Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

БИОХИМИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ПРОДУКТОВ АВТОЛИЗА ВИННЫХ ДРОЖЖЕЙ

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "БИОХИМИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ПРОДУКТОВ АВТОЛИЗА ВИННЫХ ДРОЖЖЕЙ"

, дкадемия наук cod>

. ордера ЛЕЙИНА-ИНСТИТУТ БИОХИМИИ «м. а. Н. бдхд

~ Q ^ty На правах рукописи

ШАКАРОВА Флора Ивановна

БИОХИМИЧЕСКИЕ исследования продуктов Автолиза винных дрожжей

(специальность 03.00.04—биохимия)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

(Диосертания написана на русском языке)

МОСКВА, 1974 г.

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ БИОХИМИИ им. А. Н. БАХА

(специальность 03.00.04 —биохимия)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

(Диссертация написана на русском языке)

И а правах рукоп-.

ШАКАРОВА Флора Ивановна

БИОХИМИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ .ПРОДУКТОВ АВТОЛИЗА ВИННЫХ ДРОЖЖЕЙ

*

МОСКВА, 1974 г.

Работа выполнена в ордена Ленина Институте бно.чнмлп лм.Л И.Бячя ЛИ СССР il Отраслевой и ,i у ч и о -1 i сс .чел о и м те л ье к< > м лаборатории технологии игристых вин всесоюзного заочного института пищевой промышленности.

Научный руководитель: доктор биологических наук Л. К. РОДОПУЛО

Официальные оппоненты:

доктор биологических паук П. Ф. САЕНКО доктор биологических наук Р. В. ФЕЕШКСОВД

На официальный отзыв диссертация направлена во Всесоюзный научно-нее.вддовя тел ьск л ii институт виноделия п виноградарства «Магарач».

Автореферат разослан У^? Л .... 5974 г.

Защита диссертации состоится « » , У-^-»1 , . . 19Г£"т.

на заседании Ученого совета ордена Ленина Института биохимии им. А. Н. Баха АН СССР.

Отзыв на автореферат в двух экземплярах, заверенный печатью учреждения, просим направлять по адресу: Москва, 117071, Ленинский проспект аз, Ученому секретарю.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Отделения биологических наук АН СССР.

ВВЕДЕНИЕ

■Повышение материального благосостояния народа ставит перед всеми отраслями народного хозяйства, в том числе и перед 'винодельческой промышленностью, задачи дальнейшего расширения производства продуктов. Увеличение количества вин, улу:шс;те их качества могут быть правильно решены при глубоком изучении биохимических процессов на всех стадиях производства. Большую роль з создании биохимических основ виноделия сиг-ралн работы А. [I. Опарина, Л. Л. Кур-саноп-а, II. М. Сисакяна, П. Л. Кторова, Л. К. Родопуло, Г. Г, Агабальяпца, Л. Женсзуа, П. Ряберо-ГаГюпа, Э. Пенно, А. УэОба II др.

Изучение биохимических процессов, происходящих при автолизе с;шных дрожжей, в настоящее время является актуальной проблемой, так как автолиз дрожжей широко используется в виноделии для ускорения созревания вина и особенно шампанского. На положительную роль автолптических процессов, в шампанском впервые указали А. П. Опарин и сотр. (1&47). Работами Н . М. Сисакяна, А. К- Родопуло, !1. Л. Егорова, В. П. Нилова, Е. Н. Датунашвллп п других советских биохимиков установлено положительное влияние автолизатов дрожжей, а также вызываемых ими превращении на качество вина. Однако, мнения ученых расходятся относительно роли отдельных компонентов дрожжей! клетки в биохимических процессах и сине.

Развитие исслсдилаини в области блохтшп ферментов и биологии микроорганизмов должно содействовать управлению биохимическими и микробиологическими процессами с техно-логин »¡¡яоделня.

Ряд нужных вопросов биохимии процесса автолиза винных дрожжей остается до настоящего времени малоизученным. На основании анализа сведении, приведенных в обзоре литературы, определены основные задачи:

— исследовать изменение активности ферментов в дрожжах и в вице при азтолнзе;

— исследовать продукты автолиза: азотистые зещества, 2—154 а

фосфорные соединения, вещества, влияющие на вкус и букет вика;

— изучить биохимические превращения, протекающие в вине при различных способах автолиза дрожжей;

— на основе -полученных результатов дать научно-обоснованные рекомендации производству по регулированию авголи-тических процессов и улучшению качества вина и шампанского.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Л1АТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИИ

В работе 'использованы, в основном дрожжевые клетки ЗассЬаготусеб Ьауапи5 штамм Московский (ШИ). В ряде случаев была взята культура дрожжей того же вида — французские шам панские-1 (ФШ-1), -французские щам панские-2 (ФШ-2) и клетки дрожжей вида ЗассНаготусез \чт штамм Штейн'борг 1892 ,г.

Следует отметить, что изучение локализации отдельных соединений и биохимических процессов в дрожжевых клетках осложняется наличием необычайно прочной клеточной стенки в винных дрожжах. Существуют разнообразные методы получения активных экстрактов из дрожжей, однако они дают или низкий выход разрушенных клеток или могут вызвать артефакты. При выборе метода мы учитывали многообразие технических приспособлений н собственные предварительные опыты. После сравнения имеющихся данных, для получения бесклеточных активных экстрактов использован метод прессования при —70° в камере, предложенной В. И. Любимовым и Н. П. Львовым (1968).

В качестве жидких сред служили шам-панский виномате-риал с содержанием 10—Ы % об. спирта и модельная срена, близкая по составу к вину. Модельная среда с рН 3 ы спирту-озностью 10% об. включала 4 г/л винной кислоты, 3 г/л яблочной кислоты, 1 г/л лимонной кислоты, 1 г/л уксусной кислоты, 0,1 г/л сернокислого калия и 0,25 г/л сернокислого магния.

Для детального исследования сущности сложных автоли-тических процессов, возникла необходимость в уточнении, модификации и разработке методов анализа составных компонентов вина и винных дрожжей. В исследованиях использованы новые современные методы биохимического, физнко-хими-ческото .и м^ро'биологического анализа (хроматография на бумаге, в' толком слое и на ионообменных смолах, спектро-фогомег-р'Ц-я, газожидкостиая хроматография, гелевая фильтрация, фазово-контрастная и люминесцентная микроскопия).

При исследовании ферментов приняты за основу методы, разработанные В. Л. Кретовпчем и сотр. (1957, 1970). Для выделения ферментов 200—4CÜ мл amia лиофнлизировалн, остаток растворяли в фосфатном буферном растворе, насыщали на холоду сернокислым аммонием. Вслково-фермептнын раствор обессоливали, пропуская черел колонку с ссфадексом Г-25. Ферменты дрожжей определяли в бссклеточных экстрактам, -полученных после 3-х кратного прессования дрожжей, центрифугирования их и доведения фосфатным буфером рН 7,0 до нужного объема. Этот раствор использовали в качестве исходного ферментного экстракта, в котором определяли содержание белка и активность ферментов непосредственно или после предварительной о-тетки.

Для определения активности НАД-заанснмых дстидрогеназ выбраны сиектрсфотометрические методы. Алкогольдсгидро-геназу определяли по Е. Рэкеру (1955), сукщшатдегпдрогена-зу по X. Эллсу {1359), глютаматдегпдрогеназу по В. Р. Шатилову, 3. Г. йзетпгпеевон и В. Л. Кретознчу (1958, 19S9), малатдегпдрогеназу по С. Коловик, X. Каплан (1957). Активность перокендазы определяли методом Д. М, Михлнна, 3, С. Бромовнцкон (1949). Активность протепназьЕ определяли по степени гидролиза белка (Авакянц, 1988), активность пеп-тидазы по степени накопления алшнного азота, р-фруктофу-ранозидазу по приросту ннвертного сахара, анализируемого .методом Бертрана.

Активность ферментов дрожжей пересчитывали на ] .г массы сухих дрожжей, для срсды и вина — на 1 л.

Для количественного определения полисахаридов использовали метод, предложенный В. Тревслнан, Ж- Хпррнсон (1952). Определение отдельных форм фосфорных соединений: общий фосфор, кнслоторастворимая фракция (общее содержание, ортофосфат, «лабнлиш-й» н «стабильный» фосфор, рг-стзоршше .лолпфоафаты), лппндпая фракция, хпслотоис-рс.стсорпмая фракция (фоефпр ДНК п РНК) п-роггадклн по методу П. Всрепблюм п С, Чайк в модификации X. Вснль-МалсрС, Р. Грин (19S1). Для возможности применения этого метода жидким Cipe дам, испытывали раз-личные режимы концентрирования вина, из которых было рекомендовано кон-йептрнро-изппе bikui в вакуум-эксикаторе, 'при комнатной температуре, показавшее лучшие результаты.

Отдельные фарлш азотистых веществ определяли ло принятым в биохимии методам. ДезоксприСонукленповую кислоту в дрожжах определяли ло 3. Днше в модификации К. Блртона (1956) и рибонуклеиновую кислоту по В. Мейбау.м (1945). Для

изучения аминокислотного состава лептндоз вина предложена методика, согласно которой свободные аминокислоты вина осаждали '¡а к;г;;юш[те К>'-2 в И-1" форме, а элюат, содержащий пептиды, подвергали гидролизу 2н НС! при 120° в течение 3-х часоз. Аминокислоты гидролиза га разделяли хроматографией на бумаге,

Содержание о/ргостернна в дрожжах определяли по методу А. Гайдучка, видоизмененному И. 13. Проскуряковым п сотр. (1938).

Состав вещсспи, формирующих букет вина, анализировали различными видами хроматографии н ИК-спекгроскопип. Для выделения этих компонентов использовали различные-способы экстракции: фронтальное концентрирование на иредвариггль-ио вакуумнросаннои хроматографической колонке {Крылов и др., 1У70), непрерывную и периодическую экстракцию эфир-нентанной смесью (Родолуло, Егоров, Писарницкий, 1963) и хлористым метиленом {Буадрон, Шбв). С целью определения оптимального режима экстрагнроаа-ния проведено сравнение некоторых метода;; извлечения эфирных масел вин. В результате этой работы нами разработан способ »многократной экстракции высококипящей фракции компонентов букета тремя органическими растворителями. Выеококипящне букет истые вещества пина разделяли тазожидкостной хроматографией на колонках Карбозакс 2ОМ и Карбонакс 20М ТРЛ. Идентификацию веществ осуществлял]! путем разделения па классы соединении по абсолютным и относительным (к феннлэтанолу) временам удерж икания. Количественные определения проводили методом абсолютной калпброгзк¡;. Терпенонды разделили хроматографией на -пластинках ЭПш'о! (ЧССР). Легколету-чио компоненты анализировали непосредственным вводом среды в хроматографа ческу ю колонку полиэтилен гликоль-300. В работе использовали хроматографы Хром-2, Х|юм-3 (ЧССР) н Цвет-4 (СССР).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ

Для обогащения окна продуктами автолиза дрожжей в производстве разль ;иы:с типов кипа и шампанского приняты: выдержка вина кли шампанского па дрожжах и теплопля обработка внноматсрп;!лов с дрожжами. Вместе с тем паши предварительные опыты показали, что можно добиться обогащения вина фрмепт;;\1и дрожжей при обработке холодом вина с дрожжами. Поэтому, осиспнос внимание в наших исследованиях было уделено изучению биохимических превращении при выдержке, обработка холодом и теплом вина с дрожжами.

U,i 11 олюр фо л о ги ч ее к и е и биохимические изменения irp-u выдержке вина »а дрожжах

Исследование происссов автолиза дрожжей при выдержке их в вине при температурах 10, 15 и 20" проводили в течение двух месяцев. В опытах применяли три .модельные среды: среда 1 — стерильная водопроводная вода; среда II —раствор, содержащий 7 г/л вннноп кислоты; среда Iii — раствор, содер-жг'ишй 7 г/л пиннон кислоты и 10% об. этилового спирта.

Цитологи чес кие исследования на живых и фиксированных препаратах показали, что в дрожжевых клетках, выдержанных з вине и модельных средах, происходят глубокие изменения: накапливаются жирозый включения, снижается содержание запасных веществ (-гликогена, волютина), изменяется структура митохондрий, ядра, трансформируется сорбциониая способность клеточных opra-нелл к отдельным красителям (аурофосфин, акридиновый оранжевъш и др.). Размер клеток уменьшается, они как бы сжимаются, при зтом увеличивается их мехлгямеская прочность, Отмеченные нарушения в структурных элементах дрожжевых клегок при выдержке соответственно r?j]пводят к снижению физиологической активности.

Наблюдаемые цнгофизпологпчсскне изменения, естественно, вызывались превращениями в ферментативном аппарате дрожжевой клетки. Еще в 1947 году акад. А, И. Опарин отмечал, : г то продукты автолиза дрожжей в шампанском являются источником ферментов. Изменение активности ферментов исследовали :з бесклеточных дрожжевых экстрактах. Общее содержание белков в дрожжах после выдержки снижается, что вызнано активацией протеин азы в клетках (табл. 1). Рассмотрение динамики изменения активности протеиназы в вннс, выдержанном на дрожжах при 201>, показывает большую зависимость величины активности фермента от срока выдержки. Максимальная активность протеиназы отмечается на 20— 30-е сутки. Последующая выдержка приводит к небольшой инактивации фермента. Исследование активности пептпдаз показывает (табл. 1), что дрожжевые клетки выделяют этот фермент в окружающую среду. В вине после выдержки активность ■¡н-атидазы повышается в 7 раз, при этом в дрожжевых клеткам, выдержанных на ъине, пептидзза полностью инакти-вирустся. Из анализа данных таблицы 1 видно, что активность гн'рокендазы, алкоголь-, сукцпнат- и глютамлтдегидро-геиазы в дрожжевых клетках резко снижается. Эти ферменты в основном выделяются в внно.

Перешедшие из дрожжей при выдержке и присутствующие в вине ферменты способствуют протеканию разнообразных

биохимических превращений. Наличие в вине активной про-тсипазы оказывает влияние в первую очередь на белковый обмой, что приводит к уменьшению общего количества азотистых

Таблица 1

Изменение активности ферментов и содержания белков при выдержке Дрожжей в вине и модельной среде

Дрожжн Среда

Посте пндгр- После выдер-

До ЖК11 1 мое. До жки мое.

П.жа-jaTo.il! Ряч-

КЫД^р Мо- мер- яылер- Мо-

МЗСТЬ Уино де.и,- исх'ть ж к и Вино дел ь-

Л Я

среда срела

Белки мг/г 2Э;2 14,4 19,6 мг/л 7,5 19,0 7,5

Протеин.м.г у. е. 1,21 2,10 1,74 у. е. 1,2 2,5 0.1

I '[емтидача » 0,75 0 0,23 » 2,6 57.5 14,0

Пер оксид аз а У> 9,64 3,о9 з.да 55 Ж 80

Ал ь к ого ль де-

гиярогеиаза 3,53 . 1,32 0,71 3,0 1,0 0

Суищгнатде- 0,71 3,0 2,5

пгдрогепаэа з. 24,0 1,32 > 2,5

Гл юта м а где-

пп.оогечаэд 7> 3.32 1,79 0,-33 » 1,5 1.0 0,5

веществ в дрожжи. Интенсивное выделение азотистых веществ из дрожжевых клеток в вино наблюдается в -первые 5 суток (рис. 1). Лроиатографическим анализо.ч установлено, что с повышением температуры выдержки внутриклеточная концентрация аминокислот уменьшается. В модельных средах после двух месяцев выдержки обнаружено аминокислот. В наибольшем количестве дрожжи выделяют аланин, гликокол, глютампповую кислоту и треонин.

Значительные изменения в дрожжевых клетках претерпевают фосфорные соединения. Суммарное содержание фосфора в дрожжах после выдержки падает, а в вине и модельных средах фосфорные соединения накапливаются (табл. 2) за счет перехода кпслоторастворимых фосфорных соединений из дрожжевых клеток и среду. Динамика перехода фосфорных соединений из дрожжей в вино (рис. 1) показывает, что этот процесс достаточно длителен и продолжается примерно с одинаковой скоростью и течение 30 суток.

Нам удалось обнаружить существенные сдвиги в содержании стеринов, наступающие после выдержки дрожжей в внне и модельных средах. Так, в результате гидролитического рас-

Рис. 1. Динамика пскотсрых биохимических показателен дрожжей н вина при выдержке:

— Liiii1: - - , ! — азотистые соединения: - — фосфорнце

пада стеринов, локализованных на различных органоидах клетки, » перехода их в свободное состояние после выдержки, о дрожжах г, 2—5 раз возрастает содержание эргостернна {табл. 2). Кроди- того, заметно накопление эргостернла с повышением температуры.

