Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Питательные среды для культивирования чумного микроба на основе сухого автолизата пекарских дрожжей, полученного по усовершенствованной технологии

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Питательные среды для культивирования чумного микроба на основе сухого автолизата пекарских дрожжей, полученного по усовершенствованной технологии"

г Нлпц&вах рукописи ¿1

АНТОНЫЧЕВА Марина Владимировна

ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ЧУМНОГО МИКРОБА НА ОСНОВЕ СУХОГО АВТОЛИЗАТА ПЕКАРСКИХ ДРОЖЖЕЙ, ПОЛУЧЕННОГО ПО УСОВЕРШЕНСТВОВАННОЙ ТЕХНОЛОГИИ

03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

Саратов-2012

Работа выполнена в ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научный руководитель:

Официальные оппоненты

доктор медицинских наук, доцент ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», заведующий отделом образовательных программ

и подготовки специалистов Бойко Андрей Витальевич

кандидат медицинских наук, доцент ГБОУ ВПО «Саратовский государственный медицинский университет им. В.И. Разумовского» Минздравсоцразвития Российской Федерации, доцент кафедры микробиологии, вирусологии и

иммунологии Пронина Елена Александровна

Ведущее учреждение: ФКУЗ «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Защита диссертации состоится «И2012 г. в

и

часов на заседании диссертационного совета Д 208.078.01 п</защите докторских и кандидатских диссертаций при ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» (410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»

Кандидат медицинских наук, доцент

Никифоров Алексей Константинович

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук, старший научный сотрудник

Слудский А.А.

РОССИЙСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ

БИБЛИОТЕКА _2012

ОЫЦАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РА1ЮТЫ

АктуПЛЬНОСП. проблемы

Возбудитель чумы Yersinia pestis ио-прсжисму представляет реальную опасность и угрозу жизни людей в сиизи с существованием активных природных очагов чумы но иесм мире (Евразии, Африке, Северной и Южной Америке) и высоким уровнем миграции населении. Недостаточный объем мониторинга в природных очагах обуславливает возможность возникновении вспышсчиых заболеваний. В настоящее время (1990-2011 гг.) отмечают растущий уровень заболеваемости на о. Мадагаскар, с регистрацией в 2010-2011 гг. значительного числа случае» легочной чумы [Кутырев В.В. и соавт., 2011; WER, 2010]. Кроме того, необходимо учитывать возможность использования возбудителя чумы в целях биотерроризма [Оиищепко Г.Г. и соавт., 2003].

Для успешного мониторинга природных очагов чумы необходимо решение комплекса задач, связанных с разработкой и внедрением новых диагностических и профилактических средств (Приказы Роснотребпадзора № 774 от 17.11.2005 г. и № 152 от 08.05.2008 г.).

Питательные среды, относящиеся к средствам диагностики, при проведении эпидемиологического надзора в природных очагах чумы па территории Российской Федерации должны соответствовать нормативным требованиям [МУК 4.2.2316, 2008; МУ 3.3.2.2124, 2006; Стандарты качества лекарственных средств. № 91500.05.001, 2000]. При производстве МИБП1 к питательным средам предъявляют дополнительные требования. Они должны быть эффективными по выходу целевого продута, а полученные с их применением лекарственные средст ва - безопасными для человека. Кроме того, производство питательных сред должно быть также экономичным и конкурентоспособным [Оинщспко Г.Г., Меджидов М.М., 2001].

В производстве МИБП наибольшее распространение получили среды, приготовленные из мясных и казеиновых гидролизагов. Однако это сырье является пищевым или технически ценным, к тому же может содержать в своем составе термоустойчивые антибиотики, приопы и другие «неконтролируемые факторы» [Тслишевская л.я., 2000; Раевский К.К., 2007; Himedia, 2003]. В связи с этим, фирмы-производители микробиологических питательных сред, расширили ассортимент сред на основе растительного и дрожжевого белка [Himedia, 2003].

Таким образом, при производстве микробиологических сред актуальными задачами остаются как поиск сырья для белковых основ, не уступающих мясным по питательной ценности и удовлетворяющих требованиям стандартности и безопасности, так и разработка способов его эффективной переработки.

В обзорных работах, посвященных питательным средам, дрожжевая биомасса выделена как перспективный вид сырья для приготовления белковых основ [Равилов А.З. и соавт. 1999; Тслишевская Л.Я., 2000]. Работы по получению питательных основ

1 МИБП - медицинские иммунобиологические препараты (дмагмосгическис и профилактические)

из биомассы, п основном кормовых дрожжей, и конструированию ич них микробиологических сред были развернуты в 70 - 80-е годы XX века. Полученные экстракты и авто-лизаты применяли и составе питательных сред как пептидные и витаминные добавки, а после более глубокого автолиза или гидролиза - в качестве белковых основ питательных сред для культивировании различных микроорганизмов, в том числе и чумного микроба [Борисенко Е.Г.,1967; Bridson Ii., Brecker Д., 1970; Бендас Л.Г., 1971; Шеремет О.В.,1979, 1991; Бобрышев В.И. и соавт. 1980; Милютин В.Н. и соавт., 1982; Раскмп Б.М., 1985]. Однако па III съезде Общества биотехпологов (2005 г.), было отмечено, что в нашей стране прекращено промышленное производство кормовых дрожжей, и доступным сырьем остаются пекарские и пивные дрожжи. По своему составу наиболее близки к мясу говядины пекарские дрожжи, содержащие протеины до 52-56%. Автолизаг пекарских дрожжей по физико-химическому составу близок к триптическому перевару по Хоттипгеру [Козлов Ю.А., 1950; Биргер И.О., 1982].

Способность дрожжевой клетки к автолизу предопределяет выбор экономичного способа биоконверсии этого белкового сырья. Известно, что создание определенных условий индуцирует и ускоряет течение этого процесса [Шкляр Б.Х., 1977; Эль-Регистап Г.И., Бабаян Т.Л., 1987; Кислухина О.В. и соавт., 1990; Белоусова М.И. и соавт., 1995; Плакупои В.К., 2001].

На основе авголизатов пекарских или пивных дрожжей сконструированы среды для культивирования широкого круга микроорганизмов [Альпер-Юльчевская Б.Я., 1940; Козлов 10.А., 1950; Дятлов И.А. и соавт., 1998; 'Гимербаева Р.Х. и соавт., 2000; Иванова И. Г. и соавт. 2001]. В литературе, кроме пилотной работы сотрудников РосНИПЧИ «Микроб», использовавших для получения автолизата способ индукции процесса натрием хлорида [Авдеева И.Г. и соавт., 2000], нами не найдено данных об использовании для культивирования чумного микроба пита тельных сред, сконструированных из автолизата пекарских дрожжей, в качестве единственного источника аминокислот. Однако известны работы по применению сред из панкреатического перевара пекарских дрожжей для диагностики возбудителей чумы и холеры [Мазрухо A.B. и соавт., 2004; 2005; 2009; 2011]. Таким образом, конструирование питательных сред на основе дрожжевого автолизата для культивирования чумного микроба остается актуальной задачей.

Цель работы - конструирование новых микробиологических сред для культивирования чумного микроба па основе сухого автолизата пекарских дрожжей, полученного усовершенствованным способом.

Задачи исследовании:

1. Изучить возможность индукции автолиза пекарских дрожжей химическими веществами и ферментными препаратами. Определить оптимальный комплекс методов контроля эффективности процесса автолиза.

2. Усовершенствовать технологию аппаратного способа получения сухого дрожжевого автолизата при масштабировании процесса.

3. Пронести анализ химического состава и физико-химических сиойств сухого автолизата пекарских дрожжей н соответствии с требованиями, предъявляемыми к качеству белковой основы микробиологических сред.

