Разработка научно-прикладных направлений совершенствования иммунобиологических препаратов для профилактики холеры и бешенства

Никифоров, Алексей Константинович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка научно-прикладных направлений совершенствования иммунобиологических препаратов для профилактики холеры и бешенства
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Разработка научно-прикладных направлений совершенствования иммунобиологических препаратов для профилактики холеры и бешенства"

НИКИФОРОВ Алексей Константинович

На прш си

РАЗРАБОТКА НАУЧНО-ПРИКЛАДНЫХ НАПРАВЛЕНИЙ СОВЕРШЕНСТВОВАНИЯ ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ХОЛЕРЫ И БЕШЕНСТВА

03.02.03 - микробиология 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

005546257

Саратов - 2014

005546257

Работа выполнена в Федеральном казенном учреждении здравоохранения «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб») Научный Кутырев Владимир Викторович

консультант доктор медицинских наук, академик Российской академии

медицинских наук

Федеральное казенное учреждение здравоохранения «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, директор

Официальные Борисевич Сергей Владимирович оппоненты: доктор биологических наук, профессор,

Федеральное государственное бюджетное учреждение «48 Центральный научно-исследовательский институт» Министерства обороны Российской Федерации, начальник института Швиденко Инна Григорьевна доктор медицинских наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Саратовский государственный медицинский университет им. В.И. Разумовского»,

кафедра микробиологии с вирусологией и иммунологией, профессор кафедры Щербаков Анатолий Анисимович доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова»,

кафедра микробиологии, биотехнологии и химии, профессор кафедры

Ведущая Федеральное казенное учреждение здравоохранения

организация: Ставропольский научно-исследовательский

противочумный институт Федеральной службы по защите прав потребителей и благополучия человека, г. Ставрополь

Защита состоится «21» мая 2014 г. в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 002.146.01 в Федеральном государственном бюджетном учреяедении науки Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук по адресу: 410049, Саратов, проспект Энтузиастов, 13. Тел./факс (8452) 970383.

Автореферат диссертации размещен на официальном сайте Минобрнауки РФ.

Диссертация и автореферат диссертации размещены на сайте ИБФРМ РАН: http://ibppm.ru/dissertacionnyy-sovet/

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБФРМ РАН.

Автореферат диссертации разослан «¿Г'» тО 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук

¡Шо^

Н.Н. Позднякова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В современных социально-экономических, миграционных и эпидемиологических условиях при перманентной регистрации новых инфекционных заболеваний, возвращении «старых» нозологий и угрозе их глобального распространения необходимость разработки средств специфической профилактики опасных инфекционных болезней приобретает особую актуальность. Согласно Международным медико-санитарным правилам (2005) легочная чума, холера, желтая лихорадка, геморрагические лихорадки Эбола, Ласса, Мар-бург и еще целый ряд инфекционных болезней могут спровоцировать чрезвычайную ситуацию международного значения в области общественного здравоохранения. Таким примером является масштабная эпидемия холеры на Гаити в 2010-2013 гг., где зарегистрировано 679637 больных холерой, из которых 8297 умерли (vvvvvv.who.int/csr/don/2010_10_26/ru, www.rg.ru/2011/05/1 l/holera-dok.html;

http://rospotrebnadzor.ru/epidemiologic_situation). Практически ежегодно завозные случаи холеры регистрируются в Российской Федерации (доклады Главного государственного санитарного врача за 2000-2011 гг.). В указанных докладах отмечается напряженная эпизоотологическая обстановка в России по бешенству. По данным Роспотребнадзора за антирабической помощью в лечебно-профилактические учреждения страны ежегодно обращаются более 400000 человек.

Таким образом, необходима разработка новой стратегии борьбы с чрезвычайными эпидемическими ситуациями, которая должна вобрать в себя основные достижения теории и практики управления инфекционными болезнями и обогатить их новыми технологиями индикации, дифференцирования и профилактики (Они-щенко, 2006; Кутырев, 2006; Щуковская, 2011).

Наиболее эффективными средствами профилактики опасных инфекционных заболеваний являются медицинские иммунобиологические препараты (Медуни-цын, 2004; Кутырев, 2006). Экспертами Всемирной организации здравоохранения на фоне эпидемии на Гаити рекомендована вакцинация населения против холеры (wvvw.who.int/immunization/pp_cholerae_ru.pdr). Для постэкспозиционной профилактики бешенства предложен антирабический иммуноглобулин в сочетании с культуральной вакциной. В нашей стране для профилактики холеры применяется вакцина холерная бивалентная химическая, бешенства - гетерологичный антирабический иммуноглобулин производства ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб».

В настоящей работе подведены итоги научно-экспериментальной работы за период с 1999 по 2012 гг. На начало исследований технология производства холерной вакцины (ХВ) нуждалась в существенной модернизации. Применяемые для производства холерной вакцины биореакторы не обеспечивали необходимый уровень биологической безопасности, а объем биомассы, получаемый в процессе глубинного культивирования, не соответствовал планам производства данного профилактического препарата. В производстве ХВ для культивирования штаммов холерного вибриона (Vibrio cholerae) по существующей технологии в основном

применяли дорогостоящие питательные среды на основе мясного перевара по Хот-тингеру и панкреатического гидролизата казеина с пептоном. Нестандартность исходного сырья не позволяет получать биомассу холерного вибриона и протек-тивные антигены в необходимом количестве. В то же время использование для глубинного культивирования питательных сред импортного производства («Hime-dia», «Merck») увеличивает себестоимость холерной вакцины в 1,3 и 1,8 раза, соответственно.

Во исполнение решения межведомственной комиссии Совета Безопасности Российской Федерации по охране здоровья населения (№ 1 от 24.10.2000 г.) и поручения Главного государственного санитарного врача Российской Федерации за № 2510/12020-99-26 от 09.11.99 г. в ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» организовано производство шггирабического иммуноглобулина (АИГ). Для получения иммуноглобулина была использована технология фракционирования, разработанная М.А. Селимо-вым (1957). Применяемые в данной технологии баромембранные процессы не соответствовали современным требованиям производства и не могли гарантировать получение стандартного высококачественного препарата. Апробированные методы работы с фиксированным вирусом бешенства (Rabies virus) не обеспечивали в полной мере требований Санитарных правил 1.3.1285-03. На момент начала работы в Российской Федерации не существовало нормативных документов, детально описывающих операционные процедуры при масштабной производственной работе с фиксированным R. virus. В процессе производства АИГ на этапах контроля сывороток и готового препарата безальтернативно использовали реакцию нейтрализации вируса бешенства на белых мышах, что существенно увеличивало время регламентных процедур и повышало себестоимость конечного продукта.

Таким образом, традиционные технологии выпуска холерной вакцины и анти-рабического иммуноглобулина не удовлетворяли современным требованиям, предъявляемым к производству медицинских иммунобиологических препаратов (МИБП).

На основании вышеизложенного, определяющего актуальность выбранного исследования, были сформулированы его цель и задачи.

Цель работы: разработка научно-прикладных направлений совершенствования производства медицинских иммунобиологических препаратов для профилактики особо опасных инфекционных болезней бактериальной и вирусной природы на примерах вакцины холерной бивалентной химической и гетерологичного анти-рабического иммуноглобулина.

Основные задачи исследования:

1. Сконструировать и апробировать в полупромышленных условиях питательные среды на основе автолизата пекарских дрожжей и гидролизата фибрина для экспериментального культивирования вакцинных вариантов возбудителей особо опасных инфекций бактериальной природы на модели производственных штаммов V. cholerae.

2. Определить условия культивирования и биологические свойства производственных штаммов V. сИокгае, а также провести сравнительный анализ уровня продукции протективных антигенов, полученных в условиях глубинного культивирования на сконструированных питательных средах.

3. Спроектировать и сконструировать биореактор с высоким уровнем биологической защиты персонала и окружающей среды при глубинном культивировании производственных штаммов возбудителей особо опасных инфекционных заболеваний на примере вакцинных вариантов холерного вибриона.

4. Провести сравнительную оценку биологических свойств производственных штаммов V. сИокгае, полученных в условиях глубинного культивирования на экспериментальном биореакторе, а также изучить иммунохимические, физические и биохимические свойства протективных антигенов, полученных с помощью разработанного ферментационного оборудования.

5. Разработать комплекс мер, направленных на обеспечение безопасности экспериментатора и окружающей среды при производстве противовирусных препаратов на модели антирабического иммуноглобулина при работе с фиксированным вирусом бешенства.

6. Сконструировать и апробировать в промышленном производстве эффективную фильтрационную технологическую линию для получения стандартных и качественных коммерческих серий противовирусных медицинских иммунобиологических препаратов на примере гетерологичного антирабического иммуноглобулина.

7. Разработать на базе коммерческого антирабического иммуноглобулина ма-лореактогенный препарат на основе Р(аЬ')2-фрагментов, создать эффективную технологию получения Р(аЬ')2-фрагментов, провести сравнительную оценку физико-химических и биологических свойств разработанного препарата и экспериментально обосновать перспективу его применения для конструирования профилактического иммунобиологического противовирусного лекарственного средства.

8. Изучить возможность применения тест-систем на основе дот-иммуноанализа в производстве противовирусных препаратов для определения уровня вирус-нейтрализующих антител у животных-продуцентов на модели гетерологичного антирабического иммуноглобулина.

Научная новизна работы.

На основе изучения культурально-морфологических свойств производственных штаммов холерного вибриона впервые разработана технология их культивирования, обеспечивающая получение качественных протективных антигенов. Технология базируется на применении при глубинном культивировании оригинальных питательных сред на основе дрожжевого авголизата (оптимальное содержание аминного азота в питательной среде 0,03-0,05%) и гидролизата фибрина (оптимальное содержание аминного азота в среде 0,1-0,12%). Приоритетность выполненных исследований по разработке новых питательных сред подтверждена патентом № 2425866 РФ, приоритет от 27.05.2010 г.

Впервые спроектирован и разработан биореактор с верхним магнитным приводом и системой постоянного мониторинга для глубинного культивирования промышленных штаммов холерного вибриона. На основе изучения биологических свойств холерного вибриона и специфической активности протективных антигенов, полученных в результате выращивания штаммов V. cholerae, разработана методика глубинного культивирования (на модели холерного вибриона) промышленных штаммов возбудителей особо опасных инфекционных болезней (патент на полезную модель № 86184 РФ, приоритет от 4.05.2009 г.).

Впервые на модели коммерческого противовирусного препарата (антирабиче-ского иммуноглобулина) разработана научно-методическая основа для проектирования и создания универсальной системы каскадной фильтрации. Система включает в себя предварительную, глубинную, депирогенизирующую фильтрации с ультрафильтрационным модулем. С использованием данной технологии противовирусный препарат получается более высокого качества со стандартными специ-фикационными характеристиками.

Впервые научно обоснован и экспериментально подтвержден комплекс мер, направленных на обеспечение безопасности экспериментатора и окружающей среды при масштабных манипуляциях с фиксированным вирусом бешенства. Дана детальная характеристика фиксированного вируса бешенства, определены наиболее опасные лабораторные манипуляции при выполнении регламентных работ с рабическим антигеном, разработаны стандартные операционные процедуры. Результаты данной работы явились научным обоснованием для разработки методических указаний «Безопасность работы с производственными штаммами фиксированного вируса бешенства» МУ № 3.3.1.1099.

Впервые разработана и предложена на основе дот-иммуноанализа оригинальная методика оценки уровня вируснейтрапизующих антител в сыворотках крови животных-продуцентов, вакцинированных пациентов, а также коммерческом препарате гетерологичного антирабического иммуноглобулина (патент на изобретение № 2360252 РФ, приоритет от 09.04.2008 г.). На основе сравнительного анализа впервые определена корреляционная зависимость между результатами традиционной реакции нейтрализации вируса бешенства в тесте in vivo и данными, полученными с помощью сконструированной тест-системы на основе дот-иммуноанализа для применения in vitro. Коэффициент корреляции между тест-системой на основе дот-иммуноанализа и реакцией нейтрализации составил 0,9.

Разработана оригинальная экспериментально-обоснованная эффективная технология получения ареактогенных противовирусных профилактических препаратов (на модели гетерологичного антирабического иммуноглобулина) на основе Р(аЬ')2-фрагментов, включающая ферментативный гидролиз коммерческого препарата, отделение Р(аЬ')2-фрагментов от константной части молекулы иммуноглобулина с использованием хроматографии и финишное лиофильное высушивание.

Практическая значимость исследования.

Работа имеет прикладную ориентацию и посвящена совершенствованию дей-

ствующих производств иммунобиологических препаратов для профилактики холеры и бешенства. Предложены оригинальные технологические и микробиологические решения, внедрение которых в производство МИБП вносит значительный вклад в развитие здравоохранения и укрепления санитарно-эпидемиологического благополучия Российской Федерации. В результате инновационных технологических решений снизилась зависимость Российской Федерации от препаратов импортного происхождения и, следовательно, повысилась лекарственная и экономическая безопасность страны.

Разработана технологическая линия по производству антирабического иммуноглобулина из сыворотки крови лошади, обеспечивающая выпуск качественного препарата. На данный препарат составлена и утверждена нормативно-техническая документация (регламент производства ПР № 01898109-26-10, фармакопейная статья предприятия ФСП 002639/01-250210). Антирабический иммуноглобулин зарегистрирован Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития (регистрационный № 002639/01) и внедрен в практику здравоохранения Российской Федерации. Препарат внесен в перечень жизненно необходимых и важнейших лекарственных препаратов, утвержденный распоряжением Правительства Российской Федерации от 11 ноября 2010 г. № 1938-р.

С 2003 по 2013 гг. произведено 138 производственных серий препарата в полном соответствии с нормативно-технической документацией. Все серии соответствуют спецификационным свойствам, изложенным в фармакопейной статье (ФСП 002639/01-250210). С 2003 по 2013 гг. выпущено и реализовано в лечебно-профилактические учреждения Российской Федерации более 1900 литров гетеро-логичного антирабического иммуноглобулина. В результате реализации препарата в федеральный бюджет перечислено более 200 млн. рублей. Препарат применяется с 2003 г. по настоящее время для постэкспозиционной профилактики бешенства у людей во всех субъектах Российской Федерации.

В рамках направления по повышению биологической безопасности при работе с производственными штаммами разработаны методические указания федерального уровня по обеспечению безопасности работы с производственными штаммами фиксированного вируса бешенства «Москва» и «CVS», используемыми в процессе изготовления и контроля «Иммуноглобулина антирабического из сыворотки крови лошади жидкого», «Вакцины антирабической культуралыюй из штамма Внуково-32», «Вакцины концентрированной антирабической очищенной» МУ № 3.3.1.1099.

Сконструирована современная рентабельная тест-система на основе дот-иммуноанализа для определения уровня вируснейтрализующих антител. Одобрены Учёным советом РосНИПЧИ «Микроб» и утверждены директором РосНИПЧИ «Микроб» методические рекомендации: «Получение Р(аЬ')2-фрагментов антирабического иммуноглобулина в лабораторных условиях» (протокол № 2 от 17.04.2007 г.); «Определение активности антирабических сывороток и препарата гетерологичного антирабического иммуноглобулина in vitro в дот-иммуноанализе»

(протокол № 1 от 09.04.2009 г.) и «Определение уровня антител к вирусу бешенства в сыворотках лошадей-продуцентов и человека в непрямом варианте дот-иммуноанализа с применением неферментного диагностикума» (протокол № 3 от 05.05.2011 г.).

Разработаны методические указания федерального уровня МУ 3.3.2.2124-06 «Контроль диагностических питательных сред по биологическим показателям для возбудителей чумы, холеры, сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза, легионелле-за».

Разработана эффективная технология экспериментально-производственного культивирования производственных штаммов холерного вибриона с использованием новых, эффективных питательных сред. Одобрены Учёным советом и утверждены директором РосНИПЧИ «Микроб» методические рекомендации: «Приготовление гидролизата фибрина и конструирование на его основе питательных микробиологических сред для культивирования микроорганизмов» (протокол № 2 от 21.04.10 г.).