Многие автор;.! отмечают положительное влияние автолиза дрожжей на формирование органолоптических качеств вина. Однако, исследослннн слияния автолнтнчееких процессов на изменения компонентой букета вика не было проведено. Результаты газожид костной тонкослойной хроматография позволяют установить, что при выдержке на дрожжах клетки выделяют в среду примерно 30 компонентов букета, в основном, а'цотальдегнд, этплацетат, нзоамиллаурат, эти л пальм и-та?, нзовалериа1го:;ую кислоту, этиллактат и териенонди. Следует отмстить, что выделяющиеся автолизирующнмнея клетками в среду ^--бутнролактои, этиллактат и высококипя-1.цпс эфирп по мнению ряда ученых (Уэбб и сотр., 1954; Рпбе-ро-Гайои, 1965; Родопуло, Пнсарннцкнй, 1906 н др.) способствуют развитию тонов выдержанных вив.'Установлено, что концентрации отдельных в еще ста обусловливающих 'букет, выделяемых дрожжами МШ н ФШ-2, отличаются иногда в несколько раз. Важно отметить, что в процессе выдержки дрож-жил и среде не выделяются лзобутиловый и изоамиловып спирты, что согласуются с данными II. Я- Всселова и сотр. (1952, 1971).

Результаты исследований компонентов букета вина в динамике дали основание заключить, что эторнфнкадия неприятно пахнущих нзо'бутилового и нзоамнлового спиртов, накопление иажных в орга иол оптическом отношении соединений ■происходит, с основном, при выдержке вина на дрожжах б течение 30—45 суток (рис. 2).

Усиливающиеся в процессе -выдержки гидролитические реакции, лзишшшие хим-ическ-пй состав данна, повлиял и и на физико-химические показатели. Установлено значительное снижение ОВ-потенцнала среды, причем особенно интенсивно при более высоких температурах— 15 и 20° (табл. 2), Анализ этих данных подтверждает мнение (Родопуло, 1959; Шан-дерль, 19о2), что дрожжи передают в среду окислительно-восстановительные системы с низким Ей. Некоторое повышение рН после выдержки, что согласуется с данными Е. Н. Дату-нашвнлн (1967), можно отнести за счет перехода из дрожжей соединений основного характера.

Анализ результатов цнтофнзиологнчсских и биохимических исследований позволяет отметить, что, происходящие при выдержке дрожжей в вине и .молельных средах гл\<о.\п« .морфо-

Таблица 2

Биохимические изменения а лрожевых клетках и модельной среде при выдержке

Вид среди

ОВ-п^тен-цкал

РН

Модедънан сред я

азотистые пе-щеетва.

активность

р-Фик-

то(1)у-

раиоэ.ч-дазы У.

[|]ОС-

(Ьор

эр госте " рни

иан-чэн

азотистые вещества , мг.'л

Дрожжи

активность

фруктов-ранози-

У. е.

([»Х-

фор

эрго-стерня

гликоген

нан-паи

До шдержкл

520

2,3

73,6

27,7

¡5,3

3,8

Э5,5

8,5

Через 2 месяца выдержки

I ( 220 — 144 ¡28,0 9,1 42,1 9,: — — 3,6 20,1 93,4

II 255 2,46 150 53,6 4,7 23,5 8,7 — !4,0 7,2 6,4 27,5

III 234 2,50 ¡13 — 5,1 40,6 7,9 38,6 1,4 6,3 14,4 42,2

14,-8

10,0

Продолхнтельйость зздеракя, ми

Ряс. 2. Изменение компонентов букета кила при выдержке:

атиллактат, г - этилх а прокат. 3 -- зтадкэпрнлгт, 4 - этнлка гтрниат, 5 - изобутанол 6 ~ изолентаиол, 7 — фенилэтанол.

логические изменения, зависят от температуры выдержки и состава вина. С увеличением температуры ускоряется процесс выделения из клеток в среду различных компонентов. Содержащиеся в вине кислоты и этанол снижают скорость автолиза клеток. Состав веществ, выделяющихся клетками дрожжей, зависит, от штамма дрожжей.

Согласно полученным данным, оптимальные условия для автолиза дрожжей и обогащения вина ферментами, азотистыми веществами, фосфорным;] соединениями и компонентами букета создаются при выдержке вина на дрожжах при температуре 10—15° в течение 30'—45 суток.

Проведенные исследования показывают, что регулирование аЕтолитикеских процессов и состава вина при выдержке на дрожжах может быть осуществлено путем изменения температуры, продолжительности автолиза, а также штамма используемых дрожжей.

Действие обработки холодом вина с дрожжами на структуру и свойства дрожжевой клетки н биохимические реакции в вике

Наряду с ранее принятыми температурными режимами выдержки вина с дрожжами нами было исследовано влияние пониженной температуры на процесс выделения компонентов дрожжевых клеток в внно. При этом создавалась температура, близкая к температуре замерзания, в частности, для белых столовых вин и шампанских виноматсриалов поставлены опыты при —5---6°.

Фазово-контрастная и люминесцентная микроскопия дали возможность установить, что в процессе обработки холодом при —5° 2 суток большая часть клеток угнетается, а около 30% погибает. Несколько уменьшается размер клеток и увеличивается их механическая прочность.

В обработанных холодом дрожжах активируются прогсо-литические ферменты: протеиназа и пептидаза, ускоряющие гидролиз белков. Активность большинства других ферментов (сукцинат-, глютаматдегидрогеназы, перокендазы) в дрожжевых клетках снижается. В обработанном холодом вине почти в 2—3 раза возрастает активность иротенназы, пептидазы, причем обнаружена прямая зависимость степени обогащения ей я а протеиназой от продолжительности выдержки вина с дрожжами при —5°. Использование модельных сред позволило установить выделение дрожжами алкоголь- н глютаматде-

2*

13

гндрогеназ (тпил. 3). Переход азотистых »'фосфорных веществ из дрожжевых клеток при этом режиме обработки был незначительным.

Таблица 3

Изменение активности ферментов при обработке холодом дрожжей с вином и модельной средой

По к аз а те лп Активность ферментов в дрожжах, у. е. Активность фершектоо в среде, у. е.

До обработки После оО работки 2 суток при —5' До обработки После ки 2 ПР1 об работ-суток

Вино Модель, лая среда В нло Модель, нач среда

П роте! таз а 1,31 1,31 й,7й 1,2 3,1 7,-5

Пептид аз а1 0,75 3,19 2.34 2:6 7,9

Пер оке ид аз а 9,64 2,74 ■2,68 ¡х> 40 20

Ллкоголудегидро- 2,0 8,0

теиаэа 3,50 4,5(2 о,35 3,0

Сук ад на тд еги дро - 2,5 0

геиаза 24,0 0,91 1,73 2,6

Г лю т а м а тдеги др о- 3/5 7,0

геиаза 3,52 0,97 2,®) - 1,5

Исследование динамики компонентов, обусловливающих букет, лрн обработке холодо.м показывает, иго накопление сложных зефиров происходит, в основном, в течение 2—3 суток. Максимальное содержание важного в органолептичсскои отношении фенилэтилового спирта также отмечается на 2 сутки обработки (рис. 3). Содержание жирных кислот в процессе обработки вина с дрожжами при —5° постепенно уменьшается. Специальные опыты по обработке холодом 2 суток прИ —б0 разных штаммов дрожжей показывают (табл. 4), что дрожжевые клетки после обработки холодом выделяют в водно-эта пол ьны Г; раствор 3 спирта, 12 эфиров, 4 жирные кислоты и 2 карбонильных соединения. Причем, экстракты веществ, выделенных штаммами МШ и ФШ-2, имели различный количественный и качественный состав. Так, из 12 эфиров, выделенных при обработке холодом дрожжами ФШ-2, этнлкапри-нат, нзоамилкапринат, изоамиллаурат (содержащиеся в этом образце в большом количестве) не обнаружены в экстракте образца, обработанного с дрожжами МШ. Общее содержание эфиров у образцов, обработанных холодом с дрожжами МШ, составляет 125 мг/л, а с дрожжами ФШ-2—152 мг/л.. Кроме того, модельные среды после обработки с дрожжами ФШ-2

И

богаче важными в ор га политическом отношении соединениями; фенилэтанол, у-бутнролактон, этиллактат и другие сложные эфиры. При использовании штамма МШ в среде больше

Продолжите л ыго с т ь обработин холодом, лди

Рае. Изменение компонентов букета вина при' обработке холодом: - этиллгктат, 2 — зтилкапронат, 3 - этилкзпрнлат, 4 - этилпальчитйт 5 — <',»-

ыил этанол.

накопилось жирных кислот л этил ацетата. Следовательно, этот опыт показывает, что состав выделяемых дрожжами при' обработке холодом компонентов букета может определяться используемым штаммом дрожжей.