4. Сконструировать oiiiiiMajii.ni.ic но составу плотные и жидкие питательные среды для культивирования чумного микроба па монооснове - сухом автолизате пекарских дрожжей и оцепить свойства сконструированных сред по биологическим показателям.

5. Испытать среды па основе сухого дрожжевого автолизата при экспериментально-производственном культивировании чумного микроба.

6. Обосновать экономическую целесообразность использования питательных срсд на основе дрожжевого пвтолизата.

Научили новизна

Впервые для культивирования чумного микроба сконструированы питательные среды на моиооспове - сухом автолизате пекарских дрожжей, сохраняющие стабильными культуральпо-морфологические, биохимические свойства микроорганизма и его чувствительность к бактериофагу Л-413С.

Сконструированные экономичные жидкие и плотные питательные среды впервые использованы в производстве экспериментальных серий бактериофага диагностического чумного Л-413С.

Процесс изготовления автолизата оптимизирован применением индукторов ферментной природы п условиях направленного изменения pl-l гидролизуемой срсды. В качестве индуктора автолиза дрожжевых клеток был впервые использован новый комплексный ферментный препарат микробного происхождения - протеовибрип, выделенный ранее из ультрафильтрата культуральпой жидкости производственного штамма Vibrio cholerae М 41 серовара Огава [Кузьмичспко И.А. и соавг., 2002; 2003; 2010]. Приоритетность выполненных исследований по стимулированию автолитичсской активности дрожжей протеовибрипом с целыо получения эффективной и экономически выгодной питательной основы, пригодной дли микробиологических целей, подтверждена патентом «Способ получения питательной основы и питательная среда для культивирования микроорганизмов» (№ 2360962, приоритет от 15.02.2007).

Предложен комплексный подход в выборе методой контроля эффективности автолиза и впервые для этих целей рекомендовано использовать метод кондуктометрии.

Практическая значимость

Сконструированы жидкая и плотная питательные срсды для культивирования чумного микроба и его бактериофагов, о твечающие требованиям контроля по биологическим и физико-химическим показателям. Питательные среды, приготовленные на основе сухого автолизата пекарских дрожжей для культивирования чумного микроба, использованы н производстве экспериментальных серий бактериофага диагностического чумного JI-413C. Доказана экономическая целесообразность внедрения этих сред в производство МИБГ1.

Предложен новый способ получении белковой осионы питательных сред автолизата пекарских дрожжей, отличающийся от аналогом тем, что в качестве индуктора в процессе автолиза использован ферментный препарат протеовибрип и оптимизирована рецептура питательных сред дли культивировании чумного микроба. Методические рекомендации «Приготовление автолизата пекарских дрожжей и конструирование па его основе пи тательных сред для культивировании чумного микроба» одобрены Ученым советом РосНИПЧИ «Микроб» (протокол № 5 от 24.11.09 г.) и утверждены директором РосНИПЧИ «Микроб». Определен комплекс методов, позволяющий определить эффективность процесса автолиза. Методические рекомендации «Оценка эффективности автолиза пекарских дрожжей комплексом физико-химических методов» также одобрены Ученым советом РосНИПЧИ «Микроб» (протокол № 7 от 27.06.06 г.) и утверждены директором РосНИПЧИ «Микроб».

Основные положении, Bi.iHOCHMi.ie на защиту:

1. Автолиз пекарских дрожжей, индуцированный протеолитическим ферментом в условиях щелочной среды, эффективнее способа, основанного па применении натрия хлорида.

2. Усовершенствованный технологический процесс производства автолизата пекарских дрожжей позволяет получить полноценную сухую питательную основу для микробиологических сред, соответствующую требованиям ИД по физико-химическим свойствам и составу.

3. Сконструированные питательные среды на основе сухого автолизата пекарских дрожжей обеспечивают питательные потребности чумного микроба с сохранением стабильными его культурально-морфологических, биохимических свойств, чувствительности к бактериофагу /1-413С и соответствуют требованиям МД, предъявляемым к питательным средам.

4. Сконструированные питательные среды па основе сухого автолизата пекарских дрожжей для культивирования чумного микроба по эффективности пе уступают средам, приготовленным из мясного сырья, и пригодны для масштабированного культивировании штаммов чумного микроба.

Апробации работы

Материалы, вошедшие в диссертационную работу, были представлены и обсуждены на ежегодных научно-практических конференциях «Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в РосНИПЧИ «Микроб» (2005-2011 гг.). В виде тезисных работ материалы были представлены на: VI Межгосударственной научно-практической конференции «Санитарная охрана территории государств-участников содружества независимых государств: Проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях» (Волгоград, 2005); II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Инфекции, обуслов-.......... иерсипиями» в НИИЭМ им. Пастера (Санкт-Петербург, 2006); научпо-

практической конференции ГИСК им. Тарасевича «Вакципология 2006». Совершенствование иммунобиологических средств профилактики и лечения инфекционных болезней» (Москва, 2006); V111 Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СИГ «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями п государствах-участниках СНГ» (Саратов, 2007); совещании и проблемной комиссии «Холера и патогенные для человека вибрионы» (Ростов-на-Дону, 2008); международной научно-практической конференции «Биотехнология и Казахстане: проблемы и перспективы инновационного развития», посвященной 50-летию НИИ проблем биобсзопаспости НЦБ МОИ РК (Алматы, 2008); V международной конференции «Проблемы обращения с отходами лечебпо-профилактичсскнх учреждений» (Москва, 2009); международной конференции «Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями» и ФГУИ ИИИЭМ им. Пастсра Роспотребпадзора (Санкт-Петербург, 2010).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 15 работ, в том числе 6 cí a гей, 4 из них в изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки России для публикации основных научных результатов, представляемых на соискание искомой ученой степени, и одно изобретение (Пат. 2360962 РФ МПК C12NI/20).

Структур» II объем диссертации

Диссертация изложена на 152 страницах компьютерного текста, состоит из введения, одной главы обзора литературы, шести глав собственных исследований, заключения, выводов, приложения и списка литературы. Работа иллюстрирована 30 таблицами, 15 рисунками. Список литературы содержит 279 источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Штаммы itiiiicpoopraiiinnioii. При конструировании сред для культивирования чумного микроба использован],] тсст-штаммы, рекомендуемые для контроля качества сред но биологическим показателям [МУ 3.3.2.2124, 2006]: Yersinia pestis EV НИИЭГ, полученный из лаборатории препаратов против чумы и других особо опасных инфекций ФГУ1-1 ГИСК им. J1.A. Тарасовича, а также У. pestis Р-1680, У. pestis И-2377, У. pseudotuberculosis И-199 и У. pestis КМ 277 (1LV ИМ pFSK 3) (pFra pCad" pPst" pFSK-3; Kmr), полученные из Госколлекции патогенных бактерий РосМИПЧИ «Микроб».

Методы.

Микробиологические методы: типкториальпый метод [Шкляр Б.Х., 1977; Кова-ковская С.С., 1978]; культуральпый метод [ГФ РФ XII, 2008]; определение чувствительности и скорости роста па питательной среде [МУК 4.2.2316, 2008; МУ 3.3.2.2124, 2006]; определение эффективности питательной среды но накоплению биомассы [МУК 4.2.2316, 2008; МУ 3.3.2.2124, 2006; Дятлов И.А. и соавт., MP, 1991]; определение эффективности питательной среды по биосинтезу капсульного антигена метод].] РИГА2 и

11'МГЛ - реакция непрямой геммтлютммлцми

ИФЛ1 [МУ 3.3.2.2124, 2006; Наумов A.B., Самойлова Л.В., 1992], РИД'1 [Зильбер Л.А., 1968]; определение показателя прорастания [МУК 4.2.2316, 2008; МУ 3.3.2.2124, 2006]; определение показателя стабильности основных биологических свойств микроорганизмов [МУК 4.2.2316, 2008; МУ 3.3.2.2124, 2006]; метод Грация [ТУ 9386-020-018981092008].

