Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Иммунобиологические свойства штамма ERA-CB 20M вируса бешенства и разработка на его основе антирабической вакцины

ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Иммунобиологические свойства штамма ERA-CB 20M вируса бешенства и разработка на его основе антирабической вакцины"



На правах рукописи

ЛОСИЧ Милана Анатольевна

ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ШТАММА ЕИА-СВ 20М ВИРУСА БЕШЕНСТВА И РАЗРАБОТКА НА ЕГО ОСНОВЕ АНТИРАБИЧЕСКОЙ ВАКЦИНЫ

03.02.02. - вирусология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2014

005549548

Москва-2014 г.

005549548

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт вирусологии имени Д.И. Ивановского» Минздрава РФ и Автономной некоммерческой организации «Научно-исследовательский институт диагностики и профилактики болезней человека и животных», г. Москва.

Научные руководители:

доктор медицинских наук Грибенча Сергей Васильевич

доктор биологических наук,

профессор Алипер Тарас Иванович

Официальные оппоненты:

Рыбаков Сергей Сергеевич - доктор биологических наук, профессор, начальник научно-образовательного отдела ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»)

Уласов Валентин Ильич - доктор ветеринарных наук, профессор, главный научный сотрудник отдела «Всероссийской коллекции штаммов микроорганизмов» ФГБУ «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГБУ «ВГНКИ»)

Ведущая организация:

ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко» (ВИЭВ), г. Москва

Защита диссертации состоится «23 » июня 2014 г. в 12 00 час. на заседании диссертационного совета Д 208.131.01 при ФГБУ «Научно-исследовательский институт вирусологии имени Д.И. Ивановского» Минздрава РФ по адресу 123098, г. Москва, ул. Гамалеи, д. 16.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Научно-исследовательский институт вирусологии имени Д.И. Ивановского» Минздрава РФ (123098, г. Москва, ул. Гамалеи, д. 16).

Автореферат разослан Ьйр://уак2 .ed.gov.ru/

мая 2014 г. и размещен на сайте

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

Бурцева Е.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Бешенство - это острое нейровирусное заболевание, передаваемое человеку через укусы лисы, собаки, волка и других плотоядных животных, среди которых в естественной среде обитания вирус распространяется также при укусах. Мишенью вируса является центральная нервная система. Вирус бешенства (ВБ) принадлежит к отряду Mononegavirales, семейству Rhabdoviridae, роду- Lyssaviruss и является единственным из царства Vira, поражающим всех теплокровных животных, в том числе и человека со 100 % летальностью (Грибенча C.B., 2008; Львов Д.К. с соавт., 2013 и др.). Глобальный характер распространения и многогастальность рабической инфекции привели к формированию большого разнообразия вариантов ВБ: бешенство лис, собак, арктическое бешенство, бешенство скунсов, енотов, мангуст, летучих мышей и др., а также их биологических субвариантов (Львов Д.К. с соавт., 2008 и др.). Так, по оценке Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ), бешенство входит в пятерку инфекционных болезней, общих для человека и животных, наносящих наибольший социальный и экономический ущерб (Бюллетень ВОЗ,2005). В РФ бешенство регистрируется в 63 регионах страны, представляя собой серьезную угрозу, как для животных, так и для человека. С ростом числа бездомных собак и кошек возрастает и число случаев обращения людей за антирабической помощью. Для профилактики бешенства у человека и животных разработаны и используются инактивированные культуральные вакцины против бешенства, а также живые оральные вакцины, которые применяются только для диких животных. При этом основным показателем иммуногенности антирабических вакцин является их способность индуцировать у иммунизированных животных синтез антирабических вируснейтрализующих антител. Поэтому решающим условием разработки вакцин является подбор такого сочетания штамма вируса и адъюванта, который позволит стимулировать у вакцинированных животных напряженный и длительный антирабический иммунитет. Сложная эпизоотическая ситуация по бешенству в РФ требует разработки новых, более высокоим-муногенных вакцин. В связи с этим весьма актуальными представляются ис-

следования, направленные на изучение различных штаммов ВБ и разработку технологии приготовления антирабических вакцин с использованием адъюван-тов нового поколения.

Цель исследования: изучить иммунобиологические свойства вакцинного штамма ERA-CB 20М вируса бешенства и разработать на его основе антираби-ческую вакцину.

Задачи исследования:

1. Изучить спектр чувствительности различных линий клеток к штамму ERA-CB 20М вируса бешенства.

2. Определить оптимальные условия культивирования вируса бешенства штамм ERA-CB 20М in vitro.

3. Изучить нейровирулентные свойства и патогенность вакцинного штамма ERA-CB 20М вируса бешенства для животных при различных способах введения.

4. Изучить антигенные свойства вируса бешенства штамм ERA-CB 20М в опытах на естественно-восприимчивых животных.

5. Изучить иммуногенные свойства вируса бешенства штамм ERA-CB 20М на белых беспородных мышах методом NIH.

6. Провести молекулярно-генетический анализ штамма ERA-CB 20М вируса бешенства.

7. Приготовить экспериментальные серии культуральной инактивированной вакцины на основе штамма ERA-CB 20М вируса бешенства в комбинации с различными адъювантами: ГОА и Abisco R-100.

8. Разработать иммуноферментную тест-систему (ИФА) на основе мо-ноклональных антител (МкА) 1С5 для оценки содержания гликопротеина (G-белка) ВБ в вируссодержащей культуральной жидкости.

Научная новизна работы. Впервые для получения нового вакцинного вируса бешенства был использован новый принцип селекции, основанный на определении количественного уровня синтеза гликопротеина - главного имму-ногена вируса бешенства. Впервые определен спектр чувствительных культур

клеток для репликации вакцинного штамма ERA-CB 20М вируса бешенства и разработаны оптимальные условия культивирования вакцинного вируса. Определена патогенность вируса бешенства штамма ERA-CB 20М.

Впервые дана характеристика биологических свойств штамма ERA-CB 20М вируса бешенства. Изучены антигенные и иммуногенные свойства вируса штамма ERA-CB 20М на различных видах животных: мышах, песцах, собаках и кошках. Впервые проведен филогенетический анализ фрагментов генов N и G вакцинного штамма ERA-CB 20М вируса бешенства. Установлено отличие от референтного штамма SAD1 по первичной структуре РНК на 10% и 15% соответственно.

Практическая значимость работы. В рамках выполненной работы на основе нового принципа селекции из популяции вируса бешенства штамм ERA получен новый вакцинный вирус штамм ERA-CB 20М с наиболее высоким уровнем синтеза G-белка, на базе которого разработана новая высо-коиммуногенная антирабическая вакцина для ветеринарного применения.

Разработана технология изготовления антирабической вакцины из ВБ штамм ERA-CB 20М с использованием нового иммуностимулирующего комплекса Abisco R-100 в качестве адъюванта. Для оценки поствакцинального ан-тирабического иммунитета у животных внедрён флуоресцентный вируснейтра-лизующий тест (метод FAVN), рекомендованный ВОЗ.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Наиболее пригодной для производства инактивированной культуральной антирабической вакцины из штамма ERA-CB 20М вируса бешенства является перевиваемая линия клеток почки сирийского хомячка (ВНК-21-13С).

2. Способ селекции вакцинного штамма ВБ по уровню синтеза поверхностного гликопротеина (G-белка).

3. Созданные на основе штамма ERA-CB 20М экспериментальные серии вакцины против бешенства в комбинации с современным адъювантом Abisco R-100 полностью отвечают требованиям, предъявляемым к антирабическим вакцинам.

4. Разработанная на основе МкА 1С5 иммуноферментная тест-система пригодна для контроля G-белка ВБ при производстве антирабических вакцин.

Апробация работы. Результаты исследований представлены и обсуждены на: Международном семинаре на базе Кубанского Аграрного Университета «Современные аспекты в диагностике и профилактике бешенства согласно требованиям ВОЗ» (г. Краснодар, 2011); XIX и XXI Московском Международном Ветеринарном Конгрессе (г. Москва, 2011, 2013); Международной научно-практической конференции «Современные методы диагностики и средств профилактики бешенства» (г. Санкт-Петербург, 2012); Международном Семинаре по вопросам контроля и борьбы с бешенством, (г. Санкт-Петербург, 2012); Rabies Serology Meeting ANSES (Нанси, Франция, 2013).

Публикации научных работ. По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ, в том числе 5 статей в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендуемых ВАК при Минобрнауки РФ.

Личный вклад соискателя. Все экспериментальные и теоретические исследования по теме диссертации проведены лично соискателем. Молекулярно-биологические исследования и эксперименты по оценке эффективности вакцинных препаратов на животных выполнены совместно с сотрудниками отдела прикладной вирусологии и биотехнологии ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского». Все материалы, представленные в диссертационной работе, обобщены и проанализированы лично автором.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 139 стр. машинописного текста и состоит из общей характеристики работы, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов, практических предложений и списка литературы. Материалы диссертации иллюстрированы 26 таблицами и 16 рисунками (3 фото). Список литературы включает 133 источника (21 отечественный и 112 зарубежных авторов).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Вирусы. В работе были использованы следующие вирусы бешенства: вирус бешенства штамм ERA-CB 20М; референс - штаммы, представленные референтной лабораторией OIE по бешенству ANSES (Нанси, Франция): вирус бешенства CVS-11 мозговой (challenge virus standard); CVS-11 (фиксированный культуральный штамм).

Культуры клеток. Культивирование вируса проводили в стационарном и роллерном монослое клеток ВНК-21 (почка сирийского хомячка), BSR (клон ВНК -21), VERO (почка зеленой мартышки) и ПС (почка сайги), ВНК-0 (клон ВНК -21), ВНК-Щ (клон ВНК -21). Культуры клеток получали из лаборатории ANSES и лаборатории культур и тканей ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава РФ.

Референтные сыворотки: референс-стандарт ВОЗ (Rabies Immunoglobulin, Copenhagen, Denmark) содержит 30 МЕ/мл; OIE референс-стандарт сыворотки соответствует 0,50 МЕ/мл ANSES (Нанси, Франция); отраслевой стандартный образец иммуногенности антирабической вакцины ФГБУ «ВГНКИ» содержит 1,0 МЕ/мл.

Экспериментальные животные: беспородные белые мыши (3-5-дневные, массой 6-7 г и 16-18 г); морские свинки (300-350 г); белые крысы; беспородные щенки собак (3-4 мес.); взрослые собаки; беспородные котята (3-4 мес.); взрослые кошки; песцы (10-12 мес.). Все работы с животными проводились согласно «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Минздрава от 12.08.1977 г. №755).

Адъюванты. Гидроокись алюминия ГОА - 6% гель (ФГУП «Щелковский биокомбинат»), Abisco R-100 (Isconova, Швеция).

Определение инфекционной активности вируса. Инфекционную активность вируса определяли методом титрования в культуре клеток (ВНК-21) и на новорожденных мышах. Титр вируса выражали в тканевых культуральных

инфекционных дозах lg ТЦЦ50/мл (TCID50/ml) и мышиных летальных дозах МЛД50/мл.

Инактивация вируса. Для инактивации вируса использовали р-про-пиолактон в разведении 1: 4000. Полноту инактивакции вируса оценивали по отсутствию флюоресценции в чувствительной культуре клеток ВНК -21 в течение четырех пассажей.

Определение патогенности вируса для животных. Патогенность вируса определяли на различных видах животных при интрацеребральном, внутримышечном, подкожном и оральном способах введения. Культуральным ви-руссодержащим материалом интрацеребрально заражали новорожденных мышей и мышей массой 6-8 г в объёме 0,03 см3, морских свинок - 0,1 см3, лис -0,2 см3, песцов -0,1- 0,2 см3, собак - 0,1- 0,2 см3. Культуральный вируссо-держащий материал вводили внутримышечно в объеме 0,1 см3 мышам, морским свинкам - 0,5 см3, песцам, собакам и кошкам - по 1 см3 ви-руссодержащего материала. При подкожном заражении вируссодержащий материал вводили мышам в объёме 0,1 см3, морским свинкам - 0,5 см3.

Титрование вируса на белых беспородных мышах. Инфекционную активность ВБ определяли методом титрования на новорожденных мышах. Титр вируса для заражения рассчитывали по методу Рида и Менча и выражали в lg МЛД 50/мл. Учет результатов титрования на мышах проводили с 5 по 30 сутки после заражения на основании клинических признаков и гибели животных. ВБ выявляли в мозговых отпечатках павших мышей методом флюоресцирующих антител (МФА).

Реакция нейтрализации вируса (флюоресцентный вируснейтрали-зующий тест - FAVN). Уровень антирабических ВНА определяли в реакции нейтрализации вируса в культуре клеток ВНК-21-13С по методике, рекомендованной OIE (2012). Результаты реакции выражали в Международных единицах на см3 крови (МЕ/см3).

Определение иммуногенных свойств. Иммуногенные свойства вакцинного вируса бешенства штамм ERA-CB 20М определяли методом NIH (Нацио-

нальный институт здоровья, США) на белых беспородных мышах массой 11-12 г, иммунизированных внутрибрюшинно с последующим интрацеребральным заражением референтным штаммом CVS-11 (мозговой штамм). Иммуногенная активность вакцины должна быть не ниже 1,0 МЕ/мл.

Коммерческие ИФА наборы: Для определения количества гликопротеина вируса бешенства штамма ERA-CB 20М использовали ИФА (ELISA) тест-системы компании Ingenasa (Испания), EVL (Нидерланды) и Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАН.

Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей фрагментов. Анализ результатов секвенирования производился с использованием BioEdit Sequence Alignment Editor (http://www.mbio.ncsu.edu/ bioedit/bioedit.html). пакета программ, включенных в DNASTAR LaserGene 7.1 (DNASTAR, Inc.) (EditSeq, SeqMan, MegaElign) (http://www.dnastar.com/t-allproducts.aspx). Множественное выравнивание проводили с использованием алгоритма ClustalW Multiple Alignment (http://www.clustal.org/).

Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку результатов выполняли с помощью программ Microsoft Office Excel 2007, Stat Plus 2005.Для представления данных использовали следующие статистические показатели: среднегеометрическое, среднеарифмитическое , стандартное отклонение. Различия считали достоверными при значении р<0,01.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Определение спектра наиболее чувствительной линии клеток для получения ВБ штамм ERA-CB 20М. Для культивирования вируса штамм ERA-CB 20М было использовано 6 перевиваемых линий клеток: ВНК-21-13С, ВНК-Щ, ВНК-ф, В SR, ПС и Vero, которые заражали ВБ штамм ERA-CB 20М с активностью не менее 10 50 ТЦД50/мл (табл.1).

Из данных табл.1 видно, что максимальное накопление ВБ штамм ERA-CB 20М происходит в вируссодержащей культуральной жидкости в линиях клеток ПС, BSR и ВНК-21-13С.

Таблица 1

Зависимость репродукции вируса бешенства штамм ЕЯА-СВ 20М от линии клеток и номера сбора вируссодержащей культуральной жидкости (Инфекцинная активность выражена в ^ ТЦЦ 50/мл). М±т, п=10.

Линия клеток 1-й сбор ^ 2-й сбор 3-й сбор Ъ 4-й сбор 5-й сбор

ПС 3,6±0,25 4,75±0,22 7,5±0,15 6,0±0,20 5,0±0,21

В8Я 6,0±0,22 6,5±0,26 4,0±0,31 3,5±0,23 Н.и.

ВНК-21 3,75±0,16 4,75±0,22 6,0±0,15 Н.и. Н.и.

