Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Новые питательные основы и среды для возбудителя чумы

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Новые питательные основы и среды для возбудителя чумы"

О О 1 3 х.

Министерство здравоохранения СССР

Всесоюзный ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт «Микроб"

На правах рукописи

ПЕРЕМЕТ Олег Васильевич

Уда 579.842.23:57.083.13

НОВЫЕ ПИТАТЕЛЬНЫЕ ОСНОВЫ И СРЕДЫ ДЛЯ

возБУдешдя чумы

03,00.07,- микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени || доктора медицинских наук

Саратов - 1991

©

Работа выполнена в Ростовском-на-Дону государственном -ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательском противочумном институте

Научный консультант: доктор медицинских наук Ю..М.ЛОМОВ

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, член-корреспондент Российской АН, профессор Г.М.ШУБ

доктор медицинских наук, пройЬессор

а.в.жшвдшк

доктор медицинских наук, старший неуинь-П сотрудник 3.1.ВШШ1

Ведущая организация: Неутмо-ксследов&тсльсккй противочумный

институт Кавказа и Закавказья

Защита состоится 1391 года в_ часов

на заседании спецуаллзирэванного Совета Д С74 32 01 при Всесоюзном научно-исследовательском противочумном институте "Микроб" (4100?!, г.Саратов, Университетская, 46 ВШМ "Микроб"}.

С диссертацией »'оьсно ознакомиться в библиотеке Саратовского государственного ордена Трудового Красного Знамзни науцно-иссле-доЕательского противочумного института.

Автореферат разсслгн

Учений секвптарь специализированного совета, лектор бис.югических наук

Г.А.КОКШЗВ

0Щ4Я ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. При решении многих вопросов, связанных с баптернлии чумы, возникает потребность в взращивании клеток на питательных средах. Однако используэмне в прогипочушой практике среды и методические подходы к культивированию бакге- . рий ухе по удовлетворяют возросши к шш требованиям и часто являются тормозом в развитии исследований в микробиологии, физиологии, биохимии, молекулярной биологии, генетике чумного микроба.

Проблема конструирования новых питательных ср»д для возбудителей особо опасных инфекций возникла достаточно давно, я над о§ реявшем работали шогиэ исследователя. Больной вклад в этом наяраэледаи был внесен иколоА, создмгвдй н руководимо?, профессором В<,Н.Иияютшшм (В.Н.Кшготин, Л.Ф.Касаткин, 1975; В.Н.Мюпотин с соавт., 1975; В.НДкгаотин с сотр., 1982; В.А.Копылэв и др., 19Ш)„ Вили разработаны эффективные срады дая туляремийного, бруцадяззного, сибиреязвенного микробов, холерного вибриона (ВД.Копылов с соавт., 1988; В.Н.Милютин с сотр., 1988; Е.В.Рожков, В«,В.Лобанов, 1988; В.А.Н^пыяов к др., 1990; М.И.Богданова с соавт., 1990), и серьезное внимание с¡5ращено на кеобходииость разработки новых и совершенствование имеющихся питательных срод и методов выращивания чумного микроба.

В настоящее время можно ввделить несколько вопросов, с реализацией которых в значительно!» степени связан прогресс в области конструирования питательных сред и культивирования на них возбудителя чумы. •

Правде всего, это создание экономически эффактивннх пята-тельных основ, изготавливав»« из доступного непищевого сырья ч обладающих високоЯ питательней ценностью для чумного микроба.

Располагал набором подобных препаратов, появляется возможность с гораздо большей результативность» осуществлять конструирование питательных ерзд различного назначения для возбудителя чумы.

Уснох в борьбе с чумней инфекцией во многом определяется своевременной диагностикой заболевания, которая, в свом очередь, тесно связана с полутенивы чистой культуры возбудителя на питательных средах (И.СДшкею с ссапт., 1970). В идеале, сроды, используемые длл ¿той цели, должны централизованно изготавливаться в сухом виде из доступных дешевых препаратов отечественного хфоиэвоцства, быть удобными для приготовления в условиях передвижных автономных лабораторий и обеспечивать выделение бактерий чумы из смеси с посторонней микрофлорой при наличии в пробе единичных клеток чумного микроба. 9 СССР такие среды не выпускаются, что не может не отразиться на эффективности некоторых противочумных мероприятий. Поэтому еще один вспрас, который требует своего решения, заключается в необходимости разработки ио-ьых, более соверпекных, удобных в применении и выгодных для широкомасштабного изготовления сухих элективных сред, в которых в качестве питательных основ использовались бы дешевье препараты, полученные из непищевого сырья.

Наделение чистых культур возбудителя чумн, хотя и оч?нь важное, но далеко не единственное направление в использовании питательных сред. Без них немыслимо решение многих проблем . микробиологии, Физиологии, биохимии, генетики, молекулярной биологии бактерий чумч. Питательные среди необходимы для реализации целого ряда бкотехг.ологических задач. Поэтому, наряду с диагностическими средами, требуются среды культивирования, обес-печивакше высокие показатели роста чумного микроба в интеррале

температур 28 °С - 37 °С, Примекг.емие в настоящее время с отоЯ цель» питательные среду, либо из обладав? достаточными вегвтиру-щиыи свойства»« при 37 °С, либо слоями в приготовлении, дороги, содержат дефицитнио препараты, что свидетельствует о необходимости конструирования более доступных и эффективных сред для культивирования возбудителя чуш.

Макроколекулярный, анютентй* спвкчр, активность многих ферментов н ферментных систем чумного микроба в большой степени зависит от условий инкубация клеток (В.И.Вейнблат, 1968; В.И. Вейнблач, 1970; Е.Э.Бахрах, В.И.Вейнблат, 1970; й.о-.гаЬогсиак, й.й.ВгиЬЫгег, 1932 ). В связи с этим, очень ватаю управлять процессом роста популяции, чтобы получить культуру с заданными свойствами. Одним из таких способов является использование на-'бора питачвльнглс сред с одинаково высокими вегетирувщими характеристиками, но с разным компонентным составом, причём такие сроду долины обеспечивать интенсивный рост возбудителя чумы как при Я8 °С, так и при 37 °С. Это позволит в каждом конкретном случае подбирать именно ту среду и ту температуру, которые способствуют формировании популяций чужого микроба с необходимым спектром свойств. Следовательно, вояникает потребность п конструировании набора подобных сред и в иэугонги влияния температуры выращивания, состава питательной среды на различные биологические показатели чумного микроба.

Настоящее исследование было направлено на рошекие поставленных выше вопросов.

Цель и задачи исследования. Целью явилось создэрие но гик питательных основ и сред, совершенствование методов культивирования возбудителя чумы, которые обеспечили бы повыгение эффективности диагностических исследования II экспериментальна* райот, связанных* с чумннми бактериями.

Для достижения этой цели предстояло решать следующие основные задачи:

- разработать из непищевого сырья питательные основы, ко-торыз можно использовать при конструировании сред для чумного микроба;

- сконструировать сухул элективную питательную среду, обз-спечиоажщую выделение бактерий чумы ча материала, загрязнённого посторонней микрофлорой и не требующук при приготовлении взвешивания компонентов, фильтрации, корректировки рН, стерилизации автскдавирозанием;

- разработать набор питательных сред, обладающих высокими вегетирутацими свойствами при Я8 °С и 37 °С и отличающихся по компонентному составу;

- определить условия инкубации возбудителя чумы» обесле-чиввицие (формирование популяций с максимальной иммуноренностыо, вирулентностью, наибольший содержанием фракции I, «мышиного* . токсина, уу -антигенов, широким антигенным спектром.

Научная новизна. При реализации поставленных задач:

- впервые показано, что питательными основами микробиологических сред, в том числа и для возбудителя чумы, могут служить разработанные нами препараты: автолиза? селезёнки круп-» ного рогатого скота, гидрояизат белка пшеничных отрубай, экстракт дрожжевой очищенный сутой, фогфорнокнслотний гидролиза? дрожжей, гвдрслизат бэлка подсолнечного шрота;

- впервые установлена связь меяду радиальной скоростью роста колоний бактерий чумы и удельной скоростью роста культуры, что позволило разработать простую методику определения^ц чумного микроба(

- сконструировано из мягисцевсго сырья десять новых диаг-

■ ностических сред для возбудителя чумы и показано, что по Беге-тиругацил свойствам они превосходят агар Хоттингера;

- впервые получена сухая олентивная питягельлая среда для чумного микроба, которая не требует при приготозлении взвешивания компонентов, фильтрация, ссвеччения, корректировки рН, стерилизации автоклавированием и обеспечивает Еыделение бак-тернй чукы из материала, обильно сбсеиенённого посторонней микрофлорой;

- впервые установлено, что скорость роста возбудителя чуни, в основном, определяется качественным составом гппатзль-ной среды, а выход бактериальной массы зависит преимущественно от концентрации лимитирующих факторов;

- впервые обнаружено, что выход микробных клеток на дрожжевой и селезёночной средах ограничивается недостатком цисте-га:а„ метионина, лейцина, иэолейцкна, треонина, аргинина, СяС^, урацма, ксилозы или глюкозы, а набор лимитирующих факторов зависит от вида питательной среды, её серии, а также ауксо^ро--фисети штаммов;

- впервые показано, что повысить выход бактериальной массы на селезёночной и дрожжевой средах можно путём уьсличения

в них концентрации лиыигирущих фэнтсров, которое достигается при обогащении сред гидролиэатом белка отрубей, гидролиза-том белка подсолнечного шрота, казеиновым гндролизатон, переваром мяса по Хоттингеру;

- разработано семь новых питательных сред, обладающих высокими вегетирущими свойствами по отношению к чумному млкробу в условиях 37 °С;

- определены оптимальный состав питательной среды, температура культивирсЕания, продолжительность инра,'1)ив?л1.я для пау-

чения иммунсгенности, антигенного состава, антибиотикочувстви-тельности» содержания фракции I, »мышиного" токсина, г я - антигенов чумного микроба;

- впервые выяснено, что при 37 сС наблодаэтся нарушзкма корреляции кекд/ процессаш анаболизма и катаболизма у чушо-го микроба, ©го приводит к интенсификации синтеза вторыми мзтабшштов, к числу которьк можно отнести фракция I, V,? - антиген«';

- впервые установлено, что антигенный спектр возбудителя чумы зависит от состава использованной питательной среды, tea-паратуры инкубации. Количество индуцибельных антигенов в 1,5 раза превышает число конститутивных;

- показало, что гешературикЯ факгор нз является безоговорочно ведугции в регуляции синтеза фракции I. Но в меньшей степени ее продукция завусит от состаъа питательной среди;

- впервые обнаружено, что яри развитии чумного микроба в чувствительном макроорганизма происходит кивэлироввнйз различи й, в (»держании фракции I, которые отмечались при росте на питательных средах.

Теоретическая и практическая ценность работы. Теоретическая значимость заключается в получении данных, свидетельствующих о том, что существенный прогресс в области конструирования питательных сред различного назначения для возбудителя чумы связан с наличием ассортимента новых доступных и эффективных су-ок питательных основ. Определены требования, которым должны отвечать среды для выделения чумного микроба. Камзчоны перспективы, обеспечивающие управление процессом роста возбудителя чумы и предложены некоторые методические подходы к их реализации.

В результате исследораний составлены и утаерлсдени нормативно-технические документы на следуицив разработанные нами препараты:

~ автолизат селезёнки (инструкция по изготовлении и контролю, инструкция по применении);

- гидролизат белка пшеничных отрубей сухой (лабораторный регламенте инструкция по применению);

- гидролизат белка подсолнечного шрота сухой (лабораторный регламент, инструкция по применении);

- среду дроясжзвуч элективную (СДЭЧ) сухую (лабораторный регламент, инструкция по применению);

- среду для культивирования возбудителя чу,/и пра 37 ЭС (ДЮ сухую (инструкция по изготовления и контролю, инструкция по применении).

Получено четырз авторских свидетельства на изобретения:

- аьторскоз свидетельство У 860521 на питательную среду дяя вырадивания чумного микроба;

- авторское свидотельстро .V I Ой 1043 на способ получения белкового гчдролизата из подсолнечного шрота;

- авторское свидетельство I ]'??9бб на способ лолуч'ения белка иа отрубей;

- авторское свидетельство 1222676 на способ получения питательной основы микробиологических срзд.

Внедрение результатов исследог.ания:

- автолизат оэлеэёнки испытан с положительным результатом в СССР, Болгарии, рвении. получено разрешение КВС МЗ СССР на внедрение автолизат« селезёнки с практику здравоохранения. Заключён договор о научно-техническом сотрудничестве ме\ду

- Ю -

Ростовским прогивочушым институтом (ШЧИ) и Институтом заразных и паразитарных болезней (София, Болгария), предусматривающий организации производства препарата. Налажен лабораторный выпуск автолизата в ЙГЧИ;

- гидролизат бежа отрубей, гндролизат белка подсолнечного шрота применяется в Ростовском противочумном института е. целью выращкпани« возбудителей особо опасных инфекций. Маяакэ-но лабораторное изготовлэние препаратов;

- среда СДЭЧ испытана в яротивочушюс организациях СССР, а также в институте ДЛастера (Вьетнам) в получила аысохую оценку. Решением Государственно!! меяведомстванной комиссии она рекомендована дня внедрения в практику здравоохранения. Среда отменена серебряной мэдвльп ВДНХ. Налагало лабораторное изготв-лениа СДЭЧ в Я1ЧИ;

- србды для культивирования возбудителя чуш при 37 °С испытаны в модчгдинскях учреждениях СССР, Болгарии V ЧШР и используются з.Ростовском противочумном институте при выполнении плановой научной тематики.

Апробация работы. Материалы работу докладывались: на Всесоюзной конференции ^Актуальные вопросы разработки препаратов мэдищнской биотехнологии*^ Махачкала, 1988 г.; на Всесоюзном совещании «Питательные среды в производстве бактериальных препаратов" Сболенск, Московской обл.. 1539 г.; не заседании проблемной комиссии, Москва, 1989 г,; на УП конгрессе болгарских микробиологов, Варна, Болгария, 1909 г.; неоднократно на расширенных конференциях Ростозского-на-Дону противочушого института.

Публикация результатов исследования. Основные положения аиссг?тз;ч!и отражены с 21 печатной работе.

- ii -

*'

подоления, выносимые на'защиту :

1. В качество питательных белковых осноз сред для чумного микроба могут служить автояиэат селезёнхи, экстракт кормовых дрожжей, гидролизат 0'елка пшеничных сгрубей» гидролиза? подсолнечного ирота, щелочной экстракт отрубей, фссфоркоккслот-иый гидролизат кормовых дрожжей.

2. Информация, полученная при определении радиальной скорости роста колоний возбудителя чукы, позволяет достоверно оценивать удельную скорость роста культуры.

3. Диагностические питательные среды для чумного микроба, изгстовденнне из автолизата селезёнки, гвдрояизата белка отрубей, дрожжевого экстракта, гндролиз&та белка подсолнечного арота, щелочного экстракта отрубей, гидролизата кератосодер-нат.зуо сырья, по своим "вегетаруюзрш свойства»! и универсальности превосходят агар Хсттангара.

4. Исследование материала, подозрительного на заражённость или заражённого бактериями чумы, следует осуществлять, используя сухую дрожжевую элективную среду (СДЭЧ).

5. Скорость роста чушого микроба определяется преимущественно качественным составом питательной среды, а гигаоп бактериальной массы зависит от концентрации тех компонентов, по отношению к котором чумной микроб является вуксотроЛом,

6. Факторами, лимитирующими выход микробных члеток епэ-будителя чу).«}- при 37 °С с дрожжевой среды и сред« из автоли-аата селезёнки, являются цистекн, лейцин, чэолейцин, треинин, аргинин, урацил, Са'глюкоза, ксилоза.

Высоких показателей скорости роста и выхода Сактеси-альной массн чумного микроба в условиях 37 °С моете дсбиты:я, используя экстракт кормовых дрожжей и азтолизат селолёькм,

оСогещокныэ гкдролизатои белке подсолнечного шрота, пшеничных отруЗеЧ, казеиновым гздролматом, переваром ияса по Хоттингеру.

8. Упраиление ростом возбудителя чумы возможно при наличия достоверной информации о влиянии условий выращивания на биолэ- -гивдекие свойства г.резбАз. Условия инкубации, оптимальные для накопления фрак пял Is TS - антигенов, «мышиного" токсина чужого ыигсробал для кзучзямя антигенного спектра возбудителя чуш, ого ишуногенности, вирулентности, чувствительности к антибиотикам, характеризуется различишь и строго определёнными параметрами (состав питательной среды, температура я продолни?аяь-ность выращивания).

Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, 4-х глав, заключения, выводое и списка яитвраяуры«, Она кзлоп©~ на на 352 страницах гдашнолясногс гоксга, содержи? 62 та¡Ssmuu и 18 рисунков» Список литературы включает 312 отечос'вешнк и 13Ь зарубежных литературных источников.

С0ДЕЕЩ1И2 РАБОТЫ ГЛАЗА 1. Разработка из непищевого сырья питательных основ, предназначенных для выращивания возбудителя чумы Для обеспечении интенсивного роста чумного микроба питательные среды должны содержать углеводы или другие окисляемые ,клеткой веиества, зирок"й набор аминокислот, низкомолекулярнае пептиды, некоторые витамины, нуклеиновые кислоты, целый ряд минеральных веществ и микроэлементов (У,Т.Арыл-паева с соавт., 1980; Л.Д.Картааевг с совет., 1986; g.Hills , е.зрам , 1952; ii.K.Uacou , IWJ). Проще всего этот вопрос решается при использовании комплексных препаратов природного происхождения.

В качестве источника питательных аещести в средах для вы-рпливания возбудителя чу»аы предложено значительное количество

различного сырья (А,А.Трифонова,, 19545 Л. А »Тимофеева с соавт., 1960; Л.А.Нартенс, 1964; Р.М.Нзчецхая с соавт., 1869} саткин с соавт., 1972), Тем на ыенев,, за исключением гидролиза-та мяса, большая часть препаратов широкого распространения не получила, либо из-за калэй доступности, либо из-за технической или пищевой ценности, либо из-за неудовлетворительных ростовых качеств приготовленных кз них сред. Поэтому сейчас всё ещё остаётся достаточно высоким процент мясных сред среди препаратов, используемых для культивирования чушого микроба. Такое пслонз-нк0 нельзя считать удовлетворительным/ тая как перэзар шг-а по Хотгккгеруо едса ли0 ионяо рассматривать пая нечто уникальное н яшдахцееся незаменимым источником углерода, азота, минеральных веществ.

Непкдевьм сырьём, способным явиться источником питательных компонентов в микробиологических средах,, кокет быть селезёнка крупного рогатого скота. По содержанию белка и зольных элементов она не уступает ыясу, по количеству железа, кальция, магния - значительно превосходит его.

Селезёнка шеат больпоэ число собственных протеолитическ'*х ферментов, основными из ксторкх являются катепсины (В.В.Мосоло°, 1971). С нашей точки зрения, автолитическая способность селезёнки могла оказаться достаточной для получения из нее питательной основы без применения традиционных гидролиэуккцих. агентов (кислот, щелочей, ферментных препаратов).

Эксперименты подтвердили ото предположение и позволили разработать препарат, характеризующийся полноценным изсчигтьм, угяевг лкм, минеральным составом (Табл.1). Технология колучвнид автолиэата селезёнки (Л.С) проста, не требует больших трудозатрат.

В качестве ещё одного перспективного сырья для питательных сред можно было рассматривать пшеничные отруби, являющиеся отходом мукомольной промышленности. Они содерясат 12-18$ белка,, богаты триптофаном (И.М.Ройтер с соавт., 1981), углеводами (М.С.Дудкин с соавт,, 1973), зольными элементами (Т.Д.Гуменюк, 1978), витаминами (Н.ГкКузьмина» В.Л.Кретович, 1950).

: Сведения о получении из отрубай микробиологических питательных основ в литературе отсутствует. Это можно объяснись высок:™ содержанием в них углеводов и сложностям;!, возникающими при удалении "оксических .продуктов, образующихся в процесса гидролиса отрубей (Л.П.Коржвва, В.А.Романов, 1979$ а.м.ибсЬакоя* вк а!. » ».З.Ро^гхе еЬ о!. , 1981).

Поэтому ми сочли целесообразным разработать технологию из--влечения из пшеничных отрубей белка с огаоситрльно дазкиы содержанием углеводов,, а затем получить из ного азотистую питательную основу для выращивания микроорганизмов.

В результата был отработан метод, позволивший сконструировать из отрубей препарат, содержащий 79,8 + 3,5£ ¿елка я 8,5+ О, углеводов.

Одним из промежуточных продуктов предложенной методики является щелочкой экстракт, который оказался способным в малых дозах оказывать выраженное стимулирующее действие на рост самых различных микроорганизмов. Обнаруженный эффект был подтверждён пониссионныш испытаниями.

Для получения из белка гидрелизата использовали серную кислоту, что позволило в итоге разработать сухой препарат (ГБО), срдерглций 5,9+0,5^ амикного азота, 34,0-0,биуретовых продуктов представленных пептидами с молекулярной массой от 160-900

хаиякца i

ХИМИЧЕСКИ;! СОСТАВ ПИГАТЕЛШХ ОСНШ ( в % к сухому весу )

Петатэяьн&я основа

1! О к а з a ï в J ь i АС _ | ГБО j ЭДОС ! ФГ { ГЕЛИ'

алот оС:ций 8,6 ± 0,8 11,3 + 0,8 7.4 i 7,0 + 1,3 12,7 ^ 0,2

Азот амикный 6,а ± 0,6 5,9 ± 0,5 3,0 ± 0,6 1,5 i 0,4 ô,4 ± 0,4

ВиуретоЕые продукты 18,3 + г,1 34,0 z 0,2 18,0 * 3,7 33,8 + 5,5 49,а + 1,0

Углеводы 10,4 ± 1,2 12,0 + 0,7 26,0 * 7,6 27,е + 3,9 1,7 Í 0,4

Нуклеиновые кислоты 8,3 Z °>б 2,0 + 0,1 11,0 * 3,1 9,5 + 1,4 1,0 + 0,2

Зола 15,9 ± 3,1 20,0 + 1,9 2308 + 5,9 15,4 + 5,0 12,8 + 0,9

СВОБОДНЫЕ АШШМСЛОТЫ •

триглофая лиаик ги.стидин аргинин аспарагиновая кислота CSDKK треонин глугаыиновая кислота лсолии глинин алачкн miCTvn калин «етипнин ипслейиин .Mit1 JV1H тирозин фенклаланин 0,3 4 2 Í»? 2,6 2|2 33 2,4 5,2 0.9 2 1 2 0 ¿.и 13 2,0 4 6 19 2 2 0,63 С Ь2 0*68 1,28 4110 I 12 0,62 10 10 2,22 2,0 1,35 0,2 1,54 I 19 0,76 I 63 О'бб 0,33 следы 1,3 о;? 0 6 о 0^3 0 5 19 5 02 0 3 2,9 следы 0.4 0106 02 0 3 0 1 o;i следа 0,29 0,22 0,19 1*99 0ÎI6 о; 16 0,32 • 0,0В 0*15 0,40 0 07 С,22 следы 0,16 О! 24 0,15 о; 12 0,15 0 61 0,38 1 52 II 08 Oí 99 0 61 9,26 0*91 2 96 1,90 сле^ 0)76 0 76 1,75 0 46 0,53

Суше аминокислот 44,1 31,9 29.0 5,07 35t22

дельтой и являгшимися в основном ди- и трипептидЕми. В состав гидролкзата входят нуклеиновые кислоты, углеводы (ТаблД).

Большой интерес в качестве источника питательных веществ для возбудителя чумы представляют также кортовые дрожжи. Ода выпускаются з промтлеганом масштаба, характеризуются полноценным химическим составом Ш.И.Коротченко с соавт., 1966; П.Е.Ладан с соавт., 1972) и уже наитии применение при выращивании раз» личных мякрооргкизмов (Г.К.Скрябин с соазг., 1965; Е,Г.Борисен-> ко, 1967; Л.Г.Бендас, 19711 З.М.Андреева, К.И,Гридкев£0 В.КД'слдшмид, Р.Г.Ряполова, 1980; К. ¡■'.Гриднеза, Л,С.Пономарёва, 19Ш).

Наи удалось разработать из кормовых дрожжей две питательны© основы: экстраку дрожжевой счиценный сухой (ЭДОС) и фосфор-нокислоткай гидролизаи (4Г).

Препарата содержат: все основные компоненты» необходимые для развития чумного микроба, -причём азотистые ¡вещества а ЭДОС представлены в основном амшокяслоташ к низкомолекулярныда пепигдажи» а в ФГ преямуцестазшю непткдши с высокой молекулярной массой (Табл.1). Налажено лабораторное изготовление дрожжевых ослов.

К числу перспективного сырья для питательных сред можно отнести я подсолнечный шрот, являющийся продуктом переработки семян подсолнечника. Б шроте присутствуют до 50$ белка, 24Й безазотистых веществ (Ё.Ю.Ларюшкина с соавт., 1272). Однако наличие в годсолначном шроте соединений, обладающих бактериоста-тичестшм эффектом (<|еколк&рбоновыо кислота), не позволяет использовать его непосредственно для получения гидролиэатоз. Поэтому пгедсте.вхялось целесообразным разработать вначале технологию

извлечения из подсолнечного шрота белка, лишённого фенолкьрбо-- новых кислот, а затеи подобрать оптимальный режим изготовления из белка гидролизата.

В результате была предложена методика, обеспечивающая получение сухой питательной основы, представляющей, по существу, ашшокислотно-пепгядный концентрат с включением небольього количества зольных элементов, углеводов и нуклеиновых кислот. Фенолкарбоновые кислоты в гидролизата белка подсолнечного ¡про-та (ГШШ) отсутствуют. В нзц обнарузашаются в свободном состоянии практически все необходимые для роста возбудителя чуш аминокислоты (ТаблД).

Таким образом, сконструированы новые препараты, которые могу« использоваться в качества питательных белковых основ для чумного микроба: аятолизат селезёнки, гидролизат белка пшеничных отрубейв экстракт кормовых дрояаюП, фосфорнокислотный гидролиза? дрожжей, гидролизат белка подсолнечного шрота. Разработанные питательные основы изготввливавтея в сухом вида, технология приготовления их достаточно проста и легко может быть воиспроизведена в промышленных масштабах. По своей экономической эффективности препараты превосходят существующие аналоги.

Новые основы были использованы при конструировании различных питательных сред для возбудителя чуш.

ГЛАЗА 2. Конструирование питательных сред для лабораторной диагностики чумы

Анализ литературы позволил прийти к выводу, что повысить эффективность диагностики чумы можно при использовании питательных сред, отвечающих следующим требованиям: они должны

обеспечивать высокую удельною скорость рома культуры, обладать высокой чувствительность« к высокой выпзванкоетьк; на них должны расти штаммы, выделенные в различных природное очагах и отличающиеся своими питательными потребностями; морфология колоний доякна быть -типичной для чушого микроба; скрашенные культуры должны ссхракято биологические свойства, используемые для идентификации т.рвоШ! . Среда должны обеспечивать рост возбудителя чуш при температура 28 и 37 изберательно угнетать рост сопугствусцей микрофлоры при ьзделении чкезой культуры чумного микроба из загрязнённого матзриала, изготавливаться в сухом виде из доступного деиевого сырья. Технология приготовления сред должна бить максимально упрощена, но содержать отелос филыграшн, осветления, корректировки рН и стерилизации автокяа-вировачяем.

При конструирования таких сред возникла потребность в ока-ративаоЯ оценка удельной скорости роста культуры чумного микроба} что обусловило необходимость исследований по разработке просгоро способа определения/I. За основу ногой мегодики была принята модель» предложенная ( й.л.рич , 1967). Однако она применима лишь к колониям, имеющим форму уплощённой полусферы с розньм краем по границе с агаром, а особенностью колоний Т.роа-«с , выращенных на традиционных средах, является такой характерны Я структурный признак, как «кружегная" зона, расположенная по её окружности.

Было обнаружено, что типичные для возбудителя чума холо-нчи формируются при прочности агарового геля 550-660 г по прибору Валента. При уменьшении прочности до 300 г колонии теряют характерные признаки и приобретем вид полус^ры с ровным куа-

ем. Выявленная закономерность носила универсальный характер и наблюдалась на средах, приготовленных нз различных питательных основ.

Ь последующем была установлена связь между увеличением радиуса сферических колоний чумного микроба в единицу времени и удельной сноростью роста культуры, что подтвердило данные, полученные ( S.J.Pirfc , 1967} на других бактериальных моделях, и позволило разработать простую методику дяя оценкиjx r.pa.»ti3.

Успех в конструировании да&гнсстическшг сред для возбудителя чумы зо шюгоа зависит от того, насколько верно отобраны для экспериментов препараты,, являющиеся основным источником питания. Они должны изготавливаться в сухом виде из непищевого сырья, быть экономически эффективными, но давать осадка при 'растворении. Химический состав препаратов должен перекрывать известные питательные потребности чумного микроба.

Поэтому в качестве основы диагностических сред для т.рез-tia' мы испытывали автолизат селезёнки, дрожжевой экстракт, гидролиза? белка подсолнечного крота, гидролизат кератосодеряа-щего сырья (A.B.Гончаров с соав., 19о6) и гидрслизат белка отрубей, которые отвечают всем перечислэнннм выше требованиям.

На первом зтеле отрабатывали оптимальную рецептуру среды для каждого из этих препаратов.

Максимальная скорость роста возбудителя чумы наблюдалась на средах из дротмевого экстракта и атзтолнзата селезёнки. Скорость размножения бактерий на других питательных оснпвах была существенно ниш, что, как выяснилось, связано с лимитацией м;-таминг <и группы ß и нуклеиновыми основаниями. Снять лимитацьо по этим компонентам удалось пугём обогащения срзц минимальш/м

количеством дрожжевого экстракта или щелочного экстракта отрубей.

D результате было сконструировано девять диагностических питательных сред для T.pastis (ДЭ>ПЭД>ПЭО,ОЭД»ОЭО, КЭД,КЭ0,АС, АСЭД). Всэ они обеспечивали в условиях 2d °С рост чумного шк» роба при посевной дозе 10 м.кл. с покаэателзм прорастания 50$. Через 48 часов инкубации формировались колонии диаметром болеа Is0 мм с типичной морфологией.

В последующем были выбраны среды наиболее перспективные для выделения возбудителя чумы. Основным критерием для этого явились способность сред обеспечивать рост итешгов чушого юш-роба, выделенных в различных природных очагах и характер роста культур при 37 °С.

Эксперименты показали, что наибольшая универсальность® обладают среды ДЭ и ЛСЭД5 наименьшей - агар Хоттингвра (Табл.2). В порядке снияекия этего показателя среда можно было расположить следующим образом: ДЭ-АСЭД-КЭ0-КЭД-0ЭД-АС-Г,ЭД-ПЭ0-0ЭД-агар Хоттингьра.

Другими словами, все сконструированные среды по своей универсальности превосходят агар Хоттингера и по этой причине являются перспективными для выделения т.pes tie . Тем не менее, дальнейшие исследования по разработке сухой элективной питательной среды мы проводили, используя преимущественно среду ДЭ, так как ока отличается наибольшей универсальность», а её питательная основа (дрожжевой экстракт) намечена к широкомасштабному выпуску в блгасайшие годы. Однако не вызывает сомнений, что по море необходимости, можно будет завершить научно-техническую разработку и других ерзд, сконструирован их сухие элективные варианты.

Таблица 2

ПОКАЗАТЕЛЬ УНЙВЙУСАДШОСТЙ ШКОТОШ ИШАТЕШШ. СШД

! Среды! 1 I ; 2 -3 1 4 5 6 7 ! 8 1 1 ! ! 10 ! 11

12 13 ¡12 :з 12 13; 12 13 12 13 12 13 12 13 { 12 13 I 9 !

дЭ 9 0,9 54 0,95 9 1,00 1,45 1,00 а о.зэ 6 1,00 10 1,0 6 0,67 4,74 2,67 7,41

АСЭД 7 0,7 48 0,34 9 1,00 1,32 0,91 9 1,00 8 '1,00 10 1,0 8 0,89 4,45 2,89 7,34

АС Г.ЭД 10 7 1,0 50 0,7 50 С,88 с;ез 8 6 0,89 о;б7 1,38 0,95 0,77 о;БЗ 9 1,00 3 0,33 0 6 0 0,75 5 0,5 9 0^9 2 0,22 6 0^67 4,72 з;и 0,72 2,32 5,44 5^43

пао 5 0.5 52 С,91 5 0,56 0,91 0,63 3 0,33 6 0,75 10 1,0 5 0,56 2,90 2,31 5,21

кэд 9 0,9 Ь7 1,00 7 0,78 0,96 0,66 5 0,56 6 0,75 10 1,0 9 1,0 3,90 2,75 6,65

:-оо 9 0,9 55 0,96 8 0,69 0,99 0,68 5 0,56 7 0,68 10 1,0 9 1,0 3,99 2,88 6,87 £

оэд 5 0,5 42 0,74 б 0,67 1,0 0,69 8 0,89 3 0,38 9 0,9 7 0,78 3,49 2,06 5,55 1

оэо 6 0,6 43 0,75 5 0,56 0,88 0,61 6 0,67 2 0,25 9.0,9 7 0,78 3,19 1,93 5,12

»гаг> Лотт. 6 0,6 47 0,62 9 1,00 1,39 0,96 5 0,56 0 0 I 0,1 I 0,11 3,94 0,21 4,15

1 - Число штаммов, дающих роса' более 50 колоний из 100 микробных клеток при 28 °С „

2 - Среднее количество колоний (для всех штаммов), выросших из 100 микробных клеток при 28 "С

3 - Число цтаммов, формирующих через 4с! часов инкубации при 28 С колонии диекетрои более 1,0 ш

4 - Средний диаметр колоний (для всех штаммов) через 48 часов выращивания при 28 °С (ш)

5 - Число штаммов, даканх при 2Н С рост штаммов с типичной морфологией _

6 - Число штампов, дащих рост более сО колоний из 100 микробных кдаток щи 37 С

7 - Число штаммов, выросших при 37 иС

В - Число штаммов, обеспечивающих через 48 часов инкубации при 37 °С рост колоний диаметром более - - Суммарная оценка универсальности среды при 28 "С

10 - Суммарная оценка универсальности среды при 37 °С

11 - Обиая оценка универсальности среды :2 - Показатель

- Условная опенка

Остановив свой выбор на дрогкевой питательной ерадес необ« ходимо било дать расширенную оценку её веге?ирующмх сройсфэ ко откопени» к возбудителю чу^ш и t fcíHCHM^ ь 5 из возникнут ли осложнения при идентификации культурs выращенных на ней.

В экспериментах использовали 80 музейных штаюв чушого микроба, евдеяенных в 10 различная природных очагеиг к свяичаю»' щжся по минимальным питательна»« потребностей« Исследования проведали б сравнении с агаром Хоттингера.

Полученная информация свидетельствовала о преимуществе ДЭ перид эгой средой по способности обеспечивать рос» кужмур при посевной дозе 100 микробных клеток. Большинство шашен форг®~ ровало на дрожжевой среде через 48 час» инкубации при 28 °С колонии диаметром превышающий 1,5 км с типичной корфологией» адо позволяло легко обнаруживать их при просмотре посевов»

Антигенный состав клеток возбудителя чумы, выращенных ж дротзвоЯ среде, шгаенеивноегь их днхашш при окислении глаже-аы и глпконовой кисдаты, акзигнеегь ферментов углеводного обмене (гексокиназа, альдолаза5 Зюофогемоизошраза), не отличалась ст аналогичных показателей культур» инкубированию? на агара Хсттмнгера.

После десяти последовательных пересевов на ДЭ бактерии чумы сохраняли свои основаке биологические свойства: ферментативную активность по отношению к углеводам, спиртам, мочзвике, яа-кмусову молоку, характер роста на голодно-кислом и беспептонном arapsutv чувствительность к «jarye вирулентность для белых мышей и морских свинок, содержание франции Т.

Провс-дённыо эксперименты позволили сделать вывод, что дрстсевая среда го бактериологическим параметрам соответствует

требованиям, которым должны отвечать среды для диагностики чуда " дояускзе? возможность с высокой эффективностью ссущеата-' яяяь выделение r.pestis- из исследуемого материала. Процесс . ¡вдентификадаи у. дифференциации бактерий, выросших на ДЗ, не представляет затруднений. Это явилось ещё одним аргументом а гсгъгу конструирования дрожжевой элективной среди.

Прк создании подобного рода препаратов приходится сталки-, вет&ся е проблемой избирательного подавления роста вульгарного spesese^acTo загрязнявшего материал, исследуемый на чуму. Причиной служит большая устойшьость протея к раэли<яшм ингибиторам, чем кокковых бактерий, кишечной палочки н другой хонтаки-иирущой фдсрн (ГЛ.Нестерова, 1975; a«P.Xrl«el;j et al 1364). По литературным даикьм г.ротей наиболее чувствителен к генциан-вкоявту (В.Ы.Тумаисяий, I94d),

Мы изучили возможность использования в качесгье элективных факторов 52-х соединений, обладающих антибактериальной активность В их число входили различные красители, ПАВ, ингибиторы гликолиза, терминального дыхания, антибиотики, сульфамидные ярзлараты, производные океияинилина, препараты интрофурансвого ряда. Однако бгыеэ эффективного по избирательному угнетающему действия на протей препарата, чем генциаквиолет, обнаружить не удалось. Поэтому генциенвиолег был использован для придания дрожжевой среде элективных свойств.

В результате многочисленных опытов, в тон числе и с использованием метода математического планирования экспериментов (В.Е. Бирюков, 1969), была сконструирована питательная среда, обеспечивающая надёжное вьделенне возбудитс-ля чуш при наличии в пробе Ю микробных клеток r.pe«ti.a и «леток вульгарного протея.

В материале, исследуемом на заражённость «гумнами бактериями, наряду с протеем и другими чувствительными к гекшенвио-лету микроорганизмами, могут встречаться формы устойчивые к этому препарату. В подобной ситуации можзт существенно снизиться вероятность выделения чистой культуры чукного микроба. Поэтому следовало расширить спектр ингибирующей активности дрок-нэвой среды, дополнив её нов ¡ада элективными факторами.

Необходимый эффект бьи получен при использовании эритромицина, что позволило значительно повысить степень подавления роста сопутствующей микрофлоры и обеспечило надёжное выделение возбудителя чумы из различных объектов при инкубации посевов как в условиях 28 °С, так и при 37 °С.

Последующие эксперименты были посвящены разработке сухого варианта элективной дрожжевой питательной среды» В результате был сконструирован сухой препарат (среда СДЭЧ), не -гребущий при приготовлении рабочих форм -агара взвеашвашя компонентов, осветления, фильтрации5 корректировки рН.; стерилизации аотокла-вяровашем. Среду можно приготовить, располагая лишь источником тепла н водой, что позволяет использовать её в самых иелри-собледаых условиях.

На СДЭЧ растут ауксотртфные мутанты г.рез^в , нуядащие-ся в самых различных аминокислотах, витаминах, что значительно перекрывает спектр питательных потребностей, известный для природных штаммов. На ней формируются попуячции ъоэбудителя чумы с типичны!« биологическими свойствами.

ГЛАВА 3. Разработка набора питательных сред для культивирования возбудителя чумы при 23 и 37 °С Большое число работ, опубликованных в последние годы по проблеме физиологии микроорганизмов, убедительно свидетельствуют, что микробная клетка чрезвычайно пластична, фенотипическая изменчивость её огромна (И.Л.Работиова с соав., 1933; 3 .Р.Маг^оЪ et а1.» 1981; М.Н.Воуор а1. , 1?84; Ь.Д.ОопзаХег еЬ а1,1985; Ь.Иаааоп, В.Но1Ъе1п . 1985; а.Н.ЯПНвоп, О.С„.Го1ш81;оп, 1985). Это заставляет микробиологов пересматривать ряд устоявшихся представлений к самое пристальное внимание уделять вопросам выращивания бактерий, стремясь разработать методики, обеспечивающие управление ростом клеток.

Анализ достижений, накопленных в области культивирования микроорганизмов, позволил наи наметить ¡тучи» ведущие к.управления процессом роста чумного вдакрсба, одним из которых может быть использование набора питательных сред, обладающих высокими вегбгирующига характеристиками в условиях 23 и 37 °С, и в «о же время отличающихся компонентным составом.

Особенностью возбудителя чум; является то, что оптимум температуры для его роста находится ь яределах 27-439 °С, а реализация патогенного потенциала наблюдается в условиях 71, т.е. при 37 °С. Однако размножение у. урпЫе при "той температуре сопровождается увеличением питательных-потребностей (УЛ'.Арышаова с ссав.„ 1900; я.БгоипЦоиг, О.'Аеавокя , 1960), что создает суще- • ственные прзпгтствип для достижения высоких значений скорости роста й выхода бактериальной массы - показателей, которые наиболее г.а.т.нн для сред, используемых при культивировании чумного микроба.

Дня тогсь чтобы повысить вероятность разработки сред с обходимыми вегетирущими свойствами в условиях 37 °С, од испытк-вели:: большое число различных питательных основ, содержащих ез® необходимые для эффективного размнояешш возбудителя чукы соединения, В экспериментах применяли автолиза? сеяезёнки0 гидролиза? белка отрубей, гидролизат белка подсолнечного щрота,, дрозиеаой экстракт, фосфорнокислой®!! гидролиза? кормовых дрожжей^ п'дро-¿шз&т керагосодеряащего сырья8 панкреатический перевар кяса ио Хоттккгеру, казеиновый ридролизат средней степени р&сцегшекия, кукурузный экстракт. Критерием при выборе оптимальной основы служила её способность обеспечивать максимальную удельную скорость роем при 37 °С,

Было обнаружено, что скорость роста чумного микроба в больной степени определяется видом основы и её концентрацией, прячем при использовании всех препаратов отмечалась одинаковая зависимость изучаемого показателя от содержания питательных веществ, которая во всех случаях имела форл^г пика (Рис.1). Подобная форма кривой была обусловлена действием лимитирующих и инги-бирующих компонентов. В стадии повышения скорости роста наблюдается лимитирование недостатком питательных веществ, а в фазе-снижения рост контролирувтся ингибиторами. Однако максимальное значение онороста роста и необходимая для его достижения концентрация основы резко отличались у различных препаратов, что било связано с особенностям», их химического состава. Наибольшая величин,ч показателя скорости роста наблюдалась на средах из автоли-зата селезёнки и дрожжевого экстракта.

Выход бактериальной пассы во всех опытах достигал максимального значения при концентрации ссноеы, превып-ающей оптимальную

(I) ¿ИЗУСТр КОЛОНИЙ, УМ

оос о о о о о о ^ *>-! ГО -с- кЛ СП -з со о *-<

-1—. I I 1.1 > )

(среднее из 20-60 определений)

го

Ч-»-

I—1 I - • 4—I '—I

VI СЛ ~-4

О

О О О О с

(2) Выход бактериальной массы, в млрд/»а среды (среднее из 3-9 определений)

к я по

22 К

К м а

13 с

о «

Ск о

6» & £9 0-1

о

о* О.

в ВЭ

и Я и а

01 о ч ж

ж в о

о к к

№ к к

Я ж о о

4я <»

£ •та V ч

г! (!> X №

сг о

О ж » ТЭ

а £ и

к г и

о м •с

ы (3 01 ф

я а ■а

о вг ы

*»

о •с я

•а *«; о

с: к и

к ж о

о ж

я п

и о 1*

- А2

для скорости poeta культуры. Обнаруженная закономерность была объяснена, «сходя из фактов, имеющихся в литературе (С.Дя.Перт, 1978j Р.Стейниер с соавт., 1979) и свидетельствующих о том, что выход микробных клеток определяется концентрацией лимитирующих факторов и менее чувствителен к ингибиторам, чем скорость, роста.

Полученные материалы дали основание считать, что, используя в качестве единственного источника питательных веществ, препарат с неустановленным химическим составом, практически невозможно сконструировать среду, которая в равной степени обеспечивала бы оптимальные условия для скорости роста чумного микроба и для- выхода бактериальной массы. С целью получения максимально возможного количества микробных клеток необходимо увеличивать концентрацию питательной основы, что приводит к глубокому инги-бировании скорости роста культуры. И, наоборот, при концентрации основы оптимально^ для скорости роста, в среде содержится относительно небольшое количество субстрата, лимитирующего размножение, вследствие чего выход бактериальной массы недостаточно высок.

Казалось бы, что наиболее правильным является дифференцированный подход при конструировании питательных сред для культивирования возбудителя чумы..При получении микробной массы следуем использовать более высокую концентрацию питательной ос-ногыс чем в средах, предназначенных для выращивания чумного микроба из единичных клеток. Однако необходимо учитывать, что при концентрации основы, превышающей оптимальную для скорости роста i.paatiB > последняя контролируется ингибиторами, а это неизбежно отразится на фенотипе растущая пепуляши к осложнит получение сравнимых результатов при изучении биологин возбудителя чумы.

■ С нашей точки зрения, при конструировании питательных сред для выращивания чумного микроба, прежде всего, следует исходить из способности среды обеспечивать высокую скорость роста бактерий» Выход жз микробной массы целесообразно повышать, не увеличивая концентрацию основы, т.е. не вводя ингибиторы, а дополняя состав среды факторами, лимитирующими размножение. Это позволит сохранить скорость роста культуры ка прежнем уровне и одновременно увеличить йькод микробных клеток.

Поэтому для повыпения выхода бактериальной массы необходимо било провести исследования по идентификации факторов, лимитирующих размножение возбудителя чуми при 37 °С на средах из автолизата селезёнки и дрожжевого экстракта, поскольку эти препараты обеспечивают максимальную скорость роста культура а по-лучшнал информация позволит осуществить целенаправленную оптимизация их по уровню микробного урожая«

Эксперименты показали, что лимитация выхода бактериальной массы возбудителя чумы при 37 °С йызвака одним из следующих соединений: цистеин, метионин, лейцин, изолейцин, треонин, аргинин, урацил, СаС^, углеводы (глюкоза, ксилоза). Хараетер лимитации зависел от аухсотрофноети штамма, вида и серии питательной основы.

Бал отмочен факт, что. все, идентифицированные нами, лими-тирувщмз компоненты входят в число соединений, отнесённых к числу незаменимых для х.ревЫа (У.ТДрнклаева с еоаьт., 1978, 1979). Поэтому вполне логичным представлялся вывод, что, с нельм увеличения микробного урожая, среды необходимо обогащать теми химическими веществами, по отношению к ксторчм чумной микроб является ауксстрофом, причем их перчень должен быть макси-

мгльно широк, поскольку а связи с большм диапазоном шташовых различий в питательных потребностях т„рев«з (И.Л.Мартнневсхнй, Д.М.Оседчая, 15635 Я.Н.Классовскнй и др., 1970} Л.А.ПеИсахис, В.М.Степанове 197В) и недостаточной стандартностью комплексных питательных препаратов, только в этой случае можно охватить весь возможный спектр лимитации.

Наиболее аффективный путь, ведущий к достижению подобного результата, нам видеися в обогащении автолиза^а селезёнки и дрожжевого экстракта препаратами природного происхождения, содержащими весь набор химических соединений, в которых нуждается большинство штаммов возбудителя чумы. К числу их мокко отнести гидролизат белка отрубей» гидролизат белка подсолнечного шрота, казеиновый гидролизат, фосфорнокчслотный гидролизат кор~ мовнх дрояокей, перевар мяса по Хоттингеру.

Использование для оптимизации различных коыплекеннх питательных основ, наряду с возможностью более полно и с меньшими затратами охватить весь спектр возможной лимитации, позволит, как мы надеялись, сконструировать набор питательных сред, отличающихся по своему составу и обеспечивающих высокие показатели скорости роста и выхода бактериальной массы чумного микроба в условиях 37 °С.

Проведённые исследования позволили разработать семь пита-, тельных сред, обладающих высокими ввгетирутщиыи свойствами при 37 °С (среды СО, СК, 01, ДХ, ДК, Д1, ДС). Основным источником питательных веществ в средах СО, СК, СП служит аатолизат селезёнки, в средах ДК, ДХ, ДП, ДО - дрожжевой экстракт. С целью увеличения концентрации лимитирующих выход бактериальной массы факторов в состав сред вводится дополнительно казеиновый гидро-

лизат ССК, ДК), гидрол.чзат белка пкеиичннх отрубой (СО, ДО), гч-дролиэат белка подсолнечного шрота (СП, Д1), перевар по Хоттчн-гору (ДХ).

Eco ерздн обеспечивают интенсивный рост T.poacis яр: 37 °С, о чзи свидетельствует-уровень выхода бактериальной массы» (2,06,0 млвд« 1Мкробных iuistok с I мп ерэды) м диаметр, Формирующихся на них через 72 часа иняуо'ации колоний (1,9-3,0 vu). На средах растут ауксотрофшо мутанты возбудителя чукы, испытывающие потребность в лейцине, гистидиче, глицерине, пролине, рибофлавине, урециле, сорине, фзнилая&ншт5 тиамине, кикотушамнде, петио-кгае9 пантотенате Са, глутаминэво:5 кислоте, аспарагкновой кислоте, аргинине, кзолейциноо грбоккнэ, цисгеина, триптофане, лизине» аденинв» гуашке» пуринах, шримидинах, Bg. Однако выход микробной массы этих штаммов существенно различается я зависят от вида использованной питательной срады. Полученная информация позволила предвоасить наиболее вероятную схему лимитации для каадой из сред, что, кожно надеяться, повысит эффективность проведения экспериментов по идентификации компонентов среды, ограничивающих выход микробной иассы различных природных штатов чумного микроба с известными питательими потребностями.

Разработанные среды изготавливается из дсступкого сырья, технология их приготовления просто и мохет быть легко воскрскз-ведена а лабораториях питательных сред противочумных институтов.

ГЛАВА 4. Влияние температуры культивирования, состава питательной среды нь некоторые биологические свойства чунного микроба -Имеющиеся в литературе данные свидетельствуют о высокой пластичности метаболизма чумного микроба, о зависимости его фенотипа от компонентного состава питательной среды и температуры культивирования (Б.И.Вейнблат, Е.Э.Бяхрах, 1968; В.С.Рудник, 1580; Н.ЯДЧиманюк, Б.Н.Ыиианькин, 1983; С.О.Водопьянов, И.П.Олейников, 1990; ^.Т.СЬвгоаггку, й.К.ВгиЪакег, 19У2). Однако О'ольшин-ство таких сведений получено на средах, обладающих при 37 °С низкими Бегетлруюш'ми качествам, а резкое снижение скорости роста и голодание культуры, само по себе, накладывает существенный отпечаток на свойства формирующейся популяции (И.й.Хмель, 1570; И.Л.Работнова, 197Е; Л.Г.Яцаноьа, 1977). Поэтому было необходимо исследовать влияние температуры при выращивании возбудителя чумы на средах, обладающих высокими вегетирующнми характеристиками в условиях 28 и 37 °С. Кроме этого, следовало изучить различные биологические свойства 1,ревЬ1з при культивировании на средах СО, СК, СП, ДК, ДХ, ДО, ДО и определить оптимальные режимы инкубации (вид питательной среды, температура), обеспечивающие формирование популяции с необходимыми бактериологическими параметрами.

Результаты, полученные при исследовании скорости роста, выхода бактериальной массы, дыхательной активности чумного микроба, свидетельствовали о высокой эффективности метаболизма возбудителя чумы на разработанных средах в условиях 37 °С. Установлена принципиальная возможность получения при 37 °С такого не выхода микробной массы, как и при 28 °С. Тем не менее, материал

давал основания считать нереальным достижение клетками при 37 °С тех значений скорости роста, которые возможны при выращивании бактерий в условиях 28 °С, и подтвердил, что температура 37 °С превышает оптимальную для роста 1<,рвзк1в . Увеличение температуры южубщзди с 20 °С до 37 °С приводила к снижении эф^ктив-ности конструктивного метаболизма и в то же времп сопровождалось повышением интенсивности дыхания клеток. Подобный эффект, пс мнению И.Н.ПомозгоеоЬ (1974), свидетельствует о карупении корреляции медгу процессами анаболиама и катаболизма, что должно способствовать усилению синтеза продуктов вторичного метаболизма.

Исследование антигенного спектра чумного микроба с помощью методов двойной иммунодиф^узии, линейного и перекрёстного имму-ноэлекгрофорезов показало, что он н очень большой степени зависит от условии выращивания бактерий и существенно кзкакяотся при перемене температуры инкубации, вгща питательной среды» & 45 выявленных антигенов, только 16 обнаруживались у всех кссле-доиенных субкультур. Остальные 27 синтезировались ликь при определённых условиях выращивания. Это свидетельствовало о необходимости правильного выбора условий культивирования при выделении отдельных антигенов у.розИв и о целесообразности использования разнообразных режимов выращивания при изучении антигенного состава возбудителя чумы. Применение найора разработанных наг.® питательных сред, обеспечивает более полную бенот.ипичесчул реализации свойств, заложенных в геноме клетки,и может способствовать . большей зф»$зктивности исследований, связанных с антигенным составом чумного микроба,

Содержание уд -антигенов попыталось в поздние сроки разви-тгя культуры Г.роз1и.5 а достигало наибольшей величины ка 8-9 с.угкн выраг!ипэкия при 37 К этом;/ времени на всех средах на-

нашивалось одинаковое количество антигенов, т.е. состав среды кз оказывал влияния на кх синтез. Продукция УЯ - антигенов отвечала критериям, предложенным Ы.П.Ховрычевым (1934), что позволило отнести эти соединения к вторичным метаболитам возбудителя чумы. С целью получения - антигенов целесообразно использовать среды ДК и Ж, так как на них синтезируется минимальное количество фракции I, что долено облегчить зыделение и очисткуV® -антигенов.

Эксперименты по определению фракции I свидетельствовали о том, что максимум накопления этого клеточного компонента наблюдается на третьи сутки иккуоадми при 37 °С ч о чрезвычайно высоком различии способности сконструированных сред обеспечивать продукцию данного антигена. Наибольшее количество фракции I синтезировалось на средах СО и СП„ наименьшее - на ДК и ДХ (Табя.З). Различие бато выражено настолько, что в культурах, выращенных на среде Ш при 28 °С, содержалось такое же количество антигена, как на ДО при 3? °С. Следовательно, температурный фактор не является безоговорочно ведущим в регуляции синтеза фракции I. Нз в меньшей степени продукция антигена регулируется составом пита* тельной среда. Как и та - антигены, фракции I можно было причислить к вторичным метаболитам возбудителя чумы.

При определении оптимальных условий получения «мылиного" токсина чумного микроба было установлено, что для его накоплении целесообразно использовать среды СО и ДО, а инкубацию бактерий проводить при 26 °С.

Культуры Т.рбаПа , выращенные на средах ДК, ДХ, ДО, несмотря на значительные отличия в содержании такого высокопротек-тивного антигена, как фракция 3, были равноценны по своим им-

Таблица. 3

Содержание фракции 1 чумного микроба (ЕВ) в культурах, выращенных а различных условиях

! Максимальное разведеииз I млрд. суспензии, обеспечивавшее положительную Питательная ! реакшю агглютинации

среда | ШЛА | РНАт .

? з? °с ; 23 °С ! 37 °С \ 26 °С

СО 33 550 ООО 4 100 524 ООО I 024 ,

01 4 190 ООО 32 700 524 ООО 4 С96 £

ск I 050 ООО а 200 66 ООО 512 '

да К ООО 2 6 ООО I

дх 16 ООО 255 33 ООО 8

до 66 ООО 16 8 ООО 4

дя 260 ООО 64 . 16 ООО 16

ЛХАТ I 050 ООО 512 131 ООО 32

мунэгекчш свойствам. Температура, состав питательной среды существенного влияния на значения ЕД^д не оказывали. На всех средах D как при 37 °С, так и при 28 °С формировались популяции, обладающие зысокой икцуногенностью для лабораторных животных.

Выраженный иммунный ответ на введение неболыясго количества микробных клеток может быть получен только при условии размножения бактерий э макрооргачизме. Поэтому, учитывая выявленное нами отсутствие зависимости иммуногенкссти культур от содержания фракции I, можно было предположить, что развитие клеток в организма лабораторных животных приводит, под влиянием условий i» vivo „ -к перестройке их метаболизма и нивелированию различий в фенотипе, в том числе и по содержанию фракции I.

. Это предположение было подтверждено экспериментально. Оказалось, что титры антител к фракции I у белых мыпей, иммунизированных живыми культура!.« возбудителя чумы, выращенными при 28 °С, не нихе, чем у животных, иммунизация которых проводили клетками, инкубиррваиныни при 37 °С. В то яз время, при иммунизации белых мышей убитыми бактериями,титры антител к фракции I были значительно выше в том случае, если клетки выращивались при 37 °С и содержали большее количество антигена.

Поэтому можно считать, что размножение чумного микроба в организма восприимчивого животного сопровождается нивелированием различий в содержание фракции I, которые были в культурах перед введением их в макроорг&иизм. Вполне вероятно, что подобные изменания пюисходят и со многими другими клеточными компонентами.

Известно, что иммуногенность возбудителя чумы зависит от содержания жизнеспособных клеток в популяции (А.И.Тинкер с соаьт., 1966). Нами было установлено, что наибольшей жизнеспособностью

обладают нультуры, инкубированные при 23 С,и в опытах со средами СО, СК„ СП показало, что в этом случае они более иммуногешш. Максимальная жизнеспособность при 23 °С отмечалась на среде СО, что позволило рассматривать ей как наиболее перспективную для получения иммутогенных псяуляций чумного млкроба.

Как и в случае с иммуногенностыэ, вирулентность возбудителя чумы коррелировала с процентным содержанием живи* клеток в культуре и полуденные данные свидетельствовали о необходимости использования режима 28 °С при определении Ш ^ культуры.

Было установлено влияние состава питательной преды и температуры инкубации на результат по определению №К антибиотиков. Отмечено уменьшение чувствительности т.рззиз к доксициклику, рр-фампицину, гентамицмну и увеличение её к стрептомицину при изменении темперагурч от 20 °С до 37 °С. Это свидетельствовало о необходимости максимальной стандартизации условий зыращивалкя чумного микроба прк исследовании его чувствительности к антибиотикам я, в частности, по такому параметру, как температура культивирования.

Полученные нами сведения позволили предложить схему (Табл. 4), руководствуясь которой становится возмсжнем с большей ¡эф— фзктивиостыо .решать некоторые вопросы, связанные с культивированием г оз будите л я чумы. Несомненно, что используя срег.ы ЛД, ДХ, да. ДО, СО» СК, СП,появляется возможность более продуктивно подходить к реализации не только тех задач, которое служили объектом нашего изучения, но и целого ряда других проблем.

Таблица 4

Условия выращивания возбудителя чуш, обеспечива-сщк& получение поцудяцнй со свойствами, необходимыми при реашши некоторых биологических задач

£ л «! 5 С 6. 1° 10 к «3 к 11 Ч № ^ е. В 8! 3 0 Ф 5 Н С* Цель выращивания

Изучение антигенного состава Выделение фракции I Получение - анти- | генов » О о йо и И ° Зя О д * и р< £ д ч _ <0 о & ю <59 а о ® й к Ф !? о ч ао Ю р. 0! 5£>ь й н о щ « к Получение высокоимму-ногенных популяций «1 0) л к Мёа в е< я оо к Ч.Н к к «о»« р,т о о Б к <55 я»

АД 28 37 н- + + + + +

да 26 37 + + + +

да 28 37 + + + +

до 2В 37 +■ + +

со 28 37 + + + + + +

СП 26 37 + + г + •

ск 23 3? + + +

основанный на измерении радиальной скорости роста сферических колоний чумного микроба.

б. С использованием новых питательных основ сконструировано девять диагностических сред для возбудителя чумы и показано, что по своей уъивзрсальности они превосходят агар Хотткнгера. Наибольшей универсальностью обладают среды из дрожжевого экстракта и ав~ толизата селезёнки. Дро.таевая среда обеспечивает рост штаммов чумного микроба из различных природных очагов и обладающих разнообразным!* питательными потребностями. Культуры, выращенные на ней, характеризуются высокой физиологической активностью и сохраняют все оснозные свойства, используемые при ди^еренциальной диагностике.

