Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выявление структурных особенностей лизиновойтРНК, определяющих ее селективный импорт вмитохондрии дрожжей

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Выявление структурных особенностей лизиновойтРНК, определяющих ее селективный импорт вмитохондрии дрожжей"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

На правах рукописи

ГТ5 ОД ? 5 И яиц

КАЗАКОВА Елена Александровна

Выявление структурных особенностей лизиновой тРНК, определяющих ее селективный импорт в митохондрии дрожжей.

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2000

Работа выполнена на кафедре молекулярной биологии Московского Государственного Университета им. М.В.Ломоносова и в лаборатории ЦРЯ 9005 С.Ш1.8. "М.М.О.С.О" г.Страсбург, Франция.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук, E.H. Добров кандидат биологических наук, В.Н. Ксензенко

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Институт Биохимии им.А.Н. Баха,

Защита состоится в " " 2000 года на заседании

Диссертационного Совета Д.053,0532 при Московском Государственном Университете им.М.В.Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Воробьевы Горы, МГУ, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им.М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан

2000 года

Ученый секретарь Диссертационного совета,

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

Профессор, к.б.н. И.А.Крашсншшикоа

Кандидат биологических наук

£okt. /УЗ. О — >

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Митохондрии имеют собственный геном и собственный трансляционный аппарат. Однако, большая часть митохондриальных белков закодированы в ядерном геноме, синтезируются в цитоплазме и транспортируются в митохондрии. Сравнительно недавно был открыт также импорт нуклеиновых кислот в митохондрии. Импорт тРНК был показан для дрожжей, простейших и растений. В митохондрии млекопитающих импортируются другие виды РНК, которые входят в состав РНКазыР и митохондриалыюй сайт-специфической эндорибонуклеазы (MRP), а также 5S рРНК. Количество транспортируемых видов тРНК колеблется у различных организмов. "У дрожжей импортируется только одна тРНК, а у трияаиосоштвд все тРНК закодированы s ядре. Несмотря на растущее количество примеров импорта РНК, очень мало известно о том, каким образом нуклеиновые кислоты импортируются в митохондрии.

Недавние исследования показали, что в самой последовательности тРНК могут бьггь элементы, определяющие специфичность импорта молекул. Подобные элементы обнаружены в антикодоне тРНКс|" Tetrahymem piriformis и в D-петле тРНКПе Leishmania tarentolae.

В нашей лаборатории изучаются механизмы импорта тРНК на примере лизиновой тРНК дрожжей. В клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae только одна лизиновая тРНК с антикодоном CUU (тРНК1) импортируется в митохондрии. Другая лизиновая тРНК с антикодоном UUU (тРНК2) присутствует исключительно в цитоплазме. Хотя существуют некоторые структурные различия тРНК1 и тРНК2, обе они аминоацилируются одной и той же цитоплазматической лизил-тРНК-синтетазой, ICRS. В процессе импорта принимает участие предшественник митохондриальиой лизил-тРНК-синтетазы, пре-MSK [Tarassov et al., 1995]. Ранее в нашей лаборатории было показано, что нуклеотид в 34 положении антикодона является одним из элементов, определяющих специфичность импорта [Entelis et al., 1998].

Данная работа продолжает тему изучения и поиска элементов в структуре РНК, обеспечивающих ее избирательный импорт в митохондрии. Изучение

механизмов импорта нуклеиновых кислот является одной из актуальных проблем современной биологии. Известно, что некоторые болезни человека связаны с мутациями в митохондриальных тРНК. Понимание процесса импорта тРНК поможет решению проблемы транспортировки генного материала непосредственно в митохондрии.

Цель и задачи исследования

Цель данной работы - идентификация элементов в структуре импортируемой лизиновой тРНК дрожжей, определяющих ее избирательный импорт в митохондрии. В ходе исследования решались следующие задачи:

1. Поиск нуклеотидов в аминоакцепторной части молекулы лизиновой тРНК, которые определяют избирательный импорт тРНК в условиях in vitro.

2. Введение предположительных детерминант импорта в последовательность изоакцепторной «импортируемой цигопяазматической лизиновой тРНК2 и исследование импорта гибридных молекул in vivo.

3. Выявление нуклеотидов или нуклеотидных последовательностей в центральной части молекулы лизиновой РНК, определяющих высокое сродство к одному из факторов импорта, предшественнику мигохондриальной лизил-тРНК-синтетазы (npe-MSK), и способствующих импорту в изолированные митохондрии с использованием метода SELEX (The Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment).

4. Анализ отобранных в ходе SELEXa последовательностей РНК, способных эффективно импортироваться в митохондрии.

Научная новизна и практическая ценность работы:

В настоящей работе впервые были выявлены нуклеотиды в аминоакцепторной части лизиновой РНК, определяющие избирательный импорт в митохондрии дрожжей. Используя экспериментальные подходы импорта гибридных молекул in vitro и in vivo, было показано, что первая пара в аминоакцепторном стебле G1-C72 и куклеотпд-дискриминатор U73 являются элементами, важными для селективного импорта тРНК1.

Был применен новый метод исследования SELEX для отбора молекул РНК, эффективно импортирующихся в изолированные митохондрии. Была проведена

также селекция по связыванию с одним из основных факторов импорта, предшественником митохондриальной лизил-тРНК-синтетазы, npe-MSK.

После нескольких раундов селекции вырожденной библиотеки РНК по импорту в изолированные митохондрии, были отобраны варианты, обладающие способностью импортироваться в изолированные митохондрии более эффективно, чем лизюговая тРНК1. Анализ последовательностей этих РНК показал наличие консервативного района с 10 по 23 нуклеотид. Селекция в районе антикодона, V-летли и Т-ветви отсутствовала. Для нескольких молекул, обладающих способностью к высокоэффективному импорту, предложены вторичные структуры.

Результаты работы позволяют приблизиться к пониманию механизмов импорта нуклеиновых кислот. Полученные в ходе селекции последовательности РНК, способные к высокоэффективному импорту, могут быть использованы для разработки искусственной системы импорта РНК в митохондрии.

Апробация работы

Диссертация была апробирована на совместном заседании кафедры молекулярной биологии и кафедры биохимии Московского Государственного Университета 24 мая 2000 года.

Материалы исследований, представленных в работе докладывались на международных конференциях "The First Annual Meeting of the RNA Society" (США, 1996), "The Third Annual Meeting of the RNA Society' (США,1998) " The Fifth Annual Meeting of the RNA Society" (США, 2000) и "Ломоносов-98" (Москва, 1998).

Публикации: По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ. Структура и объем работы:

Диссертация состоит из глав "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты и обсуждение" и "Выводы". Список цитируемой литературы включает 120 публикаций. Работа изложена на 150 страницах, содержит 28 рисунков, 13 таблиц и 2 приложения.

Результаты н обсуждение

В митохондрии дрожжей импортируется одна лизиновая тРНЮ с антикодоном С1Ш. Другая изоакцепторная лизиновая тРНК2 с антикодоном ШШ присутствует только в цитоплазме. Между этими тРНК имеются структурные различия, сконцентрированные в районе И-ветви, ангикодонового и аминоакцепторного стеблей (рис. 1). Обе тРНК аминоацилируются одной и той же цитошшматической лизиновой амидаацил-тРНК-синтетазой (КЕ5). Было выдвинуто предположение, что в структуре тРНК1 есть уникальные участки, которые узнаются белковыми факторами, направляющими импорт тРНК1 в матрикс митохондрий.

Ранее в нашей лаборатории было показано, чгго элементы, определяющие специфичность импорта локализованы в аминоакцепторном стебле и антикодоновой петле. Полученные данные указывали, что нуклеотид в 34 положении антикодона является одним из этих элементов [ЕшеНэ & а1., 1998].

Рис.1. Последовательность двух тоакцепторных цитоплазматичсских лизиновых тРНК в. ссге\тхие.

1ЯК1

1ЙК2

"ЖК1"- тРНК1 импортируемая в митохондрии, 'ЧГгКЗ" -тРНК2 присутствует только в цитоплазме. Нуклеотиды, по которым тРНК1 отлпчается от тРНК2 заключены в окружности. и*-2-гио-5-карбокснметилуридии

1. Элементы, определяющие селективность импорта в

амииоакцепторном стебле лишновой tPIIK 1.1. Изучение гибридных молекул тРНК! и тРНК2 in vitro

Нуклеотидные последовательности амииоакцепторных стеблей тРНК1 и

тРНК2 отличаются в позициях 1, 67-69, 72 и 73. Были созданы мутантные версии,

несущие изменения в последовательностях генов тРНЮ и тРНК2 в этих позициях

(табл. 1). Результаты импорта в изолированные митохондрии, связывания с пре-

MSK in vitro и кинетические константы аминоацилирования для Т7-транскриптов

соответствующих генов предстаатены в таблице 1 и на рис.2.

Рнс.2. Результаты импорта trA, trB, trC, tr 93, tr29, tr2, tri и tr30 в изолированные митохондрии дрожжей.

trA trB trC tri tr29 tr2 tr30 tr 93

ш m '¡щ v

Радиоавтограф геля. На 12% денатурирующий полпакриламидный гель (ПААГ) были нанесены фракции РНК, выделенные из матрикса митохондрий после импорта 32Р-меченных транскриптов in vitro.

Замена нуклеотидов в положении 67-69 в контексте последовательности тРНК! привела к потери способности эффективно связываться с npe-MSK и импортироваться в митохондрии (trC и tr40). Однако, замена нуклеотидов 67-69 в последовательности тРНК2 па нуклеотиды, свойственные тРНЮ в тех лее самых позициях, не приводила к импорту подобных молекул (trA и trB). Таким образом, эти нуклеотиды не являлись элементами, обеспечивающими селективность импорта. Замена 73 нуклеотида, иначе называемого дискриминатором, в тРНК1 (tr29) значительно снизила эффективность импорта. Замена G73 на U73 в контексте тРНК2, наоборот привела к эффективному импорту tr93. Подобный эффект можно объяснить тем, что дискриминатор влияет на структуру аминоакцепторного стебля, в частности G73 ослабляет взаимодействия концевой пары нуклеотидов [Lee et al., 1993]. По-видимому, стабильность первой пары нуклеотидов важна для селективности импорта. Для того чтобы оценить роль первой пары нуклеотидов были созданы конструкции (trC trA, trB), где первая пара нуклеотидов (G1-u72)

аминоахцепторного стебля не была строго комплементарна. В последовательности тРНК2 замена первой пары нуклеотидов (1тА) была проведена одновременно с заменой дискриминатора. Полученный транскрипт был похож на хорошо импортируемый м93. В сВ нуклеогид-дискриминатор был делетирован. Однако, и-А, Ц-В и 1гС аминоацилировались КЯИ, но не имели,сродства к пре-МБК и не импортировались в митохондрии.

Таблица 1. Ашшоацшшроваяие, связывание с пре-МЗК и импорт мутантньм транскриптов, тРНК1 и тР1ПС2.

тРНК Контекст Нуклеотиды8 Аминоацилнрование'" Pre-MSKD Импорт1', %

1:72 34 67-69 73 Км VM Vm/K„ +KRS -KRS

tPHKI G:C С CAG U 1.4 2600 16.2 100 5 юо

TPHK2 <f:A и ЧОА G 1.5 2500 14.5 <5 15 0

tri tPHKI G:C с CAG U 2.2 250 1.00 85 20 120

tr2 ЧРНК2 G:C с VGA G 1.5 450 2.6 100 40 150-200

tr29 tPHKI G:C с CAG G 6.7 290 0.4 75 45 75-1Û0

tr40 tPHKI G:C с VGA II 1.8 5 0.03 10 5 <5

trC* tPHKI G:U с VGA U 0.5 15 0.25 5 15 <5

tm' TPHK2 G:C V VGA и 5.9 10 0.02 45 100 75-100

trA' TFHK2 G:U и CAG и 0.7 70 0.85 <5 <5 <5

trB* TPHK2 G:U V CAG - 0.7 45 0.55 10 <5 <5

tr 33 TPHK2 G:U с VGA и 4.2 10 0.02 30 <5 <5

tr30 TPHK2 G: С и VGA G 1.2 15 0.10 20 20 5-10

*- конструкции, полученные в ходе данной работы.

А - мутации были внесены в последовательность тРНК1 или тРНК2. Соответственно, исследуемые транскрипты имели последовательность или тРНК1 или тРНК2, за исключением нуклеотидов, отмеченных в графе "Нуклеотиды". В — курсивом выделеяы иуклеотиды, присущие ненмнортнруемой тРНК2. С - расчеты производились по методу Лайпуивера-Бэрка.

D - связывание транскриптов и лиаивовых тРНК с iipe-MSK оценивали после предварительной инкубации с KRS (+KRS) и без нее (-KRS). За 100% принята эффективность связывания импортируемой тРНК1 в амяноацилировааном состоянии. Е - количественную оценку эффективности импорта транскриптов и лизиновых тРНК проводили по результату радиоавтографа электрофореза в ПААГ 32Р-меченных РНК на приборе Phosphor Imager (Fuji, Bas -2000). Импорт tPHKI в митохондрии был принят за 100%.

Эта результаты ясно указывают, что стабильность первой пары нуклеотидов в аминоакцепторном стебле тРНК важна при взаимодействиях с пре-MSK, а также влияет на эффективность импорта. В связи с тем, что для Т7-транскрипции

необходим гуанин в стартовом положении, мы не могли создать и анализировать конструкцию in vitro, полностью аналогичную тРНК2, поэтому были использованы подходы in vivo.

1.2. Импорт мутантных тРНК in vivo

Экспериментальный подход заключался в трансформации клеток дрожжей плазмидами, содержащими мутантные гены тРНК2 и в количественном определении наличия мутантных тРНК в цитоплазме и в матршссе митохондрий. В связи с тем, что в митохондрии импортируется тРНК1, количественное определение мутантных версий тРНК1 в митохондриях затруднено. Поэтому анализировался импорт гибридных молекул тРНК2 с заменами в аминоакцепторном стебле.

Как уже отмечалось ранее, тРНК2 не импортируется в митохондрии, тем не менее, транскрипты с последовательностью неимпортируемой тРНК, синтезированные in vitro (tr30), проникают в митохондрию с небольшой эффективностью. Вероятно, это связано с отсутствием посттранскрипционных модификаций и с заменой 1-ой пары в аминоакцепторном стебле.

Для проверки наших предположений о роли нуклеотидов 34, 1-72 и 73, которые вероятнее всего определяют селективный импорт, в последовательность тРНК2 были внесены замены, соответствующие последовательности импортируемой тРНЮ. Если при этом ранее неимпортируемая тРНК2, могла бы проникать в митохондрии, это подтвердило бы наши выводы о значимости этих нуклеотидов в избирательном импорте в митохондрии.

Для того, чтобы определить эффективность импорта мутантных версий тРНК2 в митохондрии, был использован метод точечной гибридизации мутантных версий тРНК2 с 32Р-меченными олигонуклеотидами. (Олигонуклеотиды были комплементарны мутантным версиям тРНК2 и использовались как зонды. Уровень сигнала определяли по радиоавтографу на приборе Phosphor Imager (Fuji, Bas -2000). Результаты представлены на рисунке 3 и в таблице 2

Таблица 2. Импорт in vivo мутантиых версий тРНК2

тРНК1 ТРНК2 ТРНКЗ Мутантные версии тРНК2

3J 4 5 6 7 « 9 ¡в

Антикодон сии SUU иии U'UU CVll U'UU U'UU U'UU cuu V'UU CÜU

1:72 G:C Ч<:А С:С U:A U:A G:C GXA U:C G'.C G:C G:C

73 и G А G G G G G G U и

Цитоплазма" 100 30 1 52 55 110 1 70 45 25 i 20

Митохондрияь 45 - 100 - 5 27 - - 12 10 10

Эффективн. Импорта5 100 - 20 55 60 90 110

а - Уровень экспрессии мутантных вариантов тРНК2 оценивали как отношение сигнала гибридизации с мутантпыми олигами к сигналу гибридизации с олигом к тРНК1. Уровень сигнала, полученный после гибридизации с зондом к тРНК1, принят за 100%.

b - митохондриальный пул тРНК, Уровень сигнала, полученный после гибридизации с зондом к тРНКЗ, принят за 100%

с-эффективность импорта оценивали как отношение митохопдриального пула к цнтоплазматическому и выражали в процентах по отношению к эффективности импорта тРНК1 d~TpffiC2 ген без мутаций, клонированный в вектор pRS416 е- присутствие модификаций в первом положении антикодона не оценивали

Рнс. 3. Импорт in vivo мутантных версий т?НК2.

И9 1RK2 tRKl 5 8 9 10 1RK3

Cytoplasm 1 0.1 0.01 0 • № Í5 . # t£ Ш' 0 ■

Mitochondria O.l 001 * » © » в

Точечная гибридизация общеклеточной (Cytoplasm) и митохондриальной (Mitochondria) фракции тРНК, экстрагированной из клеток, трансформированных плазмидами. Гибридизацию проводили с одигонуклеотидами, соответствующими исследуемой мутантной версии, "^"-количество тРНК, нанесенной на фильтр. "tRKl", "tRK2" и "tRK3" - гибридизация с зондами на импортируемую (тРНК1), неимпортируемую (тРНК2) н мптохондриальную тРНКЗ.