Опыты на вике подтверждают эти положения. Если в вино до обработки обнаружено 34 компонента, то после выдержки при —5° в вине идентифицировано 36 компонентов. Переходят из дрожжей у-бутиролактон и этнллаурат, что подтверждается модельными опытами. Как видно из табл. 4, после обработки холодом на 103 мг/л увеличивается содержание ъссх сложных эфиров в опытном образце, в 3 раза увеличивается содержание-фенклэтатюл а.

Проведенные исследования дрожжевых клеток с вином и модельными средами позволяют заключить, что обработка холодом вызывает определенные превращения в дрожжевых

Таблица 4

Изменение компонентов букета в виие и переход их в модельные среды при обработке холодом с дрожжами

Содержание компонентой букета, мг/л

я сги_*ле после ^т>дботкн в вике

Компоненты холодов при —5'. г суток после обра-

до обработки ботки холодом при — 2 суток

Штамм ПШ Штамм ФШ-;

Анегальдегид 134 22 1в

Этнлшетвт 79 57 26 29

Н-ирслз^с;: 2,5 3,1 5,1 6,7

Из^у-г^рсд 0 0 16 14

1Ь т'КТРИО.Ч 0 ■о 71 03

Эткллгвлат 42 '98 31 95

Этилэиаптат 0,07 0,09 2,3 9.1

Этнлкаирилат 0,05 ■0,12 1,'8 М1

Из о ам и л ка п р о) 1 а т 0,29 0,33 7,9 13

у-бутмролактон 0,03 0,10 0 1,9

Дпэтилсуедннат 0;55 0,&7 16 15

Этилпеларгонат '0 0 1,2 3,6

Этллкапрннат 0 0;И 1,1 1,2

Изоа.\шлка<прмлат 0,12 0,03 0,75 0,9

Ф ен и л э тн л з нет а т 0,01 0,01 0,30 0,1«

Фенил этиловый спирт 1,0 9,4 4,6 12

Этиллаурат 0,« 0 0 0,83

И зобу Т1 гл к а п р и нат 0,3 0 0;5 0.6

Шоамилкал ринат 0 1&,1 о^а 1,2

Диэтнлмалат 2,6 0 0,1(1 0*20

Эт ил мир ист а т 0,12 •2,7 0,25 <0,27

Изо а м ил „ч а у р а т 0 12 2,8 2,7

Этилпальмитат 0 0 7,0 8,4

Прошюновая кислота 7,3 2,2 0 0

Масляная » 0£ 0,2 4,2 1,9

Изо вале р и а пои а я » 12 11 2,9 18,6.

Капроновая » 0 0 1,2 1,0

Каттрнловая » 0,4 0,4 0 0

Пел аргоновая » 0 0 12,4 3,7

Кислый этиловый эфир

янтарной кислоты 0 0 14 16

клетках. Переходящие из дрожжей в вино ферменты (протео-лнтнческие, глютаматдсгидрогеняза, р-фруктофуранозидаза) при сУбра-ботке холодом способствуют протеканию сложных и многообразных процессов. При этом происходят изменения высших спиртов, сложных эфнров, жирных кислот И др. 10

Штамгл дрожжевых клеток существенно влияет на состав компонентов букета, выделяющихся дрожжами.

Следовательно, обработка холодом вина с дрожжами при —5° в течение 2 суток может рассматриваться как способ обогащения вина ферментами, другими биологически активными соединениями и компонентами букета. При этом, в отличие от выдержки вина с дрожжами при 10—20° или теплового автолиза, з вине не накапливаются фоофорные соединения, а также на происходят дополнительные вторичные изменения выделившихся пз дрожжей и содержащихся в вине компонентов. Таким образом, нами предложен быстрый способ обогащения вина ферментами и другими биоактивными веществами цитоплазмы дрожжевых клеток.

Оптимальным, по-видимому, можно признать 2—3 дневный срок обработки, так как дальнейшая выдержка при —5" вина с дрожжами не приводит к существенным изменениям большинства компонентов вина. Для обогащения вина ферментами период обработки может быть продлен до 5 суток.

Этот способ может быть рекомендован для обработки белых столовых вин с дрожжами после брожения, шампанизированного вина при бутылочной и резервуарной шампанизации.

Исследование цитофизнологии и биохимии теплового аЕтолиза дрожжей

Работами М. А. Герасимова (1950), П. Н. Унгуряна (1950), 3. Н. Кишковского (1966) и др. показано, что ускоренная комбинированная термическая обработка ординарных вин придает им стабильность и ускоряет созревание. Нагревание вин с дрожжами при 40—45° в течение 2 суток (Родопуло, 1945, 1959) даст возможность обогатить вино продуктами автолиза дрожжей, улучшить н» качество. Тепловая обработка вина с дрожжами прн 40° и 60—65° также широко используется в производстве шампанского непрерывным 'методом (Агабаль-янц и др., 1969), однако многие вопросы биохимии процесса теплового автолиза дрожжей в вине остаются недостаточно изученными.

Обработка теплом дрожжей с вином и модельными средами вызывает заметные превращения в структуре дрожжевых клеток, приводящие к деструкции протоплазмы и отмиранию дрожжей. Термическая обработка и, особенно пастеризация, вызывают 'почти полное исчезновение волютина и гликогена в клетках. Происходит накопление жировых включений. Значительно уменьшается размер и увеличивается механическая

про шость дро-жжсвих клеток. В процессе тепловой обработки дрожжи выделяют ь вино значительное количество^ веществ (до 30% от первоначальной массы). После тепловой обработки при 40° в течение 2 суток масса отмытых от вина дрожжей в бутылке уменьшается с 2,2799 г до 1,8071 г, а после дополнительной пастеризации при 65° в течение 3 часов до 1,6014 г.

Было обнаружено (табл. 5), что после тепловой обработки, как и после выдержки, в дрожжах падает содержание белков, которые переходят п окружающую среду, частично подвергаясь денатурации и гидролизу, После нагревания при 40' в вине активность протеиназы увеличивается в 2 раза. Последующий нагрев до 60" ииактивирует протеиназу в вине. Исследование пептндаз показывает, что дрожжевые клетки сильно выделяют этот фермент в окружающую среду. Надо отметить, что активность большинства ферментов в дрожжевых клетках после тепловой обработки снижается и наиболее интенсивно после пастеризации. Наряду с переходом из дрожжевых клеток, ферменты, например, алкогольдегидрогеназа, глютампг-дегидрогеназа инактивируются, причем в большей степенн после пастеризации.

Исследование в динамике изменения некоторых компонентов показало, что для обогащения вина ферментами оптимальным сроком нагревания вина с дрожжами является I — 2 суток. Если ставится задача обогащения вина азотистыми веществами дрожжей, то срок обработки может быть свыше 2 суток, а фосфорными соединениями не более 3 суток, так как при дальнейшем нагревании при 40° переход их из дрожжевых клеток практически прекращается.

Тепловое воздействие на дрожжи способствует гидролитическим реакциям и переходу из дрожжевых клеток в вино, азотистых веществ, фосфорных соединений, гликогена, маннана и других соединений (рис. 4).

Анализ изменений компонентов, обусловливающих букет вина, показывает, что .при тепловом автолизе максимум накопления этиловых эфиров обнаруживается на 2—3 сутки. Наибольший удельный вес при тепловой обработке приходится на этиловые эфнры капрпловой, молочной, пеларгоновой и кап-риновой кислот. Кроме того, на 2 сутки отмечается максимальный переход в вино нзоамиловых эфиров капроновой и каприловой кислог, фспилэтанола н диэтилмалата. Жирные кислоты вина, особенно валериановая, капроновая, каприлОБаяи ле-ларгоновая, в процессе нагревания с дрожжами этерифици-руются.

Наглядно переход компонентов букета из дрожжей при тепловой обработке показан в опытах на модельных средах, в

Таблица 5

Изменение активности ферментов и содержания белков в дрожжах, модельной среде и вине лрн тепловой обработке

Активность ферментов (у. е} и содержание балков (мг/г) в дрож Активность ферменгоа (у. е) н содержание белкоа (мг.'л) & среде и вине

Условия обработки Среда балок проте ина-за пентод а за перок-си паза алкоголь-деги- дгю- г сааза сук- цк1гзт- де гидрогена - 33 глю-та-нат- деги-дро-гена-за белок проте нла-за пе 11-ти дзз? пс рок-си да-за а.нко голь-дегн-дро-гена- суками ат-д-гн-дроге паза глю-та-мат-деги-дро-гена-за

До обработки (контроль) 1 а) 2 суток паи 45е " В;шо 28,2 1,21 С,75 3,50 3,52 7,5 1,2 2,6 55 3,0 2,5 1,5

.Модель- 5,4 о.ез 0 7,5 0,50 0,63 1,57 5,0 5,0 6,1 50 0 0 5,0

б) 2 суток при 45° и 3 часа при 00° ная среда ЗД 1,78 С 6,8 С,11 С,12 0 4,0 5,3 7,9 30 0 0 2,0

II

а) 2 суток при 45° б) 2 сутск при 45° к 3 часа при 60° Вино 7,6 0,45 0 4.3 2,33 0,14 0,90 16,5 2,5 2,6 25 5,0 1,3 1,0

7,2 1,12 2,!& 0,2 2,61 0,10 0,08 16 1,9 3,1 20 0 2,5 0

о

5

ТОО

Н 50.

