Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Индуцированный автолиз дрожжей

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Индуцированный автолиз дрожжей"

На правах рукописи

ИВАНОВА Нина Геннадьевна

ИНДУЦИРОВАННЫЙ АВТОЛИЗ ДРОЖЖЕЙ

03.СО.23 - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва -1998

Рабата выполнена в лаборатории биологически активных веществ Института биотехнологии.

Научные руководители: доктор биологических наук,

профессор

ЭЛЬ-РЕГИСТАН, Галина Ивановна; кандидат биологических наук, старший научный сотрудник БРАВОВА Галина Борисовна. Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор

ГРАДОВА Нина Борисовна; кандидат биологических наук, старший научный сотрудник АРЕНДС Ирина Михайловна Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский инсппуг пищевой биотехнологии

Занщта состоится " Л^у^б^сЛ. 1998 г. в часов на

заседании диссертационного совета Д 053.34.13 в Российском химико-технологическом университете им. Д.И.Менделеева по адресу: 125047, Москва, А-47, Миусская пл., 9.

С диссертацией можно ознакомиться в научно-ннформациониом центре РХТУ им. Д.И.Менделеева.

Автореферат разослан ¿р&^РаЛЯшъ г.

Ученый секретарь

диссертационного Совета, /У ,

кандидат биологических наук ¡И И.И.Гусева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Значение микроорганизмов в решении проблемы увеличения пищевых и кормовых ресурсов нашей планеты достаточно широко освещалось в научной литературе (Скрябин, 1979; Несмеянов,Беликов, 1979; Roth,I979; Rosales,!984). Основной предпосылкой применения микробного бедка в питании человека и в составе кормов для сельскохозяйственных животных и птицы явилась его полноценность, обусловленная содержанием незаменимых аминокислот.

Дрожжи как источник высококачественного микробного белка занимают особое место в биотехнологических производствах мира. Однако питательная ценность дрожжеаой биомассы ограничена малой доступностью клеточного содержимого для действия пищеварительных ферментов. Автолиз, как один из способов дезинтеграции клеток, предусматривающих высвобождение клеточных биополимеров, особенно белка, в виде растворимых легко усваиваемых соединений, считается наиболее экономически выгодным (Беликов ссоавт.,1976, 1980; Безруков с соавт.,1986; Лзтов ссоавт.,1990).

Дрожжевые автолизаты находят применение в животноводстве и кормопроизводстве, являются сырьем в производствах белковых и вкусовых добавок пищевого назначения, аминокислотных концентратов и смесей для парентерального питания, растворимых экстрактов доя изготовления ростовых в диагностических питательных сред в микробиологической и медицинской промышленносг0(Борисенко,1967;Неклюдов)К}'пов,1988; Бабаян, Латов, 1992).

В связи с изложенным, проблема разработки эффективного промышленного способа автолиза микроорганизмов, направленного на повышение питательной ценности микробной биомассы и расширение сферы ее применения, очень актуальна.

Настоящая работа предусматривала изучение ауторегуляции автолиза дрожжей на популяциоююм уровне и возможность перенесения выявленных закономерностей в биотехнологическуго практику. Ауторегуляция такого типа осуществляется при участии системы внеклеточных ауторегуляторных факторов (di и <h), контролирующих физиологическую активность клеток, одни из которых - факторы dh, как было показано ранее для других микроорганизмов (Эль-Регистзн с соает.,1979; Светличный,1982; Коновалова, 1985; Бабусенко с соавт.,1991). обла/гякгг фунгдилм;: аутоиидукгоров автолиза.

Целью работы было изучение характеристик автолиза дрожжей различных родов, индуцированного аугорегуляторньгаи факторами di или их химическим аналогом, и разработка на основе выявленных закономерностей тех-

нологии получения автолизатов дрожжей в периодическом и непрерывно режимах производства.

В задачи работы входило:

- выделение факторов cb - аутоиндукторов автолиза - дрожжей Rhode torula aurantiaca, Saccharomyces cerevisiae и Candida guilliermondii.; изучение и физиологического действия; выбор химического аналога этих ауторегудогге ров;

- изучение и подбор фкзико -химических и физиологических, карамегро! оптимальных для автолиза дрожжевых клеток, индуцированного ауторегуля торным фактором ¿2 и его химическим аналогом;

- разработка промышленной технологии получения дрожжевых автоди затов кормового назначения в периодическом и непрерывном режимах;

- разработка технологических приемов получения растворимых экс трактов авголизированных дрожжей;

- исследование биохимических характеристик и показателей качеств; дрожжевых автолизатов, полученных при различных режимах ведения про цесса и имеющих различное целевое назначение.

Научная шшшш работы. На примере дрожжей родов Rhodotorula Saccharomyces, Candida подтверждена универсальность ауторегулящш физио логической активности клеток микроорганизмов, осуществляющейся npí участии внеклеточных ввдонеспецифичных мемранотропных ауторегулято ров, одни из которых - факторы da - обладают функциями биологических ин дукторов автолиза клеток.

Похазано, что в состав активного начала факторов dj дрожжей входя моно- и полякенасыщенные свободные жирные кислоты (НСЖК), состав ко торых зависит от таксономической принадлежности продуцента, а количе ствешое соотношение - от условий культивирования; концентрационный пух внеклеточных аутоиндукторов автолиза включает кроме фракции СЖК ней' тральных штшдов зарезервированные в ацилглщеридах потенциалы»» СЖК, которые реализуются под действием липаз.

Видокеспецифичность, однотипность химической природа: и механизма действия факторов йг микроорганизмов разных таксонов явились основанием для выбора химического аналога этих регуляторов - олеиновой кислоты, обладающего свойствами обдмгатного индуктора автолиза. Это позволило впервые разработать способ автолиза микроорганизмов, который можно вести в незащищенных условиях, упразднив в технологическом процессе стадию дополнительной очистки продукта о г антисептика.

Впервые показана двустадинностъ процесса саморазрушения клеток, включающего стадии индукции и собственно автолиза, которые различаются природой и результатом событий. Теоретический анализ згапности индуцированного автолиза микроорганизмов позволил оптимизировать обе стадии процесса и определил такую значимую характеристику, как кратковременность его проведения - 4-8 ч (по сравнению с 24-96 ч по данным патентной экспертизы), Подобрзн комплекс физико-химических я физиологических параметров для оптимизации стадий индукции и собственно автолиза клеток с учетом ведения процесса в периодическом или непрерывном режимах, предусматривающий возможность полупения автолизатов различного целевого назначения.

