIZHZZH—у^--Н1=Н1^>Н=Н1^>ЛУ\/Л

preMsk1p(AH6C) Г~1Ч--~Н—-~N—н—н—-HZZ34Z^>4Zb4Z^>v\/\/x

Рис. 6. Схематическое изображение мутантных версий preMsklp, полученных в результате проведенного мутагенеза. MLS — сигнал митохондриальной локализации, С — С-концевой домен, в скобках указаны элементы, удаленные в белке.

Затем были созданы штаммы дрожжей, в каждом из которых ген MSK1 был заменен на одну из его мутантных версий. Был оценен рост этих штаммов дрожжей на средах со сбраживаемым и несбраживаемым источником углерода. На рис. 7 представлены результаты роста дрожжей на среде YPGly (содержащей глицерин).

Скорость роста мутантных штаммов дрожжей не отличается от скорости роста дрожжей с полноразмерным геном MSK1 ни для одной из протестированных конструкций ни при культивировании при 30 °С, ни при 37 °С. Это

^ ^ ^ #

ООеоопп, # # # # #

30 °С

0,001

урау

37 °С

0,001

Рис. 7. Результаты роста мутантных штаммов дрожжей на среде с несбраживаемым (УР&у, глицерин) источником углерода при 30 "С и 37 "С. ООаоопт ~ оптическая плотность взвеси клеток, нанесенной в каждом ряду. В названии дорожек в скобках указано, какой мутантный вариант ргеМ$к1р использован при создании этого штамма (рМЯ8 — плазми-да с полноразмерным геном).

свидетельствует о том, что описываемые делеции не влияют ни на способность ргеМзкЛр аминоацилировать тРЛЗ в митохондриях (в противном случае дрожжи не росли бы при 30 °С), ни на способность ргеМзк1р направлять импорт тРЛ1 в митохондрии, иначе скорость роста дрожжей при 37 °С была бы ниже в случае мутантных штаммов по сравнению с дрожжами дикого типа. Такой вывод основан на том, что тРЛ1 необходима для нормальной мито-хондриальной функции дрожжей при повышенных температурах).

Таким образом, внесенные мутации не влияют на функциональность ргеМвкЛр. Это позволяет нам предположить, что для эффективного направления импорта тРЛ1 в митохондрии важно не столько сохранение аминокислотной последовательности участка Н5-Н6, сколько вторичная структура этого региона в виде двух а-спиралей.

Исследование влияния участков dl и d2 на импорт tPJII в митохондрии

В составе N-концевого домена preMsklp были найдены два аминокислотных участка, отсутствующие в ЛизРС Е. coli (dl и d2 на рис. 1Б). Мы решили провести мутагенез белка и удалить эти участки (каждый по отдельности или оба одновременно) в контексте полноразмерного белка.

Затем были созданы штаммы дрожжей с заменой гена MSK1 на одну из его мутантных версий: preMsklp(Adl), preMsklp(Ad2) или preMsklp(Adld2). После этого из митохондрий, изолированных из мутантных штаммов, были выделены малые РНК, которые затем были проанализированы методом Нор-зерн-блот-гибридизации. Результаты представлены на рис. 8.

ТРЛЗ

А тРЛ1

тРЛ2

<& xV ЛГ х\°

^ # # #

rix

9 |

1 1 ■ _ 1

18

20

Б 10 0

Рис. 8. А - результат Норзерн-блот-гибридизации малых РНК, выделенных из митохондрий мутантных штаммов дрожжей, с зондами к тРЛ1, митохондриальной лизиновой тРНК (тРЛЗ) и цитоплазматической неимпортируемой лизиновой тРНК (тРЛ2). Б — расчет эффективности импорта тРЛ1 в митохондрии мутантных штаммов, нормированной относительно количества митохондриальной тРНК (за единицу принята эффективность импорта в митохондрии дрожжей дикого типа)

Оказалось, что удаление этих участков приводит не к снижению эффективности импорта тРЛ1 в митохондрии, а, напротив, к ее увеличению. При удалении элемента <11 эффективность возрастает в 9 раз, при удалении элемента ¿2 - в 2 раза, а при удалении двух элементов одновременно - в 18 раз. Мы решили проверить, будет ли такое значительное увеличение количества импортируемой в митохондрии тРЛ1 иметь фенотипическое проявление. Для этого мы провели дыхательные тесты для оценки скорости роста мутантных штаммов дрожжей и штамма дикого типа на средах со сбраживаемым и несбраживаемым источником углерода. Результаты представлены на рис. 9.

СЮ

УРС1у

30 °с

37 °С

Рис. 9. Результаты роста мутантных штаммов дрожжей на среде со сбраживаемым (УРО. глюкоза) и несбраживаемым (УРС1у, глицерин) источником углерода при 30 °С и 37 "С. ООбоопт - оптическая плотность взвеси клеток, нанесенной в каждом ряду. В названии дорожек в скобках указано, какой мутантный вариант ргеМ$к1р использован при создании этого штамма (рМЯ.5 — плазмида с полноразмерным геном)

Оказалось, что делеция элемента с!2 (и, как следствие, увеличение импорта тРЛ1 в 2 раза) не имеет никаких фенотипических проявлений. Однако, су-

дя по результатам дыхательного теста, делеция элемента di приводит к полной потере митохондриями их функциональности, а при делеции элементов di и d2 клетки дрожжей практически полностью теряют способности расти на среде с несбраживаемым источником углерода. Это позволяет нам заключить, что дополнительный импорт tPJTI приводит к значительным нарушениями митохондриальной функции. Это может быть связано с тем, что тРЛ1 вступает в конкуренцию с митохондриальными тРНК за связывание факторов трансляции. В связи с этим наличие элементов di и d2 в составе preMsklp становится необходимым для ограничения количества тРЛ1, поступающей в митохондрии. Мы предполагаем, что эти элементы могут играть важную роль в организации N-концевого домена. Полученный нами результат особенно интересен тем, что дает возможность влиять на эффективность импорта тРЛ1 путем тонких изменений белка-переносчика.

Поиск участков preMsklp, определяющих специфичность импорта in vivo

Ранее в нашей лаборатории in vitro было проведено исследование, показавшее, что N-концевой домен обладает такой же специфичностью импорта, как и полноразмерный белок preMsklp. Также было показано, что удаление нескольких элементов вторичной структуры с С-конца N-концевого домена, а именно, уже упоминавшихся выше элементов Н5, А6 и Н6, приводит к потере специфичности импорта: в изолированные митохондрии начинали импортироваться в норме не импортируемые РНК (например, вторая цитоплазма-тическая лизиновая тРНК, тРЛ2). Мы решили определить, какой участок белка будет отвечать за специфичность импорта тРЛ1 in vivo.

Для этого мы создали генно-инженерные конструкции на основе дрожжевых векторов, которые содержали укороченные версии гена MSK1: белки, закодированные этими версиями гена, заканчивались на элементах вторичной структуры А5, Н4, A3 и НЗ (рис. 10).

Затем были созданы штаммы дрожжей с заменой гена МЖ7 на одну из его укороченных версий. Мы изолировали промитохондрии из мутантных штаммов и методом Норзерн-блот-анализа определил малые РНК, находящиеся в промитохондриях. Оказалось, что как минимум одна цитоплазматиче-ская тРНК (аланиновая) импортируется в митохондрии данных штаммов дрожжей (рис. 11 А).

MLS H1 Н2 H2bis НЗ А1 Н4 А2 A3

Н4 А4 А5

preMsklpN!

«-л h Лл|/ Л г* А С 1 l~J \~J V J W t.,J \j л rz

prGMSK I pAO M-—-n——^^—-i*—

preMskl pA3 A3

preMskl рНЗГ~>€"Т-С"""Н "И I нз

Рис. 10. Схематическое изображение укороченных фрагментов preMskl р. Конструкции названы по названию последних элементов вторичной структуры в составе мутантных версий (N — полноразмерный N-концевой домен)

Мы решили проверить, влияет ли импорт дополнительной тРНК на мито-хондриальную функцию дрожжей. Для этого мы провели дыхательный тест на среде с несбраживаемым источником углерода, результаты которого показали, что дополнительная цитоплазматическая тРНК не влияет на дыхательную способность клеток мутантных штаммов дрожжей (рис. 11Б). Для того, чтобы неспецифический импорт тРНК в митохондрии имел фенотипическое проявление, необходимо, во-первых, чтобы импортировались лейциновые или изолейциновые тРНК (то есть те тРНК, по кодонам которых митохон-дриальный генетический код у дрожжей отличается от цитоплазматическо-го), во-вторых, чтобы они импортировались в аминоацилированной форме, в-третьих, необходимо, чтобы включение «неправильной» аминокислоты (изо-лейцина вместо метионина или лейцина вместо треонина) нарушало функционирование белка, и, в-четвертых, чтобы неспецифически импортировалось достаточно большое количество молекул тРНК для их конкурентоспособности с митохондриальными тРНК. Вероятность выполнения всех этих усло-

вий, с учетом того, что в митохондриях синтезируется всего 9 белков, весьма невелика. Видимо, именно это и объясняет отсутствие фенотипического проявления импорта дополнительных тРНК.

¿л

Г Jr Jr ¿Г

5S рРНК

тРНКц„(Ала)

•I Р *ШШ

...