500

400

300

200

100 ..

ДРОЖЖИ

I и

55

61

Ев

127

375

84

2

tVT"

91

&}

^ 18 ffl

58

26

г 34 5 6 7 I 2 3 4 567 599

ВИНО

179

4

ттт

94

Eg

43

29

I 2 3 4 5 6 7 565

213

I 2 5

Рис. 4. Биохимические изменения в дрожжах и вине тПрн тепловой обработке:

/ — до обработки; И — после обработки 2 суток при 40е: Hi — после обработки

2 суток при 40° и 3 часа при / — азотистые вещества, 2 — фосфорные соединения, $ — маннан, 4 — з р госте рин, Л — РНК, 6 — ДНК. 7 — гликоген.

которых одновременно исследовалась роль штамма дрожжей (табл. С). Наиболее высокое содержание сложных эфиров 138,8 мг/л выделено дрожжами ФШ-2 в модельную среду после 2 суточной обработки при 60°.

Та0/1и<1а О

Выделение компонентов букета в модельные среды при тепловой обработке с дрожжами

"Компоненты ;"[ко V:],>:'счг: 1". букетл в среде, мг/л [; ■' 1-' термообработки 12-е суток

при 15° при 60

МШ [ фш-2 мш фш-2

Ацетальлеглд 15 1П 1-5 19

Эталацетат 47 44 65 47

Н-проланол 1.4 2,8 1.2 !,«

Этнллактат ЗГ> 44 ее 83

Гептиловый спирт (! 0,02 о.да

Этилз-нантаг 0,05 0,02 0,04 о.эз

Этклкашрнлат 0,03 0,4!) 0.08 олз

Изоамилкал ром ат 0 0 0.24 0,35

V-бу тире л а кто н 0,0 0,04 0,03

Днэт.нлсукцинат 0,07 0.70 0.32 0,31

Этнлпеларгонат 0,37 0,03 0 <1

Этилкаприиат 0,07 о,сй 0,03 о.да

Из о а м и.тк а пр к л а г 0,04 0,07 0.01 о.оя

Фенилэтплацетат о.оа ОХИ О 0;№3

Феинлэтшювый сп;:рт 0,1) 2,0 0,15 0,2

Этиллаурат о,т 0,06 0,04 0;05

ИзоОутилкаприиат 0,85 0 0

И зо а м и лка лр ин а т 0,03 0,12 0,Ю 0,25

Днэталмалат 0,04 ■0 V 0 0

Этил мир иста т 0,11 4,1 0 0,6

Изоамлллаурит 0 0 0 6,4

Прошгоновап кислота 2,!> 2,8 1.9 1,4

Масляная кдалотз 0,0 0,6 0,3 0,2

Изов ал ери ан о в а я коло- 17 14 11

та 11

К амриловая кпелотп 0.4 0,4 0,3

Значительно изменяется содержание веществ, формирующих букет .вина в процессе тшловой обработки дрожжей с ном. Если содержание всех сложных эфиров в необработанном вине составляло ИЗ мг/л, то после пастеризации стало 142 мг/л, и 189 мг/л у образцов, обработанные при 4-5°. У а тог о же образца обнаружено максимальное количество этнллакта-та, у-буп'ролактона, феннлэтанола и этиллаурата, которые, как известно, благоприятно влияют на букет и вкус вина.

Из вышесказанного следует, что тепловая обработка зна-

чнтельно интенсифицирует биохимические процессы, происходящие з вине при длительной выдержке под действием различных ферментных систем. В течение 2 суток при 40—45° вило обогащается ферментами, компонентами букета 11 другими биологически активными веществами. Проведенные исследования подтверждают целесообразность применения способа тепловой обработки вина с дрожжами, предложенного Л. К. Род'опуло (1945, ¡959), -з ^рэпззодстве шли л адского. Этот метод .может использозаться при обработке шампанских киноматериалов, Предложена тепловая обработка шампанизированного вина с дрожжами при 40—48° (Азакянц и сотр.,

1972). Нагревание шампанизированного вина при 50—60* ре-к-о 1; с I 'VI у с т с я ь новой технологической .схеме 'Производства -шампанского непрерывным способом (Брусиловский, Саришпнлн,

1973).

Результаты экспериментальных исследований показывают, что температурный реж)зм автолиза оказывает решающее влияние па протекающие биохимические процессы и состав продуктоз автолиза. При умеренных температурах нагрева (40—45°) наблюдается накопление в вине ферментов, при повышенных температурах (60—65°) выделяющиеся дрожжами ферменты пнактивируются. Вместе с тем, при этом дрожжевые клетки выделяют больше продуктов распада в внно.

От температуры обработки зависит н количественный состав веществ, участвующих в сложении вкуса и букета вина. Ранее не изучалось выделение веществ различными штаммами дрожжей, хотя этот фактор при автолггтнческих процессах, как показывают наши исследования, является также одним из сажных. Поэтому путем подбора штамма дрожжевых клеток и изменения температуры нагревания можно направленно регулировать букет и вкус вина при тепловом автолизе.

Срок обработки также весьма важен, так как в различные периоды тепловой обработки происходит выделение разных групп веществ из дрожжей в вино, что ранее не отмечалось д.руп:,ми исследователями. Так, наши опыты показывают, что а течение первых 2 суток в вине повышается активность ферментов, содержание фосфорных соединений, некоторых эфи-ров. В дальнейшем эти компоненты в вике Не накапливаются, напротив, активность ферментов снижается. В отличие от этого, содержание азотистых веществ в вине при выдержке в течение 5 суток при 40° продолжает возрастать, увеличивается и концентрация этиллактата, этилкапроната и др. Указанное выдвигает необходимость дифференцировать срок обработки в зависимости от поставленной цели обогащения вина определенными соединениями дрожжевой клетки, 22

Исследование автолнгических процессов при шампанизаци н выдержке тиражированного шампанского па дрожжах с нарушенной структурой

А. П. Опарин и сотр. (1947) установили, что биохимические процессы, протекающие в шампанском в период послетирпж-иой выдержки, существенно влияют на качество получаемого продукта. Работы-ряда авторов (Снсакшг, 1&Ô2; Лгабальшщ, 1962; Рсдопуло, 1966 и др.) показали роль превращений отдельных компонентов вина в сложении качественных особенностей шампанского. Дальнейшие исследования в этом направлении представляют научный н практический интерес.

i. Роль ферментов дрожжевых клеток на различных стадиях бутылочной .шампанизации.

Необходимо отметить, что рядом авторов (Опарин и сотр., 1947; Лоза, 1981; Агабальяиц, Авакянп, 1968; Авакяиц, Белоу-еова, 1972; Орешкнна, Нозпкова, (974) исследованы изменения активности ферментов вина при бутылочной шампанизации. Данные об активности ферментов дрожжевых клеток и особенно окислительно-восстановительных па отдельных стадиях бутыл-очной шампанизации отсутствуют.

ТаВлица 7

Изменение активности ферментов дрожжей на различных стадиях послетнражной выдержки

Лктнтшасть ферментов в дрожжлх. у. с.