Практическая значимость работы. Разработаны высокоэффективные промышленные технологии получения автолизатов дрожжей, характеризующиеся: кратковременностью процесса (4-8 ч); проведением автолиза в условиях асептики; возможностью получать конечный продукт без дополнительной очистки от антисептика и токсичного химического индуктора; осуществляющиеся в периодическом и непрерывном режимах производства.

Разработана нормативно-техническая документация на опытно-промышленное и промышленное производство автолизатов кормовых дрожжей, выращенных на различном сырье (н-парафяны, растительные гад-ролизаты, этанол) в периодическом и непрерывном режимах. По утвержденной НТД получено более 2000 т автолизатов кормовых дрожжей.

Разработано "Наставление по применению автолизата кормовых дрожжей з животноводстве", утвержденное Главным управлением ветеринарии (К 23 от 08.01.92 г.). Применение автолизатов дрожжей в составе различных комбикормов, беяково-витаминно-микеральных добавок и заменителей цельного молока позволило увеличить привесы телят на 20-35% и кур на 7-2£>%, при экономии хорков па ! кг прироста до 20-26% и 4-10% соответственно; в пушном звероводстве - увеличить линейный рост норок, получить на 2025% больше шкурок особо крупных размеров и повысить качество меха.

Разработана нормативно-техническая документация на опытпо-промышленное производство экстрактов автолшировакных дрожжей, используемых в составе ростовых и диагностических питательных сред для микроорганизмов.

Амриозция работы. Основные результаты исследований по теме диссертации докладывались на научных конференциях (всесоюзных и региональных): "Современные проблемы биохимии и физико-химической биологии" (Москва, 1984 г.), "Пути совершенствования технологических процессов и

оборудования для производства, хранения и транспортировки продуктов питания" (Москва, 1984 г.), "Современные проблемы биотехнологии микроорганизмов" (Рига, 1987 г.), "Молодые ученые - биотехнологии" (Москва, 198S г.), "Hobos в кормлении животных и кормопроизводстве" (Москва, 1992 г.) "Разработка и производство препаратов медицинской биотехнологии" (Махачкала, 1992 г,), "Актуальные вопросы разработки микробиологически?! питательных сред к тест-систем" (Махачкала, 1995 г.), "Диотактсриозы и эу-биотики" (Москва, 1996 г.)

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов и списка литературы. Материал изложен на 142 страницах машинописного текста, содержит 15 рисунков и 27 таблиц, список литературы включаем 179 наименований.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования служили краснопигменткрованные дрожжи Rhodoiorula aurantiaca из коллекции ВНИИсиытезбедож, а также производственные штаммы дрожжей Saccharomyces cerevisiae, S.carlsbergensis, Candida guHiiermondu, C. scottii, C.giutiniw В лабораторных исследованиях дрожжи выращивали на соответствующих жидких питательных средах. В производственных испытаниях использовали дрожжевую суспензию основного производства и "остаточную биомассу" пивных дрожжей.

Стандартные микробиологические анализы проводили, пользуясь общепринятыми методами (Герхард, 1984). Микроскопические наблюдения вели на микроскопе марки "AmplevaF (Германка) в фазовом контрасте. Для уль-трамикроскошгешсих исследований клетки фиксировали по методу (Мейсель с соавт.,1962) и заливали смесью эпоксидных смол. Ультратонкиг срезы получали на микротоме LKB-III (Швеция), и просматривали на электронном микроскопе JEM-100C (Япония)

Очистку факторов d? проводили методами колоночной и тонкослойной хроматографии (ТСХ) разделения и очистки липидов с использованием сиди-кагеяя "Chemapol" и пластинок "Merk", "Kodak", "Silufol" (Кейтс,1975).

Идентификацию жирных кислот проводили методом ГЖХ и хромато-масс-спектрометрии та метиловых и триметилсилиловых эфнров на хроматографе "Цвет-101" с пламенно-ионизационным детектором и хромассе "НР-5985" с хроматографом НР-5840 и квадрупольным масс-анализагором.

Эндогенное дыхание клеток измеряли полярографически (Шольц, Островский, 1975). За единицу активности факторов ch принимались концентра-

Win, в которых они ингибировали эндогенное дыхание клеток дрожжей линейной фазы роста на 50%.

Жизнеспособность клеток микроорганизмов определяли по числу коло-ниеобразующих единиц (КОЕ) при высеве клеточных суспензии на плотные питательные среды.

В иммобилизованных яатавных и автолизированкых клетках дрожжей определяли: общий белок кри его . окрашивании бромфенолблау (Hesse et al., 1971); общий азот - ускоренным методом (Плешаков, 1976). В растворимой Фракции автолизата определяли: общий белок - по Лоури или биурстовым методом Думаса (Дженсен,1965); амяякый азот - с ТНБС (Filds,1971) и методом фермольного титрования; редуцирующие вещества - по методу Шомоди-Нельсона (Синицын,1980); общее количество углеводов - антроновым методом (Максименко с соавт.,1971); нуклеотиды ДНК и РНК - спектрофотомет-рически (Спирин, 1958); РНК и продукты ее деградации - орциповым методом (Herbert et at.,1971). Аминокислотный состав растворимых белков определяли после их кислотного гидролиза HCl на аминокислотном анализаторе КВ-4101 в физиологическом режиме.

Переваримость белков in vi!го определяли согласно "Методическим рекомендациям по биологической оценке продуктов питания" (1973); биологическую ценность продуктов - с использованием тест-объекта Tetrakymerm pyriformis согласно "Методическим рекомендациям по биологической оценке продуктов животноводства и кормов (1977).

Определение условно-патогенной контамигоптоаей микрофлоры проводили в соответствии с "Инструкцией по микробиологическому контролю производства БВК на углеводородах нефти" (1933).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Выделение, идентификация и физиологическое действие аугокидукторов автолиза - факторов ¿2 дрожжей

Сырые препараты фаеторов d: дрожжей S.serevisiae, R.aurantiaca, С. guUliermondii получали из отделенной от клеток культуральной жидкости (КЖ) культур стационарной фазы роста, путем экстракции бутанолом с последующей отгонкой растворителя и последовательным фракционированием в бифазных системах хлороформ : метанол : вода (2:2:1,8) и (2:2:5). собирая нижний хлороформеиный слой. Последнюю фракцию упа-

ривали и растворяли в 96%-ном этаноле.