Мутантные версии тРНК2 экспрессировались в цитоплазме с эффективностью 20-110% по сравнению с тРНК1. Одна версия тРНК2 (N 6) не синтезируется. Эта тРНК имела G1-A72 в качестве первой пары нуклеотидов аминоакцепторного стебля. Вероятно, отсутствие комплементарности этой пары

влияет на созревание и\яли стабильность тРНК. Версия с концевой парой U1-C72 хорошо экспрсссируется, но не импортируется в митохондрии. Этот результат соответствует нашим данным in vitro (trA, trB, trC). Введение "сильной" пары Gr С72 позволяет импортироваться подобной тРНК даже если ее антикодон аналогичен антикодону тРНК2 (версия 5). Это ясно указывает на важность первой пары аминоакцепторного стебля в селективном импорте. Замена нуклеотида-дискриминатора в 73 позиции (U73) импортируемой тРНК1 увеличивает эффективность импорта (версия 9), но экспрессия уменьшается. Дополнительное изменение U34 на С34 в антикодоне (версия 8) не сильно меняет эффективность импорта по сравнению с 5 версией. Наконец, версия 10 имеет все три мутации и импортируется наиболее эффективно. Мугангная версия тРНК2 с заменой 34, 73 и 1-72 нуклеотидов импортируется на уровне тРНЮ. Основываясь на полученных данных, мы полагаем, что первое положение антнкодона (34 н), дискриминатор (73 н) и первая пара в аминоахцепторном стебле (1-72 н) являются элементами в структуре лизиновой тРНК, определяющими селективный импорт данной тРНК в митохондрии.

2. Поиск нуклеотидпых последовательностей в молекуле лизиновой тРНК, способствующих избирательному импорту в митохондрии, с использованием метода SELEXa

Для выявления нуклеотидпых последовательностей, определяющих избирательный импорт TpHKLys в митохондрии и способствующих связыванию с npe-MSK, был использован метод SELEX.

Мы создали библиотеку РНК, имеющую случайные замены нуклеотидов в позициях, по которым тРНК1 и тРНК2 отличаются (за исключением района аминоакцепторного стебля, который соответствовал последовательности тРНК!). Исходная олигонуклеотидная матрица содержала 15 вырожденных позиций, т.е. таких позиций, в которых G, А, С и Т встречались с одинаковой вероятностью. После проведения реакций амплификации и Т7-транскрипции мы получили библиотеку РНК, которая состояла из 1,07х109 различных последовательностей. Все последовательности имели в первой позиции гуанин (это необходимое условие для транскрипции in vitro). Для того, чтобы отличить искусственно отобранные последовательности лизиновой тРНК от нативной тРНК1,

присутствующей в митохондриях, позиция 31 не была вырожденна и несла гуанин

по аналогии с последовательностью тРНК2 (рис.4).

Рис.4. Вырожденная библиотека последовательностей лизииовой тРНК

$.сеге\тае.

Позиции, где случайным образом были изменены нуклеотиды (вырожденные позиция), отмечены цифрами. Стрелками указаны третичные взаимодействия.

Полученную библиотеку РНК селектировали двумя различными способами. Серию "импорт" отбирали на способность импортироваться в изолированные митохондрии. Исходную библиотеку РНК инкубировали с изолированными митохондриями в условиях оптимальных для импорта, затем выделяли митохондриальную РНК и проводили обратную транскрипцию и амплификацию (RT-PCR). Далее проводили реакцию Т7-транскрипции in vitro. Затем транскрипты очищали при помощи электрофореза в ПААГ и повторяли цикл селекции. Эту серию отобранных библиотек мы обозначили S1, После 8 циклов селекции были отобраны варианты, способные эффективно проникать в органеллу (рис.5, А).

Другую часть исходной библиотеки РНК, серию "npe-MSK+импорт", селектировали на способность связываться с иммобилизованным на BrCN-сефарозе фактором импорта, предшественником митохондриальной дизил-тРНК-синтетазы, npe-MSK. Связавшуюся с белком РНК элюировали и проводили импорт в изолированные митохондрии. Затем выделяли митохондриальную РНК и проводили RT-PCR (рис.5, В). Эту серию мы обозначили S2. Было проведено 7 циклов селекции.

Рис. 5. Схема эксперимента по селекции выроадепных библиотек лизпновой тРНК Л'.сегеушяе. А. Селекция библиотек РНК серии "импорт".

селекгпрфваняян библиотека ГНК

кДИК

обратная транскрипция н ПЦР

ш&тпше лыжах. РНК

В. Селекция библиотек РНК серии "пре-МБК+импорт".

селектированная библиотека РНК

¥

Т7-трянскрвппня

кДНК

обратная транскрипция я ПЦР

(ПА деление .нитах.

РНК

Т1М20 и Т1М44 - митохондриальиые рецепторы, участвующие в импорте тРНК. ЮР-фракция цитоплазматических белков, необходимая для импорта тРНК. А и В-олигонуклеотиды, используемые для ИТ-РСК.

2.1. Характеристика библиотек ИПС, подученных в ходе селекции по митохондрпальному импорту

Для того чтобы оценить эффективность селекции, библиотеки РНК после каждого цикла сравнивали по эффективности импорта и связывания с пре-МвК. Для этого Т7-траискршггы метили радиоактивным фосфором и проводили импорт в условиях гп \itro. Эффективность импорта библиотек оценивали относительно импорта тРНК1. Результаты представлены в табл. 3.

Таблица 3 Характеристика библиотек тРНК. Эффективность импорта и связывания с пре-МвК вырожденных библиотек тРНК после циклов селекции

Библиотеки Связывание с npe-MSKA, % Импорт®, %

A.a Д.а

тРНК1 100 5 100

Серия "импорт

So nd 10 10

Sl-2 nd 45 10

Sl-3 nd 45 25

Sl-4 60 30 75

Sl-5 30 30 130

Sl-6 30 35 190

Sl-7 35 40 210

Sl-8 80 20 250

Серия "npc-MSK+нмнорг"

So nd 10 10

S2-1 nd 40 10

S2-3 nd nd 15

S2-4 35 70 20

S2-5 45 110 50

S2-7 50 115 230

nil- ие определяли данных характеристик для этих библиотек.

А-приицип используемого метода состоит в создании in vitro условий для образования комплекса "Р-меченных транскриптов с npe-MSK с последующим добавлением антител, специфических к npe-MSK, и protein-A сефарозы. Эффективность связывания i PIIKI в амипоацилиропашюм состоянии была принята за 100%.

В-количественную оценку эффективности импорта 32Р-транскриптов и лизиновых тРНК, выделенных из обработанных нуклеазами митохондрий, проводили по результату радиоавтографа электрофореза в ПААТ па приборе Phosphor Imager (Fuji, Bas -2000). Импорт тРНШ в митохондрии был принят за 100%.

So-исходная библиотека, Sl-2, Sl-З...-библиотеки после 2-ого, 3-его и т.д. циклов селекции серии "импорт", S2-1, S2-3- библиотеки после 1-ого, 3-его и т.д. циклов селекции серии "npe-MSK+iiMiiopT".

Эффективность импорта селектированных библиотек серии "импорт" возрастала с каждым последующим раундом и достигла 250% относительно импорта нативной тРНК1 после проведения 8-ого раунда селекции. В то же время, эффективность связывания с npe-MSK отселекгированных библиотек РНК практически не менялась и оставалась на уровне 30-40%. Эффективность связывания оценивали для библиотек с предварительным аминоацилированием и без него. После проведения 8-ого раунда селекции, полученная библиотека была клонирована в вектор pUC18 и секвенирована.

2.2. Характеристика библиотек РНК, отобранных по способности связываться с npe-MSK

Библиотеки РНК серии "npe-MSK+импорт" после каждого цикла характеризовали на способность связываться с npe-MSK и импортироваться в митохондрии в условиях in vitro. После 3-его, 5-ого и 7-ого циклов полученные библиотеки РНК были клонированы и секвенированы. Эффективность связывания отселектированных библиотек РНК с npe-MSK представлены а таблице 3. После 5-ого цикла эффективность связывания библиотек с белком была достаточно высокой и составляла около 110% относительно эффективности связывания импортируемой тРНК1 в аминоацилированном состоянии. После 5-ого раунда было проведено еще два обогатительных цикла селекции. В этих циклах концентрация белка была в 10 и 100 раз меньше, чем в предыдущих циклах селекции. Эффективность связывания библиотек (S2-5 и S2-7) с npe-MSK возросла незначительно, поэтому, после 7-ого цикла селекция была закончена.

Эффективность импорта библиотек серии "пре-МБК+импорт" была не высока до 5-ого цикла селекции. Так как в этой серии в первую очередь шел отбор на связывание с белком, селекция по импорту была не столь эффективной. Чтобы создать более жесткие условия селекции по импорту, после 6-ого цикла связывания с белком библиотека тРНК была амплифицирована. Было получено значительное количество транскриптов, которые импортировали в митохондрии in vitro в "жестких" условиях (концентрация митохондриальных белков в реакции импорта in vitro была снижена в 5 раз относительно стандартных условий). Этот дополнительный цикл селекции позволил значительно обогатить фракцию РНК

вариантами, способными эффективно импортироваться в митохондрии (табл. 3). В результате эффективность импорта библиотеки РНК (82-7) резко возросла.

2.3. Анализ полученных в ходе селекции последовательностей

После циклов селекции, проводили обратную транскрипцию и амплификацию с праймерами, имеющими сайты рестрикции. Библиотеки ДНК клонировали и секвенировали. Затем был проведен статистический анализ данных. Если селекция на связывание с факторами, обеспечивающими импорт, отсутствовала, то вероятность встречаемости нуклеотидов в вырожденных позициях должна была быть равномерной. В противном случае, если селекция действительно была, то наблюдалось бы преобладание одного из четырех нуклеотидов. Только те позиции мы считали, отобраны статистически достоверно, в которых распределение нуклеотидов значительно отличалось от равномерного. Для проверки гипотезы о неравномерном распределении нуклеотидов мы применили критерий %2.

В серии "пре-МЙК+ишюрт" анализ клонов проводили после 3-его, 5-ого и 7-ого циклов селекции. Результаты приведены в таблице 4. После 3-его цикла селекции была проанализирована 31 версия тРНК. В 6 позициях вероятность встречаемости нуклеотидов была статистически достоверна. Это район Б-петли (М 9, 12, 15, 17), а также 41 и 48 позиция. После 5-ого цикла были проанализированы 20 версий. Количество "достоверных" позиций увеличилось до 8. После заключительного 7-ого цикла селекции серии "пре-МЭК+импорт" было проанализировано 36 вариантов. Большинство версий РНК имели значительные делении в области антикодона и Т-ветви. В области Б-ветви в позициях 9, 12, 15, 17 и 23 преобладали те же нуклеотиды, которые были отобраны в предыдущих циклах селекции. В позиции 9 наравне с О присутствовало много версий с С. Статистический анализ серединной части молекулы был невозможен из-за делеций, но практически во всех вариантах были обнаружены АС-богатые районы.

Анализ отселектированных последовательностей серии "импорт" был проведен после 8-ого цикла. Было проанализировано 23 версии (табл.4)

Таблица 4. Сравнительная таблица последовательностей РНК после разных циклов селекции. Приведены нуклеотпды, вероятности встречаемости которых статистически достоверпм

РНК Позиции, по которым проводили селекцию

9 12 15 17 23 28 29 34 35 36 39 41 42 45 48

ве12-3 С в С С А/ в С

Йе12-5 в <3 С в; с А А А С

8е12-7 в С в С с А

Яе11-8 <? в в/ С с А

ТРНК1 в в А с С А и С и и и А и в и

тРНК2 Л и в и А и С и V и с С А и с

Нуклеотиды, выделенные курсивом, соответствуют нуклеотидам импортируемой тРНК1.

Приблизительно половина версий (12 из 23) имела почти одинаковую последовательность, за исключением области В-ветви. Результаты статистического анализа показали, что в области Э-ветви преобладают те же нуклеотиды, которые были отобраны в серии "пре-МБЮ-импорт".

Для того чтобы удостоверится, что версии, преобладающие в библиотеке 818 обладают высокой эффективностью импорта, мы провели анализ индивидуальных версий на способность к импорту и связыванию с пре-М8К.