П ^ 1.'.1 ь (1-фрук-

И ость после- M : : Î J с Сукцн-

тиражной Ллкоголь- ТОфурЯ * Про-

выдержки гилрог finira H.ïriieni.i- ЛС.ГНЯРО-I ен 1' ,'i т .. с i': м РОГС31ЯЗД '"i.i,,: ■ ткни дэл

0 диен 2,1 3,5 1.2 24,0 332 ! ,2

14 дне» 3,7 G.0 0 12,0 ■К.-З 53

30 дней 3,4 3,0 2,3 3,1 0,6

С,О мес. 2,У 2.D M 2,0 7S4 5,3

1 гол 0 (1 il 1,7 Е8Я 4.4

1,5 год.ч 1.4 л (1 1,4 2,2

2,0 годя 0 « 0 0 442 3,9

2,5 гада 0 О 0 0 2ВЗ 1,6

3,0 годя 0 (1 0 0 574 1,4

>

Для проведения таких исследований использовали кюве различных сроков выдержки завода шампанских вин «Абрау-Дюрсо^. Установлено, что молодые дрожжевые клетки обладают достаточно активной ферментной системой (табл. 7). Окончание вторичного брожения (30 суток) сопровождается .нарастанием угнетенных и мертвых дрожжевых клеток. В ре-

зультате чего дрожжи начинают выделять ферменты в среду. В этот период в дрожжах в 8 раз снижается активность сук-цкнатдегидрогеназы. Активность внутриклеточных гидролитических ферментов остается достаточно высокой. В течение последующей выдержки усиливается автол-пз дрожжей л о клетках сохраняется высокая активность лротеиназы и р-фрукто фуранозидазы. В результате действия активной протеиназы ускоряется гидролиз внутриклеточных белков и ферментов и активность дегпдрогеназ в дрожжевых клетках заметно снижается. В течение первого года шампанизации в дрожжевых клетках сохраняются в активном состоянии многие окпелн-тельно-Еосстаповительные и гидролитические ферменты, что свидетельствует о преобладании в этот период окислительно-восстановительных реакции. На втором и третьем годах выдержки значительно снижается активность оксидоредуктаз и повышается активность протеолнтических ферментов, что обусловливает интенсификацию протекающих гидролитических реакций. Большинство выделяемых дрожжами ферментов-переходнт в вино. Вместе с тем, полученные результаты показывают, что роль дрожжей сводится не только к обогащению вина ферментами, которые в дальнейшем ускоряют реакции в шампанском. Нельзя исключать и влияние внутриклеточных ферментов дрожжей на биохимические процессы в шампанском. Так, в результате непрерывного обмена дрожжевых клеток, содержащихся в кюве, происходит потребление одних компонентов вина и выделение продуктов метаболизма клеток. Таким образом, постоянно в цитоплазме и в органоидах дрожжевой клетки ферменты дрожжей катализируют многочисленные реакции, в ходе которых происходит трансформация отдельных компонентов шампанского. Эти процессы не затухают, пока клетка полностью не погибнет. Интенсивность таких реакций определяется активностью составляющих ферментов в клетках дрожжей. Исходя из этого можно заключить, что определяя активность внутриклеточных ферментов, можно судить о направленности биохимических превращении в шампанском.

2, Особенности процесса послетнражной выдержки шампанского на дрожжах с нарушенной структурой,

Л. И. Опарин с сотр. (1947), Н. М. Снсакян с сотр. (1961, 1963) рекомендовали интенсифицировать биохимические процессы при шампанизации внесением в тираж авголизатов дрожжей, содержащих ферменты, витамины и азотистые соединения.

Нами было исследовано влияние .механически разрушенных дрожжей на 'биохимические процессы при шампаннзацин. 24

Для их получения дрожжи Штейнберг 1892 трижды прессова~ ли в камере при —70° (Любимов, Львов, 1963), что обеспечивает полное разрушение структуры клетки и сохранение ферментов в активном состоянии. В опытный тираж, включающий сухой внноматерпал, 2% сахара и 3% дрожжевой разводки, вводили различные количества разрушенных дрожжей (4 варианта): I—0,4; И—1,2; III—2,4; IV—3,2 г/л.

Переходящие в вино ферменты разрушенных дрожжевых клеток катализируют гидролитические реакции. Дрожжевые клетки в процессе иослетиражной выдержки обедняются азотистыми и фосфорными соединениями, полисахаридами, особенно гликогеном (в 10 раз). По-видимому, из гликогена частично синтезируется эргостерин, концентрация которого в дрожжевых клетках в процессе выдержки заметно увеличивается (табл. 8). В шампанизируемом шше в процессе вы-

Таблица 8

Изменение биохимических показателей дрожжевых клеток при послетиражной выдержке, мг/г

Показатели До выдержки Через 3 At ее. Чарез !0 месяцев

Контроль Опыт IV Контроль 1 Опыт

I П III IV

1. Общий азот 150 i» 9i 89 S5 82 56 47

2. Фосфорные сое- 17,8 5,71 7;О 6,2 7;3 7,4 6j5 6,0

динения,

в том числе:

а) кис л ото раство- — I,« 2,9 2,1 3,2 3,3 3,1 2,2

римая фракция.

в том числе:

орто фосфат 0,9 1,9 КО 1,5 0,9 0,9

стабильные — 0$ 0,4 0,5 0,9 1,3 1,4 0,8

соед.

лабильные ____ 0,1 0.6 0,6 о,а 0,7 0j8 0,5

СО0Д.

растворимые _ 0,7 1,4 0;5 1.5 0$ 0j5 0,6

лолифосфаты 0,3

б) липидная _ 0,7 0,9 1,1 0,9 0,3 0,4

фракция 3,0 3,1

в) клотонерас- — 3,2 3,7 3,0 ■3,2 3,2

творимая фрак-

ция

3. Гликоген 58,5 Э2.Э 5,0 10,6 12,2 ! 0,8 9,6 4,9

4. (Маннзи 3,8 2,7 4,8 2,4 и» 1,7 1.7 1,0

5. Трегалоза __ —. __ 1.7 1,3 0,7 0,7 0.5

6. Эргостерин ¡2,4 19*2 23,1 24,0 15,3 20,7 25,5 33,0

держки повышается содержание азотистых к фосфорных соединений, причем тем значительнее, чем больше количество внесенных разрушенных дрожжевых клеток. Изменяется соотношение отдельных форм фосфорных соединений в вине, особенно его лабильных соединений, составляющих в начальном вине 7% от общего содержания фосфора, а к концу опыта достигших 14% (табл. 9), Кроме того в шампанском, ларал-

Таблица 9

Изменение отдельных форм фосфора » вине при выдержке тиражированного шампанского с разрушенными дрожжевыми клетками, мг/л

Показатели До выдержки "Через 3 мес. Через 10 месяцев

Контроль Опит IV Контроль Опыт

1 II Ш IV

Фосфорные соеди- Э0.3 32,5 35,7 39,4 14,0 52,3

нения,

в том числе:

Кис лото рас тво- 2Э;5 31,0 45,8 -34,8 38,3 43,8 49,7

римая фракция.

в том числе:

ортофосфат 16,5 17,7 30.6 21,9 25,9 27,4

стабильные кое д. 10,3 ll.il 115,8 lt,9 123 15,2 16,2 17,2

лабильные еоед. 2Д 2,1 3,5 4,4 5,4 6,7 7,1 7,4

растворимые полп- 0,7 0,5 0.7 0,5 0,5 0,7 0,8 0,9

фосфаты

дельно с увеличением дозы внесенных автолизатоз, увеличивается содержание этиловых эфиров жирных кислот, диэтил-сукцината, диэтилмалата и кислого этилового эфира янтарной кислоты. После дегустации выдержанного 10 месяцев шампанского лучшим был признан образец с добавкой 2,4 г автолиза-тов. Ето приятный вкус и букет, по-видимому, формируются определенным сочетанием и оптимальной концентрацией веществ, обусловливающих 5 у кет, а также повышенным по сравнению с остальными образцами содержанием фенилэтанола. Таким образом, обнаруженная интенсивная направленность автолнтическнх процессов при выдержке тиражированного шамлапс-хого на дрожжах с нарушенной структурой «легки, улучшает его вкус и букет.

3. Влияние штамма дрожжей на качественные особенности шампанского.

А. М. Фролов-Багреев (1958) и Г. Г. Агабальянц (1962) обращали внимание на существенное влияние расы дрожжей в формировании качественных особенностей шампанского. На-26

мн поставлены две серии опытов по шампанизации виномлте-рналов различными штаммами дрожжей.

В первой серии использовали пиломатериал из винограда Пнно-Фран. Btop.üHj'.cc З'рожеипе арооодллн с дрожжами Д1Ш и ФШ-2. Газожид костная хроматография выявляет отличия в составе многих компонентов этих образцов шампанского. В прс'нессе шампанизации и выдержки увеличивается содержание высоко кипящих эфиров и феннлэтанола. Если в вино-материале содержание сложных эфиров составляет 105 мг/л, то после выдержки на дрожжах A1L1I— 115 мг/л, а па дрожжах ФШ-2 — 139 мг/л.

В следующем опыте было изучено влияние 4 штаммов дрожжей, используемых в шампанском производстве; Штейн-берг 1892, МШ, ФШ-1 и ФШ-2. В отличие от предыдущего опыта тираж был поставлен на купаже Московского завода шампапсклх пил и выдерживался после брожения 1 год. Из табл. 10 видно, что штамм дрожжей оказывает значительное влияние на качественный п количественный состав компонентов. После шампанизации с дрожжами ФШ-2 образуется наибольшее количество сложных эфнров — 235 мг/л, в то время как в шампанском, сброженном на дрожжах МШ обнаружено минимальное содержание сложных эфирои — 64 мг/л. В образцах шампанского с дрожжами Ф111-1 и ФШ-2 содержится больше этиловых и изоамиловых эфнров жирных кислот и (1-фснплэтанола, Дегустационная оценка отмеченных образцов соответственно высокая — 9,1 и 9,0 балла. Полученное шампанское имеет развитый тонкий букет, характерный для бутылочного шампанского. При использовании дрожжей Штсйиберг 1892 аромат н вкус шампанского посредственный. Брожение на дрожжах МШ дает наиболее низкокачественное шам па некое. Поэтому штаммы ФШ-l и ФШ-2 могут рассматриваться -как .перспективные для шариатского производства.

Таким образо.м, протекающие прн шампанизации автоли-тнческие ¡процессы существенно влияюг па активность ферментов в дрожжевых клетках и интенсивность катализируемых ими превращений в шампанском. Снижение активности окислительно-восстановительных ферментов в дрожжевых клетках При некотором повышении активности гидролитических ферментов к концу первого года выдержки обусловливает соответствующий характер биохимических процессов на отдельных стадиях бутылочной шампанизации. Дрожжевые клетки в шампанизируемом вине следует рассматривать не только как источник ферментов вина, но и как центры сложных биохимических превращений. Ферменты дрожжевых клеток прн дли-

тельной послетнражноп выдержке играют весьма важную роль.

Применение отдельных штаммов дрожжей, отличных по биохимическим признакам, позволяет изменять процессы и со-

Таблица 10

Влияние штамма Дрожжей на состав компонентов букета, образующихся при шампа«мзацни

Компоненты Содержание компонентов букета 1 й шампанском после выдержки J на дрожжах мг/л) год

ШтеЯлбеиг !В9> мш ФШ-1 ФШ-'J

Этиллактат 78 18 77 1ЭО

Этнлкалрнлат m >'А >32 2S

Из оа м н.п к ал р о 11 ат 5.6 0 4,5 IS

Y-бутиролактом 0 0,61 044 0,48

Дютнлсукиннат 3,7 5,1 4,2 4,4

Эти лп ел а р:гон ат 6,9 2й 7,6 11

Этилкапрниат И 3,5 5.9 ■2 ¡8

Шоамид кал р плат .3,7 1.1 1,0 ■5;4

Фен и лэт пл а иетат 0Д9 0,13 0,76 0.1S

Фенилэтанол 7,8 12 16 аэ

Этиллаурат 0 0,14 0,13 M

Из о б у т ! i л атцмш а т '0 0 0,73 0

Е (зоа ч и л к ал 1 ри н я т 0,7 0 0;2ô 1,4

Диэтилмалат 7,0 8,2 7,6 (0

Этилмиргсстьт 0,712 0,43 1,2 0,75

Изоамиллаурат 0,® 0 0 0

Этилпз.пь.млтат 12 6,0 10 7,в

ТСропионовая клелота 5,® 1,5 1,0 2,1

Масляная кислота 4,3 1,0 1,4 2,-9

Изовалсрцзновая

кислота 6,2 0$ 1,2 0,3

Каирошмля ¡«¡слот,-1. 0 0,2 0,3 0,7

Капрнлоная кислота 0,5 0 0 0

Пел аргоновая кислота U ОД 0,7 0,7

Капроновая кислота 0,3 ад 0,7 0,4

Кислый этиловый эфир

янтарной кислоты 21 7,6 19 10

став образующихся при шампанизации веществ. Это подчеркивает необходимость работ по селекции дрожжей для шампанского производства.

Добавление механически разрушенных на холоду дрожжевых клеток, позволяет интенсифицировать биохимические процессы в шампанском, поскольку такие клетки содержат комплекс активных ферментов и других веществ, улучшающих вкус и букет вина и шампанского, 23

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Обобщение полученных экспериментальных данных позволяет определить особенности биохимических процессов при различных -способах автолиза.

При выдержке, нагревании, обработке холодом вина с дрожжами и шампанизации наблюдается выделение дрожжевыми клетками большого числа компонентов, влияющих на вкус н букет вина. При этом изменяются биохимические и физиологические особенности дрожжей. Уменьшаются размеры и масса дрожжевых клеток, повышается механическая прочность клеточной оболочки, изменяется сорбцпонная способность клеточных органелл к отдельным красителям, уменьшается содержание резервных веществ, распадаются белковые комплексы клеточных структур. Этн изменения наименее выражены в дрожжах, выдержанных при —5° и с повышением температуры выдержки усиливаются. Вместе с тем, если хранение вина с дрожжами при 10—20" сопровождается медленно возникающими процессами деструкции, то нагревание при 40—50° обусловливает резкие необратимые явления денатурации отдельных структур л в целом дрожжевой клетки. Таким образом, при тепловой обработке дрожжей в вине клетка бистро авто-лягн-руетея н продукты ее распада выделяются в «лио. В отличие от этого в процессе выдержки в вине при Ш—15° внутриклеточные процессы прекращаются медленно и дрожжевые клетки длительный период времени сохраняют физиологическую активность. Снижению скорости автолиза способствуют низкое рН вина {3,1—4,0), содержащиеся в вине кислоты, этиловый спирт и вещества, которые могут метаболизнроватьел дрожжевыми клетками в анаэробных условиях. Благодаря этому процесс выдержки дрожжевых клеток характерен не только выделением продуктов автолиза дрожжей в вино, но и биохимическими процессами, совершающимися в вине и в жизнедеятельных дрожжевых клетках. В пользу такого вывода* свидетельствуют цнтофизнологпческне наблюдения дрожжевых клеток с фазовым контрастом и люминесцентной микроскопией, а также данные об активности внутриклеточных ферментов в дрожжевых клетках, выдержанных и шампанском в течение трех лет. Так, большинство клеток полностью не разрушается, а как бы мумпиизируется. В течение I — 2 лет в дрожжевых клетках сохраняют активность многие де-гндро-геназы, катализирующие важные биоеингстнческне процессы и клетках.

Одним пз основных факторов, определяющих автолиз дрожжей, как показывают наши исследования, является знд-

чительная активация внутриклеточных гидролитических ферментов: прогепнзгш н пснтпдазы, которые ускоряя гидролиз структурных белкой и многих жизненно важных ферментов вызывают л::-шло распада клеток. Одновременно др о жжение клетки выдели¡n г уермеигы в вино, причем в наибольшей степени при сбрабоr¡;e холодом и выдержке при 10—15°. В процессе тепловой обработки наряду с выделением 'проч^хед,;-" инактивация ферментов.

Среди продуктов автолиза дрожжей необходимо от различные формы азотистых н фосфорнькх всщестз, полисахариды, липоиды, терленопды, сложные эфпры. Азотистые и фосфорные соединения в минимальной степени переходят п вино при сбрабопсс холодом, В процессе выдержки при 13—-0° па Солее заметно обогащаются этими компонентами, одновременно протекают и процессы их вторичной траноформац!!И. Так, бьгдслнешнсся белки дрожжей гпдролнзуюгея до аминокислот, последние в результате биохимических превращении дают всщсстза, влияющие на вкус н букет вина. В результате взаимодействия кислот дрожжей со спиртами вина образуются эфпры, изменяющие букет вина. При нагревании дрожх;сй в вике скорости данных реакций возрастают, существенно интенсифицируются карбоинламинпые реакции. Наряду с этих;;;, процессами ву. :;::хе>ют явления термического распада химических вещсстс, тепловой денатурации белков, инактивации ферментов и вызванное этим снижение скорости ряда ферментативных реакций. Отмеченные отличия в направленности и интенсивности биохимических превращении при описанных способах автолиза обусловили значительные различия в составе веществ, накапливающихся прн этом в вине. Как показали анализы, образцы вин, выдержанных с дрожжами различные сроки при —5. Í5, 40 и 60°, отличались по составу ам;шо;;,;с-лег, фосфорных соединений, терпенопдов, зфиров, спиртов, к [[слот, а, следовательно, по вкусу н букету.

Таким образом, приведенные закономерности процесса автолиза дрожжей в вине подчеркивают, что температурный т>с-жим определяет не только количественные, но и качественны различия в продуктах, образующихся прн этом в вине. Следует отметить, что важнейшее значение имеют также биохимические осс^беиностл автол нзирующихся дрожжевых клеток. Опыты по выдержке нескольких штаммов винных дрожжей в модельных средах при одинаковых условиях показывают достаточно заметные отличия в продуктах автолиза отдельные штаммов. Несомненную роль играет и способ предварительной обработки дрожжей.

IIa ослодачпн прозеденных исследований можно ззклю-

чнть, что регулирование процессом автолиза дрожжей осуществима путем выбора определенных рас дрожжей, состава среды, изменения температуры н продолжительности процесса. Для регулирования состава продуктов автолизл использованием отдельных рас дрожжей, необходимо знание химического состава и ферментативной активности дрожжевых клеток. В случае одинаковых штаммов дрожжей и среды, температурный фактор выдержки является крайне важным. В частности, выдержка на холоду при —5--позволяет обогатить вино ферментами дрожжей. Выдержка вина с дрожжами при 10—20' способствует переходу в вино ферментов, азотистых, фосфорных соединений, компонентов букета и протеканию ферментативных процессов и вине. При нагревании шшп с дрожжами при 40—'35" в течение 1—2 суток большинство процессов, характерных для выдержки при 10—20э, протекают с более высокой скоростью. Повышение температуры и удлинение продолжительности обработки обусловливает преобладание 13 вши пеферментатнвных процессов, накопление продуктов ! ..убэкого распада клетки и теплового воздействия.

Выделенные закономерности биохимических процессов, протекающих ирн автолизе дрожжей п вино и шампанском, могут быть нсподьловаиы п практике и зависимости от конкретных задач производства.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что н процессе выдержки дрожжей в агше. обработки холодом и теплом вина с дрожжами в клетках происходят заметные цптофпзнологическне изменения. Особенно интенсивная деструкция внутриклеточных структур дрожжей пронсхп;шт при тепловом автолизе. Наименьшие отклонения возникают в дрожжевых клетках при обработке холодом. Экспериментально установлено, что при автолизе в клетках дрожжей активируются внутриклеточные протсипазп и пентн-даза, которые ускоряют распад структурных белков дрожжей.

Выяснено, что автелнзнрующнеся дрожжи выделяют в вино протеолптическне ферменты, дегидрогеназы, я мин о кислоты, пептиды, маннан, кислоторастворимые формы фосфорных соединении, сложные эфири, терпенолды.

2. Найдено, что наибольшее обогащение вина ферментами происходит и процессе обработки вина с дрожжами при —5°. При тепловой обработке наряду с переходом веществ из дрожжей в 1з;ито наблюдается инактивация ферментов.

3. При выдержке вина с дрожжами снижается содержание ацетальдегида, нзобутапола, нзопентакола п спнтезиру-

,Ч]

ются эфиры этилового, изабугилового и изоамилового спиртов и жирных кислот. Эти процессы способствуют развитию тонсе с ы держанных вин. Результаты исследовании динамики компонентов букега позволяют установить оптимальный режим процесса выдержки вина на дрожжах: 30—45 суток при температуре ¡0—15". В качестве объективных критериев этого процесса предлагается оценивать концентрацию этиловых эфнрсс молочной, капроновой, каприловой и капрнновой кислот.

4. Выяснено, что азотистые и фосфорные вещества в наименьшей степени переходят из дрожжей в вино при обработке холодом. Выдержка и тепловая обработка вина с дрожжами способствуют не только обогащению вина этими компонентами, но и вызывают их дальнейшие превращения, которые интенсифицируются по мере повышения температуры и удлинения срока обработки. Композиционный состав веществ, сбуслсвлисающих букет вина, также находится в зависимости от режима процесса азтолкза,

5. Исследованы автолнтнческие процессы при шампанизации. Обнаружено, что активность окислительно-восстановительных и гидролитических ферментов в дрожжевых клетках изменяется в различные периоды шампанпзацпн и выдержки шампанизированного вина па дрожжах. Активность внутриклеточных ферментов дрожжей определяет интенсивность соответствующих реакций при шампанизации. В течение первого года шампанизации преобладают окислнтельно-восстанови-тельные реакции, а па втором-третьем годах выдержки 'Главенствующими являются гидролитические реакции.

6. Изучено влияние четырех штаммов дрожжей на состав веществ, обусловливающих вкус и букет шампанского. Показано, что большее накопление сложных эфироц и феинлэта-нола и лучшее качество шампанского отмечается при использовании дрожжей ФШ-1 и ФШ-2. Исследовано действие механически разрушенных дрожжевых клеток на процесс шампанизации. Обнаружено, что под влиянием ферментных систем этих клеток интенсифицируются автолшическне процессы, ща.мпанскос обогащается продуктами автолиза, улучшающими его вкус и букет. Таким образом, применение для шампа-низанни -наилучших штаммов дрожжей и добавление механически разрушенных дрожжевых клеток перед шампаН7;згшпеи позеоляст повысить качество шампанского.

7. Па основании проведенных исследований обоснованы способы регулирования процессов автолиза дрожжей пр:( производстве шампанского. Показано, что состав продуктов автолиза дрожжевых клеток зависит от штамма дрожжей, темпе-32

ратурного режима, продолжительности процесса и состава вина. Указанное позволяет дать научно-обоснованные рекомендации производству. Тепловой автолиз дрожжей следует использовать в тех случаях, когда необходимо обогатить вино азотистыми, фосфорными п букетистыми веществами клеток и продуктами их превращений. Обработка холодом внна -с дрожжаатн при в течение 2—5 суток нами предложена я качестве эффективного технологического приема обогащения вина ферментами дрожжевых клеток.

список

работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Цнтофизиологические к биохимические исследования дрожжевых клеток в вине при термической обработке и в процессе выдержки их на вине. Тезисы докладов на научной конференции ВЗИПП, 1968, 216 (в соавторстве с Авакянц С. П., Лебедевой Т. И.).

2. Действие нагревания и охлаждения вина с дрожжами на структуру и ссойстаа дрожжевой клетки. Прикладная биохимия и микробиология, 1959, 5, в. I, 72 (в соавторстве с Авакянц С. П., Сергеевой А. М.).

3. Патофизиология в биохимия автолиза дрожжей в вине. Известия высших учебных заведений. Пищевая технология, 1970, № 4, 81 (в соавторстве с Авакянц С. П.).

4. Ферментные превращения при автолизе дрожжей п вине. Материалы научной конференции ВЗИПП, 1971, 26 (в соавторстве с Авакянц С. П., Саркнсовоп Л, Г.).

5. Биохимические и микробиологические методы нсследова-

■:ей и вина. ЦНННТЭИ Пищепром, 19/1, брошюра, 2,5 п. л. {в соавторстве с Авакянц С. Г1.).

6. Газохроматюграфпческое определение легколетуч их компонентов вина. ЦШ-ШТЭИ Пищепром. Винодельческая промышленность. 1971, в 8, 3 (в соавторстве с Авакянц С. П., Крыловым Б. К.).

7. Изменения активности ферментов в дрожжах и вине при автолизе. Прикладная биохимия и микробиология, 1972, 8, в. 4, 481 {в соавторстве с Авакянц С. П., Саркисовон Л. Г).

8. Влияние автолиза дрожжей на букетпетые веществ» вина. Тезисы докладов на научной конференции ВЗИПП, 1972, 30 (в соавторстве с Авакянд С. П.).

9. Определенно высококппящпх букетнетых веществ вина и шампанского. Виноделие и виноградарство СССР, 1973, № 1, 10 (в соавторстве с Авакянц С. П.).

10. Влияние автолиза дрожжей на состав букетнетых веществ вина. Известия высших учебных заведений. Пищевая технология, 1973, Лэ 4, 95 (в соавторстве с Авакянц С, П.).

11. Динамика некоторых компонентой вина и дрожжей прн выдержке н термической обработке. Материалы научной конференции ВЗППП. 1974, 19 (в соавторстве с Авакянц С. П., Мальцевой П. О.).

12. В биохимических процессах при выдержке тиражированного шампанского на дрожжах с раздробленной структурой. Биологический журнал Армении, 1974, 27, № Т, 72 (в соавторстве с Авакяпц С. П.).

По результатам диссертационной работы сделаны доклады: на научных конференциях Всесоюзного заочного института пищевой промышленности в 1908, 1971, 1972, 1971 гг.

Т(фяж 200

Заказ 494

Тип. ЦННМТЭП Мпнзага ССОР, 123?М, Млскиа, Д-290, Мук-о мольный пр., д, 3