ВНК-Щ 5,5±0,31 5,0±0,20 3,5±0,24 2,5±0,33 Н.и.

ВНК-ф 4,75±0,15 3,5±0,25 2,5±0,31 Н.и Н.и

Уего 3,5 ±0,23 2,5±0,20 Н.и Н.и Н.и

* н.и- не исследовали

Количественное определение гликопротеина вируса бешенства. Количественное определение гликопротеина вируса бешенства проводили с помощью отечественной ИФА тест-системы. Полученные результаты свидетельствовали о том, что наиболее высокий уровень гликопротеина был определен в следующих клетках: ВБЯ (285 нг/мл, 1-й пассаж, 1-й сбор), ВНК-21(275 нг/мл, 1-й пассаж, 1- й сбор) и ВНК-0 (270 нг/мл, 1-й пассаж, 1-й сбор).

Оптимизация условий выращивания ВБ штамм ЕЯЛ-СВ 20М при помощи количественной оценки гликопротеина. В рамках решения данной задачи были проведены исследования по определению оптимальных условий культивирования клеток ВНК-21 (табл. 2), определению оптимальной множественности заражения (табл.3) и определению оптимального протокола заражения клеток ВБ.

Таблица 2

Сравнительная оценка количества гликопротеина (нг/мл) вируса бешенства при

использовании различных видов субстрата для ВНК-21.

Субстрат 1 сбор 2 сбор 3 сбор 4 сбор 5 сбор

Культуральный флакон 270 265 290 230 200

роллер 400 480 460 410 -

Данные, представленные в табл.2, наглядно демонстрируют преимущества роллерного культивирования ВБ штамм ЕЯА-СВ 20М по сравнению с исполь-

зованием культуральных флаконов (матрасов) и заражения на монослое клеток ВНК-21.

Таблица 3

Определение оптимальной множественности заражения линии клеток ВНК-21

ВБ штамм ЕЯА-СВ 20М._

MOI Количество гликопротеина, нг/мл

1 сбор 2 сбор 3 сбор 4 сбор 5 сбор

1,0 390 470 450 420 -

0,5 400 480 460 410 -

0,1 250 320 460 480 -

0,01 120 240 320 430 -

Полученные данные свидетельствуют о том, что оптимальной множественностью заражения является 0,5 - дальнейшее увеличение количества инфекционных частиц на клетку не приводило к увеличению количества гликопро-теина в сборе; в то же время уменьшение множественности значительно снижало выход белка в первых сборах. В ходе выполнения исследований было установлено, что оптимальным моментом для заражения является 80-90% монослой культуры клеток.

Принцип селекции ВБ штамм ERA-CB 20М. C.B. Грибенча (2002) впервые было показано, что популяция штаммов уличного вируса бешенства ге-терогенна по составу биологических вариантов, а также существует возможность выделения биологических вариантов из популяции вируса.

В исследованиях был применен разработанный нами новый принцип селекции биологических вариантов на основе количественного уровня экспрессии гена G- белка - главного иммуногена вируса бешенства. Это позволило выделить 16 биологических вариантов, которые прошли более 20 последовательных пассажей в перевиваемой культуре клеток ВНК-21-13С. Выделенные биологические варианты отличались от родительского вируса штамм ERA более выраженными антигенными свойствами и были обозначены как варианты вируса штамм ERA-CB 20М. Для сравнительного исследования уровня синтеза G-белка из популяции исходного родительского вируса штамм ERA было отобра-

но 3 варианта вируса (1а, 16, 1в), а также 16 вариантов вируса, полученных в ходе селекций после 20 последовательных пассажей в культуре клеток ВНК-21. Варианты вируса штамм ERA-CB 20М были отобраны из популяции родительского вируса штамм ERA. Было определено, что у всех трех вариантов (1а,1б,1в) родительского вируса штамм ERA количество G- белка (450, 520,200 нг/мл) значительно уступало количеству G- белка (844-3100 нг/мл), определяемого у биологических вариантов (2-17) вируса штамм ERA-CB 20М, полученных в результате селекции. Таким образом, впервые нами установлено, что количество G- белка - главного иммуногена вируса бешенства - не зависит от титра ВБ штамм ERA-CB 20М.

Определение нейровирулентных и патогенных свойств ВБ штамм ERA-CB 20М. Результаты опытов показали, что нет существенной разницы между патогенностью вируса штамм ERA и вируса штамм ERA-CB 20М при самом высоко патогенном внутримозговом методе заражения как для молодых (6,53 и 6,83 lgLD50), так и для взрослых мышей (6,45 и 6,5 lgLD50) соответственно. Однако при внутримышечном методе заражения выявляется определенная повторяемая разница в патогенности между вирусами. Более высокая патогенность штамма ERA по сравнению с вирусом ERA-CB 20М установлена как для молодых мышей массой 6-7 г (3,82 и <3,0 lgLDso/мл), так и для взрослых животных массой 16-18 г (1,9 и < 1,0 lgLD50 соответственно). Четкие различия в патогенности вирусов ERA и ERA-CB 20М для мышей выявлены и при подкожном методе их введения. Оба вируса оказались апатогенными при подкожном методе заражении в дозе 105000 micLD50, а также при дозе 6000 micLD50 для мышей массой 12-13 г как при im, так и sc методах заражения. Аналогичная картина была установлена и в опытах на морских свинках, белых крысах, кроликах и песцах, зараженных внутримышечно и подкожно (табл.4).

Таким образом, проведенные исследования показали, что полученный на основе разработанного нами нового принципа селекции вируса с использованием количественного определения уровня экспрессии G- белка, но-

вый вакцинный вирус штамм ERA-CB 20М оказался менее патогенен, чем родительский вирус штамм ERA.

Таблица 4

Сравнительное исследование патогенности вирусов бешенства штамм ERA и _ERA-CB 20М для лабораторных животных и песцов_

Вид животного Метод заражения, объем в мл Доза вируса в MicLD50 Вирус штамм ERA Вирус штамм ERA-CB20M

Заболели Пали Заболели Пали

Морские свинки im 0,5 1.580.000 4/15 2/4 1/15 0/1

sc 0,5 1.580.000 0/5 0/5 0/5 0/5

- - - - - -

Белые крысы im 0,5 1.580.000 2/5 1/2 1/10 0/1

sc 0,5 1.580.000 1/5 0/1 0/5 0/5

Кролики «шиншилла» im 1,0 3.160.000 0/5 0/5 0/5 0/5

im 1,0 316.000 0/3 0/3 0/3 0/3

sc 1,0 3.160.000 0/3 0/3 0/3 0/3

Песцы im, 1,0 3.160.000 н.и. н.и. 0/15

im, 1,0 316.000 н.и. н.и. 0/15

Sc,l,0 3.160.000 н.и. н.и. 0/15

Примечание: mic - мышиный интрацеребралъный LD50, im - внутримышечный, sc- подкожный

Кроме того, ВБ штамм ERA-CB 20М отличается от родительского вируса штамм ERA более высоким уровнем экспрессии гена G-белка.

Изучение антигенных и иммуногенных свойств вакцинного вируса бешенства штамм ERA-CB 20М в опытах на лабораторных и диких животных. Антигенную активность вакцинного вируса изучали в опытах на белых мышах, белых крысах, песцах. Для иммунизации животных использовали вакцинные препараты, содержащие 200 и 1400 нг/мл G-белка. Препараты вводили однократно внутримышечно в объеме 0,1; 0,5 и 1,0 мл соответственно. На 21 день после введения титр ВНА определяли методом FAVN, а количество антигена - методом ИФА (табл.5).

Как видно из табл.5, антарабическая вакцина, изготовленная из вируса штамм ERA-CB 20М, индуцирует выраженный защитный уровень вируснейт-рализующих антител независимо от вида животных. Вакцина, содержащая 1400

нг/мл, индуцировала более высокий уровень ВНА, чем вакцина, содержащая 200 нг/мл.

Таблица 5

Титр вируснейтрализующих антител в зависимости от количества О_ __белка ВБ

Вид животных Концентрация G-белка в нг/мл (ИФА) Вируснейтрализующие антитела в МЕ/см3 (FAVN)

Белые мыши 200 1400 1,51 2,87

Белые крысы 200 1400 0,87 2,1

Песцы 1400 2,61

При этом все испытуемые препараты индуцировали синтез ВНА на уровне 1,0 МЕ/см3 и выше, что соответствует требованиям ВОЗ.

Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей фрагментов генов N и G-белка штамма ERA-CB-20M вируса бешенства. Проводили определение первичной структуры фрагментов генов, кодирующих N-белок и G-белок. Полученные данные о нуклеотидных последовательностях генома исследуемого штамма вируса сравнивали с данными первичной структуры генома штамма Щелково-51, а также с последовательностями других вакцинных штаммов вируса бешенства из базы данных NCBI (www.ncbi.nlm). Выровненные последовательности генов различных вакцинных штаммов ВБ были использованы для построения филогенетических дендрограмм с использованием программы MegaAIign из пакета программного обеспечения Lasergene фирмы DnaStar (Clustal W Method). Результаты исследований приведены на рис. 1, 2.

_IEF206718 SAD1 Var2_Njartseq

I SAD B19_N_parlseq L|— SAD BERN.Njaitseq

SAD BERN Lysvulpen Njaitsen SAD P5 B8_Njaitssq

SADVnukovo isolate 9503TCH nucieoprote C0 20M N gene (1) partseq Ef206ÍW SAD1 Vaii_Njartseq ERA.Njaitseq

_|RV97_Njaitseq

- ShBlVovn N gane Й partseq

-CVSH.Njaitseq

6 4 2 0

Nucleoide SubsMons («100)

Рис. 1. Филогенетическая дендрограмма, построенная на основе фрагментов гена размером 601 н., кодирующих N -белок вакцинных штаммов вируса бешенства.

S9fi

..1Q.Q.Q

97 9

97 J> 664

85.4Г SAD Bern Sanafox G protein.sec SO-I - SAD P5 88 G protein.seq

SAD B19 G proteinl EF206709.S m " SAD Bern G protein.seq — ERA G protein.seq

171 1r-

6.8.

79.6I EF206717 SAD1 Var1 G protein ' EF206718 SAD1 Var2 G protein

— CB20M Consensus G from ATG.

— PV-2061-2 G Segment.seq

— CTN-1V5 G segment.seq

— RV-97 glycoprotein.seq

— 4aGV7 G segment.seq

— CVS 11 G protein GQ918139.seq

6 4 2 0

Amino Acid Substitutions (x100) Bootstrap Trials = 1000, seed = 111

Рис.2. Филогенетический анализ вакцинных штаммов вируса бешенства с использованием аминокислотных последовательностей белка G с начала открытой рамки считывания до позиции 524 (Megalign v. 7.0. (метод ClustalW).

На основании филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей фрагментов генов N и G штамма ERA-CB 20М установлено, что данный штамм попадает в группу вакцинных штаммов SAD1. Сравнение с референтным штаммом SAD1 выявило 10% нуклеотидных отличий во фрагменте reHaN и 15% - во фрагменте гена G.

Разработка экспериментальной серии вакцины из штамма ERA-CB 20М вируса бешенства. Для приготовления вакцин использовали вирус бешенства (штамм ERA-CB 20М), полученный в культуре клеток ВНК-21-13С, с

активностью 106,8 ТЦД5о/см3. Вирус инактивировали p-пропиолактоном в концентрации 1:4000 в течение 2 ч при 37 °С. Полноту инактивации вируса бешенства контролировали в культуре клеток ВНК-21 по отсутствию фокусов флуоресценции через 48 ч после внесения в нее инактивированного вируса. Из одной партии инактивированного вируса бешенства штамм ERA-CB 20М приготовили два образца препаратов с разными адъювантами: один- с 10 % ГОА (ГОА-вакцина), а второй - в комбинации с адъювантом AbISCC>R-100 в концентрации 75мкг/см3 (ISCOM-вакцина).

Иммуногенная активность приготовленных вакцин, определенная объемным методом NIH на белых мышах, составила 1,39 МЕ/см3 для ГОА-вакцины и 2,11 МЕ/см3 для вакцины с адъювантом AbISCC)R-100 (Р< 0,05).

Иммуногенность вакцин изучали на белых мышах, двукратно иммунизированных с интервалом 21 сутки в дозе 0,1 см3. Средние геометрические титры антител, определенные методом FAVN, через 21 день после первой иммунизации были 1,5 МЕ/см3 для ГОА-вакцины и 3,1 МЕ/см3 для ISCOM-вакцины. На 21 сутки после второй иммунизации данные показатели составили 2,5 МЕ/см3 и 3,9 МЕ/см3 соответственно.

На 30-е сутки после второй иммунизации от мышей были получены спле-ноциты, которые затем были простимулированы антигеном ВБ in vitro. Содержание цитокинов (ИФН-у, ИЛ-2, ИЛ-4) в клетках селезенки мышей определяли методом ИФА с помощью соответствующих коммерческих наборов (EVL, Нидерланды). Было установлено, что у мышей, привитых вакциной с адъювантом AbISCOR-100, средний уровень ИФН-у составил 1270 пг/мл, а ИЛ-2 - 700 пг/мл, что превышало аналогичные показатели у мышей, иммунизированных ГОА-вакциной - 405 пг/мл и 410 пг/мл соответственно (Р< 0,05). Уровень ИЛ-4 составил 15 пг/мл и 30 пг/мл соответственно.

Антигенную активность экспериментальных образцов вакцин из ВБ штамм ERA-CB 20М с адъювантами ГОА и AbISCOR-100 изучали на песцах в сравнении с коммерческой антирабической вакциной. Для этого животных разделили на 4 группы, по 8 голов в каждой. Песцов групп с первой по третью иммунизи-

ровали внутримышечно двукратно с интервалом 21 сутки в дозе 1,0 см3, животных четвертой группы не вакцинировали (контроль). Сыворотку крови всех песцов исследовали на наличие ВНА методом РАУИ (табл. 6).

Таблица 6

Динамика вируснейтрализующих антител в сыворотке крови песцов после од-

но- и двукратной иммунизации разными антирабическими вакцинами

№ гр Препарат Уровень вируснейтрализующих антител, МЕ/ см3 (М±ш)

до вакцинации на 21-е сут после первой вакцинации на 21-е сутки после второй вакцинации

1 Коммерческая вакцина <0,10 2,31 ±0,25 5,10 ±0,53

2 ГОА-вакцина <0,10 3,44 ± 0,73 5,81 ±0,56

3 Вакцина с адъ- ювантом АЫбсо 11-100 <0,10 4,54 ± 0,40 14,58 ±1,15

4 Контроль <0,10 <0,10 <0,10

Анализ полученных результатов свидетельствует о том, что вакцина с адъ-ювантом АЫбсо Я-100 индуцировала синтез ВНА в высоких титрах. У животных контрольной группы сероконверсии отмечено не было.

Изготовление экспериментальных образцов антирабических вакцин для собак и кошек. Экспериментальные серии антирабических вакцин были изготовлены из штамма ЕЯА-СВ-20М с АЫБСОМОО в качестве адъюванта. Были изготовлены 3 опытные серии вакцины против бешенства собак («РА-БИКС») и 3 опытные серии вакцины против бешенства кошек («РАБИФЕЛ»). Все серии вакцины содержали инактивированный, с проверенной полнотой инактивации, вирус бешенства штамм ЕЯА-СВ 20М с активностью от 6,5 до 7,0 ^ ТИД 50/см3. В качестве адъюванта использовался АЫБСОМОО в концентрации 75 мкг/см3 в вакцине для собак и 30 мкг/см3 в вакцине для кошек. Все исследуемые серии вакцины «РАБИКС» и вакцины «РАБИФЕЛ» представляли собой прозрачную жидкость розового цвета с незначительным осадком, разбивающимся при встряхивании в гомогенную взвесь. Наличия или образования

17

посторонних примесей, изменения внешнего вида и рН, нарушения целостности флаконов не было отмечено ни сразу после изготовления препаратов, ни через 6, 12 и 18 месяцев хранения при температуре от 2 до 8°С. В течение всего периода наблюдений в питательных средах с посевами роста бактериальной и грибной микрофлоры не наблюдалось.

Определение безвредности всех экспериментальных серий вакцин проводили сразу после их приготовления, а также через 6, 12 и 18 месяцев хранения при температуре от 2 до 8°С. Оценку безвредности и реактогенности вакцины «РАБИКС» проводили на беспородных щенках 8-10-недельного возраста и белых мышах массой 12-15 г. Щенкам препараты вводили подкожно в область лопатки в дозе 5,0 см3, мышам - подкожно в объеме 0,2 см3 однократно. Учет результатов безвредности проводили в течение 21-го дня после введения препарата (срок наблюдения).

Оценку безвредности вакцины «РАБИФЕЛ» проводили на беспородных котятах 8-10-недельного возраста и белых мышах массой 12-15 г. Котятам препараты вводили подкожно в область лопатки в дозе 5,0 см3, мышам - подкожно в объеме по 0,2 см3 однократно. Учет результатов безвредности проводили в течение всего срока наблюдения.

Клинические обследования животных показали, что введение вакцин «РАБИКС» и «РАБИФЕЛ», свежеприготовленных или хранившихся в течение 6,12 или 18 месяцев, не вызвало у животных отклонений в состоянии здоровья и побочных эффектов.

Определение иммуногенной и антигенной активности вакцин. Им-

муногенную активность экспериментальных серий вакцин определяли объемным методом Ы1Н на белых мышах сразу после приготовления и в процессе хранения при температуре от 2 до 8°С (табл. 7).

Таблица 7

Иммуногенная активность вакцин «РАБИКС» и «РАБИФЕЛ» на разных сроках __хранения__

Препарат Иммуногенность (МЕ/см3)

( 1 месяца 6 месяцев 12 месяцев 18 месяцев

Исследуемая серия вакцины «РАБИКС»

1 1,64 1,39 1,25 1,25

2 2,02 1,64 1,5 1,49

3 2,37 1,72 1,72 1,64

Исследуемая серия вакцины «РАБИФЕЛ»

1 1,72 1,64 1,25 1,22

2 2,07 2,02 1,72 1,5

3 2,5 2,37 2,02 1,72

Антигенную активность каждой серии вакцины «РАБИКС» и «РАБИФЕЛ» определяли на песцах и котятах соответственно. Животных иммунизировали подкожно смесью из 5 флаконов каждой серии вакцины в дозе 1,0 см3. Через 21 день инъекцию повторяли. Сыворотки крови песцов и котят исследовали на наличие антител к вирусу бешенства методом РАУЫ до вакцинации и через 21 день после введения вакцины (табл.8).

Было отмечено, что у всех вакцинированных животных на 21 день после первой вакцинации уровень антирабических антител превышал 0,5 МЕ/см3. После повторной инъекции препаратов уровень ВНА был достоверно выше (р<0,01).

Таблица 8

Антигенная активность экспериментальных серий вакцин на разных сроках хранения

Время после изготовления вакцины № серии Средние геометрические титры антител (МЕ/см'') п=4

До введения После 1-го введения После 2-го введения

Вакцина «РАБИКС»

Менее 1 мес. 1 0,11 1,34 7,60

2 0,16 1,43 8,23

3 0,18 1,38 6,96

6 мес. 1 0,11 1,91 8,08

2 0,10 1,47 6,13

3 0,14 1,29 6,33

12 мес. 1 0,14 1,45 7,44

2 0,11 1,34 7,24

3 0,11 1,43 5,22

18 мес. 1 0,14 2,30 6,76

2 0,10 0,55 9,06

3 0,18 1,91 6,53

Вакцина «РАБИФЕЛ»

Менее 1 мес. 1 0,10 1,20 8,71

2 0,14 2,03 11,48

3 0,14 1,29 10,02

6 мес. 1 0,11 1,34 7,44

2 0,16 1,43 9,54

3 0,18 1,38 8,08

12 мес. 1 0,11 2,30 10,65

2 0,14 0,55 7,60

3 0,10 1,91 9,06

18 мес. 1 0,18 1,47 8,23

2 0,11 1,29 6,96

3 0,14 1,45 9,54

Критерий достоверности р<0,01.

Оценка антигенной активности вакцин на домашних животных. Вакциной «РАБИКС» иммунизировали клинически здоровых щенков и взрослых собак пород немецкая овчарка и Лабрадор общим числом 32 головы. Вакциной «РАБИФЕЛ» иммунизировали клинически здоровых котов и кошек различных пород и возрастов числом 26 голов. Ранее не вакцинированным от бешенства

животным вакцины вводили подкожно двукратно, с интервалом 21 день, ранее вакцинированным - однократно. После вакцинации у животных брали пробы сыворотки крови, которые проверяли на наличие антител к вирусу бешенства методом FAVN. В результате проведенных исследований было установлено, что у всех вакцинированных животных на 21 день после последней вакцинации уровень антирабических антител значительно превышал защитный уровень в 0,5 МЕ/см3 и составлял 3,46 - 18,01 МЕ/см3.

Разработка ИФА для оценки содержания гликопротеина (G-белка) ВБ в вируссодержащей культуральной жидкости. Основным иммунологическим компонентом разработанной тест-системы в формате «сэндвич»-ИФА стали ранее полученные C.B. Грибенча МкА 1С5 со строгой специфичностью к эпито-пам гликопротеина как фиксированного, так и уличного вируса бешенства. Очищенные МкА использовали для абсорбции на поверхности лунок 96-луночного планшета (первичные, или фиксирующие) и в качестве иммунопе-роксидазного конъюгата (вторичные, или детектирующие).

Проведенные эксперименты показали, что разработанная тест-система позволяет дискриминировать пробы с различным содержанием гликопротеина вируса бешенства и не дает перекрестных реакций с представителями других семейств вирусов. Установлено, что инактивация вируса p-пропиолактоном не влияла на содержание G-белка в пробе.

Далее эту тест-систему сравнивали с зарубежными аналогами при оценке содержания гликопротеина ВБ в культуре клеток ВНК-21. Максимальный коэффициент корреляции зафиксировали между разработанной нами тест-системой и ИФА-набором фирмы Ingenasa (г=0,87; р<0,01). При исследовании проб с разным содержанием G-белка в диапазоне от 10 до 300 нг/мл (п=31) установили положительную корреляцию между обратной величиной титра гликопротеина и его концентрацией (г=0,9; р<0,01), а чувствительность созданного ИФА и его зарубежного аналога составила 20 нг/мл. При исследовании образцов с установленным титром вируса бешенства (п=12) гликопротеин выявляли в пробах с

инфекционной активностью от 103 ТЦД5о/см3 и выше при отсутствии положительной корреляции между показателями.

На заключительном этапе мы оценивали степень корреляции между уровнем гликопротеина вируса бешенства в образцах вируссодержащей жидкости, выявляемого в ИФА, и иммуногенностью вакцин, приготовленных из этих образцов вакцин, которую оценивали методом №Н.

Полученные результаты указывают на наличие положительной корреляции между относительным содержанием С-белка в экспериментальных образцах вакцины, определяемым в ИФА, и индексом иммуногенности (г=0,89; р<0,05). Препараты с титром в ИФА > 1:160 обладали иммуногенной активностью (индекс иммуногенности > 1 МЕ/см3), соответствующей требованиям ВОЗ.

Таким образом, ИФА можно использовать на этапе предварительного контроля количества гликопротеина ВБ при производстве антирабических вакцин.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что наиболее чувствительными к вирусу бешенства штамм Е11А-СВ 20М являются перевиваемые линии клеток: ПС, ВБЯ, и ВНК-21-13С, в которых он накапливается в титрах: 7.5 (± 0,15), 6,5 (±0,26) и 6,0 (±0,15) ^ ТЦД 50/мл соответственно.

2. Оптимизированы условия получения ВБ штамм Е11А-СВ 20М при стационарном и роллерном способах культивирования. Концентрация клеток перевиваемой линии ВНК-21-13С должна составлять не менее 2х106 клеток/мл при множественности инфицирования клеток 0,5-0,01 ТЦД50/мл.

3. Вакцинный штамм ЕЯА-СВ 20М вируса бешенства является патогенным для белых мышей при интрацеребральном способе введения. При внутримышечном и подкожном способах заражения штамм является слабопатогенным для мышей, белых крыс и морских свинок и непатогенным для кроликов, собак, кошек и песцов.

4. Вакцинный штамм ЕЯА-СВ 20М вируса бешенства обладает выраженными антигенными свойствами, индуцируя выработку вируснейтрализующих

антител у мышей, белых крыс, песцов, кошек и собак в титрах, значительно превосходящих защитный, пороговый уровень (0,5 МЕ/см3).

5. Вакцинный штамм ERA-CB 20М вируса бешенства обладает выраженными иммуногенными свойствами, что было продемонстрировано в экспериментах на белых мышах с использованием метода NIH. Иммуногенность экспериментальных образцов вакцинных препаратов составила 1,5-2,2 МЕ/см3, препараты сохраняли свои иммуногенные свойства на протяжении 18 месяцев.

6. На основании филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей фрагментов генов N и G штамма ERA-CB 20М установлено, что данный штамм попадает в группу вакцинных штаммов SAD1. Сравнение с референтным штаммом SAD1 выявило 10% нуклеотидных отличий во фрагменте reHaN и 15% - во фрагменте гена G.

7. При сравнительном испытании различных типов адъювантов: ГОА и Abisco R-100 в экспериментальных условиях показано, что выраженным иммуностимулирующим эффектом обладает вакцина в комбинации с адъювантом Abisco R-100.

8. Разработана ИФА тест-система для оценки содержания гликопротеина вируса бешенства в культуральной вируссодержащей жидкости на основе мо-ноклональных антител 1С5. Установлена положительная корреляция результатов, полученных в ИФА и методом NIH (г=0,89; р<0,05). Препараты с титром в ИФА > 1:160 обладали пороговой защитной иммуногенной активностью.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Материалы исследований по разработке и применению вакцин на основе штамма ERA-CB 20М вируса бешенства вошли в следующие нормативные документы:

1. Регистрационное удостоверение лекарственного препарата для ветеринарного применения № 77-1-17.11-0484№ПВР-1-17.11/02758, выданное Рос-сельхознадзором 31.10.2011 г.

- Стандарт организации на Вакцину против бешенства собак инактивиро-ванную «РАБИКС» «СТО 76418883-0009-2011»от31 октября 2011 г.

23

- Инструкция по применению вакцины против бешенства собак инактивиро-ванной «РАБИКС», утвержденная Россельхознадзором 31 октября 2011 г.

2. Регистрационное удостоверение лекарственного препарата для ветеринарного применения № 77-1-17.11-0485№ПВР-1-17.11/02759, выданное Россельхознадзором 31.10.2011 г.

- Стандарт организации на Вакцину против бешенства кошек инактивиро-ванную «РАБИФЕЛ» «СТО 76418883-0008-2011» от 31 октября 2011 г.

- Инструкция по применению вакцины против бешенства кошек инактиви-рованной «РАБИФЕЛ», утвержденная Россельхознадзором 31 октября 2011 г.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых научных изданиях, рекомендованных ВАК РФ

1.Грибенча C.B., Лосич М.А., Грибенча Л.Ф., Непоклонова И.В./Новый принцип селекции вакцинного вируса на основе количественного уровня экспрессии G-белка - главного иммуногена вируса бешенства.//Вопросы Ви-русологии.-2012г.-№2-С.44-47.

2.Грибенча C.B., Козлов А.Ю., Костина Л.В., Елаков А.Л., Лосич М.А., Цибезов В.В., Забережный А.Д., Алипер Т.И./Получение моноклональных антител к нуклеопротеину вируса бешенства//Вопросы Вирусологии.-2013, Том 58,№-5 с.38-43.

ЗЛосич М.А., Непоклонова И.В., Мухин А.Н., Раев С.А, Грибенча C.B., Верховский O.A., Алипер Т.И./Разработка и иммунобиологические свойства новой антирабической вакцины «РАБИФЕЛ»/Российский Ветеринарный Жур-нал.-2012.-№2,- С.10-14.

4Лосич М.А., Непоклонова И.В. Верховский O.A.. Грибенча C.B.. Баландина М.В., Мухин А.Н, Раев С.А., Алипер Т.И. / Разработка и использование ИФА для оценки содержания гликопротеина (G-белка) вируса бешенства// Ве-теринария.-2012.-№7.-С.30-35.

5 Лосич М.А., Непоклонова И.В., Верховский O.A., Грибенча C.B., Мухин А.Н., Раев С.А., Алипер Т.И./ Иммунобиологические свойства новой вакцины Рабикс//В етеринария.- 2011.-№12.-С.17-21.

24

Работы, опубликованные в сборниках научных трудов, материалах конференций, съездов и других изданиях

1. Яровая И.И., Колотвина П.В., Кохнович (Лосич) М.А., Грибенча С.В.//Клиническая лабораторная диагностика. Национальное руководство. Частная вирусология. Вирус бешенства.- 2012 г.-Том 2,- С.645-649.

2. Грибенча C.B., Литвин A.A., Кохнович (Лосич) М.А. Сергиенко В.И., Стовбун C.B., Безмен В.Г// Защитная активность препарата Панавир при экспериментальной рабической инфекции.//Антибиотики и Химиотерапия.-2009.-Том 54,- №5-6, -С. 31-36.

3. Лосич М.А., Непоклонова И.В. Верховский О.А //Оценка напряженности поствакцинального иммунитета к вирусу бешенства у мелких домашних жи-вотных.//Материалы 19 Московского Международного Ветеринарного Конгресса//2011 г. е.-21-22.

4. Losich Milana, Aliper Т.1./ Analysis of vaccine-induced antirabic humoral immunity in carnivores (dogs, cats and grey foxes)./ Rabies serology meeting, ANSES, Nancy, France, 2013, p.10.

Благодарности

Автор приносит глубокую благодарность за оказание научно-методической помощи в организации проведений исследований д.б.н., профессору Верхов-скому O.A., к.в.н. Непоклоновой И.В., д.б.н., профессору Гребенниковой Т.В., к.б.н. Мухину А.Н., к.в.н. Раеву С.А.

Подписано в печать: 22.04.14 Тираж: 100 экз. Заказ № 1117 Отпечатано в типографии «Реглет» г. Москва, Ленинградский проспект, д. 74 (495)790-47-77; www.reglet.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Лосич, Милана Анатольевна, Москва

ФБГУ НИИ Вирусологии им. Д.И. Ивановского Минздрава РФ

На правах рукописи

Лосич Милана Анатольевна

04201458520

Иммунобиологические свойства штамма ЕЯА-СВ 20М вируса бешенства и разработка на его основе антирабической вакцины.

Диссертация На соискание ученой степени Кандидата биологических наук 03.02.02 «вирусология»

Научные руководители: Доктор медицинских наук, Грибенча C.B.

Доктор биологических наук, Профессор Алипер Т.И.

Москва -2014 г.

Список сокращений

АИГ - антирабический иммуноглобулин АПК - антиген-представляющая клетка АТ- антитела

антиген ВБ - вирус бешенства ВНА - вируснейтрализующие антитела ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения ГОА - гидроокись алюминия ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ИЛ - интерлейкин ИНФ - интерферон ИФА - иммуноферментный анализ кДНК - комплементарная ДНК

КОКАВ - концентрированная очищенная культуральная антирабическая вакцина

ЛД-50% -ная летальная доза

МкА - моноклональные антитела

МЛД5о - 50% -ная мышиная летальная доля

МПА - мясо-пептонный агар

МПБ - мясо-пептонный бульон

МППБ - мясопептонный бульон под вазелиновым маслом

мРНК - матричная РНК

МФА - метод флуоресцирующих антител

МЭБ -Международное эпизоотическое бюро

ОТ - ПЦР - ПЦР с обратной транскрипцией

ПС - перевиваемая культура клеток почка сайги;

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РНК - рибонуклеиновая кислота РНП - рибонуклеопротеид РИФ-реакция иммунофлуоресценции СМЖ - спинномозговая жидкость с/х - сельскохозяйственный ТМБ - тетраметибензидин Тх - Т-хелперы

ВНК-21 - перевиваемая культура клеток почки сирийского хомячка;

BSR - перевиваемая культура клеток почки хомячка;

ERA - штамм вируса бешенства

FAVN - Fluoresent Antibody Virusneutralization Test

im - введение внутримышечное

ic - введение подкожное

M - средняя арифметическая,

m - ошибка средней арифметической,

Mic - мышенная летальная доза.

MNA - мышиные нейробластомы

п - число наблюдений или животных в опыте,

NASBA- генбанк

NIH - метод по определению иммуногенности на белых мышах

(National Institute of Health, USA) P - критерий достоверности г - коэффициент корреляции, RFFIT - Rappid Fluorescent Focus Inhibition Test RTCIT - Rabies Tissue Cultural Test

Содержание:

ВВЕДЕНИЕ...........................................................................................8

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.............................................................13

1.1 Классификация, структура и свойства вируса бешенства.......................13

1.1.1 Классификация лиссавирусов............................................................13

1.1.2 Морфология и структура вируса бешенства.........................................17

1.1.3 Репродукция вируса бешенства........................................................18

1.2 Эпизоотологические особенности бешенства......................................21

1.2.1 Ситуация с бешенством в РФ...........................................................21

1.2.2 Бешенство в других странах мира.....................................................25

1.3 Диагностика бешенства..................................................................28

1.3.1 Метод флуоресцирующих антител и его аналоги...................................29

1.3.2 Выделение вируса бешенства как метод диагностики............................31

1.3.3 Серологические методы диагностики.................................................32

1.3.4 Молекулярные методы диагностики и исследования..............................34

1.4 Профилактика бешенства у человека и животных................................35

1.4.1 Штамммы вирусов бешенства, применяемые при производстве аптирабических вакцин..............................................................................................36

1.4.2 Антирабические вакцины................................................................41

1.4.3 Рекомендации к антирабическим вакцинам..........................................47

1.4.4 Адъюванты для антирабических вакцин..............................................48

Глава 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.........................................51

2.1 Материалы и методы.....................................................................51

2.1.1 Материалы................................................................................51

2.1.1.1 Вирусы.....................................................................................51

2.1.1.2 Культуры клеток.........................................................................51

2.1.1.3 Референтные сыворотки...............................................................51

2.1.1.4. Экспериментальные животные......................................................51

2.1.1.5 Адъюванты................................................................................51

2.1.1.6 Коммерческие ИФА наборы.........................................................51

2.1.1.7 Среды и растворы.......................................................................52

2.1.1.8 Реагенты..................................................................................52

2.1.1.9 Оборудование............................................................................53

2.1.2 Методы......................................................................................53

2.1.2.1 Культивирование вируса бешенства штамм ERA-CB 20М...................53

2.1.2.2 Культивирование штамма CVS-11 вируса бешенства..........................55

2.1.2.3 Титрование вируса в культуре клеток...............................................56

2.1.2.4 Определение инфекционной активности вируса..................................57

2.1.2.5 Титрование вируса на белых беспородных мышах..............................57

2.1.2.6 Инактивация вируса бешенства штамм ERA-CB 20М..........................57

2.1.2.7 Определение контаминации бактериальной и грибной микрофлорой.....57

2.1.2.8 Антигенные свойства..................................................................58

2.1.2.9 Определение титра антирабических вируснейтрализующих антител в сыворотках крови животных методом FAVN..............................................58

2.1.2.10 Определение патогенности вируса для животных..............................62

2.1.2.11 Определение иммуногенной активности методом NIH на белых беспородных мышах.............................................................................63

2.1.2.12 Индикация вируса бешенства.......................................................63

2.1.2.13 Выделение РНК........................................................................65

2.1.2.14 Получение кДНК.......................................................................66

2.1.2.15 Проведение ПЦР......................................................................66

2.1.2.16 Очистка образцов из геля.............................................................68

2.1.2.17 Секвенирование.........................................................................68

2.1.2.18 Анализ результатов секвенирования...............................................69

2.1.2.19 Статистическая обработка результатов..........................................70

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ..................71

3.1 Изучение культуральных свойств вакцинного вируса бешенства штамм ERA-CB 20М.....................................................................................71

3.1.1 Определение спектра наиболее чувствительной линии клеток для получения вакцинного вируса бешенства штамм ERA-CB 20М.....................................71

3.1.2 Количественное определение гликопротеина вируса бешенства................73

3.1.3 Оптимизация условий получения гликопротеина вакцинного штамма ERA-CB 20М вируса бешенства.....................................................................76

3.1.4 Определение оптимальных условий инфицирования клеток и способов культивирования вакцинного вируса штамм ERA-CB 20М...........................80

3.1.5 Изучение иммунобиологических свойств вакцинного вируса бешенства

штамм ERA-CB 20М............................................................................81

3.1.6. Изучение нейровирулентных и патогенных свойств штамма ERA-CB 20М вируса бешенства.................................................................................85

3.1.7 Изучение антигенных свойств вакцинного вируса бешенства штамм ERA-CB 20М в опытах на лабораторных и диких животных.......................................89

3.1.8 Определение иммуногенной активности вакцины из штамма ERA-CB 20М..................................................................................................91

3.1.9 Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей фрагментов

генов N- и G - белка штамма ERA-CB 20М вируса бешенства.........................92

3.2 Разработка экспериментальной серии вакцины против бешенства из штамма ERA-CB 20М вируса бешенства.................................................95

3.2.1 Подбор адъюванта.........................................................................95

3.2.2 Изготовление экспериментальных образцов антирабических вакцин для собак и кошек.....................................................................................98

3.2.3 Оценка безвредности, антигенной активности и стабильности вакцин «РАБИКС» и «РАБИФЕЛ» в лабораторных условиях...................................99

3.2.3.1 Определение внешнего вида и цвета................................................99

3.2.3.2 Определение стерильности..........................................................100

3.2.3.3 Определение безвредности и реактогенности...................................100

3.2.3.4 Определение иммуногенной активности.........................................101

3.2.3.5 Определение антигенной активности вакцины «Рабикс»...................102

3.2.3.6 Определение антигенной активности вакцины «Рабифел»...................103

3.2.3.7 Оценка антигенной активности вакцины «Рабикс» на естественно-восприимчивых животных....................................................................104

3.2.3.8 Оценка антигенной активности вакцины «Рабифел» на естественно-

восприимчивых животных....................................................................105

3.3 Разработка ИФА тест - системы для первичного скрининга полученных пулов культурального вируссодержащего материала из штамма ERA-CB 20М вируса бешенства...........................................................................................106

3.3.1 Разработка тест системы ИФА на основе МКА 1С5 для определения G-белка в вакцинных полуфабрикатах........................................................106

3.3.2 Сравнительное определение белка методом ИФА с зарубежными аналогами иммуноферментного анализа для определения гликопротеина.......................108

3.3.3 Анализ зависимости значения количества гликопротеина методом ИФА от

индекса иммуногенности вакцинного препарата методом NIH.....................111

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ...................................................................114

Выводы..........................................................................................125

Практические предложения..................................................................126

Список литературы...........................................................................127

Приложения......................................................................................140

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы.

Бешенство - это острое нейровирусноё заболевание, передаваемое человеку через укусы лисы, собаки, волка и других плотоядных животных, среди которых в естественной среде обитания вирус распространяется также при укусах. Мишенью вируса является центральная нервная система. Вирус бешенства (ВБ) принадлежит к отряду Mononegavirales, семейству Rhabdoviridae, роду- Lyssaviruss и является единственным из царства Vira, поражающим всех теплокровных животных, в том числе и человека со 100 % летальностью [3,11].

Глобальный характер распространения и многогастальность рабической инфекции привели к формированию большого разнообразия вариантов ВБ: бешенство лис, собак, арктическое бешенство, бешенство скунсов, енотов, мангуст, летучих мышей и др., а также их биологических субвариантов [11].

Так, по оценке Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ), бешенство входит в пятерку инфекционных болезней, общих для человека и животных, наносящих наибольший социальный и экономический ущерб [10,103]. В РФ бешенство регистрируется в 63 регионах страны, представляя собой серьезную угрозу как для животных, так и для человека. С ростом числа бездомных собак и кошек возрастает и число случаев обращения людей за антирабической помощью [14,20].

Для профилактики бешенства у человека и животных разработаны и используются инактивированные культуральные вакцины против бешенства, а также живые оральные вакцины, которые применяются только для диких животных. При этом основным показателем иммуногенности ангирабических вакцин является их способность индуцировать у иммунизированных животных синтез антирабических вируснейт-рализующих антител. Поэтому решающим условием разработки вакцин является подбор такого сочетания штамма вируса и адъюванта, который

позволит стимулировать у вакцинированных животных напряженный и длительный антирабический иммунитет.

Сложная эпизоотическая ситуация по бешенству в РФ [14,16] требует разработки новых, более высокоиммуногенных вакцин. В связи с этим весьма актуальными представляются исследования, направленные на изучение различных штаммов ВБ и разработку технологии приготовления антирабических вакцин с использованием адъювантов нового поколения.

Цель исследования: изучить иммунобиологические свойства вакцинного штамма ERA-CB 20М вируса бешенства и разработать на его основе антирабичсскую вакцину.

Задачи исследования:

1. Изучить спектр чувствительности различных линии клеток к вакцинному штамм ERA-CB 20М вируса бешенства.

2. Определить оптимальные условия культивирования вируса бешенства штамм ERA-CB 20М in vitro.

3. Изучить нейровирулентные свойства и патогенность вакцинного штамма ERA-CB 20М вируса бешенства для животных при различных способах введения.

4. Изучить антигенные свойства вируса бешенства штамм ERA-CB 20М в опытах на естественно - восприимчивых животных.

5. Изучить иммуногенные свойства вируса бешенства штамм ERA-CB 20М на белых беспородных мышах методом NIH.

6. Провести молекулярно-генетический анализ штамма ERA-CB 20М вируса бешенства.

7. Приготовить экспериментальные серии культуральной инактивиро-ванной вакцины на основе штамма ERA-CB 20М вируса бешенства в комбинации с различными адъювантами: ГОА и Abisco R-100.

8. Разработать иммуноферментную тест-систему (ИФА) на основе мо-ноклональных антител (МкА) 1С5 для оценки содержания гликопротеина (G-белка) ВБ в вируссодержащей культуральной жидкости.

Научная новизна работы. В результате проведенных исследований впервые для получения нового вакцинного вируса бешенства был использован новый принцип селекции, основанный на определении количественного уровня экспрессии гликопротеипа- главного иммуногена вируса бешенства. Впервые определен спектр чувствительных культур клеток для репликации вакцинного штамма ERA-CB 20М вируса бешенства и разработаны оптимальные условия культивирования вакцинного вируса. Определена патоген-ность вируса бешенства штамма ERA-CB 20М.

Впервые дана характеристика биологических свойств штамма ERA-CB 20М вируса бешенства. Изучены антигенные и иммуногенные свойства вируса штамма ERA-CB 20М на различных видах животных: мышах, песцах, собаках и кошках. Впервые проведен филогенетический анализ фрагментов генов N и G вакцинного штамма ERA-CB 20М вируса бешенства. Установлено отличие от референтного штамма SAD1 по первичной структуре на 10% и 15% соответственно.

Практическая значимость работы. В рамках выполненной работы на основе нового принципа селекции из популяции вируса бешенства штамм ERA получен новый вакцинный вирус штамм ERA-CB 20М с наиболее высоким уровнем экспрессии G-белка, на базе которого разработана новая высо-коиммуногенпая антирабическая вакцина для ветеринарных целей.

Разработана технология изготовления антирабической вакцины из ВБ штамм ERA-CB 20М с использованием нового иммуностимулирующего комплекса Abisco R-100 в качестве адыованта. Для оценки поствакцинального антирабического иммунитета у животных внедрён флуоресцентный вируснейтрализующий тест (метод FAVN), рекомендованный ВОЗ.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Перевиваемая линия клеток почки сирийского хомячка (ВНК-21-13С) является наиболее пригодной для производства инактивированной

культуральной аитирабической вакцины из штамма ERA-CB 20М вируса бешенства.

2. Способ селекции вакцинного штамма ВБ по уровню синтеза

поверхностного гликопротеина G.

3. Созданные на основе штамма ERA-CB 20М экспериментальные серии

вакцины против бешенства в комбинации с современным адъювантом Abisco R-100 полностью отвечают требованиям, предъявляемым к антирабическим вакцинам.

4. Разработанная на основе МкА 1С5 иммуноферментная тест-система

пригодна для контроля G-белка ВБ при производстве аптирабических вакцин. Апробация работы. Результаты исследований доложены и обсуждены на: Международном семинаре на базе Кубанского Аграрного Университета «Современные аспекты в диагностике и профилактике бешенства согласно требованиям ВОЗ» (г. Краснодар, 2011); XIX и XXI Московском Международном Ветеринарном Конгрессе (г. Москва, 2011, 2013); Международной научно-практической конференции «Современные методы диагностики и средств профилактики бешенства» (г. Санкт-Петербург, 2012); Международном Семинаре по вопросам контроля и борьбы с бешенством, (г. Санкт-Петербург, 2012); Rabies Serology Meeting ANSES (Нанси, Франция, 2013).

Публикации научных работ. По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ, в том числе 5 статей в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендуемых ВАК при Минобрнауки РФ.

Личный вклад соискателя. Все экспериментальные и теоретические исследования по теме диссертации проведены лично соискателем. Молекулярно-биологические исследования и эксперименты по оценке эффективности вакцинных препаратов на животных выполнены совместно с сотрудниками отдела прикладной вирусологии и биотехнологии ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского». Все материалы, представленные в диссертационной работе, обобщены и проанализированы лично автором.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 139 стр. машинописного текста и состоит из общей характеристики работы, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов, практических предложений и списка литературы. Материалы диссертации иллюстрированы 26 таблицами и 15 (из них 3 фото) рисунками. Список литературы включает 132 источника (21 отечественный и И 1 зарубежных авторов).

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Классификация, структура и свойства вируса бешенства.

Вирус бешенства - единственный из царства Vira, который поражае