2.4. Анализ индивидуальных вариантов

После проведения заключительных циклов селекции в серии "импорт" и характеристики вырожденных библиотек, мы приступили к анализу индивидуальных вариантов. Около половины отсеквенированых клонов библиотеки Б1-8 имели одинаковую последовательность в центральной части (эти последовательности отмечены звездочкой). Эта последовательность не была похожа на последовательности тРНК1 и тРНК2. Мы проанализировали б вариантов. Транскрипты 81-8-24% 81-8-56*, 51-8-61*, 81-8-36*, 81-8-57* и Э1-8-19* имели отличия только в районе 1>петли (табл. 5).

Таблица 5. Последовательности индивидуальных вариантов РНК, отобранных после заключительных циклов селекции._

Последовательности РНК

АА-стебель й-ветвь антикодоновая ветвь Т-ветвь АА-стебель

тРНК1 GccttgttGgcGcaAtCggtagCgcgtATgActCTTaaTcATaaGgtTaggggttcgagccccctaCAGggCTcca

81-8-19* GccttgttGgcGcaCtAggtag^gcCgrCЛggcгЛГCaíгЛcCGвПgí4agttcgagcccccctaCAGggCTcca

81-8-24* GcЮgttGAcGcaGtGggtag^gcCgгC4ggct4TCв<г4cCGaПgMagttcgagccccctaCAGggCTcca

81-8-36* GccttgttGgcGcaCtGGggtag^gcr¿7C^¿gcfcíГCaa4cCGa7Tg//^agttcgagccccctaCAGggCTcca

81-8-56* GccttgttGgcGcaGtCGggtag^g(;CgíCЛggcь47'CaйUcCGй7Tg^íagttcgagccccctaCAGggCTcca

81-8-57* GcettgttAgcGcaGtCGggtagЛgíCg(Cíggc/^ГCaaЛcCGa7Tgí^agttcgagccccctaCAGggCTcca

81-8-61* GccttgttGgcTcaGtCGggtagЛgcCgíC4ggc^ГCaa4cCGa7Tg^agttcgagccccctaCAGggCTcca

81-8-13 gccttgttGgcGcaCtCggtagcgtCCggctCGGaaCcGCaaCgtTGaggggttcgagcccccctaCAGggCTcca

81-8-33 gccttg^tAgcAcaCtGggcagAgcgtTCCggccttCCCCgagcccccctaCAGggCTcca

в2-7-5 gccttgttCgcGcaCtAggtagAgcAtCCggctCCCaaCcACaaGgtGaggggttcgagccccctaCAGggCTcca

82-5-18 gccttgttGgcGcaCtGggtagGAgcgtAAACcaaGgcccccctaGGCggTCcca

82-7-30 gccttgttTgcCcaCtAggtaAgCAgcgtCCCCGACcgagccccctaCAGggCTcca

82-7-81 gccttgttGgcGcaCtAggtagTAcacgtccgcttccaacccccaccccctaCAGggCTcca

в2-7-92 gccttgttGgcGcaGtCggtagcgtAttaggctGGCaaCcCCccccgagccccctaCAGgtCTcca

*' варианты, имеющие одинаковую последовательность в центральной части. Курсивом выделена одинаковая последовательность нуклеотидов. Антикодон тРНК1 выделен жирным шрифтом. Заглавными буквами выделены пуклсотиды в позициях, по которым проводилась селекция. Нумерация вариантов: 8(тип селекцнн)-(номер цикла селекции)-(помер индивидуальной РНК)

Все варианты обладали способностью к импорту в изолированные митохондрии. Транскрипты 81-8-57*, 81-8-19* и 81-8-56* импортировались с высокой эффективностью в митохондрии, особенно если предварительно РНК были инкубированы со смесью дрожжевых аминоацил-тРНК-синтетаз и аминокислот (табл.6) Инкубация с цитоплазматической лизил-тРНК-синтетазой (КЯЭ) не влияла на эффективность импорта.

Далее мы оценили способность транскриптов аминоацнлироваться цитоплазматической лизил-гРНК-синтетазой и смесью дрожжевых синтетаз. Ни один из транскриптов не способен аминоацнлироваться лизином, но после инкубации со смесью синтетаз в течение 4 минут наблюдается незначительное их

аминоацилирование. В таблице 6 приведена начальная скорость реакции аминоацилирования индивидуальных транскриптов, выраженная в процентах относительно скорости аминоацилирования суммарного препарата дрожжевых тРНК.

Таблица 6. Эффективность импорта и связывания с лре-МБК индивидуальных вариантов РНК, отобранных в результате селекции после заключительных циклов селекции

Варианты Связываппе с npc-M.SK, % Начальная скорость амииоацилирлвания Импорт, %

Д.а А.а' Сумм. 1РШС= 100% Д.а А.а А.а1

81-8-24* 20 60 10 100 30 50

81-8-36* 70 50 25 70 40 50

81-8-56* 70 100 25 50 50 160

81-8-57* 85 20 32 30 40 135

81-8-61* 17 25 36 40 20 50

81-8-19* 20 110 27 20 п<1 200

81-8-13 50 80 30 90 70 315

81-8-33 80 70 па 50 П(1 50

82-5-18 110 30 120 120 480

82-7-5 80 40 30 55 50 180

82-7-30 70 150 50 40 80 180

82-7-81 50 150 п<1 260 п<) 1650

82-7-92 120 130 п<1 170 па 435

1 - транскрипты были предварительно аминоацнлиропаны смесью дрожжевых тРНК синтетаз, 2- трапскрипты были предварительно амииоацилированы дрожжевой лнзил-тРНК-синтетазой (КИЯ), Д.а-транскрапты в деацплироаанном еостояпии, п^-данный параметр не определяли.

После заключительного раунда селекции серии "импорт" среди отсеквенированных последовательностей РНК присутствовали полноразмерные варианты тРНК, которые, по-видимому, сохраняют вторичную структуру типа "клеверного листа". Транскрипт 81-8-13 импортировался с высокой эффективностью в митохондрии (315%), особенно после предварительного аминоацилирования смесью дрожжевых синтетаз и аминокислот (табл. б).