Биохимические методы: определение протеолитической активности па плотных тест-средах [Шкляр Б.Х., 1977]; определение наличия низкомолекулярной фракции белка [МУК 4.2.2316, 2008]; определение пептидов [МУК 4.2.2316, 2008]; колориметрический метод определения белка по Лоури [ГФ РФ XII, 2008]; фенол-сернокислый метод определения содержания углеводов [Dubois М. et al, 1956]; метод ВЖЭХ [ГФ РФ XII, 2008].

Химические методы: метод формольпого титрования [МУК 4.2.2316, 2008]; определение сульфатной золы [Ф РФ XII, 2008]; определение общего азота [МУК 4.2.2316, 2008]; аргептометрическос определение хлоридов [МУК 4.2.2316, 2008]; колориметрическое определение общего фосфора в прису тствии восстановителя [Фердман Д.Л., Со-пин Е.Ф., 1957]; метод Фиске-Суббароу [Фердман Д.Л., Сопип Е.Ф., 1957]; метод де Ваарда [Неменова Ю.М., 1972]; метод Гадиеита [Петруимсима A.M., 1961]; метод колориметрии с роданистыми солями для определении железа [Фердман Д.Л., Сопип Е.Ф., 1957]; качественное определение наличия тяжёлых металлов [ГФ РФ XII, 2008].

Физические методы: потенциометрическое определение активности ионов водорода [МУК 4.2.2316, 2008];турбидиметрический метод [Кислухипа О.В., и соавт., 1990]; коидуктометрическое определение удельной электропроводимости [MP, Иркутск, 2003]; колориметрическое определение цветности [ГФ РФ XII, 2008]; колориметрическое определение количества тирозина по стандартной кривой [Алексеенко Л.П., 1968]; ареометрическое измерение относительной плотности автолизата [Азеиич З.Ф. и соавт., 1990]; определение массовой доли влаги [МУК 4.2.2316, 2008]; метод визуального определения прозрачности и цветности [МУК 4.2.2316, 2008]; определение растворимости [МУК 4.2.2316, 2008].

Обработку результатов проводили с применением методов вариационной статистики [Ашмарип И.П., Воробьёв A.A., 1962; Лакип Г.Ф., 1990] и рассчитывали: среднее арифметическое (М); среднее квадратнческое отклонение (о); среднюю ошибку среднего арифметического (ш); степень достоверности различий по Стыоденту (р).

Все исследования проведены самостоятельно или при активном участии автора, за исключением работы по определению содержания аминокислот в сухих сериях автолизата, выполненной по договору о научно-исследовательском сотрудничестве в ИБФРМ РАИ (г. Саратов) с использованием метода ВЭЖХ на хроматографе Knaner Smartline 5000.

1 ИФЛ - иммумофермемтпын niinnirj 1Ч-1Д-|Кпкцпи иммуподиффушм

Материалы и оборудование дли приготовлении сухого автолизата пекарских дрожжей. Оптимизацию процесса автолиза проводили в условиях лабораторного эксперимента и масштабированного производства. При приготовлении сухого автол и-зата пекарских дрожжей (САПД5) -основы микробиологических сред - использовали дрожжи хлсбопекарские прессованные (ГОСТ 171-81) в виде водной суспензии.

Для протсолитичсского воздействия на дрожжевые клетки применяли коммерческие препараты: трипсин (Serva), нроназу (Serva), пенсии (Spofa) и экспериментальный ферментный комплекс - нротсовибрип с известной активностью ферментов [Кузьми-чепко И.Л. и соавт. 2002, 2003, 2010]. Шестичасовой автолизат пекарских дрожжей использовали как самостоятельный полифсрмсптпый препарат, внося его в дозе 1, 3 и 5% к объему исходной дрожжевой взвеси. 3 лабораторных условиях автолиз проводили в объеме до 10,0 л при периодическом перемешивании и температуре (49+1) °С. В качестве бактериостатического и илазмолизирующего вещества использовали хлороформ (до 1-2%). Через 4 ч после приготовления взвеси дрожжей и инициации процесса автолиза проводили коррекцию рН срсды (8,0+0,5) натрием двууглекислым, натрия гидроокисью или аммонием углекислым. Длительность процесса составляла 18-30 ч. Пробы отбирали через каждые 2 ч. Ферментативный процесс останавливали прогреванием биомассы при режиме 110 °С (0,5 кгс/см2) в течение 30 мин. После отстаивания взвеси в течение 1 сут, падосадочпую жидкость декантировали, фильтровали и сушили па сублимационной установке (LZ 9 W Frigera). Лабораторным способом получено 79 серий автолизата пекарских дрожжей, из них 23 серии в лиофилизироваиной форме.

Для масштабирования процесса автолиза (объем дрожжевой взвеси 500 л) и производства экспериментальных серий САПД реакторным способом использовано оборудование и технологическая линия, состоящая из реактора (РЗРЯ-100), сепаратора (АСЭБ 3000), аппарата для фильтрации (ЭПВ.СЦ-300/080), вакуум-выпарной установки (УВВ-50), емкостей для сбора сунсрпатанта (РЗРЯ 600 и РЗРЯ-100), а также установки для высушивания препарата (КЯУЛ 101325.002).

По оптимизированной технологической схеме произведено 5 серий САПД. При анализе физико-химических свойств и определении химического состава использован САПД, приготовленный по предложенной рапсе [Дятлов И.А. и соавт., 1998] исходной 'технологической схеме реакторным способом с индукцией автолиза натрием хлористым. Препаратом сравнения был экстракт автолизировапных пекарских дрожжей Aulolizate Yeast exrael, «SERVA» (Германия), также была использована экспериментальная серия автолизата пивных дрожжей «Авимин», ООО «БИТРА», Москва).

Материалы и оборудование дли нрнготопленни питательных сред и диагностические препараты. Плотные и жидкие питательные срсды па основе серий САПД, полученных реакторным и лабораторным способом, готовили по общепринятой методике [Биргср М.О., 1982]. 13 качестве контрольных ............... сред были использова-

5 сухой аптолнзаг мекарекмх дрожжей;

им среды лабораторного изготовления для культивирования чумного микроба на основе гидролизата по Хоггипгеру, предварительно прошедшие контроль. Среды, используемые для культивирования Y. pestis Р-1680, дополнительно содержали тиамин (0,0001 мг/ji), для культивирования У. pestis КМ 277 - капамицип (20 мкг/мл).

Диагностические препараты: Для определения стабильности культуральпо-морфологических свойств чумного микроба применяли «Бактериофаг чумной диагностический Л-413С» (РосНИПЧИ «Микроб», Россия). Для определения капсульиого антигена использовали «Диагпостикум чумной эритроцитариый аитительный» (Казахский научный центр караптийных и зоопозиых ин[|)екций им. М. Айкимбаева, Казахстан), «Диагпостикум чумной эритроцитариый иммуноглобулиповый» (ФГУ ЦМИИ МО РФ, Киров) и для РИД по Оухтерлопи - специфические чумные сыворотки экспериментальных серий (РосНИПЧИ «Микроб», Саратов).

РЕЗУЛ ЬТАТЫ И ССЛ ГСДО НА IIИ Й

Оптимизация индуцированного автолиза пекарских дрожжей. В ходе экспериментов изучены условия автолиза пекарских дрожжей и возможность индукции этого процесса химическими веществами и ферментными препаратами. Для оценки автолити-ческой активности дрожжей использованы методики, основанные па различных принципах действия: турбидиметрический метод, ориентированный па изменение оптической плотности автолизируемого субстрата; метод определения конечных продуктов автолиза (амипного азота или тирозина); потепциометрнческий метод регистрации изменения реакции среды и метод коидуктометрического измерения удельной электропроводимости среды.