В процессе хроматографэтеской очистки факторов d2 от примесей биологическую активность каждой фракции определяли: а) количественно - по

влиянию на эндогенное дыхание клеток продуцента; б) качественно - по способности индуцировать автолш клеток. Учитывая архитектонику дрожжевых клеток, их эндогенное дыхание измеряли в двух вариантах: непосредственно внося испытуемую фракцию в полярографическую ячейку, содержащую биологический материал (как в опытах с прокариотами), или предварительно инкубируя дрожжевые клетки с испытуемой фракцией липидов в течение 15 мину г.

о

о

о р.

о м

о

I 1

t=í

; р

-I £ 1

st i

ПК Ш В 2 Ш3 Ш4 Об

Рис. I Зависимость степени ингибирования дыхания клеток препаратами фактора (I; (30 мкг/мл) от времени инкубации: а - непосредственное воздействие фактора; в - прединкубация клеток с фактором с течение 15 мшит (К - контроль; 1 - моноглицериды; 2 - диглицеркды; 3 - стеролы; 4 - свободные жирные кислоты; 5 - триглицериды)

После разделения сырых препаратов авторегуляторов на колонках с си-ликагелем биологическая активность была обнаружена во фракции нейтральных лиггидов, качественный состав которых был одинаков для исследуемых дрожжей разных родов и включал, например для R.aurantiaca: моно-глицеридов - 9,9%; диглицеридов - 14,8%; сгеролов - 19,8%; свободных жирных кислот (СЖК) - 40,6%; триглицеридов - 7,9%. Тестирование хроматогра-фически гомогенных препаратов ауторегуляторов, полученных методами препаративной ТСХ, выявило, что биологической активностью аутоипдукто-ров автолиза обладает преимущественно фракция СЖК (табл.1), аналогично показанному ранее для микроорганизмов других таксопов (Светличный, 1982; Коновалова, 1985; Бабусепко с соавт.,1991). Действие moho-, ди- и триглицеридов на дыхание клегок проявлялось, в основном, после их прединкубации с

тест-материалом (рис.1). Полученные данные весьма существенны для объяснения критического повышения концентрации СЖК в стационарной фазе роста микробных культур, которое может рассматриваться как побудительная причина их спонтанного автолиза,'и коррелируют с результатами определения динамики факторов (1г в развивающихся культурах других микроорганизмов (Светличный, 1982; Коновалова, 1985; Бабусенко с соавт.,1991).

Таблица 1

Индукция автолиза Я.аигапНаса хроматографически гомогенными фракциями фактора ¿2

Фракция фактора Концентрация, вызывающая автолиз, мкг/мл (2 ед. актива.)

Моноппщериды 30

Диглицериды 36

СЖК 9,6

Триглицериды 48

Фактор йг (сырой препарат) 42

Качественньш состав фракций СЖК факторов cb дрокжей был определен методами ГЖХ и хроматомасс-спектрометрии (табл.2). В отличие от состава фаеторов ch прокариот (Светличный, 1932; Бабусешсо с соавт.,1991), где доминировали пальмитиновая, стеариновая и олеиновая кислоты, у дрожжей в значительных количествах дополнительно обнаруживались пальмитолеи-новая, линолевая и линоленовая кислоты.

Продуценты, выращенные на этаноле или образующие его в процессе роста, в отличие от растущих на сусле или н-иарафинах, характеризовались более высоким содержанием моно- и полиненасыщенных жирных кислот (табл.2), что можно объяснить компенсаторным увеличением их синтеза для поддержания степени жидкоспгости мембран и обеспечения липид-белковых взаимодействий в них (Dombak, Ingram, 1984).

В биологических тестах было установлено, что факторы й?. различной степени очистки исследуемых продуцентов, фракции СЖК аутошщукторов и коммерческие препараты ненасыщенных жирных кислот (НЖК), входящих в их состав в доминирующих количествах, имели аналогичное действие. Во всех случаях степень ингибирования дыхания кчетек пспишалась: при увеличении концентрации вносимых шшидов (рис.2), снижении рН инкубационной среды (рис.4), уменьшении количества биологического материала в ячейке (рис.5), а также развивалась во времени (рис.3) и зависела; от физиологического возраста клеток (рис.2).

120 т

500

1000

1500

нМ/мл

Рис 2. Влияние олеиновой кислоты на эндогенное "дыхание клеток КашапИаса, взятых с экспоненциальной (1) и середины линейной (2) фаз роста

о -ч 00

о

Р< о

Е 40

о «

X о

е-

о

§ 8 я

к ч:

о

О 1 234567 8

рН

мш

НЕ—2

Рис.3. Влияние пальмитиновой (1), стеариновой (2), олеиновой (3) и л «нолевой (4) кислот в концентрации 600 нМ/мя на эндогенное дыхание клеток S.serevisiae.

О 2 4 6 8 10 12 14 16 18" 20

Ксадштрвдшююгочиоадотагаш,»/» or Mi

О

-0-1-л-г

Рис. 4. Влияние факторов da R. ammtiaca(l) н S.cerevmae (2) на эндогенное дыхание киеток линейной фазы poen a в зависимости от рН среды (0,15 М фос-фат-цшратный буфер, концентрация факторов I ед.акт./мл)

Рис. 5. Влияние фактора йг Р^аигапиаса на эндогенное дыхание клеток продуцента линейной фазы роста в зависимости от концентрации клеточной суспензии (концентрация фактора 40 мкг/мг МСК)

Стимуляцию дыхания клеток линейной фазы роста под действием низких концентраций фракции СЖК (0,5-2,0 мкг/мл) или индивидуальных жирных кислот (7-25 нМ/мл) можно объяснить как их разобщающим действием на систему дыхания и окислительного фосфорилирования, так и, в случае действия НЖК, увеличением степени жидкостносги мембран митохондрий, что ведет к повышению активности ферментов е-тракспортной цепи (Антонов, 1982; Essel, 1982). Высокие концентрации фракций СЖК (20-80 мкг/мл) или индивидуальных НЖК (200-800 нМ/мл), приводя к сверхкритическому увеличению жидкостносги клеточных мембран, вызывали ингибиро-вание дыхания клеток любой фазы роста. Повышение концентрации НЖК до 1000 нМ/мл и более не приводило к ускорению или увеличению степени инги-бирования дыхания клеток, видимо, из-за эффекта насыщения мембран жирными кислотами (Sheii, Freese, 1983).

Таблкна2

Состав фракций СЖК факторов dz отдельных продуцентов

Жирнокислот-ный состав фактора d* Количество жирной кислоты, % от общего количества |

C.guiHi- ermondii, н-парафины R. aurantiaca S. cerevisias

этанол сусло СШфТСОб-разующие хлебопекарные

С 12:0 14,7 - 2,0 2,02 4,3

С 14:0 9,1 0,88 7,0 3,14 7,7

С 14:1 - - - 2,71

С 16:0 29,8 16,25 33,4 12,17 38,1

С 16:1 - - 2,0 43,36 4,9

С 16:2 - - - 0,22 -

С 17:0 - 0,80 - 0,34 -

С 17:1 - - - 0,25 -

С 18:0 22,8 3,46 16,0 .5,14 20,1

С 18:1 12,1 53,07 10,7 28,47 8,4

С 18:2 - 23,94 - 1,21

ГС 18:3 - 1,59 ' - -

С 3.9:0 - - - 0,97 -

стероид - - - - 4,0

С 120Сн 11,5 - 15,5 - 12.5

К18:0П !0QH - - 13,4 - -

Е насыщ. 76,4 21,39 58,40 23,78 70,2

2 нёнасыщ. 12,1 78,61 12,7 76,22 13,30

2 оксикислот 11,5 - 28,90 - ' 12,5

Отметим, что только у клеток линейной фазы роста или более старых была отмечена стимуляция дыхания при низких концентрациях дополнительно вносимого аутоиндуктора различной степени очистки или его химического аналога, в то время как у экспоненциально растущих клеток эти дозы вызывали ингкбирование дыхания и индуцировали автолиз. Полученные результаты объясняются тем, что липиды мембран клеток экспоненциальной фазы роста в наибольшей ст епени обогащены НЖК, что и определяет их максимальную физиологическую активность, а также максимальную чувствительность к индукторам автолиза (табл.3), поскольку даже незначительное повышение жццкосгности этих мембран является сверхкритнческим.

Таблица 3

Влияние коммерческих препаратов жирных кислот на дыхание шггактных клеток фазы линейного роста Р..аигап11аса

ЖК Остаточное дыхание клеток, % от контроля при добавлении препарата в концентрации

25 нМ/мл 200 нМ/мя 300 нМ/мл 600 нМ/мл 800 лМ/мл

Пальмитиновая (С 16:0) 106,0 100,5 103,0 93,5 84,2

Стеариновая (С 18:0) 102,0 112,0 95,0 84,0 78,1

Олеиновая (С 18:1) 142,5 43,0 27,0 25,5 20,0

Линолевая (С 18:2) 95,0 40,0 25,0 22,0 20,0

. Повышение биологической активности фактора ёг или его аналога при снижении рН инкубационной среды связано с лучшей растворимостью в ли-пидаой строме мембран протонироаанных молекул ЖК.

С биологической активностью, определяемой по изменению дыхания клеток, полностью коррелировала способность факторов йг, фракций СЖК я шздевидуалышх НЖК индуцировать автолиз клеток, о чем судили по падению ОП клеточных суспензий и снижению числа КОЕ при высеве автолизи-рующихся дрожжевых суспензий на плотные среды,

Различия в дестабилизирующем мембраны действии различных жирных кислот связаны с разницей в температурах их плавления, более низких у НЖК. Кроме того увеличение степени ненасыщенности лштадов клеточных мембран приводит к увеличению „дршмцаемости последних, изменению их

функциональной активности, влияет на лабильность фосфолипидов в системе перекисного окисления, изменяет эффективность механизмов защиты (Williams et al.,1972). Суммарные моднфикационные изменения структурных и функциональных свойств мембран, вызванные дестабилизирующим действием НЖК, играют существенную роль в развитии патологических процессов, одним из которых является автолиз клеток (Владимиров, Арчаков,!972; Ар-хипенко с соавт., 1975; Araki,Rifkind, 1981; Островский, 1997).

Отметим, что для дрожжей, имеющих сложную компартментализацию клеток, мишенью действия Ж К является не только ЦПМ, как у прокариот, но и мембраны внутриклеточньсс органелл, в том числе лизосом, при разрушении которых факторами ch или их аналогом начинается неконтролируемое расщепление макромолекул и клеточных структур под действием лчзосо-мальных гидролаз, которое заканчивается гибелью клетки.

Таким образом, в основном за физиологическое действие фактора ch исследуемых дрожжей ответственны ненасыщенные свободные жирные кислоты (НСЖК), аналогично показанному ранее для факторов ch других микроорганизмов как про-, так и эвкариот (Светличный, 1982; Коновалова,!985; 5а-бусешсо с соавт., 1991), а также для аутоиндуктора автолиза мнкеобактерий -фактора AMI (Roseabluh, Rosenberg, 1990).

Полученные результаты, с учетом практического аспекта дальнейших исследований, послужили основанием для выбора з качестве химического аналога фактора ch дрожжей олеиновой кислоты - нетоксичного соединения, не требующего его удаления из конечного продукта.

Обнаруженные однотипность химической природы аутоиядукторов автолиза микроорганизмов, их видонегаецифичность и закономерности механизмов действия факторов йг и их аналога - олеиновой кислоты - как дестзбилизаторов клеточных мембран микроорганизмов дали основание рассматривать их как облигатные индукторы автолиза микроорганизмов различных физиологических групп и таксономической принадлежности. Экспериментально данный вывод был подтвержден работами по автолизу избыточной биомассы очистных сооружений Новополоцкого завода БВК, в которых было показано, что после 4-часового автолиза, индуцированного олеиновой кислотой, в суспензии "активного ила" (МСК 2,7%) общее количество бактерий снижалось с 2x105 до 5x102 клетп«/чл, пслпссп-го отс? шшовали вмзнеспосоьные бактерии кишечной группы, в том числе сальмонеллы, оставшийся уровень "обсемененности" определялся в основном спорами кло-стридий.

Изучение автолиза дрожжевых ¡клеток, индуцированного факторами (12 и их химическим аналогом

В качестве индукторов автолиза в наших экспериментах были использованы факторы ¿2 исследуемых дрожжей или олеиновая кислота, вызывающие нарушение структурной и функциональной организации клеточных мембран. В числе первых регистрируемых характеристик автолиза клеточных суспензий были отмечены ингйбирование энергрдающих процессов, падение числа КОЕ и увеличение в инкубационной среде количества низкомолекулярных соединений.

При изучении физико-химических параметров, влияющих на интенсивность автолиза было показано, что падение числа КОЕ и ингибирование дыхания клеток максимальны при рН 3-4 (рис.2), в то время как преимущественное высвобождение из клеток продуктов гидролиза белка наблюдается при рН 6-8 (рис.6). Не менее важно, что максимальное ингибирование дыхания и критическое надеине КОЕ (до 0,01-0,05%) совпадали по времени и отмечались через 10-15 мин, после внесения индуктора в подкисленную клеточную суспензию. За этот период времени практически не регистрировался выход из клеток низкомолекулярпых соединений: клетки оставались интактиыми, но уже нежизнеспособными.

¡С

Рис. 6. Зависимость глубины автолиза клеток Я. аитапНаса от условий ведения процесса (индуктор - олеиновая кислота, 600 нМ/мл; время ведения процесса -4 ч, глубина автолиза - количество растворимого бедка к 100% белка в нативных клетках)

При определении глубины автолиза установили, что: 1) ощутимая деградация клеточного белка наблюдается через 2 ч и достигает максимума (з периодическом режиме) к 4-у ч ведения процесса, после чего скорость автолиза значительно замедляется (табл.4); 2) максимальная деградация белка отмечается в области рН 6,0-8,0, оптимальной для нейтральных и щелочных про-теаз дрожжей (рис.6); 3) скорость автолиза зависит от температуры дрожжевой суспензии (рис.6), что типично для кинетики ферментативных реакций. Повышение температуры выше 60 °С приводило к снижению скорости автолиза дрожжей вплоть до его прекращения, что объясняется инактивацией гидролаз, вследствие нарушения частичного протеолиза комплексов лизосо-мальных протеаз с ингибиторами, транслоцирующимися в цитозоле (РотгетоН в а1.,1983; Ко11аг, 81иг<3г1с, 1989).

Анализ полученных результатов дает основание говорить о двустадий-ности как индуцированного, так и спонтанного автолиза микроорганизмов, где первой стадией является индукция, регистрируемая по икгкбированшо знерго дающих процессоа и паденшо числа жизнеспособных клеток, а второй -собственно автолнтнческое разрушение клеток, определяемое по выходу в инкубационную среду продуктов деградации биополимеров. Подчеркнем, что эти стадии различаются принципиально как по природе и итогу процесса, так и по условиям, оптимальным для достижения этого итога.

Таблица 4

Влияние подкисления среды при индукции процесса на саморастворение клеток дрожжей Я аитапИаса (12% МСК)

Условия Продолжи- Концентрация Содержание рас-

автолиза тельность олеиновой творимого белка

автолиза, ч к-ты, нМ/мл мг/г МСК.

рН 6,8-7,0 6 600 201,3

рНЗ,5 15 мин. затем рН 6,8 2 200 115,6

4 200 170,4

6 200 207,7

К параметрам, которые необходимо учитывать на стадии индукции относятся: рН инкубационной среды; плотность автолизнрушок клеточной суспензии; концентрация индуктора и способ его внесения. Оптимизация этого этапа позноляег существенно (»2д более раз) сократить расход индуктора (табл.4), а также влияет на скорость и глубину автолиза на стадии деградации клеток. Автолиз как суммарный каталитический процесс протекает со скоростью, определяемой физико-химическими условиями.

Автолиз дрожжей в периодическом режиме

Наш практический интерес а основном был сопряжен с получением ав-толизатов кормового назначения, что требовало подбора условий, оптимальных для функционирования протеолкгаческого комплекса при обеспечении минимума активностей нукяеодеиолимераз (Покровский, 1972),

Для исследуемых дрожжей рН-опгимум проявления действия протеаз был обнаружен при значениях рН 6,0-8,0, а нуклеаз - в области рН 3,0-5,0. Исходя из этого было ограничено время пребывания клеточной суспензии на стадии индукции путем подщеяачивания инкубационной среды до рН 6,0-7,5 через 30-45 мин. после внесения индуктора и поддержании рН в нейтральной области до конца процесса.

Анионный состав инкубационной среды, создаваемый при ее подкисле-нци на стадии индукции какой-либо из минералькых кислот (серной, соляной, азотной или фосфорной), не оказывал существенного влияния на протеоли-тачес^то активность автолизирующихся клеток. Одновременно было показано, что ГО^-ионы икгибируют активность нуклеаз (0,59% нухлеотидов при подкислещш Нз?04, 1,09% - при использовании НгБО^.. Поэтому на стадии индукции было рекомендовано использовать ортофосфорную кислоту.

Катионный состав щелочей (ЫаОН, КОН, КШОН), применяемых при переходе к стадии собственно автолиза для оптимизации активности дрожжевых протеаз, так же не влияя на скорость гидролиза бешсрв, но был важен как качественная характеристика автолизатов кормового назначения, в связи с чем в технологические нормы бьшо внесено использование ЫаОН,

Таблица 5

Компонентный состав автолизатов кормовых дрожжей (папркна), полученных в разных режимах автолиза

Режим автолиза Содержание в растворимой части

бачка, мг/г МСК свободных аминокислот, иг/г МСК нуклеотцдов. мг/г МСК

1 205,2 11,2 9,8

2 240,0 87,4 12,8

3 131,2 . 13,8 16,7

4 312,4 107,2 2,47

Автолиз дрожжей С.цшШегтопйИ, проводимый в течение 6 ч при рН 6,57,0 в присутствии фосфат-ионов (режим 4 в табл.5) стандартно обеспечивал'

содержание в растворимой фракции до 30% глубокогидролизованного бейка и около 10% свободных аминокислот при незначительном - 0,25% - содержании нуклеопщов.

Температурный оптимум автолитической деградации клеток на обеих стадиях находился в интервале Т=45-58 °С и зависел от таксономической принадлежности и условий культивирования дрожжей: для С^иНЦеттогиШ и Б.сегеуише - 52-58 °С: для КаигаШшса, выращиваемых на этаноле - 45-52 °С.

Из физиологических параметров, влияющих на интенсивность автолиза, существенны физиологический возраст клеток (как отмечено выше) и плотность клеточных суспензий. Оптимальными по эффективности процесса были суспензии с 7-16% МСК, т.к. в более плотных наблюдался эффект каталитического ретроингибирования, а разбавленные суспензии было не выгодно использовать из экономических соображений (дополнительное емкостное оборудование, расход энергоносителей). Возраст меток, подвергаемых автолизу, в промышленных условиях определялся режимом накопления биомассы в основном производстве и поэтому данный параметр не корректировался.

Таблица 6

Качественные характеристики автолизатоз дрожжей - промышленных

продуцентов белка

Продуцент белка Содержание белка в ка-тивной биомассе мг/г МСК Содержание в растворимой части

беляа, мг/г МСК аминокислот, мг/г МСК нуклеоти-дов, %

Дрожжи на этаноле - БЖД (/?. шгапйаса) 169,7 102,1 20,4 1,22

Пивные дрожжи ($. сагЬЬегкепяЬ) 380,0 250,7 67,6 0,92

Гидролизные дрожжи (С. ясоШЦ 370,5 240,0 52.6 0,47

Дрожжи на углеводородах (С. Ю'ИИегтотЩ) 427,0 317,0 105,3 0,30

Анализ комбинаций физико-химических и физиологических параметров (Лакин,1980), влияющих па интенсивность яитптття дрогшей, ныгглил, что при получении продуктов кормового назначения более существенно строгое поддержание в автолизируемой суспензии рН, нежели температурного режима, поскольку при значениях рН ниже 5,5 вне зависимости от температуры в

растворимой фракции возрастало количество нуклеотидов; ведение процесса при температуре не более 30 СС существенно увеличивало продолжительность автолиза и расход индуктора; предварительный (на стадии индукции) подогрев суспензии до температуры, оптимальной для стадии автолиза, повышая эффективность процесса на 30%. Полученные данные свидетельствуют о возможности регуляции процесса автолиза и получения стандартных продуктов разнообразного качественного состава и целевого назначения (табл.5), га биомассы различных микроорганизмов (табл.6).

Таблица 7

Сравнение способов разрушения клеток бадково-жнровых дрожжей (БЖД)

Стадия роста культуры Способ обработки Содержание в супернатанте, мг/гМСК

белковых соединений аминного азота редуцирующих веществ

12ч Автолиз (1) 231,0 ±4,70 95,2 ±4,2 3,60 ±0,11

Ферментативный гидролиз (2) 177,8 ±9,9 75,3 ±5,1 0,81 ± 0,03

Без обработки (К) 147,1 ±14,3 14,9 ±8,5 0,17 ±0,16

18-244 (конец белкового накопления) 1 190,3 ±3,8 72,1 ±4,9 4,90 ± 1,03

2 147,8 ± 3,9 47,9 ± 5,8 0,97 ±0,25

К 85,1x9,1 8,4 ±5,1 0,13 ±0,12

20 часов ожирива- ния 1 170,2 ±9,7 70,7 ±6,8 7,42 ±0,60

2 65,2 ±3,6 22,8 ±2,0 3,21 ± 0,62

К 62,6 ±2,6 4,2 ±2,9 1,45 ± 1,0

40 часов ожирива- ния 1 102,1 ± 24,0 20,4 ±0,1 8,60 ±1,63

2 48,7 ±3,1 10,8 ±0,7 2,80 ±0,19

К 36,9 ±8,2 0,7 ± 0,2 0,87 ± 0,30

Установленные параметры, оптимальные для автолиза дрожжей, вошли в технологическую схему получения автолизатов в периодическом режиме, на основании которой были оформлены опытно-промьшшенные и пусковые регламенты для Нозололоцкого завода БВК и Башкирского биохимического завода. По разработанной технологии получено более 2000 т сертифицированного продукта - автолизатов кфмовых дрожжей, использованных в отече-

ствекном к зарубежном животноводстве и кормопроизводстве. Предложенный способ был также применен для автолиза белково-жировых дрожжей (БЖД), выращенных в периодическом режиме на минеральной среде с этанолом, фджентативное разрушение клеток которых, особенно в конце "ожиривания", крайне затруднено, вследствие измененного состава клеточной стенки и липид-белковых взаимодействий в мембране (табл.7). По разработанным технологическим рекомендациям на Вильнюсском НПО. "Фермент" было получено более 100 кг автолизатов БЖД, использованных для создания заменителя цельного молока (ЗЦМ) дня телят.

Автолиз дрожжей о непрерывном режиме При разработке технологии автолиза в непрерывном режиме были учтены все физико-химические и физиологические параметры, оптимальные ддя периодического процесса. Технологическая схема получения автолизатов дрожжей представлена на рис.7.

Таблица 8

Характеристика непрерывного автолиза пекарских дрожжей (У=30л, МСК=12%)

Параметр процесса -- Время пребывания в аппарате, час |

4 6 7 8 10

Скорость разбавления, час-1 0,25 0,17 0,14 0,125 0,10 0,008

Скорость протока, л/час 7,5 5,0 4,29 3,75 3,0 2,5

Количество белка, % к МСК автолизата 17,8 25,4 35,7 30,3 28,7 26,2

Количество аминного азота, % к МСК 4,1 7,8 8,9 9,2 10,9 11,2

Производительность по белку, г/л • час 5,34 5,08 6,12 4,55 3,44 12

Удельная активность по белку, ж/г ■ час 44,5 42,33 51,0 37,87 28,7 23,24

Производительность по амшшему азоту, г/л - час 1,23 1,56 1,53 1,38 1,33 1,12

Удельная активность по аминному азоту, мг/г • час 10,25 13,0 12,71 11,5 10,9 9,33

Для непрерывного процесса глубина автолиза зависела от скорости разбавления (времени удержания) дрожжевой суспензии в автолизаторе (табл.8). Относительно высокие скорости разбавления (0,25 т!), при которых содержание в растворимой части низкомолекулярных пептидов составляло около 17-20%, были рекомендованы для получения продуктов кормового назначения. Белково-нуклеотидные композиции с содержанием белковых компонентов 25-30% получали при более медленных скоростях разбавления (0,14-0,08 ч1). Автолизаты такого качественного состава представляли интерес как сырье для получения очищенных растворимых препаратов, используемых в микробиологической и пищевой промьшшенности, а также в медицине.

При низких скоростях протока существовала опасность развития кон-тамкнирующей микрофлоры в последних секциях автолизатора, что воспроизводилось в экспериментах преднамеренным заражением автолюата в 4-ой секции бактериями Е. coli. Для предотвращения этой ситуации в технологии были предусмотрены. 1) возможность подачи индуктора в 4-ю секцию при временном прекращении непрерывного процесса и перевод его на периодический режим на 3 часа; 2) возврат автолизата из секции, где произошло заражение, в 1-ую секцию - индукционную (что более эффективно для крупнотоннажного производства). В последнем варианте непрерывность процесса не нарушалась, лишь временно изменялась его скорость.

С целью экономии расхода индуктора были разработаны два варианта: 1) предусмотреть не постоянную, а периодическую подачу индуктора в количестве 200-800 нМ/мл (в зависимости от плотности клеточной суспензии к скорости протока) в первую секцию в режиме, когда интервалы подачи индуктора и прекращения подачи одинаковы и равны 2-м, 3-м или 4-м часам, (более длительный интервал резко сокращает глубину автолиза); 2) осуществлять постоянную подачу индуктора в низкой концентрации ■■ 100 нМ/мд, при одновременной непрерывной рециркуляции из 4-ои секции автолизатора в 1-ю секцию отъема автолизата в количестве 10-30% (в зависимости от скорости протока и требований к качеству конечного продукта).

При получения щубокогидрозшзоваиных автолизатов было предложено вносить во 2-ую секцию аппарата СаС1г и MgCh в количестве 0,005-0,02%, для стабилизации клеточных деполимераз и защиты их от самопереваривания. С целью повышения экстракционной способности инкубационной среды в плазмолизатор одновременно с суспензией автолизированных дрожжей целесообразно вносить 0,05-0,3% NaCl,

Дрожжевая суспензия^— _Индуктор

н,Р04

№ОН

Индуктор

КаОН

Индуктор

Ы,РОл

1 секция-индукция автолиза рН=3,5-4,5; Т=54-58 °С; время удержания 0,3-1 ч; периодическое перемешивание

2 секция-автолиз дрожжевой суспензии рН=6,8-7,2; Т=52-58 °С; время удержания 1-3 ч; периодическое перемешивание

■ >

3 секция-автолиз дрожжевой суспензии рН=6,8-7,2; Т=52-58 °С; время удержания 1-6 ч; периодическое перемешивание

1 ■

4 секция-автолиз дрожжевой суспензии рН=6,0-6,8; Т-52-53 СС; время удержания 1-6 ч; периодическое перемешивание

Острый пар |

Р-8 ктс/см2 . Плазмолиз автолизировапной дрожжевой суспензии

Т=95±5 °С; время удержания 1 ч

Острый пар Р=8 кгс/см2

Распылительная сушка автолизата Тм=230-300 °С; Твых=95-110 °С

Упаковка азтодизата кормозых дрожжей

Автолизат кормовых дрожжей:

- влажность, не более 10%

- растворимый бедок, не менее 12% МСК

- амНтшй -ом* г, не менее 4"'о МСЖ

- зола, не более 8% МСК

- нуклеотиды, не более 1,2% МСК

Рис. 5.Технологическая схема получения автолизата дрожжевой биомассы в непрерывном режиме

Выработанные технологические рекомендации были использованы при составлении опытно-промышленного регламента на производство автолиза-тов углеводородокисдяющих дрожжей в непрерывном режиме.

На основании результатов проведенных исследований и опытно-промышленных испытаний были разработаны подтвержденные патентами способы получения автолизатов микроорганизмов в периодическом и непрерывном режимах.

Практическое применение автолизатов дрожжей Автояизаты кормовых дрожжей С. циШклпотиШ (н-парафины) и С.иШЬ (этанол), полученные в промышленных условиях при различных режимах ведения процесса, прошли полную медико-биологическую проверку пригодности их использования в животноводстве: они не обладают токсическим действием, не раздражают кожу и слизистую глаз, не способны к кумуляции при пероральном введении, не вызывают мутагенного эффекта в микроядерном тесте, не влияют на гуморальное звено иммунитета, практически не обладают аллергизирующим действием.

Основной формой применения автоягоата кормовых дрожжей являлось его введение в различные комбикорма, бешсово-витаминно-минералъные добавки (БВМД) и заменители цельного молока (ЗЦМ) в соответствии с разработанными нормами (табл.9), утвдвденными Главным управлением ветеринарии (№23 от 08.01,92г.)

Таблица 9

Нормы введения автолщата в иолнорациоюше комбикорма

Вид и половозрастная группа Вид корма Норма введения

% по массе % от сырого протеина

Цыплята яичных линий Полноценный комбикорм до 2,0-2,5 доЗ, 0-6,0

Цыплята-бройлеры Полноценный комбикорм до 2,0-2,5 до 3,0-6,0

Телята до 6-месячного возраста Стартерные комбикорма до 6,5 до 18,0-20,0

БВМДиБВД до 20,0 до 37,5

ЗЦМ до 5,0 до 4,0-15,0

Использование автолизата кормовых дрожжей в составе комбикормов для молодняка кур от 6-ти до 120-дневного возраста стимулировало прирост живой массы цыплят на 7-20%, особенно в первые 30 дней жизни, и приводи-

яо к снижению затрат кормов на 3,5-9,5% в расчете на 1 кг прироста живой массы. Увеличивались: переваримость жира на 5,9-9,7%, клетчатки в 5-6,5 раз, усваиваемостъ азота на 5,9-8,0%, депонирование в печени витамина Е и каротина до 404,5 и 302,2 мкг/г соответственно.

Введете автолизата в состав БВМД и БВД для телят увеличивало их среднесуточный прирост в летний период на 19,2-30,7%, а в зимне-стойловый период на 24,4-35,5% при экономии кормов на 1 кг прироста на 16,0-23,5% и 19,6-25,9% соответственно. На 5,5-8,0% повышалась переваримость протеина. Замена автолизатом сухого обезжиренного молока в составе ЗЦМ приводила к увеличению привесов телят на 11-13% по сравнению с животными, полу-. чавшими стандартное регенерированное молоко. У молодняка свиней, получавших автолгоаты, отмечали увеличение мясности.

В пушном звероводстве использование автолизата приводило к увеличению линейного роста норок, на 20-25% возрастало количество особо крупных шкурок.

Для использования в медицинской промышленности была разработана технология получения экстрактов я осветленных экстрактов автолизнрован-пых кормовых и пгацевых дрожжей, которая включала дополнительные стадии протеолиза, термокоагуляции и мембранной очистки препарата, предназначенного для микробиологических питательных сред. Среды с добавлением полученных экстрактов были испытаны для роста и биосинтеза генно-инженерного штамма продуцента а-интерферона и бифидобактерий; как стимулятор и белковая основа сред для диагностики раневых инфекций и др. Качественная характеристика экстрактов автолизированных дрожжей и эффективность их применения в питательных средах были сравнимы с качественными показателями дрожжевых экстрактов известных зарубежных фирм "Difco", "Ohly", "Abbot".

ВЫВОДЫ

1. Впервые выделены внеклеточные, мембранотропные ауторегулятор-гале факторы cii (аутоиндукторы автолиза) из промышленных штаммов дрожжей: Kkodotorula aurantiaca, Saccharorayces cereviciae, Candida guiHier-mondii. Показано, что активным началом факторов ch являются свободные пендеыщенные жирные кисло ты, композиция которых характерна для каждого продуцента, а количественные соотношения зависят от условий культивирования. Установлено, что моно-, дй- и триглицериды служат резервом СЖК, пополняя их внеклеточный пул после гидролиза липазами.

2. Показано, что аугоиндукторы автолиза дрожжей как по химической природе, так и по механизму действия не обладают видоспецифичностыо, что позволило подобрать их химический аналог - олеиновую кислоту, и обеспечило в технологии получения автолизатов дрожжей возможность проведения процесса в условиях асептики, а также применение конечного продукта без дополнительной очистки (от возможно токсичных индуктора и антисептика).

3. Впервые установлено, что как индуцированный, так и спонтанный автолиз являются двуетадийными процессами, где стадии индукции и собственно каталитического разрушения клеток различаются по природе и итогу процессов, а также условиям, оптимальным дата каждой стадии, что легло в основу разработки способов промышленного получения автолизатов дрожжей и определило такую значимую технологическую характеристику, как кратковременность процесса (4-8 ч).

4. Анализ комбинаций физико-химических и физиологических параметров, влияющих на скорость и глубину автолиза, позволил оптимизировать процесс, что обеспечило технологическую возможность получения стандартных продуктов различного состава и целевого назначения,

5. Впервые разработаны промышленная технологии автолиза дрожжей в периодическом я непрерывном режимах, а также ооытно-промьпшхенные и пусковые регламенты получения автолизатов кормовых дрожжей в крупнотоннажном производстве. По утвержденной НТД получено получено более 2000 т сертифицированного продукта, использованного в отечественном в зарубежном животноводстве.

6. Разработана технология производства экстрактов автолизированных дрожжей, с целью их применения з составе ростовых и диагностических питательных сред для микроорганизмов.

7. Совместно с Московской ветеринарной академией разработаны нормы использования автолизатов кормовых дрожжей в составе кормов для телят, с/х птицы и пушных зверей. Использование кормов, сбалансированных по белку добавлением в них автолизатов, существенно увеличивает скорость роста (привесы) животных и птнцы, повышает качество мясопродуктов и продукции пушного звероводства и позволяет получить значительную экономию кормов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Мосягина Н.Г., Белов Б.М., Алексеева В.В.. Баканова Н.В., Романовская E.H. Кормовые смеси для молодняка с/х животных на основе продуктов микробного синтеза. Обзор. - М., ОНТИТЭИ Главмикробиопром, 1982.- 35 с.

2. Мосягина Н.Г., Эль-Регистан Г.И. Характеристика автолиза кормовых дрожжей, индущфованного ауторегуляторным фактором dz. В сб.: "Современные проблемы биохимии и физико-химической биологии". - М., Ин-Т биохимии им. А.Н.Баха АН СССР, 1984. - 4 с. - Деп. в ВИНИТИ.

3. Мосягина Н.Г., Козлова А.Н. Ауторегуляторный фактор ¿г, индуцирующий автолиз клеток продуцента. - Там же. - 3 с.

4. Мосягина Н.Г., Коновалова Е.Ю., Эль-Регистан Г.И., Бравова Г.Б. Индуцированный автолиз дрожжей/ Пути совершенствования технологических процессов и оборудования для производства, хранения и транспортировки продуктов литания: Тез. докл. Всесоюзной научной кокф., сентябрь 1984г.-М., 1984.-С, 154-155.

5. Коновалова Е.Ю., Мосягина Н.Г., Эль-Регистан Г.И., Бравова Г.Б. Характеристика индуцировагагого автолиза Rhodosporidium iomloides. - Там же.-С. 150-151.

6. A.C. 1228486 СССР. Способ получения регуляторов автолиза микроорганизмов для производства физиологически активных автолизатов и бакпрепаратой.// Г.И. Эль-Регистан, В.И, Дуда, А.Н. Козлова, Г.Б. Бравова, Н.Г. Мосягина, Е.Ю. Коновалова, В,А. Светличный, В.И.Лаущос, Н.П. Ка-лунянц, В.А. Еремин, В.В. Алексеева, А.Л. Юргулис. -1986.

7. Бравова O.K., Иванова Н.Г., Козлова А.Н. Характеристика автолиза-тсв кормовых дрожжей// Современные проблемы биотехнологии микроорганизмов: Тез. докл. конф. молодых ученых. - Рига, 1987. - С. 10.

8. A.C. № 1419148 СССР. Способ получения автолизатов микроорганизмов.// Г.И. Эль-Регистан, В.И. Дуда, Г.Б. Бравова, А.Н. Козлова. Н.Г. Иванова, Н.В. Баканова и.цр. - 1988.

9. Иванова Н.Г. Ауторе1уляторные факторы d в период лаг-фазы эта-нояьных дрожжей//Молодые ученые - биотехнологии: Тез. докл. Всесоюзной конф.-М„ 1989.-С. 28-29.

10. Бравова Г.Б., Иванова Н.Г., Эль-Регистан Г/И Km™??. А.К., Eaica-нова Н.В., Конобрий В.Н. Индуцированный автолиз и его применение для повьппения эффективности использования микробной биомассы. Обзор. - М., ВНИИСЭНТИ, 1990. - Вып. 4. - 30 с.

11. Баканова Н.В., Иванова Н.Г. Сравнительная характеристика аминокислотного состава ширина и его автояизатаЯКовое в кормлении животных и кормопроизводстве: Сб. научн. трудов Моск. вет. акад. - М., 1992. - С. 52-53.

12. Бравова Г.Б., Иванова Н.Г., Шишкова Э.А., Сухих O.A., Иншутина Н.Б., Фокина С.С. Технология получения осветленного экстракта автолизи-ровашшх дрожжей для питательных сред//Разработка и производство препаратов медицинской биотехнологии: Тез. кокф. - Махачкала, 1992. - С. 4-5.

.13. Афиногенов Г.Е., Доморад A.A., Бравова Г.Б., Иванова Н.Г., Шишкова Э.А. Использование нового стимулятора роста в накопительных питательных средах //Актуальные вопросы разработки микробиологических питательных сред и тест-систем: Доклады Всеросс, н.-нракг. конф.- Махачкала, 1994.-С. 111.

14. Афиногенов Г.Е., Доморад A.A., Бондаренко В.М., Бравова Г.Б., Иванова Н.Г., Шишкова Э. А. Применение селективных питательных сред в диагностике дисбактериоза ктиечинха//Дисбахтериозы и эубиотики: Тез. Всеросс. научно-практ. конф. - Москва, 1996.

15. Патент Российской Федерации 2065275. Способ автолиза дрожжевой биомассы.// Г.Б. Бравова, Г.И, Эдь-Регистан, Н.Г. Иванова, А.Н. Козлова и др.- 3aper.20.08.9S .

16. Патент Российской Федерации J& 2084173. Способ получения осветленного экстракта автолизированных дрожжей.// Г.Б. Бравова, Н.Г. Иванова, Э.А. Шишкова, Г.И. Эль-Регистан и др. - Зарег, 20.07.97.