Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Эпизоотологический мониторинг и контроль эффективности вакцинопрофилактики бешенства диких животных в Калининградской области

ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Эпизоотологический мониторинг и контроль эффективности вакцинопрофилактики бешенства диких животных в Калининградской области"

На правах рукописи

/Г /

ЖЯфШ!

ПЕТРОВА ТАТЬЯНА ПЕТРОВНА

ЭПИЗООТОЛОГИЧЕСКИЙ МОНИТОРИНГ И КОНТРОЛЬ ЭФФЕКТИВНОСТИ ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКИ БЕШЕНСТВА ДИКИХ ЖИВОТНЫХ В КАЛИНИНГРАДСКОЙ ОБЛАСТИ

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

13 КАР 2014

005545813

Казань-2014

005545813

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» (ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ») г. Казань

Научный руководитель: Хисматуллина Наиля Анваровна —

доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты: Алимов Азат Миргасимович - доктор

ветеринарных наук, профессор, заведующий кафедрой биологической и неорганической химии ФГБОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины» им. Н.Э. Баумана

Каримов Мидхать Минвалеевич - кандидат биологических наук, главный врач филиала ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Высокогорском районе Республики Татарстан» Ведущая организация: ГНУ Всероссийский научно-исследовательский

институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко (ГНУ ВИЭВ Россельхозакадемии)

Защита состоится « 01» СшЬЫД 2014 года в _часов на заседании

диссертационного совета Д-220.012.01 при ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» (420075, г. Казань, Научный городок - 2, ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ»).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (г. Казань). Текст объявления о защите размещен на официальном сайте ВАК РФ www.vak.ed.gov.ru; полный текст диссертации, автореферата и отзыв научного руководителя - на официальном сайте ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» www.vnivi.ru.

Автореферат разослан <4£» фе8|)0иа 2014 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, ,

кандидат ветеринарных Степанов Владимир Иванович

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Бешенство занимает исключительно важное место в инфекционной патологии, поскольку болезнь поражает большое количество видов домашних и диких животных, представляя смертельную опасность для человека. Эпизоотологическая, эпидемиологическая и социальная опасность данной болезни привлекает внимание как медицинских, так и ветеринарных специалистов во всем мире [2,4, 8].

Оральная вакцинация является эффективным методом борьбы с природным бешенством, отвечающим интересам охраны природы и обеспечивающая устойчивость животных к заражению [10, 14].

В последние годы в Европейских странах показана значимость оральной иммунизации диких животных в борьбе с этой болезнью, которая позволила ликвидировать бешенство среди животных [5, 17].

Однако эти мероприятия, проводимые в России на протяжении многих лет, не привели к ожидаемому результату из-за отсутствия должной организации, неполной вакцинации поголовья и недостаточного финансирования мероприятий [9].

Вместе с тем, по мнению некоторых ученых [1,2,3,15], аттенуированные вакцинные штаммы вируса бешенства РБ-71 (РВ-97), ERA, SAD В 19, SAD Bern, используемые для изготовления оральных вакцин, могут привести к поствакцинальному бешенству животных и циркулировать в природе.

В связи с этим, актуальной остается проблема контроля эффективности вакцинопрофилактики бешенства в дикой фауне.

В тоже время, по данным ряда авторов [7, 13], научно обоснованные противоэпизоотические мероприятия должны основываться на изучении особенностей краевой эпизоотологии этого зооноза с учетом климатогеографических, экологических факторов и биологических свойств возбудителя бешенства, циркулирующего в регионе.

В этом отношении интерес представляет Калининградская область, расположенная в Центральной Европе, входящая в состав Северо-Западного Федерального округа Российской Федерации, где начиная с 2007 г. по настоящее время проводится планомерная оральная вакцинация диких плотоядных животных.

Степень разработанности проблемы. По итогам международного семинара-совещания ветеринарных служб 39 стран СНГ и Европы, состоявшегося 03 сентября 2003 года по согласованию с Минсельхозом России, Калининградская область была включена в долгосрочную Международную Программу по искоренению бешенства животных. В рамках данной Программы

Служба ветеринарии и государственная ветеринарная инспекция области совместно с Федеральным центром охраны здоровья животных (ФГБУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир) разработала региональную Программу по оральной вакцинации диких плотоядных животных против бешенства в Калининградской области на 2007-2015 годы. В ходе реализации Программы, начиная с осени 2007 года, в регионе проводится оральная вакцинация диких плотоядных животных. Контроль эффективности вакцинопрофилактики на данной территории до 2010 года проводился ФГБУ «ВНИИЗЖ», начиная с 2010 г. по настоящее время-ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ». В доступной литературе имеются единичные данные о заболеваемости бешенством животных по Калининградской области за 1993-2000 гг. [11], однако сведений по комплексному изучению ситуации по заболеваемости бешенством в Калининградской области и биологических свойств эпизоотических изолятов вируса бешенства, циркулирующих на территории данного региона, мы не нашли.

Цель и задачи. Цель исследований - провести анализ эпизоотической ситуации и изучить эффективность вакцинопрофилактики бешенства диких плотоядных животных на территории Калининградской области.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Изучить эпизоотолого-эпидемиологическую ситуацию по заболеваемости бешенством в Калининградской области за 2002-2013 гг.

2. Провести анализ эффективности оральной вакцинации диких плотоядных животных по эпизоотологическим показателям.

3. Провести исследования костной ткани на обнаружение тетрациклина и сывороток крови на выявление вируснейтрализующих антирабических антител целевых животных, отстрелянных в зонах применения оральной вакцины.

4. Провести анализ биологических свойств изолятов вируса бешенства, выделенных в эпизоотических очагах и в зонах проведения оральной вакцинации Калининградской области.

Научная новизна. Впервые проведен ветеринарно-географический анализ распространения бешенства на территории Калининградской области за 2002-2013 гг., разработана карта эпизоотологического районирования территории области.

Изучены биологические свойства изолятов вируса бешенства, выделенные на территории Калининградской области и установлено их антигенное соответствие вакцинным штаммам.

Проведен контроль эффективности вакцинопрофилактики бешенства среди диких плотоядных животных на территории Калининградской области за 2011-2013 гг. и даны соответствующие рекомендации.

Теоретическая и практическая значимость. Установленное антигенное соответствие эпизоотических изолятов вируса бешенства, выделенных на территории Калининградской области, вакцинным штаммам рабического вируса имеет важное значение для диагностики и профилактики бешенства в данном регионе.

В результате проведенных исследований разработаны: «Рекомендации по купированию первичных очагов бешенства», «Методические указания по индикации возбудителя бешенства методом ОТ-ПЦР», «Информационное научно-популярное издание «Защити себя от бешенства», утв. директором ФГБУ «ФЦРТБ-ВНИВИ» чл.-корр. РАСХН, профессором А.В. Ивановым 09.06.2011 г., 14.11.2013 г. и 08.07.2013 г., соответственно. Издана Памятка по профилактике бешенства для населения (500 экз.), одобренная ученым советом ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», протокол №1 от 15.01.2013 г.

Представлены результаты эпизоотологического мониторинга распространения бешенства на территории Калининградской области за 2002-2012 гг., разработана электронная эпизоотическая карта области по заболеванию бешенством животных с использованием компьютерной программы Microsoft Excel. Знания зон повышенного риска распространения болезни позволяют уточнять оптимальные масштабы и сроки профилактической вакцинации животных, своевременно регулировать численность диких животных и вести борьбу с бродячими собаками.

Показана прямая корреляционная связь заболеваемости бешенством животных с плотностью популяции лисиц с коэффициентом корреляции (г) равным 0,36. Рекомендовано снижение плотности популяции лисиц до 0,1-0,2 гол./км2 в районах, где этот показатель выше.

Установлено, что способ раскладки вакцины с применением малой авиации является более эффективным по сравнению с раскладкой вручную, которое находит отражение на поедаемости вакцины и уровне заболеваемости бешенством среди диких животных.

Показано, что заболеваемость бешенством животных в целом в Калининградской области имеет обратную зависимость от объема вакцинации и кратности применения антирабической вакцины с г = - 0,66.

Установлена эффективность оральной вакцинации диких плотоядных животных на территории Калининградской области, которая обеспечила благополучие области по данной инфекции. При этом активность вируснейтрализующих антител в сыворотке крови целевых животных

составила 0,5 МЕ/мл и более, свидетельствующая о достаточном уровне протективного иммунитета. Для создания популяционного иммунитета среди дикой фауны на территории Калининградской области, рекомендуем продолжать кампанию оральной вакцинации и контроль эффективности ее проведения.

Методология и методы исследования.

В работе применяли культуральные, вирусологические, серологические методы исследования, иммуноферментный и иммунофлуоресцентный анализы, реакцию нейтрализации в культуре клеток ВНК-21 С13, биопробу на белых мышах и в культуре клеток НГУК-1.

Работа выполнена в 2010-2013 гг. в лаборатории иммунологии и биохимии ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» МСХ РФ, а также в неблагополучных очагах по заболеваемости бешенством Калининградской области согласно тематическим планам НИР (№ госрегистрации 01200202604). Отдельные фрагменты работы выполнены с участием к.б.н. Сабировой В.В., к.в.н. Усольцева К.В. и зав. отделом организации и мониторинга противоэпизооти-ческих и лечебно-профилактических мероприятий ГБУВ Калининградской области «Областная СББЖ» Дреерис А.Ф.

Методы исследований

Метод флуоресцирующих антител (МФА) проводили в прямом варианте по ГОСТу 26075-84 с использованием «Флуоресцирующего антирабического глобулина», разработанного ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», согласно инструкции по его применению, утв. Россельхознадзором 03.03.2008 г.

Прямой сэндвич - вариант ИФА проводили с использованием «Набора препаратов для лабораторной диагностики бешенства животных методом иммуноферментного анализа (ИФА)», разработанного ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», согласно инструкции по его применению, утв. Россельхознадзором 03.03.2008 г. [12].

Непрямой вариант ИФА для определения антител проводили согласно Методическим рекомендациям по лабораторной диагностике бешенства, утвержденным ДВ МСХиП РФ 14.05.97 г. [6]. В качестве антигена для непрямого варианта ИФА использовали гликопротеин вируса бешенства, который выделяли из культуральной суспензии вируса, штамм «Овечий» ГНКИ, по методу В. Dietzschold et al. (1996).

Реакцию нейтрализации (РН) проводили в культуре клеток ВНК-21 С 13 с использованием стандартного вируса бешенства CVS, адаптированного к культуре клеток ВНК-21 С 13 по методике, рекомендованной МЭБ [16]. В качестве контрольной положительной сыворотки использовали отраслевой

стандартный образец антирабической сыворотки (референс-сыворотка), сер. ЫСА-ОЗ с активностью 20 МЕ/мл.

Выделение возбудителя бешенства проводили биопробой на белых мышах согласно ГОСТу 26075-84 и в культуре клеток невриномы Гассерова узла крысы (НГУК-1) - согласно Методическим рекомендациям по лабораторной диагностике бешенства, утвержденным ДВ МСХиП РФ 14.05.97 г. [6].

Выделение вирусной РНК из проб патологического материала осуществляли согласно инструкции по применению для выделения РНК/ДНК «Рибо-сорб» производства (ФГУН «ЦНИИЭ» Роспотребнадзора, г. Москва), постановку обратной транскрипции - согласно инструкции по применению комплекта реагентов для получения кДНК на матрице «РЕВЕРТА-Ь» производства (ФГУН «ЦНИИЭ» Роспотребнадзора, г. Москва).

Контроль эффективности вакцинопрофилактики бешенства проводили по эпизоотологическим показателям, а также оценке поедаемости антирабической вакцины согласно «Методическим указаниям по обнаружению флуоресцентным методом антибиотиков тетрациклинового ряда в ткани зубов и костей животных для контроля поедаемости оральных антирабических вакцин», разработанным ВНИИЗЖ (2010), уровню сероконверсии у целевых животных в непрямом ИФА согласно Методическим рекомендациям по лабораторной диагностике бешенства, утвержденным ДВ МСХиП РФ 14.05.97 г. [6] и в реакции нейтрализации в культуре клеток ВНК-21 С 13 по методике,

рекомендованной МЭБ [16].

Эпизоотологические исследования. Для решения отдельных вопросов эпизоотологии бешенства (распространения, эпизоотичность, сезонность, источник и факторы передачи возбудителя инфекции) применяли различные приемы и способы, описанные в «Рекомендациях по методике эпизоотического исследования» под редакцией И.А. Бакулова (1975). Эпизоотологическое районирование территории Калининградской области, а также количественную оценку напряженности эпизоотической ситуации проводили по методике, описанной М.Г. Таршисом и В.М. Константиновым (1975). При анализе эпизоотолого-эпидемиологической ситуации по заболеваемости бешенством в Калининградской области использовали статистические данные Госветслужбы и ТУ Роспотребнадзора по Калининградской области.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

- характеристика эпизоотической ситуации по заболеваемости бешенством в Калининградской области за 2002-2013 гг. Районирование территории области по степени распространения заболевания;

- биологическая характеристика изолятов вируса бешенства, выделенных в эпизоотических очагах Калининградской области;

- поедаемость антирабической вакцины и уровень сероконверсии у целевых животных.

Степень достоверности и апробация результатов. Экспериментально полученный цифровой материал обрабатывали методом вариационной статистики с применением пакета прикладных программ Microsoft Excel. Для получения достоверных результатов все опыты проводили повторно не менее трех раз.

Основные результаты диссертации представлены и доложены на ежегодных отчетных научных сессиях ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» по итогам НИР за 2010-2013 гг.; Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы научного и кадрового обеспечения инновационного развития АПК» (Казань, 2012); Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы болезней, общих для человека и животных» (Ставрополь, 2012); III Международной научно-практической конференции «Достижения молодых ученых в ветеринарную практику» (Владимир, 2012); Международной научно-практической конференции «Биотехнологии в решении экологических проблем природы, общества и человека в Евразии: взгляд молодых ученых и специалистов» (Казань, 2013).

2 ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

2.1 Природно-географическая характеристика Калининградской области. Калининградская область - самая западная и маленькая по площади область Российской Федерации, входит в состав Северо-Западного федерального округа, административный центр - Калининград, отделена от остальной России территорией других государств, но соединена морем и является, таким образом, полуэксклавом, граничит с Европейским союзом - с Польшей на юге, с Литвой на севере и востоке. На западе Калининградская область омывается водами Балтийского моря. Через территорию области проходят водные, автомобильные и железнодорожные пути. Широко распространены хвойные и широколиственные леса. Для области характерны дерново-подзолистые, суглинистые и песчаные почвы.

Животный мир области разнообразен. Имеются животные отрядов копытных, хищников, грызунов, насекомоядных и рукокрылых. Доля заповедников и национальных парков в общей площади области составляет 0,52%.

2.2 Анализ эпизоотолого-эпидемиологической ситуации и мер борьбы с бешенством в Калининградской области. Анализ эпизоотической ситуации по заболеваемости бешенством животных за период 2002-2013 гг. в Калининградской области показал, что заболевание за 2002-2012 гг.,

регистрируется ежегодно, в 2013 г. бешенство не регистрировалось. За 2002-2012 гг. заболевание в области зарегистрировано в 15 муниципальных районах и 14 городах у 378 животных различных видов. Так, бешенство установлено у сельскохозяйственных (с.-х.) животных в 55 случаях (14,6%), в том числе 50 - у крупного рогатого скота, что составило 13,2% от всех заболевших животных, 4 - у мелкого рогатого скота - 1,1% и 1 - у лошади (0,3%). В указанный период болезнь зарегистрирована также у 129 домашних животных (34,1%), в том числе у 86 собак (22,7%) и 43 кошек (11,4%).

Бешенством болело также 194 диких животных (51,3%), в том числе 175 лисиц (46,3%) и 9 енотовидных собак (2,4%). Кроме того, заболевание бешенством регистрировалось среди других диких животных: 3 случая у хоря и по одному случаю в различные годы у волка, куницы, выдры, ежа, хомяка,

зайца и белки (2,6%).

При этом основным источником и распространителем бешенства в Калининградской области являются лисицы, на долю которых среди заболевших диких животных приходится 90,2%. Другие дикие животные, такие как волки, енотовидные собаки, куницы, вовлеченные в эпизоотический процесс, ввиду своей малочисленности не играют в нем существенной роли. Вместе с тем, они представляют потенциальную угрозу для человека и животных в качестве источника бешенства. Необходимо отметить также, что собаки и кошки, составляющие соответственно 22,7 и 11,4% от всех заболевших бешенством животных, также представляют угрозу заболеваемости

животных и людей.

Таким образом, несмотря на широкий круг животных, участвующих в эпизоотическом процессе рабической инфекции в Калининградской области, лисица играет главную роль в резервации и распространении инфекции (46,3%). При этом с.-х. животные, составляющие 14,6% от общего количества заболевших животных, являются биологическим тупиком для данной инфекции.

Характеристика территориальной приуроченности вспышек бешенства, картографирование неблагополучных районов и городских округов. За период 2007-2012 гг. в Калининградской области бешенство встречалось во всех в 15 районах области, а также в 4 городских округах из 7. Проведено разделение районов области по степени напряженности на 3 условные группы. Ранжирование территории области проводили по количеству случаев бешенства на 1000 км2. Первая группа - наиболее опасная зона, где за период 2007-2012 гг. регистрировалось от 13 до 28 случаев бешенства в пяти районах области: Гвардейском, Неманском, Полесском, Нестеровском и Черняховском. Вторая группа - средняя зона, где за указанный период регистрировалось от 8

до 12 случаев бешенства в пяти районах: Гусевском, Багратионовском, Правдинском, Славском, Озерском. Третья группа - слабая зона, где за указанный период регистрировалось от 1 до 7 случаев заболевания в пяти районах области: 'Балтийском, 'Светлогорском, Гурьевском, Зеленоградском и Краснознаменском.

Выделенные эпизоотические районы первой, второй и третьей группы характеризуются соответствующим риском заражения человека и животных. Выяснение зон повышенного риска распространения болезни позволяют уточнять оптимальные масштабы и сроки профилактической вакцинации животных, своевременно регулировать численность диких животных и вести борьбу с бродячими собаками.

Анализ заболеваемости бешенством по городским округам показал, что заболевание регистрировалось в 4 городских округах из 7 имеющихся: Светловском, Советском, Янтарном и г. Калининград. Благополучными по данному заболеванию городскими округами были: Ладушкинский, Мамоновский и Пионерский где за 2007-2012 гг. бешенство не отмечено.

В то же время нельзя не учитывать факт опасности заноса инфекции из сопредельных государств - Польши, Литвы, Латвии, Белоруссии и других.

Характеристика эпизоотической ситуации по заболеваемости бешенством в Калининградской области по годам и сезонам года. Анализ статистических данных по заболеваемости животных бешенством в Калининградской области (с 1994 по 2012 гг.) показал, что проявления эпизоотии характеризуются подъемами и спадами в отдельные годы. Первый подъем заболеваемости был зарегистрирован в 2000 г., когда заболело 53 животных, с последующим снижением в 2002 г. - до 15 случаев. Второй подъем заболеваемости бешенством был отмечен в 2003 г. - 63 случая и снижение заболеваемости в 2004 г. - до 28 случаев, с последующим подъемом в 2005 г. - до 47 случаев.

Тем не менее, строгой периодичности в проявлении бешенства не отмечено. Так, за 1995-1998 гг. наблюдался 3-х летний цикл, 1998-2002 гг. - 4-х летний, 2002-2004 гг. - 2-х летний, 2004-2007 гг. - 3-х летний, 2007-2012 гг. -5-ти летний цикл.

При анализе периодичности эпизоотии бешенства в Калининградской области за последние 10 лет, обращает на себя внимание снижение амплитуды кривой заболеваемости бешенством. Пики заболеваемости в 2003, 2005, 2009 и 2010 гг. идут по убывающей - 63,47 и 43 случая соответственно.

За исследуемый период максимальное проявление бешенства отмечено в осенний период года, составляющее 35,1%, в весенний период заболеваемость

' - для указанных районов случаи бешенства определяли из расчета на 100 км".

составила 31,1%, минимальная заболеваемость регистрировалась в летний период года - 12,2%. Сезонность, как и периодичность бешенства, связана с биологией лисиц. Периодичность и сезонность бешенства в Калининградской области необходимо учитывать при проведении противоэпизоотических мероприятий в очагах бешенства.

Изучение связи заболеваемости бешенством животных и плотностью. популяции лисиц. По данным официальной статистики, численность лисиц -главного источника и распространителя бешенства в Калининградской области, за период 2006-2010 гг. варьировала от 2352 до 2650 особей, то есть плотность популяции лисиц составляла от 0,7 до 0,8 гол./км2, то есть выше пороговой плотности, упомянутой в литературе (от 0,6 до 1 гол./км2- по М. Stubbe, 1981 и 0,2 гол./км2 - по В. Torna, 1977). Анализ корреляционной зависимости заболеваемости бешенством животных в Калининградской области от плотности популяции лисиц, показал, что эти показатели имеют прямую положительную связь с коэффициентом корреляции (г) равным 0,36. В связи с этим, считаем целесообразным снижение популяции лисиц до 0,1-0,2 гол./км в районах, где этот показатель выше.

Некоторые показатели антирабической деятельности Роспотребнадзора Калининградской области за 2008-2012 гг. На фоне подъема заболеваемости бешенством животных, резко увеличивается число случаев нападения этих животных на людей. Нередки факты нарушения владельцами правил содержания домашних животных и безответственности за их поведение. Максимальный курс антирабических прививок был оказан в 2009 г. и 2011 г., за указанные годы госпитализировано 525 человек. В 2012 г. оказана медицинская помощь 1785 пострадавшим, в том числе в условиях стационара - 207. Обращаемость населения к 2012 г. снизилась по сравнению с 2008 г. на 511 чел. и на 107 - госпитализированных пострадавших. Случаев заболеваний гидрофобией, благодаря своевременно проведенным лечебно-профилактическим прививкам покусанных, не отмечено. В тоже время отмечались случаи самовольного отказа пострадавших после контакта с животными от лечебно-профилактических прививок. В этой связи необходимо проводить разъяснительную работу среди населения, а также охотников, лесников, егерей и людей других профессий, которые находятся в группе риска, об опасности бешенства и мерах его профилактики. В этом отношении нами издана Памятка для населения по профилактике бешенства.

Меры борьбы с бешенством в Калининградской области. В связи с неблагополучной эпизоотической обстановкой по бешенству в Калининградской области и в целом в Российской Федерации, на территории области принято к исполнению Постановление Главного государственного санитарного

врача Российской Федерации № 13 от 01.02.2012 г. «Об усилении мероприятий, направленных на профилактику бешенства в Российской Федерации».

В целях недопущения ухудшения обстановки по бешенству органами ветеринарного и государственного санитарно-эпидемиологического надзора Калининградской области проводится совместная организационная работа.

Принято Постановление Главы администрации (губернатора) Калининградской области от 10 мая 2000 года №181 «О мерах по предупреждению заболеваемости людей и животных бешенством». В соответствии с этим Постановлением принято Постановление администрации Калининградской области от 29 сентября 2000 г. № 460 «Об утверждении Временных правил содержания собак и кошек в городах и других населенных пунктах области».

Издан совместный Межведомственный план мероприятий по профилактике бешенства людей и животных в Калининградской области на 2006-2010 гг., предусматривающий проведение в полном объеме специфических мер профилактики районными и городскими службами, включающие противоэпидемические, противоэпизоотические мероприятия в период эпиднеблагополучия и мероприятия по ликвидации очагов бешенства.

В соответствии с этим планом Территориальные управления Роспотреб-надзора и Россельхознадзора по Калининградской области, а также Госвет-служба области проводят ежегодные совещания заинтересованных служб для решения вопросов профилактики бешенства среди животных и предупреждения заболевания у людей, проводят эпидемиологическое расследование в очагах бешенства по каждому случаю укусов людей животными.

Кроме того, ветспециалисты областной и районых СББЖ обеспечивают своевременную диагностику бешенства животных, ликвидацию очагов болезни и в случае подтверждения бешенства разрабатывают оперативные планы по оздоровлению очагов заболевания.

Для купирования первичных очагов и профилактике бешенства нами разработаны рекомендации, утвержденные директором ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» от 09.06.2011 г.

Госветслужба области и приграничных городов осуществляет взаимодействие с приграничными государствами (Польша и Литва) по вопросам профилактики бешенства у животных.

Кроме того, согласно этому Плану в районах и хозяйствах области, неблагополучных по бешенству, ветеринарной службой организована профилактическая вакцинация с.-х. животных, охотничьих, служебных и хозяйственных собак.

За период 2008-2012 гг. в Калининградской области иммунизировано 108580 гол. животных, в том числе с.-х. - 17933, собак-75456, кошек - 15191. Ежегодно проводится десятидневное наблюдение за животными, покусавшими людей. В 2003 году, когда заболеваемость бешенством достигла максимальных показателей, ветеринарной службой были организованы подворные обходы, при которых проводилась иммунизация против бешенства домашних животных на местах.

Анализ противоэпизоотических мероприятий, проведенных в неблагополучных районах 1-ой, 2-ой и 3-ей групп опасности за 2010-2012 гг., показал что, в эпизоотических очагах осуществляется вынужденная антирабическая вакцинации диких, с.-х. и домашних животных.

В городах и других населенных пунктах области специализированными бригадами проводится отлов бродячих собак и кошек и их отстрел - на территориях охотничьих угодий.

Кроме того, ТУ Россельхознадзора по Калининградской области и охотопользователи регулируют численность плотоядных животных на территории области независимо от сезона и хозяйственной принадлежности территории. Так, за период с 2008 по 2010 гг. в лесных угодьях Калининградской области отстреляно 3685 лисиц, 630 енотовидных собак, 1540 куниц и 283 барсука.

По данным ветслужбы Калининградской области, в 2006 г. разработана Программа по ликвидации бешенства на территории Калининградской области, в соответствии с которой оральная вакцинация диких плотоядных животных проводится ежегодно, начиная с 2007 г. по настоящее время.

На следующем этапе исследований изучали биологические свойства изолятов вируса бешенства, циркулирующих в эпизоотических очагах Калининградской области.

2.3 Идентификация и изучение биологических свойств эпизоотических изолятов вируса бешенства, циркулирующих на территории Калининградской области. Идентификацию и обнаружение антигена рабического вируса проводили по МФА, методом ИФА и в реакции нейтрализации с применением диагностических препаратов, разработанных в ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ». Выделение возбудителя бешенства проводили на белых мышах или в культуре клеток НГУК-1.

В качестве специфических антител использовали антирабический иммуноглобулин, полученный из сыворотки крови овец, иммунизированных вакцинным штаммом «Овечий» ГНКИ вируса бешенства с индексом нейтрализации равным 2 и более. Исследовали 67 проб патологического материала от различных видов животных, поступивших с подозрением на

бешенство из неблагополучных районов Калининградской области, а также 800 проб от лисиц и енотовидных собак, полученных в период отстрела на территории проведения вакцинации. Из 67 проб патматериала положительный диагноз поставлен в 11 случаях.

Титры специфического антигена уличного вируса бешенства в ИФА в зависимости от содержания его в патматериале варьировали в пределах от 1:20 до 1:160 при Ken = 2,1 и более. Изучаемые изоляты вируса бешенства выделялись в культуре клеток НГУК-1 с последующим обнаружением рабического антигена по МФА и ИФА через 72-96 ч после заражения без проявления цитопатического действия. Антиген вируса бешенства выявлялся в цитоплазме клеток НГУК-1 в виде ярких гранул различной формы и величины. В контрольных препаратах, где клетки НГУК-1 инкубировали с мозговой взвесью от интактных животных при окрашивании их флуоресцирующим антирабическим глобулином, специфических гранул не обнаруживали. На следующем этапе экспериментов была установлена патогенность изучаемых изолятов для лабораторных животных — белых мышей и кроликов. Специфичность клинических проявлений бешенства подтверждена по МФА и ИФА. Исследуемые изоляты вируса бешенства вызывали заболевания белых мышей с летальным исходом как при интрацеребральном, так и при подкожном способах заражения. Продолжительность видимых проявлений болезни обычно составляла менее суток и в редких случаях — 2-3 суток. Инфекционная активность эпизоотических изолятов на белых мышах при интрацеребральном заражении составила 4,0 lg LDVcm3 и более.

Изучение степени патогенности проведено с тремя изолятами вируса бешенства (№№15988,13991 и 21486), выделенными из мозга лисиц.

Для характеристики вирулентности изолята вируса бешенства использовали индекс инвазивности, который определяли как разницу титров в пересчете на 1 мл суспензии при интрацеребральном и подкожном заражениях.

Индекс инвазивности эпизоотических изолятов вируса бешенства на уровне 2-го пассажа был в пределах от 1,3 до 1,9, инкубационный период -варьировал от 10 до 23 суток. В последующих экспериментах было установлено, что изоляты вируса бешенства, имеют выраженные преципитирующие и комплементфиксирующие свойства с активностью в реакции диффузионной преципитации и длительного связывания комплемента 1:4-1:16.

Изучаемые изоляты вируса бешенства нейтрализовались сыворотками, полученными на вакцинный штамм «Щелково-51» и производственный -«Овечий» ГНКИ вируса бешенства, что свидетельствует об антигеном соответствии эпизоотических изолятов вируса бешенства, циркулирующих на

территории Калининградской области, вакцинному и производственному штаммам и это имеет важное значение для профилактики и диагностики данного заболевания. При этом индекс ^ нейтрализации антирабической референс-сывороткой составил 3,0 lg LDs0/cm и более.

При проведении ПЦР применяли пару праймеров на участок

гликопротеина (ГП) рабического вируса:

G_F gacttgggtctcccgaactgggg;

LR caaaggagagttgagattgtaggtc.

Данная пара праймеров разработана в результате анализа нуклеотидной последовательности гена гликопротеина с помощью программы Vector NTI 9.0.

Предварительно были оптимизированы условия постановки ПЦР: температура отжига составила 56 °С, концентрация MgCl2 - 2,5 мкМ. При этих условиях происходит оптимальный синтез специфического продукта

полимеразной реакции в 880 п.о.

Молекулярно-генетический анализ производственного штамма Овечий ГНКИ, а также эпизоотических изолятов вируса бешенства показал, что исследуемые пробы идентифицируются с помощью праймеров L_R и G_F на ген ГП вируса бешенства, амплифицирующие участок гена ГП в 880 п.о.

Вместе с тем, в дальнейших исследованиях необходимо провести секвенирование нуклеотидных последовательностей.

По результатам изучения культуральных, серологических и молекулярно-генетических свойств эпизоотических изолятов вируса бешенства составлены паспорта и разработаны «Методические указания по индикации возбудителя бешенства методом ОТ-ПЦР», утв. директором ФГБУ «ФЦРТБ-ВНИВИ» 14.11.2013 г.

2.4 Контроль эффективности вакцинопрофилактики бешенства диких плотоядных животных на территории Калининградской области за 2011-2013 гг. Вакцинация диких плотоядных животных на территории Калининградской области в период 2011-2013 гг. проводилась двукратно, весной и осенью с использованием антирабической вакцины из штамма «ERA G333». После каждого этапа вакцинации с целью определения ее эффективности осуществлялся диагностический отстрел диких плотоядных животных. Эффективность оральной антирабической вакцинации целевых животных определяли по поедаемости вакцины, путем определения тетрациклина в костной ткани (зубах или нижней ветви челюсти), по уровню антирабических антител в пробах сывороток крови методом ИФА и РН в культуре клеток ВНК-21 С13, исследовали также головной мозг на наличие антигена вируса бешенства по МФА, методом ИФА и биопробой на белых мышах или в культуре клеток НГУК-1.

Всего исследовано по 800 проб костной ткани, сывороток крови и головного мозга лисиц и енотовидных собак, отстрелянных на территории проведения вакцинации за 2011-2013 гг. В результате исследований проб костной ткани животных было установлено, что из 800 проб, 521 проба была положительной по тетрациклину в зубах или челюстях, что составило 65,1%, из них в 329 пробах обнаружены специфические к вирусу бешенства антитела, что составило 63,1%.

При анализе эффективности применения оральной вакцины по видам животных установлено, что выборку из 800 исследуемых животных составило 702 - лисицы и 98 енотовидных собак. Из них получило антирабическую вакцину 470 лисиц, что составило 67,0%, из них выработало специфические к вирусу бешенства антитела - 303 особи, что составило 64,4% от вакцинированных. Из 98 енотовидных собак получило антирабическую вакцину 51 енотовидная собака (52,0%) и выработали антирабические антитела - 26 особей, что составило 51,0% от вакцинированных. При этом по МФА и ИФА в мозге лисиц и енотовидных собак специфических антигенов вируса бешенства не обнаружено. Результаты иммунохимических методов подтверждены биопробой на белых мышах и в культуре клеток НГУК-1.

Таким образом, анализом полученных данных установлена эффективность применяемой антирабической вакцины на анализируемой выборке животных, обеспечивающей поедаемость вакцины лисицами - 67,0% и енотовидными собаками - 52,0% и выработку специфических антител к вирусу бешенства у 64,5% лисиц и 51,0% енотовидных собак от вакцинированных животных.

При этом, титры антирабических антител составили в ИФА от 1:40 до 1:200 при Ксп более или равном 2,1. В реакции нейтрализации в культуре клеток ВНК-21 С13 активность сывороток соответствовала 0,5 МЕ/мл и более, что свидетельствовало о достаточном уровне протективного иммунитета.

2.5 Анализ эффективности вакцинопрофилактики бешенства диких плотоядных животных на территории Калининградской области за 2007-2013 гг. на фоне применения различных антирабических вакцин. По данным Госветслужбы Калининградской области, оральная вакцинация диких плотоядных животных в разные годы проводилась с использованием антирабических вакцин из разных штаммов: с 2007 по 2011 гг. - вакцина «Оралрабивак» из штамма «РВ-97», с 2012 по 2013 гг. - вакцина «Рабивак» из штамма «ERA 0/333». Отличалось и кратность применения антирабических вакцин. Так, в 2007-2009 гг. вакцинация проводилась однократно, а с 2010 г. -дважды в год весной и осенью. Необходимо отметить, что в разные годы отличался и способ раскладки антирабической вакцины. Так, в 2007 г.

раскладка вакцины проводилась вручную, в 2008-2010 гг. - с применением малой авиации и частично вручную и в 2011-2013 гг. - с применением малой авиации.

В связи с вышеизложенным, на следующем этапе исследований интерес представляла сравнительная характеристика поедаемости вакцины, уровня сероконверсии, а также результатов исследований мозга целевых животных на наличие антигена вируса бешенства на фоне использования различных антирабических вакцин, способа раскладки и кратности их применения.

Кроме того, научно - практический интерес представлял анализ заболеваемости бешенством диких животных в Калининградской области на фоне применения различных антирабических вакцин.

Показано, что эффективность антирабической вакцинации зависит от штамма применяемой вакцины, кратности и способа её раскладки.

Установлено, что способ раскладки с применением малой авиации является более эффективным по сравнению с раскладкой вручную, которое находит отражение на поедаемости вакцины и на уровне заболеваемости

бешенством среди диких животных.

Показано, что заболеваемость бешенством животных в целом в Калининградской области имеет обратную зависимость от объема вакцинации и кратности применения антирабической вакцины с г = - 0,66.

Анализ результатов исследований проб мозга на обнаружение антигена вируса бешенства целевых животных, проведенных в 2008, 2010-2013 гг. показали отрицательные результаты. По данным ветслужбы Калининградской области, исключение составили положительные результаты исследований 4-х проб головного мозга лисиц, отстрелянных на территории проведения вакцинации в 2009 г., что составило 2,6%. При этом использовалась антирабическая вакцина «Оралрабивак» из штамма «РВ-97».

Кроме того, поедаемость антирабической вакцины при одинаковых условиях раскладки и кратности ее применения зависела также от штамма вакцины. Так, поедаемость вакцин при двукратном применении и их раскладки с применением малой авиации отличалась и составила 70,3% при использовании вакцины «Оралрабивак» из штамма «РВ-97» в 2011 г. и 62-, 63%- при использовании вакцины «Рабивак» из штамма «ERA 0/333», которая использовалась в 2012 и 2013 гг. Однако, несмотря на это, заболеваемость бешенством среди диких животных в 2012 г. снизилась в два раза и составила 7 случаев, а в 2013 г. бешенство не отмечалось, что свидетельствовало о большей эффективности антирабической вакцины «Рабивак» из штамма «ERA 0/333».

Таким образом, установлена эффективность вакцинопрофилактики бешенства в дикой фауне на территории Калининградской области за

2007-2013 гг. В 2013 г. бешенство среди всех видов животных в целом в области не регистрировалось. Тем не менее, несмотря на достигнутое благополучие по данной инфекции на основании собственных исследований «ФЦТРБ-ВНИВИ» и известных рекомендаций МЭБ, ВОЗ и ЕС на территории Калининградской области рекомендуем проводить:

- непрерывный контроль над ситуацией по заболеваемости бешенством;

- территорию Калининградской области считать свободной от бешенства, если после последнего случая регистрации заболевания, по крайней мере, в течение 2-3 лет бешенство не регистрируется в дикой фауне и среди домашних животных. В течение этого периода продолжать кампанию по оральной вакцинации для создания популяционного иммунитета среди диких плотоядных животных, как основного источника и распространителя бешенства на территории Калининградской области;

- непрерывное наблюдение и эпидемиологический скрининг для обнаружения (или исключения) любых новых вспышек бешенства на ранней стадии. Животных обследовать на вирус бешенства и изучать свойства выделенных изолятов рабического вируса по МФА и ИФА, биопробой в культуре клеток и на белых мышах, методом ОТ-ПЦР и др.;

- систематически проводить оценку популяционного иммунитета к возбудителю бешенства, главным образом у лисиц, путем определения уровня вируснейтрализующих антител;

- для определения популяционного иммунитета у лисиц к возбудителю бешенства и его исключения проводить контрольный отстрел лисиц; размер выборки, должен соответствовать не менее 4 животных на 100 км2;

- оральную вакцинацию в дикой фауне на территории Калининградской области проводить в сочетании с регулированием численности лисиц, до порогового значения, соответствующего 0,1-0,2 особи на 1 км".

3 ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее время на территории Российской Федерации (РФ) сохраняется неблагополучная ситуация по бешенству. Почти во всех регионах страны периодически отмечается активизация природных очагов бешенства, растет число случаев заболевания среди диких плотоядных животных, вовлекаются в эпизоотический процесс домашние и сельскохозяйственные животные. Ежегодно регистрируются случаи гидрофобии.

Согласно данным литературы, оральная вакцинация является единственной эффективной мерой борьбы с природным бешенством. Однако мероприятия по оральной вакцинации, проводимые в России на протяжении многих лет, не привели к ожидаемому результату.

В связи с этим, актуальной остается проблема контроля эффективности

вакцинопрофилактики бешенства в дикой фауне.

В этом отношении представляла интерес Калининградская область, где начиная с 2007 г. по настоящее время проводится оральная вакцинация диких

плотоядных животных.

с учетом изложенного, целью наших исследований явилось проведение

анализа эпизоотической ситуации и изучение эффективности

вакцинопрофилактики бешенства среди диких плотоядных животных на

территории Калининградской области.

В результате проведенных исследований получены следующие

результаты: „„

1 Впервые представлена эпизоотолого-эпидемиологическая ситуация по

заболеваемости бешенством в Калининградской области за 2002-2012 гг. За указанный период зарегистрировано 378 случаев лабораторно подтвержденного бешенства в 15 районах и 14-ти городах среди диких животных - 194 кошек -43" собак - 86 и сельскохозяйственных животных - 55. Удельная заболеваемость диких животных составила 51,3%, кошек - 11,4%, собак 22 7% и сельскохозяйственных - 14,6%. Главным источником и распространителем бешенства в Калининградской области является лисица, на долю которой среди заболевших диких животных приходится 90,2%. Случаев заболевании гидрофобией не отмечено. Тем не менее, отмечаются случаи отказов населения от антирабической помощи после укуса животных. С целью повышения грамотности населения разработаны информационное научно-популярное издание «Защити себя от бешенства» и «Памятка по профилактике бешенства

для населения».

2 Установлена прямая корреляционная связь заболеваемости бешенством животных с плотностью популяции лисиц с коэффициентом корреляции (г) равным 0,36. Рекомендовано снижение плотности популяции лисиц до 0,10 2 гол /км2 в районах, где этот показатель выше. ' 3 За последние 11 лет (2003-2013 гг.) установлено снижение эпизоотии бешенства в Калининградской области. Пики заболеваемости идут по убывающей - 63, 47 и 43 случая, соответственно. В 2013 г. случаев бешенства не отмечено. При этом максимальное количество больных бешенством животных в Калининградской области регистрировалось в осенние месяцы 35,1% весенние месяцы - 31,1%, в зимние месяцы - 21,6%. Минимальны« уровень заболеваемости регистрировался в летние месяцы - 12,2%.

4 Проведено ветеринарно-географическое картографирование неблагополучных по заболеваемости бешенством районов Калининградской области. Для районов, неблагополучных по заболеваемости бешенством, разработаны

Рекомендации по купированию первичных очагов бешенства, утвержденные в установленном порядке.

5. Установлены выраженные преципитирующие и комплементфикси-рующие свойства, патогенность эпизоотических изолятов вируса бешенства для лабораторных животных и их антигенное соответствие вакцинным штаммам «Щелково-51» и «Овечий» ГНКИ вируса бешенства. Исследуемые изоляты вируса бешенства идентифицировались с помощью праймеров на ген гликопротеина вируса бешенства G_R и LR в 880 п.о.

6. Анализом эффективности вакцинопрофилактики бешенства дикой фауны на территории Калининградской области установлены поедаемость приманок лисицами и уровень сероконверсии, составляющие 67,0- и 64,5%, соответственно, поедаемость приманок енотовидными собаками и уровень сероконверсии, составляющие 52,0- и 51,0%, соответственно. При этом содержание антирабических вируснейтрапизующих антител в сыворотке крови целевых животных с активностью 0,5 МЕ/мл и более свидетельствует о достаточном уровне протективного иммунитета. Кроме того, по МФА и методом ИФА в мозге целевых животных специфических антигенов вируса бешенства не обнаружено. Результаты иммунохимических методов подтверждены биопробой на белых мышах и в культуре клеток НГУК-1.

Таким образом, установлена эффективность вакцинопрофилактики бешенства в дикой фауне на территории Калининградской области за 2007-2013 гг. В 2013 г. бешенство среди всех видов животных в целом в области не регистрировалось. Тем не менее, несмотря на достигнутое благополучие по данной инфекции, на основании собственных исследований «ФЦТРБ-ВНИВИ» и известных рекомендаций МЭБ, ВОЗ и ЕС на территории Калининградской области рекомендуем проводить непрерывное наблюдение и эпидемиологический скрининг для обнаружения или исключения любых новых вспышек бешенства на ранней стадии. Для создания популяционного иммунитета среди дикой фауны на территории Калининградской области, рекомендуем продолжать кампанию по оральной вакцинации и контролю эффективности ее проведения.

4 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Баньковский, Д.О. Иммунобиологические свойства штамма ERA G333 вируса бешенства для изготовления оральной антирабической вакцины: автореф. дис. ... канд. биол. наук: 06.02.02 / Баньковский Денис Олегович. -Щелково, 2010,- 19 с.

2. Гулюкин, М.И. Ситуация уже кризисная / М.И. Гулюкин, В.А. Ведерников // Ветеринарная жизнь. - 2008. - № 12. - С. 6-8.

3. Жестерев, В.И. Иммунобиологические свойства штамма РБ-71/10 вируса бешенства / В.И. Жестерев, О.Г. Лаптева, М.А. Филатова // Вестник РАСХН. -2008.-№4.-С. 61.

4. Иванов, A.B. Эпизоотологический и иммунологический надзор за бешенством / A.B. Иванов, H.A. Хисматуллина, A.M. Гулюкин // Ветеринарный врач. - Казань, 2010. - № 4 (17). - С. 3-6.

5. Макаров, В.В. Оральная вакцинация лисиц против бешенства безальтернативна / В.В. Макаров // Вестник РАСХН. - 2010. - № 2. - С. 57-58.

6. Методические указания по лабораторной диагностике бешенства, утв. ДВ МСХиП РФ 14.05.97 г. / H.A. Хисматуллина, Р.Х. Юсупов, С.Р. Янбарисова,

A.Н. Чернов, Ш.А. Тятигачев (ВНИВИ, г. Казань), М.А. Селимов, А.Г. Татаров,

B.Я. Кармышева, Л.И. Кондакова (ИПВЭ им. М.П. Чумакова, г. Москва).

7. Необходим учет новых особенностей эпизоотологии бешенства / В.М. Авилов, В.А. Седов, С.А. Коломыцев, В.А. Ведерников [и др.] // Ветеринария. - 1998. -№ 6. - С. 3-6.

8. Полещук, Е.М. Бешенство животных в России в 2007-2011 гг. /Е.М. Полещук, Г.Н. Сидоров, Е.С. Березина // Российский ветеринарный журнал. - 2012. - № 6. - С. 8-12.

9. Сафонов, Г.А. Перспективы искоренения случаев бешенства в Российской Федерации / Г.А. Сафонов, Е.М. Хрипунов // Вестник РАСХН. -2011.-№5.-С. 67.

10. Селимов, М.А. Современные достижения в области рабиологии / М.А. Селимов: обзорная информация. - М.: ВНИИМИ. - 1987. - В.4. - 40 с.

11. Современная характеристика бешенства в Калининградской области / В.Н. Селюк, Т.П. Груничева, H.H. Черкес, А.Г. Кандудин // Нейроинфекция: бешенство, губкообразная энцефалопатия КРС, Крейтцфельдта-Якоба и другие прионные болезни; листериоз, болезнь Ауески, болезнь Тешена: матер. Межд. науч. - практ. конф. - Покров: ВНИИВВиМ. - 2001. - С. 19-21.

12. Хисматуллина, H.A. Нормативная документация к «Набору препаратов для лабораторной диагностики бешенства методом иммуноферментного анализа (ИФА)» / H.A. Хисматуллина, Р.Х. Юсупов, А.Н. Чернов, утв. Россельхознадзором 03.03.2008 г.

13. Эпизоотологический и иммунологический мониторинг бешенства и борьба с ним в Республике Татарстан / H.A. Хисматуллина, А.Н. Чернов, A.B. Иванов, Р.Х. Юсупов [и др.] // Матер. Межд. Симпозиума 28-30 ноября. -Казань, 2005. - (II часть). - С. 370-380.

14. Epizootic situation and fox rabies prophylaxis in Tatarstan /М.А. Khismatullina, R.H. Yusupov, A.V. Ivanov, A.N. Chernov, M. Sh. Zaydullin // Dev.Biol. Basel, Karger. - 2006. - V. 125. - P. 41-49.

15. Human infection due to a recombinant vaccinia -rabies glycoprotein virus / C.T. Rupprecht, L. Blass, K. Smith [et al.] // J. Med. - 2001. - V. 345. -P. 582-586.

16. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals // OIE Terrestrial Manual, 2008. - Part 2. - section 1. - chapter 2.1.13. - P. 304-323.

17. Vos, A. Oral vaccination of foxes against rabies with SAD В 19 in Europe, 1983 - 1988: A review / A. Vos, T. Muller, P. Schuster // Vet. Bull. - 2000. - V. 70. -P. 1-6.

5 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Хисматуллина, H.A. Выделение и изучение биологических свойств эпизоотических изолятов вируса бешенства, циркулирующих на территории Калининградской области / H.A. Хисматуллина, Т.П. Петрова,

B.Е. Кадочников [и др.] // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. - Казань, 2012. - Т. 211. -

C.187-191.

2. Хисматуллина, H.A. Оценка эпизоотической ситуации по бешенству и эффективность специфической профилактики у диких плотоядных животных на территории Калининградской области / H.A. Хисматуллина, Т.П. Петрова,

B.Е. Кадочников [и др.] // Актуальные проблемы болезней, общих для человека и животных: матер. Юбилейной науч. — практ. конф., посвящ. 60-летию ФКУЗ Ставропольского противочумного института Роспотребнадзора. - Ставрополь, 2012.-С. 104.

3. Петрова, Т.П. Иммунологический мониторинг бешенства в дикой фауне на территории Калининградской области / Т.П. Петрова // Матер. IV Межд. Казанского инновационного нанотехнологического форума. - Казань, 2012. -

C. 475-477.

4. Хисматуллина, H.A. Разработка и применение средств и методов диагностики бешенства / H.A. Хисматуллина, А.Н. Чернов, Р.Х. Юсупов, A.M. Гулюкин, В.В. Сабирова, Т.П. Петрова [и др.] // Научные основы производства и обеспечения качества биологических препаратов для АПК: матер. Межд. науч. - практ. конф. 5-7 декабря. - Щелково, 2012. - С. 146-152.

5. Хисматуллина, H.A. Контроль эффективности вакцинопрофилактики бешенства дикой фауны на территории Калининградской области РФ / H.A. Хисматуллина, Т.П. Петрова, A.M. Гулюкин [и др.] // Ветеринарный врач.-2012,-№6.-С. 8-11.

6. Петрова, Т.П. Анализ заболеваемости бешенством среди различных видов животных и их роль в распространении этого зооноза на территории Калининградской области / Т.П. Петрова, В.Е. Кадочников // Биотехнологии в решении экологических проблем природы, общества и человека в Евразии:

взгляд молодых ученых и специалистов: 26-29 марта. - Казань, 2013. - С. 114-116.

матер. Межд. науч. - практ. конф.

Отпечатано в ООО «Печатный двор», г. Казань, ул. Журналистов, 2А, оф.022

Тел: 295-30-36, 564-77^1, 564-77-51. Лицензия ПД№7-0215 от 01.11.2001 г. Выдана Поволжским межрегиональным территориальным управлением МПТР РФ. Подписано в печать 04.02.2014 г Печ.л. 1,5 Заказ М> К-7363. Тираж 100 экз. Формат 60x841/16. Бумага офсетная. Печать -ризография.

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Петрова, Татьяна Петровна, Казань

04201 4ЭЬ7У<^

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «ФЕДЕРАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОЙ, РАДИАЦИОННОЙ И

БИОЛОГИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ»

На правах рукописи

ПЕТРОВА ТАТЬЯНА ПЕТРОВНА

ЭПИЗООТОЛОГИЧЕСКИЙ МОНИТОРИНГ И КОНТРОЛЬ ЭФФЕКТИВНОСТИ ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКИ БЕШЕНСТВА ДИКИХ ЖИВОТНЫХ В КАЛИНИНГРАДСКОЙ ОБЛАСТИ

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология

с микотоксикологией и иммунология

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: Заслуженный деятель науки РТ, доктор биологических наук, профессор Хисматуллина H.A.

Казань-2014

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

1 ВВЕДЕНИЕ.................................................................... 4

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.................................................... 11

2.1 Распространенность бешенства....................................... 11

2.2 Биологические свойства возбудителя бешенства.................. 13

2.3 Методы диагностики и эпизоотологического мониторинга бешенства................................................................................................................................................16

2.4 Профилактика и меры борьбы с бешенством............................................30

3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ......................34

3.1 Природно-географическая характеристика Калининградской области.................................................................................. 34

3.2 Анализ эпизоотолого-эпидемиологической ситуации и мер борьбы с бешенством в Калининградской области.................... 35

3.3 Идентификация и изучение биологических свойств эпизоотических изолятов вируса бешенства, циркулирующих на территории Калининградской области.................................. 56

3.4 Контроль эффективности вакцинопрофилактики бешенства диких плотоядных животных на территории Калининградской области за 2011 -2013 гг...................................................... 63

3.5 Анализ эффективности вакцинопрофилактики бешенства диких плотоядных животных на территории Калининградской области за 2007-2013 гг. на фоне применения различных антирабических вакцин..................................................... 70

4 ЗАКЛЮЧЕНИЕ.............................................................. 76

5 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ................................................ 79

6 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.................. 80

7 СПИСОК ИЛЛЮСТРАТИВНОГО МАТЕРИАЛА................ 117

8 ПРИЛОЖЕНИЯ............................................................... 120

Приложение А Информационное научно-популярное издание

«Защити себя от бешенства»................................................ 120

Приложение Б Памятка по профилактике бешенства для

населения....................................................................... 121

Приложение В Рекомендации по купированию первичных очагов

и профилактике бешенства.................................................. 122

Приложение Г Паспорт на эпизоотический вирус бешенства,

штамм 21486-лиса............................................................... 124

Приложение Д Паспорт на эпизоотический вирус бешенства,

штамм 15928-лиса........................................................................ 125

Приложение Ж Паспорт на эпизоотический вирус бешенства,

штамм 13991-лиса............................................................ 126

Приложение К Методические указания по индикации

возбудителя бешенства методом ОТ-ПЦР............................... 127

Приложение Л Акты по результатам исследований на бешенство патматериала от диких и домашних животных, доставленных из ФГБУ «Калининградская межобластная ветеринарная лаборатория»................................................................... 129

1. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования. Бешенство занимает исключительно важное место в инфекционной патологии, поскольку болезнь поражает большое количество видов домашних и диких животных, представляя смертельную опасность для человека. Эпизоотологическая, эпидемиологическая и социальная опасность данной болезни привлекает внимание как медицинских, так и ветеринарных специалистов во всем мире [68, 81, 149].

Оральная вакцинация является эффективным методом борьбы с природным бешенством, отвечающим интересам охраны природы и обеспечивающая устойчивость животных к заражению [170, 254].

В последние годы в Европейских странах показана значимость оральной иммунизации диких животных в борьбе с этой болезнью, которая позволила ликвидировать бешенство среди животных [112, 307].

Однако эти мероприятия, проводимые в России на протяжении многих лет, не привели к ожидаемому результату из-за отсутствия должной организации, неполной вакцинации поголовья и недостаточного финансирования мероприятий [164].

Вместе с тем, по мнению некоторых ученых [13, 68, 76, 257], аттенуированные вакцинные штаммы вируса бешенства РБ-71 (РВ-97), ERA, SAD В 19, SAD Bern, используемые для изготовления оральных вакцин, могут привести к поствакцинальному бешенству животных и циркулировать в природе.

В связи с этим, актуальной остается проблема контроля эффективности вакцинопрофилактики бешенства в дикой фауне.

В тоже время, по данным ряда авторов [126, 222], научно обоснованные противоэпизоотические мероприятия должны основываться на изучении особенностей краевой эпизоотологии этого зооноза с учетом климатогеографических, экологических факторов и биологических свойств возбудителя бешенства, циркулирующего в регионе.

В этом отношении интерес представляет Калининградская область, расположенная в Центральной Европе, входящая в состав Северо-Западного Федерального округа Российской Федерации, где начиная с 2007 г. по настоящее время проводится планомерная оральная вакцинация диких плотоядных животных.

Степень разработанности проблемы. По итогам международного семинара-совещания ветеринарных служб 39 стран СНГ и Европы, [192] состоявшегося 03 сентября 2003 года по согласованию с Минсельхозом России, Калининградская область была включена в долгосрочную Международную Программу по искоренению бешенства животных. В рамках данной Программы Служба ветеринарии и государственной ветеринарной инспекции области совместно с Федеральным центром охраны здоровья животных (ФГБУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир) разработала региональную Программу по оральной вакцинации диких плотоядных животных против бешенства в Калининградской области на 2007-2015 годы. В ходе реализации Программы, начиная с осени 2007 года в регионе, проводится оральная вакцинация диких плотоядных животных. Контроль эффективности вакцинопрофилактики на данной территории до 2010 года проводился ФГБУ «ВНИИЗЖ», начиная с 2010 г. по настоящее время -ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ». В доступной литературе имеются единичные данные о заболеваемости бешенством животных по Калининградской области за 1993-2000 гг. [180], однако данных по комплексному изучению ситуации по заболеваемости бешенством в Калининградской области и биологических свойств эпизоотических изолятов вируса бешенства, циркулирующих на территории данного региона, не отмечено.

Цель н задачи. Цель исследований - провести анализ эпизоотической ситуации и изучить эффективность вакцинопрофилактики бешенства диких плотоядных животных на территории Калининградской области.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Изучить эпизоотолого-эпидемиологическую ситуацию по заболеваемости бешенством в Калининградской области за 2002-2013 гг.

2. Провести анализ эффективности оральной вакцинации диких плотоядных животных по эпизоотологическим показателям.

3. Провести исследования костной ткани на обнаружение тетрациклина и сывороток крови на выявление вируснейтрализующих антирабических антител целевых животных, отстрелянных в зонах применения оральной вакцины.

4. Провести анализ биологических свойств изолятов вируса бешенства, выделенных в эпизоотических очагах и в зонах проведения оральной вакцинации Калининградской области.

Научная новизна. Впервые проведен ветеринарно-географический анализ распространения бешенства на территории Калининградской области за 2002-2013 гг., разработана карта эпизоотологического районирования территории области.

Изучены биологические свойства изолятов вируса бешенства, выделенные на территории Калининградской области, и установлено их антигенное соответствие вакцинным штаммам.

Проведен контроль эффективности вакцинопрофилактики бешенства среди диких плотоядных животных на территории Калининградской области за 2011-2013 гг. и даны соответствующие рекомендации.

Теоретическая и практическая значимость. Установленное антигенное соответствие эпизоотических изолятов вируса бешенства, выделенных на территории Калининградской области, вакцинным штаммам рабического вируса имеет важное значение для диагностики и профилактики бешенства в данном регионе.

В результате проведенных исследований разработаны: «Рекомендации по купированию первичных очагов бешенства», «Методические указания по индикации возбудителя бешенства методом ОТ-ПЦР», Информационное научно-популярное издание «Защити себя от бешенства», утв. директором ФГБУ «ФЦРТБ-ВНИВИ» чл.-корр. РАСХН, профессором A.B. Ивановым 09.06.2011 г., 14.11.2013 г. и 08.07.2013 г., соответственно. Издана Памятка по

профилактике бешенства для населения (500 экз.), одобренная ученым советом ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», протокол №1 от 15.01.2013 г.

Представлены результаты эпизоотологического мониторинга распространения бешенства на территории Калининградской области за 2002-2012 гг., разработана электронная эпизоотическая карта области по заболеванию бешенством животных с использованием компьютерной программы Microsoft Excel. Знания зон повышенного риска распространения болезни позволяют уточнять оптимальные масштабы и сроки профилактической вакцинации животных, своевременно регулировать численность диких животных и вести борьбу с бродячими собаками.

Показана прямая корреляционная связь заболеваемости бешенством животных с плотностью популяции лисиц с коэффициентом корреляции (г) равным 0,36. Рекомендовано снижение плотности популяции лисиц до 0,1-0,2 гол./км ~ в районах, где этот показатель выше.

Установлено, что способ раскладки вакцины с применением малой авиации является более эффективным по сравнению с раскладкой вручную, которое находит отражение на поедаемости вакцины и уровне заболеваемости бешенством среди диких животных.

Показано, что заболеваемость бешенством животных в целом в Калининградской области имеет обратную зависимость от объема вакцинации и кратности применения антирабической вакцины с г = - 0,66.

Установлена эффективность оральной вакцинации диких плотоядных животных на территории Калининградской области, которая обеспечила благополучие области по данной инфекции. При этом активность вируснейтрализующих антител в сыворотке крови целевых животных составила 0,5 ME/мл и более, свидетельствующая о достаточном уровне протективного иммунитета. Для создания популяционного иммунитета среди дикой фауны на территории Калининградской области, рекомендуем продолжать кампанию оральной вакцинации и контроль эффективности ее проведения.

Методология и методы исследования.

В работе применяли культуральные, вирусологические, серологические методы исследования, иммуноферментный и иммунофлуоресцентный анализы, реакцию нейтрализации в культуре клеток ВНК-21 С13, биопробу на белых мышах и в культуре клеток НГУК-1.

Работа выполнена в 2010-2013 гг. в лаборатории иммунологии и биохимии ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» МСХ РФ, а также в неблагополучных очагах по заболеваемости бешенством Калининградской области согласно тематическим планам НИР (№ госрегистрации 01200202604). Отдельные фрагменты работы выполнены с участием к.б.н. Сабировой В.В., к.в.н. Усольцева К.В. и зав. отделом организации и мониторинга противоэпизоотических и лечебно-прифилактических мероприятий ГУВ Калининградской области «СББЖ» Дреерис А.Ф.

Методы исследований

Метод иммунофлуоресценции (ИФ) проводили в прямом варианте по ГОСТу 26075-84 с использованием «Флуоресцирующего антирабического глобулина», разработанного ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», согласно инструкции по его применению, утв. Россельхознадзором 03.03.2008 г.

Прямой сэндвич - вариант ИФА проводили с использованием «Набора препаратов для лабораторной диагностики бешенства животных методом иммуноферментного анализа (ИФА)», разработанного ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», согласно инструкции по его применению, утв. Россельхознадзором 03.03.2008 г. [193]

Непрямой вариант ИФА для определения антител проводили согласно Методическим рекомендациям по лабораторной диагностике бешенства, утвержденным ДВ МСХ и П РФ 14.05.97 г. [118] В качестве антигена для непрямого варианта ИФА использовали гликопротеин вируса бешенства, который выделяли из культуральной суспензии вируса, штамм «Овечий» ГНКИ, по методу В. Dietzschold et al. (1996) [250].

Реакцию нейтрализации (РН) проводили в культуре клеток ВНК-21 С 13 с использованием стандартного вируса бешенства CVS, адаптированного к

культуре клеток ВНК-21 С 13 по методике, рекомендованной МЭБ [264]. В качестве контрольной положительной сыворотки использовали отраслевой стандартный образец антирабической сыворотки (референс-сыворотка), сер. NCA-03 с активностью 20 МЕ/мл.

Выделение возбудителя бешенства проводили биопробой на белых мышах согласно ГОСТу 26075-84 и в культуре клеток невриномы Гассерова узла крысы (НГУК-1) - согласно Методическим рекомендациям по лабораторной диагностике бешенства, утвержденным ДВ МСХ и П РФ 14.05.97 г. [118].

Выделение вирусной РНК из проб патологического материала осуществляли согласно инструкции по применению для выделения РНК/ДНК «Рибо-сорб» производства (ФГУН «ЦНИИЭ» Роспотребнадзора, г. Москва), постановку обратной транскрипции - согласно инструкции по применению комплекта реагентов для получения кДНК на матрице «PEBEPTA-L» производства (ФГУН «ЦНИИЭ» Роспотребнадзора, г. Москва).

Контроль эффективности вакцинопрофилактики бешенства проводили по эпизоотологическим показателям, а также оценке поедаемости антирабической вакцины согласно «Методическим указаниям по обнаружению флуоресцентным методом антибиотиков тетрациклинового ряда в ткани зубов и костей животных для контроля поедаемости оральных антирабических вакцин», разработанным ВНИИЗЖ (2010), уровню сероконверсии у целевых животных в непрямом ИФА согласно Методическим рекомендациям по лабораторной диагностике бешенства, утвержденным ДВ МСХ и П РФ 14.05.97 г. [118] и в реакции нейтрализации в культуре клеток ВНК-21 С 13 по методике, рекомендованной МЭБ [264].

Эпизоотологическне исследования. Для решения отдельных вопросов эпизоотологии бешенства (распространения, эпизоотичность, сезонность, источник и факторы передачи возбудителя инфекции) применяли различные приемы и способы, описанные в «Рекомендациях по методике эпизоотического исследования» под редакцией И.А. Бакулова (1975). Эпизоотологическое районирование территории Калининградской области, а также количественную оценку напряженности эпизоотической ситуации проводили по методике,

описанной М.Г. Таршисом, В.М. Константиновым (1975). При анализе эпизоотолого-эпидемиологической ситуации по заболеваемости бешенством в Калининградской области использовали статистические данные Госветслужбы и ТУ Роспотребнадзора по Калининградской области.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

- характеристика эпизоотической ситуации по заболеваемости бешенством в Калининградской области за 2002-2013 гг. Районирование территории области по степени распространения заболевания;

- биологическая характеристика изолятов вируса бешенства, выделенных в эпизоотических очагах Калининградской области;

- поедаемость антирабической вакцины и уровень сероконверсии у целевых животных.

Степень достоверности и апробация результатов. Экспериментально полученный цифровой материал обрабатывали методом вариационной статистики с применением пакета прикладных программ Microsoft Excel. Для получения достоверных результатов все опыты проводили повторно не менее трех раз.

Основные результаты диссертации представлены и доложены на ежегодных отчетных научных сессиях ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» по итогам НИР за 2010-2013 гг.; Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы научного и кадрового обеспечения инновационного развития АПК» (Казань, 2012); Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы болезней, общих для человека и животных» (Ставрополь, 2012); III Международной научно-практической конференции «Достижения молодых ученых в ветеринарную практику» (Владимир, 2012); Международной научно-практической конференции «Биотехнологии в решении экологических проблем природы, общества и человека в Евразии: взгляд молодых ученых и специалистов» (Казань, 2013).

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 Распространенность бешенства. Бешенство - острое инфекционное природно-антропургическое зоонозное заболевание вирусной этиологии с раневым механизмом передачи инфекции и характеризующиеся поражением центральной нервной системы с абсолютной летальностью [11, 30, 63, 70, 208].

В большинстве регионов России эпизоотическая ситуация по бешенству чрезвычайно сложна - резко активизировались при