В серии "пре-МБК+импорт" большинство вариантов содержат делении в районе Т-ветви и короче, чем нативная тРНК. Многие варианты имеют районы с большим количеством С или АС-богатые участки. В связи с этим, мы выбрали несколько коротких версий (32-7-30 и 82-5-18) и версии с АС-богатыми

последовательностями (82-5-81, 82-7-92, 82-7-5). Все эти варианты хорошо импортировались в митохондрии. Наиболее эффективный импорт обнаружен после амшюацшшрования смесью аминокислот и препаратом дрожжевых синтетаз у транскрипта 82-7-81 содержащего 15 н. АС-богатый район (1650%). Короткие версии 82-7-30 и 82-5-18 также импортировались достаточно эффективно, несмотря на пространные делении в их последовательностях (табл.5).

Для транскриптов серии "пре-МЭК+импорт" ожидалась достаточно высокая эффективность связывания с ирс-МХК. Все версии быта исследованы на эффективность связывания с белком в деацилированном состоянии и после предварительной инкубации со смесью синтетаз. Результаты представлены в таблице б. Все транскрипты серии "пре-МЖ+импорт" обладали достаточно хорошей эффективностью связывания (>80%) или в деацилированной форме или после инкубации со смесью дрожжевых синтетаз.

2.5. Обсуждение результатов селекции

В начале проведения эксперимента мы планировали после нескольких циклов селекции получить набор полноразмерных молекул тРНК и, проведя статистический анализ частоты встречаемости нуклеотидов в вырожденных позициях, определить значимые для избирательного импорта и/или связывания с пре-МйК нуклеотиды. Однако большая часть полученных нами вариантов содержала пространные делеции, а иногда и дополнительные нуклеотиды, что сделало невозможным проведение статистического анализа в серединной части молекулы. Было показано, что в изолированные митохондрии способны проникать укороченные варианты тРНК, которые не могут образовывать классическую структуру типа "клеверного листа". Несмотря на большую вариабельность последовательностей, большинство вариантов имели консервативный участок в области О-ветви. Как правило, на этом участке не было делеций. В позициях 9, 12, 15, 17 и 23 в серии "импорт" преобладали следующие нуклеотиды Од, йи, в1Сц, С]7 и Агз- В серии "пре-МвК+импорт" сохранялся практически тот же мотив: в/С*), 0(2, С]5, Сп и Агз. Вероятно, что этот участок важен для взаимодействия с лре-ШК. Эти данные совпадают с результатами, ранее полученными в нашей лаборатории. При помощи метода "¡ЪсЛрппПпЁ" было

показано, что D-стебель tPHKI непосредственно контактирует с npe-MSfC (неопубликованные результаты). Эти результаты согласуются с данными исследования импорта тирозиповой тРНК в митохондрии Leishmania. Было показано, что элементы, обеспечивающие импорт, локализованы в D-ветви [Mahapatra et al., 1998].

В области антикодона наблюдалась большая вариабельность. По-видимому, область антикодонового стебля оказалась незначимой для избирательного импорта. Это соответствуют данным о том, что единичные мутации й антикодоне tPHKI не нарушают импорт молекул в изолированные митохондрии (неопубликованные данные). В первой части данной работы, было показано, что транскршгг с антикодоном неимпоргируемой тРНК2 (tr 30, N5 и N9) может импортироваться in vitro и in vivo. Мы полагаем, что детерминантой импорта служит не цигозин в положении 34, а отсутствие модификаций в этом положении. Вероятно, что сильно модифицированное основание (2-тио-5-карбоксиметилурацил) в последовательности тРНК2 играет роль антидетерминанты импорта.

Ранее было показано, что tPHKI импортируется в митохондрии только в аминоацшшрованной форме. Но некоторые транскрипты могли проникать в митохондрии и эффективно связываться с npe-MSK в деацилированном состоянии (tr93). Ранее в нашей лаборатории было показано, что мутантные варианты tPHKI и тРНК2 могут быть аминоацшшрованы другими синтетазами и импортироваться в митохондрии [ICoIesnikova et al., 2000]. Действительно, многие отобранные в ходе селекции варианты импортируются наиболее эффективно после инкубации со смесью дрожжевых синтетаз и аминокислот. Некоторые из исследованных нами версий (S1-8-13 и S2-7-5) не имеют пространных делеций и вероятно могут образовывать классическую структуру типа "клеверного листа". Антикодон транскрипта S1-8-13 CGG соответствует антикодону пролиновой тРНК. Основными элементами узнавания, например, для тРНК.1''0 E.coíi соответствующей синтетазой, являются антикодон (CGG), нуклеотид-дискриминатор (А73) и нуклеотиды G15 и С48, образующие третичные взаимодействия [Liu et al., 1995]. Так как транскрипт S1-8-13, имеет пару G1-C72, антикодон CGG и третичную пару C15-G47, напоминающую пару G15-C48 в пролииовых тРНК, мы предполагаем, что при инкубации со смесью дрожжевых

тРНК, транскрипт может взаимодействовать с пролиновой синтетазой. На рис. 6 представлена возможная вторичная структура транскрипта 81-8-13.

Транскртипт 82-7-5 импортируется также достаточно эффективно после предварительной инкубации с дрожжевыми синтетазами (180%). На рисунке 6 представлена возможная вторичная структура транскрипта. В случае сохранения классической структуры клеверного листа, подобный транскрипт вероятнее всего может связываться с глициновой аминоацил-тРНК-синтетазой. Основными элементами узнавания для дрожжевой глициновой синтетазы являются пара Оз-Сп, С35, С36 [Ыатей й а!., 1997]. В исследуемом транскрипте присутствует основные элементы узнавния, только пара С3-С70 заменена парой Сз-О7о.

Рис.6. Вторичная структура транскриптов №81-8-13 и №82-7-5.

ССА-ОН

и

G-C C-G c-g 70 U-ti U-А G-C

ю U-A _

' GGGG т с

Си А

©© <3) © a® "oL rr

Tul

g-c

G U

trS 1-8-13

tr S2-7-5

Позиции, по которым проводилась селекция, заключены в окружности.

Наиболее вероятная вторичная структура, предложенная для одной из укороченных версий из серии S1-8, представлена на рисунке 7. Предполагается, что подобная молекула может принимать пространственную конформацию, по форме и размерам близкую к классической L-форме тРНК, причем роль антикодона в такой структуре играют нуклеотиды AUC, выделенные на рисунке 7 (S.Steinberg, личное сообщение). Таким образом, мы предполагаем, что полученные в ходе селекции РНК, содержащие протяженные делеции и не

способные принимать структуру "клеверного листа", тем пе менее по пространственной конформацки близки к тРНК и могут аминоацилироваться и взаимодействовать с теми же белковыми факторами, что и тРНК1.

Рнс. 7. Наиболее вероятная вторичная структура транскрипта 81-8-19* (личное сообщение д-ра 8.81етЬег(;), АЛС-пуклеотиды аптпкодона

Анализ связывания транскрипгов с пре-МЭК показал, что пропорциональной зависимости эффективности импорта от эффективности связывания с предшественником митохондриалыгой лдзил-тРНК-синтетазы не наблюдается. Связывание с пре-МЭК является необходимым, но недостаточным условием для селективного импорта лизиновой тРНК в митохондрии. Анализ серии "пре-МЭК+импорт" показал, что возрастание способности связываться с белком не коррелирует с увеличением эффективности импорта. Мы полагаем, что для импорта в митохондрии достаточно, чтобы транскрипты в аминоацилированном или деацилироваяном состоянии могли взаимодействовать с пре-М8К. Эффективность импорта вероятно зависит от дополнительных факторов.

В большинстве отобранных вариантов присутствует АС-богатый участок, иногда аналогичный последовательности, присутствующий,в митохондриальной тРНКЗ. Ниже приведены последовательности транскриптов 82-7-81, 82-8-92, 8-56* и собственно митохондриальной тРНКЗ. Как правило, АС-богатый участок исследуемых версий включает в себя 6-8 нуклеотидов. В случае транскрипта Э2-7-81, показавшего наилучшую эффективность импорта, протяженность АС-богатого

о.

района составляет 15 н. Возможно, что АС-богатый район важен при взаимодействии с факторами импорта.

Последовательности транскриптов 82-7-81, 52-7-92 81-8-56* и последовательность собственно митохондриалыгой тРНКЗ: 82-7-81

gcuuguuggcgcacllagguagucacguccgcuuccaacccccacccccuacagggcucca 82-7-92

gccuuguuggcgcagucgguagcguauшggcuggcaaccccccccgagcccccuacaggucucca 81-8-56*

gcuuguuggcgcagucgggшgagccg^!caggcuaucaaaccgauuguaaguucgagcccccuacagggcucca тРНКЗ

gagaauauuguшaaг>ggc■uaaaacagшg^lcuшaagcaacccaugcuugguucaacuccagcшшcucacca

Таким образом, подвода итога проведенного эксперимента, можно утверждать, что не существует жесткого критерия для последовательности и размера РНК, импортируемой в изолированные митохондрии. Однако для эффективного импорта и связывания с пре-МБК. важна последовательность I)-участка молекулы. Отобранные в ходе селекции последовательности РНК, могут импортироваться эффективнее, чем дативная лизиновая тРНК, что может быть использовано для разработки митохондриальных векторных систем.

Выводы

1. Элементами аминоакдепторного стебля, определяющими селективность импорта в изолированные митохондрии лизиновой тРНЮ, являются первая пара нуклеотидов в аминоакцепторном стебле ОгС?2 и нуклеотид-дискриминатор и7з.

2. Введение детерминант импорта в последовательность неимпортируемой лизиновой тРНК позволяет подобной молекуле импортироваться в митохондрии гп гп-о.

3. К высокоэффективному импорту в изолированные митохондрии способны производные тРНК1, сохраняющие структурные особенности 1)-ветви.

4. В изолированные митохондрии дрожжей способны проникать укороченные молекулы тРНК (50-60 н.), имеющие делеции различной протяженности в области ангикодона, У-петли н Т-ветви, не имеющие классическую вторичную структуру типа "клеверного листа".

5. Селекции в районе предполагаемого антикодона тРНК ие наблюдается, и различия в этой области не сказываются на избирательности импорта в митохондрии in vitro.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Казакова Е.А., Тарасов И.А., Энтелис Н.С./ Импорт РНК в митохондрии./ Молекулярная биология, т. 30 (4), 748-758,: 1996. Kazakova H.A., Tarasov I.A., Entclis N.S., / RNA import into mitochondria./ Molecular Biology, 1996 Jul-Aug; 30(4): pp 438-443.

2. Kazakova H.A., Entelis N.S., Martin R. P., Tarassov I.A./ Mitochondrial targeting of a nuclear DNA-encoded tRNA in yeast: a search for import determination elements./ p.343, The First Annual Meeting of The RNA Socicty, Madison, May 28-June 2,1996

3. Kazakova H.A., Kolesnikova O.A., Entelis N.S., Martin R. P., Tarassov I.A. / Aminoacceptor stem nucleotides of yeast tRNALys are involved in mitochondria import selectivity, / p.378, The Third Annual Meeting of the RNA Society, Madison, May 2631,1998.

4. Kazakova H.A., Entelis N.S., Martin R. P., Tarassov I.A. / The aminoacceptor stem of the yeast tRNALys contains determinants of mitochondrial import selectivity / FEBS Letters, (442) 2-3: pp. 193-197,1999.

5. Kazakova H.A., Entelis N.S., Martin R. P., Tarassov I.A. / In vitro selection of tKNA1"^ versions imported into mitochondria of S.cerevisiaeJ p.432, The Fifth Annual Meeting of the RNA Society, Madison, May 30-June 4, 2000.