.7. Разработана элективная дрожжевая среда, обеспечивающая в условиях £8 °С и 37 °С выделение чистой культуры чумного микроба из материала, загрязнённого посторонней микрофлорой при наличии в проба 10 микробных клеток возбудителя чумы. Отработаны технология изготовления среды в сухом виде и способ её приготовления из сухого порошка, позволяющий использовать среду в сауых неприспособленных условиях.

В. Предложен новый методический подход, позволяющий получать среды, обеспечивающие одновремзнно высокие скорость роста и выход бактериальной массы чумного микроба, заключающийся в обогащении исходной среды предварительно идентифицированными факторами, лимитирующими уровень микробного урсл;ая. С использованием этого метода сконструировано семь питательных сред для культивирования возбудителя чумы, обладающих высокими вегетирующини свойствами при температуре °С и 37 °С и отличающихся своим компонснткнм составсы. Все среды изготавливаются из доступного сырья.

Э„ Установлено, что при 3? °С наблюдается нарушение корреляции между процессами анаболизма и катаболизма у чумного микроба, выражающееся в снижении jll культуры и одновременной увеличении интенсивности дыхания клеток. Подобный эффект приводит к повшению синтеза вторичных метаболитов возбудителя чумы. К их числу uoscho причислить фракни» I, v/i - антигены.

10. Определены условия (состав среды, температура и продолжительность инкубации"), обеспечивающие максимальную продукцию фракции I, v.v - антигенов, .шпичого" токсина чуююго микроба* Бри выделении у;?- антигенов культуру следует выращивать в течение 6-9 суток при 27 °С на средах ДК или ДХ. Максимум синтеза фракции I наблюдается через 72 часа инкубации при 37 °С isa средах СО или СП. Сптичальные условия дли получения «ишганс-го* токсина характеризуются следуюцяки параметрами: среда СО или ДО, температура - 28 °С, продолжительность выращивания - 'й часов.

11. Показано, что антигенный спектр возбудителя чумы в большой степени зависит от состава питательной среды, температуры культивирования. Из выявленных 45 антигенов, только 18 обнаруживаются .у всех исследопанкых субкультур'. Остальные 27 синтезируются лишь при определённых условиях инкубации.

12. Обнаружено» что иммукогенность культур T»peatia t зы_ ращенных Па питательных средах пр:: 37 °С, несмотря на значительно большее количество фракции I, ниже, чем инкубированных в условиях 2В °С. Это связью с перестройкой фечотипа бактерий при размножении в чунствительном макроорг-иизме и нивелированием различий в содержании фракции I, которые обнаруживались vitro . Более высокая иммуногенность популя:;ий, ку:ьтиаироввн-

ных при 28 0 С, связана с большим процентом живых клеток.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ ОТРАЖЕНО В СЛЕДУПДИХ РАБОТАХ:

1. 'Перемет О.В. Характер роста чумного микроба на плотной дрожжевой питательной среде.//Проблемы особо опасных инфекций.-Саратов, 197Б.-выл.4.-С.28-31.

2. Милютин В.Н., Шеремет О.В., Оленмчэва Л.С., Хазан U.A. Питательная среда для выращивания чумного микроба //Авт.свид. № 8Ô062I, 1981.

3. Шеремет О.В., Копылов В.А. Скорость радиального роста колоний чумного микроба - критерий оценки удельной скорости роста культуры //Вопросы профилактики природноочагозых инфекций.-Саратов, 1933.-0.13-16.

4. Шеремет О.В. Зависимость скорости роста и Еыхода бактериальной м&ссы Yersinia pestle при 37 °С от концентрации некоторых питательных основ //Диагностика и профилактика особо опасных инфекций.-Саратов, 1983.-0.48-53.

Ь. Шеремет О.В., Ыилютин Б.Н., Каччух A.A., Корганов Я.Н. 0п7имиэация условий культивирования чумного микроба на дрожжевой среде при 37 °С. //Иикробиол.., генетика и иммунология чумы и холеры—Саратов, 1983.-СЛ6-20.

ü.Милютин В.Н., Хазан U.A., Канчух A.A., Рыкова S.A., Шере-мат О.В., Матова H.H. Влияние компонентов гидролкзата Хоттинге-ра на выход биомассы чумного микроба с плотной дрожгевой среды при 37 °С.//Рукопись депонирована во ВИИИкШ МЗ СССР, * 03У5-ЙЭ.-

Мед.рзферативный журнал.-1983.-раздел Ш.-¡НО.-публ. 3062.

7. Милютин В.Н., Фоменко И.М., Рожков Е.В. и др. Способ получения белкового гидролиза?а из подсолнечного трота //Авт. свзд. № 1031843, I9Ö3.

8. Шеремет О,В., Рыжков B.D. Факторы, лимитирующие выход бактериальной массы чумного микроба ирн 37 °С иа средах из дрожжевого экстракта //Проблемы биотехнологии, микробиологии и иммунологии особо опасных инфекций.-Саратов, 1984.-С. 15-17.

9.' Милютин В.Н., Карташёва Л.Д., Крамаренко В.В,, Шеремет О.В. Способ получения белка из отрубей //Авт.спид.

№ I177966, 1985.

10. Милотин В.Н., Копылов В,А., Бурякоа В.Г., Иеремзт О.В. и др. Способ получения питательной основы микробиологических сред. // Авт.свид. № 12222676, 1965.

. II. Шеремет О.В., Мщготин В.Н., Корг&нов Я.Н., Копылов В.А. Вирулентность, жизнеспособность и чувствительность к антибиотикам возбудителя чумы при выращивании на некоторых питательных . средах при 28 °С и 37 °С.//Журн. иикробиол., эпьдемиол. и иммунобиологии. -i960. -«б. -С. 5 3-56.

12. Шеремет О.В., Милютин З.Н., Корганоз Я.Н., Канчух A.A., Рожков 2.В. Некоторые показатели роста чушого микроба на питательных средах при 23 и 37 °С. //Лабораторная диагностика, биохимия ч спзцифич. профилактика чумы и холера.-Саратов, 1966.-G.8-I3.,

13. Шеремет C.B., Некляэа З.К., Котлов S.A., Какчух A.A. Антигенный cocvaa чумного микроба, выраженного на некоторых питательных средах при 28 и 37 °С ///¡урн. микробнол., эпидемиол. и иммунобиологии.•• ¡93/.-И.-С.III - 112.

14. Шеремет О.В., Терентьев А,H., Цатова U.K., Морозова Л.Н, Содержание фракции I и v.;- антигенов в культурах чумного микро-бав выраженных на средах At, ДК, Д1./Дурн. микробиол., отщеми-ол. и иммунобиологии.- 1967,- ,'Гб._С. ib-22.

15. ДЬремет О.Ь., Милютин В.П., Терентьев А.Н., Морозова Л.Н.. йммуногенноеть чужого микроба, выращенного на некоторых питательных средах при 2Ь и 37 °С /Дурн. микробиол., зпидзмиол. к иммунобиологии.- 19Ь7.-С.63-68.

16. Копылов Б.А., ИЬремет О.В., Махмудова А.А., Х&эан М.А. Новая питательная основа из непищевого сырья для микробиологических целей. //Проблемы медицинской и санитарной микробиологии г.Ростова-на-Дону. - Ростов-на-Дону, IS87.-C.93-S4.

,17. Милютин В,К», Картаыёва Л.Д., Крамаренко Е.В., Шеремет О.В. Способ получения белка из отрубей // Изобретательство и рационализация в медицине.-M., 1987.-С.67-70.

:а. Терентьев А. h., Be ренет О.В., Богданова Я.И., Морозова JI.H. Некоторые биологические свойства бактерий вакцинного штамма T.pastis ïV 7ô при росте на различных питательных средах. //Актуальные вопросы разработки препаратов мед. биотехнологии.-Махачкала, I960.-С. Кб-ЮТ.

19. Шеремет О,В., Коргансв Я.Н., Терентьев А.Н., Шатова И.Н. Среды для культивирования возбудителя чуш при температуре 2а -37 °С //Актуальные гспроси разработки препаратоз мед. биотехнологии. -Махачкала, I9bb„-C.I0d-IÛ9.

20. Шеремет О.В., Милютин 3.1'.., Копылов В. А., Терентьев А.Н., Некляез ВЛ. Питательные среды из экстракта кормовых дрожжей для выращивания чушого микроба при 37 °С. //Актуальные вопросы разработка препаратов мед.биотехнологии.-Махачкала, Г9йЬ. —G.116—IIci.

21. Изргиэт O.D., Ногшлов В.А., Картопёвв Л.Д., Рыжков B.D., Харабодоишт Г.Д., Богданова И.И, Элективные питательные среды для выделения чужого микроба //Разработка и производство препаратов мзд.биотехнология.-Махачкала, ГЭ90.-Ч.2.-С.6-7.

РОУС. 5як. 881. 1,ф. 120.