Спроектированный и сконструированный биореактор использован при производстве холерной вакцины. На разработанном аппарате успешно проведено восемь выращиваний производственных штаммов холерного вибриона. Разработанный биореактор обеспечивает высокую защиту персонала и окружающей среды на этапах глубинного культивирования. Биореактор в соответствии с актом, утвержденным директором института от 28.03.2008 г., введен в эксплуатацию в лаборатории холерных вакцин ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб».

Результаты проектирования и конструирования биореактора явились научным обоснованием для разработки нескольких разделов методических указаний федерального уровня «Биологическая безопасность при глубинном аппаратном культивировании микроорганизмов 1-И групп патогенности» МУ 1.3.2411-08.

Одобрены Учёным советом РосНИПЧИ «Микроб» и утверждены директором РосНИПЧИ «Микроб» методические рекомендации «Оценка эффективности автолиза пекарских дрожжей комплексом физико-химических методов» (протокол № 7 от 27.06.06 г.).

Материалы диссертационной работы используются при чтении лекций на курсах профессиональной переподготовки и усовершенствования врачей по особо опасным инфекциям при РосНИПЧИ «Микроб».

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Питательные среды на основе дрожжевого автолизата и гидролизата фибрина (содержание аминного азота в среде 0,03-0,05% и 0,1-0,12%, соответственно) эффективны при культивировании производственных штаммов V. сИо1-егае 569В Инаба и М41 Огава.

2. Необходимый уровень биологической защиты персонала и окружающей среды обеспечивает сконструированный ферментер на основе реактора РЗРЯ-6/0,63 с верхним магнитным приводом при глубинном культивировании производственных штаммов V. сИокгае 569В Инаба и М41 Огава.

3. Производственные штаммы V. cholerae 569В Инаба и М41 Огава, полученные при глубинном культивировании на экспериментальном биореакторе РЗРЯ-6/0,63 с магнитной мешалкой, соответствуют требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам холерного вибриона.

4. Разработанные нормативные документы, регламентированные лабораторные методики, установленное технологическое оборудование и высокие квалификационные требования к персоналу лаборатории создали эффективную систему биологической безопасности при производстве антирабического иммуноглобулина.

5. Система каскадной фильтрации, состоящая из предварительной, осветляющей, депирогенизирующей, ультра- и стерилизующей фильтрации, применяемая в производстве коммерческих серий антирабического иммуноглобулина, позволяет получить стандартный качественный препарат с высокими потребительскими свойствами.

6. Разработанная технологическая схема позволяет получать малореакто-генный препарат на основе Р(аЬ')2-фрагментов антирабического иммуноглобулина, обладающий высокой вируснейтрализующей активностью.

7. Разработанная тест-система на основе дот-иммуноанализа с использованием гидрозоля золота с размером частиц 15-17 нм, связанных сорбционно с антигеном, является высокочувствительной и специфичной при определении уровня вируснейтрализующих антител в сыворотках крови лошадей-продуцентов и готовом препарате антирабического иммуноглобулина.

Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнялась в ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» в рамках плановых научно-исследовательских работ № 262-05: «Разработка и внедрение в производство новых МИБП для профилактики и диагностики возбудителей инфекционной и вирусной природы» (номер госрегистрации: 0120.05044663) и № 40-2-09 «Оптимизация технологических этапов производства МИБП и разработка новых препаратов для диагностики ООИ» (номер госрегистрации: 0120.0853923). Вклад автора в представленные результаты заключается в личном участии во всех теоретических и экспериментальных исследованиях, обработке результатов и формулировании выводов. На защиту вынесены только те положения и результаты экспериментов, идея которых принадлежит автору данной работы и в получении которых роль диссертанта была определяющей. Часть исследований выполнена в соавторстве с сотрудниками ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» М.В. Антонычевой, И.М. Жулидовым, A.B. Комиссаровым, А.Ю. Ульяновым, С.А. Ереминым, Е.Г. Абрамовой, М.Н. Киреевым, C.B. Генераловым, H.A. Шараповой, O.A. Волох.

Автор лично принимал участие в определении направлений, планировании и выполнении исследований: по конструированию питательных сред для культивирования производственных штаммов холерного вибриона; по разработке требований к приборному и аппаратному оформлению биореактора с высоким уровнем биологической безопасности. Автор руководил и принимал непосредственное

участие в научно-практических работах: по определению и оценке рисков при манипуляциях с фиксированным вирусом бешенства; по разработке наиболее адекватной биотехнологической модели использования фильтрационных процессов в процессе производства антирабического иммуноглобулина. Планировал, координировал и руководил исследованиями, направленными на совершенствование производства антирабического иммуноглобулина: конструирование препарата на основе Р(аЬ')2-фрагментов; разработка тест-систем на основе дот-иммуноанализа.

Апробация работы. Материалы, вошедшие в диссертационную работу, были доложены и обсуждены на ежегодных научно-практических конференциях «Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в РосНИПЧИ "Микроб"» (2005-2012 гг.). В виде тезисных работ материалы были представлены на: VI Межгосударственной научно-практической конференции «Санитарная охрана территории государств - участников содружества независимых государств: Проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях» (Волгоград, 2005); II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Инфекции, обусловленные иерсиния-ми» в НИИЭМ им. Пастера (Санкт-Петербург, 2006); всероссийском научном форуме «Инновационные технологии медицины XXI века» (Москва, 2006); научно-практической конференции «Вакцинология 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики и лечения инфекционных болезней» (Москва, 2006); IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007); VIII Межгосударственной научно-практической конференции государств - участников СНГ «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах - участниках СНГ» (Саратов, 2007); II Всероссийской научно-практической конференции молодых учёных и специалистов «Окружающая среда и здоровье» (Рязань, 2007); VIII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ» (Саратов,2007); совещании проблемной комиссии «Холера и патогенные для человека вибрионы» (Ростов-на-Дону, 2008); международной научно-практической конференции «Биотехнология в Казахстане: проблемы и перспективы инновационного развития», посвященной 50-летию НИИ проблем биобезопасности НЦБ МОН РК (Алма-Аты, 2008); V международной конференции «Проблемы обращения с отходами лечебно-профилактических учреждений» (Москва, 2009); международной конференции «Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями» в ФГУН НИИЭМ им. Пастера Роспотребнадзора (Санкт-Петербург, 2010); международной научно-практической конференции «Вавиловские чтения-2010» (Саратов, 2010); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вакцинология 2010. Совершенствование иммунобиологи-

ческих средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» (Москва, 2010); 15 международной школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2011); на проблемной комиссии Координационного научного совета по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации (Ростов-на-Дону, 2011).

Публикации. Основное содержание диссертации отражено в 58 опубликованных работах (в научных журналах, рекомендуемых ВАК - 18 статей, 1 статья в нерецензируемом журнале, в материалах международных конференций -21, всероссийских - 9, отраслевых - 9), а также в 6 нормативных документах (регламентах производства, фармакопейных статьях), 6 методических рекомендациях и указаниях и в 3 патентах РФ на изобретения.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы», 7 глав собственных исследований, заключения, выводов и списка использованной литературы. Она изложена на 309 страницах, содержит 30 таблиц и 43 рисунка. Список литературы включает 294 отечественных и 131 зарубежных литературных источника.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Первая глава. Обзор литературы

В литературном обзоре рассмотрены публикации, имеющие непосредственную взаимосвязь с материалами исследования, а именно: питательные среды и методы глубинного культивирования микроорганизмов на примере холерного вибриона; применяемое ферментационное оборудование для выращивания производственных штаммов; современные направления усовершенствования противовирусных препаратов на примере лекарственных средств для постэкспозиционной профилактики бешенства; классификация и технологии получения профилактических иммуноглобулиновых препаратов.

Вторая глава. Материалы и методы

В работе использовали производственные штаммы холерного вибриона: V. cholerae штамм М41 серовар Огава и V. cholerae штамм 569В серовар Инаба. Для проверки эффективности разработанных питательных сред использовали тест-штамм V. cholerae 01 Р-1 (145). В исследованиях по совершенствованию производства антирабического иммуноглобулина использовали штаммы фиксированного вируса бешенства Virus fixe штамм Москва 3253 и Virus fixe штамм CVS, предоставленные ФГБУ «НЦ ЭСМП Минздравсоцразвития».

В экспериментах для определения иммуногенности холерной вакцины использовали беспородных белых мышей (Mus musculus) обоего пола, массой 10±1 г, для проведения испытаний на токсичность массой 19±1 г. Кроликов (Oryctolagus си-niculus) породы советская шиншилла массой 2,75±0,25 кг использовали для определения антигенной активности холерной вакцины и пирогенности антирабического иммуноглобулина.

В экспериментах использовали белых мышей (M. musculus) обоего пола линии BALB/c массой 10-12 г. для постановки реакции нейтрализации фиксированного

вируса бешенства. Для осуществления испытания антирабического иммуноглобулина на токсичность использовали беспородных морских свинок (Cavia porcellus) обоего пола массой 250-350 г.

Определение физико-химических свойств, иммуногенной активности, специфической безопасности, специфической стерильности и микробиологической чистоты холерной вакцины проводили согласно ФСП Р №001465/01-220708 на «Вакцину холерную бивалентную химическую, таблетки покрытые кишечнорас-творимой оболочкой». Контроль антирабического иммуноглобулина осуществляли согласно фармакопейной статьи предприятия ФСП Р N002639/01 на «Иммуноглобулин антирабический из сыворотки крови лошади, жидкий».

В главе представлен подробный список оборудования для проведения лабораторных и производственных манипуляций, а также содержится описание бактериологических, биологических, биохимических, химических, физических, физико-химических методов исследования и способов математической и статистической обработки материалов.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Третья глава исследования посвящена конструированию питательных сред на основе сухого автолизата пекарских дрожжей (САПД) для культивирования производственных штаммов холерного вибриона. Для контроля использовали гид-ролизат по Хоттингеру (ГХ) и гидролизат казеина (ГК).

Результаты изучения основных биологических свойств штаммов по характеру роста, морфологии, серологическим и биохимическим свойствам, а также фаголи-забельности свидетельствовали о соответствии твердых сред на основе САПД с содержанием аминного азота 0,03 и 0,05% питательным потребностям холерного вибриона.

Затем были определены биологические показатели и эффективность жидких питательных сред при статическом культивировании производственных штаммов холерного вибриона. Результаты работы по изучению биологических показателей экспериментальных жидких питательных сред представлены в таблице 1.

Отмечено, что жидкие питательные среды на основе САПД проявили высокую степень чувствительности, однако дрожжевые среды, содержащие аминный азот 0,05%, не обеспечивали стабильность основных культуральных свойств микроорганизмов, на них была выявлена SR - диссоциация штаммов V. cholerae. Требованиям МУ 3.3.2.2124-06 соответствовали среды на основе САПД с содержанием аминного азота 0,02-0,03%.

Следующим этапом нашей работы являлось изучение эффективности жидких питательных сред на основе САПД в условиях глубинного культивирования производственных штаммов холерного вибриона на шейкере-инкубаторе. Для повышения эффективности среды на основе гидролизата казеина при производстве ХВ применяют ферментативный мясной пептон в концентрации до 2%.

Таблица 1 - Биологические показатели жидких питательных сред, приготовленных на основе сухого автолизата пекарских дрожжей при культивировании штаммов холерного вибриона п=18

Жидкая пи- Показатель чувстви- Эффективность по концентрации био-

тательная тельности массы

среда/Ыамин,% М+т, разведение 10"5 млрд м.к./мл М+т

(п.ч. -103 м.к.) V. сИокгае 569В п.ч. 10"6 м.к./мл V. скоктае М41 п.ч. 10"6 м.к./мл

САПД/0,015 378+2 0,40+0,02 0,43+0,01

САПД/0,02 497+3 0,46+0,01 0,42+0,02

САПД/0,03 498+3 0,96+0,03 0,82+0,02

САПД/0,05 602+2 1,00+0,02 0,99+0,02

ГХ/0,12 634+2 1,97+0,01 2,51 ±0,03

Мы оценили возможность замены пептона на САПД в составе вышеуказанной среды и сравнение эффективности трех жидких сред: с моноосновой из САПД, на основе ГК с добавкой САПД в качестве заменителя пептона и на основе ГК с пептоном (2%). С этой целью в эксперименте были использованы варианты сред с добавлением САПД в различных концентрациях к казеиновому бульону (КБ). Результаты экспериментов по определению оптимальной концентрации в питательных средах САПД как добавки к КБ, приготовленному на основе ГК, представлены в таблице 2. Обращает внимание, что добавление САПД к КБ до концентрации 0,25% обеспечивает такое же накопление биомассы производственных штаммов холерного вибриона и продукцию основных антигенов (АГ), что и при добавлении пептона до концентрации 2%.

Отмечено, что все среды позволяют получить протективные АГ (О-антиген и холерный токсин (ХТ)) в одинаковом титре. Основные биологические свойства штаммов, полученных на экспериментальных средах, по характеру роста, морфологии, серологическим и биохимическим свойствам соответствовали паспортным показателям.

Для апробации сконструированных сред в условиях промышленного производства проведены эксперименты по выращиванию производственных штаммов в ферментере вместимостью 10,0 дм3 и дробной подкормки глюкозой в течение 9 ч.

По результатам, полученным на питательных средах на основе ПГК с добавлением САПД, отображенным в таблице 3, не выявлено различий с контролем. Данные свидетельствуют о возможности замены в составе производственных сред мясного пептона на САПД для использования в условиях глубинного культивирования штаммов холерного вибриона. Проведенные исследования по выращиванию производственных штаммов в условиях глубинного культивирования на средах с основой ПГК с добавлением САПД показали, что выход биомассы и основных антигенов холерного вибриона сохраняется на том же уровне, что и на контрольной среде и соответствует требованиям регламента производства «Вакцина холерная бивалентная химическая».

Таблица 2 - Результаты исследования эффективности жидких сред на основе сухого автолизата пекарских дрожжей при культивировании вакцинных штаммов холерного вибриона на шейкере-инкубаторе ЯС-ТК (п=12)

Наименование штамма Питательная среда Биомасса, мг/мл среды Продукция АГ (обратный титр)

О-АГ ХТ

V. сИо1егае М41 КБ+0,1 % САПД 75 16 -

КБ+0,25%САПД 90 32 -

КБ+0,5% САПД 85 32 -

КБ+1,0%САПД 90 32 -

КБ+2,0% САПД 90 32 -

КБ+2% пептона 90 32 -

Среда САПД 85 32 -

V. сИо1егае 569В КБ+0,1% САПД 70 4-8 2-4

КБ+0,25% САПД 80 4-8 2-4

КБ+0,5% САПД 80 4-8 2-4

КБ+1,0% САПД 80 4-8 2-4

КБ+2,0% САПД 80 4-8 2-4

КБ+2% пептона 80 4-8 2-4

Среда САПД 55 4-8 2-4

Примечание: "-"не проводили измерений

Таблица 3 - Результаты исследования эффективности жидких сред при культивировании вакцинных штаммов холерного вибриона в реакторе-ферментере (п=9)

Наименование штамма Питательная среда Биомасса, мг/мл среды Продукция антигенов (обратный титр)

О-АГ ХТ

V. ско1егае М41 КБ+0,25% САПД 90 32 не определяли

КБ+2,0% САПД 90 32 не определяли

КБ+2% пептона 95 32 не определяли

V. с1го1егае 569В КБ+0,25% САПД 80 8 4

КБ+2,0% САПД 80 8 4

КБ+2% пептона 85 8 4

Сконструированные питательные среды на основе автолизата пекарских дрожжей дешевле традиционных сред по Хоттингеру в 3,3 раза, на основе гидро-лизата казеина в 1,3 раза. Применение разработанных питательных сред в производстве холерной вакцины приведет к снижению себестоимости препарата на 79%.

В четвертой главе приводятся результаты исследований по разработке питательных сред на основе гидролизата фибрина для культивирования производственных штаммов холерного вибриона.

При существующей во ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» технологии производства гетерологичного антирабического иммуноглобулина в качестве отхода образуется фибрин. Научно-практический интерес представляло получение на его основе

питательных сред для культивирования производственных штаммов холерного вибриона. В своей работе мы применяли ферментативные методы гидролиза (использовали в качестве фермента поджелудочную железу крупного рогатого скота), поскольку они не приводят к разрушению и потере ценных аминокислот, как их химические аналоги. Разработана технология получения сухой питательной основы из жидкого ферментативного гидролизата фибрина (ФГФ), включающая стадии концентрирования и высушивания гидролизата.

Логическим продолжением работы явилось конструирование питательных сред на основе ФГФ для культивирования штаммов, применяемых в производстве холерной вакцины. На первом этапе работы были изучены биологические показатели питательных сред в статических условиях. На экспериментальных и контрольной средах установлена высокая чувствительность плотных экспериментальных сред на основе сухого ФГФ. По результатам изучения основных биологических свойств штаммов сделан вывод, что среды обеспечивают питательные потребности холерного вибриона и соответствуют требованиям методических документов (МУ 3.3.2.2124-06 и МУК 4.2.2316-08).

При определении показателя эффективности плотных питательных сред выход биомассы V. сИокгае 569В составил на средах с ФГФ с содержанием аминного азота 0,1% 9,24x109 м.к./мл, с 1,2% - 9,1 хЮ9 м.к./мл, что меньше, чем с контрольной среды (гидролизат по Хоттингеру) - 11,44x109 м.к./мл (1СТ>2, р<0,05).

Выход биомассы V. скокгае М41 составил 10,5хЮ9 м.к./мл с питательной среды ФГФ с содержанием аминного азота 0,1%, что также меньше, чем с ГХ -13,1 хЮ9 м.к./мл. Однако, сравнивая эффективность плотных экспериментальных сред (ФГФ/0,1) с данными, полученными при культивировании штаммов V. скпкгае 569В и V. скокгае М41 на контрольной среде с основой панкреатического гидролиза казеина (ПГК) (9,3+0,2 хЮ' и 10,4+0,25x109 м.к./мл, соответственно), нами отмечена более высокая эффективность экспериментальных сред р<0,05).

Для экспериментальных жидких питательных сред на основе ФГФ зарегистрированы показатели эффективности, представленные в таблице 4.

Таблица 4 — Биологические показатели жидких питательных сред, приготовленных на основе сухого ферментативного гидролизата фибрина при культивировании штаммов холерного вибриона (п=18)

Жидкая питательная сре-да/Намин,% Показатель чувствительности из разведения 10"6 (п.ч. - 10 м.к.) Эффективность, млрд м.к./мл

V. скокгае 569 В п.ч. 10~б м.к./мл V. скокгае М41 п.ч. 10"6 м.к./мл

ФГФ/0,08 578+2 0,90+0,02 0,43+0,01

ФГФ/0,1 930+3 1,70+0,01 1,65+0,01

ФГФ/0,12 941+3 0,96+0,01 0,92+0,01

ГХ/0,12 910+2 1,97+0,01 2,51+0,01

ПГК/0,18 600+2 0,91+0,01 0,91+0,01

На испытуемых средах ФГФ/0,08, ФГФ/0,12 выход биомассы V. скокгае 569В (п.ч. 10"6 м.к.) был сопоставимым с ПГК, и достоверно меньшим, чем на ГХ. При культивировании V. скокгае М41 на среде из ФГФ/0,1 выход биомассы составил -1,65x109 м.к./мл, что больше чем на средах с ФГК. На данном этапе было определено оптимальное содержание аминного азота в среде на основе ФГК, для плотной - 0,1 -0,12% и жидкой - 0,08-0,1 %.

На основе сухого ферментативного гидролизата фибрина и в комбинации с сухим автолизатом пекарских дрожжей (до 1%) сконструированы жидкие питательные среды для культивирования производственных штаммов в условиях термостатируемого шейкера-инкубатора. Анализ эффективности питательных сред по способности накапливать на них биомассу и синтезировать протективные антигены выявил индивидуальную чувствительность штаммов к составу среды. В таблице 5 представлены результаты объединенного пула трех повторов.

Таблица 5 - Результаты исследования эффективности экспериментальных жидких сред при культивировании вакцинных штаммов холерного вибриона на

шейкере-инкубато] эе

Штамм Питательная среда/ N амин, % Биомасса, мг/мл среды Продукция АГ (ИФА)

О-АГ мг/мл ХТ мкг/мл

V. скокгае М41 ФГФ/0,1 30,8 1,28 -

ФГФ+1% САПД 34,8 0,7 -

САПД 48,0 0,96 -

ГХ 32,8 1,6 -

V. скокгае 569В ФГФ 38,2 2,4 8,73

ФГФ+1% САПД 39,1 1,6 6,95

САПД 20,1 2,5 7,18

ГХ 40,0 1,2 8,75

Примечание: "-" не проводили измерений

Отмечено, что для накопления биомассы штамма V. скокгае М41 оптимальным был состав среды на основе САПД, которая по эффективности (количество биомассы - 48 мг/мл) достоверно (1„>2, р<0,05) превосходила другие среды: ФГФ

- 30,8 мг/мл, для комбинированной среды (КС) - 34,8 мг/мл и для контрольной среды ГХ - 32,8 мг/мл. Однако по способности синтезировать О-АГ, выявлена обратная тенденция. Лучшим был результат на среде из традиционной основы ГХ

- 1,6 мг/мл, среда на основе ФГФ незначительно ей уступала - 1,28 мг/мл, и достоверно низкий результат был зафиксирован на средах с дрожжевым автолизатом: САПД - 0,96 мг/мл и комбинированной среде — 0,7 мг/мл.

При культивировании штамма V. скокгае 569В не отмечено достоверной разницы при накоплении биомассы на средах ФГФ, КС и ГХ, соответственно в мг/мл: 40,0; 38,2 и 39,1, но все они были значительно эффективнее среды на основе САПД (20,1 мг/мл). Среды, содержащие САПД, уступали другим экспериментальным средам по способности синтезировать ХТ: на КС - 6,95

мкг/мл, на САПД - 7,18 мкг/мл, что достоверно отличает их от сред: ФГФ - 8,73 мкг/мл и ГХ — 8,75 мкг/мл. Синтез О-АГ на сопоставимом уровне обеспечивали среды, (мг/мл): на ФГФ - 2,4, на САПД - 2,5 и на контрольной среде ГХ - 1,2, достоверно ниже был синтез О-АГ на комбинированной среде - 1,6. Таким образом, на этапе культивирования производственных штаммов холерного вибриона в шейкере-инкубаторе экспериментально доказана высокая эффекгивность экспериментальных сред на основе ФГФ по способности накапливать биомассу и продуцировать протективные антигены (О-АГ и ХТ).

Потенциальную возможность использования сконструированных сред на основе гидролизата фибрина в производстве МИБП определили в условиях глубинного культивирования в реакторе-ферментере объемом 0,5 м3 штамма V. cholerae М41. При культивировании на среде из гидролизата фибрина при (37±1) °С в течении 9 ч показатель эффективности составил 158 млрд м.к./мл, в то время как на традиционной среде из панкреатического гидролизата казеина — 111,4 млрд м.к./мл (Рисунок 1).

Рисунок 1 - Эффективность жидких питательных сред при накоплении биомассы V. cholerae М41 в условиях глубинного культивирования в реакторе-ферментере

—череда на основе гидролизата казеина -■-среда на основе гидролизата фибрина

Таким образом, показатель эффективности среды на основе гидролизата фибрина в 1,5 раза выше по сравнению со средой на основе гидролиза казеина. При определении количества О-антигена в центрифугате формалинизированной культуры V. ско/егае М41, выращенной на бульоне из гидролизата фибрина и казеиновом бульоне, регистрировали положительную реакцию преципитации в разведении соответственно 1/16 и 1/8.

Результаты, полученные при оценке эффективности сред на основе ферментативного гидролизата фибрина и в комбинации с сухим автолизатом пекарских дрожжей, позволяют использовать данные среды в производстве холерной вакцины при культивировании и накоплении биомассы V. с/ю/егае 569В и V. сИо1егае М41, заменив среды на основе панкреатического гидролизата казеина. Один литр гидролизата фибрина дешевле гидролизата по Хоттингеру в 13,6 раза, гидролизата казеина в 5,3 раза. При использовании сконструированных питательных сред для производства холерной вакцины предполагается снижение ее себестоимости на 20-22%. Применение гидролизата фибрина, полученного из отхода производства АИГ, в качестве основы питательных сред расширяет

ассортиментный ряд, экономически целесообразно и является примером снижения техногенной нагрузки на окружающую среду.

Пятая глава посвящена разработке и конструированию аппарата для глубинного культивирования вакцинных вариантов возбудителей опасных инфекционных заболеваний с использованием в качестве модели производственных штаммов холерного вибриона. В качестве базисной модели для создания биореактора был выбран химический реактор РЭРЯ-6/0,63. Конструкторской особенностью разработанного биореактора является отсутствие сальниковых и торцевых уплотнений перемешивающего устройства. Разработанный биореактор отличается от других аппаратов для культивирования тем, что магнитный привод перемешивающего устройства с турбинной мешалкой расположен на крышке реактора и оснащен разделительной мембраной, барботер и сифонная трубка в пределах культурально-го сосуда выше уровня заполнения жидкости подключены к крану, выполненному таким образом, что в открытом положении барботер и сифонная трубка сообщаются с полостью реактора. Отличительной особенностью разработанного реактора является отсутствие нижнего слива из полости ферментера, что полностью исключает возможность аварийных ситуаций при выращивании штаммов холерного вибриона. На сконструированном биореакторе изучили кинетику роста производственных штаммов холерных вибрионов и динамику накопления О-АГ и холеро-гена. На рисунках 2, 3 и в таблицах 6, 7 представлены результаты экспериментов при выращивании холерных вибрионов штаммов V. ско1егае М41 и 569В.

Таблица 6 - Кинетика накопления О-антигена холерного вибриона штамма V. ско1егае М41 в условиях глубинного культивирования (п=12)

Продолжительность выращивания, ч Содержание О-антигена в РИД с 01 сывороткой, обратный титр Нормируемое значение

Производственный реактор Сконструированный реактор

5 0 1

6 1 2 и «

7 2 4 а ?)

8 6 8 а ,,

9 10 12

10 10 12 8

Примечание: "-" — требования отсутствуют

При сравнительном анализе полученных табличных и графических данных кинетики роста биомассы и накопления О-АГ и холерогена отмечается аналогичность показателей при культивировании на существующих производственных реакторах и экспериментальном ферментере.

Кроме того, полученные полуфабрикаты (О-АГ обоих штаммов холерного вибриона и холероген) полностью соответствуют регламентным требованиям.

Таблица 7 - Кинетика накопления О-антигена и холерогена холерного вибриона штамма V. ско1егае 569В в условиях глубинного культивирования (п=10)

Содержание О-антигена в РИД с 01 сывороткой, обратный Содержание токсина в РИД с ДУГ

Продолжи- титр

тельность Произ- Скон- Норми- Произ- Скон- Норми-

выращива- вод- струиро- руемое вод- струиро- руемое

ния, ч ствен- ванный значение ствен- ванный значе-

ныи реактор ный реактор ние

реактор реактор

5 1 1 1 1

6 2 2 2 2 а »

7 6 6 3 3

8 10 10 4 4

9 10 10 8 4 4 4

Примечание: "-" - требования отсутствуют

Важным этапом нашей работы являлись исследования по изучению свойств сублимационно высушенных препаратов холероген-анатоксина (ХА) и О-антигена, полученных после культивирования производственных штаммов на традиционном и экспериментальном биореакторах. В лиофилизированных фракциях определяли наличие ряда ферментов и содержание ХА и О-АГ с использованием дот-иммуноанализа.

Рисунок 2 - Кинетика роста биомассы Рисунок 3 - Кинетика роста биомассы холерного вибриона штамма холерного вибриона штамма

V. ско!егае М41 V. сИокгае 569В

Кроме того, мы изучили химический состав компонентов холерной вакцины, а также провели сравнительный анализ полуфабрикатов с применением хромато-графических и электрофоретических методов.

В таблице 8 представлены результаты исследований химического состава фракций, полученных при помощи двух технологий культивирования. Установлено, что общее количество основных химических компонентов в препаратах было идентичным. Проведены исследования с использованием дот-иммуноанализа содержания ХА и О-АГ в препаратах, полученных двумя способами.

На рисунках 4 и 5 представлены данные, свидетельствующие о том, что ХА и О-АГ в обоих препаратах обнаруживаются в разведениях 1:380 и 1:1280 соответственно.

Таблица 8 - Сравнительная характеристика препарата холерогена-анатоксина и О-антигена, полученных с использованием традиционного и экспериментального биореактора (п=8)

Наименование характеристики Значение характеристики препарата ХА и О-АГ

полученного по регламентному способу полученного по экспериментальной технологии

Белок, % 32,1±0,5 32,4±0,5

Углеводы, % 15,0±0,4 15,3±0,5

Липиды,% 8,61±0,2 8,3±0,3

Нуклеиновые кислоты, % 0,81±0,05 0,84±0,05

iill

ряд 1 - препарат, полученный при культивировании на производственном биореакторе; ряд 2 - препарат, полученный при культивировании на экспериментальном биореакторе; (разведения препарата от 1:40 до 1:1280 с шагом разведения,

равным 2)

Рисунок 4 - Содержание холерогена-анатоксина в препаратах сравнения

чо* 1 i ! 1 i

i m № I i i j

-J IfifpH ivi

ряд 1 - препарат, полученный при культивировании на производственном биореакторе; ряд 2 — препарат, полученный при культивировании на экспериментальном биореакторе; (разведения препарата от 1:40 до 1:1280 с шагом разведения,

равным 2)

Рисунок 5 - Результаты исследования содержания О-антигена

Проведено хроматографическое фракционирование полученных препаратов на колонке с Т8К-гелем Н\\/-60 (Рисунок 6). Во время разделения элюировалось три белковых пика, которые демонстрировали практически полную идентичность при сравнении препаратов, полученных двумя способами.

0,5

0,25

Е280 й

| 1

; О

J Р

0,5 Е280

0,25

V ЭЛЮЦИИ, мл V элюции, мл

Рисунок 6 - Результаты хроматографического анализа препаратов: препарат, полученный при культивиро- препарат, полученный при культиви-вании на производственном биореакто- ровании на экспериментальном биоре-ре акторе

На рисунках 7 и 8 представлены данные проведенных экспериментов по изучению электрофоретической подвижности полученных препаратов.

1-6 - маркеры молекулярной

массы (1 - 12300 Да, 2 - 17800 Да, _

3 - 25000 Да, 4 - 37000 Да, 5 - ' 45000 Да, 6 - 67000 Да); 7 и 8 - 5 препараты, полученные на тради- 4 1

ционном и разработанном биореак- : ,

торе

Рисунок 7 - Результаты диск-электрофореза (с окраской серебром) при изучении электрофоретической подвижности препаратов сравнения

Результаты свидетельствует о том, что белково-углеводные комплексы препаратов, полученных традиционным и разработанным способами, идентичны и состоят из компонентов с молекулярной массой от 12 до 90 кДа.

На заключительном этапе работы по данному направлению мы провели сравнительный анализ спецификационных свойств вакцины холерной бивалентной химической, полученной по традиционной и экспериментальной технологиям. Для проведения исследования приготовлены три экспериментальные серии химической холерной вакцины, изучены их свойства в соответствии с требованиями фармакопейной статьи. В качестве контроля была исследована производственная серия № 86, полученная по регламентной технологии.

1, 2, 7, 8 - маркеры молеку- 2 лярной массы (1 - 37000 Да, 2 -45000 Да, 7 - 17800 Да, 8 - 12300 Да); 3, 4 и 5, 6 - препараты, по- 1 лученные на традиционном и разработанном биореакторе

А иг щ| Ир ■

3 4 5 6

Рисунок 8 - Результаты диск-электрофореза (с окраской Кумасси 11-250) при изучении электрофоретической подвижности препаратов сравнения

Проанализировав полученные результаты мы сделали вывод, что экспериментальная серия удовлетворяет требованиям нормативных документов, а ее качество не уступает вакцине, приготовленной по существующей технологии. Таким образом, в результате разработки и внедрения в производственную линию ферментера на базе РЭРЯ-6/0,63 достигнуты следующие результаты: повысился уровень биологической безопасности производства на этапах глубинного культивирования производственных штаммов холерного вибриона; увеличилась кинетика накопления биомассы холерного вибриона, а, следовательно, и количество протективных антигенов; качество полученных полуфабрикатов и готовой вакцины полностью соответствует нормативно-технической документации.

В шестой главе описаны исследования, направленные на создание эффективной системы биологической безопасности при производстве противовирусных иммунобиологических препаратов на примере производственных штаммов фиксированного вируса бешенства. В начале работы была проведена оценка рисков биологической опасности, с которыми могут столкнуться сотрудники, выполняющие стандартные технологические операции при изготовлении органо-тканевого раби-ческого антигена.

В результате проведенной работы выявлены наиболее критичные, в плане биологической безопасности, этапы процесса производства антирабического иммуноглобулина и предложены дополнительные меры для адекватной защиты экспериментаторов и окружающей среды. Результаты исследований легли в основу Методических указаний МУ 3.3.1.1099 «Безопасность работы с производственными штаммами фиксированного вируса бешенства». Определенные риски, разработанные нормативные документы (методические указания, регламент производства, стандартные операционные процедуры), регламентированные лабораторные методики, установленное технологическое оборудование и высокие квалификационные требования к персоналу лаборатории позволили создать эффективную систему биологической безопасности при производстве антирабического иммуноглобулина (АИГ).

Седьмая глава исследования посвящена созданию универсальной системы каскадной фильтрации иммуноглобулиновых препаратов на модели АИГ. Одной

из приоритетных задач данного раздела работы являлось удаление из раствора гамма-глобулина остаточного количества риванола, применяемого для отделения балластных фракций альбумина, а- и Р-глобулинов. Для решения указанной задачи были поставлены эксперименты по подбору оптимального предварительного фильтра. Результаты отражены в таблице 9.

Таблица 9 - Результаты исследования фильтровального картона различных типов для проведения осветляющей фильтрации (п=12)

Тип фильтровального картона Производитель Рейтинг фильтрации, мкм Эффективность удаления риванола, % Пропускная способность комплекта фильтрпластин на установке ФС-7 по раствору белка, дм3

Seitz HS 800 Pall 0,8—1,5 100 330+20

Seitz HS 1000 -»- 1,5 — 4,0 100 400+30

Seitz HS 2000 -»- 4,0 — 9,0 75 -

Seitz HS 4000 -»- 5,0—12,0 50 -

Seitz К 250 -»- 4,0 — 9,0 75 -

Seitz HR 2000 -»- 4,0 — 9,0 75 -

КТФ-1П Косинская бумажная фабрика 1,0 — 3,0 100 410+20

КФБЖ Технофильтр 0,8 100 180+10

F4HP Sartorius 1,5 100 390+30

C4P -»- 8 75 -

Примечание: «-» - не определяли

Наилучшим продуктом для решения первой фильтрационной задачи по удалению примесей риванола из раствора гамма-глобулина с технологической точки зрения являются пластины фильтровального картона марок Seitz HS 1000 (Pall), КТФ-1П (Косинская бумажная фабрика) и F4HP (Sartorius) на основе целлюлозного волокна с рейтингом фильтрации не более 4 мкм, обладающие высокой сорбци-онной способностью и достаточным ресурсом работы.

Вторая фильтрационная задача - удаление из растворенного осадка иммуноглобулина крупных коллоидных или взвешенных частиц размером более 0,20

мкм. В данном случае технические характеристики мембранной фильтрации адекватны поставленной задаче. Учитывая объем одной производственной серии иммуноглобулина - до 20 дм3, для проведения предварительной фильтрации нами были апробированы и внедрены в производственный процесс патронные мембранные элементы «Технофильтр» марки ЭПМ.К (Россия) с площадью поверхности 0,85 м2.

В предлагаемой нами схеме раствор иммуноглобулина последовательно подается сначала на фильтроэлементы ЭПМ.К-0,80/0,45 с двумя слоями мембраны, затем через элементы ЭПМ.К-0,45/0,20 с размером пор 0,45 и 0,20 мкм.

Очередной фильтрационной задачей являлась максимальная очистка жидкого иммуноглобулина от нежелательных низкомолекулярных примесей, главным образом, от остатков этилового спирта, применяемого для осаждения гамма-глобулина из антирабической сыворотки.

Для удаления остатков спирта из препарата необходим этап ультрафильтрации или диализа. В работе исследовали возможность применения на этапе диализа разделительных ультрафильтрационных волоконных аппаратов УВА-ПС-20-1040 производства химпредприятия г. Мытищи (Россия), АР ПС-50-2,5 марки «МИФИЛ» (Беларусь), характеризующихся величиной номинального молекуляр-но-массового предела задерживания (НММП), соответственно, 20 и 50 кДа. Помимо указанных ультрафильтрационных установок, в настоящей работе была исследована возможность применения для удаления из раствора иммуноглобулина низкомолекулярных примесей диализаторов F10HPS и FX100 («Fresenius», Германия) с НММП менее 60 кДа. Использование для очистки раствора иммуноглобулина аппаратов F10HPS и FX100, применяемых в медицине при проведении гемодиализа, было абсолютно новым решением с технологической точки зрения. Диализные колонки F10HPS и FX100, испытанные при очистке раствора иммуноглобулина, обладают большей эффективностью процесса ультрафильтрации, о чем свидетельствуют показатели остаточного содержания спирта в препарате иммуноглобулина. Так, среднее значение данного фармакопейного показателя составило соответственно (2,5±0,07) и (2,1±0,06), время проведения баромембранного процесса - не более 3 ч при температуре раствора иммуноглобулина 37 °С. В ходе экспериментов выявлены удовлетворительные качественные характеристики всех типов ультрафильтрационных препаратов, однако, применение капиллярных диализаторов повышенной проницаемости F10HPS и FX100 имеет явные преимущества. Таким образом, на основании проведенных исследований представляется целесообразным использование на этапе ультрафильтрации капиллярных диализаторов F10HPS и FX100 однократного применения, обладающих высокой удельной производительностью и обеспечивающих качественную очистку раствора иммуноглобулина от низкомолекулярных примесей (Рисунок 9).

эСодержание этилового спирта до упьтрафильтрации з Содержание этилового спирта после ультрафильтрации —Предельно допустимый уровень согласно НД

Рисунок 9 - Эффективность использования фильтров для снижения содержания остаточного этилового спирта в растворе АИГ (п=87)

В настоящее время на технологических этапах осветляющей фильтрации широко применяют фильтры на основе активированного угля. Для проведения осветляющей фильтрации были взяты образцы угольсодержащих глубинных фильтров марки ZetaCarbon R55SP («CUNO», Франция) и Seitz AKS4 (Pall, США). Результаты испытаний представлены в таблице 10. Первые три типа глубинных фильтров эффективно задерживали частицы гемпигмента.

Таблица 10 - Результаты испытаний фильтровальных пластин для осветляющей фильтрации (п=76)

Тип пластины/ производитель Материал пластины Показатель цветности, опт. ед.

до фильтрации после фильтрации

ZetaCarbon R55SP, CUNO Активированный уголь, очищенная целлюлоза, диатомит, полимерная смола 0,52 0,04+0,007

Seitz AKS4, Pall Активированный уголь, очищенная целлюлоза, диатомит, полимерная смола 0,52 0,07+ 0,003

Seitz HR 100, Pall Очищенная целлюлоза, связующая смола, диатомит 0,52 0,10+0,004

Seitz HR 2000, Pall Очищенная целлюлоза, связующая смола, диатомит 0,52 0,18+0,006

При использовании пластин с активированным углем показатель цветности имел более низкое значение, что позволяет сделать заключение о целесообразности использования на данном технологическом этапе пластин с активированным углем. Проведены исследования по определению зависимости эффективности сорбции от величины интенсивности потока.

g 0.1 0,15 0.2

С Скорость потока, дмЗ/мин

Рисунок 10 - Влияние интенсивности потока на эффективность сорбции гемпигмента (п=8)

На рисунке 10 показано влияние интенсивности потока на адсорбционную емкость материала фильтра. Так, при величине давления 0,05 МПа интенсивность потока раствора иммуноглобулина с содержанием белка 10% составила 0,20 дм3/мин, при этих значениях зафиксировано наибольшее значение показателя цветности - 0,08 опт. ед. Значение показателя цветности производственных серий иммуноглобулина (132 серии) многократно ниже установленных требований и составляет в среднем 0,035 опт. ед. при требовании фармакопейной статьи предприятия не более 0,15 (Рисунок 11).

Рисунок 11 - Значения показателей цветности производственных серий антирабического иммуноглобулина.

По оси ординат - значения показателей цветности, опт. ед. (п=88)

106 107 108 109 110 111 112 113

Производственные серии АИГ i Значения цветности -«-Требования НД цветности

Несомненный прикладной интерес представляла экспериментальная оценка эффективности удаления эндотоксина при фильтрации раствора иммуноглобулина через глубинные картонные фильтры нескольких модификаций. Из обширной линейки фильтрационных элементов нами были выбраны специально адаптированные для удаления пирогенов модифицированные фильтры ZetaPlus 90 ZA (CUNO) диаметром 142 мм с основой из целлюлозы и диатомита с двойным механизмом сорбции - за счет Zeta+ потенциала и сорбции в глубине матрикса и фильтр-картонные пластины Sartorius диаметром 142 мм следующих модификаций: S 5Р с микронным рейтингом 0,3 мкм, F7HP с рейтингом 1,0 мкм, F4HP с рейтингом 1,5 мкм, С 4Р с рейтингом 8 мкм.

Результаты исследований показали, что наиболее эффективно процесс депиро-генизации проходит с использованием модифицированного глубинного фильтра ZetaPlus (CUNO) марки 90ZA. Использование фильтр-картона S 5Р с микронным рейтингом 0,3 мкм (Sartorius) также позволило получить удовлетворительные данные в отношении удаления пирогенов - в результате однократной фильтрации

0.14 0.12 0.1 0.08 0,06 0.04 0.02

показатель пирогенности с величины 3,5 °С был снижен до уровня (1,2±0,2) °С, что соответствует требованиям регламента.

Таким образом, для депирогенизации раствора иммуноглобулина предпочтительнее применение глубинных фильтров CUNO ZetaPlus 90А, что позволяет привести показатель пирогенности в соответствие с требованиями фармакопейной статьи при определении биологическим методом на кроликах (Рисунок 12).

г т 1 5 1 4!&> з- с л 2 -1 1 * 0- —

ь _

-1, 1, 3, tu л, h í,

45 46 48 52 51 64 65 67 71 Производственные серии

I 1 Значение пирогенности до фильтрации через /с1а1'1и.ч Е53 Значение пирогенности после фильтрации через /с[а1'1ич I Гределыго допустимое значение пирогенности

Рисунок 12 — Уровень содержания эндотоксинов в препарате иммуноглобулина до и после фильтрации через модифицированные пластины с 2е1а+потенциалом

(п=88)

Одним из направлений исследований являлась оценка эксплуатационных характеристик наиболее часто употребляемых в технологии стерилизующей фильтрации гидрофильных микрофильтрационных мембран по критерию стерильности раствора после фильтрации, выбор наиболее подходящих фильтроэлементов для стерилизации раствора иммуноглобулина по критерию пропускной способности с целью увеличения производительности процесса стерилизации. В эксперименты по изучению процесса стерилизующей фильтрации иммуноглобулина были включены только мембранные дисковые и капсульные фильтры с рейтингом 0,20 мкм, являющиеся стерилизующими по назначению.

На первом этапе исследований определяли свойства микрофильтрационных гидрофильных полимерных дисковых мембран с микронным рейтингом 0,2 мкм на основе ацетата целлюлозы, нитрата целлюлозы, полиамида отечественного производства («Владисарт»), а также капсульных фильтров ДФП-201-60 с фильтрующими элементами ЭКОПОР-ПА на основе полиамида и ЭКОПОР-АС на основе ацетата целлюлозы («Экспресс-ЭКО») с площадью фильтрации 0,2 м2, КФМ.ПС на основе полисульфоновой мембраны («Технофильтр») с площадью фильтрации 0,2 м2 и 8аг1оЬгап Р М1(ИСар8 («ЗаЛопив») на основе ацетата целлюлозы с площадью фильтрации 0,45 м2. Сравнительные эксплуатационные характеристики различных типов мембран и фильтроэлементов представлены в таблице 11.

Тип фильтрующего элемента Фирма-производитель Пропускная способность, дм3 Количество положительных испытаний на целостность мембраны, % Количество стерильных процедур, %

ФМАЦ «Владисарт», РФ 5,5±0,2*/ 27,3±1,7* * 100 100

ФМНЦ «Владисарт», РФ 4,8±0,1*/ 25,5±1,0* * 100 100

ФМПА «Владисарт», РФ 4,6±0,1 */ 23,8±0,5* * 100 100

ЭКОПОР-АЦ ООО Экспресс-Эко», РФ - 0 0

ЭКОПОР-ПА ООО «Экспресс-Эко», РФ 19,5±0,7 100 100

КФМ.ПС НПП «Технофильтр», РФ 22,5±0,5 100 100

БаПоЬгапР «БаПопиБ», Германия 31,4± 1,0 100 100

Примечание: * - значение для 1 мембраны диаметром 142 мм; ** - значение для комплекта из 10 мембран диаметром 142 мм

В ходе экспериментов выявлено, что дисковые мембранные фильтры на основе различных полимеров пригодны для стерилизации иммуноглобулина, обеспечивая стерильность инъекционного раствора. Экспериментальная оценка пропускной способности мембран как по отдельности, так и в комплекте, показала значения в диапазоне от (4,6±0,1) до (5,5±0,2) дм3 для одной мембраны и от (23,8±0,5) до (27,3±1,7) дм3 для комплекта мембран. Наибольшую производительность показали мембраны на основе ацетата целлюлозы.

Таким образом, впервые предложен и экспериментально доказан комплексный подход к решению фильтрационных задач при производстве АИГ. Разработанная система каскадной фильтрации используется в настоящее время при серийном выпуске иммуноглобулина и полностью гарантирует выпуск качественного препарата. Данная система полностью или частично может быть использована при производстве аналогичных препаратов.

Глава восьмая посвящена разработке оптимальной биотехнологической схемы получения АИГ на основе Г(аЬ')2-фрагментов с применением ферментативного гидролиза. На первом этапе мы определили условия ферментативного гидролиза и фракционирования Р(аЬ')2-фрагментов АИГ от реакционной смеси. В качестве базовой модели для осуществления этапа ферментативного гидролиза АИГ выбрана модель реактора периодического действия с мешалкой. Одной из важнейших задач при исследованиях процесса ферментативного гидролиза является определение оптимального температурного режима.

иу

Рисунок 13 — Результаты хроматографии продуктов ферментативного гидролиза на БР-сефарозе при расщеплении АИГ при температурах 30 и 37 °С (п=7)

гаэрэдизпри 37°С V, мл

гидролиз при 30°С

Подбор температуры реакционной смеси обусловлен биохимическими свойствами молекул иммуноглобулина и пепсина. В нашей работе исследованы варианты гидролиза при температурах 30 и 37 °С при экспозиции в течение 18 часов при рН 4,6. Профили элюции соответствующих гидролизатов показаны на рисунке 13. При сравнительном анализе результатов хроматографии видно, что выход Р(аЬ')2-фрагментов, полученных в результате инкубации при 37 °С, выше, чем при

Затем были подобраны условия хроматографического фракционирования продуктов ферментативного гидролиза для получения Р(аЬ')2-фрагментов из реакционной смеси. Для хроматографического фракционирования гидролизата АИГ использовали ионообменную хроматографию на катионобменном геле 8Р-ЗерИагозе-ХЬ и гель-хроматографию с применением сефадекса С-200.

В обоих вариантах фракционирования имело место разделение продуктов ферментативного гидролиза на четыре фракции (Рисунки 14 и 15).

30 °С.

Рисунок 14 - Профиль элюции продуктов ферментативного гидролиза после гель-фильтрации на сефадексе С-200 (п=8)

Рисунок 15 - Профили элюции продуктов ферментативного гидролиза на БР-сефарозе ХЬ (п=8)

Вначале элюировались остатки цельного гаммаглобулина, вторым пиком выходили Р(аЬ )2-фрагменты, третьим и четвёртым пиком элюировались мелкие пептиды. Детекцию полученных фракций проводили с помощью ЗОБ- электрофореза (в денатурирующих условиях) в полиакриламидном геле (Рисунок 16). Как видно из рисунка 14, пики 1 и 2 частично перекрываются. Это свидетельствует о том, что остатки нерасщепленного иммуноглобулина и Р(аЬ'^-фрагменты на сефадексе разделяются не полностью. Фракционирование на 8Р-сефарозе позволяет добиться лучшего разделения фракций.

М\У

Рисунок 16 - 505-ПААГ электрофорез продуктов ферментативного гидролиза антирабического иммуноглобулина.

1 - маркеры молекулярного веса;

2 - антирабический иммуноглобулин (фракция 1); 3-7 - Р(аЬ')2-фрагменты антирабического иммуноглобулина (фракция 2);

8-9 - гидролиза! антирабичес кого иммуноглобулина (п-8).

34.0 25.0

Далее мы определили основные физико-химические показатели иммуноглобулина на основе Р(аЬ')2-фрагментов (Таблица 12).

Таблица 12 - Физико-химические параметры препарата на основе Р(аЬ')2-фрагментов антирабического иммуноглобулина (п=16)

Показатель Значения Нормативные значения

Концентрация белка 8,0 % 9-11%

рН 6,7 6,6-7,4

Прозрачность 0,03 не более 0,05

Цветность 0,11 не более 0,15

Электрофорети-ческая однородность Фракция Р(аЬ')2-фрагментов иммуноглобулина- 100% Присутствие — а,(3-глобулинов - не более 20%. Фракция -у-глобулина -не менее 80%; Альбумин в препарате должен отсутствовать

Электрофоретическую однородность определяли методом электрофореза на ацетатных плёнках. В качестве контроля использовали препарат антирабического иммуноглобулина и нормальную лошадиную сыворотку. Результаты электрофоре-тической однородности продемонстрированы на рисунке 17.

Анализируя результаты, можно сделать вывод, что разработанный иммуноглобулин на основе Р(аЬ')2-фрагментов не содержит белковых примесей, однороден, имеет одинаковую электрофоретическую подвижность с коммерческим иммуноглобулином, поскольку данный показатель определяется отрезком тяжелой цепи, входящей в Р(аЬ')2-фрагмент.

1 - нормальная лошадиная сыворотка; 2 - антирабический иммуноглобулин; 3,4,5 -Р(аЬ')2-фрагменты антирабиче-ского иммуноглобулина

Рисунок 17 - Исследование электрофоретической однородности препарата F(ab')2-фрагментов антирабического иммуноглобулина

Таким образом, физико-химические параметры экспериментального препарата на основе Р(аЬ')2-фрагментов АИГ, полученного путём ферментативного гидролиза с последующей хроматографической очисткой, удовлетворяет требованиям, предъявляемым к препарату антирабического гетерологичного иммуноглобулина (ФСП Р №002639/01). Важнейшей составляющей частью настоящей работы являлось определение специфической активности F(ab ^.фрагментов АИГ. Данный тест ш vivo проводили с использованием реакции нейтрализации вируса бешенства на белых мышах (Таблица 13).

Таблица 13 - Результаты реакции нейтрализации F(ab )2.фрагментов АИГ

№ эксперимента Ig отраслевой стандартный образец lg (исходный препарат) F(ab')2

1 1:3475 (400МЕ) 1:3119(359МЕ) 1:2460 (283МЕ)

2 1:11748 (400МЕ) - 1:4000(136 ME)

3 1:12882 (400 МЕ) - 1: 16000(497 ME)

Полученные нами результаты доказывают, что разработанный препарат на основе Р(аЬ')2-фрагментов обладает высокой нейтрализующей активностью в опытах in vivo.

Испытание на токсичность Р(аЬ')2-фрагментов проводили на белых беспородных мышах обоего пола, массой 18-20 г. Результаты исследования отражены в таблице 14. Полученные результаты экспериментов указывают на отсутствие токсичности у экспериментального препарата на основе Р(аЬ')2-фрагментов при аппликации белым мышам в дозе 2,1 ±0,1 г/кг массы животного.

Следующий этап нашей работы - проведение сравнительного анализа реакто-генных свойств экспериментального препарата его основе Р(аЬ')2-фрагментов и его коммерческого аналога.

альбумины

al-глобулины

а2-глобулины -[í-глобулины - flK

у-глобулины -

Таблица 14 - Сравнительный анализ токсичности препарата на основе Р(аЬ')2-фрагментов и коммерческого иммуноглобулина (п=8)

Препарат Масса животных по дням наблюдения, г Результат проверки препарата

1 2 3 4 5 6 7

Р(аЬ')2 18,8+0,2 19+0,4 19+0,3 19+0,4 19+0,4 20+0,3 20+0,3 нетоксичен

20+0,3 20+0,3 20+0,2 20+0,3 20+0,3 21+0,2 21+0,3 нетоксичен

Изучение анафилактогенных свойств препаратов проводили с использованием реакции активной анафилаксии. Результаты по изучению активной анафилаксии представлены на рисунке 18.

Рисунок 18 - Результаты изучения реактогенных свойств экспериментального препарата на основе Р(аЬ')2-фрагментов и

■Антирабический иммуноглобулин 4 ' ' •

коммерческого иммуноглобу-

□ Р(аЬ)2-фрагменты г ^ ^

иммуноглобулина ЛИНЗ.

Полученные результаты свидетельствуют, что Р(аЬ')2-фрагменты антирабиче-ского иммуноглобулина обладают гораздо меньшей реактогенностью, чем исходный иммуноглобулин. Таким образом, доказано, что препарат на основе Р(аЬ')2-фрагментов антирабического иммуноглобулина обладает высокой вируснейтра-лизующей активностью, является более безопасным, чем исходный препарат нерасщепленного иммуноглобулина.

Глава девятая посвящена применению тест-системы на основе дот-иммуноанализа (ДИА) для определения уровня вируснейтрализующих антител и возможности использования данного диагностикума в процессах производства противовирусных иммунобиологических препаратов на модели антирабического иммуноглобулина. В процессе эксплуатации животных-продуцентов важен мониторинг за уровнем вируснейтрализующих антител (ВНА) в сыворотках лошадей. При оценке ВНА с применением ДИА были получены результаты проиллюстрированные на рисунках 19 и 20.

Отмечено, что уровень активности гипериммунных антирабических лошадиных сывороток, выявленный методом ДИА, соответствует значениям 1:320-1:640, у отдельных сывороток - до 1:1280.

| I |

ряд - нормальная лошадиная сыворотка

Рисунок 19 —Результаты контроля специфической активности иммунных сывороток лошадей-продуцентов в дот-иммуноанализе с использованием маркера, меченного коллоидным золотом

по горизонтали: двукратные разведения анти-рабических сывороток с1:40иАИГ с 1:160; по вертикали: 1-3 ряды - гипериммунные антирабиче-ские лошадиные сыворотки; 4 ряд - гетерологич-ный АИГ серия 39; 5 ряд - нормальная лошадиная сыворотка

Рисунок 20 - Результаты контроля специфической активности иммунных сывороток лошадей-продуцентов в дот-иммуноанализе с использованием маркера, меченного коллоидным золотом

Несомненный научно-практический интерес представляло изучение возможности использования разработанного диагностикума для проверки специфической активности сывороток людей после проведения полного курса антирабической вакцинации в связи с укусом подозрительным на бешенство животным. Особенно актуальна данная методика для оценки напряженности поствакцинального иммунитета. С этой целью было проведено исследование сывороток крови у трех пациентов Н., К., Е., полученных через 30 дней после окончания курса вакцинации. При определении уровня содержания вируснейтрализующих антител в крови вакцинированного выявлен титр 1:1280 (Рисунок 21).

по горизонтали: разведения сыворотки больного с 1:20 и иммуноглобулина с 1:80;

по вертикали: 1-3 ряд - сыворотки больных Н., К., Е., 4 ряд - гипериммунная лошадиная сыворотка; 5 ряд - нормальная человеческая сыворотка.

1 а

2 С?

4 • • ф ©

Рисунок 21 - Результаты детекции уровня специфической активности сывороток человека методом дот-иммуноанализа

Несомненный прикладной интерес представляло изучение возможности использования созданного диагностикума на этапах промышленного производства

при определении специфической активности образцов коммерческих серий гете-рологичного АИГ. Тест-система in vitro диагностики показала, что все промышленные серии имели высокие титры вируснейтрализующих антител. Уровень антител в коммерческих препаратах был зафиксирован на уровне 1:5000 - 1:10000, у отдельных серий - до 1:20000 (Рисунок 22).

по горизонтали: двукратные разведения

2 ) 0 ф t иммуноглобулина, начиная с 1:160; по

3 Ф #"*• • ~~ вертикали: 1-7 ряд - АИГ серий 45, 46, 48,

4 Л @ • ----- 50, 51, 52, 56; 8 ряд - нормальная лошади-

^ ^---------—----- ная сыворотка

6 7

__J

□ пп Q щ

ПС • ф

п пи •

П па

па • ш

п пп т _i _i _1

Till 1 п

Рисунок 22 - Результаты определения специфической активности АИГ методом дот-иммуноанализа

Следующим этапом нашего исследования было определение корреляции результатов реакции нейтрализации на белых мышах (тест in vivo) и тест-системы для in vitro диагностики. Было проведено сравнительное изучение специфической активности образцов препарата пяти коммерческих серий (с 35 по 49) антирабического иммуноглобулина. Было доказано, что коэффициент корреляции между ДИА и РН составил г = 0,9.

Титры специфических антирабических антител, выявленные в РН, колебались в пределах от 1:2576 до 1:13772, соответствующие титры определенные методом ДИА - от 1:2500 до 1:20000. Таким образом, на основании полученных данных можно сделать вывод о целесообразности применения дот-иммуноанализа на предварительных этапах промежуточного контроля производства антирабического иммуноглобулина при анализе уровня специфической активности иммунных лошадиных сывороток. Указанный метод можно рекомендовать как достойную альтернативу классической реакции нейтрализации.

Заключение

Обобщая изложенное в предыдущих главах, можно констатировать, что в последние годы отмечается позитивная тенденция, касающаяся разработок и внедрения в биотехнологические процессы наукоемких инновационных технологий, повышающих конкурентоспособность производимой продукции. Одним из вариантов совершенствования биотехнологического процесса производства является использование комплексного подхода, направленного на модернизацию сразу нескольких стадий технологического процесса. Данный многовекторный подход упрощает регламентные манипуляции, увеличивает уровень биологической безопасности персонала и окружающей среды, повышает качество и стандартность выпускаемых препаратов, снижает себестоимость конечного продукта. В своей работе мы коснулись совершенствования производства холерной вакцины и анти-

рабического иммуноглобулина и разработки на их примере научно-прикладных направлений модернизации медицинских иммунобиологических препаратов для профилактики особо опасных инфекционных болезней бактериальной и вирусной природы.

В работе показано, что использование питательных сред на основе дрожжевого автолизата в качестве моноосновы позволяет получить основные протективные антигены, являющиеся компонентами холерной химической вакцины, в титре сопоставимом, полученному на контрольной среде. Экспериментально доказана возможность замены мясного пептона на дрожжевой автолизат в составе производственных жидких питательных сред с основой из панкреатического гидролиза-та казеина при выращивании холерных вибрионов без изменения эффективности сред по способности накапливать биомассу и продуцировать протективные антигены.

Сконструированные питательные среды на основе ферментативного гидроли-зата фибрина превосходят среды на основе гидролизата казеина и обеспечивают эффективный рост производственных штаммов холерного вибриона с характерными морфологическими и тинкториальными свойствами, позволяя получить качественные протективные антигены холерного вибриона. Разработанные питательные среды дешевле традиционных соответственно в 3,3 и 1,3 раза, а на основе гидролизата фибрина соответственно в 13,6 раза и в 5,3 раза. Применение питательных сред на основе автолизата пекарских дрожжей в производстве холерной вакцины приведет к потенциальному снижению себестоимости вакцины холерной на 7-9%, а на основе гидролизата фибрина на 20-22%.

Разработанный биореактор обеспечивает высокий уровень биологической безопасности на этапах глубинного культивирования производственных штаммов холерного вибриона. Нашими исследованиями доказано, что культивирование производственных штаммов холерных вибрионов на разработанном биореакторе обеспечивает получение стандартных нативных О-АГ и холерогена. Иммунохими-ческие, физические и биохимические свойства протективных антигенов, полученных с помощью экспериментального ферментационного оборудования и по традиционной технологии, идентичны. При сравнительном анализе спецификационных свойств холерной вакцины, полученной по традиционной и экспериментальной технологиям, показано, что физико-химические и иммунобиологические свойства данного профилактического препарата, произведенного с использованием экспериментальной технологии, соответствовали требованиям нормативной документации.

ваны действия сотрудников при осуществлении производственных работ, связанных с Virus fixe. Принимая во внимание, что требования к обеспечению необходимого уровня биологической безопасности универсальны, можно предположить, что данные разработки будут актуальными при производстве аналогичных противовирусных иммунобиологических препаратов для профилактики особо опасных инфекционных болезней.

Разработанная и внедренная в производство оригинальная система каскадной фильтрации гарантирует получение стандартных и качественных серий антира-бического иммуноглобулина. Результаты работы вошли в основу регламента производства ПР № 01898109-26-10 иммуноглобулина антирабического из сыворотки крови лошади жидкого и фармакопейной статьи предприятия ФСП 002639/01250210 на данный препарат. Созданная система фильтрации может быть экстраполирована на производство как гомо- так, и гетерологичных иммуноглобулиновых препаратов. Кроме того, отдельные модули данной системы могут быть использованы при масштабном производстве других противовирусных специфических иммуноглобулиновых препаратов.

Сконструированный препарат на основе Р(аЬ')2-фрагментов антирабического иммуноглобулина обладает высокой вируснейтрализующей активностью в сравнительных экспериментах in vivo и in vitro. Препарат на основе F(ab')2-фрагментов антирабического иммуноглобулина нетоксичен. Сравнительное изучение реактогенных свойств в реакции активной анафилаксии показало, что препарат на основе Р(аЬ')2-фрагментов антирабического иммуноглобулина является более безопасным, чем исходный препарат нерасщепленного гетероло-гичного антирабического иммуноглобулина.

Разработанная тест-система на основе дот-иммуноанализа для определения уровня вируснейтрализующих антител в сыворотках животных-продуцентов и готовом антирабическом иммуноглобулине показала высокую чувствительность и специфичность. Тест-система позволяет получить результат в течение 2-3 часов. Экономическая эффективность от внедрения тест-системы на основе дот-иммуноанализа при производстве антирабического иммуноглобулина составила 352845 рублей при контроле одной серии препарата.

Выводы

1. Впервые предложен комплексный подход к совершенствованию производства медицинских иммунобиологических препаратов для профилактики особо опасных инфекционных болезней бактериальной и вирусной природы на примерах вакцины холерной бивалентной и гетерологичного антирабического иммуноглобулина.

2. Впервые разработаны питательные среды на основе автолизата пекарских дрожжей и гидролизата фибрина для культивирования производственных штаммов V. cholerae. Экспериментально доказано, что с использованием питательных сред на основе дрожжевого автолизата и гидролизата фибрина

возможно получение основных протективных антигенов (холерного токсина и О-антигена) холерной химической вакцины.

3. Спроектирован, сконструирован, изготовлен и установлен на участке культивирования аппаратурно-технологической линии производства холерной бивалентной вакцины биореактор с высоким уровнем биологической защиты персонала и окружающей среды. Оригинальными конструкционными особенностями разработанного биореактора является конструкция верхнего осевого магнитного привода и система мониторинга физико-химических показателей процесса культивирования, расположенная в специально разработанной кювете.

4. Впервые показано полное соответствие кинетик роста производственных штаммов V. сИо1егае 569В Инаба и М41 Огава и накопления О-антигена и холеро-гена, полученные при глубинном культивировании на экспериментальном биореакторе, регламентным требованиям. Изучение физиологических и морфологических свойств производственных штаммов холерных вибрионов в ходе их глубинного культивирования на производственных и разработанном биореакторах показало их идентичность.

5. Впервые разработан комплекс мер, направленный на обеспечение безопасности экспериментатора и окружающей среды при производстве гетерологич-ного антирабического иммуноглобулина при работе с фиксированным вирусом бешенства. Создана эффективная система биологической безопасности при производстве гетерологичного антирабического иммуноглобулина, включающая в себя нормативные документы (методические указания, регламент производства, стандартные операционные процедуры), регламентированные лабораторные методики, технологическое оборудование и высокие квалификационные требования к персоналу лаборатории.

6. Разработанная, сконструированная и внедренная в технологическую линию оригинальная система каскадной фильтрации позволяет получать стандартный и качественный коммерческий антирабический иммуноглобулин.

7. Сконструированная технологическая схема получения Г(аЬ')2-фрагментов антирабического иммуноглобулина позволяет получать препарат, обладающий высокой вируснейтрализующей активностью. Сравнительное изучение реактогенных свойств в реакции активной анафилаксии показало, что препарат на основе Р(аЬ')2"Фрагментов антирабического иммуноглобулина является более безопасным, чем исходный препарат нерасщепленного гетерологичного антирабического иммуноглобулина.

8. Доказана эффективность применения тест-систем на основе дот-иммуноанализа для определения уровня вируснейтрализующих антител в сыворотках крови животных-продуцентов и готовом препарате гетерологичного антирабического иммуноглобулина. Зафиксирована достоверная корреляция между результатами дот-иммуноанализа и традиционной реакции нейтрализации на мышах.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Работы, опубликованные в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК

1. Никифоров, А.К. Оценка риска как основа обеспечения безопасности работ с производственными штаммами фиксированного вируса бешенства / А.К. Никифоров, И.А. Дятлов, С.А. Еремин, O.A. Волох, М.Н. Ляпин // Проблемы особо опасных инфекций. - 2006.-№2.-С. 38-40.

2. Никифоров, А.К. Препарат антирабический на основе F(ab')2-фрагментов: получение и анализ / А.К. Никифоров, O.A. Волох, O.A. Лобовикова, И.А. Дятлов, И.М. Жулидов // ЖМЭИ. - 2007. - №1. - С.72-74.

3. Никифоров, А.К. Получение и анализ основных свойств препарата гете-рологичного антирабического иммуноглобулина, состоящего из F(ab')2-фрагментов / А.К. Никифоров, И.А. Дятлов, O.A. Волох, O.A. Лобовикова, М.Н. Киреев // Проблемы особо опасных инфекций. - 2007. - №2. - С.75-78.

4. Генералов, C.B. Получение препарата Р(аЬ')2-фрагмента антирабического иммуноглобулина с использованием иммобилизованного пепсина / C.B. Генералов, Е.Г. Абрамова, А.К. Никифоров, Е.М. Храмкова, И.А. Шепелев, Л.В. Савицкая, Л.Н. Минаева, М.В. Галкина, H.H. Кочкалова, М.Н. Киреев // Проблемы особо опасных инфекций. - 2008. - №3. - С.53-56.

5. Антонычева, М.В. Эффективность автолиза пекарских дрожжей, индуцированного ферментными препаратами / М.В. Антонычева, И.А. Кузьмиченко, А.К. Никифоров II Проблемы особо опасных инфекций. - 2009. - №2. - С.62-65.

6. Генералов, C.B. Изучение анафилактогенных свойств Р(аЬ')2-фрагментов гетерологичного антирабического иммуноглобулина / C.B. Генералов, Е.Г. Абрамова, А.К. Никифоров, Л.В. Савицкая, М.В. Галкина, Л.Н. Минаева, Т.А. Михеева, А.Г. Селезнева, И.М. Жулидов, P.A. Свинцов, Г.П. Лазаренко, Ю.В. Брандзи-шевский // Проблемы особо опасных инфекций. - 2009. - №2. - С. 65-67.

7. Абрамова, Е.Г. Производство гетерологичного антирабического иммуноглобулина - итоги первых пяти лет / Е.Г. Абрамова, А.К. Никифоров, O.A. Лобовикова, С.А. Еремин, Ю.Г. Васин, Т.А. Михеева, И.М. Жулидов, Л.Н. Минаева, М.В. Галкина, Л.В. Савицкая, А.Г. Селезнева, P.A. Свинцов, C.B. Генералов, И.В. Шульгина // Проблемы особо опасных инфекций. - 2010. - №3. - С. 58-62.

8. Шарапова, H.A. Определение активности антирабических сывороток и препарата гетерологичного антирабического иммуноглобулина in vitro в дот-иммуноанализе / H.A. Шарапова, Е.Г. Абрамова, А.К. Никифоров, Л.В. Савицкая, Л.Н. Минаева, Т.А. Михеева, М.В. Галкина, Я.М. Граснов // Проблемы особо опасных инфекций. — 2010. - №1. — С. 63-66.

9. Абрамова, Е.Г. Определение молекулярных параметров препарата гетерологичного антирабического иммуноглобулина методом гель-фильтрации / Е.Г. Абрамова, А.К. Никифоров, М.Н. Киреев, H.H. Кочкалова, C.B. Генералов, А.Г. Селезнева, Л.В. Савицкая, Ю.В. Иванов // Проблемы особо опасных инфекций. -2010. - № 4. — С.54-57.

10. Жулидов, И.М. Безотходные технологии в производстве гетерологичного антирабического иммуноглобулина / И.М. Жулидов, Е.Г. Абрамова, А.К. Никифоров, М.В. Антонычева, И.В. Шульгина, O.A. Лобовикова, Н.И. Бахрушина, А.Д. Белоусов, С.А. Еремин, М.Н. Киреев, H.A. Шарапова, Л.В. Савицкая, Т.А. Михе-ева, Л.Н. Минаева, М.В. Галкина, P.A. Свинцов, Т.В. Аленкина, Ю.Г. Васин, Г.В. Базлов // Проблемы особо опасных инфекций. - 2011. — № 4. - С.80-84.

11. Ульянов, А.Ю. Разработка биореактора и оценка возможности его использования в производстве холерной вакцины / А.Ю. Ульянов, А.К. Никифоров, С.А. Еремин, Ю.Г. Васин, Д.А. Щербаков, A.B. Комиссаров // Вестник Саратовского Госагроуниверситета. - 2011. - №1. - С. 39-43.

12. Онищенко, Г.Г. Специфическая профилактика холеры в современных условиях / Г.Г. Онищенко, В.В. Кутырев, Т.Н. Щуковская, Н.И. Смирнова, А.К. Никифоров, С.А. Еремин, В.П. Топорков // Проблемы особо опасных инфекций. - 2011. - №1. - С.5-12.

13. Жулидов, И.М. Биотехнологические аспекты переработки фибрина - отхода производства гетерологичного антирабического иммуноглобулина / И.М. Жулидов, Е.Г. Абрамова, М.В. Антонычева, А.К. Никифоров, И.В. Шульгина, O.A. Лобовикова, Н.И. Бахрушина, С.А. Еремин, Т.В. Аленкина // Вестник биотехнологии. - 2011. - Т.7, №3. - С. 17-23.

14. Базлов, Г.В. Совершенствование технологии получения экстракта авто-лизата пекарских дрожжей / Г.В. Базлов, A.B. Комиссаров, М.В. Антонычева, А.К. Никифоров, А.Д. Белоусов // Вестник Саратовского Госагроуниверситета. - 2012. -№1.- С. 11-14.

15. Базлов, Г.В. Конструирование питательных сред на основе дрожжевого автолизата пекарских дрожжей для культивирования холерного вибриона в производстве вакцины холерной бивалентной химической таблетированной / Г.В. Базлов, Н.Г. Авдеева, А.К. Никифоров, С.А. Еремин, O.A. Волох, Ю.И. Самохвалова, М.В. Антонычева, А.Д. Белоусов, A.B. Комиссаров, И.В. Сергеева // Вестник Саратовского Госагроуниверситета. - 2012. -№3. - С. 7-11.

16. Никифоров, А.К. Исследование процессов культивирования штаммов холерного вибриона - продуцентов протективных антигенов вакцины холерной бивалентной химической таблетированной в сконструированном биореакторе / А.К.Никифоров, A.B. Комиссаров, А.Ю. Ульянов, С.А. Еремин, O.A. Волох, Н.И. Белякова, Ю.А. Алешина, Ю.Г. Васин // Проблемы особо опасных инфекций. -2012,-№2.-С. 85-88.

17. Никифоров, А.К. Исследование свойств протективных антигенов Vibrio cholera 569В Инаба, полученных на производственных и разработанном биореакторе и по усовершенствованной технологии / А.К. Никифоров, М.Н. Киреев, О.В. Громова, A.B. Комиссаров, С.А. Еремин, O.A. Волох, Ю.А. Алешина, A.B. Гаева, Т.Л. Захарова, В.И. Павлова // Бюллетень Восточно-сибирского научного центра сибирского отделения РАМН. -2012. - №4, часть 1. - С. 284-287.

18. Никифоров, А.К. Промежуточные итоги обеспечения биологической

безопасности / A.K. Никифоров, Е.Г. Абрамова, С.А. Еремин, М.Н. Ляпин // Проблемы особо опасных инфекций. - 2012. - №4. - С. 5-12.

Патенты

19. Патент на изобретение №2360252 Российская Федерация. Диагностикум и тест-система для определения активности антирабических сывороток и препарата гетерологичного антирабического иммуноглобулина in vitro методом дот-иммуноанализа / H.A. Подборонова, Е.Г. Абрамова, А.К. Никифоров, Я.М. Краснов, Н.П. Гусева, М.Н. Киреев, В.В. Кутырев. Заявитель и патентообладатель ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб».

20. Патент на полезную модель № 86184 Российская Федерация. Ферментационная установка для культивирования микроорганизмов / А.К. Никифоров, Ю.Г. Васин, Д.А. Щербаков, А.Ю. Ульянов, В.В. Строганов, С.А. Еремин Заявитель и патентообладатель ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб».

21. Патент на изобретение № 2425866 Российская Федерация. Питательная среда для глубинного культивирования холерного вибриона / М.В. Антонычева, С.А. Нижегородцев, С.А. Еремин, Т.А. Аленкина, И.В. Шульгина, А.Д. Белоусов, И.М. Жулидов, А.К. Никифоров.

Тезисы и материалы докладов международных, всероссийских и отраслевых конференций

22. Кутырев, В.В. Организация производства антирабического иммуноглобулина и перспективы его совершенствования / В.В. Кутырев, И.А. Дятлов, А.К. Никифоров // Тезисы первой Всероссийской конференции по вакцинологии «Медицинские иммунобиологические препараты для профилактики, диагностики и лечения актуальных инфекций» - Москва 10-11 ноября 2004 г. - С. 23.

23. Никифоров, А.К. Применение новых технологий в производстве гетерологичного антирабического иммуноглобулина / А.К. Никифоров, O.A. Волох, М.Н. Киреев, И.А. Дятлов, C.B. Генералов // Сб. материалов Всероссийского научного форума «Инновационные технологии медицины XXI века». - М.: ЗАО «МЕДИ Экспо». - 2006 г. - С.137-138.

24. Волох, O.A. Использование ферментативного катализа для получения препарата антирабического иммуноглобулина с улучшенными свойствами на основе (РаЬ')2-фрагментов / O.A. Волох, А.К. Никифоров, C.B. Генералов, М.Н. Киреев, Е.Г. Абрамова // Материалы IX съезда Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов,— М.: Санэпидмедиа, 2007,- Т. 1. - С. 86-87.

25. Генералов, C.B. Получение F(ab')2- фрагментов антирабического иммуноглобулина в лабораторных условиях / C.B. Генералов, O.A. Волох, O.A. Лобови-кова, Е.Г. Абрамова, А.К. Никифоров // Методические документы и отчеты по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации. -2007.-С.20.

26. Киреев, М.Н. Конструирование и изучение потребительских характеристик тест-системы для определения антирабических антител в сыворотках живот-

ных / M.H. Киреев, H.A. Подборонова, Е.Г. Абрамова, H.П. Гусева, JI.B. Савицкая, A.A. Багаев, C.B. Генералов, А.К. Никифоров // Материалы VIII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ». - 25-26 сентября 2007 г., Саратов. - С. 219-221.

27. Генералов, C.B. Применение нативного и иммобилизованного пепсина для получения Р(аЬ')2-фрагментов антирабического иммуноглобулина / C.B. Генералов, O.A. Волох, O.A. Лобовикова, Е.Г. Абрамова, М.Н. Киреев, А.К. Никифоров // Научно-практический журнал «Биопрепараты». - 2007. - №2. - С.20-21.

28. Базлов, Г.В. Концентрирование автолизата пекарских дрожжей в процессе производства сухой питательной основы / Г.В. Базлов, Д.А. Щербаков, М.В. Антонычева, Ю.Г. Васин, В.В. Строганов, И.В. Шульгина, А.К. Никифоров, С.А. Нижегородцев // Международная научно-практическая конференция, посвященная 50-летию Научно-исследовательского института проблем биологической безопасности НЦБ МОН PK «Биотехнология в Казахстане: проблемы и перспективы инновационного развития. - 19-21 мая 2008г. Алматы - С.57-61.

29. Абрамова, Е.Г. Производство антирабического иммуноглобулина: современные технологии при проведении баромембранных процессов / Е.Г. Абрамова, А.К. Никифоров, Ю.Г. Васин // Материалы IX Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ. - Волгоград, 2008. - С. 13-15.

30. Абрамова, Е.Г. Современные фильтрационные технологии в производстве гетерологичного антирабического иммуноглобулина / Е.Г. Абрамова, А.К. Никифоров, Ю.Г. Васин, C.B. Генералов, А.Г. Селезнева, И.М. Жулидов // Тезисы всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней. Тезисы Всероссийской научно-практической конференции. - 11-12 ноября 2008 г. Москва. - С. 12.

31. Абрамова, Е.Г. Дот-иммуноанапиз при определении активности антира-бических сывороток и иммуноглобулиновых препаратов / Е.Г. Абрамова, А.К. Никифоров, H.A. Шарапова, М.Н. Киреев, Л.В. Савицкая, C.B. Генералов, Т.А. Михеева, Л.Н. Минаева, М.В. Галкина // Тезисы всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней. Тезисы Всероссийской научно-практической конференции. - 11-12 ноября 2008 г. Москва.-С. 13.

32. Генералов, C.B. Получение антирабического препарата на основе F(ab')2-фрагментов иммуноглобулина / C.B. Генералов, Е.Г. Абрамова, А.К. Никифоров, Е.М. Храмкова, И.А. Шепелев, Л.В. Савицкая, H.H. Кочкалова, М.Н. Киреев // Тезисы всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и

лечения инфекционных болезней. Тезисы Всероссийской научно-практической конференции. -11-12 ноября 2008 г. Москва. - С.38.

33. Генералов, C.B. Характеристика протективных и реактогенных свойств препарата Р(аЬ')2-фрагментов антирабического иммуноглобулина / C.B. Генералов, Е.Г. Абрамова, А.К. Никифоров, Л.В. Савицкая, Л.Н. Минаева, Т.А. Михеева, C.B. Будыхо // Тезисы всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней. Тезисы Всероссийской научно-практической конференции. -11-12 ноября 2008 г. Москва. - С.39.

34. Антонычева, М.В Безотходные технологии в производстве медицинских иммунобиологических препаратов / М.В. Антонычева, И.В. Шульгина, А.К. Никифоров, И.А. Кузьмиченко, С.А. Нижегородцев // Тезисы V международной конференции «Проблемы обращения с отходами лечебно-профилактических учреждений» Сборник материалов под редакцией академика РАМН Н.В. Русакова. -2009.-С. 34.

35. Никифоров, А.К. Состояние и перспективы производства медицинских иммунобиологических препаратов (МИБП) в ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб» / А.К. Никифоров, И.В. Шульгина, O.A. Лобовикова, Г.А. Сомова // Материалы юбилейной научно-практической конференции посвященной 90-летию Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной «Научное обеспечение противоэпидемической защиты населения». - 15-17 июня 2009 г. Н. Новгород. - С. 28-30.

36. Никифоров, А.К. Производство препарата гетерологичного антирабического иммуноглобулина: достижения и пути усовершенствования / А.К. Никифоров, Е.Г. Абрамова, O.A. Лобовикова, C.B. Генералов, H.H. Кочкалова, Ю.В. Иванов // Материалы пятого Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». — 16-20 марта 2009 г. Москва. — С. 182183.

37. Абрамова, Е.Г. Результаты использования дот-иммуноанализа для оценки специфической активности антирабических сывороток и иммуноглобулина / Е.Г. Абрамова, H.A. Шарапова, А.К. Никифоров, М.Н. Киреев, Л.В. Савицкая, C.B. Генералов, Т.А. Михеева, Л.Н. Минаева, М.В. Галкина // Материалы пятого Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». - 16-20 марта 2009 г. Москва. - С. 104.

38. Абрамова, Е.Г. Оценка активности антирабических сывороток и имму-ноглобулиновых препаратов in vitro / Е.Г. Абрамова, H.A. Шарапова, А.К. Никифоров, М.Н. Киреев, Л.В. Савицкая, C.B. Генералов, Т.А. Михеева, Л.Н. Минаева, М.В. Галкина, А.Ю. Бутырский // Сборник тезисов Второго международного конгресса «ЕвразияБио-2010», Москва, 13-15 апреля 2010 / Под ред. Р.Г. Василова. Сб. тезисов 2-ого международного конгресс-партнеринг и выставки по биотехнологии и биоэнергетике. -13-15 апреля 2010 г. Москва. - С. 5-6.

39. Киреев, М.Н. Выявление компонентов холерной химической вакцины

анатоксина и О-антигена при ее производстве / М.Н. Киреев, H.A. Шарапова, А.К. Никифоров // Сборник тезисов Второго международного конгресса «ЕвразияБио-2010», Москва, 13-15 апреля 2010 / Под ред. Р.Г. Василова. Сб. тезисов 2-ого международного конгресс-партнеринг и выставки по биотехнологии и биоэнергетике. -13-15 апреля 2010 г. Москва. - С.90-91.

40. Жулидов, И.М. Приготовление гидролизата фибрина и конструирование на его основе питательных сред для культивирования микроорганизмов / И.М. Жулидов, М.В. Антонычева, Н.И. Бахрушина, А.Д. Белоусов, И.В. Шульгина, C.B. Астафьева, Е.Г. Абрамова, А.К. Никифоров, С.А. Еремин, Н.И. Белякова, Т.В. Аленкина, C.B. Генералов // Материалы проблемной комиссии Координационного научного совета по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации - Ростов-на-Дону, июнь 2010, Вып. 23. - С. 116.

41. Жулидов, И.М. Безотходные технологии в производстве гетерологичного антирабического иммуноглобулина / И.М. Жулидов, А.К. Никифоров // Современные технологии обеспечения биологической безопасности. Материалы научно-практической школы-конференции молодых ученых и специалистов Роспотребна-дзора. -25-27 мая 2010 ФГУН ГНЦПМБ, Оболенск. - С. 122-124.

42. Ульянов, А.Ю. Экспериментальная оценка возможности использования разработанного промышленного биореактора в производстве холерной вакцины / А.Ю. Ульянов, А.К. Никифоров, Ю.Г. Васин, С.А. Еремин, Д.А. Щербаков, A.B. Комиссаров // Тезисы Всероссийской научно-практической конференции Вакци-нология 2010. -9-10 ноября 2010 г. Москва. - С. 113.

43. Жулидов, И.М. Приготовление гидролизата фибрина и конструирование на его основе питательных сред для культивирования микроорганизмов / И.М. Жулидов, М.В. Антонычева, Н.И. Бахрушина, А.Д. Белоусов, И.В. Шульгина, C.B. Астафьева, Е.Г. Абрамова, А.К. Никифоров, С.А. Еремин, Н.И. Белякова, Т.В. Аленкина, C.B. Генералов // Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями: материалы международной конференции / Под. ред. А.Б. Жебруна. - СПб.: ФГУННИИЭМ им. Пастера Роспотребнадзора, ООО "РосБалт" 2010.-С. 116.

44. Ульянов, А.Ю. Исследование массообменных характеристик ферментера с целью оценки возможности использования его в технологии производства холерной бивалентной химической вакцины / А.Ю. Ульянов, А.К. Никифоров, С.А. Еремин, Ю.Г. Васин, Д.А. Щербаков, В.В. Строганов, A.B. Комиссаров // Материалы международной научно-практической конференции "Вавиловские чтения-2010". - 25-26 ноября 2010 г. Саратов. - С. 179-180.

45. Ульянов, А.Ю. Математическая модель кинетики накопления О-антигена в ходе глубинного культивирования холерного вибриона / А.Ю. Ульянов, А.К. Никифоров, A.B. Комиссаров, С.А. Еремин // VI Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития». - 21-25 марта 2011 г. Москва. - С. 389-390.

46. Жулидов, И.М. Разработка безотходных технологий в производстве гете-

рологичного антирабического иммуноглобулина / И.М. Жулидов, А.К. Никифоров, Е.Г. Абрамова, С.А. Еремин, М.В. Антонычева, А.Д. Белоусов, МН. Киреев, И.В. Шульгина, O.A. Лобовикова, Т.В. Аленкина, Г.В. Базлов, Ю.Г. Васин // VI Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития». - 21-25 марта 2011 г. Москва. - С. 396-397.

47. Ульянов, А.Ю. Изучение биокинетических особенностей культивирования Vibrio cholerae М41 Огава в сконструированном биореакторе / А.Ю. Ульянов, А.К. Никифоров, С.А. Еремин, A.B. Комиссаров, Н.И. Белякова, Ю.Г. Васин, O.A. Волох // 15-я Международная Путинская школа-конференция молодых ученых. Сборник тезисов. -18-22 апреля 2011 г. Пущино. - С. 316.

48. Щуковская, Т.Н. Специфическая профилактика холеры на современном этапе / Т.Н. Щуковская, А.К. Никифоров, В.В. Кутырев // Материалы совещания специалистов Роспотребнадзора по вопросам совершенствования эпидемиологического надзора за холерой и материалы Проблемной комиссии (48.04). - Ростов на Дону, 2011-06-10, Выпуск № 24. - С. 163.

49. Громова, О.В. Новые технологии в производстве экспериментальных холерных вакцин против Vibrio cholerae 0139 / O.B. Громова, A.B. Комиссаров, Т.Л. Захарова, М.Н. Киреев, С.А. Еремин, А.К. Никифоров, В.В. Кутырев // Материалы совещания специалистов Роспотребнадзора по вопросам совершенствования эпидемиологического надзора за холерой и материалы Проблемной комиссии (48.04). - Ростов на Дону, 2011-06-10, Выпуск № 24. - С. 145.

50. Жулидов, И.М. Получение сухого гидролизата фибрина и применение его в качестве основы для изготовления питательных сред / И.М. Жулидов, А.К. Никифоров, Е.Г. Абрамова, М.В. Антонычева, O.A. Лобовикова // Материалы III научно-практической школы-конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских организации Роспотребнадзора «Современные технологии обеспечения биологической безопасности». - 31мая-2 июня 2011 г. Оболенск. — С. 261-263.

51. Жулидов, И.М. Приготовление гидролизата фибрина и конструирование на его основе питательных сред для культивирования микроорганизмов / И.М. Жулидов, С.А. Нижегородцев, М.В. Антонычева, Н.И. Бахрушина, А.Д. Белоусов, И.В. Шульгина, C.B. Астафьева, Е.Г. Абрамова, А.К. Никифоров, С.А. Еремин, Н.И. Белякова, Т.В. Аленкина, C.B. Генералов // В сб. методические документы и отчеты по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации. - Саратов, 2011. Методические рекомендации. - С. 14.

52. Жулидов, И.М. Биотехнологические аспекты переработки и применения отходов производства гетерологичного антирабического иммуноглобулина / И.М. Жулидов, А.К. Никифоров, Е.Г. Абрамова, М.В. Антонычева, O.A. Лобовикова, И.В. Шульгина, Т.В. Аленкина, С.А. Еремин, М.Н. Киреев // Инновационные технологии обеспечения противоэпидемической защиты населения: Материалы научно-практической конференции молодых ученых и специалистов Роспотребнадзора, поев. 90-летию со дня рождения академика РАМН И.Н. Блохиной. — Нижний

Новгород, 2011.-С. 95-98.

53. Жулидов, И.М. Разработка безотходных технологий в производстве ге-терологичного антирабического иммуноглобулина / И.М. Жулидов, А.К. Никифоров, Е.Г. Абрамова, С.А. Еремин, М.В. Антонычева, А.Д. Белоусов, М.Н. Кире-ев, И.В. Шульгина, O.A. Лобовикова, Т.В. Аленкина, Г.В. Базлов, Ю.Г. Васин // Биотехнология: состояние и перспективы развития. Матер. VI Междунар. конгресса. — 21 -25 марта 2011 г. Москва. — С. 396.

54. Жулидов, И.М. Получение сухого гидролизата фибрина и применение его в качестве основы для изготовления питательных сред / И.М. Жулидов, А.К. Никифоров, Е.Г. Абрамова, М.В. Антонычева, O.A. Лобовикова // Биотехнология: состояние и перспективы развития. Матер. VI Междунар. конгресса. -21-25 марта

2011 г. Москва. - С. 261-263.

55. Базлов, Г.В. Интенсификация процесса получения сухого экстракта дрожжевого автолизата / Г.В. Базлов, A.B. Комиссаров, М.В. Антонычева, А.К. Никифоров, А.Д. Белоусов, М.Н. Беляев // Материалы Московской международной научно-практической конференции «Фармацевтические и медицинские биотехнологии». - 20-22 марта 2012 г. Москва. - М.: ЗАО «Экспо-биохимтехнологии», РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2012. — С. 401.

56. Гаева, A.B. Сравнительный анализ свойств протективных антигенов Vibrio cholerae 569В Инаба полученных на разработанном биореакторе по экспериментальной технологии / A.B. Гаева, А.К. Никифоров, A.B. Комиссаров, Ю.А. Алешина, М.Н. Киреев, С.А. Еремин, О.В. Громова, Т.Л. Захарова, АЛО. Ульянов // БИОЛОГИЯ - НАУКА XXI ВЕКА: 16-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых. Сборник тезисов. - 16-21 апреля 2012 г. Пущине. -С. 293.

57. Базлов, Г.В. Перспективы применения питательных сред на основе дрожжевого автолизата пекарских дрожжей в производстве вакцины холерной бивалентной химической таблетированнной / Г.В. Базлов, Н.Г. Авдеева, А.К. Никифоров, С.А. Еремин, O.A. Волох, Ю.И. Самохвалова, М.В. Антонычева, А.Д. Белоусов, A.B. Комиссаров // Материалы X съезда ВНПОЭМП. - 12-13 апреля

2012 г. Москва. - Т.2, № 1-2. - С. 93.

58. Шарапова, H.A. Изучение специфической активности антирабического иммуноглобулина и иммунных сывороток in vitro в дот-иммуноанализе / H.A. Шарапова, Е.Г. Абрамова, А.К. Никифоров, М.Н. Киреев, Л.В. Савицкая, C.B. Генералов // Материалы X съезда ВНПОЭМП. - 12-13 апреля 2012 г. Москва. - Т.2, № 1-2.-С. 113.

59. Никифоров, А.К. Новые питательные среды для культивирования возбудителей чумы и холеры / А.К. Никифоров, М.В. Антонычева, И.М. Жулидов, O.A. Лобовикова, И.В. Шульгина, С.А. Еремин, Т.В. Аленкина, Н.И. Бахрушина, C.B. Астафьева, А.Д. Белоусов, Л.В. Зайцева, О.С. Пуденкова, Е.Г. Абрамова // Материалы X съезда ВНПОЭМП. - 12-13 апреля 2012г. Москва. - Т.2, № 1-2. -С.306.

60. Жулидов, И.М. Новая питательная среда на основе сухого гидролизата

фибрина для культивирования холерных вибрионов / И.М. Жулидов, М.В. Анто-нычева, O.A. Лобовикова, Е.Г. Абрамова, А.К. Никифоров, И.В. Шульгина, Л.В. Зайцева, Н.П. Миронова, Н.И. Бахрушина, C.B. Астафьева, В.И. Павлова, B.C. Бронникова, O.A. Волох, Н.Г. Авдеева, Г.В. Базлов, A.B. Комиссаров // Матер, научной конференции с международным участием «Фундаментальные и прикладные аспекты инфекционной патологии», посвященной 100-летию Института эпидемиологии и микробиологии НЦ ПЗСРЧ СО РАМН. - Бюллетень ВосточноСибирского научного центра СОРАН. -2012. -№ 5 (87). - Ч. 1. - С. 220-223.

61. Жулидов, И.М. Разработка приемов безотходных технологий в производстве гетерологичного антирабического иммуноглобулина / И.М. Жулидов, А.К. Никифоров, М.В. Антонычева, Е.Г. Абрамова, O.A. Лобовикова, O.A. Волох, М.Н. Киреев // Материалы Международной научно-практической конференции «Биотехнология: реальность и перспективы в сельском хозяйстве». - Саратов, 2013.-С. 54-56.

Формат 60*84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная.

Гарнитура Тайме. Усл. п. л. 2,0. Тираж 100 экз. Отпечатано на полиграфическом оборудовании ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» Роспотребнадаора. 410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46.

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Никифоров, Алексей Константинович, Саратов

ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО НАДЗОРУ В СФЕРЕ ЗАЩИТЫ ПРАВ

ПОТРЕБИТЕЛЕЙ И БЛАГОПОЛУЧИЯ ЧЕЛОВЕКА

Федеральное казенное учреждение здравоохранения Российский научно-исследовательский противочумный

институт Микроб"

На правах^рукописи

05201450920

НИКИФОРОВ Алексей Константинович

03.02.03-микробиология 03.01.06 -биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Научный консультант: академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор

В.В. Кутырев

Саратов, 2014

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение.............................................................................. 5

ГЛАВА 1. ОСНОВНЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЙ, 23 ПРИМЕНЯЕМЫЕ В ПРОИЗВОДСТВЕ МЕДИЦИНСКИХ ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ (МИПБ)

(ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)..................................................................