На основании проведенных исследований, был выбран оптимальный комплекс методов контроля эффективности процесса. Для определения качества сырья - оценки эффективности автолиза пекарских дрожжей, впервые был применен метод коидукто-метрии. В качестве контрольных параметров I стадии процесса предложено применять комплекс методов до стабилизации показателей: турбидиметрическое определение степени лизиса дрожжевых клеток по изменению экстипкцин взвеси после инкубации и формольное титрование для определения амипного азота. Методы доступные, простые в исполнении и позволяют оперативно оцепить эффективность автолиза.

На этом этапе исследований был определён гидромодуль - оптимальное соотношение разводящей жидкости (воды) и биомассы дрожжей в реакционной смеси. Анализ результатов, полученных в каждом объёмно-весовом соотношении, свидетельствует об увеличении степени лизиса клеток, росте содержания низкомолекулярных азотсодержащих веществ с разбавлением суспензии дрожжевых клеток и подтверждает данные литературы [Белоусова I I.И. и соавт., 1995]. Однако значительное разбавление суспензии, на наш взгляд, создает дополнительные трудности при концентрировании суперпа-тапта и приводит к увеличению энергозатрат при масштабировании процесса. Таким об-

разом, экспериментально доказано, оптимальным соотношением дрожжей и воды является 1:4.

При обосновании способа индукции процесса автолиза было изучено действие протеолитических фермен тных препаратов (трипсина, пепсина, пропазы, протеовибрипа и собственно автолизата пекарских дрожжей). Предварительно определяли активность ферментов при температуре (37+1) °С па плотной тест-среде с обезжиренным молоком и дозы, выравнивали по активности (табл. 1).

Таблица I - Влнинис ферментов различного происхождении на показатели

автолиза пекарских дрожжей через 24 ч инкубации

Вариант автолиза К,,,,,,, % М+т Прирост* N»11111, % М±т Степень автолиза % М+т

Трипсин 16000 усл.сд./л, п=10 0,182+0,01 62,5+1,5 49+0,01

Трипсин 80000 усл.ед./л, п=14 0,186+0,01 66,2+1,4 50,99+0,01

Протеовибрип 16000 усл.сд./л, п=10 0,180+0,01 60,7+1,6 51+0,01

Протеовибрии 80000 усл.ед./л, п=14 0,196+0,01 75,4+1,5 52,63+0,01

Пепсин 80000 усл.сд./л, п=10 0,130+0,0015 40+4 49,30+0,45

Пропаза 80000 усл.сд./л, п=10 0,168+0,0035 60+2 45,16+0,5

До 1% автолизата, п=10 0,129+0,015 15,2+1,8 38,0+0,015

До 3% автолиза!', п=10 0,152+0,015 36,1+1,5 45,0+0,01

До 5% автолизах, п=14 0,168+0,01 40,0+1,6 45,1+0,01

Контроль, п=14 0,112+0,02 100±1,6 32,7+0,01

""Уровень амипного азота в контроле условно приняли за 100%; разница с контролем статистически достоверна (р<0,05)

Было изучено воздействие на автолиз клеток пекарских дрожжей минимальных доз ферментов (16 и 80 и 120 тыс. усл.сд./л). Также изучено действие шестичасового свежеприготовленного автолизата, в качестве комплексного ферментного препарата, в концентрации 1, 3 и 5% в автолизируемой взвеси дрожжей. Антолитический процесс протекает эффективнее в присутствии ферментов трипсина, протеовибрипа и шестичасового автолизата (3 и 5%), что отмечено по уровню накопления амипного азота, уже через 12 ч автолиза. Их применение позволяет повысить в автолизате содержание амипного азота через 24 ч на 62,5-75,4%. Статистически значимы и результаты, свидетельствующие об эффективности автолиза с применением минимальных доз фермента (до 80000 усл.ед./л), однако при масштабировании процесса пе удалось воспроизвести результат малообьемпого эксперимен та.

Таким образом, доказано, что применение трипсина и протеовибрипа в дозах (80100 тыс. усл.ед./л) сокращает время автолиза па 6 ч и увеличивает в 1,5-1,7 раза выход водорастворимой части автолизата (по амиипому азоту до 0,196 %). Использование ферментов трипсина и протеовибрипа в дозах более 120 тыс усл.ед./л создает условия для протеолитического гидролиза дрожжевой биомассы. Впервые в качестве индуктора автолиза дрожжевых клеток был использован ферментативный комплекс - протсовиб-рип, выделенный из отходов производства холерной вакцины, и доказана перспективность его применения.

Подтверждены данные литературы о нротеолитнческон активности шестичасового антолизата пекарских дрожжей. Отмечено его индуцирующее действие па автолиз при добавлении к свежеприготовленной дрожжевой взвеси и концентрации 3-5%. Однако автолизат п качестве индуктора значи тельно уступает трипсину и протеовибрииу, гак как способствует повышению в автолизате содержания амипиого азота только па 3540%, по сравнению с контролем.

При изучении автолитического процесса установлено, что создание щелочной или кислой реакции способствует активации ферментной системы дрожжевой клетки. Направленное изменение реакции среды (рИ 8,0+0,5), через 4 ч с начала автолиза, позволяет получить продукт - автолизат со средней степенью гидролиза в течение 20-24ч. По уровню накопления амипиого азота в реакционной смеси и степени лизиса дрожжевых клеток через 24 ч выявлены статистически значимые различия с контролем (р<(),001). Концентрация амиппого азота в автолизате выше контрольных показателей на 74-85%. Однако при сравнении показателей, свидетельствующих об эффективности автолиза, таких как содержание амиппого азота и степень лизиса дрожжевых клеток, не было выявлено статистически достоверного отличия между испытанными веществами (табл.2). В эксперименте при создании кислой реакции дрожжевой биомассы отмечено индуцирующее действие кислоты па автолиз (различие с контролем статистически значимое р<0,05), однако прирост амипиого азота составил 14,8% за 24 ч.

Таблица 2 - Влияние па автолиз пекарских дрожжей химических пещсстп

Показатель эффективности автолиза Натрий гидроокись (п=18) М+т Натрий двууглекислый (n=18) М+т Аммоний углекислый (п=12) М+т Кислота соляная (11=12) М+т Контроль (n=l 8)М+т

Содержание Nn......,% 0,188+0,001 0,192+0,001 0,200+0,006 0,124+0,005 0,112+0,0 2

Прирост* N„.....,% 74,1 + 1,0 77,7+1,0 85,1 + 1,4 14,8+1,3 100

Степень автолиза, % 47+0,5 47,5+0,5 48+0,5 31,5+0,5 32,7+0,01

'•"Уровень Na>llll[. в контроле условно приняли за 100%.

На следующем этапе было изучено сочегаппое применение комплексного ферментного препарата - протеовнбрнпа и натрия двууглекислого. Этот способ позволил получить аитолизат пекарских дрожжей с максимальной концентрацией амиппого азота (до 0,23%) через 18-20 ч, что свидетельствует об интенсификации процесса в созданных условиях. В технологическом процессе получения авголизата пекарских дрожжей оправдано применение натрия двууглекислого, относящегося к пищевым продуктам и не требующего особых условий хранения и применения.

Таким образом, дли приготовлении дрожжевой пзпеси предложен гидромодуль 1:4 и способ двустадийного режима индуцированного ав толиза, основанного на изменении реакции среды при добавлении в дрожжевую взвесь натрия двууглекислого (8 г/л).

Оптимизации этапов технологического процесса масштабированного получении сухого аптолщатл. Одной нз основных наших задач было усовершенствование технологии производства САПД, для решения которой проведены мероприятия по существенному изменению аппаратного обеспечении технологического процесса. Предложен способ двустадийпого режима индуцированного автолиза, основанного на изменении реакции среды при добавлении в дрожжевую взвесь натрия двууглекислого (8 г/л). Применение этого индуцирующего автолиз способа, вместо ранее применяемого натрия хлорида (2%), позволило сократить продолжительность I стадии технологического процесса с 30-34 ч до 20-24 ч. Затем была демонтирована система, используемая па стадии концентрирования полуфабриката, состоящая из теплообменника трубчатого, форсунки распыления и насоса импеллерного, и установлен вакуум-выпарпой аппарат (УВВ-50). Это позволило сократи ть технологическую операцию с 96 до 15 ч. Для достижения заданной концентрации полуфабриката (упаривания в 4,5-5 раз) па ранее используемой системе требовалось до 4-5 сут. Расход энергии и пара при применении УВВ-50 снижен в 8 раз; проточной воды в 4 раза. Эти мероприятия сокращают и вероятность контаминации полуфабриката посторонней микрофлорой. Кроме этого, для осветления препарата предложено использовать соли кальция хлористого и натрия фосфорнокислого двузамещеппого, что обеспечивает образование геля фосфата кальция и фильтрацию па установке с фильтром марки ЭПВ.СЦ-300/080 вместо ранее используемой фильтрации па аппарате Сальникова.

Мероприятия по оптимизации масштабированного получения автолизата пекарских дрожжей позволили п итоге получить САПД, соответствующий требованиям НД [МУК 4.2.2316, 2008] по физико-химической характеристике.

Характеристика показателен качсстиа сухого апголизата пекарских дрожжей н питательных сред на его осноне. Оценку качества питательных основ и микробиологических сред проводили с помощью совокупности физико-химических и биологических показателей [МУК 4.2.2316, 2008; МУ 3.3.2.2124, 2006].

В соответствии с НД [МУК 4.2.2316, 2008, Стандарты качества лекарственных средств. № 91500.05.001, 2000], физико-химическая характеристика препарата должна содержать описательные сведения о внешнем виде, прозрачности, цветности, растворимости, а также влажность, рН и количественное содержание пептидов, общего и амип-пого азота, хлоридов, углеводов. Однако было бы целесообразно расширить спектр характеристики питательных основ. Для роста микроорганизмов имеет значение и уровень содержания отдельных аминокислот, и их соотношение, а также минеральный состав среды и наличие тяжелых металлов. Поэтому нами были дополнительно определены содержание аминокислот, общего и неорганического фосфора, железа, кальция, магния, солей тяжелых металлов и индола.

Сухие образцы автолизатов - аморфные порошки светло-кремового цвета с приятным хлебным запахом. Исключение - «Авнмип» и автолизаг пекарских дрожжей, по-

лученный с использованием натрия хлористого, у которых отмечен темио-коричпепый цист. Это свидетельствует о наличие мслаиоидов в основе, что характерно для питательных основ низкого качества. Все образцы хорошо растворимы и имели нейтральные значения pl l в пределах 7,0+0,3. Растворы - прозрачные, однако отмечена опалесценция растворов, приготовленных из темных по окраске автолизатов. По содержанию пептидов (1,2-1,8 %) дрожжевые автолизаты близки к гидролизату но Хотгингеру. Следы "непереваренного" белка определены только в препарате «Авимин».

По показателю влажности образцы автолизата, полученные но оптимизированном технологии - 2,7-3,5%, соответствовали нормативному показателю (не более 5%). Отмечена недопустимо высокая влажность до 7,5% и высокая степень гигроскопичности у препаратов в лиофилизированпой форме. Во всех исследованных нами образцах содержание хлоридов в допустимых пределах - 0,65-0,7%, кроме серий САПД, приготовленных с использованием натрия хлористого, где содержание хлоридов - 1,5%, что превышает нормируемый показатель (1%). Подтверждены данные литературы о высоком содержании в автолизатах дрожжей углеводов (12,1+1,0%), что конкретизирует область их применения в качестве основы сред для культивирования микроорганизмов, исключая использование в составе дифферспциальпо-диагпостичсеких сред.

При анализе содержании кальция (г/кг), магнии (г/кг) и железа (мг/кг) в образцах автолизата, полученного нами по оптимизированной технологии и в образце автолизата «SERVA» получены сопоставимые результаты - 1,6; 6,5; 99,0 и 1,5; 2,0; 100,0 соответственно. Содержание этих катионов значительно выше в образцах серий САПД, полученных с применением натрия хлористого, где в технологической схеме использована водопроводная вода н близко к содержанию в автолизате «Авимин», соответственно 10,0; 8,5; 225,0 и 9,2; 5,8; 150,0. Во всех образцах автолизатов отсутствуют тяжелые металлы и индол, отрицательно влияющие па ростовые свойства питательных сред.

При исследовании автолизатов, полученных с использованием разных ферментных препаратов, выявлено, что применяемый фермент влияет на профиль аминокислотного состава автолизата. Выявлена зависимость содержания глютамина, аргинина, ала-пипа и лизнна от метода индукции автолиза пекарских дрожжей. Уровень этих аминокислот выше в образцах, полученных с применением ферментного препарата - про-теовибрина. Определен полный набор аминокислот, содержание которых отличается стабильностью. По сумме содержания свободных аминокислот образцы можно отнести к основам со средней глубиной расщепления белка.

Таким образом, результаты исследований физико-химического состава САПД, приготовленного но оптимизированной схеме, свидетельствуют о соответствии требованиям НД (МУК 4.2.2316, 2008) по физико-химической характеристике, его стандартности и полноценном составе микро- и макроэлементов и аминокислот.

Определение качества питательной основы САПД по биологическим показателям было осуществлено в процессе конструирования питательных сред.

Конструирование ниппельных сред на оснпис сухого антолн зата пекарских дрожжей для культиинроплини чумного микроба. Оптимизация состава плотных и жидких дрожжевых сред (ДС) была проведена как по содержанию и них количества белковой основы (САПД), так и по составу солей. Прототипом по минеральному составу явились среды для культивирования чумного микроба па основе гидролизата по Хот-тингеру по прописи, модифицированной в РосНИПЧИ «Микроб». В результате работы по оптимизации состава сред предложены варианты плотной и жидкой сред на монооснове САПД, которые приведены в сравнении с составом кон трольных сред (К) по Хот-тнпгеру. Были также испытаны жидкая и плотная комбинированные среды (КС), приготовленные на основе гидролизата по Хоттингеру с добавлением САПД до 2,5%, с амин-нмм азотом в среде 0,8 и 1,0 г/л соответственно (табл.3).

Таблица 3 - Состав экспериментальных дрожжевых сред

Жидкая питательная среда

Состав среды К (г/л) ДС (г/л) КС (г/л)

Питательная основа/Ыщ.....в среде Хотгингер/0,8 :апд/о, 15-0,3 Хотгингер+САПД/0,8

[•(атрий хлористый 3,0 3,0 3,0

Аммонии молибденовокислый 0,5 0,5 0,5

Натрия метабисульфит 0,05 0,05 0,05

Плотная питательная среда

Состав среды К (г/л) ДС (г/л) КС (г/л)

Питательная основа/И,1м„„ в среде Хотгипгер/1,0 САПД/0,25-0,5 Хотгингер+САПД/1,0

Натрий хлористый 3,0 3,0 3,0

Натрий фосфорнокислый двузаме-щенпый 2,0 2,0 2,0

Калий фосфорнокислый двузаме-щеипый 2,0 2,0 2,0

Аммоний молибдепово-кислый 1,0 0,5 1,0

Натрия метабисульфит 0,1 0,05 0,1

Железо сернокислое (1!) 7/в 0,006 0,006 0,006

Агар 18-20 18-20 18-20

Ростовые качества сред были проконтролированы при температурных режимах 28 и 37°С. Определены чувствительность, показатель прорастания, скорость роста, эффективность среды и способность сохранять стабильные морфологические и биохимические свойства микроорганизмов при культивировании и многократном пассировании (МУ 3.3.2.2124, 2006). Результаты, полученные при культивировании У. резИз ЕУ НИИЭГ, представлены в табл.4. Штаммы У. резН:/ Р-1680, У. реяНз И-2377, У. реяНз КМ-227, У. р5еис1о1иЬегси1ох1Е И-199 растут на всех испытанных экспериментальных средах и сохраняют типичную морфологию при аналогичных значениях аминного азота.

Штаммы чумного микроба, выросшие па экспериментальных средах, сохраняют типичную морфологию. Плотная дрожжевая среда незначительно уступает агару по Хоттингеру по показателю эффективности - выходу биомассы, однако, что важно для производственных питательных сред, позволяет чумному микробу синтезировать кап-

сульпый антиген (по данным 1'ПГЛ) аналогично результату на контрольной среде. Комбинированная плошал срсда способствует более интепенипому накоплению биомассы, что и 1,2-1,3 раза больше результата, полученного на контрольной срсде но Хоттнгеру.

Используя прием поэтапного исключения из срсды солсй, и их двойного уменьшения или увеличения, памп установлено, что содержание натрия сульфита и аммония молибдсиовокислого в дрожжевой среде может быть уменьшено в два раза но сравнению с контрольной средой, соответственно до 0,05 и 0,5 г/л.

Таблица 4 - 1'остовыс свойства плотных питательных сред (рН 7,2) при

Показатель Плотная питательная срсда / Nnjml„ % (п= 15)

ДС/ 0,015 дс/ 0,020 ДС/ 0,025 ДС/ 0,030 ДС/ 0,050 ДС/ 0,060 КС/ 0,1 К/ 0,1-0,12

Чувствительность(нз разведения 10"7) М+ш 3+1,0 8+2,0 7,5+1,0 8+2,2 8+2,0 8+2,1 8+2 8+2,5

Прорастание (нз разведения 10"г'), % М+ш 30+5,0 47+3,2 49+3,4 55+3,8 65+2,8 60+4,1 65+2,5 55+2,5

Эффективность:

концентрация биомассы (млрд м.к /мл) М+111 <1 1,5+0,2 1,8+0,25 2,6+0,5 3,5+0,5 4,0+0,5 6,6+0,2 5,2+0,25

синтез АГ (37°С), ти гр РИГА 1:64 1:512 1: 1024 1: 1024 1: 1024 1:2048 1: 1024

Диаметр колоний, (мм) М+ш Точечные <1,0 1,0 1,0 >1,0 >1,0 1,2+0,1 1,1+0,1

Харак тер роста Атипичны! Атипичный Типичный Гпнич личный Типичный Атипичный Гииич 11ИЧ-II 1.1 й Типичный

^Прочерк - нет роста при 37 °С

Заключительным этапом работы по конструированию плотных питательных сред для культивирования чумного микроба было определение способности сред па основе САПД длительно сохранять стабильными основные биологические свойства при многократном пассировании штамма. Культура чумного микроба на примере У. рехНх ЕУ 1-1ИИЭГ после десяти пассажей па плотной среде (ДС/0,05) сохраняла основные биологические свойства.

Аналогичным образом были испытаны жидкие среды, приготовленные па моно-оснопе САПД (Ып).....0,015; 0,02; 0,025; 0,03; 0,05%), и среда, комбинированная с использованием САПД в виде ростостимулирующей добавки (N„,„,1, 0,08%). Жидкие дрожжевые срсды (N¡,,„,1, 0,015-0,03%) обеспечивали полноценный рост всех тест-штаммов чумного микроба. В табл. 5 представлены основные характеристики роста У. ре.чп$ ЕУ НИИЭГ при культивировании на жидких питательных средах. Все жидкие среды при посеве чумного микроба нз разведений 10"6 и 10"3 (посевное число 100 и 1000 м.к.) оказались высокочувствительными, обеспечивали рост во всех грех пробирках. Характер роста )'. реьИз ЕУ НИИЭГ па ДС/0,015-0,05 был типичным, но по показателю эффективности - концентрации биомассы, контрольной среде соответствовали среды

ДС/0,025; ДС/0,03; ДС/0,05. Достоверно значимое различие с контролем (р<0,05) по выходу биомассы при культивировании К резИя ЕУ НИИЭГ было получено па средах ДС/0,03, ДС/0,05 и КС.

Таблица 5 - Гостовыс свойства жидких питательных сред (рП 7,2) нрн культнви-

ровашш У.рейкДКННПЭГ

Показатель Жидкая питательная среда / N..,„„,„ % (н=15)

ДС/0,01 5 ДС/0,02 ДС/0,02 5 ДС/0,03 ДС/0,05 КС/0,08 К/0,08

Концентрация биомассы (млрд м.к./мл) М+т 0,75+0,2 1,55+0,15 1,7+0,2 1,8+0,15* 1,9+0,2* 2,5+0,2* 1,65+0,2

Характер роста Типичный Типичный Типичный Типичный Атипичный Типичный Типичный

*р<0,05"

Однако жидка« экспериментальная среда ДС/0,05 не обеспечивала стабильности основных биологических свойств чумного микроба. При высеве па плотную среду после инкубации в бульоне, колонии чумного микроба в диаметре были (1,6+0,2) мм и не имели характерной кружевной периферической зоны, отмечалась диссоциация - рост в виде 8- и Я-форм. Эффективность среды с моноосповой СДПД (Н,,,,,,, 0,03%) достоверно выше, чем среды по Хоггиигеру па 15%. Культивирование штамма У. резИз ЕУ НИИЭГ па комбинированной жидкой среде доказало высокую эффективность среды, достоверно превосходящую контрольную среду по Хоптингеру на 50% и дрожжевую среду - 32%.

Таким образом, в результате проведенной работы по оптимизации состава сред показано, что плотная (Ы1Ш„,0,025-0,05%) и жидкая (Ыа>11Ш0,015-0,03%) среды на основе автолизата пекарских дрожжей по биологическим показателям соответствуют требованиям, предъявляемым к средам культивирования чумного микроба, и позволяют накапливать АГ аналогично результату па контрольной среде. Плотная н жидкая комбинированные среды, с использованием автолизата в качестве росгостимулирующей добавки, также по биологическим показателям соответствуют требованиям, предъявляемым к средам культивирования чумного микроба и по эффективности (концентрации биомассы) превосходят контрольную среду па 27 и 50%.

Применение питательных сред на основе дрожжевого автолизата дли масштабированного культннпроилиин чумного микроба. Практический интерес представляло применение сред культивирования чумного микроба па основе САПД в производстве МИБП. Среды были использованы для экспериментального производства диагностических средств - произведено 6 серий бактериофага чумного диагностического Л-413С. Для сред культивирования штамма У. реяНх ЕУ НИИЭГ использован САПД в виде мопооспопы и в качестве ростостимулирующей добавки (2,5%) в составе комбинированных сред на основе гидролизата но Хо ггиигеру.

Вес среды как приготовленные на основе автолизата пекарских дрожжей, так н содержащие автолиэат в виде добавки оказались пригодными для воспроизводства чумного бактериофага Л-413С. Оии обеспечивали высокую концентрацию фаговых частиц па этапе размножения, хорошую выживаемость после лпофилизации, а также стабильность свойств в процессе храпения. Однако более эффективными, па наш взгляд, являются среды, в которых дрожжевой автолизат является питательной белковой мопоосио-аой. Среды па моиоосповс САПД с минимальным содержанием азота (0,025%) обеспечивали наиболее высокую специфическую активность, превышающую в 2,4 раза результат, полученный па контрольной среде по Хогтннгеру, соответствен но - 20,0-107 и 8,4-107 фаговых частиц (табл. 6).

Таблица б - Фнзнко-хнмнчсскнс и биологические показа тели бактериофага Л-413С

Показатель Требования ИД* САПД - мопооснова САПД -добавка к Хотпшгеру Бульон по Хогтннгеру

ДС/1 ДС/2 ДС/3 КС/4 ICC/5 К/1 | К/2

Растворимость, мин 3 1 1 1 1 I I 1

рН 6,5-7,5 6,96 7,0 7,1 6,43 7,1 6,45 6,91

Потеря в массе при высушивании, % <3 1,75 0,6 0,5 1,73 0,4 1,3 0,4

Специфическая активность частиц:

цо лиофилизации >п-10" 20,0107 4,65-107 4,6-107 4,0-107 2,59-10' 8,4-10' 5,0-107

после лиофилизации >и-10"' 8,0-10° 1,6-10" 1,0-10" 1,9-107 1,0-10" 3,8-10" 1,1-10"

Спектр логической активности Типичный Типичный Типичный Типичный Типнч-пич- II ый Типичный Типичный Типичный

11Д*-ТУ 9386-020-01898109-2008

Тенденция преимущества сред па основе САПД с минимальным содержанием амиппого азота сохранялась как при лиофилизации чумного бактериофага, так и в процессе хранения в течение срока наблюдения при разных температурных режимах. Результаты изучения свойств препаратов в процессе храпения свидетельствуют о стабильности таких показателей, как растворимость и потеря в массе при высушивании в течение срока годности (3 года), а также через 1 год после его истечения.

Экономически целесообразным является и использование САПД в качестве ро-стостимулирующей добавки. Способ комбинированного использования основ позволяет использовать мясной перевар в значительно меньшем количестве (на 30%),что обеспечивает в сочетании с азотистыми основаниями САПД содержание в готовой жидкой среде амиппого азота 0,08%. Комбинированная среда способна полностью обеспечивать питательные потребности чумного микроба и способствует выживаемости чумного бактериофага па этапе лиофилизации и храпения.

Опыт использования жидкой экспериментальной среды для масштабированного выращивания чумного микроба. Для изучения возможности применения сухого автолнзата пекарских дрожжей в производстве диагностических и препаратов, в условиях

масштабированного эксперимента в качестве объекта дли эксперимепгалыю-производстпеиного культивировании были использованы штаммы: Y.pesHs EV МИИЭГ и Y. pestis КМ 277 при режиме культивирования 28 и 37 °С.

Установлено, что глубинное культивирование штаммов чумного микроба (Кpestis КМ 277 и Y. pestis EV МИИЭГ) па жидкой среде (N амии. 0,015%), сконструированной па основе САПД, при 28 °С и 37 °С позволяет накапливать как биомассу, так и капсульпмй антиген (дот-ИФД). Эффективность экспериментальной жидкой среды сопоставима по результатам контрольной среде по Хотгингеру. При культивировании Y.pestis КМ 277 и Y. pestis EV МИИЭГ на плотных дрожжевых средах (при 28 °С) получены результаты, не уступающие результатам с контрольной среды по Хоттнигеру. Определено, что штамм Y.pestis КМ 277 при культивировании па экспериментальных средах с основой САПД при температурном режиме 28 °С (до 24 ч) по способности сип-теза в среду капсульпого антигена превосходит штамм Y. pestis EV МИИЭГ.

В следующей серии экспериментов для культивирования штаммов чумного микроба (Y.pestis КМ 277 и Y. pestis EV МИИЭГ) использована серия жидкой питательной среды па основе САПД (N амин. 0,015 %). Инкубацию до 24 ч осуществляли при 28 "С в реакторе У-6 с объемом питательной среды 125 л. Определение Ф1 было проведено методом РИД. Анализируя данные, полученные при культивировании Y.pestis КМ 277 при температуре 28 °С, следует отметить высокий уровень секреции в среду Ф1 - 5,0 мг/мл, и в то же время небольшой выход биомассы с единицы объема питательной среды -1410° м.к./мл. Соответственно результаты, полученные при культивировании в тех же условиях Y.pestis EV МИИЭГ - 2,5 мг/мл и 35 10' м.к./мл. На основании сравнения данных, полученных при масштабированном выращивании штаммов чумного микроба на экспериментальной среде и среде по Хоггипгеру [Никифоров А.К., 2011], можно заключить, что разработанная жидкая среда па основе САПД не уступает по эффективности традиционно применяемой среде.

Учитывая, что современное производство питательных сред должно быть экономически эффективным, было проведено сравнение стоимости основ, приготовленных из разного сырья. Установлено, что применение в составе питательных сред культивирования моноосновы - автолизата пекарских дрожжей может снизить себестоимость МИБП. Рассчитанная стоимость автолизата меньше, чем стоимость гидролизата по Хот-тиигеру и гидролизата казеина соответственно в 3,3 и 1,3 раза.

Экономический эффект связан и с уменьшение количества основы, используемой для приготовления жидкой среды культивирования, так как дрожжевые среды обеспечивают питательные потребности чумного микроба и способствуют накоплению целевого продукта (бактериофага или капсульпого антигена) при содержании в них минимального количества амшшого азота (0,015-0,025%). При приготовлении питательных сред для культивирования штамма-продуцента бактериофага, дрожжевой основы расходуется меньше в 2 и 1,8 раза, чем гидролизата по Хоттингеру и казеинового гидролиза-

та. Следовательно внедрение жидких сред на осиоис автолизата пекарских дрожжей в производство может существенно (в 5,3 раза) снизить себестоимость МИБГ1.

Таким образом, в результате оптимизации производства автолизата пекарских дрожжей предложены технологические способы, позволяющие получить сухую стандартную основу питательных сред полноценную по аминокислотному составу и со стабильным содержанием микро- и макроэлементов.

При выращивании тест-штаммов доказана пригодность жидкой и плотной сред, сконструированных на монооспове - сухом ¡штолизате пекарских дрожжей для культивирования чумного микроба. Доказана эффективность применения дрожжевых сред при экспериментальном производстве чумного бактериофага Л-413С, для накопления биомассы и Ф1 при глубинном культивировании штаммов чумного микроба.

ВЫВОДЫ

1. Индуцированный протсовнбрипом автолиз пекарских дрожжей в условиях щелочной среды (рН 8,0+0,5) сокращает продолжительность процесса в 1,7 раза и повышает выход азотсодержащих веществ до 20% по сравнению со способом, предложенным рапсе с применением натрия хлорнда.

2. Предложенный комплекс оперативных методов контроля, включающий определение концентрации амппного азота в реакционной смеси и степени лизиса дрожжевых клеток на стадии технологического процесса, а также измерение удельной электропроводимости па стадии входного контроля сырья, позволяет определить эффективность автолиза.

3. Усовершенствованный технологический процесс производства автолизата пекарских дрожжей с применением направленного изменения рН среды, способа фильтрации, концентрирования на вакуум-выпарной установке и распылительного высушивания позволяет получить полноценную сухую питательную основу для микробиологических сред, соответствующую требованиям НД но физико-химическим свойствам и химическому составу.

4. Плотная и жидкая среды на основс автолизата пекарских дрожжей по биологическим показателям соответствуют требованиям, предъявляемым к средам для культивирования чумного микроба.

5. Комбинированные плотная и жидкая среды с использованием автолизата в качестве ростостимулирующей добавки (амипный азот 0,1 и 0,08% соответственно) по биологическим показателям соответствуют требованиям, предъявляемым к средам культивирования чумного микроба, и по накоплению биомассы (при 37 и 28 °С) превосходят контрольную среду по Хоттиигеру (на 27 и 50% соответственно).

6. Сконструированные дрожжевые среды обеспечиваю!' при масштабированном культивировании питательные потребности чумного микроба н способствуют накоплению целевого продукта (бактериофага или капсулыюго антигена) при содержании в них минимального количества аминиого азота (0,015-0,025%).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО Т I'M IL ДИССЕРТАЦИИ

1. Антонычспа VI.В., Шульгина И.В., Базлоп Г.В., Бахрушина Н.И., Нижегородце» С.А., Астафьева C.B., Дятлов И.А. Применение питательных сред на основе сухого аутолнзата дрожжей для культивирования чумного микроба // Санитарная охрана территории государств-участников содружества независимых государств: Матер.VI Межгос. пауч.-практ. копф. - Волгоград, 2005. - С. 206-208.

2. Антонычспа M.В., Шульгина И.В., Бахрушина И.И., Нижегородцев С.А., Волох O.A., Астафьева C.B., Дятлов И.А. Использование сухого автолизата дрожжей для сред культивирования чумного и псевдотуберкулезиого микробов // Инфекции, обусловленные иерсиниями, НИИЭМ им. Пастера: Матер. II Всеросс. пауч.-практ. конф. с между-иарод. участием. - СПб, 2006. - С. 32-34.

3. Аленкина Т.В., Знпнпа О.С., Антонычспа М.В., Шульгина И.В., Бахрушина Н.И. Изготовление бактериофага диагностического чумного Л-413С на жидких средах из аутолизата пекарских дрожжей // Инфекции, обусловленные иерсиниями, НИИЭМ им. Пастера: Матер. II Всеросс. пауч.-практ. копф. с междупарод, участием. - СПб., 2006. -С. 27-29.

4. Антонычспа М.В., Шульгина И.В., Аленкина Т.В., Зипина О С., Бахрушина H.H., Нижегородцев С.А. Применение сухого автолизата дрожжей в производстве медицинских иммунобиологических препаратов // Вакцииология 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики и лечения инфекционных болезней: Матер, пауч.-практ. конф. ГИСК им. Тарасевича. - М., 2006. - С. 15.

5. Пат. 2360962 Российской Федерации МПК CI2NI/20 Способ получения питательной основы и питательная среда для культивирования микроорганизмов возбудителе чумы и холеры / Кузьмиченко И.А., Громова О.В., Киреев М.Н., Плотников О.П., Грачева И.В., Виноградова H.A., Солодовников U.C., Нижегородцев С.А., Антонычсоа М.В. -№2007122604; заявл. 15.02.2007; опубл. 10.07.09 // Вюлл. 2009. -№ 19.

6. Крушельницкий Р.В., Антонычспа М.В., Нижегородцев С.А., Бахрушина Н.И., Шульгина И.В., Белоусов А.Д. Использование отходов производства автолизата пекарских дрожжей для приготовления белковой питательной основы // Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ: Матер. VIII Межгос. пауч.-практ. конф. гос-уд. - участ. СНГ. - Саратов: ООО «Приволжское изд-во», 2007. - С. 236-237.

7. Кузьмиченко И.А., Громова О.В., Киреев М.И., Плотников О.П., Грачева И.В., Виноградова H.A., Червякова U.C., Нижегородцев С.А., Антонычспа М.В. Питательные среды для культивирования возбудителей холеры, чумы, псевдотуберкулеза, приготовленные с использованием ферментативного комплекса холерного вибриона - протеовибрипа // Холера н патогенные для человека вибрионы: Матер, совещ. и пробл. комиссии. - Ростов-н/Д, 2008. - Вып. 21. - С. 126-127.

8. Базлов Г.В., Щсрбакон Д.Л., Антопычспа iVI.ll., Васин 10.Г., Строганой В.В., Шульгина И.В., Никифоров А.К., Бахрушина Н.И., Нижегородцев С.А. Концентрирование ав-толизата некарскнх дрожжей в процессе производства сухой питательной ochobi.i // Биотехнология в Казахстане: проблемы и перспективы инновационного развития: Матер, междунар. науч.-иракт. конф., поев. 50-лстню НИИ проблем бнобезонасности IIЦБ МОП PK. - Алматы, 2008. - С. 57-61.

9. Антонмчсна М.В., Шульгина И.В., Никифоров А.К., Кузьмичепко И.А., Нижегородцев С.А. Безотходные технологии в производстве медицинских иммунологических препаратов // Проблемы обращения с отходами лсчсбпо-профмлактнческих учреждений: Сб. матер. V междупар. конф. - М., 2009. - С. 34-35.

10. Антонмчсиа М.В.. Кузьмичепко И.А., Никифоров А.К., Волох O.A., Шульгина И.В. Эффективность автолиза некарскнх дрожжей, индуцированного ферментными препаратами // Пробл. особо опасных ипф. - 2009. - Вып. 3(101). - С. 62-65.

П.Зинина О.С., Алсикипа Т.В., Антопычсва М.В., Вахрушина II.И., Никифоров А.К. Перспективы применения питательных сред на основе аутолнзата пекарских дрожжей в производстве чумных бактериофагов // Актуальные проблемы предупреждения и ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций в области санитарно-эпидемиологическою благополучия населения государств-участников СНГ: Матер. X Мсжгос. пауч.-иракт. коиф. государств - участников СНГ (5-6 октября, г. Ставрополь). -2010.-С. 188-189.

12.Алснкина Т.В., Зипппа О.С., Антопычсва М.В., Вахрушина 11.И., Никифоров А.К. Эффективность применения сред па основе аутолнзата пекарских дрожжей в производстве бактериофага диагностического чумного J1-4I3C // Жури. инф. иатол. - Иркутск, 2010. Вып. З.-С. 15-17.

13.Алепкнна Т.В., Знпина О.С., Антопычсва М.В., Вахрушина Н.И., Никифоров А.К. Оптимизация стадии репродукции в технологии производства бактериофага диагностического чумного J1-4I3C // Пробл. особо опасных ипф. 2011. Выи. 2(108). - С. 79-82.

М.Жулидов И.М., Абрамова Ii.Г., Никифоров А.К., Антопычсва М.В., Шульгина И.В., Лобовикова O.A., Бахрушина И.И., Белоусов А.Д., Еремин С.А., Киресв М.М., Шарапова H.A., Савицкая Л.В., Михеева Т.А., Минаева Л.Н., Галкина М.В., Свиицов P.A., Алешина Т.В., Васин 10.Г., Базлов Г.В. Безотходные технологии в производстве гетерологич-ного аптирабического иммуноглобулина // Пробл. особо опасных инф. 2011. В. 4 (111). -С.80-84.

15. Базлов Г.В., Комиссаров A.B., Никифоров А.К., Антопычсва М.В., Белоусов А.Д. Совершенствование технологии получения экстракта автолизата некарскнх дрожжей // Вестник Саратовского госагроупиверситета им. Н.И. Вавилова. - 2012. - № 1. - С. 1114.

Подписано в печать 19.11.2011. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Гарнитура Тайме. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Отпечатано на полиграфическом оборудовании ФКУЗ Российский научно-исследовательский противочумный

институт "Микроб" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. 410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46.

12 -3979

{&Ù

2010282783

2010282783