А

Б

Рис. 11. А -результаты Норзерн-блот-анализа малых РНК, выделенных из митохондрий мутантных штаммов дрожжей с зондами к 5S рРНК, аланиновой цитоплазматической тРНК и тРЛ1; Б — результаты роста мутантных штаммов дрожжей на среде с несбраживаемым источником углерода (глицерином) при 30 °С и 37 "С. ODöOOnm — оптическая плотность взвеси клеток, нанесенной в каждом ряду

Также мы создали штаммы дрожжей, в которых отсутствовал ген MSK1 в геноме, однако в них присутствовал ген гомологичного preMsklp белка Ashbya gossypii (плазмида, содержащая этот белок, будет называться pAshRS), который способен аминоацилировать тРЛЗ в митохондриях, то есть выполнять основную функцию preMsklp, однако неспособен импортировать тРЛ1. Кроме того, в созданных штаммах также присутствовала одна из мутантных версий гена MSK1. Для этих штаммов методом оксиметрии была измерена скорость поглощения ими кислорода. Результаты измерения представлены на рис. 12.

В данном эксперименте косвенно оценивается эффективность импорта тРЛ1 мутантными версиями гена MSK1. Поскольку даже при 30 °С видна разница в скорости поглощения кислорода штаммом, в котором есть только

белок А. gossypii и штаммом, где также экспрессируется Ы-концевой домен ргеМэкЛр (который направляет импорт тРЛ1 в митохондрии), видимо, тРЛ1 и при 30 °С способствует повышению уровня митохондриальной трансляции.

А

1.6 1.4 1.2

■\МДМ(рАз1^3,рЖ5) ®\Л/ДМ(рА5ИР!3,рА5К8) ■ \МДМ(рАз1^31рН4ЯЗ) ■УУДМфАэЬРЗ.рАЗРЗ) ■УУДМфАзИРЗ.рНЗКЗ) \Л/ДМ{рАз11КЗ)

Б

0.8

0.6

0.4

0.2

■\Л/ДМ(рАзИРЗ,р^8) УУДМ(рАзЬНЗ,рА5НЗ) •\Л/ДМ(рАзИКЗ,рН4ЯЗ) ■\№Ш(рАзИРЗ,рАЗРЗ) »WДM(pAshRS,pHЗRS) \Л/ДМ(рАзИКЗ)

Рис. 12. Относительная скорость поглощения кислорода мутантными штаммами дрожжей при 30 °С (А) и 37 "С (Б)

Этот результат подтверждается также данными дыхательных тестов (дрожжи с заменой гена МБК1 на гомологичный ген А. gossypii и при 30 °С растут медленнее на средах с глицерином, чем дрожжи дикого типа (рис. 13)). Результаты данного эксперимента косвенно подтверждают, что мутантные укороченные версии гена МБК1 действительно направляют импорт тРЛ1 в митохондрии. Однако эффективность этого процесса в случае мутантных версий 20

гена ниже, чем в случае полноразмерного 1М-концевого домена белка, поскольку скорость поглощения кислорода при 37 °С оказалась на 30-60 процентов ниже, чем скорость поглощения кислорода контрольным штаммом (с рАвЬЯБ и рИЯЗ).

30 °С 37 °С

Рис. 13. Результаты роста дрожжей штамма 1¥АМ(рМК8) — штамм с делецией гена МЖ/ в геноме и с плазмидой с геном (фенотипически этот штамм эквивалентен

штамму дикого типа), штамма №АМ- с делецией гена М8К1, ¡УАМфАяНИЗ) - с заменой гена МЗК1 на ортологичный ген А. дох.чур//, ОР)(,оопт — оптическая плотность взвеси клеток, нанесенной в каждом ряду. УРС> - среда, содержащая глюкозу в качестве источника углерода, УРС1у - среда, содержащая глицерин в качестве источника углерода

Таким образом, оказалось, что исследованные укороченные версии ргеМвкЛр способны направлять импорт тРЛ 1 в митохондрии, а также направляют импорт как минимум одной дополнительной цитоплазматической тРНК (аланиновой). Судя по всему, участок белка, определяющий специфичность импорта, находится в пределах элементов вторичной структуры, отличающих самую длинную из исследованных версий (А5) от полноразмерного 14-

концевого домена. Эти элементы вторичной структуры включают в себя исследованные ранее а-спирали Н5 и Н6, а также ß-элемент А6.

Таким образом, участок Н5-Н6 отвечает не только за направление импорта тРЛ1 в митохондрии (в контексте полноразмерного белка), но и за специфичность этого процесса. С другой стороны, ранее в нашей лаборатории было показано, что нуклеотид в 34-м положении тРНК, то есть первый нуклео-тид антикодона, играет очень важную роль в качестве детерминанты импорта: если в составе тРЛ2 (неимпортируемой цитоплазматической лизиновой тРНК) заменить урацил в 34-м положении на цитозин, то есть на нуклеотид тРЛ1, то такая тРНК будет импортироваться в митохондрии. Можно предположить, что участок Н5-Н6, отвечающий за импорт тРЛ1, связывается с ан-тикодоном, то есть последовательностью тРНК, со своей стороны отвечающей за специфичность импорта. При таком допущении структура комплекса должна отличаться от классической структуры комплекса тРНК с соответствующей аминоацил-тРНК-синтетазой, в котором шарнирный участок белка расположен вблизи вариабельной петли тРНК. Это согласуется с полученными ранее в нашей лаборатории данными по футпринтингу, которые показали отличия в организации комплексов.

Разработка методики экспресии preMsklp

Гетерологическая экспрессия генов предшественников митохондриаль-ных белков представляет определенные трудности, поскольку наличие сигнала митохондриальной локализации в их составе приводит к накоплению белка в тельцах включения.

Нами была найдена и оптимизирована методика, которая позволила экс-прессировать preMsklp в растворимой форме. Суть метода заключается в экспрессии белка в условиях высокой тоничности среды (0,5 М NaCl) при низких температурах (20 °С) и при низких концентрациях индуцирующего агента (0,1-0,4 mM IPTG). При таких условиях в клетках Е. coli синтезируются белки-шапероны. Низкая температура культивирования и низкая кон-22

центрация индуцирующего агента приводит к медленному синтезу белка, что при наличии шаперонов способствует более корректному его сворачиванию и, следовательно, переходу белка в растворимую форму. Полученный белок оказался активным в стандартных тестах на определение активности ргеМвк! р: экспериментах по связыванию тРЛ1 и экспериментах по направлению импорта тРЛ1 в изолированные митохондрии.

Этот результат вплотную позволил нам приблизиться к проведению экспериментов по кристаллизации комплекса ргеМвЫр и тРЛ1.

выводы

1. In vitro и in vivo картирован участок предшественника митохондриаль-ной лизил-тРНК-синтетазы дрожжей, отвечающий за обеспечение доставки импортируемой лизиновой тРНК в митохондрии: этот участок включает в себя аминокислоты 208-243 (a-спирали Н5 и Н6, а также Р-элемент А6).

2. Установлено, что вторичная структура участка предшественника мито-хондриальной лизил-тРНК-синтетазы дрожжей (аминокислоты 208-243) в контексте полноразмерного белка критична для доставки импортируемой лизиновой тРНК в митохондрии in vivo

3. Укороченные версии N-концевого домена предшественника митохон-дриальной лизил-тРНК-синтетазы (аминокислоты 1-199, 1-164, 1-146 и 1-98) способны направлять неспецифический импорт тРНК в митохондрии дрожжей

4. Присутствие в митохондриях в норме не импортируемой цитоплазма-тической аланиновой тРНК не нарушает митохондриальную функцию клеток дрожжей

5. Делеция аминокислот 148-151 предшественника митохондриальной лизил-тРНК-синтетазы дрожжей приводят к двухкратному увеличению количества импортируемой цитоплазматической лизиновой тРНК в митохондриях по сравнению с нормальными значениями. Это не отражается на дыхательной функции клеток дрожжей. В то же время, делеция аминокислот 128-133 и одновременная делеция аминокислот 128-133 и 148-151 приводят к увеличению количества импортируемой цитоплазматической лизиновой тРНК в митохондриях в 9 и в 18 раз, соответственно, по сравнению с нормальными значениями. Это ассоциировано с существенным нарушениям дыхательной функции клеток дрожжей.

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Kamenski P., Smirnova Е., Kolesnikova О., Krasheninnikov I.A., Martin R.P., Entelis N., Tarassov I. tRNA mitochondrial import in yeast: Mapping of the import determinants in the carrier protein, the precursor of mitochondrial lysyl-tRNA synthetase//Mitochondrion. 2010. V. 10(3). P. 284-293.

2. Смирнова E.B., Лакунина B.A., Тарасов И., Крашенинников И.А., Каменский П.А. Неканонические функции аминоацил-тРНК-синтетаз// Биохимия (Москва). 2012. Т. 77. № 1. С. 21-33.

3. Kamenski P., Smirnova Е., Entelis N., Martin R.P., Krasheninnikov I., Tarassov I. Mutations in MSK1 gene: a possibility to alter the selectivity of tRNA import into yeast mitochondria// ARCUS Congress. Strasbourg. France. 2008. P. 50.

4. Смирнова E., Каменский П. Поиск участков белка preMsklp, необходимых для направления специфического импорта тРНК в митохондрии дрожжей// Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2009». Секция «Биология». Москва. Россия. 2009. С. 192.

5. Smirnova Е., Kamenski Р., Entelis N., Kolesnikova О., Krasheninnikov I.A., Martin R.P., Tarassov I. N-domain of mitochondrial lysyl-tRNA-synthetase precursor determines the selectivity of tRNA import into yeast mitochondria// 23rd tRNA Workshop. Aveiro. Portugal. 2010. P. 94

6. Kamenski P., Smirnova E., Entelis N., Krasheninnikov I.A., Martin R.P., Tarassov I. Precursor of mitochondrial lysyl-tRNA synthetase is a key player of yeast mitochondrial tRNA import game// 16th RNA Workshop. Kyoto. Japan. 2011. P. 475.

Заказ № 78-П/04/2012 Подписано в печать 16.04.2012 Тираж 70 экз. Усл. п.л.1,2

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-тай: info@cfr.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Смирнова, Екатерина Васильевна, Москва

61 12-3/787

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ _имени М.В. ЛОМОНОСОВА_

Биологический факультет

На правах рукописи УДК 547.963.32.02

СМИРНОВА Екатерина Васильевна

ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ИМПОРТИРУЕМОЙ В МИТОХОНДРИИ ДРОЖЖЕВОЙ ЛИЗИНОВОЙ тРНК С ПРЕДШЕСТВЕННИКОМ МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ ЛИЗИЛ-тРНК-СИНТЕТАЗЫ

03.01.03 - молекулярная биология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: кандидат биологических наук, П.А. Каменский

Москва 2012 г.

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений.......................................................................................................................5

1. Введение.....................................................................................................................................7

2. Обзор литературы: неканонические функции аминоацил-тРНК-синтетаз..........................9

2.1. АРСазы: общие сведения..............................................................................................9

2.2. Внеклеточные функции АРСаз..................................................................................16

2.2.1. АРСазы как цитокины.........................................................................................16

2.2.2. АРСазы как регуляторы ангиогенеза................................................................18

2.2.3. Участие АРСаз в сборке ретровирусных вирионов.........................................21

2.2.4. АРСазы как аутоантитела...................................................................................22

2.3. Цитоплазматические функции АРСаз.......................................................................23

2.3.1. АРСазы как регуляторы апоптоза......................................................................23

2.3.2. АРСазы как регуляторы трансляции.....................................................................23

2.3.3. Необычные реакции, катализируемые АРСазами............................................27

2.3.4. Участие АРСаз в репликации ДНК у бактерий...............................................29

2.3.5. АРСазы как регуляторы транскрипции генов..................................................30

2.4. Ядерные функции АРСаз............................................................................................30

2.4.1. Участие АРСаз в синтезе рРНК.........................................................................30

2.4.2. Участие АРСаз в формировании 3'-конца молекулы мРНК...........................31

2.4.3. Участие АРСаз в экспорте тРНК в цитозоль....................................................33

2.5. Митохондриальные функции АРСаз.........................................................................34

2.5.1. Участие АРСаз в сплайсинге интронов группы I митохондриальных РНК..........34

2.5.2. Участие АРСаз в импорте тРНК в митохондрии.............................................36

3. Материалы и методы............................................. ..................................................................39

3.1. Материалы...................................................................................................................39

3.1.1. Реактивы...............................................................................................................39

3.1.2. Растворы...............................................................................................................41

3.1.3. Коммерческие наборы........................................................................................42

3.1.4. Приборы, оборудование и расходные материалы.................. ..........................43

3.1.5. Программное обеспечение.................................................................................44

3.1.6. Штаммы микроорганизмов................................................................................44

3.1.7. Питательные среды.............................................................................................44

3.1.8. Генно-инженерные конструкции.......................................................................45

3.1.9. Олигонуклеотиды................................................................................................50

3.2. Методы.........................................................................................................................51

3.2.1. Полимеразная цепная реакция...........................................................................51

3.2.2. Рестрикция...........................................................................................................51

3.2.3. Электрофорез в агарозном геле.........................................................................52

3.2.4. Дефосфорилирование..........................................................................................52

3.2.5. Очистка продуктов реакции рестрикции, ПЦР или

реакции дефосфорилирования..........52

3.2.6. Лигирование.........................................................................................................52

3.2.7. Переосаждение НК..............................................................................................52

3.2.8. Трансфекция клеток S. cerevisiae......................................................................53

3.2.9. Измерение поглощения кислорода клетками S. cerevisiae..............................53

3.2.10. Определение фенотипов штаммов дрожжей S. cerevisiae.............................54

3.2.11. Транформация клеток Е. coli............................................................................54

3.2.12. Выделение общеклеточной ДНК из клеток S. cerevisiae...............................54

3.2.13. Выделение фракции плазмидной ДНК из клеток Е. coli...............................55

3.2.14. Измерение содержания белка в препарате методом Бредфорд....................55

3.2.15. Выделение митохондрий из клеток S. cerevisiae............................................55

3.2.16. Выделение промитохондрий из клеток S. cerevisiae......................................56

3.2.17. Выделение фракции малых РНК из митохондрий

(или промитохондрий) клеток S. cerevisiae.......57

3.2.18. Выделение тотальной РНК из клеток S. cerevisiae.........................................57

3.2.19. Электрофорез РНК в полиакриламидном геле...............................................58

3.2.20. Нозерн-блот гибридизация...............................................................................58

3.2.21. Вестерн-блот гибридизация.............................................................................59

3.2.22. In vitro Т7-транскрипция...................................................................................59

3.2.23. Аминоацилирование тРНК...............................................................................60

3.2.24. Транспорт радиоактивно-меченных тРНК в изолированные

митохондрии дрожжей (импорт in vitro)......60

3.2.25. Метод задержки в геле......................................................................................61

3.2.26. Выделение тРЛ1 в аминоацилированной форме из клеток S. cerevisiae.....61

3.2.27 Проверка статуса аминоацилирования тРНК..................................................62

3.2.28. Гетерологическая экспрессия белков в клетках Е. coli.................................62

3.2.29. Аффинная хроматография белков с применение носителя с

иммобилизованными ионами никеля (Ni-агарозы)......63

3.2.30. Измерение кругового дихроизма белков........................................................63

4. Результаты и обсуждение.......................................................................................................64

4.1. Поиск участков preMsklp, являющихся ответственными за импорт

tPJII в митохондрии дрожжей.......64

4.2. Мутагенез участков Н1-НЗ и Н5-Н6 и исследование влияния

мутаций на импорт tPJII.......66

4.3. Исследование влияния участков di и d2 на импорт tPJII в митохондрии.................79

4.4. Поиск участков preMsklp, определяющих специфичность

импорта тРЛ1 in vivo......84

4.5. Разработка методики экспрессии preMsklp.............................................................91

Выводы.........................................................................................................................................99

Благодарности............................................................................................................................100

Список цитируемой литературы..............................................................................................101

Приложение................................................................................................................................110

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

Ар4А

CD AM

СР1 EGF

EMAP II

GAIT

GAPDH

HUVEC

IPTG

NS1

NSAP1

ORF

PDGF

PPi

TNFa

VEGF

Аа-АМФ

Аа-тРНК

Аа, а/к

АТФ, АДФ

ГТФ, ГДФ

АРСаза

ВИЧ-1

ДМ

ДНК

ДЭАЭ

диаденозинтетрафосфат

cell-death associated molecules, молекулы, ассоциированные с клеточной гибелью

connective polypeptide 1, соединительный полипептид 1 epidermal growth factor, эпидермальный фактор роста endothelial monocyte-activating polypeptide II, эндотелиальный моно-цит-активирующий полипептид

IFN-gamma-activated inhibitor of translation, ингибитор трансляции, активируемый интерфероном-у

glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа

human umbilical vein endothelial cells, клетки эндотелия пупочных сосудов

изопропил-ß-D-1 -тиогалактопиранозид

non-structural protein 1, неструктурный белок 1

NS1 -associated protein-1, белок 1, ассоциированный с NS1

open reading frame, открытая рамка считывания

plateled-derived growth factor, тромбоцитарный фактор роста

пирофосфат

tumor necrosis factor а, а-фактор некроза опухолей

Vascular endothelial growth factor, фактор роста сосудистого эндотелия

аминоациладенилат

аминоацил-тРНК

аминокислота

аденозинтрифосфат, аденозиндифосфат гуанозинтрифосфат, гуанозиндифосфат аминоацил-тРНК-синтетаза вирус иммунодефицита человека 1 дерматомиозит

дезоксирибонуклеиновая кислота диэтиламиноэтил

илп

МНФ мРНК мРНП

нк

ОРС, ORF

п.о., п.н.

ПААГ

ПМ

ПМНЛ

ПЦР

РА

РНК

РНКаза А рРНК СКВ тр1

тРЛ1, 2, 3 тРНК

ХххРС

ЭГТА ЭДТА

интерстициальныи легочный процесс мононуклеарные фагоциты матричная РНК

матричный рибонуклеопротеид нуклеиновая кислота

открытая рамка считывания (open reading frame) пары оснований, пары нуклеотидов полиакриламидный гель полимиозит

полиморфонуклеарные лейкоциты полимеразная цепная реакция ревматоидный артрит рибонуклеиновая кислота рибонуклеаза А рибосомальная РНК системная красная волчанка Т7-транскрипт гена тРЛ1 лизиновая тРНК 1, 2, 3 S.cerevisiae транспортная РНК

любая АРСаза (Ххх - обозначение аминокислоты в трехбуквенном

русском коде)

этиленгликотетраацетат

этилендиаминтетраацетат

Обозначения аминокислот и нуклеотидов приводятся в соответствии со стандартными правилами сокращений.

Названия белков и генов дрожжей приводятся согласно базе данных Saccharo-myces Genome Database (http://www.yeastgenome.org/).

1. ВВЕДЕНИЕ

Митохондрии обладают собственным геномом и системой синтеза белка, однако большинство генов в ходе эволюции перенеслось из митохондриального генома в ядерный. В связи с этим из цитоплазмы в митохондрии импортируется значительное число макромолекул: как белков, так и РНК. Количество импортируемых в митохондрии белков у всех организмов значительно превосходит количество белков, синтезируемых в ми-тохондриальном матриксе (например, у человека в митохондриях синтезируется 13, а у S. cerevisiae — 9 белков из более чем тысячи необходимых для функционирования орга-нелл). В то же время, количество импортируемых РНК значительно варьируется от вида к виду. Так, например, у простейших рода Tetrahymena из 36 митохондриальных тРНК из цитоплазмы импортируется 26, у растения M. polymorpha импортируется 2 тРНК, а 27 закодировано в митохондриальном геноме, у дрожжей S. cerevisiae импортируется лишь одна лизиновая тРНК. У млекопитающих тРНК в митохондрии не импортируются, однако показан импорт 5S рРНК и РНК, входящих в состав РНКаз Р и MRP.

Несмотря на то, что у млекопитающих отсутствует конститутивный импорт тРНК, в их клетках есть все необходимое для осуществления этого процесса. Было показано, что производные импортируемой дрожжевой тРНК (tPJII) при экспрессии их генов в клетках человека начинают импортироваться в митохондрии млекопитающих и включаться в процесс трансляции (Kolesnikova et al., 2004). Это позволяет предполагать, что импорт тРНК в митохондрии у дрожжей и млекопитающих происходит по одному и тому же механизму. Значительное количество наследственных заболеваний человека ассоциировано с мутациями в ми-тохондриальной ДНК. Эти мутации зачастую затрагивают гены тРНК. Импорт не мутированных тРНК из цитоплазмы и их включение в митохондриальную трансляцию позволил бы су-прессировать такие мутации.

Импорт tPJI 1 в митохондрии дрожжей является высокоспецифичным процессом. В определении его специфичности играет роль не только нуклеотидная последовательность импортируемой тРНК, но и структура белка-переносчика, которым является предшественник митохондриальной лизил-тРНК-синтетазы (preMsklp). Этот белок после импорта в митохондрии подвергается протеолитическому расщеплению, в результате которого теряет сигнал митохондриальной локализации. После этого белок становится функциональным в качестве аминоацил-тРНК-синтетазы и выполняет свою основную

функцию - аминоацилирует митохондриальную лизиновую тРНК (тРЛЗ). Ранее в нашей лаборатории было показано in vitro, что мутагенез определенных участков preMsklp расширяет набор импортируемых молекул. В нашей работе мы попытались определить степень вовлеченности этих участков в обеспечение импорта тРЛ1 в митохондрии, а также их роль в процессе определения специфичности импорта.

Целью данной работы было выявление в составе белка preMsklp участков, обеспечивающих процесс импорта тРЛ1 в митохондрии дрожжей, и определение, как мутагенез этих участков влияет на процесс импорта тРЛ1, а также выявление участка белка, отвечающего за определение специфичности импорта тРНК в митохондрии дрожжей.

Для достижения этих целей были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1) Сравнить последовательность preMsklp с известной последовательностью лизил-тРНК-синтетазы Е. coli, найти участки, по которым отличается вторичная структура белков.

2) С помощью сайт-направленного мутагенеза создать мутантные версии preMsklp с делениями найденных участков.

3) Используя методы задержки в геле и in vitro импорта тРНК в митохондрии, определить, способны ли мутантные версии белка связывать тРЛ1 и направлять ее импорт в изолированные митохондрии.

4) Создать штаммы дрожжей с заменой гена MSK1 на одну из его мутантных версий. Определить фенотипическое проявление мутаций в гене MSK1.

5) Выделить митохондрии из мутантных штаммов дрожжей и методом Норзерн-блот гибридизации определить, какие из цитозольных малых РНК присутствуют в митохон-дриальном матриксе.

6) Подобрать условия гетерологической экспрессии гена MSK1 в клетках Е. coli, приводящей к синтезу белка в растворимой форме.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ НЕКАНОНИЧЕСКИЕ ФУНКЦИИ АМИНОАЦИЛ-тРНК-СИНТЕТАЗ

На протяжении десятков лет постулат «один белок - одна функция» считался аксиомой. Однако сейчас становится понятным, что клеточные белки работают в составе сложной сети, разветвленность которой достигается за счет многофункциональности многих белков. Хорошо изученным примером белка с несколькими функциями является цитохром с, который не только участвует в синтезе АТФ в митохондриях, но также может высвобождаться из митохондрий (например, при серьезном повреждении ДНК) и приводить к активации каскада каспаз и, в результате, к апоптозу (Ко et al., 2002). Белок может действовать по-разному в разных клеточных компартментах; в клетке и после секреции в межклеточное пространство; в мономерном или олигомерном состоянии; при связывании разных лигандов и т.д. (Jeffery, 1999).

Многие аминоацил-тРНК-синтетазы (АРСазы) также являются многофункциональными белками. Помимо своей основной функции - ковалентного присоединения аминокислоты к соответствующей тРНК - они могут участвовать в транспорте тРНК, сплайсинге РНК, апоптозе, регуляции транскрипции и трансляции (Ibba and Soll, 2001), (Martinis et al., 1999), передаче сигнала от внешней среды внутрь клетки (Wakasugi and Schimmel, 1999b). Эти неканонические функции были обнаружены у АРСаз самых разных групп живых организмов. Предположительно, АРСазы приобрели дополнительные функции для связывания процесса белкового синтеза с другими процессами, протекающими в клетке (Ко et al., 2002).

2.1. АРСазы: общие сведения

Согласно адаптерной гипотезе Ф. Крика (1957 г.), тРНК является той молекулой, при помощи которой осуществляется «перевод» генетической информации в последовательность аминокислот в белковой молекуле. тРНК - небольшая молекула (примерно 80 нуклеотидов), вторичная структура которой имеет вид «клеверного листа» (рис. 1). Такая вторичная структура позволяет молекуле сложиться в L-образную третичную структуру (рис. 2) (Киселев, 1984).

А

Аминоакцелтортй

стебель

¡-ветвь

В1

я».

О-яетвь

II

1Ш

1т

И 1ВВ

■

|р|| ■

и

М йвг (¡¡¡к 1Ив

. с

7,Щ

лш ЯР^

Вариабельная петля

ветвь

Ч

Н

Нукпеотидаые остатки, образующие автагадон

Аминоакцетггорный стебель

0-8в¥8ь

Вариабельная петля

Антикодоновая ветвь

Нукпштидные остатки, образующие антикодон

Рис. 1. Вторичная структура тРНК

Рис. 2. Третичная структура тРНК

Схема процесса образования третичной структуры представлена на рис. 3. Два основных домена, образующих третичную Ь-образную структуру молекулы, расположены под углом 90°. Один из доменов состоит из акцепторного стебля и Т-ветви молекулы, а второй - из антикодоновой и О-ветвей. Т- и Б-шпильки взаимодействуют, образуя «угол» Ь-образной структуры (Киселев, 1984).

О-ветвь

3'

Аминоакцепторный стебель

Т-ветвь

Т-ветвь

Аминоа кцептор ный стебель

Р-ветвь

Вариабельная петля

Антикодоновая ветвь

Вариабельная петля

Антикодоновая ветвь

Рис. 3. Схема образования третичной структуры тРНК из вторичной структуры «клеверный лист»

К тРНК в L-форме и присоединяется аминокислота в реакции аминоацилирования.

Аминоацилирование тРНК является ключевым этапом процесса трансляции генетической информации (Soll, 1990). Эту реакцию осуществляют ферменты семейства аминоа-цил-тРНК-синтетаз (АРСаз), способных специфически узнавать и связывать три субстрата: тРНК, АТФ и аминокислоту. В каждой клетке АРСаза, узнающая определенную аминокислоту, узнает и соответствующую тРНК и осуществляет ковалентное присоединение аминокислоты к тРНК (Schulman, 1991).

Аминокислота в реакции аминоацилирования присоединяется к 3'-концу молекулы тРНК. Реакция проходит в два этапа: первый этап - активация аминокислоты:

Аа + АТФ Аа-АМФ + PPi; где Аа - свободная аминокислота, Аа-АМФ - аминоациладенилат, PPi - пирофосфат.

Аминоациладенилат, образующийся в результате реакции, не высвобождается в раствор, а остается в составе комплекса с АРСазой. Равновесие в реакции активирования аминокислоты сдвигается в сторону образования продуктов реакции за счет гидролиза пирофосфата.

Второй этап - акцептирование аминокислоты молекулой тРНК: Аа-АМФ + тРНК <-* Аа-тРНК + АМФ;

где Аа-тРНК - аминоацил-тРНК.

На этом этапе происходит присоединение аминокислоты к 2'- или 3'-гидроксильной групп