1.1. Питательные среды для культивирования микроорганизмов.................. 27

1.2. Варианты глубинного культивирования, применяемые при производстве иммунобиологических препаратов....................................................... 36

1.3. Ферментационное оборудование для культивирования микроорганизмов............................................................................................... 41

1.4. Фильтрационные технологии в производстве МИБП........................... 47

1.5. Современные направления усовершенствования противовирусных препарг тов на примере средств для постэкспозиционной профилактики бешенства................................................................................................. 58

1.6. Иммуноглобулиновые профилактические препараты: классификация и тех

нологии получения............................................................................. 63

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ............................................... 76

2.1. Материалы.............................................................................. 77

2.1.1. Штаммы микроорганизмов......................................................... 77

2.1.2. Питательные среды, используемые в экспериментах......................... 77

2.1.3. Экспериментальные животные.................................................... 78

2.1.4. Реактивы................................................................................ 78

2.1.5. Приборы и оборудование............................................................ 82

2.2. Методы................................................................................... 84

2.2.1. Микробиологические методы...................................................... 84

2.2.2. Биологические методы............................................................... 85

2.2.3. Биохимические методы.............................................................. 85

2.2.4. Химические методы.................................................................. 89

2.2.5. Физические методы.................................................................. 86

2.2.6. Физико-химические методы........................................................ 87

2.2.7. Методы выделения гамма-глобулина............................................. 88

2.2.8. Методы контроля гетерологичного антирабического иммуноглобулина. 88

2.2.9. Методы математической и статистической обработки материалов...... 89

ГЛАВА 3. КОНСТРУИРОВАНИЕ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД НА ОСНОВЕ СУХОГО АВТОЛИЗАТА ПЕКАРСКИХ ДРОЖЖЕЙ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ПРОИЗВОДСТВЕННЫХ ШТАММОВ ХОЛЕРНОГО ВИБРИОНА............................................................................................... 90

3.1. Конструирование питательных сред на основе дрожжевого автолизата для 93 культивирования производственных штаммов V. cholerae.....................................

3.2. Применение питательных сред на основе дрожжевого автолизата для культивирования производственных штаммов V. cholerae.................................. 99

3.3. Экономическая эффективность питательной среды - автолизата пекарских

дрожжей.......................................................................................... 104

ГЛАВА 4. РАЗРАБОТКА ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ПРОИЗВОДСТВЕННЫХ ШТАММОВ

V. CHOLERAE НА ОСНОВЕ ГИДРОЛИЗ ATA ФИБРИНА............................. 109

4.1. Получение ферментативного гидролизата фибрина............................... 111

4.2. Конструирование питательных сред на основе ферментативного гидролизе

та фибрина для культивирования штаммов V. cholerae.......................................... 115

4.3. Сравнительный анализ питательных сред, полученных на основе гидролизата фибрина и традиционных сред в условиях глубинного культивирования......................................................................................................... 120

4.4. Исследования морфометрических показателей холерного вибриона, культивируемого на экспериментальных питательных средах..........................................124

4.5. Экономическая эффективность питательной среды на основе гидролизата

фибрина.......................................................................................... 128

ГЛАВА 5. РАЗРАБОТКА БИОРЕАКТОРА ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ ПРОЦЕССОВ ГЛУБИННОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ПРОИЗВОДСТВЕННЫХ ШТАММОВ ХОЛЕРНОГО ВИБРИОНА................................................ 131

5.1. Технические и конструкторские решения при создании экспериментального ферментера на базе реактора РЗРЯ-6/0,63............................................ 135

5.2. Определение массообменных характеристик аппарата для ферментации... 140

5.3. Исследование процессов культивирования штаммов холерного вибриона-продуцентов протективных антигенов вакцины холерной бивалентной химической таблетированной......................................................................... 143

5.4. Сравнительный анализ препаратов протективных антигенов V. cholerae и таблетированной холерной вакцины, полученных с помощью экспериментального и производственного биореакторов................................................. 148

5.5. Изучение физико-химических и иммунобиологических свойств холерной вакцины, произведенной по экспериментальной и традиционной технологиям...................................................................................................... 152

ГЛАВА 6. ОЦЕНКА РИСКОВ ПРИ РАБОТЕ С ПРОИЗВОДСТВЕННЫМ]

ШТАММАМИ «ФИКСИРОВАННОГО» ВИРУСА БЕШЕНСТВА............ 156

ГЛАВА 7. ПРИМЕНЕНИЕ СОВРЕМЕННЫХ ФИЛЬТРАЦИОННЫХ ТЕХНОЛОГИЙ В ПРОИЗВОДСТВЕ АНТИРАБИЧЕСКОГО ИММУНОГЛОБУЛИНА И РАЗРАБОТКА ПРИНЦИПИАЛЬНОЙ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОЙ СХЕМЫ, ОБЕСПЕЧИВАЮЩЕЙ КАЧЕСТВО ПРЕПАРАТА ПРИ ИЗГОТОВЛЕНИИ КОММЕРЧЕСКИХ СЕРИЙ.................... 165

7.1. Разработка биотехнологической системы предварительной осветляющей фильтрация антирабического иммуноглобулина...................................... 166

7.2. Разработка технологического модуля для проведения ультрафильтрации антирабического иммуноглобулина...................................................... 172

7.3. Конструирование фильтрационной системы для эффективного удаления гемпигмента и пирогенов из полуфабриката антирабического иммуноглобулина................................................................................................. 177

7.4. Разработка системы стерилизующей фильтрации антирабического иммуноглобулина..................................................................................... 186

ГЛАВА 8. РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ

Е(аЬ')2-ФРАГМЕНТОВ АНТИРАБИЧЕСКОГО ИММУНОГЛОБУЛИНА. 195 8.1. Выбор оптимальных параметров ферментативного гидролиза антирабического иммуноглобулина.................................................................... 198

8.1.1.Определение оптимальной температуры проведения ферментативного

гидролиза антирабического иммуноглобулина........................................ 199

8.1.2. Определение оптимальной pH реакционной смеси при проведении фер-

ментативного гидролиза антирабического иммуноглобулина....................... 200

8.1.3.Определение условий хроматографического фракционирования антираби

ческого иммуноглобулина.................................................................... 201

8.1.4. Концентрирование Р(аЬ2')-фрагментов антирабического иммуноглобули на.................................................................................................. 203

8.2. Определение физико-химических показателей антирабического иммуноглобулина, полученного на основе Р(аЬ')2-фрагментов............................. 206

8.3. Исследование иммунобиологических свойств F(ab'^-фрагментов антирабического иммуноглобулина................................................................ 209

8.3.1. Определение специфической активности, полученных препаратов....... 209

8.3.2. Определение токсигенных и анафилактогенных свойств разработанных

иммуноглобулинов............................................................................ 215

ГЛАВА 9. ИЗУЧЕНИЕ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ IN VITRO ДИАГНОСТИКИ УРОВНЯ АНТИРАБИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ НА ОСНОВЕ ДОТ-ИММУНОАНАЛИЗА...................................................................... 223

9.1. Изучение использования нитроцеллюлозных мембран для конструирования диагностической тест-системы на основе дот-иммуноанализа............... 231

9.2. Детекция уровня вируснейтрализующих антител в коммерческом антира-бическом иммуноглобулине и гипериммунных сыворотках в дот-иммупоанализе с использованием разработанного диагиостикума................ 233

9.3. Определение специфичности тест-систем на основе дот-иммуноанализа дл детекции антирабических антител......................................................... 238

9.4. Изучение стабильности диагностикума в процессе хранения.................. 240

9.5. Экономическая эффективность применения гест-системы на основе дот-иммуноанализа в процессе производства гетерологичного антирабического им

муноглобулина................................................................................. 242

ЗАКЛЮЧЕНИЕ............................................................................... 244

ВЫВОДЫ....................................................................................... 255

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ................................... 257

ВВЕДЕНИЕ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

В мире в последнее время возрастает понимание чрезвычайной социально-экономической значимости глобального распространения опасных инфекционных заболеваний. По оценке ряда экспертов, до 2 млрд. человек в мире, страдают от инфекционных болезней, до 3 млрд. проживают в условиях кризисов природного или антропогенного характера (Воробьев A.A., 1987; Покровский В.И., 2002; Онищенко Г.Г., 2007).

В современных социально-экономических, миграционных и эпидемиологических условиях при перманентной регистрации новых инфекционных болезней, возвращении «старых» нозологий и угрозе их глобального распространения, необходимость разработки средств специфической профилактики особо опасных инфекционных болезней приобретает особую актуальность.

Необходима разработка новой стратегии борьбы с чрезвычайными эпидемическими ситуациями, которая должна вобрать в себя основные достижения теории и практики управления инфекционными болезнями и обогатить их новыми технологиями индикации, дифференцирования и профилактики (Онищенко Г.Г., 2006, Кутырев В.В., 2006, Щуковская Т.Н., 2009, 2011, www.who.int/tdr/documehts/TDR-10-year-vision-rus.pdr).

Основные мероприятия по повышению уровня биологической безопасности биотехнологических объектов нашли свое отражение в Федеральной целевой программе «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009-2014 годы)».

В программе отмечено, что особую актуальность приобретают исследования в области совершенствования вакцинопрофилактики особо опасных инфекционных болезней, возбудители которых отнесены к I-II группам патогенности. Согласно Международным медико-санитарным правилам (2005) легочная чума, холера, желтая лихорадка, гемморагические лихорадки Эбола, Ласса, Марбург и

еще целый ряд инфекционных болезней могут спровоцировать чрезвычайную ситуацию в области общественного здравоохранения международного значения (Онищенко Г.Г., 2006, 2007, http://www.un.org/ru/documents/decl_conv/ сопуеп1юп5^ЭД1еа1Ш_ге§и1а1юп5^£ Международные медико-санитарные правила ММСП, 2005). Таким примером является масштабная эпидемия холеры на Гаити в 2010-2013 г.г.

В настоящее время в мире остается высокой заболеваемость холерой. Согласно официальным данным, опубликованным ВОЗ, за последние 3 года ежегодно регистрировалось 178000-237000 случаев холеры и 4000-6300 летальных исходов. Однако, с учетом большого числа не представленных сведений, по тем или иным причинам, во Всемирную организацию здравоохранения, реальная заболеваемость холерой по оценке экспертов ВОЗ, составляет 3-5 млн. случаев в год, в результате которой умирает ежегодно более 120000 человек (www.who.int/mediacenter/factsheets/fsl07/ru/index.html). Больные холерой преимущественно регистрировались в странах Африки и Азии, где имеются эндемические очаги холеры. Предпосылками для формирования очагов в данных регионах являются низкий социально-экономический уровень населения, жаркий климат и отсутствие профилактических мероприятий со стороны органов здравоохранения. Однако, в 2010 году была зарегистрирована крупная вспышка холеры в западном полушарии на острове Гаити в результате которой погибло более 8000 человек (www.who.int/csr/don/2010_10_26/ru, www.rg.ru/2011/05/ll/ holera-dok.html). Угроза выноса инфекции из эндемичных стран и реальность возникновения заносных эпидемических очагов остается актуальной (Онищенко Г.Г., 2007, 2011, Щуковская Т.Н., 2009). Данное заключение подтверждается событиями в Мариуполе (Украина) в 2011 году, где была зафиксирована вспышка холеры (www.rospotrebnadzor.com). В Российской Федерации практически ежегодно регистрируются завозные случаи холеры (www.rospotrebnadzor.com).

Одним из эффективных методов борьбы с заболеваемостью холерой, по мнению экспертов ВОЗ (www.who.int/immunization/pp_cholerae_ru.pdr), является вакцинация контингента с повышенным риском инфицирования (граждане, по-

страдавшие от стихийных бедствий, беженцы, лица без определенного места жительства), а также туристов (Weekly Epidemiological Record, 2001 http://www.filariasis.org/pdfs/Press%20Centre/WER/2001_76_389-400.pdf). В Российской Федерации вакцинация против холеры включена в календарь профилактических прививок и проводится по эпидемиологическим показаниям. В качестве средства специфической профилактики применяется вакцина холерная химическая бивалентная производства ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» (Джапаридзе М.Н. и соавт., 1982, Кутырев В.В. и соавт., 2006).

ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» с начала своего образования в 1918 году занимался разработкой и производством профилактических и диагностических препаратов. Особое внимание уделялось исследованиям, направленным на совершенствование препаратов для профилактики холеры.

В 1971-1973 гг. в ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» была разработана и внедрена в практику здравоохранения вакцина холерная сухая и жидкая (холероген-анатоксин), предназначенная для внутрикожного введения (Джапаридзе Н.М., 1976). Основным действующим началом холерной вакцины являлся холероген-анатоксин холерного вибриона (Vibrio cholerae) серовара Инаба. Препарат создавал у привитых антитоксический иммунитет.

В 1974 была освоена производственная линия и налажен серийный выпуск препарата. Разработана поточная аппаратно-технологическая линия изготовления холерогена-анатоксина. В результате дальнейших исследований был усовершенствован препарат холероген-анатоксин. В него был добавлен новый компонент - О-антиген холерного вибриона, что позволило создавать у вакцинированных и антитоксический, и антибактериальный иммунитет.

С 1991г. во исполнение приказа Министерства здравоохранения СССР №28 от 22.05.91г. разрешено применение в практике здравоохранения вакцины холерной бивалентной химической. С 1995г. начато масштабное производство указанного препарата. В состав холерной химической вакцины входят три основных протективных антигена холерного вибриона: 01 антиген серовара Ина-

ба, 01 антиген серовара Огава, а также инактивированный холерный токсин, продуцируемый холерным вибрионом классического биовара.

Исследования по усовершенствованию холерной вакцины в ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» ведутся традиционно с использованием последних достижений современной биотехнологии. В своей работе мы подводим итоги научно-экспериментальной работы за период с 2000 по 2012 г.г. выполненной в экспериментально-производственных подразделениях ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб». В 2000-2001 г.г. технология производства холерной вакцины нуждалась в существенной модернизации. Применяемые для производства холерной вакцины биореакторы не обеспечивали необходимый уровень биологической безопасности, а объем биомассы, получаемый в процессе глубинного культивирования, не соответствовал планам производства данного профилактического препарата.

В производстве холерной вакцины для культивирования штаммов V. chol-erae по существующей технологии в основном применяли питательные среды на основе мясного перевара по Хоттингеру и на основе панкреатического гидроли-зата казеина с пептоном. Нестандартность исходного сырья не позволяет получать биомассу холерного вибриона и протективные антигены в необходимом количестве. В тоже время использование для глубинного культивирования питательных сред импортного производства увеличивает себестоимость холерной вакцины (применение питательных сред на основе автолизата пекарских дрожжей производства «Himedia» увеличит цену препарата в 1,3 раза, производства «Мегск» в 1,8 раза).

Исходя из вышеизложенного, мы определили основные направления усовершенствования данного производства. Во-первых - повышение уровня биологической безопасности при проведении глубинного культивирования производственных штаммов холерного вибриона, за счет использования сконструированного биореактора. Во-вторых - усовершенствование основных этапов технологического процесса, включающих: разработку новых, высокоэффективных, стандартных, недорогих, питательных сред; конструирование аппарата для

культивирования производственных штаммов холерного вибриона, обеспечивающего необходимый объем производства холерной вакцины.

Другим важнейшим направлением деятельности ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб�

Информация о работе

Никифоров, Алексей Константинович
доктора биологических наук
Саратов, 2014
ВАК 03.02.03

Диссертация

Разработка научно-прикладных направлений совершенствования иммунобиологических препаратов для профилактики холеры и бешенства - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Разработка научно-прикладных направлений совершенствования иммунобиологических препаратов для профилактики холеры и бешенства - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы