Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка методов оценки оральной антирабической вакцинации животных

ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Разработка методов оценки оральной антирабической вакцинации животных"

На правах рукописи

005555177

Сухарьков Андрей Юрьевич

РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ОЦЕНКИ ОРАЛЬНОЙ АНТИРАБИЧЕСКОЙ ВАКЦИНАЦИИ ЖИВОТНЫХ

03.02.02 «Вирусология»

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 3 НОЯ 2014

Владимир-2014

005555177

Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном учреждении «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), г. Владимир.

Научный руководитель: Метлин Артем Евгеньевич -

кандидат ветеринарных наук

Официальные оппоненты:

Кузнецова Светлана Владимировна - доктор биологических наук, профессор, ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» РАСХН, ведущий научный сотрудник отдела молекулярной биологии и вирусологии

Грибенча Сергей Васильевич - доктор медицинских наук, ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского», руководитель лаборатории иммунологии

Ведущая организация:

ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко» Россельхозакадемии

Защита состоится 9 декабря 2014 года в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 220.015.01 при ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), г. Владимир, мкр. Юрьевец.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте www.arriah.ru ФГБУ «ВНИИЗЖ» (г. Владимир).

Автореферат разослан 5 ноября 2014 г.

Учёный секретарь

диссертационного совета, "^Г^^.^П

кандидат биологических наук 'А' Жбанова Татьяна Валентиновна

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследований. Бешенство - широко распространенное вирусное заболевание животных, которое вызывает нейротропный вирус рода Ьуз$а\чгиз в семействе Ш1аЬс1оутс1ае, отряд Mononegavirales. В пределах рода выделяют двенадцать генотипов. Наибольший интерес вызывает вирус классического бешенства.

Оральная вакцинация является основным способом борьбы с бешенством в дикой природе. С помощью оральной вакцинации было ликвидировано бешенство наземных млекопитающих в большинстве стран Западной Европы. Уменьшение численности диких плотоядных имеет лишь ограниченный эффект.

Мониторинг — важная составляющая программы оральной антирабической вакцинации. Он позволяет оценить эпизоотическую обстановку по бешенству в зоне вакцинации, а также качество проводимых мероприятий, путем оценки поедаемости приманок с вакциной и уровня серопревалентности.

В Российской Федерации борьбе с бешенством в природной среде с помощью оральной вакцинации диких животных уделяется все большее внимание, как и вопросам мониторинга ее эффективности. Однако проводить исследования по оценке эффективности антирабической вакцинации с использованием классических методов в настоящее время имеют возможность лишь крупные научно-исследовательские учреждения.

Таким образом, актуальной задачей является разработка и усовершенствование существующих методов, позволяющих в ветеринарных лабораториях разного уровня качественно и быстро оценить результаты проведенной оральной антирабической вакцинации.

Степень разработанности проблемы. Оценке эффективности оральной антирабической вакцинации посвящены работы ряда зарубежных [3, 4] и отечественных [1, 2] авторов.

Поедаемость оральных антирабических вакцин рекомендуют оценивать с помощью биологических маркеров, которые включают в состав приманок. Обычно в качестве маркера используют антибиотики тетрациклинового ряда.

Данным способом оценивали большинство кампаний по оральной антирабической вакцинации, проводимых в Европе и Северной Америке. В России метод оценки поедаемости оральных вакцин до 2007 года не использовался. Учитывая тот факт, что оральная вакцинация все чаще применяется для борьбы с бешенством в России, было необходимо освоить и внедрить в лабораторную практику этот метод.

Основным методом оценки эффективности антирабической вакцинации на сегодняшний день является РН (реакция нейтрализации) в культуре клеток. Этот метод имеет ряд недостатков: он дорогостоящий и требует большого количества времени на постановку. Эпизоотическую обстановку по бешенству принято определять путем проведения лабораторных исследований проб головного мозга с помощью РИФ (реакция иммунофлуоресценции). Однако этот метод малопригоден при широкомасштабных исследованиях, с использованием большого количества проб, ввиду своей трудоемкости. МЭБ (Международное Эпизоотическое Бюро) предлагает в качестве возможной альтернативы для оценки эффективности вакцинации использовать ИФА (иммуноферментный анализ) для определения количества антирабических антител, а для диагностического мониторинга, в случаях, если отсутствует опасность заражения человека, использовать ИФА для выявления ВБ (вирус бешенства) [5]. В связи с этим целесообразно было разработать ИФА для определения уровней антирабических антител и для диагностики бешенства, оценить возможность использования данных методов для проведения диагностического мониторинга и мониторинга эффективности антирабической вакцинации.

Цели и задачи. Основной целью работы являлась разработка методов, позволяющих оценить качество мероприятий по оральной антирабической вакцинации диких животных и провести диагностический мониторинг по бешенству в зоне вакцинации. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- усовершенствовать методику по отбору и пересылке проб с целью диагностики бешенства животных и оценки качества проведения оральной

антирабической вакцинации;

- освоить и внедрить в лабораторную практику метод определения тетрациклина в тканях костей и зубов;

- разработать ИФА для определения уровней антител к гликопротеину ВБ в сыворотках крови животных;

- разработать прямой сэндвич-вариант ИФА для обнаружения ВБ в головном мозге животных;

- оценить поедаемость оральных антирабических вакцин с помощью метода определения тетрациклина в тканях костей и зубов в ряде регионов РФ;

- провести диагностический мониторинг по бешенству с использованием разработанного прямого сэндвич-варианта ИФА в ряде регионов РФ.

Научная новизна. Оценена поедаемость оральных антирабических вакцин в ряде регионов Российской Федерации и Республики Беларусь, используя метод обнаружения тетрациклина в тканях зубов и костей животных.

Оценена возможность использования прямого сэндвич-варианта ИФА с целью проведения диагностического мониторинга по бешенству. С помощью ИФА проведен мониторинг по бешенству в Калининградской, Ленинградской областях и Республике Карелия.

Разработан ИФА для определения в сыворотках крови животных антител к гликопротеину ВБ, который позволяет проводить количественную оценку иммунитета.

Усовершенствован метод отбора и пересылки проб патологического материала с целью диагностики бешенства животных и оценки эффективности оральной антирабической вакцинации.

Теоретическая и практическая значимость. В результате проведенных исследований разработаны:

- «Методические указания по отбору и пересылке проб головного мозга, сывороток крови и костной ткани с целью диагностики бешенства животных и оценки эффективности оральных антирабических вакцин», утверждены директором ФГУ «ВНИИЗЖ» 2009 г.

- «Методические указания по обнаружению флуоресцентным методом антибиотиков тетрациклинового ряда в тканях зубов и костей животных для контроля поедаемости оральных антирабических вакцин», утверждены заместителем руководителя Россельхознадзора России 2010 г.

- «Методические указания по определению антител к гликопротеину вируса бешенства в сыворотках крови животных в иммуноферментном анализе», утверждении директором ФГУ «ВНИИЗЖ», 2010 г.

- «Методические указания по выявлению антигенов вируса бешенства в головном мозге животных в твердофазном прямом сэндвич-варианте иммуноферментного анализа», утвержденны заместителем директора ФГБУ «ВНИИЗЖ», 2012 г.

Разработанные методы применяются в ФГБУ «ВНИИЗЖ» и в других научных учреждениях и лабораториях ветеринарного профиля.

Методология и методы исследования. В работе применяли биохимические, вирусологические, серологические и культуральные методы исследования, использовали выделение вируса биопробой на мышах, реакцию нейтрализации в культуре клеток, ИФА, РИФ и другие методы.

Основной объем исследований проведен автором самостоятельно, отдельные этапы работы выполнены с участием других сотрудников лаборатории. Консультативную и методическую помощь при выполнении работы оказывал канд. биол. наук Назаров H.A.

Основные положения, выносимые на защиту:

- Оценка поедаемости оральных антирабических вакцин.

- Определение уровней антител к гликопротеину ВБ в непрямом варианте ИФА в сыворотках крови животных.

- Выявление антигенов ВБ в головном мозге животных в твердофазном прямом сэндвич-варианте ИФА.

Степень достоверности и апробация результатов. Для получения достоверных результатов большинство опытов, представленных в диссертации, проводили в нескольких повторах. Результаты диссертационной работы

представлены и обсуждены на Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии» (г. Чебоксары, 2011 г.) и на 29-ом Международном конгрессе биологов-охотоведов (г. Москва, 2009 г.), а также неоднократно докладывались на заседаниях ученого совета ФГБУ «ВНИИЗЖ», Российско-Финских совещаниях по профилактике бешенства диких животных в граничащих с Финляндией регионах России. По теме диссертационной работы опубликовано семь научных статей, в том числе три статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 141 странице. Список литературы включает 22 отечественных и 199 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 29 таблицами и 19 рисунками. Исследования по теме диссертационной работы выполнены в 2008-2012 гг. в лаборатории диагностики болезней сельскохозяйственных животных ФГБУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир.

2 ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

2.1 Материалы

Фиксированные штаммы ВБ и вакцины:

- штамм «ВНИИЗЖ» использовался для получения антигенов ВБ и иммунизации лабораторных животных;

- штамм CVS использовался в качестве контрольного штамма в различных диагностических реакциях (РН, РИФ, ИФА);

- антирабическая вакцина Рабивак-О/333, изготовленная из штамма ERA G333 (ОАО «Покровский завод биопрепаратов»).

Диагностические специфические препараты:

- конъюгат белок А — пероксидаза хрена («Sigma») - универсальный пероксидазный конъюгат, специфично реагирующий с IgG (иммуноглобулины класса G);

антирабический ФИТЦ-иммуноглобулин (ФГБУ «ВНИИЗЖ») -антирабические иммуноглобулины, меченные флуоресцеинизотиоционатом (ТУ 9388-091-00495527-2004);

- антитела диагностические против IgG морской свинки, меченные пероксидазой (ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи, г. Москва).

Стандартные препараты:

- референтная антирабическая сыворотка собак («Nancy» Франция) — использовалась в качестве калибровочной сыворотки в ИФА для определения антител к гликопротеину ВБ в сыворотках крови животных;

- лиофилизированная инактивированная 20% суспензия ткани головного мозга кролика, инфицированного ВБ (штамм CVS) - служила положительным контролем в ИФА для выявления антигенов ВБ (ТУ 9388-091-00495527-2004);

- лиофилизированная 20% суспензия мозговой ткани здорового кролика — использовалась в качестве отрицательного контроля в ИФА для выявления ВБ (ТУ 9388-091-00495527-2004).

Лабораторные и экспериментальные животные. В работе использовали белых беспородных мышей массой 6-8 г, кроликов массой 1,5-3,0 кг, морских свинок массой 0,3-0,5 кг.

2.2 Методы

Очистка и концентрирование ВБ. В работе использовали суспензию инактивированного культурального ВБ, штамм «ВНИИЗЖ», полученную путем репродукции вируса в перевиваемой культуре клеток ВНК-21. Процесс очистки и концентрирования включал пять этапов: осаждение суспензии клеток ВНК-21, содержащей антигены ВБ (1-й этап), осаждение вируса полиэтиленгликолем (2-й этап), дифференциальная элюция ВБ из полученных осадков с последующим концентрированием вируса ультрацентрифугированием (3-й этап), очистка вирусных частиц от сопутствующих белков в ступенчатом градиенте хлористого цезия (4-й этап) и осаждение вируса из градиента (5-й этап).

Получение антигенов ВБ. Гликопротеин ВБ получали из очищенного ВБ методом деструкции вирионов тритоном Х-100, с последующим разделением

антигенов высокоскоростным центрифугированием в ступенчатом градиенте плотности хлористого цезия. Очистку гликопротеина от тритона Х-100 и хлористого цезия проводили с помощью диализа.

РНП (рибонуклеопротеин) ВБ получали из суспензии клеток ВНК-21, инфицированных ВБ. Клетки разрушали и проводили элюирование из осадка. Далее проводили очистку высокоскоростным центрифугированием в ступенчатом градиенте плотности хлористого цезия. Очистку полученного РНП ВБ от хлористого цезия осуществляли путём диализа.

Оценка чистоты и концентрации полученных антигенов. Концентрацию белка в полученных препаратах определяли по методу Лоури. Степень чистоты контролировали методом вертикального электрофореза в полиакриламидном геле.

Получение полнклональных антител к антигенам ВБ. Поликлональные антитела получали путем иммунизации кроликов и морских свинок антигенами ВБ. Из отобранных сывороток от иммунизированных животных выделяли фракцию методом высаливания сульфатом аммония. Использовали

сыворотки крови с титрами антител в ИФА к ВБ и РНП ВБ не ниже 1/243000. Концентрацию белка в конечных препаратах определяли методом спектрофотомерии при длине волны 280 нм.

Получение антирабического пероксидазного коньюгата. Для получения антирабического пероксидазного коньюгата использовали поликлональные антирабические антитела морских свинок. Конъюгаты антител были получены по методу Накане с некоторыми модификациями.

Подготовка проб для исследований. При проведении исследований на наличие в пробах ВБ в РИФ, биопробе на мышах и ИФА использовали пробы головного мозга (мозжечок, продолговатый мозг, аммоновы рога, кора больших полушарий). В РИФ головной мозг использовали в цельном виде. Для постановки ИФА готовили 30% суспензию. Гомогенизировали путем замораживания и встряхивания материала в процессе оттаивания. Материал центрифугировали, для дальнейших исследований использовали супернатант. Аналогичным образом

готовили материал для биопробы на мышах, только использовали 10% суспензию и добавляли антибиотик гентамицин. Для проведения исследований по оценке поедаемости оральных антирабических вакцин использовали пробы одной из ветвей нижних челюстей с зубами. С поверхности фрагментов челюстей с зубами удалили остатки слизистых оболочек, мышечных и других тканей. При определении уровней антирабических антител в РН и ИФА использовали сыворотки крови, очищенные путем центрифугирования.

РИФ и биопроба на мышах. Постановку прямого варианта РИФ и биопробы на мышах проводили в соответствии с ГОСТ 26075-84 «Методы лабораторной диагностики бешенства».

Обнаружение антибиотиков гетрациклинового ряда в тканях зубов и костей животных. Для получения срезов производили распиливание зубов и костей с помощью специального станка. Результаты обнаружения тетрациклина учитывали с помощью флуоресцентного микроскопа. Исследовали образцы при увеличении х40-100. Образцы считали тетрациклин-положительными, если при просмотре в ткани зуба или кости в поле зрения микроскопа были видны тонкие кольца, полукольца, дуги желтого цвета.

РН в культуре клеток. Для определения количества ВНА (вируснейтрализующие антитела) использовали два варианта РН в культуре клеток: FAVN (fluorescent antibody virus neutralization test) и RFFIT (rapid fluorescent focus inhibition test). Их использовали в соответствии с разработанными в ФГБУ «ВНИИЗЖ» «Методическими указаниями по определению вируснейтрализующих антител к вирусу бешенства в сыворотках крови животных в реакции нейтрализации в культуре клеток ВНК-21 (FAVN)» и «Методическими указаниями по определению вируснейтрализующих антител к вирусу бешенства в сыворотках крови диких плотоядных животных в реакции нейтрализации в культуре клеток ВНК-21 (RFFIT)».

Определение уровня антител к гликопротеину ВБ. Сенсибилизировали иммунологический планшет раствором гликопротеина. Затем блокировали раствором казеина натриевой соли, и вносили сыворотки и контроли. Далее

использовали универсальный конъюгат в рабочем разведении. В качестве хромогена добавляли субстрат ортофенилендиамин. Реакцию останавливали добавлением ЗН H2S04. Учитывали реакцию, регистрируя ОП (оптическая плотность) при длине волны 492 нм. Затем вычисляли титры антител к гликопротеину ВБ, результаты выражали в ME/мл (международная единица/мл).

Выявление антигенов ВБ в головном мозгу животных в твердофазном прямом сэндвич-варианте ИФА. Сенсибилизировали иммунологический планшет раствором поликлональных кроличьих антител к РНП ВБ, затем вносили пробы и контроли. Далее использовали антирабический пероксидазный конъюгат. Затем добавляли ортофенилендиамин, реакцию останавливали добавлением ЗН H2SO4. Учитывали реакцию, регистрируя ОП при длине волны 492 нм.

Выявление ВБ в твердофазном непрямом сэндвич-варианте ИФА. ВБ выявляли в соответствии с «Методическими указаниями по выявлению антигенов вируса бешенства в головном мозгу животных в твердофазном непрямом сэндвич-варианте иммуноферментного анализа», разработанными в ФГУ «ВНИИЗЖ» в 2005 году.

Обработка результатов. Подсчет уровня антител к гликопротеину в ИФА, статистическую обработку результатов, полученных в ходе выполнения диссертационной работы, а также построение графиков и диаграмм, проводили с использованием компьютерной программы Microsoft Excel 2010.

23 Результаты исследований

2.3.1 Отбор проб патологического материала. Для получения более качественных образцов проб зубной и костной ткани был усовершенствован метод отбора и пересылки проб патологического материала и утверждены директором ФГБУ «ВНИИЗЖ» методические указания. В усовершенствованной методике также представлены несколько способов отбора образцов крови у отстреленных животных и описаны способы отбора проб головного мозга, в том числе более быстрый способ, позволяющий извлекать пробы головного мозга с помощью пластиковых трубок, не прибегая к распиливанию черепной коробки.

2.3.2 Визуальная оценка поедаемости оральных антирабических вакцин. Данным методом проводили оценку поедаемости оральной антирабической вакцины Рабивак-О/333, изготовленной из штамма ERA G333, в Краснодарском крае и Владимирской обл. С этой целью были сформированы контрольно-следовые площадки. В центр площадки помещали три вакцинные приманки. Площадки проверяли ежедневно.

В условиях Краснодарского края на контрольных площадках, не смотря на неблагоприятные погодные условия, 93,9% приманок были съедены в течение первых четырех суток. Во Владимирской области уже на вторые сутки поедаемость приманок составила 84,6% (рисунок 1). При проведении испытаний в местах раскладки приманок были обнаружены блистеры с нарушенной целостностью и следами зубов плотоядных (вакцинная суспензия в них отсутствовала), что свидетельствовало о попадании вакцины в организм животных. В ряде случаев, на приманках обнаруживали следы зубов мелких мышевидных млекопитающих, которые локализовались по краям. Некоторые вакцинные штаммы опасны для грызунов, однако, как показали исследования, обнаруженные повреждения не достигали капсулы с вакциной.

Поедаемость приманок в Краснодарском крае

■ а текущее сутки □ с нэнала наблюдения

Поедаемость приманок во Владимирской области

—

1

-

1- 12 3 Сугеи в текущие сутки □ с начала наблюдения |

Рисунок 1 — Учет поедаемости приманок с вакциной в условиях Краснодарского края и Владимирской области

Метод визуального контроля позволяет в полной мере оценить качество и время поедания приманок, а также определить оптимальные места распределения приманок и погодные условия для их распространения. Его с успехом можно использовать на ограниченных и доступных территориях, на первых этапах при

разработке планов реализации долгосрочных программ по оральной вакцинации диких животных. Однако, он довольно трудоемок, что ограничивает применение при проведении широкомасштабных кампаний по оральной вакцинации диких животных. Для этих целей чаще применяют флуоресцентный метод определения скоплений тетрациклина в тканях костей и зубов животных.

2.3.3 Определение скоплений тетрациклина в тканях костей и зубов животных флуоресцентным методом. Проведенные исследования показали, что наилучшие результаты по выявлению скоплений тетрациклинов достигаются при использовании поперечных и продольных срезов зубов, наиболее для этого подходят поперечные срезы клыков, с прохождением среза через пульпарную полость. В срезах костной ткани тетрациклин обнаруживается, но значительно реже, он выявляется в виде хаотично расположенных желтых флуоресцирующих колец. В тетрациклин-положительных препаратах зубов выявляли ярко-желтые полосы вокруг пульпарной полости зуба. Чем дальше они располагались от пульпарной полости, тем больше срок между поеданием приманки и датой отстрела животного. Наличие нескольких полос свидетельствует о неоднократном поедании животным вакцинных приманок. В препаратах зубной ткани, не содержащих тетрациклин, регистрировали равномерное свечение зеленого цвета.

2.3.4 Контроль поедаемости оральных антирабических вакцин. Мониторинг поедаемости оральных антирабических вакцин в Калининградской области. В 2007 году была начата программа по оральной вакцинации диких животных в Калининградской области. Мониторинг антирабической вакцинации в Калининградской области до 2010 года проводился в ФГБУ «ВНИИЗЖ». Перед началом вакцинации определили фоновый уровень тетрациклин-позитивных проб, который составил 3,9%. Затем по 2008 год было установлено увеличение уровня проб, содержащих тетрациклин, однако, в 2009-2010 годах произошло его снижение до 37,3% (рисунок 2). Снижение уровня поедаемости может быть связано с трехкратным увеличением выборки в 2009 году, что позволило более качественно оценить ситуацию.

Примечание: п - общее число исследованных проб.

Рисунок 2 — Результаты обнаружения скоплений тетрациклина в костной ткани животных, отстрелянных в зоне вакцинации в 2007-2010 гг.

Мониторинг поедаемости оральных антирабических вакцин в других регионах Российской Федерации. В 2009 году был проведен мониторинг эффективности вакцинации в некоторых регионах РФ, где проводились мероприятия по оральной вакцинации диких животных. Поедаемость приманок на уровне выше 70% не наблюдалась ни в одном из исследуемых регионов. Однако из большинства регионов было прислано недостаточное количество проб для получения точной оценки поедаемости приманок с вакциной. Наибольшее количество проб было прислано из Московской, Тульской и Нижегородской областей, где поедаемость приманок не превысила 30% (рисунок 3). Всего было исследовано 242 пробы, 28,5% из которых содержали тетрациклин, что является низким результатом.

Рисунок 3 - Поедаемость вакцинных приманок в некоторых регионах РФ в 2009г.

Мониторинг поедаемости оральных антирабических вакцин в Республике Беларусь. Мониторинг проводили в трех областях: Гродненской, Витебской и Минской. Высокие уровни поедаемости приманок в Гродненской области в течение 2011 и 2012 года наблюдались во многих районах. Однако в Зельвенском, Кореличском и Слонимском районах уровень поедаемости приманок не превышал 40% (рисунок 4).

Рисунок 4 - Поедаемость вакцинных приманок в 2011-2012 гг. в Гродненской

области

В Витебской области в Браславском районе поедаемость приманок в 2011 и 2012 годы сохранялась выше 70%. Более 60% тетрациклин-позитивных животных было выявлено в Докшицком и Поставском районах (рисунок 5).

В Минской области в Вилейском районе поедаемость приманок в 2011 и 2012 годах сохранялась выше 70%. Близкие к 70% показатели были отмечены в Логойском районе. В 2012 году в Молодечненском районе поедаемость приманок составила более 70%, в Воложинском около 60% (рисунок 5).

Всего в 2011 году из Республики Беларусь было исследовано 444 пробы, из которых 266 (59,9%) оказались положительными. В 2012 году исследовали 1176 проб, из них 683 положительных, что составило 58,1%. Во всех трех исследованных регионах Республики Беларусь в 2011 и 2012 году уровень

поедаемости приманок находился в пределах 50-70%, за исключением Минской области, где в 2011 году тетрациклин обнаружили у 49,2% проб.

Витебская область Минская область

Рисунок 5 — Поедаемость вакцинных приманок в 2011-2012 гг. в Витебской и

Минской областях

Если тетрациклин обнаруживают менее чем у 70% животных, то плотность распределения приманок признается недостаточной и требует увеличения. В Калининградской области максимальный уровень поедаемости приманок составил 52,9%. Связано это вероятно с тем, что в Калининградской области до 2010 года вакцинацию проводилась один раз в год, хотя рекомендуют проводить двукратно. В пробах, поступивших из Республики Беларусь, общий показатель поедаемости приманок в регионах занижался из-за неудовлетворительной вакцинации в отдельных районах.

В Республике Беларусь и Калининградской области вакцинация проводилась с использованием авиации, и были достигнуты более высокие показатели поедаемости приманок, по сравнению с регионами Российской Федерации, в которых использовался ручной способ раскладки оральной антирабической вакцины. Использование авиации при проведени кампании по оральной антирабической вакцинации позволяет более равномерно производить раскладку вакцины, а также менее значимым становится человеческий фактор, кроме того, проще контролировать качество распределения вакцинных приманок.

3.3.5 Разработка метода определения антител к гликопротеину ВБ в сыворотках крови животных в ИФА.

Получение и очистка ВБ и его гликопротеина. В ходе работы было получено четыре препарата очищенного ВБ с концентрацией 0,72 мг/мл, 2,16мг/мл, 2,1 мг/мл, 1,68 мг/мл. Гликопротеин получали путем деструкции вирионов ВБ. Чистоту полученных антигенов определили в электрофорезе.

Определение рабочего разведения гликопротеина. Рабочее разведение гликопротеина определяли методом титрования с использованием антирабического иммуноглобулина кролика, сыворотки неиммунного кролика и диагностических антител против иммуноглобулинов кролика, меченных пероксидазой. За рабочее разведение гликопротеина приняли разведение при котором достигалось наибольшее значение соотношения величины ОП с антирабическим иммуноглобулином к величине ОП соответствующего разведения неиммунной сыворотки. В результате гликопротеин использовали в разведении 1/50.

Определение рабочего разведения конъюгата. В реакции в качестве конъюгата использовали стафилококковый белок А, меченый пероксидазой. Рабочее разведение конъюгата устанавливали с использованием антирабического кролика и определяли из соотношения ОП в лунках с иммуноглобулином и ОП в лунках без иммуноглобулина. Рабочее разведение конъюгата определили как 1/3000.

Подбор блокирующего буферного раствора. Исследования показали целесообразность использования блокирующего раствора для снижения неспецифической сорбции, свободного от примеси факторов сыворотки крови. При выборе блокирующего агента наилучшие результаты показал 0,1% раствор казеина натриевой соли.

Определение рабочего разведения сывороток крови для исследования в ИФА проб в одном разведении. Рабочее разведение сывороток крови определяли постановкой ИФА с использованием негативных сывороток крови диких и домашних животных. Наименьшее значение ОП у негативных в РН

сывороток крови диких животных было достигнуто при разведении 1/200 и 1/400, у негативных сывороток крови домашних животных — при разведении 1/100 и 1/200. Учитывая эти данные, определили рабочее разведение сывороток крови от животных как 1/200.

Определение уровней антител к гликопротеину ВБ в сыворотках крови животных. Провели тестирование сывороток крови собак, поступивших из региональных ветеринарных лабораторий. Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1 — Результаты определения антирабических антител в сыворотках крови животных в ИФА

Статус сыворотки РН в культуре клеток Результаты исследования в ИФА

положительные отрицательные

Положительные 53 48 5

Отрицательные 25 5 20

Всего 78 78

Всего исследовано 78 сывороток крови. Принято считать положительными сыворотки с титром >0,5 МЕ/мл. В результате в ИФА было выявлено 48 из 53 положительных в РН сывороток, отрицательными в ИФА оказались 20 из 25. Чувствительность теста составила 90,6%, специфичность - 80%.

Сыворотки, положительные в ИФА, но отрицательные в РН, а также ряд сывороток положительных и отрицательных в обоих методах были дополнительно двукратно исследованы в ИФА. Все пробы подтвердили свой статус в ИФА по результатам трех исследований.

Вероятно, расхождение результатов между ИФА и РН связано с принципиальными различиями между этими методами. Количество антител, которые связываются с гликопротеином ВБ, не будет точно соответствовать уровню ВНА присутствующих в сыворотке крови, т. к. с гликопротеином реагируют антитела, обладающие и не обладающие вируснейтрализующими свойствами, тогда как в РН определяются преимущественно пул антител с нейтрализующими свойствами. При уровне ВНА близком к 0,5 МЕ/мл существует вероятность ошибки при определении количества антител в ИФА.

3.3.6 Разработка метода выявления антигенов ВБ в головном мозге животных в твердофазном прямом сэндвич варианте ИФА.

Определение разведения антирабического конъюгата. Рабочее разведение антирабического пероксидазного конъюгата определяли с использованием положительного и отрицательного контрольных препаратов. Рабочее разведение конъюгата определили как 1/1500.

Определение влияния блокирующего раствора на результаты ИФА. Исследование показало, что использование блокирующего раствора (10% раствор неиммунной сыворотки лошади) приводит к небольшому понижению аналитической чувствительности теста. Отсутствие в реакции блокирующего раствора не влияло на специфичность теста, поэтому, для повышения чувствительности и уменьшения времени на постановку анализа, решили блокирующий раствор не использовать.

Определение аналитической чувствительности. С целью измерения предела аналитической чувствительности разработанного метода провели анализ с использованием РНП ВБ известной концентрации. Предел чувствительности метода находился в диапазоне 11,7 - 23,4 нг/мл, около 15 нг/мл. Коэффициент вариации при определении чувствительности не превышал 5,3%.

Оценка специфичности теста. Для оценки специфичности разработанного прямого сэндвич-варианта ИФА исследовали 30 проб головного мозга от разных животных отрицательных по бешенству в РИФ. Расчетная ОП отрицательных проб была 0,0130 ± 0,0004, что свидетельствуют о высокой специфичности разработанного ИФА, которая в данном исследовании составила 100%.

Сравнение разработанного прямого сэндвич варианта ИФА с другими методами диагностики. Для изучения эффективности диагностики бешенства разработанным прямым сэндвич вариантом ИФА провели исследования 100 проб головного мозга животных. Диагноз на бешенство был поставлен с использованием РИФ, дополнительно для подтверждения диагноза использовали биопробу на мышах и ПЦР (полимеразная цепная реакция). Из 70 проб головного мозга от различных видов диких, домашних и с/х животных, положительных в

РИФ в прямом сэндвич варианте ИФА было выявлено 68 проб, что составило 97,14%. Оказались отрицательными две пробы, в отпечатках ткани головного мозга которых, при постановке РИФ, находили единичные клетки со специфичными включениями. В ПЦР эти пробы оказались также положительные. Все пробы, отрицательные в РИФ оказались так же отрицательными в прямом сэндвич варианте ИФА. Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2 — Результаты исследований образцов мозговой ткани животных на наличие вируса бешенства в прямом сэндвич варианте ИФА

Статус проб по Вид животного Результаты РИФ Прямой сэндвич вариант ИФА

бешенству положительн. отрицательн.

волк 1 1 0

енотовидная собака 4 4 0

коза 2 2 0

Положительн. кошка 4 4 0

КРС 4 4 0

лисица 42 41 1

олень 3 3 0

собака 9 8 1

хорек 1 1 0

енотовидная 1 0 1

Огрицательн. собака

лисица 29 0 29

Всего 100 100

Получение в ИФА отрицательных результатов для положительных в РИФ проб связано с низкой концентрацией антигена ВБ в мозговой ткани, ниже предела чувствительности метода. Однако такие пробы в случае клинического бешенства практически не встречаются.

Для сравнения результатов разработанного прямого сэндвич варианта ИФА с непрямым сэндвич вариантом ИФА, разработанным ранее, исследовали приготовленные суспензии головного мозга в непрямом методе. Результаты исследований в прямом и непрямом сэндвич вариантах ИФА полностью совпали. Однако для постановки прямого варианта ИФА требуется меньше времени, вследствие использования антирабического конъюгата вместо антивидового и отказа от использования блокирующего раствора.

Использование разработанного теста для оценки эпизоотической ситуации по бешенству. Чтобы определить возможность использования разработанного нами прямого сэндвич варианта ИФА для оценки эпизоотической обстановки по бешенству, нами были проведены мониторинговые исследования. С этой целью пробы головного мозга, отобранные в ходе мониторинга в Калининградской области в 2010 году, исследовали в ИФА. Результаты, полученные в прямом сэндвич варианте ИФА, полностью совпали с результатами РИФ (таблица 3).

Таблица 3 — Сравнение результатов полученных в РИФ и ИФА при оценке эпизоотической ситуации по бешенству в Калининградской области в 2010 г.

Диагноз на бешенство Вид животного РИФ ИФА

положительные отрицательные

Отрицательный енотовидная собака 7 0 7

лисица 134 0 134

Положительный лисица 5 5 0

Всего 146 5 141

Подобным образом оценивали эпизоотическую ситуацию в других регионах. При исследовании 45 проб головного мозга от волков, лис, собак, медведей, лосей и барсуков, доставленных из Республики Карелия, ВБ выявлен не был. При исследовании 13 проб головного мозга волков, лис и куницы из Ленинградской области ВБ также не обнаружен. Результаты прямого сэндвич варианта ИФА полностью совпали с результатами РИФ.

Проведенные исследования проб головного мозга, полученных в ходе мониторинга на бешенство в Калининградской области, а также в Ленинградской области и Республике Карелия, показывают возможность использования разработанного нами прямого варианта ИФА для оценки эпизоотической ситуации по бешенству животных.

Разработанный ИФА может также использоваться как альтернативный вариант для диагностики бешенства при исследовании разложившегося материала. Паталогический материал может оказаться непригодным для диагностики методом биопробы на мышах и выделения вируса в культуре клеток

вследствие своей токсичности, а в РИФ при исследовании разложившегося материала чувствительность ниже, чем в ИФА.

3. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Во многих странах мира бешенство остается одной из важнейших проблем ветеринарии. Оральная вакцинация является основным способом борьбы с бешенством в дикой природе. Однако в результате различных нарушений применение антирабических вакцин может быть не всегда эффективно, поэтому мониторинг - важнейшая составляющая программы оральной вакцинации. Он позволяет оценить эпизоотическую обстановку по бешенству в зоне вакцинации, а также эффективность проводимых мероприятий. В связи с этим, целью наших исследований являлась разработка методов, позволяющих оценить качество мероприятий по оральной антирабической вакцинации диких животных и провести диагностический мониторинг по бешенству в зоне вакцинации.

В ходе проведенных исследований получены следующие результаты:

1. Усовершенствован метод отбора и пересылки проб патологического материала с целью диагностики бешенства животных и оценки качества проведения оральной антирабической вакцинации, позволяющий быстро и качественно производить отбор проб головного мозга, крови и костной ткани.

2. Освоен и внедрен в лабораторную практику метод определения тетрациклина в тканях костей и зубов.

3. Разработан непрямой ИФА для определения уровня антител к гликопротеину вируса бешенства в сыворотках крови животных. Чувствительность и специфичность метода составила 90,6% и 80%, соответственно. Проведенные исследования показали возможность использования данного метода в качестве скринингового при оценке эффективности проводимой антирабической вакцинации.

4. Разработан прямой сэндвич-вариант ИФА для обнаружения РНП ВБ в головном мозге животных. Чувствительность и специфичность метода составила 97,14% и 100%, соответственно. Показана возможность использования

разработанного прямого сэндвич-варианта ИФА для проведения диагностического мониторинга на бешенство.

5. С помощью метода определения тетрациаклина в тканях костей и зубов проведена оценка поедаемости оральных антирабических вакцин в ряде регионов. В Калининградской области уровень поедаемости вакцинных приманок за период наблюдения 2007-2010 годы не превысил 52,9%. Общий уровень поедаемости вакцинных приманок в исследованных регионах Российской Федерации в 2009 году составил 28,5%, в Республике Беларусь в 2011 году -59,9%, а в 2012 году - 58,1%.

6. С помощью разработанного ИФА проведен диагностический мониторинг по бешенству в Калининградской, Ленинградской областях и Республике Карелия. В Калининградской области из 146 исследованных проб патологического материала выявлено пять положительных, что составило 3,4%. В Ленинградской области и Республике Карелия ВБ обнаружен не был. Результаты ИФА полностью совпали с результатами РИФ.

Таким образом, в результате проделанной работы поставленные задачи были выполнены. Разработанные в ходе проведенных исследований методы применяются в ФГБУ «ВНИИЗЖ» и в других научных учреждениях и лабораториях ветеринарного профиля.

4 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВБ - вирус бешенства

ВНА - вируснейтрализующие антитела

ИФА - иммуноферментный анализ

МЕ - международная единица

МЭБ - Международное Эпизоотическое Бюро

ОП - оптическая плотность

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РИФ - реакция иммунофлуоресценции

РН - реакция нейтрализации вируса

РНП - рибонуклеопротеин

FAVN - fluorescent antibody virus neutralization test

IgG - иммуноглобулины класса G

RFFIT — rapid fluorescent focus inhibition test

5 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Гулюкин, A.M. Эпизоотологический мониторинг и совершенствование серологического контроля эффективности вакцинопрофилактики бешенства: дис. ... канд. биол. наук. — Казань, 2011. - 216 с.

2. Истомина, М.А. Совершенствование методов диагностики и оценки эффективности вакцинопрофилактики бешенства животных: дис. ... канд. биол. наук. — Щелково, 2011. - 120 с.

3. Background prevalence of tetracycline-like fluorescence in teeth of free ranging red foxes (Vulpes vulpes), striped skunks (Mephitis mephitis) and raccoons (Procyon lotor) in Ontario, Canada. / C.P. Nunan, C.D. Maclnnes, P. Bachmann [et al.] // J. Wildl. Dis. - 1994. - Vol. 30. - P. 112-114.

4. Barton, L.D. Measurement of rabies-specific antibodies in carnivores by an enzyme-linked immunosorbent assay / L.D. Barton, J.B. Campbell // J. Wildl. Dis. -1988. - Vol. 24. - P. 246-258.

5. OIE. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. -Paris, 2013.-Vol. l.-Chap. 2.1.13.

6 СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Анализ иммуногенности вакцин, применяемых для профилактики бешенства животных на территории Российской Федерации / Е.В.Чернышова, Н.А. Назаров, А.Е. Метлин С.С. Рыбаков, А.В.Чепуркин, А.Ю. Сухарьков [и др.] // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. - 2010. - Т. 8. - С. 6473.

2. Анализ эффективности оральной вакцинации против бешенства животных в дикой среде на примере некоторых регионов Российской Федерации /

А.Ю. Сухарьков, H.A. Назаров, А.Е. Метлин [и др.] // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. - 2010. - Т.8. - С. 57-63.

3. Определение скоплений тетрациклина в тканях костей и зубов животных флуоресцентным методом для оценки поедаемости оральных антирабических вакцин / А.Ю. Сухарьков, Е.В. Чернышова, А.Е. Метлин [и др.] // Актуальные проблемы биологии: матер. Всерос. науч.-практ. конф. — 2011. — С. 77-81.

4. Оценка поедаемости оральных антирабических вакцин / А.Ю. Сухарьков, Е.В. Чернышова, А.Е. Метлин [и др.] // Ветеринария. - 2011. -№ 11. —С.31-34.

5. Применение антибиотиков тетрациклинового ряда в качестве биомаркера для контроля поедаемости оральной антирабической вакцины / Е.В. Чернышова, В.В. Михалишин, С.С. Рыбаков, А.Н.Балашов, А.Ю. Сухарьков [и др.] // 29-й Междунар. конгр. биологов-охотоведов: сб. матер. — 2009. — Ч. 2. — С. 35-37.

6. Сухарьков, А.Ю. Диагностика бешенства животных методом иммуноферментного анализа, сравнение прямого и непрямого сэндвич-варианта / А.Ю. Сухарьков, H.A. Назаров, А.Е. Метлин // Ветеринария Кубани. - 2011. -№ 6.-С. 12-14.

7. Сухарьков, А.Ю. Перспективы использования иммуноферментного анализа для оценки эффективности антирабической вакцинации животных / А.Ю. Сухарьков, Е.В. Чернышова, H.A. Назаров // Актуальные вопросы ветеринарной биологии. - 2012. - №2 - С. 34-40.

Подписано в печать 8 октября 2014 г. Формат 60x90 1/16 Усл. печ. л. 1. Тираж 80 экз. Отпечатано на полиграфической базе ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных».