Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Иммунобиологические свойства штамма ERA G333 вируса бешенства для изготовления оральной антирабической вакцины

ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Иммунобиологические свойства штамма ERA G333 вируса бешенства для изготовления оральной антирабической вакцины"

Баньковский Денис Олегович

Иммунобиологические свойства штамма ERA G333 вируса бешенства для изготовления оральной антирабической вакцины

06.02.02 - Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

-2 ЛЕН 2010

004615355

На правах рукописи

Баньковский Денис Олегович

Иммунобиологические свойства штамма ERA G333 вируса бешенства для изготовления оральной антирабической вакцины

06.02.02 - Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Исследования по диссертационной работе проводились в 2005-2010 гг. на базе ОАО «Покровский завод биопрепаратов».

Научный руководитель:

Член-корреспондент Россельхозакадемии, доктор биологических наук, профессор

Сафонов Георгий Анатолевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Кузнецова Светлана Владимировна

доктор биологических наук, профессор Рыбаков Сергей Сергеевич

Ведущее учреждение: ФГУ «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ «ВГНКИ»)

Зашита состоится 17 декабря 2010 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 006.069.01 при ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» Россельхозакадемии по адресу: 141142, Московская область, Щелковский район, пос. Биокомбината, ВНИТИБП; e-mail: vnitibp@mail.ru С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» (ВНИТИБП) Россельхозакадемии.

Автореферат разослан 16 ноября 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совет; кандидат биологических наук

1. Общая характеристика работы Актуальность.

Бешенство остается актуальной проблемой в глобальном смысле, являясь одной из самых опасных болезней человека и животных.

В настоящее время многие страны Европы смогли значительно улучшить эпизоотическую ситуацию по бешенству и даже полностью искоренить данную болезнь на своих территориях, в чем не малую роль играла планомерно организованная работа по проведению кампаний оральной вакцинации диких плотоядных.

Не смотря на то, что в мире существует немало коммерческих аншрабических вакцин для оральной иммунизации, по-прежнему существуют сомнения в их безопасности, а порой и эффективности, и, как результат, продолжается поиск и разработка новых более совершенных по этим показателям препаратов. Так эксперты ВОЗ постоянно указывают на необходимость совершенствования имеющихся и разработки новых более безопасных антирабических препаратов.

В России в настоящее время применяются оральные антирабические вакцины, изготовленные с применением атгенуированных штаммов вируса бешенства ТС-80 и РВ-97. Данные штаммы имеют остаточную вирулентность для некоторых видов млекопитающих и теоретически могут представлять опасность, особенно при неправильном их применении в природе в больших количествах.

Многообещающим, на наш взгляд, является применение штаммов нового поколения, таких как рекомбинантные и генетически модифицированные. Данные штаммы не способны вызывать заболевание бешенством ввиду отсутствия генетической информации, необходимой дня репродукции вирионов, либо по причине искусственно произведенных изменений в структуре вирусной РНК, в результате которых утрачивается вирулентность для животных. Поэтому для нас представляло особый интерес изучение иммунобиологических свойств штамма «ERA G333» полученного Др. Руппрехтом и Др. By в Центре по контролю болезней, Атланта, США (CDC) методом обратной генетики путем замены аргинина на глютаминовую кислоту в позиции 333 эктодомена гликопротеина исходного штамма ERA (Evelyn-Rokitincky-Abelseth) вируса бешенства.

Цель и задачи исследований. Основной целью работы являлось изучение иммунобиологических свойств генетически модифицированного штамма ERA G333 вируса бешенства с целью его дальнейшего использования при производстве оральной антирабической вакцины.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить чувствительность различных культур клеток при репродукции штамма ERA G333;

2. Определить оптимальные параметры культивирования штамма ERA G333 в монослое и суспензии клеток;

3. Определить степень патогенности штамма ERA G333 для различных видов животных;

4. Изучить генетическую стабильность штамма ERA G333;

5. Изучить антигенные и иммуногенные свойства штамма ERA G333;

6. Определить термостабильность штамма ERA G333.

Научная новизна работы. Научная новизна состоит в том, что в результате проведенных исследований:

• Отработаны оптимальные параметры промышленного культивирования штамма ERA G333 в монослое и суспензии клеток;

• Изучена патогенность штамма ERA G333 для различных видов животных;

• Изучена генетическая стабильность штамма ERA G333;

• Изучены антигенные и иммуногенные свойства штамма ERA G333;

• Изучена термостабильность штамма ERA G333.

Практическая значимость работы. Показана высокая иммуногенность и безвредность штамма ERA G333 для лабораторных, домашних и диких животных.

Полученные результаты проведенных исследований использованы при разработке следующих нормативно-технических документов:

«Методические указания по освежению, консервированию и хранению штамма ERA G333 вируса бешенства»

Апробация работы. Результаты основных исследований доложены и обсуждены на заседании технологической методической комиссии ОАО «Покровский завод биопрепаратов» в 2010 г., подтверждены комиссиошю (акт от 15.04.2008 г.). Результаты, полученные в ходе подготовки диссертации доложены и опубликованы в материалах научных конференций: THE XVI INTERNATIONAL CONFERENCE ON RABIES IN THE AMERICAS, RITA, 2005 Ottawa, Canada; THE XVÏÏ INTERNATIONAL CONFERENCE ON RABIES IN THE AMERICAS, RITA, 2006 Brasilia, Brazil; Towards the Elimination of Rabies in Eurasia Joint OŒ/WHO/EU International Conference, Paris, May 2007; THE XIX INTERNATIONAL CONFERENCE ON RABIES IN THE AMERICAS, RITA, 2008 Atlanta, USA, Centers for Disease Control and Prevention.

Личный вклад соискателя. Экспериментальные исследования и обобщение результатов по теме диссертации выполнены автором самостоятельно. Благодарности. Автор выражает благодарность за помощь в выполнении отдельных фрагментов диссертации сотрудникам ФГУП «Щелковский биокомбинат»: И.Ю. Литенковой, М.Ю. Кожушко, Е.В. Маслову. Основные положения, выносимые на защиту:

• иммунобиологические свойства (безвредность, антигенноегь, иммуногенность, термостабильность) штамма ERA G333 вируса бешенства. Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 109 страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы, практические предложения. Список литературы включает 155 источников, в том числе 56 отечественных и 99 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 12 таблицами, 3 рисунками и дополнена приложениями.

2. Собственные исследования Материалы и методы

Вирусы. Вирус бешенства, штамм ERA G333 (1 пассаж в культуре клеток BSR) получен из Центра по контролю и профилактике болезней (CDC, Атланта,

США), 7,5 lg FFU so/см3 в рамках проекта МНТЦ #2090;

Вирус бешенства, референс - штамм CVS-11 получен из OIE (МЭБ) - референс-лаборатории по бешенству (Нанси, Франция), титр 5,0 lg FFUso/см3. Животные. Беспородные белые мыши (1-3-х дневные, массой 6-7 г и 16-18 г), морские свинки (300-350 г), беспородные щенки собак (2 мес.), беспородные котята (1-2 мес.), песцы (10-12 мес.), лисы (8-10 мес.), енотовидные собаки, куры (21-дневного возраста).

Культуры клеток. В работе использовали перевиваемые культуры клеток: ВНК-21, BSR (клон ВНК-21), MNA (мышиная нейробластома),УЕ1Ш и ПС (почка сайги). Культуры клеток получали из Центра по контролю и профилактике болезней (CDC, Атланта, США) и коллекции культур клеток ОАО «Покровский завод биопрепаратов».

Культивирование вируса. Культивирование вируса проводили в стационарном и роллерном монослое клеток ВНК-21, BSR, MNA, VERO и ПС и в суспензии перевиваемой культуры клеток ВНК-21.

Определение инфекционной активности вируса. Инфекционную активность вируса определяли методом титрования в культуре клеток (ВНК-21, BSR) и на новорожденных мышах. Титр вируса выражали в фокусформирующих инфицирующих дозах FFUso/cm3 и мышиных летальных дозах МЛД5о/см3. Определение вирулентности вируса для животных. Культуральный вируссодержащий материал интрацеребрально вводили взрослым мышам, мышам массой 6-8г и новорожденным мышам в объёме 0,03 см3, морским свинкам - 0,1 см3, лисам - 0,2 см3, песцам - 0,2 см3, собакам - 0,2 см3. Внутримышечно мышам массой 6-8 г и новорожденным мышам вводили 0,1 см3, морским свинкам - 0,5 см3, лисам, песцам, собакам и кошкам - по 1 см3 вируссодержащего материала. Подкожно вируссодержащий материал вводили мышам массой 6-8 г и новорожденным мышам в объёме 0,1 см3, морским свинкам - 0,5 см3. Вируссодержащий материал орально вводили новорожденным мышам в объёме 0,1 см3. За животными вели наблюдением в течение 30 суток после инокуляции.

Определение реверсибелыюсти. Проводили пять последовательных интрацеребральных пассажей вируса на новорожденных мышах. 10%-ную суспензию, приготовленную из головного мозга мышей погибших в каждом пассаже, использовали для следующего пассажа. Наличие вируса бешенства в мозговых препаратах подтверждали в МФА и путем выделения в культуре клеток. Мозговую суспензию, приготовленную из головного мозга мышей, на которых осуществляли пятый пассаж, использовали для интрацеребрального заражения 10 взрослых мышей и 10 мышей массой 6-8 г, а также для внутримышечного - 10 мышей массой 6-8 г. За животными вели наблюдение в течение 30 дней.

Определение антигенности. Антигенность вируса определяли на собаках, лисах, енотовидных собаках, кошках по уровню антирабических ВНА при внутримышечном и оральном введении вируссодержащей культуральной жидкости.

Определение иммуногенности. Иммуногенность вируса для лабораторных животных определяли на белых мышах и морских свинках вакцинированных штаммом ERA G333 вируса бешенства по результатам интрацеребрального заражения референс-штаммом CVS вируса бешенства через 30 дней после иммунизации. Иммуногенность вируса для целевых животных определяли на лисах вакцинированных штаммом ERA G333 вируса бешенства по уровню и динамике формирования антирабических ВНА и по результатам контрольного заражения вирулентным штаммом 777-М вируса бешенства через 180 дней после иммунизации.

Статистическая обработка результатов. Математическую обработку результатов проводили с использованием программы Microsoft Excel-2007. Достоверность результатов оценивали с использованием критерия Стьюдента-Фишера по H.A. Плохинскому (1970). Результаты собственных исследований

Изучение культуральных свойств штамма ERA G333 вируса бешенства. Определение чувствительности перевиваемых культур клеток к вирусу бешенства. Основываясь на данных литературы, для определения

чувствительности к штамму ERA G333 вируса бешенства были выбраны перевиваемые культуры клеток ВНК-21, BSR, MNA, VERO и ПС.

Инфицирование культур клеток осуществляли из расчета 0,1 FFU50/iuicTKy. Интенсивность репродукции вируса оценивали по инфекционной активности полученного в процессе культивирования вируссодержащего материала в реакции иммунофлюоресценции.

В результате проведенных исследований установлено, что лучшими вирусрепродуцирующими свойствами обладают культуры клеток ВНК-21 и BSR. Показано, что накопление вируса бешенства штамм ERA G333 в данных клеточных системах в 100 и более раз выше, чем в культурах клеток MNA, VERO и ПС. Данные, представленные в табл. 1 показывают, что накопление штамма ERA G333 в культурах клеток ВНК-21 и BSR уже в третьем пассаже составляет 7,7±0,21 и 7,8±0,20 lg FFU50/cm3 соответственно.

Таблица 1.

Уровень репродукции вируса бешенства штамма ERA G333 в культурах

клеток

п=3

№ пассажа Инфекционная активность вируса (lg FFUso/см3)

ВНК-21 BSR VERO MNA ПС

1 6,7±0,23 7,3±0,22 3,5±0,24 4,9±0,22 5,0±0,22

3 7,7±0,21 7,8±0,20 4,8±0,19 5,6±0,15 5,2±0,20

5 7,9±0,22 8,0±0,20 5,0±0,25 5,5±0,20 5,5±0,20

8 7,7±0,20 7,8±0,20 4,9±0,25 5,2±0,13 5,6±0,13

16 7,7±0,21 7,8±0,25 н.и. н.и. н.и.

Примечание: н.и. - не исследовали;

Максимальное накопление вируса было получено в результате 4-5 последовательных пассажей. На данном пассажном уровне штамм ERA G333 стабильно накапливался в титре 7,8+8,2 lg FFU50/cm3. При увеличении количества пассажей в культуре клеток BSR до 16 вирус также стабильно накапливался в высоких титрах (7,7+8,1 lg FFU5o/cm3).Инфекционная активность штамма ERA G333 вируса бешенства, на уровне 5-8 пассажей в культуре клеток BSR составила 7,8+8,2 lg FFUsq/cm3. Период максимального

накопления штамма ERA G333 в перевиваемых культурах клеток ВНК-21 и BSR являлся практически одинаковым и колебался от 3 до 4 суток включительно. Репродукция штамма ERA G333 вируса бешенства в клетках ВНК-21, BSR, MNA, VERO и ПС протекала без цитопатогенного действия.

Показано, что наиболее перспективными для культивирования штамма ERA G333 вируса бешенства являются перевиваемые культуры клеток ВНК-21 и BSR.

Изучение параметров культивирования штаммов ERA G333 вируса бешенства в культурах клеток ВНК-21 и BSR. Как уже было показано, наиболее оптимальными объектами для репродукции штамма ERA G333 вируса бешенства, являются перевиваемые культуры клеток ВНК-21 и BSR. Поскольку клетки BSR адаптированы к монослойному методу культивирования, а линия клеток ВНК-21 может быть использована как при монослойном, так и при суспензионном культивировании представляло интерес в сравнительном плане изучить параметры культивирования вируса в данных клеточных системах при различных методах.

Определение оптимальных доз инфицирования клеток и способов культивирования вируса. Свежеприготовленные для посева суспензии и сформировавшийся суточный монослой клеток ВНК-21 и BSR инфицировали вирусом в дозах 1,0; 0,1; 0,01; 0,001; FFUso/кл. с экспозицией в течение 45 минут. Последующее культивирование вируса, осуществляли в стационарном (в пластиковых кулыуральных флаконах Т25, Т75) и круговом (в 0,5 л, 2,5 л и 4,5 л бутылях) монослое клеток. Результаты экспериментов представлены в табл. 2.

Установлено, что при множественности заражения 0,01 FFUso/кл. максимальное накопление вируса происходило на 3 сутки культивирования. Снижение дозы заражения культуры клеток до 0,001 FFUjo/кл. приводило к увеличению срока культивирования вируса в обеих линиях клеток до 4 суток и повышению инфекционной активности на 0,25-1,00 lg FFUsq/cm3.

Таблица 2.

Изучение влияния дозы, метода заражения и способа культивирования инфицированных клеток ВНК-21 и ВЯЛ на накопление

вируса бешенства

п=5

Культура Клеток Метод Заражения Доза заражения (НОЬо/кл) Время максимального накопления вируса(сут) Титр вируса РН11 5о/см3) полученный при культивировании

в стационарном монослое в круговом монослое

В* и И к м 53 о ю I Й £ § и 1 0,1 0,01 0,001 2 3 3-4 4 6,75±0,20 7,25±0,20 7,75±0,20 8,00±0,20 7,00±0,20 7,50±0,20 7,75±0,20 8,50±0,20

« 3 к - ^ о Лин д о 5 о § 1 0,1 0,01 0,001 2 3 3-4 4 5,50±0,20 6,50±0,20 6,25±0,20 7,25±0,20 6,75±0,20 7,50±0,20 7,50±0,20 7,75±0,20

<ч £ и 2 К И £3 о Я 8 Й и 1 0,1 0,01 0,001 2 3 3-4 4 6,75±0,20 7,25±0,20 7,50±0,20 8,25±0,20 6,75±0,20 7,50±0,20 7,75±0,20 8,75±0,20

153 2 и - ^ О Лин Я о 5 о § 2 1 0,1 0,01 0,001 2 3 3-4 4 5,75±0,20 6,00±0,20 6,25±0,20 7,50±0,20 6,50±0,20 6,75±0,20 7,25±0,20 7,50±0,20

Полученные результаты указывают на то, что множественность

инфицирования клеток влияет как на «урожай» вируса, так и на время его накопления. При инфицировании свежеприготовленной для посева суспензии клеток отмечено более высокое накопление вируса, чем при инфицировании суточного монослоя этих же клеток.

При множественности заражения 0,1 РРи50/кл и культивировании в стационарных условиях вирус накапливался с инфекционной активностью 6,007,25 РРизо/см3. При аналогичных условиях инфицирования и культивировании вируса в круговом монослое клеток инфекционная активность увеличивалась до 7,25-7,75 ^ БРи 50/см3.

Установлено, что максимальное накопление вируса происходило при культивировании в течение 96 часов в круговом монослое клеток ВНК-21 и В8Я, инфицированных в свежеприготовленную суспензию. Представляло интерес изучить зависимость титров инфекционной активности вируса и сроков

культивирования от посевной концентрации клеток. Для изучения данного аспекта была выбрана культура клеток БЭЯ. Готовили суспензии с различным количеством клеток ВБЯ для инфицирования вируса и дальнейшей посадки в роллерные бутыли, исходя из посевной концентрации 250 тыс., 500 тыс., 1,0 млн., 1,5 млн. и 2,0 млн. кл/см3. Инфицированные вирусом суспензии клеток со множественностью заражения 0,001 РРЦзо/кл выдерживали 45 минут при 37°С с перемешиванием каждые 5-7 минут. Последующее культивирование проводили в круговом (в 0,5 л и 4,5 л бутылях) монослое клеток. Результаты экспериментов представлены в табл. 3.

Таблица 3.

Результаты анализа влияния посадочной концентрации клеток ВвЯ на

накопление штамма ERA G333 вируса бешенства

п=5

Посевная концентрация клеток BSR в см3 Титр инфекционной активности (lg FFU 50/см3)

2 суток 3 суток 4 суток

250 тыс. 7,00±0,25 7,75±0,25 8,75±0,25

500 тыс. 7,50±0,25 8,00±0,25 7,75±0,25

1,0 млн. 7,75±0,25 8,25±0,25 8,00±0,25

1,5 млн. 7,50±0,25 8,25±0,25 7,75±0,25

2,0 млн. 7,50±0,25 8,00±0,25 7,50±0,25

В результате анализа полученных данных установлено, что период максимального накопления вируса сокращался при увеличении концентрации клеток и наоборот, снижение посадочной концентрации клеток приводило к увеличению сроков накопления вируса. Максимальный титр вируса составил 8,50f-9,00 lg FFUx/см3 при культивировании вируса в роллерных бутылях в течение 4 суток с посевной концентрацией 250 тыс. клеток BSR в 1 см3. Увеличение посадочной концентрации клеток до 1,0 - 2,0 млн. в 1 см3 не приводило к увеличению значений титров вируса, в то же время значительно увеличивая расход питательной среды на выращивание необходимого количества клеток.

Результаты, полученные при культивировании штамма ERA G333 вируса бешенства роллерным методом в монослое культур клеток ВНК-21 и B§R, позволяют сделать вывод о том, что вирус накапливается в высоких титрах с сопоставимыми значениями. Следующим этапом нашей работы было изучение параметров репродукции вируса в клетках ВНК-21 при суспензионном способе культивирования.

Суспензионное культивирование клеток ВНК-21 и вируса проводили в биореакторах различного объёма (New Brunswick - 5 л, КС - 40 л) при 37°С, аэрацией и скоростью перемешивания 70-90 об/мин., посевная концентрация клеток составляла 500-600 тыс. кл/см3. Для инфицирования использовали суспензию, содержащую необходимое для посадки количество клеток ВНК-21 находящихся в 1/5 от объёма культивирования и множественность заражения 0,1-0,01 ЕГОя/кл. После контакта вируса с клетками в течение 45 минут при медленном вращении мешалки (40-50 об/мин.), доводили объём культивирования до конечного ростовой питательной средой. Последующее культивирование проводили в течение 3 суток с постоянным поддержанием рН среды в диапазоне 7,0-7,2. Через 24, 40, 48, 60 и 72 часа культивирования производили отбор проб из сосудов для подсчета клеток и замораживания при минус 70°С для последующего определения титров инфекционной активности. Динамика изменения титров вируса и концентрации клеток ВНК-21 в процессе культивирования представлена в табл. 4.

Таблица 4

Результаты анализа уровня репродукции штамма ERA G333 в культуре

клеток ВНК-21 при суспензионном культивировании.

п=5

Показатели Время культивирования, часы

24 40 48 64 72

Титр вируса (lgFFUso/cM3) 7,50±0,25 7,75±0,25 9,25±0,25 8,25±0,25 6,50-Ь0,25

Концентрация клеток, млн./см3 1,6 3,8 4,2 4,0 3,5

Из данных приведенных в табл. 4 видно, что нарастание титров вируса происходит в течение 48 часов культивирования, и при дальнейшем культивировании отмечается снижение инфекционной активности. Отмечено также, что концентрация клеток ВНК-21 в суспензии через 48 часов культивирования достигала максимального значения в 4,2 млн. клеток в 1 см3, а затем постепенно снижалась и к 72 часам культивирования составляла 3,5 млн. клеток в 1 см3.

Изучение патогенности вируса для животных. Патогенность вируса бешенства, штамм ERA G333 изучали на уровне 1, 9 и 16 пассажей, культуре клеток BSR.

Патогешюстъ вируса бешенства оценивали по его вирулентности для различных видов животных и реверсибельносга.

Вирулентные свойства. Были проведены опыты по изучению вирулентности штамма ERA G333 вируса бешенства при шгграцеребралыюм, внутримышечном, подкожном и оральном методах введения для некоторых видов диких, домашних и лабораторных животных: лисы, песцы, собаки, кошки, морские свинки, белые мыши, куры. Результаты исследований показали, что данный штамм не обладает вирулентностью для целевых и лабораторных животных и не вызывает гибель, даже при внутримозговом введении животным, в том числе белым мышам двухнедельного возраста и вызывает гибель только мышат-сосунков.

Реверсибелыюсть. Поскольку при применении живых вакцин против бешенства необходимо проводить контроль возможности реверсии атгенуированных штаммов к исходной вирулентной форме, нами был проведен эксперимент по определению реверсибельносга штамма ERA G333 вируса бешенства. Как уже было показано в наших экспериментах, единственной живой моделью чувствительной к данному штамму являются мыши в первые дни жизни, а пассирования вируса в культуре клеток, на наш взгляд, не достаточно для определения реверсибельносга вируса бешенства, было проведено пять последовательных шпрацеребральных пассажей штамма ERA G333 вируса бешенства на новорожденных мышах. Объединенную суспензию, приготовленную из головного мозга мышей погибших в каждом пассаже, использовали для следующих пассажей. Наличие вируса бешенства в мозговых препаратах подтверждали в МФА и путем выделения вируса в культуре клеток.

Мозговую суспензию, полученную от мышей, погибших в пятом пассаже, использовали для заражения 10 взрослых мышей и 10 мышей 2-недеяьного возраста массой 6-7 г инграцеребрально, а также 10 мышей 2-недельного возраста внутримышечно (6-й пассаж). За животными вели наблюдение в течение 30 дней, на протяжении срока наблюдения специфической гибели мышей обнаружено не было. Нами было установлено, что проведение пяти шпрацеребральных пассажей штамма ERA G333 вируса бешенства на новорожденных мышах не приводит к повышению его вирулентных свойств, о чем свидетельствует отсутствие вирулентности

вируссодержащего материала пятого пассажа для взрослых мышей и мышей 2-недельного возраста массой 6-7 г.

Изучение антигенности штамма ERA G333. Антигенную активность определяли по способности штамма вызывать образование антирабических вируснейтрализующих антител в организме вакцинированных животных. Для этого были иммунизированы 38 лис с использованием различных доз и методов введения вируса. До вакцинации, а также через 30 и 60 дней после вакцинации у всех животных брали пробы крови дня определения титров антирабических вируснейтрализующих антител в реакции нейтрализации (FAVN). Все животные были серонегативными по бешенству до вакцинации. В табл. 5 представлены результаты данного эксперимента.

Таблица 5

Результаты анализа антигенной активности

штамма ERA G333 вируса бешенства _

а я Титры антител, ME (IU)/cm3

щичество шотных в опыте x о 30 дней после вакцинации 60 дней после вакцинации

CJ с.1 Я я л ч м Диапазон разброса Среднее Диапазон разброса Среднее

¡2 Н S3 й: s величин титров антител значение величин титров антител значение

3 в/м /7,5 lg FFUso/см3 13,5-30,7 19,4 - -

3 Орально/8,5 lg FFUso/см3 23,3-30,7 28,0 23,4-53,3 38,1

26 Орально/7,5 lg FFUso/см3 0,5 - 30,7 7,15 0,28 - 53,3 7,0

6 Орально/6,5 lg FFUso/см3 0,37-17,76 3,15 0,8 - 14,8 3,53

2 Контроль <0,04 <0,04

Примечание:«-» не исследовали

Из результатов представленных в табл. 5 видно, что 100% лис, иммунизированных орально штаммом ERA G333 вируса бешенства, имели титры В НА через 60 дней после вакцинации в значениях равных или превышающих минимальный порог в 0,5 МЕ/см3, что свидетельствует о высокой антигенной активности штамма ERA G333 вируса бешенства.

Изучение иммуногенности. Изучена иммуногенность штамма ERA G333 для морских свинок и белых мышей.

В опыте использовали 15 взрослых морских свинок, 30 белых мышей двухнедельного возраста. Для вакцинации использовали разведение вируса с активностью Ю5^ FFD5(/cm3. Первой группе из 5-ти морских свинок вирус вводили подкожно, второй группе - внутримышечно по 0,5 см3. Третью группу из 5-ти животных не вакцинировали.

Мышей также разделили на три группы по 10 животных в каждой. Первую группу вакцинировали внутримышечно, вторую — подкожно, третью не вакцинировали. Объем вводимого вируссодержащего препарата 0,1 см3. Через 30 дней все животные были заражены интрацеребрально вирусом бешенства шт. CVS в дозе 300 МЛД50- За животными вели наблюдение в течение 30 дней. Результаты этого опыта суммированы в табл. 6.

Таблица 6.

Иммупогенность штамма ERA G 333 для морских свинок и белых мышей

Вид животного Количество животных Метод введения Объем инокулята Результаты контрольного заражения iht.CVS погибло/выжило

Морские свинки 5 в/м 0,5 см3 0/5

5 п/к 0,5 см1 0/5

5 контроль - 5/5

Белые мыши 10 в/м 0,1 см3 0/10

10 п/к 0,1 см' 0/10

10 Контроль - 10/10

Данные, представленные в табл. 6 показывают, что все контрольные животные погибли к 15 дню после заражения, в то время как все вакцинированные животные были живы до конца срока наблюдения и не проявляли признаков бешенства.

Для определения иммуногенности для целевых животных и длительности иммунитета три лисы (№№ 4-6), были вакцинированы орально по 2 см3 вируссодержащего препарата с инфекционной активностью 108-5 FFlWcM3, двадцать шесть лис (№№ 7-32) - по 2 см3 с инфекционной активностью 107,5 FFU5(/cm3 и шесть лис (№№ 33-38) - по 2 см3 с инфекционной активностью lO^FFUa/cM3. У группы лис вакцинированных орально производили отбор проб крови до вакцинации, а также на 30, 60, 90, 120, 150, 180 сутки после вакцинации с целью определения уровня аншрабических вируснейгрализующих антител в реакции нейтрализации (FAVN). Все лисы били серонегативные по бешенству до вакцинации. На 180-е сутки после

вакцинации все вакцинированные лисы и 5 невакцинированных были заражены вирулентным штаммом вируса бешенства в дозе 1000 МЛДя/гол. За подопытными животными вели наблюдение в течение 60 суток после контрольного заражения. Все невакцинированные лисы погибли на 15-22 сутки с симптомами бешенства. Для подтверждения специфической гибели лис мозговые отпечатки были исследованы в РИФ. Все вакцинированные лисы оставались живы в течение срока наблюдения и не проявляли симптомов бешенства. Анализ результатов данного эксперимента представлен в таб.7.

Таблица 7

Титры антител у лис вакцинированных орально шт. ERA G333 вируса

бешенства

Оральная доза вакцины Количество животных в опыте Сроки определения титров антител, сутки Средние геометрические (М) титры антител, ME Диапазон разброса величин титров антител, ME Титры вирус нейтрализующих антител на 30 сутки после контрольного заражения, МЕ

8,5 lg FFIWcm3 3 30 60 90 120 150 180 29,9 40.6 20,1 20,1 16,2 16.7 23,38 - 30,77 23,38 - 55,30 13,5 -33,12 14,79 - 30,77 13,5 -21,33 14,79 -17,76 31,7 (23,38-44,38)

7,51g FFUso/cm3 26 30 60 90 120 150 180 7,15 7,0 4.0 2,6 2.1 2,1 0,5 -30,77 0,28 - 53,3 0,21-40,5 0,21-30,7 0,28-23,3 0,28-21,3 12,3 (0,65-92,32)

6,5 lg FFUso/cm3 6 30 60 90 120 150 180 3,1 3,5 2,1 1,5 0,8 0,78 0,37 - 17,76 0,79 -14,79 0,6 - 5,4 0,65 - 3,41 0,37- 2,59 0.21 - 2,59 12,8 (3,41-53,30)

Контрольные лисы 5 <0,04 ♦5/0

Примечание: «-» - не исследовали; * - пали

Из выше приведенных данных следует, что через 6 месяцев после

вакцинации произошло снижение титров антител у трех лис вакцинированных дозой 7,5 РРи50/см3 и одной лисы вакцинированной дозой 6,5 ^ РРи5о/см3 ниже уровня 0,5 МЕ/см3. Несмотря на это все вакцинированные лисы выжили после контрольного заражения штаммом М-777 вируса бешенства и не

проявляли симптомов бешенства в течение срока наблюдения. Кроме того, после контрольного заражения был отмечен резкий рост уровней антирабических вируснейтрализующих антител в крови животных, что указывает на наличие бустерного эффекта при заражении. По окончании срока наблюдения пробы головного мозга, полученные от всех животных, используемых в эксперименте, исследовали в РИФ, при этом антигена вируса бешенства в исследованных пробах не обнаружено. Изучение термостабильности штамма ERA G333 вируса бешенства.

При выборе аттенуированного вакцинного штамма вируса бешенства для изготовления живых оральных вакцин одним из наиболее важных свойств является его термостабильность. Для изучения динамики снижения титров инфекционной активности штамма ERA G333 вируса бешенства в процессе хранения при положительных температурах использовали свежеприготовленную культуральную вируссодержащую жидкость с инфекционной активностью Ю8,0 FFIWcm3. Вируссодержащую жидкость разливали в стерильные пластиковые пробирки и хранили при температуре 4-6°С и 18-20°С в течение 40 суток, несколько пробирок были заморожены при температуре -70°С в качестве контроля. Пробирки с вирусом с различным сроком экспозиции при положительных температурах замораживали при температуре -70°С и хранили до определения титров инфекционной активности.

Данные полученные при титровании вируса представлены в табл. 8.

Таблица 8

Результаты изучения термостабилыюсти штамма ERA G333 вируса бешенства __п=5

Время экспозиции, сутки Температура

4'С 20 "C

0 8,0 lg FFUso/см3 8,0 lg FFUso/см3

5 8,0 lg FFU50/cmj 8,0 lg FFU50/cm3

7 8,0 lg FFU50/cmj 7,75 lg FFUso/см3

10 7,75 lg FFU50/cm3 7,25 lg FFUso/см3

15 7,75 lg FFUS0/cmj 7,25 lg FFUjo/cm3

21 7,75 lg FFU50/cmj 6,75 lg FFU50/cm3

25 7,0 lg FFU50/cmj 6,75 lg FFUjo/cm3

30 7,0 lg FFU50/cmj 6,75 lg FFU50/cm3

35 7,0 lg FFU50/cm3 6,5 lg FFUso/см3

40 6,75 lg FFUso/см3 6,25 lg FFUso/см3

Из полученных данных видно, что инфекционная активность штамма ERA G333 вируса бешенства снижается на 0,25 lg в процессе хранения при 4°С в течение 21 суток, а при 18-20°С аналогичное снижение титров происходило на 7 сутки. К 40 суткам экспозиции при 4°С и 20°С титры инфекционной активности снизились на 1,25 и 1,75 lg соответственно.

Исходя из данных литературы, было решено использовать растворы TRTS-буффера и EDTA (версен) для повышения термостабильносги вируссодержащего материала. Данные растворы добавлялись в смеси к вируссодержащей жидкости в соотношении 1:10 с последующим доведением значения рН до 7,5-7,8. Данные полученные при определении титров инфекционной активности представлены в табл. 9.

Таблица 9

Результаты изучения термостабильности вируссодержащей жидкости с добавлением TRIS-буффера и EDTA

п=5

Время экспозиции, сутки Температура

4'С 20 'C

0 7,75 lg FFU50/cmj 7,75 lg FFUso/cm3

7 7,75 lg FFU50/CM3 , 7,75 lg FFU50/cm3

10 7,75 lg FFUso/см3 7,5 lg FFUso/cm3

15 7,5 lg FFU50/cmj 7,5 lg FFUso/cm3

21 7,5 lg FFU50/cm3 7,25 lg FFUso/cm3

25 7,5 lg FFU50/cmj 7,25 lg FFUso/cm3

30 7,5 IgFFlWcM3 7,0 lg FFUso/cm3

35 7,5 lg FFU5o/cmj 7,0 lg FFUso/cm3

40 7,5 lg FFUso/cm3 6,75 lg FFUso/cm3

На графике, изображенном, на рис. 1 показана динамика снижения титров с линиями тренда при экспозиции вируссодержащего материала с добавлением ТЩБ-буффера и ЕЭТА при 4°С и 20°С.

Рисунок 1

Из данных представленных в табл. 9 и рис. 1 видно что снижение титров вируса в процессе хранения при 4°С и 20°С в течение 40 суток составило 0,25 и 1,0 ^ соответственно. Установлено, что добавление к вируссодержащей жидкости ТЫБ-буффера и ЕОТА позволило повысить термостабильность штамма ЕЯА 0333 вируса бешенства.

Для определения срока хранения вакцинного вируса при температуре минус 20°С пробирки с вирусом (титр инфекционности Ю8,0 РРи5о/см3) хранили при температуре минус 20"С в течение 18 месяцев (срок наблюдения). Через 3, 6, 12, 15, 18 месяцев проверяли инфекционную активность образцов препарата. Результаты представлены в табл. 10.

Таблица 10

Анализ изменения титра вируса в процессе хранения при температуре минус 20°С

п=3

Инфекционная активность вируса, БРи/см3

0 3 6 12 15 18

мес. мес. мес. мес. мес. мес.

8,0 8,0 8,0 8,0 8,0 7,75

Установлено, что при хранении культуральной вируссодержащей жидкости при температуре минус 20°С 15 мес., препарат сохраняет свою инфекционную активность, а к 18 мес. произошло снижение титров на 0,25

3. Выводы

1. Установлено, что максимальное накопление штамма ERA G333 вируса бешенства происходит в линиях культуры клеток ВНК-21 и BSR. Накопление вируса бешенства штамм ERA G333 в данных клеточных системах в 100 и более раз выше, чем в культурах клеток MNA, VERO и ПС, и уже в третьем пассаже составляет 7,7±0,21 и 7,8±0,20 lg FFUso/см3 соответственно. Максимальное накопление вируса происходило в результате 4-5 последовательных пассажей, когда штамм ERA G333 стабильно имел титры в диапазоне 7,8+8,2 lg FFU50/cm3 (р<0,05).

2. Инфицирование перевиваемых клеток ВНК-21 и BSR непосредственно во время посева в дозе 0,001 FFU50/ioi и последующее культивирование вируса в роллерных бутылях с посевной концентрацией 250 тыс. клеток в 1 см3 обеспечивает максимальное накопление на 4 сутки штамма ERA G333 - титр вируса составил 8,50+9,00 lg FFU50/cm3. При множественности инфицирования 0,1-0,01 FFUso/кл. и посевной концентрации 500-600 тыс. клеток ВНК-21 в 1см3 максимальное накопление вируса приходилось на 48 часов культивирования суспензионным способом. Титр вируса составил 9,0+9,5 lg FFU50/cm3(p<0,05).

3. Установлено, что ввиду отсутствия вирулентности для целевых и лабораторных животных (собаки, кошки, лисы, песцы, морские свинки, мыши, куры) при интрацеребральном, внутримышечном, подкожном и оральном методах введения в организм, штамм ERA G333 относится к группе авирулентных штаммов вируса бешенства.

4. Экспериментально установлено отсутствие реверсии штамма ERA G333 при проведении пяти интрацеребральных пассажей вируса на новорожденных мышах.

5. Вакцинный штамм ERA G333 вируса бешенства является антигенно- и иммуногенно-активным и индуцирует образование у лис вируснейтрализующих антител в титрах превышающих минимальный защитный уровень в 0,5 ME /см3, обеспечивает защиту от внутримозгового заражения референс-штаммом CVS белых мышей и морских свинок в дозе 300 МЛД50/ГОЛ., а также защиту лис от бешенства через 6 месяцев после

иммунизации при внутримышечном заражении вирулентным штаммом М-777 вируса бешенства в дозе 1 ООО МЛД 50/гол.

6. Добавление растворов TRIS-буффера и EDTA (версен) повышает термостабильность штамма ERA G333 вируса бешенства. Снижение титров вируса в процессе хранения при 4°С и 20°С в течение 40 суток составило 0,25 и 1,0 lg соответственно.

4. Практические предложения

• Предложен штамм ERA G333 вируса бешенства для производства антирабической вакцины орального применения. По результатам комиссионных испытаний данный штамм депонирован во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве под названием: аттенуированный производственный штамм «ERA G333» - ДЕП вируса бешенства.

• Разработаны и утверждены директором ОАО «Покровский завод биопрепаратов» (от 15.07.2010 г.) «Методические указания по поддержанию, консервированию и хранению штамма ERA G333 вируса бешенства».

5. Список опубликованных работ по материалам диссертации

1. Сафонов Г.А. Некоторые проблемы бешенства в Российской Федерации. / Сафонов Г.А., Баньковский Д.О., Калинина Т.А.// Научные аспекты обеспечения защиты животных от экотоксикантов, радионуклеидов и возбудителей опасных инфекционных заболеваний: Материалы междунар. симп. -Казань, 2005. С 125-128

2. Сафонов Г.А. Изучение свойств штамма ERA G333 вируса бешенства / Сафонов Г.А., Баньковский Д.О. // Вестник РАСХН. 2009. №6. С.70-72

3. Сафонов Г.А. Оценка антигенных и иммуногенных свойств штамма ERA G333 вируса бешенства / Сафонов Г.А., Баньковский Д.О. // Вестник РАСХН. 2010. №5. С.61-63

4. Bankovskiy D, Safonov G, Kurilchuk Y. Immunogenicity of the ERA G333 rabies virus strain in foxes and raccoon dogs. // Dev Biol (Basel). 2008; 131:461-6.

Отпечатано в ООО «Мещёра», М.О., г. Щёлково, ул. Свирская, 8а Тир. 100 экз., заказ № 436

Содержание диссертации, кандидата ветеринарных наук, Баньковский, Денис Олегович

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1L Классификация, структурами свойства вируса бешенства.

2:2. Антигенные свойства вируса бешенства.

2.3. Эпизоотологические особенности бешенства.

2.4. Проблемы бешенства в Российской Федерации.

2.5. Оральная вакцинация.

2.6. Штаммы вируса бешенства.

2.7. Требования к приманкам.

2.8. Новые вакцинные штаммы и типы приманок.

2.9. Обоснование выбора вакцинного штамма вируса бешенства.

3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1.1. МАТЕРИАЛЫ.

3.1.1.1. Вирусы.

3.1.1.2. Животные.

3.1.1.3. Культуры клеток.

3.1.1.4. Среды и растворы.

3.1.1.5. Реактивы.

3.1.1.6. Оборудование.

3.1.2. МЕТОДЫ.

3.1.2.1. Культивирование вируса.

3.1.2.2: Определение инфекционной активности вируса.

3.1.2.2.1. Титрование вируса в культуре клеток.

3.1.2.2:2. Титрование вируса на белых мышах.

3.1.2.2.3. Выделение вируса в культуре клеток.

3.1.2.3. Определение контаминации бактериальной и грибной микрофлорой.

3.1.2.4: Определение вирулентности вируса для животных.

3.1.2.5. Определение реверсибельности.

3.1.216. Приготовление стабилизирующего раствора.

3.1.217. Сублимационное высушивание вируссодержащего материала.

3.1.2.8. Определение антигенности.

3.1.2.8.1. Определение уровня антирабических ВНА в сыворотках крови животных.

3.1.2.9. Определение иммуногенности.

3.1.2.9.1. Определение иммуногенности для лабораторных животных.

3.1.2.9.2. Определение иммуногенности для целевых животных.

3.1.2.10. Методы статистической обработки данных.

3.2. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.2.1. Изучение культуральных свойств штамма ERA G333 вируса бешенства.

3.2.1.1. Определение чувствительности перевиваемых культур клеток к вирусу бешенства.

3.2.1.2. Изучение параметров культивирования штаммов ERA G вируса бешенства в культурах клеток ВНК-21 и BSR.

3.2.1.2.1. Определение оптимальных условий инфицирования клеток и способов культивирования вируса.

3.2.3. Изучение патогенности штамма ERA G333 вируса бешенства для животных.

3.2.3.1. Вирулентные свойства.

3.2.3.2. Изучение реверсибельности.

3.2.4. Изучение антигенности штамма ERA G333'.

3.2.5. Изучение иммуногенности для лабораторных животных.

3.2.6. Изучение иммуногенности штамма ERA G333 для целевых, животных.

3.2.7. Изучение термостабильности штамма ЕКА ОЗЗЗ вируса бешенства.

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ.

5. ВЫВОДЫ.

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Иммунобиологические свойства штамма ERA G333 вируса бешенства для изготовления оральной антирабической вакцины"

Бешенство остается актуальной проблемой в глобальном смысле, являясь одной из самых опасных болезней человека и животных.

Бешенство ведет свою очень богатую и длинную историю с древних времен. Первая прививка человека от бешенства, осуществленная Пастером в 1885 году следовала за столетиями ужаса, ассоциирующегося с этой болезнью и неэффективными способами «лечения» людей после укусов бешеными животными. Было бесчисленное количество суеверий и неправильные представления о болезни, многие из которых бытуют и по наши дни в некоторых частях мира. Бешеные собаки продолжают нести ответственность за смертельные случаи бешенства человека, в то время как дикие плотоядные животные, включая лис, енотовидных собак, скунсов и енотов, поддерживают природные резервуары и энзоотические циклы распространения вируса бешенства. В современной науке и практике сложились принципы борьбы с этой инфекцией, которые направлены в первую очередь на предотвращение инфицирования человека и домашних животных путем прерывания цепи передачи инфекции на различных её «участках». А именно вакцинация домашних животных, сокращение численности и вакцинация бродячих собак и кошек и, конечно устранение природного резервуара бешенства путем оральной вакцинации диких плотоядных.

В настоящее время многие страны Европы смогли значительно улучшить ситуацию по бешенству и даже полностью искоренить данную болезнь на своих территориях, в чем не малую роль играла планомерная и хорошо организованная работа по проведению кампаний оральной вакцинации диких плотоядных.

Несмотря на то, что в мире существует немало коммерческих антирабических вакцин для оральной иммунизации, по-прежнему существуют сомнения в их безопасности, а порой и эффективности, и, как результат, продолжается поиск и разработка новых более совершенных по этим показателямшрепаратов. Так эксперты ВОЗ постоянно указывают на необходимость совершенствования имеющихся и разработки; новых; более безопасных антирабических препаратов.

В России в настоящее время применятся оральные антирабические вакцины, изготовленные с применением аттенуированных штаммов вируса бешенства ТС-80 и РВ-97. Данные штаммы имеют остаточную вирулентность для некоторых видов млекопитающих и теоретически могут представлять опасность, особенно при возможном неправильном их применении в природе в больших количествах.

Многообещающим, на наш взгляд, является разработка1 и применение штаммов нового поколения, таких как рекомбинантные и генетически модифицированные. Данные штаммы не способны вызывать заболевание бешенством ввиду отсутствия генетической информации, необходимой для репродукции вирионов) либо по причине искусственно произведенных изменений структуры вирусной РНК, в результате которых утрачивается вирулентность для животных. Поэтому для нас представляло особый интерес изучение иммунобиологических свойств штамма «ERA G333» полученного Др. Руппрехтом и Др. By в Центре по контролю болезней, Атланта, США (CDC) методом обратной генетики путем замены аргинина на глютаминовую кислоту в позиции 333 эктодомена гликопротеина исходного штамма ERA (Evelyn-Rokitincky-Abelseth) вируса бешенства.

Цель и задачи исследований. Основной целью работы являлось изучение иммунобиологических свойств генетически модифицированного штамма вируса бешенства ERA G333 с целью его дальнейшего использования при производстве оральной антирабической вакцины. . .

Для достижения поставленной цели необходимо было;' решить следующие задачи:

1. Изучить чувствительность различных культур клеток при репродукции штамма ERA G333;

2. Определить оптимальные параметры культивирования штамма ERA G333 в монослое и суспензии клеток;

3. Определить степень патогенности штамма ERA G333 для различных видов животных;

4. Изучить генетическую стабильность штамма ERA G333;

5. Изучить антигенные и иммуногенные свойства штамма ERA G333;

6. Определить термостабильность штамма ERA G333.

Научная новизна работы. Научная новизна состоит в том, что в результате проведенных исследований впервые:

• Отработаны оптимальные параметры промышленного культивирования штамма ERA G333 в монослое и суспензии клеток ВНК-21 и BSR;

• Изучена патогенность штамма ERA G333 для различных видов животных;

• Изучена генетическая стабильность штамма ERA G333;

• Изучены антигенные и иммуногенные свойства штамма ERA G333;

• Изучена термостабильность штамма ERA G333. Практическая значимость работы.

Показана высокая иммуногенность и безвредность штамма ERA G333 для лабораторных, домашних и диких животных.

Полученные результаты проведенных исследований использованы при разработке следующих нормативно-технических документов: «Методические указания по освежению, консервированию и хранению штамма ERA G333 вируса бешенства»

Публикации научных работ. По материалам диссертации опубликовано 4 научные работы.

Основные положения, выносимые на защиту:

• иммунобиологические свойства1 (безвредность, антигенность, иммуногенность, термостабильность) штамма ERA G333 вируса бешенства

Апробация работы.

Результаты основных исследований подтверждены комиссионно (акт от 15.04.2008 г., приложение № 1). Результаты, полученные в ходе подготовки диссертации, доложены и опубликованы в материалах научных конференций: THE XVI INTERNATIONAL CONFERENCE ON RABIES IN THE AMERICAS, RITA, 2005 Ottawa, Canada; THE XVII INTERNATIONAL CONFERENCE ON RABIES IN THE AMERICAS, RITA, 2006 Brasilia, Brazil; Towards the Elimination of Rabies in Eurasia Joint OIE/WHO/EU International Conference, Paris, May 2007; THE XIX INTERNATIONAL CONFERENCE ON RABIES IN THE AMERICAS, RITA, 2008 Atlanta, USA, Centers for Disease Control and Prevention.

Структура и объем диссертации.

Исследования по диссертационной работе проводились в 2005-2010 гг. в ОАО «Покровский завод биопрепаратов. Диссертация изложена на 109 страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы, практические предложения. Список литературы включает 155 источников, в том числе 55 отечественных и 100 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 12 таблицами, 3 рисунками и дополнена приложениями.

Заключение Диссертация по теме "Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов", Баньковский, Денис Олегович

5. ВЫВОДЫ

1\ Установлено, что максимальное накопление штамма ERA G333' вируса бешенства происходит в линиях культуры клеток ВНК-2Г и В SR. Накопление вируса бешенства штамм ERA G333 в данных' клеточных системах в 100 и более раз выше, чем в культурах клеток MNA, VERO и ПС, и уже в третьем пассаже составляет 7,7±0,21 и 7,8±0,20 lg FFU50/cm3 соответственно (при критерии достоверности разницы tp больше критерия Стьюдента, вероятность р<0,05). Максимальное накопление вируса происходило в результате 4-5 последовательных пассажей, когда штамм ERA G333 стабильно имел титры в диапазоне 7,8^-8,2 lg FFU5o/cm3.

2. Инфицирование перевиваемых клеток ВНК-21 и BSR непосредственно во время посева в дозе 0,001 FFUso/кл и последующее культивирование вируса в роллерных бутылях с посевной концентрацией 250 тыс. клеток в 1 см3 обеспечивает максимальное накопление на 4 сутки штамма ERA G333 - титр вируса составил 8,50-5-9,00 lg FFU50/cm3. При множественности инфицирования 0,1-0,01 FFU50/1ÜI и посевной концентрации 500-600 тыс. клеток ВНК-21 в 1см3 максимальное накопление вируса приходилось на 48 часов культивирования суспензионным способом. Титр вируса составил 9,0-ь9,5 lg FFU50/cm3.

3. Установлено, что ввиду отсутствия вирулентности для целевых и лабораторных животных при различных методах введения в организм и наличия вирулентности только для мышат-сосунков штамм ERA G333 на уровне 9-16 пассажа в культуре клеток BSR относится к группе авирулентных штаммов вируса бешенства.

4. Экспериментально установлено отсутствие реверсии штамма ERA G333 -проведение пяти интрацеребральных пассажей вируса на новорожденных мышах не приводит к усилению его вирулентности.

5. Вакцинный штамм ERA G333 вируса бешенства является антигенно- и иммуногенно-активным и индуцирует образование > у лис вируснейтрализующих антител в титрах превышающих минимальный порог в 0,5 МЕ/см , обеспечивает защиту от внутримозгового заражения референс-штаммом CVS белых мышей и морских свинок в дозе 300 МЛД5о/гол., а также защиту лис через 6 месяцев после иммунизации от внутримышечного заражения вирулентным штаммом М-777 вируса бешенства в дозе 1 ООО МЛД 50/гол.

6. Добавление растворов TRIS-буффера и EDTA (версен) повышает термостабильность штамма ERA G333 вируса бешенства - снижение титров вируса в процессе хранения при 4°С и 20°С в течение 40 суток составило 0,25 и 1,0 lg соответственно.

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

• Предложен штамм ERA G333 вируса бешенства для производства антирабической вакцины орального применения. По результатам комиссионных испытаний данный штамм депонирован во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве под названием: аттенуированный производственный штамм «ERA G333» - ДЕП вируса бешенства (приложения №1, №2, №3).

• Разработаны и утверждены директором ОАО «Покровский завод биопрепаратов» (от 15.07.2010 г.) «Методические указания по поддержанию, консервированию и хранению штамма ERA G333 вируса бешенства» (приложение № 4).

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата ветеринарных наук, Баньковский, Денис Олегович, Щёлково

1. Авилов В.М., Седов В.А., Коломыцев С.А. и др. Необходим учет новых особенностей эпизоотологии бешенства// Ветеринария." 1998.-№6.-С.З-6.

2. Авилов В.М., Сочнев В.В., Савин A.B. и др. Функционирование паразитарной системы бешенства в субъектах Федерации Поволжского экономического района. Ветеринарная патология, 2004 г., № 3.

3. Апалькин В.А., Ведерников В.А., Балдина И.В., Яременко H.A., Гулюкин A.M., Харкевич A.A., Коломыцев С.А., Шабейкин A.A. -Бешенство животных в России. Особенности современной эпизоотической обстановки. Ветеринария, № 12, 2004 г.

4. Белик Е.В., Рыбаков С.С., Груздев К.Н. и другие «Ведомственная целевая программа борьбы с бешенством в Российской Федерации».//Российский ветеринарный журнал. Сентябрь, 2008г.

5. Вакцины для животных // технический отчет ВОЗ, серия 931, 2004г. с.34

6. Васильев К.Г.Эпидемиологические изучения живых вирусных вакцин //Издат. Академии наук Латвийской ССР. 1987г.с.13

7. Ведерников В.А. Бешенство не знает границ. Ветеринарная газета, 2002 г., №11.

8. Ведерников В.А., Балдина И.В., «И все-таки как лечить бешенство?».// Ветеринарная жизнь №5, Август 2008г.

9. Вишняков И.Ф., Никишин И.В., Недосеков' В.В1., Горшкова Т.Ф., Жестер ев В.И., Шевченко A.A., Зуев ВВ., Груздев К.Н. Инактивированная культуральная вакцина против бешенства животных // Ветеринария. 19981- № 6. - С.76-80г

10. Волкова A.B. Культивирование вируса бешенства штамма;Внуково-32 в культуре перевиваемых клеток для производства антирабической вакцины: Дисс. . канд. биол. наук. М., 1997.- 117 с.

11. Вуннер В. Культивирование, очистка и титрование рабдовирусов // Вирусологические методы. -М.: «Высшая школа», 1988. С. 1.12-130.

12. Гочмурадов М.Г. Усовершенствование технологии промышленного производства инактивированной культуральной вакцины против бешенства: Автореф. дисс. . канд. наук. Владимир, 1999. - 23 с.

13. Груздев К.Н., Недосеков В.В. Бешенство животных. М.: «Аквариум ЛТД», 2001.-304 с.

14. Груздев JI.K., Дешевых А.Е., Груздев К.Н. Изучение репродукции фиксированного штамма в культурах клеток // Вопросы прикл. экологии (природопользования), охотоведения и звероводства. -Киров, 1997.-С. 285-286.

15. Гулюкин М.И., Ведерников В.А., «Ситуация уже кризисная».//Ветеринарная жизнь №12,июнь 2008г.

16. Дудников С.А. Лисицы как маркер риска при бешенстве: II Противоэпизоотические мероприятия. Труды конференции ВНИИВВиМ, г. Покров, 2003 г.

17. Иванов B.C., Кузнецов П.П., Школьников Е. Э. Состояние иперспективы борьбы с бешенством животных и человека // Вестник РАСХН. 2000. №2.

18. Исаев Ю.А. Цитирован по Скоморохову A.JT. Заразные болезни животных. Бешенство. 1956 г., с. 186

19. Книзе A.B., Бакулов И.А., Дмитренко Н.В. География эпизоотологии болезней диких млекопитающих в Российской Федерации. Материалы конференции ВНИИВВиМ, Покров, 2002 г.

20. Комитет экспертов ВОЗ по бешенству: Докл. 8-й. Женева, 1994 (СТД 824).- 118 с.

21. Кузнецов П.П., Таршис М.Г. Бешенство животных: Обзорная информ. М.: ВНИИТЭИсельхоз, 1981. - С. 4-5.

22. Кузьмин И.В., Сидоров Г.Н., Ботвинова А. Д., Рехов Е.И. Эпизоотическая ситуация и перспективы борьбы с бешенством на юге Западной Сибири в 1990-2000 гг. Ветеринарная патология, 2002 г., № 1,92 с.

23. Кутузов Н.М., Белкин Б.Л., Персова A.C. и др. Эпизоотическая ситуация и меры борьбы с бешенством животных на территории Орловской области. Труды конференции ВНИИВВиМ, г. Покров, 2003г.

24. Мавсесянц A.A. Современные проблемы бешенства. Труды Международной научно-практической конференции ВНИИВВиМ, г. Покров, 2003 г., 26 с.

25. Метлин А.Е., Рыбаков С.С., Михайлишин В.В. Оральная вакцинация диких плотоядных животных против бешенства // Ветеринария. 2009. №8.

26. Мовсесянц A.A., «Бешенство серьезная проблема наших дней».//Журнал, Эпидемиология и Вакцинопрофилактика, № 3(10), 2003г.

27. Наумкина М.А. Разработка методов молекулярной гибридизации и полимеразной цепной реакции для идентификации вируса бешенства: Автореф. дисс. канд. биол. наук. Покров., 1999'. - 27 с.

28. Непоклонов А.Е., Еременко H.A. Эпизоотическая ситуация по антропозоонозным болезням в Российской Федерации. Труды конференции ВНИИВВиМ г. Покров, 2003 г., 16 с.

29. Онищенко Г.Г. «Об усилении мероприятий по борьбе с бешенством в Российской Федерации» Постановление главного государственного врача Российской Федерации от 29 августа 2008г № 53.// Российская газета 21.11.2008г.

30. Осидзе Д.Ф., Ивановский Э.В. Ветеринарные препараты, 1981. Москва. Колос, с.61.

31. Пиле Э.Р., Воганов М.Н. Ж. Успехи современной биологии, т.92, вып. 1(4), изд. Наука, Москва, 1981.

32. Пилле Э. Р. Лиссавирусы // Вопросы вирусологии. 1996.- №1.- С. 2-6.

33. Редакционная информация, «Бешенство в разгаре».//Ветеринарная жизнь №12, Июнь 2008г.

34. Сазонкин В.Н., Семенова М.А. Анализ случаев бешенства в 2003 г. в Москве и Московской1 области. Труды конференции ВНИИВВиМ г. Покров, 2004 г.

35. Сафонов Г.А., Чевелев С.Ф., Калинина Т.А., Башмакова А.П. Результаты исследований по разработке и производственным испытаниям культуральной лиофилизированной вирусвакцины из штамма ТС-80 // Отчет о НИР. Покров, 1991. - 43 с.

36. Селимов М.А. Бешенство М.: Медицина, 1978. - 336 с.

37. Селимов М.А. Бешенство. Медиздат, 1972 г.

38. Сливко И.А. Иммунобиологические свойства вакцинных штаммов

39. ТС-80 и 71БелНИИЭВ-ВГНКИ вируса бешенства: Автореф. дисс. канд. вет. наук. Покров, 2003. - 22 с.

40. Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я., Соловьев Б.В., Фомина Н.В. Бешенство/ Вирусные болезни животных. М., 1998. - 928 с.

41. Таршис М. Г., Черкасский Б. JI. Болезни животных, опасные для человека. М.,1997.

42. Таршис М.Г., Ковалев H.A., Кузнецов П.П. Бешенство животных. -Минск: «Ураджай», 1990. 175 с.

43. Тетеричев В.И., Рубан Е.А., Белоусов В.И., Бирюков А.Г., Самойленко С.А. Эпизоотическая ситуация по бешенству в Тульской и смежных областях Российской Федерации, 2001 г.

44. Цвиль Л.А., Родина Л.А. Эпидемическая ситуация и меры профилактики бешенства в г. Москва. Труды конференции ВНИИВВиМ г. Покров, 2003 г.,115 с.

45. Черкасский Б. Л., Кноп А. Г., Ведерников В. А. и др. Эпидемиология и эпизоотология бешенства на территории бывшего СССР // Журн. микробиол. -1995.-№ 2. С. 21-26.

46. Чирков Ю.Н. Цитирован по Скоморохову А.Л. Заразные болезни животных. Бешенство. 1956 г., с. 186.

47. Шафеева P.C., Фролова A.B. Культуральная антирабическая вакцина на клетках Vero //Цитология. 1994. - Т. 36, № 6.- С. 588.

48. Шеен P.M., Шумейкина И.А. Скрытые формы экспериментального бешенства. К. Бешенство. Москва. Медиздат, 1958 г.

49. Шестопалов A. M., Аксенов В. И., Рассадкин Ю. Н., Устинова Е. Н. Обстановка по рабической инфекции в Новосибирской области // Журн. микробиол.-1999.- № 5. С. 115-116.

50. Шестопалов А. М., Рассадкин Ю. Н., Аксенов В. И., Устинова Е. Н. Бешенство в Новосибирской области // Пробл. инфекционной патологии в регионах Сибири и Дальнего Востока: Науч. конф. -Новосибирск, 1998.- С.82-83.

51. Шипилов В.И. Усовершенствование технологии изготовления антирабической вакцины // Вирусные болезни сельскохозяйственных животных: Тез. докл. Всероссийской науч.-практ. конф. Владимир, 1995.-С. 57.

52. Щербак Ю.Н., Рябошапка А.П., Шевченко JI.C. Экологические и эпидемиологические проблемы бешенства природного типа. 1978 г. Киев, с. 30.

53. Akacem О., Couillin P., Benmansour A., Coulon P., Brahimi M., Benhassine M. Production of monoclonal antibodies against a fixed strain of rabies virus // Arch. Inst Pasteur Alger. 1988. - Vol. 56. - P. 225-231.

54. Aubert M. Epidemiology and campaign against rabies in France and in Europe// Bull. Acad. Natl. Med. -1995.- V. 179, N 5.- P. 1033-1054.

55. Bahmanyar. Introduction* epidemiology and control of rabies: present day knowledge. 8-th Intern. Congress on tropical medicine and malaria. Teheran, 1968.

56. Balbo, T. and Rossi L. Fox vaccination in Italy. In Pastoret, P.P., Brochier, B., Thomas, I., and Blancou, J. (eds.). Vaccination to control rabies. Commission of the European Communities, Luxembourg. (1988) 61-69.

57. Benmansour A., Leblois H., Coulon P., Tuffereau G., Gaudin Y., Flamand A., Lafay F. Antigenecity of rabies glycoprotein // J. Virology. 1991. -Vol. 65, № 8. - P. 4198-4203.

58. Bijienga G., Joubert L. High pathogenicity for mice of a viral component of the modified-Iive ERA/BHK rabies vaccine administered by the oral route. Rabies prophylaxis in France // Bull, de I'Academie. 1974. - V. 47. - P. 423-435.

59. Bjilenga G., Hernander B.E.M. Adaptation, attenuation and plaque purification of a rabies virus isolate (V-319) from a vampire bat (Desmodus rotundus) // Cornell Vet. 1980. - № 70. - P. 290-302.

60. Black J.G. and Lawson, K.F. Further studies of sylvatic rabies in the fox (Vulpes vulpes). Vaccination by the oral route. Canadian Veterinary Journal, (1973) 14,206-211.

61. Black, J.G. and Lawson, K.F. Sylvatic rabies studies in the silver fox (Vulpes vulpes). Susceptibility and immune response. Canadian Journal of comparative Medicine, (1970) 34, 309-311.

62. Bourhy H., Kissi B. Molecular diversity of the Lyssavirus genus // Virology. 1993. - Vol. 194. - P.' 70-81.

63. Bourhy H., Kissi B., Audry L. et al. Ecology and evolution of rabies virus in Europe//J. Gen. Virol.-1999.- V. 80, N2 10.- P. 2545-2557

64. Briggs D.J., Smith J.S., Mueller F.L., Schwenke J., Davis R.D., Gordon

65. C.R., Schweitzer K., Orciari L.A., Yager P.A. & Rupprecht C.E. A comparison of two serological methods for detecting the immune response after rabies vaccination in dogs and cats being exported to rabies-free areas. Biologicals, (1998) 26, 347-355.

66. Campbell, J.B. Oral rabies immunization of wildlife and dogs: challenge to the Americas. In Rupprecht, C.E., Dietzschold, B., Koprowski, H. (eds.) Lyssaviruses. Springer-Verlag, Berlin, (1994) P. 245-266.

67. Ciuchini F. Effects of corticosteroids mediated immunosuppression on the distribution of rabies vaccine virus in red foxes orally immunized against rabies //J. Yet. Med. -1986. V. 33. - P. 628-631.

68. Cleaveland S. Epidemiology and control of rabies. The growing problem in Africa // Trans. Roy. Soc. Trop. Med. Hyg.- 1998. V. 92, N2 2.- P. 131134.

69. Cliquet F., Aubert M. & Sagne L. Development of a fluorescent antibody virus neutralisation test (FAVN test) for the quantitation of rabies-neutralising antibody. J. Immunol. Methods, (1998).212, 79-87.

70. Conzelman K., Cox J., Schneider L., Thiel H. Molekular cloning and complete nucleotide sequence of the attenuated rabies virus SAD B19 // Virology. 1990. - P. 485-499.

71. Curk A., Carpenter T.E. Efficacy of the first oral vaccination against fox rabies in Slovenia// Rev. Sci. Tech. -1994 V. 13, N3. - P. 763-775.

72. Debbie, J.G. Use of inoculated eggs as a vehicle for the oral rabiesvaccination of red foxes (Vulpes fulva). Infection and Immunity (1974) 9, 681-683.

73. Debbie, J.G., Abelseth, M.K., and Baer, G.M. The use of commercially available vaccines for the oral vaccination of foxes against rabies. American Journal of epidemiology, (1972) 96: 231-235.

74. Dietzschold B. Localization and immunological characterization of antigenic domans of the rabies virus internal N and NS proteins // Virus. Res. 1987.- №8. -P. 103-105.

75. Dietzschold В., Wang H., Rupprecht C., Celis E., Tollis M., Ertl H., Heber-Katz E., Koprowski H. Induction of protective immunity against rabies by immunization with rabies virus ribonucleoprotein // Proc. Natl. Acad. Sci. -1987.-Vol. 84.-P. 9165-9169.

76. Dietzschold В., Wunner W., Wiktor Т., Koprowski H. Characterization of an antigenic determinant of the glycoprotein that correlates with pathogenicity of rabies virus // Proc. Natl. Acad. Sci. 1983. - Vol. 80. - P. 70-74.

77. Dietzschold В., Wunner W., Wiktor Т., Koprowski H. Chemical and immunological analisis of the rabies soluble glycoprotein // Virology. -1983.-Vol. 124.-P. 330-337.

78. Flamand A., Raux H., Gaudin Y., Ruigrock R. Mechanism of rabies virus neutralization // Virology. 1993. - Vol. - P. 302-313.

79. Foster U. Safety tests of live rabies vaccines on wild rodent // J. Fortschritte Vet. rmed. -1976. - Bd. 25. - S. 257-262.

80. Fu Z. F. Rabies and rabies research: past, present and future // Vaccine.-1997.- Suppl. 15.- P.20-24.

81. Gaudin Y., Rugrock R., Tuffereau C. et al. Rabies virus glycoprotein is a trimer // Virology. 1992. - Vol. 187, № 2. - P. 627-632.

82. Häfliger, U., Bichsel, P., Wandeler, A., and Steck, F. Zur oralen Immunisierung von Füchsen gegen Tollwut: Stabilisierung und Köderapplikation des Impfvirus. Zentralblatt für. Veterinärmedizin, Reihe (1982) B 29, 604-618.

83. Kappeler, A. and Wandeler, A.T. Entwicklung von Strategien zur Feldanwendung der oralen Immunisierung von Füchsen gegen Tollwut. Schweizer Archiv für Tierheilkunde (2000) 142, 439-446.

84. Kasempimolporn S., Hemachudha T., Khawplod P., Manatsathit S. Human immune response to rabies nucleocapsid and glycoprotein antigens // Clin. Exper. Immunol.- 1991.- v.84, № 2.-p. 195-199.

85. Kawano H., Mifune K, Mannen K. et al. Protection against rabies in mice by a cytoxic T cell clone recognizing the glicoprotein of rabies virus // J. Gen. Virol. 1990. - Vol. 71. - P. 281-287.

86. Kieny, M.-P., Lathe, R., Drillien, R., Spehner, D., Skory, S., Schmitt, D., Wiktor, T.J., Koprowski, H., and Lecocq, J.P. Expression of rabies virus glycoprotein from a recombinant vaccinia virus. Nature. -1984. -V. 312. -P. 163-166

87. Kissi B., Tordo N., Borhy H. Genetis polymorphism in the rabies virus nucleoprotein gene // J. Virol. 1995. - Vol. 209, № 2. - P. 223-229.

88. Kissling, R. and Gram, G. Orale Immunisierung von Füchsen gegen Tollwut in Österreich im Zeitraum von 1986 bis 1991. Wiener Tierärztliche Monatsschrift (1992) 79, 333-344.

89. Lafay, F., Benejean, J., Tuffereau, C., Flamand A., and Coulon, P. Vaccination against rabies Construction and characterization of SAG2, a double avirulent derivate of SAD(Bern). Vaccine. -1994. -V. 12. -P. 317320.

90. Lafon M., Ideler J., Wunner W. Investigation of the antigenic structure of rabies virus glycoprotein by monoclonal antibodies // Monoclon. Antibod.: Stand. Charact. and Use. Pros. Symp. Paris, 1983. - P. 219-225.

91. Lafon M., Lafage M. Antiviral activity of monoclonal antibodies specific for the internal proteins N and NS of rabies virus// J.Gen. Virol. 1987. -Vol. 68, № 12.-P. 3113-3123.

92. Lafon M., Wiktor T. Antigenic sites on the ERA rabies virus nucleoprotein and non-structural protein. // J. Gen. Virol. 1985. - Vol. 66, № 10. - P. 2125-2133.

93. Lawson K. F. Safety and immunogenicity of ERA strain of rabies virus propagated in a BHK-21 cell line // Canad. J. Vet. Res. -1989. V. 53.

94. Leblois, H., Tuffereau, C., Blancou, J., Artois, M., Aubert, A., and Flamand A. Oral immunization of foxes with avirulent rabies virus mutants. Veterinary Microbiology. -1990. -V. 23. -P. 259-266.

95. Lodmell D., Smith J., Esposito J., Ewalt L. Crossprotection of mice against a global spectrum of rabies virus variants// J. Virol. — 1995. Vol. 69, № 8. -P. 256-261.

96. Mannen K., Niramatsu K., Mifune K., Sakamoto S. Conserved nucleotide seguence of rabies virus cDNA encoding the nucleoprotein // Virus Gen. -1991.-Vol. 5.-P. 69-73.

97. Manz, D. Markiemngsversuche an Füchsen im Revier als Vorbereitung für eine mögliche spätere perorale Vakzination gegen Tollwut. Fortschritte der Veterinärmedizin (1976) 25, 263-269.

98. Martinezarends A. Superantigen properties of the rabies virus nucleocapsid // INTERCIECIA. 1997. - Vol. 22, Iss 2. - P. 68-72.

99. Miller J. International Congress of infection and parasitic disease. 6-th. Warszawa, 1974. VI.

100. Perrin P., Lafon M., Versmisse P. & Sureau P. Application d'une méthodeimmunoenzymatique au titrage des anticorps antirabiques neutralisants en cultures cellulaires. J. Biol. Stand., (1985). 13, 35-42.

101. Rosatte R.C., Lawson K.F., Maclnnes C.D. Development of baits to deliver oral rabies vaccine to raccoons in Ontario // J. Wildl. Dis. -1998. V. 34, N 3.-P. 647-652 .

102. Rupprecht CE, Blass L, Smith K, et al. Human infection due to a recombinant vaccinia-rabies glycoprotein virus. // N Engl J Med 2001;345:582 -6.

103. Sagara J., Kawai A. Identification of heat shock protein in the rabies virion.// Virol. 1992. - Vol. 190, №2. - P. 845-848.

104. Scheider L.G., Shoop U. Pathogenesis of rabies and rabies line viruses. Ann. Just. Pasteur, 1972.

105. Schneider L.G., Cox J. H. Bat lyssavirus in Europe // Curr. Top. Microbiol. Immunol. -1994. V. 187, N2 2. - P. 207-218.

106. Schneider, L.G., Cox, J.H., Müller, W.W., and Hohnsbeen, K.P. Current oral rabies vaccination in Europe: an interim balance. Review of Infectious Diseases (1988) 10, S654-S659.

107. Serokova D. Zyu wet. 1975. VI 1.

108. Smith J. S., Orciari L, Yager P. A. Molecular epidemiology of rabies in United States // Semin. Virol. -1995. V. 6, Ns 4. - P. 387-400.

109. Smith J.S., Yager P.A. & Baer G.C. (1973). A rapid reproducible test fordetermining rabies neutralizing antibody. Bull. WHO, 48, 535-541.

110. Steck F., Wandeler A., Capt P., Schneider L. Oral immunization of foxes against rabies // Zbl. Vet. Med. -1982.- Bd. 29. S. 372-396

111. Steck, F., Wandeler, A., Bichsei, P. Capt, S., and Schneider, L. Oral immunisation of foxes against rabies. Zentralblatt fur Veterinärmedizin, Reihe (1982) B 29, 372-396.

112. Svrcek S., Durove A., Ondrejka R. et al. Immunogenic and antigenic activity of an experemental oral vaccine prepared from the strain Vnukovo-32/107// Vet Med.- 1995 V. 40, N3. - P. 87-96.

113. T. Mueller, L. Geue, J. Klemt, T. Selnorst, J. Frost, C. Bunzenthal, K. Zimmmer, E. Vanek. VACCINE-ASSOCIATED RABIES in Germany and Austria. The 16 international conference on RABIES in the AMERICAS. Canada, 2005.p 44.

114. Tollis M., Dietzschold B., Viola C., Koprowski H. Immunization of monkeys of with rabies ribonucleoprotein (RNP) confers protective immunity against rabies // Vaccine. 1991. - Vol. 9. - P. 134-136.

115. Tordo N. Characteristics and molecular biology of the rabies virus // Laboratory techniques in rabies 4-th ed. Geneva, 1996. - P. 28-45.

116. Tordo N., Poch O. Structure of rabies virus // Campbell J., Charlton K. eds Rabies. Boston, Kluwer Academic Publishers. - 1988. - P. 25-45.

117. Virus Taxonomy: Sixth Report of the International committee on Taxonomy of Viruses. 1995. - 458 p.

118. Vos, A., Neubert, A., Aylan, O., Schuster, P., Pommerening, E., Müller, T., and Chivatsi, D.C. An update on safety studies of SAD B19 rabies virus vaccine in target and non-target species. Epidemiology and Infection. -1999. -V. 123.-P. 165-175.

119. Wandeler A. I. Oral immunization of wildlife // The natural history of rabies. 2nd ed. - Boca Baton - CRC Press, 1991. - P. 485-503.

120. Wandeler A. Oral immunization against rabies: afterthoughts and foresight. Schweizer Archiv für Tierheilkunde. -2000. V. 142. -P. 455-462.

121. Wandeler, A., Pfotenhauer, P., and Stocker, C. Ueber die Verwendung von Ködern zu biologischen Untersuchungen an Füchsen. Revue Suisse de Zoologie (1975) 82, 335-348.

122. Wandeler, A.I., Bauder, W., Prochaska, S., and Steck, F. Small mammal studies in a SAD baiting area. Comparative Immunology, Microbiology and infectious Diseases (1982) 5, 173-176.

123. Wandeler, A.I., Capt, S., Kappeler, A., and Hauser R. Oral immunization of wildlife against rabies: concept and first, field experiments. Review of Infectious Diseases 10: (1988) S649-S653.

124. Westerling, B. A Field trial on oral immunization of raccoon dogs and foxes against rabies in Finland 1988-1989. Rabies bulletin Europe (1989) 13(2) 942.

125. WHO. Expert Committee on Rabies. Geneva, Monograph series № 23.

126. WHO. Rabies Bulletin Europe information surveillance research. 2001, 3/200, V24, № 3.

127. Wiktor T. et al. Antigenic properties of rabies virus components // J. Immunol. 1973. - № 4. - P. 243-251.

128. Wiktor T., Flamand A., Koprowski H. Use of monoclonal in diagnosis of rabies virus infection and differentiation of rabies and rabies-related viruses // J. Virol. Meth. 1980. - № 1. - P. 33-46.

129. Wiktor T.J., Koprowcki H, Rorkel B. Localized rabies infection in mice. Proc. soc. exp. biol. 1972. V140 № 3.

130. Wiktor T., Koprowski H. Use of Hybridoma monoclonal antibodies, in the detection of antigenis differences between rabies and rabies-related virus proteins // J. gen. Virol. 1980. - Vol. 48. - P. 97-104.

131. Wilhelm, U. and Schneider L.G. Oral immunization of foxes against rabies practical experiences of a field trial in the Federal Republic of Germany. Bulletin of the World Health Organization (1990) 68, 87-92.

132. Winkler W.G., Shaddok J. H., Williams L W. Oral rabies vaccine:evaluation of its infectivity in three species of rodents // Amer. J. Epidemiol. -1976. V. 104. - P. 294-298.

133. Winkler, W.G. A review of the development of the oral vaccination technique for immunizing wildlife against rabies. In Bogel, K., Meslin, F.X., and Kaplan, M. (eds.). Wildlife rabies control. Wells Medical, Royal Tunbridge Wells. 1992. - P. 82-96.

134. Winkler, W.G. and Baer G.M. Rabies immunization of red foxes (Vulpes fulva) with vaccine in sausage baits. American Journal of Epidemiology (1976) 103,408-415.

135. Winkler, W.G., McLean, R G., and Cowart, J.C. Vaccination of foxes against rabies using ingested baits. Journal of Wildlife Disease (1975) 11, 382-388.

136. World Health Organisation Laboratory Techniques in Rabies, Fourth Edition, Meslin F.-X., Kaplan M.M. & Koprowski H., eds. WHO, Geneva, Switzerland. (1996).

137. Wunner W. Structure of rabies viruses // World's debt to Pasteur. 1985. -P. 171-186.