Совершенствование биотехнологии производства питательных сред для культивирования чумного микроба на основе сырья животного и растительного происхождения

Старцева, Ольга Леонидовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Совершенствование биотехнологии производства питательных сред для культивирования чумного микроба на основе сырья животного и растительного происхождения
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Совершенствование биотехнологии производства питательных сред для культивирования чумного микроба на основе сырья животного и растительного происхождения"

На правах рукописи

СТАРЦЕВА ОЛЬГА ЛЕОНИДОВНА

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ БИОТЕХНОЛОГИИ ПРОИЗВОДСТВА ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ЧУМНОГО МИКРОБА НА ОСНОВЕ СЫРЬЯ ЖИВОТНОГО И РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ставрополь - 2005

Работа выполнена в Ставропольском научно-исследовательском противочумном институте

Научный консультант:

доктор медицинских наук Малецкая Ольга Викторовна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Дударь Юрий Александрович

доктор биологических наук Майский Виктор Григорьевич

Ведущая организация:

ФГУП НПО «Питательные среды» Министерства здравоохранения РФ г. Махачкала

Защита диссертации состоится « 3 » октября 2005 года в Ю00 часов на заседании регионального диссертационного совета ДМ 212.256.04 при Ставропольском государственном университете по адресу: 355009, г. Ставрополь, ул. Пушкина, д. 1, корпус 2, аудитория 506.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ставропольского государственного университете по адресу: 355009, г. Ставрополь, ул. Пушкина, д. 1, корпус 1.

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук

Джандарова Т.Н.

[¿ЪЬ£

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Организация эффективного эпиднадзора и предупреждение заболеваемости людей чумой остаются актуальными в настоящее время и осуществляются путем контроля за активностью природных очагов и проведения специфической профилактики этого заболевания.

Для проведения бактериологического исследования носителей и переносчиков возбудителя чумы при обследовании энзоотичных по данной инфекции территорий, а также производства специфических профилактических препаратов требуются качественные чувствительные питательные среды, обеспечивающие потребности роста чумного микроба. Эффективность диагностики чумы и качество бактерийных препаратов во многом определяются полноценностью состава микробиологических сред.

Разработка белковых гидролизатов, как основы для производства питательных сред, до настоящего времени привлекает внимание исследователей. В подавляющем большинстве случаев для научных и коммерческих целей применяют традиционные среды на основе мясного сырья. Условия его переработки с помощью гидролиза оказывают влияние на степень расщепления азотистых веществ. Согласно существующим методикам (Биргер М.О., 1982) гидролиз целесообразно вести в течение 8 -14 дней. В случае массового проведения анализов в период эпидемий или стихийных бедствий, а также при внеплановом увеличении производства бактерийных препаратов, когда требуется дополнительное расходование питательных основ, такой метод ведения гидролиза оказывается неэффективным и трудоемким. Зачастую возникает потребность в ускоренном получении гидролизатов как основ для бактериологических сред.

Культивирование чумного микроба на мясных средах в целом удовлетворяет требования бактериологов. Среды обеспечивают хороший рост при сравнительно небольших посевных дозах, не изменяют основных культуральных и биологических свойств микроорганизмов (Смирнова Г.А. с соавт., 1985; Ахапкина И.Г., 2001). Однако использование мяса в традиционных технологиях приготовления питательных сред увеличивает себестоимость последних, а при производстве бактерийных препаратов -и себестоимость конечного продукта. Поэтому очевидна необходимость поиска более дешевых источников белкового сырья.

устранить риск случайного введения

яММйшАциюняеюяшФсих патогенов (Трош-БИБЛИОТЕКА { СПетсИП" < О*

чзази

кова Г.П. с соавт., 2003). Таким сырьем может служить соя, применение которой, по нашему мнению, в питательных средах является перспективным и экономически обоснованным. Известен опыт использования соевых гидролизатов в качестве основы питательных сред, применяемых для культивирования и диагностики чумного микроба (Домарадский И.В. с соавт., 1961; Трофименко Н.З с соавт., 1963; 1969). Но, несмотря на положительные результаты, такие среды не нашли практического использования. Усовершенствование технологического процесса приготовления соевых гидролизатов и производство на их основе полноценных питательных сред, имеющих низкую себестоимость, является актуальным для практической бактериологии и выполнения производственных задач.

Цель исследования: изучение возможности использования мясных гидролизатов, приготовленных ускоренным способом, и соевых основ при конструировании питательных сред, оценка возможности их использования для культивирования чумного микроба в диагностических целях и при производстве чумной живой вакцины.

Основные задачи исследования:

- изучить возможность проведения ускоренного ферментативного гидролиза мяса с целью использования его при приготовлении питательных сред для чумного микроба;

- разработать технологию получения гидролизатов сои (бобов) и продуктов ее переработки как белковой основы питательных сред для культивирования возбудителя чумы и других микроорганизмов;

- определить физико-химические и биологические свойства белковых гидролизатов, полученных различными видами гидролиза;

- провести сравнительное изучение качества питательных сред на основе мясных и соевых гидролизатов, а также их сочетаний;

- изучить возможность полной или частичной замены мясных гидролизатов соевыми в составе питательных сред, используемых при производстве вакцины чумной живой сухой.

Научная новизна. Впервые предложено при конструировании питательных сред для культивирования чумного микроба использовать гидролизаты мяса, приготовленные ускоренным способом ферментативного расщепления.

Проведен сравнительный анализ соевых гидролизатов, приготовленных ферментативным, кислотным и щелочным способами, по аминокислотному составу, физико-химическим и биологическим свойствам.

На основе сравнительного изучения культуральных, физико-химических свойств и аминокислотного состава предложена технология приготовления питательных сред для культивирования чумного микроба из гидролизатов сои (бобов) и продуктов ее переработки. Оригинальность технологии доказывает патент Российской Федерации на изобретение № 2245362 «Питательная среда для культивирования вакцинного штамма чумного микроба».

На основании сравнительной оценки ростовых качеств различных питательных сред для накопления биомассы чумного микроба показано преимущество использования комбинированных мясных и соевых питательных основ для приготовления питательных сред, предназначенных для получения жизнеспособной биомассы чумного микроба. Оригинальность технологии доказывает патент Российской Федерации № 2241033 «Питательная среда для накопления биомассы вакцинного штамма чумного микроба».

Экспериментально доказана возможность и экономическая целесообразность дальнейшего изучения использования в производстве чумной живой вакцины комбинированных питательных сред на основе ферментативного гидролизата мяса и ферментативного гидролизата сои.

Практическая значимость работы. На основании полученных результатов экспериментальных данных по возможности использования ускоренного типа гидролиза для промышленного изготовления питательных сред подготовлена и утверждена ГИСК им. Л.А. Тарасевича нормативно-техническая документация: ЭПР № 1087-01 и ФСП 42-0397-2610-02 «Питательный агар для культивирования микроорганизмов, готовый к применению (агар Хотгингера); ЭПР № 1088-01 и ФСП 42-0397-2539-02 «Питательный бульон для культивирования микроорганизмов, готовый к применению (бульон Хотгингера); на разработанные препараты получены сертификаты производства № 000049 и № 000050 и регистрационные удостоверения № 003503/01 и № 003504/01 с разрешением их медицинского применения и промышленного выпуска.

Материалы диссертации вошли в «Методические рекомендации по приготовлению питательной среды для культивирования чумного микроба на основе ферментативного гидролизата сои (бобов), контроль ее физико-химических свойств и ростовых качеств», «Методические рекомендации по использованию жидких и плотных питательных сред на основе ферментативных гидролизатов сои (бобов и соевого молока) для культивирования чумного микроба», одобренные ученым советом Став-НИПЧИ (протоколы: № 7 от 16.07.2003; № 4 от 27.04.2005) и утвержденные директором СтавНИПЧИ.

Питательные среды, сконструированные на основе ферментативных гидроли-затов мяса, полученных ускоренным способом, прошли комплексные испытания в Ставропольской государственной медицинской академии, в ЦГСЭН Карачаево-Черкесской республике, на Элистинской противочумной станции, ЦГСЭН в Кабардино-Балкарской республике, ЦГСЭН в Краснодарском крае. Во всех случаях получены положительные заключения, свидетельствующие о возможности применения разработанных сред в диагностических целях.

Питательные среды, приготовленные на соевых основах, прошли комиссионную проверку на ростовые качества в лаборатории-изготовителе (лаборатории питательных сред), в лаборатории диагностических препаратов, лаборатории биолого-технологического контроля СтавНИПЧИ и признаны пригодными для культивирования чумного микроба и других микроорганизмов.

Диссертационная работа выполнена в рамках государственной темы НИР № ГР 01200109084 «Оптимизация технологии получения питательных основ и сред из животного и растительного сырья, используемых для культивирования возбудителей ООИ и других микроорганизмов».

Основные положения, выносимые на защиту

1. Питательные среды, приготовленные на основе мясного ферментативного гидролизата, полученного ускоренным способом, по биологическим показателям равноценны средам из мясных основ, подвергшихся ферментативному гидролизу традиционным методом, а также коммерческим аналогам.

2. Жидкие и плотные питательные среды, сконструированные на основе гид-ролизатов сои, обеспечивают полноценный рост и биохимические реакции возбудителя чумы и микроорганизмов тест-штаммов.

3. Оптимальной по показателю эффективности производственных питательных сред для культивирования чумного микроба является питательная среда, приготовленная из равных частей ферментативных гидролизатов мяса и сои с добавлением сульфита натрия.

конференции «Карантинные и зоонозные инфекции в Казахстане» (Алматы, 2002); научно-практической конференции, посвященной 50-летию НПО «Питательные среды МЗ РФ «Разработки и стандартизация микробиологических питательных сред и тест-систем» (Махачкала, 2003); научно-практической конференции «Естествознание и гуманизм» в честь 170-летия со дня рождения Г.Н. Потанина (Томск, 2005).

Публикации. Основное содержание диссертации, выполненной в рамках НИР, отражено в 17 опубликованных работах (депонированы - 2, в материалах межгосударственных, Всероссийских конференций -13, в патентах РФ на изобретения - 2).

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 158 страницах и состоит из введения, обзора литературы, трех глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 294 источника, в том числе 249 работ отечественных и 45 - зарубежных авторов. Материалы исследований иллюстрированы 18 таблицами и 14 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований. При проведении контроля экспериментальных питательных сред использованы 6 тест-штаммов, предоставленные ГИСК им. JI.A. Тарасовича, и вакцинный штамм чумного микроба Yersinia pestis EV (Y. pestis EV), полученный из коллекционного центра СтавНИПЧИ. Все штаммы обладали типичными для бактерий соответствующего вида морфологическими, культуральными и биохимическими свойствами.

Для получения питательных основ в качестве сырья использовали мясо говяжье (ГОСТ 7269-79, вырезка), бобы сои (ГОСТ 17109-88), пищевой соевый обогатитель (ТУ 9146-027-10126558-98), соевое молоко (ТУ 9146-025-10126558-98). Ферментативные основы мяса (ФГМ(к)) получали по технологии, описанной в регламенте производства № 1542-04 «Вакцина чумная живая сухая» (2004). Кислотные (КГМ) и щелочные (ЩГМ) мясные основы готовили по рецептуре, предложенной Козловым Ю.А. (1950). Ферментативный ускоренный гидролизат мяса (ФГМ(у)), ферментативный гидролизат сои (ФГС), ферментативный гидролизат соевого молока (ФГСМ), ферментативный гидролизат соевых бобов на соевом молоке (ФГСБМ), ферментативный гидролизат соевого обогатителя (ФГСО), а также кислотный (КГС) и щелочной (ЩГС) гидролизаты сои (бобов) получали по разработанной нами технологии. Плотные и жидкие питательные среды на основе полученных гидролизатов готовили по общепринятой методике (Биргер М.О., 1982).

Физико-химические свойства питательных основ и сред (рН, аминный азот, общий азот, хлориды, сухой остаток, прочность студня, температура плавления и за-

студневания, продолжительность плавления) оценивали в соответствии с ФС 42-387499 «Физико-химические, физические и иммунохимические методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов» (М., 1999), «Методическими указаниями по применению физико-химических методов контроля питательных сред» (М., 1977) и МУ 4.1/4.2.588-96 «Методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов, вводимых людям» (М., 1996). Содержание остаточного белка, глюкозы, микроэлементов (ионов калия, натрия, кальция, железа, хлора) в питательных основах определяли на биохимическом анализаторе "Stat-fax" (США), содержание свободных аминокислот изучали на аминокислотном анализаторе 2 ААА-3 (Чехия).

Биологические свойства экспериментальных питательных сред (чувствительность, скорость и эффективность роста изучаемых микроорганизмов, морфология колоний) определяли в соответствии с «Методическими рекомендациями к контролю питательных сред по биологическим показателям» (М., 1980). Иммуногенные свойства субкультур У pestis EV, полученных с использованием предлагаемых питательных сред, изучали на 100 морских свинках и 200 белых мышах, приобретенных в питомнике СтавНИПЧИ (г. Благодарный).

Статистическую обработку результатов проводили на IBM PC 550 с использованием компьютерной обработки программой Excel 7.0 по методам биометрии (Jla-кинГ.Ф., 1990).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

При конструировании питательных сред важным начальным этапом является выбор оптимальных белковых питательных основ, которые во многом определяют качество конечного продукта. Поскольку степень расщепления азотистых веществ зависит от продолжительности гидролиза, мы изучили возможность приготовления ферментативных гидролизатов мяса ускоренным способом в сравнении с классическим ферментным методом ведения гидролиза (8-14 сут) и химическим - с помощью кислот и щелочей.

Сырье (мясо КРС) подвергали гидролизу ферментами поджелудочной железы при температуре 37±1 "С в течение 24; 48 и 72 ч. Процесс ферментации останавливали кипячением при достижении аминного азота 0,5-0,7 %. Полученные основы изучали по физико-химическим свойствам (таблица 1).

По содержанию натрия, железа и хлоридов гидролизаты, приготовленные ускоренным способом, были практически равноценны классическим ферментным основам. По количеству калия уже после 24 ч расщепления ферментативные гидролизаты превосходили кислотные и щелочные основы. Уровень кальция и глюкозы после 48 ч

Таблица 1. Физико-химический состав гидролизатов мяса, приготовленных различными способами

Способ гидролиза Количество серии Контролируемые показатели (М±т)

рн Азот общий, % Азот аминный % Расщепление белка, % К, г/л Ыа, г/л Са, г/л Ре, г/л СГ, г/л Глюкоза, г/л

Ферментативный ускоренный (24 ч) 5 7,4*0,1 0,91±0,01 0,52±0,02 56±1 0,76±0,03 4,65±0,10 0,036±0,001 8,5*0,1 0,49*0,03 1,13*0,04

Ферментативный ускоренный (48 ч) 5 7,2*0,1 0,99*0,02 0,61*0,01 60*1 0,74*0,04 4,70*0,9 0,034*0,001 8,4*0,3 0,49*0,02 1,19*0,02

Ферментативный ускоренный (72ч) 5 7,2*0,1 1,08*0,01 0,71*0,01 65±1 0,79*0,02 4,77*0,11 0,039±0,001 8,6*0,1 0,50*0,02 1,14*0,01

Ферментативный классический (14сут) 4 7,3*0,2 1,31*0,03 0,92*0,05 70*2 0,81*0,03 4,82*0,15 0,038*0,002 8,7*0,2 0,50*0,06 1,13*0,02

Кислотный 4 7,0*0,2 0,98*0,09 0,55*0,04 55±2 0,75*0,02 5,51*0,11 0,034*0,001 7,2*0,4 0,92*0,07 1,19*0,03

Щелочной 4 7,5*0,1 1,09*0,03 0,49*0,04 47*5 0,66*0,01 3,63±0,13 0,028*0,004 5,4*0,1 0,42*0,02 1,11*0,01

ферментации был равен показателям кислотных гидролизтов. Поскольку только лишь по физико-химическим показателям нельзя судить о преимуществе способа гидролиза, мы изучили биохимический состав мясных основ, подвергшихся различным способам гидролитического процесса.

Изучение качественного и количественного аминокислотного состава позволило во всех основах установить наличие 16 аминокислот: аспарагиновой и глютамино-вой кислоты, треонина, серина, пролина, глицина, аланина, валина, метионина, изо-лейцина, лейцина, тирозина, фенилаланина, гистидина, лизина, аргинина. Количественный уровень аминокислот зависел от типа проведенного гидролиза. В ферментативных гидролизатах по сравнению с кислотными и щелочными, было выше содержание большинства аминокислот, тогда как ферментативные гидролизаты, приготовленные ускоренным способом, по общему содержанию выявленных аминокислот уступали классическим в 1,2 раза. Тем не менее, они содержали все выделенные аминокислоты, характерные для классических ферментативных основ (рисунок 1).

I-

К Ж

Асп Тре Сер Глю Про Гли Ала Вал Мет Изо Лей Тир Фен Гис Лиз Apr

Аминокислоты

-ФГМ - - - ФГМ(у)72 ч

Рисунок 1. Аминокислотный состав ФГМ(к) и ФГМ(у) 72 ч

По количеству пролина (5,02±0,1 г/л), валина (7,81 ±1,7 г/л), метионина (2,1 ±0,3 г/л) и изолейцина (3,72±0,12 г/л) ускоренные ферментативные гидролизаты (72 ч) были равнозначны классическим. Содержание лейцина и лизина в них было также достаточно высоким и составляло соответственно 7,2±0,9 г/л и 7,54±0,23 г/л, а по коли-

честву аспарагиновой кислоты (4,42±0,01 г/л), тирозина (1,9±0,03 г/л), фенилаланина (2,3±0,05 г/л), аланина (5,36±1,2 г/л), глицина (5,01±1,01 г/л) и пролина (5,02±1,4 г/л) они превосходили кислотные и щелочные гидролизаты. Кислотные гидролизаты мяса по большинству количественных показателей аминокислот превосходили щелочные, но в них было ниже, чем в щелочных содержание глютаминовой кислоты и валина.

Из полученных основ готовили агар и бульон Хоттингера, pH 7,3±0,2 (Биргер М.О., 1982). Каждую серию изучаемых гидролизатов предварительно разводили дистиллированной водой до конечного показания аминного азота 0,14±0,03 %. Оценку качества сред по биологическим показателям (чувствительность, скорость роста, образование пигментов, индола) проводили с помощью набора тест-штаммов: для контроля бульона Хоттингера - Shigella ßexneri 1 а 8516 (Sh flexneri 1 а 8516); Corynebakterium xerosis 1911(C. xerosis 1911); Streptococcus pyogenes Dick!(St. pyogenes Dick 1); Yersinia pestis EV (Y pestis EV); агара Хоттингера - Shigella sonnei "S -form"(Sh sonnei "S-form"); Sh flexneri la 8516; Serratia marcescens 1(S marces-cens 1); Pseudomonas aeruginosa 27/99 (Ps aeruginosa 27/99); Y. pestis EV.

Анализируя полученные данные экспериментов, проведенных на твердых питательных средах, отмечена максимальная чувствительность агаров, приготовленных на основе ферментативных гидролизатов. Следует отметить, что использование гидролизатов, приготовленных ускоренным способом ферментации, равноценно применению основ, подвергшихся классическому ферментативному процессу. Среды на основе ФГМ(к) и ФГМ(у) обеспечивали количественно больший рост исследуемых тест-штаммов: Sh. flexneri 1 а 8516 и Sh. sonnei "S-form" через 22±2 ч инкубации вырастали в виде бесцветных, прозрачных, круглых колоний диаметром 1,0-2,0 мм в количестве 46±0,6 и 43±0,1 от засеянной дозы; Ps aeruginosa 27/99 и S marcescens 1 образовывали 46±0,4 и 46±0,3 пигментированных колоний диаметром 2,0-2,5 мм через 22±2 ч инкубации при температуре 37±1 и 22±2 °С соответственно. Рост вакцинного штамма Y. pestis EV наблюдали через 46±2 ч инкубации при температуре 27±1 °С в количестве 56±0,1 колоний диаметром 1,5-2,0 мм в R-форме с бурым зернистым центром и кружевной зоной на периферии. Жидкие питательные среды, независимо от используемой питательной основы, обеспечивали характерный рост исследуемых микроорганизмов.

Таким образом, мясные ферментативные гидролизаты, полученные ускоренным способом, наравне с основами, приготовленными обычным методом, в составе жидких и плотных питательных сред, обеспечивали высокие показатели роста для всех изучаемых штаммов с сохранением характерных биохимических реакций. Кроме

того, ферментативные ускоренные основы не требуют длительного «созревания» и могут быть использованы для культивирования патогенных микробов, в том числе возбудителя чумы, сразу после изготовления.

Данные сравнительных экспериментов, проведенных с коммерческими аналогами агара и бульона Хотгингера - сухого питательного агара (СПА) и сухого питательного бульона (СПБ) (НПО «Питательные среды» г. Махачкала); МПА-агара и МПБ-бульона (АООТ «Биомед» им. И.И. Мечникова); питательного агара и питательного бульона на основе коммерческой белковой основы - Бактофок-МК (НПЦ «Гидробиос») показали, что по ростовым свойствам все экспериментальные серии агара Хотгингера не отличались от коммерческих препаратов. Морфология колоний культивируемых микроорганизмов и характер образования пигмента тест-штаммами также были сходными при росте на всех изучаемых средах. Бульон Хотгингера обеспечивал равноценный с коммерческими жидкими средами рост изучаемых бактерий и проявление ими характерных биохимических реакций (индолообразование Аехпеп 1а 8516).

Традиционными для культивирования возбудителя чумы являются питательные среды на основе белков животного происхождения, чаще всего - мяса. Тем не менее, белки растений представлены необычайно большим числом компонентов с различным аминокислотным составом, который в совокупности представляет собой эталон сбалансированности белка в отношении незаменимых аминокислот (Кретович В.Л., 1975). Поскольку целью нашей работы было изучение возможности замены мясных основ более дешевыми - растительными при конструировании питательных сред, важным разделом исследований явился подбор оптимального растительного белкового сырья. Среди разнообразия растительных продуктов нами выбрана соя, как культура, богатая белками (35-55 %), витаминами и микроэлементами. По разработанной нами технологии получены ферментативный гидролизат сои (бобов) (ФГС), ферментативный гидролизат соевого молока (ФГСМ), ферментативный гидролизат соевых бобов на соевом молоке (ФГСБМ), ферментативный гидролизат соевого обогатителя (ФГСО), кислотный гидролизат сои (бобов) (КГС), щелочной гидролизат сои (бобов) (ЩГС). Анализ их физико-химических свойств показал, что ферментативные гидролизаты сои и продуктов ее переработки имеют несомненное преимущество перед питательными основами, полученными кислотным и щелочным способами (таблица 2).

Таблица 2. Физико-химические показатели соевых гидролизатов, полученных различными способами

Образец гидроли-зата рн Аминный азот, % Белок, г/л Глюкоза, г/л К, г/л N8, г/л Са, г/л Ре, г/л СГ, г/л

ФГС 7,2*0,2 0,88*0,03 7,6*0,2 0,84*0,02 0,75±0,01 5,40*0,25 0,27*0,02 1,61*0,15 0,53*0,07

ФГСМ 7,2*0,2 0,74±0,04 12,3±0,1 0,92±0,03 0,75*0,02 5,50±0,19 0,01*0,001 1,16*0,12 1,01*0,04

ФГСБМ 7,3±0,1 0,86*0,03 22,5±0,5 1,2*0,4 0,70±0,01 5,38±0,22 0,02*0,001 1,69*0,09 0,88*0,06

ФГСО 7,1*0,1 0,52±0,02 15,2*0,2 0,22*0,01 0,44±0,02 4,55±0,31 0,24*0,01 1,14*0,11 0,52*0,03

КГС 7,2*0,4 0,043*0,001 17,0*0,1 0,89±0,04 0,36*0,02 3,82±0,14 ОД 4*0,01 1,10*0,2 3,51*0,05

ЩГС 7,5±0,1 0,043±0,001 8,2*0,2 0,13±0,02 0,45±0,02 4,44*0,20 0,19*0,01 1,11*0,2 0,09*0,01

В результате аминокислотного анализа в составе всех полученных соевых основ обнаружено наличие 16 аминокислот: аспарагиновой и глготаминовой кислот, треонина, серина, глицина, пролина, аланина, валина, метионина, изолейпина, лейцина, тирозина, фенилаланина, гистидина, лизина и аргинина. Однако их количество было различным и зависело от типа проведенного гидролиза. Химические гидролизаты по количественному составу аминокислот значительно уступали всем ферментативным. Исключение составлял аргинин, количество которого (2,09±0,03 г/л) в ЩГС превосходило содержание во всех ферментативных гидролизатах.

Во всех соевых основах отмечено преобладание глютаминовой кислоты, содержание которой в ФГСБМ достигло 9,61 ±0,72 г/л. По содержанию дефицитных в растительных белках аминокислот - лизину и метионину, данный вид гидролизата также превосходил другие соевые ферментные основы.

Ферментативный гидролизат сои содержал лизина 2,67±0,24 г/л, в его составе доминировали глютаминовая (6,46±0,07 г/л) и аспарагиновая (4,6±0,03 г/л) кислоты, а также изолейцин (3,92±0,11 г/л) и лейцин (3,17±0,14 г/л), но количество метионина было минимальным и составляло 0,15±0,02 г/л.

ФГСО по количеству почти всех определяемых аминокислот значительно уступал другим ферментативным основам сои. Только содержание тирозина (0,7±0,08 г/л) и аргинина (1,31±0,06 г/л) в нем было выше, чем в ФГС.

Качественно ферментативные гидролизаты соевых продуктов и мяса практически равноценны, но в количественном отношении различия более существенны.

Мясные гидролизаты превосходят соевые по содержанию большинства аминокислот (рисунок 2), (г/л, треонин 6,11±0,3; серии 7,82±2,3; глицин 6,67±1,4; аланин 7,67±2,4; валин 7,81±1,9; лейцин 8,91±1,0; тирозин 2,15±0,09), но значительно уступают по содержанию аспарагиновой 4,43±0,02 и глютаминовой 6,01±0,11 кислот; метионина 2,37±0,8; изолейцина 3,85±0,9; гистидина 1,12±0,03; аргинина 1,13±0,02. По содержанию глютаминовой кислоты данный вид гидролизата превосходит мясной в 1,6 раза. Очевидно, что при объединении соевых и мясных гидролизатов, аминокислотный состав и в качественном, и в количественном отношениях взаимно дополняются, что позволяет сделать питательную основу более сбалансированной.

Для установления количественного соотношения гидролизатов мяса и сои, оптимального для развития чумного микроба, проводили смешивание гидролизатов в соотношениях 1:1; 1:2; 2:1 соответственно. На полученных основах готовили плотные среды с аминньгм азотом 0,14±0,03 % с добавлением сульфита натрия (0,4 г/л) или липоевой кислоты (0,5 г/л). По ростовым качествам оптимальной была питательная

Асп Тре Сер Глю Про Гли Ала Вал Мет Изо Лей Тир Фен Гис Лиз Apr

Аминокислоты

—ФГМ — —ФГСБМ

Рисунок 2. Аминокислотный состав ФГМ и ФГСБМ

среда, приготовленная из ферментативных гидролизатов сои и мяса, взятых в равных объемах. Данная среда обеспечивала через 46±2ч инкубации рост Y. pes lis EV в количестве 78,1 ±7,0 колоний диаметром 2,2 мм с хорошо выраженной кружевной зоной, сохраняющейся в течение 5 суток (срок наблюдения).

Изучение биологических свойств химических гидролизатов сои в составе питательных сред показало, что жидкие питательные среды на основе ЩГС и КГС с добавлением сульфита натрия обеспечивали агтлютинабельный рост вакцинного штамма чумного микроба с рыхлым осадком на дне пробирки. Плотные питательные среды, приготовленные на основе ЩГС, обеспечивали качественный рост чумного микроба в количестве 57±2 колоний диаметром 1,0-2,0 мм.

Положительные результаты применения гидролизатов сои при производстве питательных сред для культивирования чумного микроба позволили нам продолжить работу по изучению гидролизатов из соевых белков, содержащихся в продуктах переработки сои - соевом молоке и соевом обогатителе. На полученных основах готовили жидкие и плотные питательные среды, в том числе с добавлением стимуляторов (сульфита натрия и липоевой кислоты). Биологический контроль питательных сред проводили с помощью вакцинного штамма чумного микроба. Полученные данные (таблица 3) свидетельствуют, что оптимальными были среды, приготовленные на

Таблица 3. Результаты биологического контроля ростовых свойств плотных питательных сред, приготовленных на ферментативных основах

продуктов переработки сои

№ п/п Наименование питательной среды Количество серий Количество колоний а, мм Характер роста

1 Агар на основе ФГСМ без добавок 5 19,2±2,1 до 1 мм Мелкие колонии с отсутствием кружевной зоны

2 Агар на основе ФГСМ с сульфитом натрия 5 55,4±3,5 2,0 Колонии в Я-форме с крупной кружевной зоной, сохраняющейся в течение 5 суг на всех колониях

3 Агар на основе ФГСМ с сульфитом натрия и липоевой кислотой 5 60,0±3,0 2,0 Тоже

4 Агар на основе ФГСМ с липоевой кислотой 5 78,0±1,0 2,2 То же

5 Агар на основе ФГСБМ без добавок 5 30,4±3,2 до 1 мм Мелкие колонии с узкой, нежной кружевной зоной

6 Агар на основе ФГСБМ с сульфитом натрия 5 77,4±2,1 2,2 Колонии в Я-форме со светлой, нежной кружевной зоной, сохраняющейся в течение 5 сут на всех колониях

7 Агар на основе ФГСБМ с сульфитом натрия и липоевой кислотой 5 77,3±1,3 2,2 Тоже

8 Агар на основе ФГСБМ слипоевой кислотой 5 78,1±1,0 гл То же

9 Агар на основе ФГСО без добавок 5 — — Роста нет

10 Агар на основе ФГСО с сульфитом натрия 5 55,2±3,0 до 1,5 Колонии в Я-форме, очень мелкие, со слабо выраженной кружевной зоной, сохраняющейся в течение 5 сут на всех колониях

И Агар на основе ФГСО с сульфитом натрия и липоевой кислотой 5 59,1 ±2,2 1,5 Колонии в Я-форме, с кружевной зоной, сохраняющейся в течение 5 сут на всех колониях

12 Агар на основе ФГСО с липоевой кислотой 5 Роста нет

13 Агар Хоттингера без добавок (контроль) 1 25,0±1,5 1 мм Мелкие колонии с узкой, нежной кружевной зоной

14 Агар Хоттингера (контроль) 1 62,1±1,2 1,3 Колонии в Я-форме, со светлой кружевной зоной, сохраняющейся через 48 ч у некоторых колоний

Обозначения: (—) - рост отсутствует; (<1) - диаметр колоний

комбинированной соевой основе (ФГСБМ) с добавлением стимуляторов, которые обеспечивали в среднем рост 77,4 % из 100 посеянньгх м.к., колонии диаметром 2,2 мм с ярко-выраженной кружевной зоной, сохраняющейся в течение 5 сут. Кроме того, отмечено, что на данных средах формирование колоний происходило на 3 ч раньше, чем на других соевых средах.

Изучение ростовых качеств жидких питательных сред, приготовленных на ферментативных основах соевого молока и соевого обогатителя, а также на комбинированной соевой основе (ФГСБМ), показало, что данные среды с добавлением стимуляторов роста обеспечивали рост Y. pestis EV при посевной дозе 10"' , 10"6 через 46±2 ч при температуре 27±1 °С в виде взвешенных хлопьев в прозрачном бульоне с рыхлым осадком на дне пробирки. На бульонах, приготовленных с использованием ферментативного гидролизата соевого молока, агглютинабельный рост наблюдался уже через 24 ч, что на 24 ч раньше начала роста на бульоне Хоттингера. Кроме того, ростовые качества питательных сред стабильно сохранялись и улучшались в процессе хранения соевых основ (2 года срок наблюдения).

В процессе изучения образования пигментов на плотных средах, включающих в качестве основы исследуемые соевые гидролизаты, было выявлено, что наиболее интенсивно сине-зеленый _ пигмент Ps aeruginosa 21/99 и розово-красный S. marces-cens 1 продуцировали на средах, приготовленных с использованием ФГС, ФГСМ и ФГСБМ. Несколько менее выражено - при использовании ФГСО в качестве основы питательной среды.

Поскольку использование сои позволяет значительно снизить затраты на производство питательных сред для культивирования чумного микроба, мы изучили также возможность использования соевых сред в качестве накопительных для Y. pestis EV. Тест-пггамм выращивали на 3 % плотных средах, с добавлением сульфи-4 та натрия, приготовленных на основе ФГС, а также комбинированных из ФГС и ФГМ

в соотношениях 1:2; 1:1; 2:1. Контролем служил 3 % агар Хоттингера. Культивирование вакцинного штамма чумного микроба проводили согласно требованиям регламента производства вакцины чумной живой сухой, используя культуру второй генерации. Посевная доза составляла 1х106 м.к на 1 мл питательной среды. Посевы инкубировали при температуре 27±1 'С в течение 46±2 ч.

Выход биомассы вакцинного штамма чумного микроба на среде, приготовленной с использованием ФГС, составил (6,2±0,2)х109 м.к./мл с жизнеспособностью 35,6±0,8 % в то время как на контрольной среде при выходе биомассы

(8,2±0,2)х109 м.к./мл жизнеспособными было 38,8±0,7 % клеток. На питательной среде, приготовленной с использование двух частей ФГМ и одной части ФГС, сбор биомассы составил (9,0±0,1)х109 м.к./мл с жизнеспособностью 36,7±0,4 %. Наиболее интенсивное накопление бактериальной массы наблюдалось на среде, приготовленной из равных объемов основ сои и мяса, где выход биомассы составил (10,2±0,3)х109 м.к./мл, что в 1,25 раза превышало результаты контроля. Максимальное число живых микробных клеток составило 56,1±0,8 %, что в 1,45 раз выше жизнеспособности биомассы, выращенной на агаре Хоттингера.

Иммуногенносгь биомассы чумного микроба является основным тестом, определяющим качество конечного проекта в вакцинном производстве. Для оценки им-муногенности использовали 100 морских свинок и 200 белых мышей, которых иммунизировали субкультурой вакцинного штамма ЕВ, выращенной на плотных средах, изготовленных из ФГС, ФГМ, а так же из комбинации ФГС и ФГМ, взятых в соотношении 1:1. Оценку иммуногенности изучаемых препаратов проводили по ЕД50 Морских свинок иммунизировали путем введения в паховую область подкожно 0,5 мл взвеси в дозах 40, 200, 1000 и 5000 м.к; белых мышей - 0,2 мл взвеси в дозах 200, 1000, 5000 и 2500 м.к. На 21 сут после вакцинации животных обеих групп заражали культурой вирулентного штамма Y. pestis 461. Наблюдение за зараженными животными вели в течение 21 сут. Погибших в течение этого срока и выживших животных вскрывали, изучали патоморфологическую картину. Роста чумного микроба из посевов крови и легких не наблюдалось ни в одном случае. Результаты исследования показали, что ЕД5о независимо от используемой питательной основы во всех экспериментальных сериях не превышала для морских свинок 1000 живых микробных клеток, для белых мышей - 10000 живых микробных клеток.

Таким образом, показано, что по критерию иммуногенности чумного микроба представляется возможным использование комбинированных питательных сред при производстве живой чумной вакцины. Разработаны технологические процессы приготовления питательных основ и сред из растительного сырья - сои и продуктов ее переработки. Получены сравнительные данные о физико-химических и биологических свойствах полноценных по составу белковых соевых гидролизатов, которые могут быть использованы при конструировании бактериологических сред. Доказана эффективность применения данных основ в составе плотных и жидких питательных сред для культивирования различных микроорганизмов, в том числе возбудителя чумы.

ВЫВОДЫ

1. Ферментативные гидролизаты мяса, приготовленные ускоренным способом, через 72 ч равноценны мясным основам, полученным классическим методом, при использовании их для конструирования микробиологических сред.

2. Соевые питательные основы по качественному составу химических веществ, микроэлементов и аминокислот идентичны мясным основам, но уступают им в количественном соотношении. Общее количество в них микроэлементов (калия, натрия, кальция, железа и хлоридов) на 2 % меньше, чем в мясных. Содержание аспарагиновой и глютаминовой кислот, изолейцина, гистидина и аргинина в соевых основах было на 40 % выше, чем в мясных.

3. Ферментативные гидролизаты сои и продуктов ее переработки превосходят химические соевые основы по количеству большинства физико-химических и биохимических показателей. Содержание в них калия, натрия и железа на 25 % выше, чем в кислотных и щелочных соевых гидролизатах, но в последних количество хлоридов больше на 18 %. По общему содержанию аминокислот химические соевые гидролизаты на 57 % уступали ферментативным, а по количеству аргинина, превосходили их на 20 %.

4. Питательная среда, приготовленная из равных частей ферментативных гидролизатов мяса и сои, обеспечивает выход биомассы чумного микроба, обладающую жизнеспособностью клеток выше на 34 % по сравнению со средой, имеющей в составе один из указанных гидролизатов.

5. Питательные среды, полученные на основе щелочных гидролизатов сои (бобов), себестоимость которых ниже ферментативных, в отличие от сред из щелочных гидролизатов мяса, обеспечивают полноценное прорастание единичных клеток вакцинного штамма чумного микроба без добавления стимуляторов.

6. Среды, сконструированные на комбинированной соевой основе - соя (бобы) на соевом молоке, обеспечивают характерный рост возбудителя чумы на 21 % выше, чем среды на основе сои (бобов) или продуктов ее переработки.

7. В процессе хранения ферментативных соевых гидролизатов происходит нарастание аминного азота в среднем на 12 % после двух лет хранения и увеличение pH от 7,1 до 7,4 ед, что способствует улучшению ростовых качеств приготовленных из них питательных сред.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Катунина JI.C., Гавристова И.А., Смирнова Е.Б., Тюменцева И.С., Проскурина В.А., Старцева O.J1., Жарникова И.В. К вопросу об изучении свойств питательного

агара для культивирования микроорганизмов,- Ставрополь,- 2000,- 13 с,- Деп. в ВИНИТИ 11.08.00, № 2239-ВОО.

2. Катунина JI.C., Гавристова И.А., Смирнова Е.Б., Тюменцева И.С., Проскурина В.А., Старцева O.JI., Жарникова И.В. К вопросу об изучении свойств питательного бульона (жидкого) для культивирования микроорганизмов,- Ставрополь,- 2000,- 10 с,-Деп. в ВИНИТИ 11.08.00, № 2238-ВОО.

3. Смирнов С.Е., Старцева О.Л. Содержание белка в соевых продуктах // Мат. VIII итоговой науч. конф. молодых ученых и студентов,- Ставрополь,- 2000.- С. 225.

4. Катунина JT.C., Смирнова Е.Б., Старцева O.JI., Проценко C.JI., Борздова И.Ю. Влияние концентрации сульфита натрия на сбор биомассы вакцинного штамма чумного микроба штамма ЕВ // Матер. 3-й Междунар. науч.-практ. конф. «Актуал. вопросы разработки и производства диагностических питательных сред и тест-систем». -Махачкала.- 2001.- С. 66.

5. Старцева O.JI., Смирнова Е.Б., Катунина Л.С., Проценко С.Л., Борздова И.Ю. К вопросу о технологии изготовления белковых питательных основ // Матер. 3-й Междунар. науч.-практ. конф. «Актуал. вопросы разработки и производства диагностических питательных сред и тест-систем». - Махачкала,- 2001.- С. 7.

6. Смирнова Е.Б., Старцева О.Л., Катунина Л.С., Проценко С.Л., Борздова И.Ю. Использование растительного сырья в питательных основах // Матер. 3-й Междунар. науч.-практ. конф. «Актуал. вопросы разработки и производства диагностических питательных сред и тест-систем». - Махачкала,- 2001.- С. 8.

7. Катунина Л.С., Смирнова Е.Б., Старцева О.Л., Борздова И.Ю. Оценка ростовых качеств питательных бульонов на рост чумного микроба штамма ЕВ // Карантинные и зоонозные инфекции в Казахстане: Сб. науч. работ,- Алматы,- 2001,- Вып. 4,-С. 307-309.

8. Старцева О.Л., Катунина Л.С., Смирнова Е.Б., Чурикова Н.В., Головнева С.И. Сравнительная оценка ростовых свойств питательных сред, приготовленных из различных белковых основ // Матер, юбил. науч.-практич. конф. «Эпидемиологическая безопасность на Кавказе. Итоги и перспективы»,- Ставрополь,- 2002,- С. 254-255.

9. Старцева О.Л., Смирнова Е.Б., Катунина Л.С., Головнева С.И. Влияние уровня аминного азота мясных основ на показатели сухого остатка питательных сред // Матер, юбил. науч.-практич. конф. «Эпидемиологическая безопасность на Кавказе. Итоги и перспективы».- Ставрополь.- 2002.- С. 255-257.

10. Катунина Л.С., Смирнова Е.Б., Старцева О.Л., Головнева С.И., Борздова И.Ю. Оценка ростовых качеств питательных агаров на рост чумного микро-

ба при введении липоевой кислоты // Матер, юбил. науч.-практич. конф. «Эпидемиологическая безопасность на Кавказе. Итоги и перспективы»,- Ставрополь.- 2002.-С. 120-121.

11. Смирнова Е.Б., Старцева О.Л., Катунина Л.С., Головнева С.И., Чурикова Н.В. Оценка качества бульона Хоттингера в зависимости от сроков хранения // Матер, юбил. науч.-практич. конф. «Эпидемиологическая безопасность на Кавказе. Итоги и перспективы».- Ставрополь.- 2002,- С. 243-244.

12. Старцева О.Л., Катунина Л.С., Смирнова Е.Б., Головнева С.И. Разработка технологии приготовления плотной питательной среды на основе ферментативного гидролизата сои (бобов) для роста чумного микроба // Матер. 4-й Междунар. науч.-практич. конф. «Разработки и стандартизация микробиологических питательных сред и тест-систем».- Махачкала.- 2003.- С. 36.

13. Катунина Л.С., Старцева О.Л., Смирнова Е.Б., Головнева С.И. Разработка производственной питательной основы для культивирования чумного микроба // Матер. 4-й Междунар. науч.-практич. конф. «Разработки и стандартизация микробиологических питательных сред и тест-систем».- Махачкала.- 2003,- С. 37.

14. Старцева О.Л., Катунина Л.С., Смирнова Е.Б., Головнева С.И. Экономический эффект применения соевых питательных основ // Матер. 4-й Междунар. науч.-практич. конф. «Разработки и стандартизация микробиологических питательных сред и тест-систем»,- Махачкала,- 2003.- С. 41.

15. Патент РФ № 2241033 С 12 1/20, С 12 О 1/04. Питательная среда для накопления биомассы вакцинного штамма чумного микроба / Смирнова Е.Б., Катунина Л.С., Старцева О.Л., Смирнов С.Е., Головнева С.И., Борздова И.Ю., Бор-здов А.А. - Заявка № 2002133825; Заявлено 15.12.2002; Зарегистрирован в Гос. реестре изобретений РФ 27.11.2004, Бюл. № 33.

16. Патент РФ № № 2245362 С 12 1/20, С 12 <} 1/04. Питательная среда для культивирования вакцинного штамма чумного микроба / Смирнова Е.Б., Катунина Л.С., Старцева О.Л., Смирнова С.Е., Головнева С.И. - Заявка № 2002133824; Заявлено 15.12.2002; Зарегистрирован в Гос. реестре изобретений РФ 27.01.2005, Бюл. №3.

17. Старцева О.Л. Характеристика ферментативного гидролизата соевого молока - новой основы микробиологических питательных сред // Естествознание и гуманизм: Сб. науч. работ,- Т. 2.- № 1,- Томск, 2005,- С. 48.

Печать офсетная. Бумага офсетная. Формат 60x84/16 Физ. печ. л.-1,3 Усл. печ. л.-1,2 Заказ 445 Тираж-100 Отпечатано в цехе оперативной полиграфии краевого комитета государственной статистики г. Ставрополь, ул. Пушкина,4

•156 71

РНБ Русский фонд

2006-4 12368

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Старцева, Ольга Леонидовна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1 СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ПРОБЛЕМЫ ПРОИЗВОДСТВА ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ).

1.1 Среды на основе сырья животного происхождения и их использование при культивировании чумного микроба.

1.2 Растительное сырье как основа питательных сред.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1 Материалы исследования.

2.1.1 Штаммы микроорганизмов.

2.1.2 Реактивы, сырье.

2.1.3 Питательные среды.

2.1.4 Лабораторные животные.

2.2 Методы исследования.

2.2.1 Получение питательных сред.

2.2.2 Методы получения питательных основ.

2.2.3 Методы физико-химического контроля

2.2.4 Методы биологического контроля

2.3 Методы статистической обработки материала.

ГЛАВА 3 СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД НА ОСНОВЕ ЖИВОТНОГО

СЫРЬЯ.

3.1 Разработка ускоренного способа приготовления ферментативных мясных гидролизатов.

3.2 Сравнительная характеристика мясных основ, полученных ускоренным способом ферментации, в сравнении с классическим ферментативным и химическим видами гидролиза.

3.2.1 Определение физико-химических свойств питательных основ.

3.2.2 Аминокислотный состав кислотных, щелочных и ферментативных гидролизатов.

3.3 Качественная оценка питательных сред, приготовленных на основе кислотных, щелочных и ферментативных гидролизатов мяса

3.3.1 Характеристика сред по биологическим показателям.

3.3.2 Оценка качества сред по пигменто- и индолообразованию тест-штаммов

3.4 Сравнительная оценка качества полученных питательных сред с коммерческими аналогами.

ГЛАВА 4 ИЗУЧЕНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ СОИ ДЛЯ КОНСТРУИРОВАНИЯ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ СРЕД.

4.1 Определение свойств соевых питательных основ.

4.1.1 Физико-химические показатели полученных гидролизатов.

4.1.2 Аминокислотный состав соевых гидролизатов.

4.2 Разработка технологии приготовления питательных сред для культивирования чумного микроба на основе соевых гидролизатов

4.2.1 Сравнительное изучение ростовых качеств питательных сред, приготовленных с использованием ферментативного гидролизата сои (бобов).

4.2.2 Оценка ростовых качеств питательных сред, приготовленных из щелочных и кислотных гидролизатов сои (бобов).

4.2.3 Оценка ростовых качеств питательных сред, приготовленных на ферментативной основе продуктов переработки сои.

4.2.4 Оценка качества соевых сред по пигменто- и индолообразованию тест-штаммов.

4.3 Биохимические свойства чумного микроба при культивировании его на основе соевых питательных сред.

4.4 Оценка сохранения качества плотных питательных сред при хранении соевых основ.

ГЛАВА 5 ИЗУЧЕНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД НА ОСНОВЕ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ ГИДРОЛИЗАТОВ СОИ ПРИ ПРОИЗВОДСТВЕ ЧУМНОЙ ВАКЦИНЫ.ЛОЗ

5.1 Использование питательных сред, приготовленных на ферментативных основах сои (бобов), в качестве накопительных при культивировании вакцинного штамма чумного микроба.

5.2 Изучение иммуногенных свойств вакцинного штамма чумного микроба, выращенного на соевых средах.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Совершенствование биотехнологии производства питательных сред для культивирования чумного микроба на основе сырья животного и растительного происхождения"

Разработка белковых гидролизатов, как основы для производства питательных сред, до настоящего времени привлекает внимание исследователей. В подавляющем большинстве случаев для научных и коммерческих целей применяют традиционные среды на основе мясного сырья. Условия его переработки с помощью гидролиза оказывают влияние на степень расщепления азотистых веществ. Согласно существующим методикам [25] гидролиз целесообразно вести в течение 8-14 дней. В случае массового проведения анализов в период эпидемий или стихийных бедствий, а также при внеплановом увеличении производства бактерийных препаратов, когда требуется дополнительное расходование питательных основ, такой метод ведения гидролиза оказывается неэффективным и трудоемким. Зачастую возникает потребность в ускоренном получении гидролизатов как основ для бактериологических сред.

Культивирование чумного микроба на мясных средах в целом удовлетворяет требования бактериологов. Среды обеспечивают хороший рост при сравнительно небольших посевных дозах, не изменяют основных культу-ральных и биологических свойств микроорганизмов [7, 187]. Однако использование мяса в традиционных технологиях приготовления питательных сред увеличивает себестоимость последних, а при производстве бактерийных препаратов - и себестоимость конечного продукта. Поэтому очевидна необходимость поиска более дешевых источников белкового сырья.

В последние годы при производстве биопрепаратов возрос интерес к растительному белку, источником которого является доступное и недорогое сырье. Кроме того, использование гидролизатов растений, как основы питательных сред, позволяет устранить риск случайного введения животных или человеческих патогенов [216]. Таким сырьем может служить соя, применение которой, по нашему мнению, в питательных средах является перспективным и экономически обоснованным. Известен опыт использования соевых гидролизатов в качестве основы питательных сред, применяемых для культивирования и диагностики чумного микроба [64, 212, 213]. Но, несмотря на положительные результаты, такие среды не нашли практического использования. Усовершенствование технологического процесса приготовления соевых гидролизатов и производство на их основе полноценных питательных сред, имеющих низкую себестоимость, является актуальным для практической бактериологии и выполнения производственных задач.

Основные задачи исследования:

Научная новизна. Впервые предложено при конструировании питательных сред для культивирования чумного микроба использовать гидроли-заты мяса, приготовленные ускоренным способом ферментативного расщепления.

Практическая значимость работы. На основании полученных результатов экспериментальных данных по возможности использования ускоренного типа гидролиза для промышленного изготовления питательных сред подготовлена и утверждена ГИСК им. JI.A. Тарасевича нормативно-техническая документация: ЭПР № 1087-01 и ФСП 42-0397-2610-02 «Питательный агар для культивирования микроорганизмов, готовый к применению (агар Хоттингера); ЭПР № 1088-01 и ФСП 42-0397-2539-02 «Питательный бульон для культивирования микроорганизмов, готовый к применению (бульон Хоттингера); на разработанные препараты получены сертификаты производства № 000049 и № 000050 и регистрационные удостоверения № 003503/01 и № 003504/01 с разрешением их медицинского применения и промышленного выпуска.

Материалы диссертации вошли в «Методические рекомендации по приготовлению питательной среды для культивирования чумного микроба на основе ферментативного гидролизата сои (бобов), контроль ее физико-химических свойств и ростовых качеств», «Методические рекомендации по использованию жидких и плотных питательных сред на основе ферментативных гидролизатов сои (бобов и соевого молока) для культивирования чумного микроба», одобренные ученым советом СтавНИПЧИ (протоколы: № 7 от 16.07.2003; № 4 от 27.04.2005) и утвержденные директором СтавНИПЧИ.

Питательные среды, сконструированные на основе ферментативных гидролизатов мяса, полученных ускоренным способом, прошли комплексные испытания в Ставропольской государственной медицинской академии, в ЦГСЭН Карачаево-Черкесской республике, на Элистинской противочумной станции, ЦГСЭН в Кабардино-Балкарской республике, ЦГСЭН в Краснодарском крае. Во всех случаях получены положительные заключения, свидетельствующие о возможности применения разработанных сред в диагностических целях. и

Основные положения, выносимые на защиту

2. Жидкие и плотные питательные среды, сконструированные на основе гидролизатов сои, обеспечивают полноценный рост и биохимические реакции возбудителя чумы и микроорганизмов тест-штаммов.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на VIII итоговой научной конференции молодых ученых и студентов (Ставрополь, 2000); 3-й научно-практической конференции НПО «Питательные среды» МЗ РФ «Разработка и производство диагностических сухих питательных сред и микротест-систем» (Махачкала, 2001); научно-практической конференции, посвященной 50-летию Ставропольского научно-исследовательского противочумного института «Эпидемиологическая безопасность на Кавказе. Итоги и перспективы» (Ставрополь, 2002); научно-практической конференции «Карантинные и зоонозные инфекции в Казахстане» (Алматы, 2002); научно-практической конференции, посвященной 50-летию НПО «Питательные среды МЗ РФ «Разработки и стандартизация микробиологических питательных сред и тест-систем» (Махачкала, 2003); научно-практической конференции «Естествознание и гуманизм» в честь 170-летия со дня рождения Г.Н. Потанина (Томск, 2005).

Публикации. Основное содержание диссертации, выполненной в рамках НИР, отражено в 17 опубликованных работах (депонированы - 2, в материалах межгосударственных, Всероссийских конференций - 13, в патентах РФ на изобретения - 2).

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Старцева, Ольга Леонидовна

выводы

6. Среды, сконструированные на комбинированной соевой основе -соя (бобы) на соевом молоке, обеспечивают характерный рост возбудителя чумы на 21 % выше, чем среды на основе сои (бобов) или продуктов ее переработки.

7. В процессе хранения ферментативных соевых гидролизатов происходит нарастание аминного азота в среднем на 12 % после двух лет хранения и увеличение рН от 7,1 до 7,4 ед, что способствует улучшению ростовых качеств приготовленных из них питательных сред.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Для нормального роста культивируемых микробов, их размножения и осуществления биосинтетических процессов необходимо создание оптимальных условий, обеспечение состава и достаточной концентрации питательных веществ, присутствие стимуляторов роста, создание температурного режима и других физических и химических факторов.

В лабораторных условиях для обеспечения питательных потребностей бактерий применяют искусственные среды, при изготовлении которых могут быть использованы различные источники естественного происхождения: мясо, молоко, кровь, сыворотка, желток куриного яйца, дрожжи, мясо-костная мука, казеин и т.д. Известно, что наиболее доступной формой азотистого питания для бактерий являются продукты расщепления белка, поэтому большинство питательных сред готовится на основе различных белковых гидролизатов [159, 200, 265].

В настоящее время для культивирования микроорганизмов традиционно применяют бульон и агар Хоттингера, приготовленные из мясных гидролизатов, прошедших 2-3 летний период созревания. В некоторых случаях, связанных с внеплановым расширением производства бактерийных препаратов или возникновением чрезвычайных ситуаций, требующих проведения большого количества бактериологических исследований, возникает необходимость в дополнительном производстве питательных сред. Поскольку приготовление мясных гидролизатов осуществляется в плановом порядке, производство внепланового количества сред вызывает дополнительную потребность в гидролизных основах.

В связи с этим нами был разработан ускоренный способ приготовления ферментативных гидролизатов мяса, используемых в качестве питательных основ плотных и жидких микробиологических сред.

Гидролиз вели при 37±1 °С в течение 1, 2 и 3 сут. Остановку процесса гидролиза проводили при температуре 100 "С с экспозицией 15 мин. Максимальную степень расщепления белка, количество общего и аминного азота наблюдали через 72 ч ферментирования. Следует отметить, что через 24 и 48 ч гидролиза указанные показатели также были достаточно высокими.

В связи с тем, что существуют различные методы ведения гидролиза, была проведена сравнительная качественная характеристика полученных нами ускоренных гидролизатов с основами, изготовленными как классическим ферментативным, так и химическим способами. Полученные гидролизаты изучали по физико-химическим и биохимическим свойствам, определяли содержание в них микроэлементов.

В результате установлено, что питательные основы, приготовленные из одного сырья, но различными способами, отличались друг от друга по всем определяемым показателям, но были сходны во всех сериях, полученных одинаковым способом. По большинству физико-химических показателей, мясные основы, подвергшиеся ферментативному гидролизу, превосходили кислотные и щелочные. После 24 ч гидролиза мяса ферментами поджелудочной железы содержание общего и аминного азота достигало 0,91 ±0,01 % и 0,52±0,02 % соответственно. К 48 ч содержание аминного и общего азота увеличивалось незначительно. К концу 72 ч ферментации уровень расщепления белка был достаточно высокий и составлял 65±1 %. Анализом выявлено наличие в гидролизатах всех изучаемых микроэлементов. По содержанию натрия (4,25±0,1 г/л), железа (8,1±0,1 г/л) и хлоридов (0,49±0,02 г/л) ускоренные гидролизаты были практически равноценны классическим ферментным основам, прошедшим 2-3 летний период «созревания». По количеству калия (0,76±0,03 г/л) уже после 24 ч расщепления ферментативные гидролизаты превосходили кислотные и щелочные основы. Уровень кальция (0,034±0,001 г/л) и глюкозы (1,19±0,01) после 48 ч ферментации был равен показателям кислотных гидролизтов.

Поскольку только лишь по физико-химическим показателям нельзя судить о преимуществе способа гидролиза, мы изучили биохимический состав мясных основ, подвергшихся различным способам гидролиза.

Известно, что рост патогенных микробов зависит от степени и глубины расщепления белковых субстратов, т.е. от качественного и количественного состава аминокислот. Чем выше степень расщепления азотистых веществ, тем интенсивнее рост патогенных микробов [179, 241]. В связи с этим, нами проведен качественный и количественный анализ состава мясных гидролизатов, полученных различными способами, на содержание 16 свободных аминокислот, участвующих в метаболизме бактерий.

В результате установлено, что все изучаемые гидролизаты качественно были равноценны и содержали следующие аминокислоты: глютаминовую и аспарагиновую кислоты, треонин, серин, пролин, глицин, аланин, валин, ме-тионин, изолейцин, лейцин, тирозин, фенилаланин, гистидин, лизин, аргинин. Сравнение же количественного состава показало, что оно зависит от условий получения гидролизатов - ферментативным или химическим путем. Более высокое содержание свободных аминокислот наблюдалось в случае ферментативных гидролизатов. Приготовленные ускоренным способом основы по количеству аминокислот уступали классическим в 1,2 раза, что обусловлено преждевременной остановкой и более низким содержание аминного азота. Тем не менее, за 72 ч ферментации общее количество аминокислот в них увеличивалось на 18 %, и они содержали все выявленные аминокислоты, характерные для гидролизатов глубокой степени расщепления. По количеству валина (7,81±1,7 г/л), изолейцина (3,72±0,12 г/л), пролина (5,02±0,1 г/л) и метионина (2,1 ±0,3 г/л) ускоренные ферментативные гидролизаты через 72 ч расщепления были равнозначны классическим. Содержание в них аспараги-новой кислоты (4,42±0,01 г/л), тирозина (1,9±0,03 г/л), фенилаланина (2,3±0,05 г/л), аланина (5,36±1,2 г/л), глицина (5,01±1,01 г/л) и пролина (5,02±1,4 г/л) превосходило показатели кислотных и щелочных гидролизатов.

В щелочных гидролизатах в относительно большем количестве представлен треонин (6,73±1,3 г/л), кислотные - отличались от других повышенным количеством в них гистидина (1,25±0,03 г/л).

Таким образом, полученные питательные основы представляли собой смесь микроэлементов и свободных аминокислот, преобладание которых отмечено в ферментативных гидролизатах. Количественное содержание аминокислот в гидролизатах, полученных ускоренным способом, было несколько ниже, чем в основах, приготовленных классическим способом ферментативного расщепления, но существенно выше, чем в химических гидролизатах. Для окончательного решения вопроса о качестве мясных основ мы продолжили их изучение с помощью микробиологического метода.

Для этого готовили плотные и жидкие питательные среды с максимальным содержанием аминного азота 0,14±0,03 % по общепринятой методике [25]. Для контроля бульона Хоттингера использовали тест-штаммы: Sh. flexneri 1 а 8516, С. xerosis 1911, St. pyogenes Dick 1, Y. pestis EV; для контроля агара - Sh. sonnei "S-form", Sh. flexneri 1 a 8516, S. marcescens 1, Ps. aeruginosa 17/99, Y. pestis EV.

В результате биологического контроля качества жидких и плотных питательных сред, приготовленных на основе кислотных, щелочных, ферментативных классических и ферментативных ускоренных гидролизатов мяса, установлено, что все бульоны, независимо от используемой питательной основы, обеспечивали характерный рост исследуемых микроорганизмов. При изучении качества плотных сред отмечена максимальная чувствительность агаров, приготовленных на основе ферментативных гидролизатов. При этом основы с ускоренным типом ферментации в составе питательных сред по ростовым качествам не уступали классическим. Все серии плотных сред через 24 ч культивирования стабильно обеспечивали рост тест-штаммов Sh. sonnei "S-form " и Sh. flexneri 1 a 8516 в виде бесцветных, прозрачных, круглых колоний в количестве 43±0,1 и 46±0,6 от засеянной дозы; тест-штаммов S. marcescens 1 и Ps. aeruginosa 17/99 в количестве 46±0,3 и 46±0,4 пигментированных колоний. Рост Y pestis EV среды обеспечивали через 48 ч инкубации в количестве 56±0,1 колоний с характерной морфологией. На плотных средах, приготовленных из классического ферментативного гидролизата, количество и морфология выросших колоний были в пределах требований официальных регламентированных инструкций [76, 134].

Таким образом, использование для культивирования микроорганизмов питательных сред на основе гидролизатов, приготовленных ускоренным ферментативным расщеплением (72 ч), равноценно применению основ, подвергшихся классическому ферментативному гидролизу.

Состав среды и ряд физических факторов оказывают большое влияние на образование пигментов бактерий [87, 131]. Одним из критериев оценки ростовых качеств питательных сред является оценка пигментообразующих свойств тест-штаммов микроорганизмов при культивировании, как на плотных, так и на жидких питательных средах.

Поэтому для биологического контроля полученных ускоренным способом гидролизатов в сравнении с гидролизатами глубокой степени расщепления были выбраны пигменто- и индолообразующие штаммы микроорганизмов.

Учет результатов через 19±1 ч инкубации S. marcescens 1 и Ps. aeruginosa 17/99 показал наличие сплошного роста с образованием соответственно оранжево-красного и сине-зеленого пигментов на агаре Хоттингера всех экспериментальных серий независимо от глубины расщепления белка в основах. Через 24±1 ч роста Sh. flexneri 1 а 8516 в бульоне наблюдали розовое окрашивание индикаторных бумажек, свидетельствующее об образовании индола.

Сравнение с коммерческими аналогами изготовленных нами жидких и плотных питательных сред на основе разработанного гидролизата показало, что по физико-химическим свойствам, морфологии колоний, интенсивности роста, по характеру пигменто- и индолообразования все экспериментальные серии агара и бульона Хоттингера соответствовали регламентированным критериям по качеству питательных сред.

Таким образом, гидролизаты, полученные нами ускоренным способом ферментации наравне с мясными основами, приготовленными классическим методом равноценно обеспечивали высокие показатели роста и характерные биохимические реакции исследуемых штаммов микроорганизмов.

Традиционно используемые для производства питательных сред гидролизаты, готовятся из дорогостоящего сырья - отборной говяжьей вырезки. Для его замены предлагалось применять различные отходы мясной, рыбной, молочной промышленности, растительное сырье и т.д. В последние годы возобновился интерес к разработкам питательных основ и сред из растительного сырья, возможность использования которого рассматривалась в 30-60 гг XX века, но не получила широкого распространения. Полученные в то время положительные результаты позволяют считать обоснованным попытки разработки доступных основ и сред из растительного сырья как более дешевого. Из большого разнообразия растительных продуктов мы выбрали сою, как культуру, богатую белками, широко культивируемую и имеющую низкую себестоимость производства.

На основе сои и продуктов ее переработки изготовили 24 серии различных питательных основ. Прежде всего их исследовали по физико-химическим показателям. Было установлено, что ферментативные гидролизаты сои и продуктов ее переработки имели несомненное преимущество перед питательными основами, полученными химическим способом по количественным показателям химических веществ и микроэлементов. Среди соевых основ, полученных ферментативным расщеплением белка, более высокие показатели отмечены в ФГС, уровень аминного азота в которых достигал 0,88±0,03 %, содержание калия - 0,75±0,02 г/л, кальция - 0,27±0,02 г/л. Повышенным количеством натрия (5,50±0,19 г/л), хлоридов (1,01±0,04 г/л) и минимальным - кальция (0,01±0,001 г/л) характеризовались ФГСМ. Показатели аминного азота (0,86±0,03 %), натрия (5,38±0,22 г/л) и железа (1,69±0,09 г/л) в ферментативных гидролизатах соевых бобов на соевом молоке соответствовал таковым в ФГС, что было максимальным относительно всех полученных гидролизатов. В ФГСО количество кальция (0,24±0,01 г/л), железа

1,14±0,11 г/л) и хлоридов (0,52±0,03 г/л) было сопоставимо с соответствующими показателями у выше описанных гидролизатов.

Щелочные и кислотные гидролизаты сои (бобов) имели чрезвычайно низкий аминный азот (0,043±0,001 %) и уступали ферментативным гидроли-затам сои практически по всем показателям.

Известно, что для полноценного роста чумного микроба требуется определенный набор аминокислот. Наиболее интенсивному превращению в клетках чумного микроба подвергаются глютаминовая кислота, аланин, серии, треонин и пролин. Меньше — аспарагиновая кислота, валин, фенилала-нин [63, 158].

Проведенный аминокислотный анализ показал, что во всех соевых основах, так же как и в мясных, обнаружен набор из 16 аминокислот. В количественном же отношении наблюдались различия. Мясные гидролизаты превосходили соевые по содержанию большинства аминокислот: лейцина, треонина, серина, глицина, аланина, валина, тирозина, но значительно уступали по содержанию аспарагиновой кислоты, изолейцина, аргинина. Содержание глютаминовой кислоты в ФГСБМ в 1,6 раза было выше чем в ФГМ.

Во всех соевых основах отмечено преобладание глютаминовой кислоты, содержание которой в ФГСБМ достигло 9,61 ±0,72 г/л. По содержанию дефицитных в растительных белках аминокислот — лизину и метионину, данный вид гидролизата также превосходил другие соевые ферментные основы. В количественном отношении он оказался наиболее богатым субстратом.

ФГСО по количеству почти всех определяемых аминокислот значительно уступали другим ферментативным основам сои. Только содержание тирозина (0,7±0,08 г/л) и аргинина (1,31 ±0,06 г/л) в нем было выше, чем в ФГС.

Химические гидролизаты значительно уступали всем ферментативным по количеству аминокислот и соответственно по величине аминного азота. Исключение составляет аргинин, количество которого (2,09±0,03 г/л) в ЩГС превосходило содержание во всех ферментативных гидролизатах. Количественное содержание аминокислот в КГС было несколько выше, чем в щелочных гидролизатах, но значительно уступало всем ферментативно полученным соевым основам.

Поскольку разработанные нами соевые гидролизаты содержали все необходимые аминокислоты, мы изучили ростовые свойства соевых сред. Питательные среды, приготовленные только на ферментативной соевой основе, обеспечивали достаточно высокий рост чумного микроба с характерной морфологией в количестве 68-70 % от посевной дозы.

Использование для приготовления питательных сред комбинированных ферментативных соевых и мясных основ в различных соотношениях позволило увеличить культуральные качества сред. Оптимальной для чумного микроба оказалась питательная среда, приготовленная из ферментативных гидролизатов сои и мяса, взятых в равных объемах (1:1), с добавлением сульфита натрия или липоевой кислоты. Данная среда обеспечивала через 46±2 ч инкубации рост 78,1±7,0 колоний диаметром 2,2 мм с хорошо выраженной кружевной зоной, сохраняющейся в течение 5 суток (срок наблюдения).

Полученные данные положены в основу оригинальной методики питательной среды для культивирования вакцинного штамма чумного микроба [патент РФ № 2245362]

Несмотря на то, что химические гидролизаты уступали ферментативным по физико-химическим свойствам и количественному составу аминокислот, мы изучили ростовые свойства сред, приготовленных из основ, полученных с помощью кислотного и щелочного гидролиза.

На средах, приготовленных из кислотного гидролизата сои, рост Y. pestis EV был ниже, чем на других средах. Морфология колоний чумного микроба, культивируемого на них, оказалась недостаточно четко выраженной.

На средах из щелочного соевого гидролизата вырастало 60±2 колоний с четко обозначенными классическими морфологическими признаками.

Таким образом, низкое содержание аминного азота в питательных основах не обусловило плохое качество полученных из них питательных сред. Для роста чумного микроба из единичных клеток при добавлении стимуляторов достаточно 25-75 мг% аминного азота в среде [106, 244], что подтверждают наши исследования. Среды, приготовленные из щелочных гидролизатов, содержали 43 мг% аминного азота.

Исследованиями показано, что плотные питательные среды, приготовленные на основе продуктов переработки сои с добавлением стимуляторов роста, являются полноценными для выращивания чумного микроба из небольших посевных доз. Плотные питательные среды на основе ФГСО обеспечивали рост 59,1 ±2,2 колоний чумного микроба диаметром 1,5 мм. Применение ФГСМ в составе питательных сред давало рост 55,4±3,5 колоний диаметром 2,0 мм. Оптимальными были среды, приготовленные на комбинированной соевой основе (ФГСБМ) на которых вырастало 77,4±2,1 колонии диаметром 2,2 мм. Кроме того, на данных средах формирование колоний происходило на 3 ч раньше, чем на других соевых средах. Морфология колоний и микробов, формирование кружевной зоны во всех случаях были ярко-выражены и характерны для Y. pestis EV.

Тест-штаммы S. marcescens 1 и Ps. aeruginosa 17/99 при выращивании на соевых средах в состав которых входили ФГС, ФГСМ и ФГСБМ стабильно сохраняли способность синтеза пиоцианина и продигиозина.

Жидкие соевые питательные среды так же давали характерный рост исследуемых микроорганизмов. На бульонах, приготовленных с использованием ФГСМ характерный рост вакцинного штамма чумного микроба наблюдался уже через 24 ч, что на 24 ч раньше начала роста на контрольных (мясных) средах.

Наблюдение за изменением качества ферментативных соевых гидролизатов в течение двух лет их хранения при температуре от 2 до 8 "С показало, что азотистый состав гидролизатов не является стабильным. В них все время происходят различные процессы, которые приводили к улучшению качества приготовленных из них питательных сред (в течение срока наблюдения).

С целью использования соевых питательных сред в производственных условиях изучали их накопительные свойства при выращивании вакцинного штамма чумного микроба. Биомассу получали во флаконах с 50±10 мл скошенной питательной среды, после смыва в которой оценивали биологическую и оптическую концентрацию микробных клеток и их морфологию.

На контрольной среде (агаре Хоттингера) мы получили (8,2±0,2)х109 м.к./мл с жизнеспособностью 38,8±0,7 %. Выход биомассы с питательных сред, приготовленных на основе ФГС составил (6,2±0,2)х109 м.к./мл с количеством живых микробных клеток 35,6±0,8 %. Добавление к двум частям ФГС одной части мясной основы снижало жизнеспособность биомассы до 22,3±0,2 % при достаточно высоком выходе ((7,2±0,3)х109 м.к./мл). Сочетание основ сои и мяса в концентрациях 1:2 в составе накопительных сред, обеспечивало выход (9,0±0,1)х109 м.к./мл жизнеспособность которой составляла 36,7±0,4 %. Оптимальным по составу являлось комбинирование ферментативных гидролизатов мяса и сои в соотношении 1:1, которое способствовало выходу (10,2±0,3)х109 м.к./мл биомассы с жизнеспособностью 56,1±0,8 %.

По материалам исследований получен патент РФ № 2241033 «Питательная среда для накопления биомассы вакцинного штамма чумного микроба».

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Старцева, Ольга Леонидовна, Ставрополь

1. Абгарян А.Г., Майский В.Г., Еременко Е.И. Рост сибиреязвенного микроба на различных питательных средах // Современные аспекты профилактики зоонозных инфекций: Тез. докл. науч. конф.- Ставрополь, 1991.- С. 102.

2. Аванян Л.А., Губина Н.Е. Действие железа на рост и вируленность чумного микроба // Тр. Армянской противочум. станции.- Ереван, 1960.-№ 1.- С. 149.

3. Акимов И.Г., Нахимсон Л.Н. Кислотный гидролиз как метод использования сои для питательных сред // Журн. эпидемиол. и микробиол.-1938.-№ 11.- С. 38.

4. Андреева И.Н., Огородникова Т.И. Влияние условий культивирования на рост и пигментацию Seratia marcescens II Журн. микробиол.- 1999.- № 3.- С. 16-2 0.

5. Антипова Л.В., Жеребцов Н.А. Биохимия мяса и мясных продуктов.-Воронеж, 1991.- 183 с.

6. Ахапкина И.Г., Блинкова Л.П. Питательные среды как искусственная среда роста и развития микроорганизмов // Журн. микробиол.- 2001.- № 6.- С. 99.

7. Ахапкина И.Г., Блинкова Л.П., Бутова Л.Г. Культивирование Pseudomonas aeruginosa на средах с использованием ферментативного гидролизата хлореллы в качестве питательной основы // Журн. микробиол,-2002.- № 5.- С. 67-68.

8. Ахметова Э.М., Меджидов М.М., Омаров С.М. Разработка и испытание сухих питательных сред для индикации уреаплазм // Журн. микробиол.- 2000.- № 3.- С. 29.

9. Багмет А.Г. Биопрепараты, приготовленные на горохово-гидролизной среде // Биопрепараты, вирусы, микробы.- T.VI.- Сельхозгиз, 1956.- С. 194-197.

10. Багузина И.В., Качаровская М.А., Контор В.И. Опыт выращивания микробов на овощно-пептонной среде // Лаб. дело.- 1970.- № 4.- С.204-206.

11. Бахрах Е.Э., Обухова З.А., Маслова О.П. Усовершенствование технологии приготовления питательных сред для выращивания чумного микроба. Сообщ.1. О режиме гидролиза основных растворов Хоттингера // Тр. ин-та «Микроб», I960.- Вып. 4.- С. 501-507.

12. Бахрах Е.Э., Мартене Л.А., Обухова З.А., Соколова Н.М., Юргина З.А. Среды из кислотного гидролизата казеина для выращивания чумного микроба // Там же.- С. 514-518.

13. Бахрах Е.Э., Мартене Л.А., Соколова Н.М., Обухова З.А. Режим кислотного гидролизата казеина, обеспечивающий получение сред, пригодных для выращивания чумного микроба // Уч. зап. Дагест. НИИ пит. сред.- 1964.- Вып.4.- С. 105-120.

14. Безсонова А.В. Метод получения переходно-шероховатых (ОР) вариантов Р. pestis II Вестн. микробиол., эпидемиол. и паразитол.- 1936.- Т. XV, вып. 2.- С. 195-198.

15. Бендас Л.Г., Сидорчук Н.В. Кормовые дрожжи как исходное сырье питательных сред для культивирования микробов // Лаб. дело.- 1970.- № 1.-С. 43-45.

16. Бендас Л.Г. Ферментативные гидролизаты кормовых дрожжей — основа бактериологичсеких питательных сред: Автореф. дис. . канд. биол. наук.- М., 1971.- 16 с.

17. Бендас Л.Г., Раскин Б.М. Стимулятор бактериального роста из кормовых дрожжей // Лаб. дело.- 1974.- № 1.- С. 43-45.

18. Бибергал С.И., Калныня Л.Я. Овощно-пептонная среда для выращивания различных бактерий // Лаб. дело.- 1965.- № 6.- С. 360-361.

19. Биология, селекция и генетика сои: Сб. науч. тр. ВАСХНИЛ / Под. ред. В.Ф. Кузина. Новосибирск, 1986.- 186 с.

20. Биргер М.О. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования.- М.: Медицина, 1982.- 461 с.

21. Блинкова Л.П., Горобец О.Б., Батуро А.П. Биологическая активность спирулины // Журн. микробиол.- 2001.- № 2.- С. 114-118.

22. Блинкова Л.П., Шмыгалева Т.П., Горобец О.Б., Мухин О.Б., Новиков В.К. Испытания гидролизатов из отходов морепродуктов в питательных средах // Там же.- С. 49.

23. Борисенко Е.Г. Конструирование питательных сред из кислотных гидролизатов белково-витаминных препаратов // Лаб. дело.- 1967.- № 8.-С. 488-501.

24. Борисенко Е.Г. Культивирование микроорганизмов на питательных средах, приготовленных из продуктов микробиологического синтеза // Лаб. дело.- 1968.- № 3.- С. 184-185.

25. Бузолева Л.С., Сомов Г.П. Питательная среда для культивирования и количественного учета иерсиний и листерий в объектах внешней среды: Пат. № 2161655 РФ, МПК7 C12Q 1/04, C12N 1/20.- № 98120740/13. Заявлено 10.11.98. Опубл. 10.01.01. Бюл. № 1.

26. Бульон В.В., Хныченко Л.К., Малышкин К.А. Использование диет, включающих соевые продукты, при лечении экспериментальной алиментарной дистрофии // Вопросы питания.- 1996.- № 3.- С. 38-40.

27. Вавилов П.П., Посыпанов Г.С. Бобовые культуры и проблемы растительного белка.- М.: Россельхозиздат, 1983.- 256 с.

28. Вейнблат В.И., Кузьмиченко И.А., Синичкина А.А., Борисова Н.П. Синтетическая питательная среда для выращивания чумных микробов при 28е и 37°С // Проблемы особо опасных инфекций.- Саратов, 1972.- Вып. 4.-С. 123-127.

29. Верховцева Н.В., Дубинина Г.А., Глебова И.Н. Трансформация соединений трехвалентного железа Leptothrix pseudoochracea II Микробиология.- 1992.- Т.61, вып. 5.- С. 830-837.

30. Водоросли морские, травы морские и продукты их переработки. Методы анализа ГОСТ 26185-84.- М., 1984.- 54 е.- (Гос. комит. СССР по ст.м).

31. Волина Е.Г., Саруханова Л.Е. Культивирование лептоспир в жидкой питательной среде с лизированной кроличьей кровью // Журн. микробиол.-2001.-№ 1.-С. 3-5.

32. Гавристова И.А., Бендас Л.Г. Характеристика белковых основ бактериологических питательных сред по содержанию углеводов // Журн. микробиол.- 1991.- № 5.- С.76.

33. Голшмид В.К., Илиджев А.К., Ландсман Н.М., Богословская Л.Н., Токинова Т.Н. Гидролизаты крови для микробиологических питательных сред // Лаб. дело.- 1990.- № 10.- С. 68.

34. Гомимид В.К., Богословская Л.Н., Ландсман Н.М., Токинова Т.Н. Применение веществ, стимулирующих рост энтеробактерий в практике получения микробных адсорбентов // Журн. микробиол.- 1984.- № 6.- С. 4750.

35. Гордиенко В.А., Либерштейн И.И. Кладовая белка.- М.: «Колос», 1969.- 151 с.

36. Горобец О.Б., Блинкова Л.П., Батуро А.П. Стимулирующее и ингибирующее воздействие Spirulina platensis на микроорганизмы // Журн. микробиол.- 2001.- № 6.- С. 20.

37. Горобец О.Б., Блинкова Л.П., Батуро А.П. Действие Spirulina platens is на вирусы бактерий // Журн. микробиол.- 2002.- № 6.- С. 18-21.

38. Грачева И.М. Технология ферментных препаратов.- М, 1987.- 335 с.

39. Грачева И.М., Иванова А.А., Кантере В.М. Технология микробных белковых препаратов, аминокислот и биоэнергия.- М., 1992.- 383 с.

40. Гремякова Т.А., Степаншина В.Н., Шулюпин O.K., Негрий В.Ф., Мицевич Е.В. Экспрессия основных антигенов и ростовые свойства клеток Yersinia pestis в средах различного состава при 37 °С // Журн. микробиол.-1993.- №1.- С. 16-20.

41. Грязнов Н.И. Дрожжевые питательные среды для приготовления вакцин // Тез. докл. науч. сессии, посвящ. 25-летию Свердловского ин-та мкробиол. и эпидемиол.- Свердловск, 1945.- С. 28.

42. Губарев Е.М., Заплатина С.И., Коннова A.M. Культивирование Past, pestis на питательных средах известного химического состава // Тр. Ростов н/Д противоч. ин-та.- 1956.- Т. X.- С. 69-89.

43. Гюлушанян К.С. Использование питательной среды на основе кукурузного экстракта в производстве чумной вакцины ЕВ: Автореф. дис. . канд. биол. наук.- Саратов, 1994.- 19 с.

44. Дмитриевская Н.А., Чеботаревич М.Ф. Опыт применения прессованных дрожжей в деле приготовления вакцин против коли-тифозных инфекций // Гигиена и эпидемиология.- 1930.- № 4-5.- С. 42-43.

45. Домарадский И.В., Иванов В.А. Некоторые данные по культивированию чумного микроба на синтетических средах // Журн. микробиол.- 1957.- № 2.- С. 54-59.

46. Домарадский И.В., Башева B.C., Сидорова Н.К. Культивирование чумного микроба на средах известного состава // Изв. Иркутского гос. НИПЧИ Сибири и Дальнего Востока.- Улан-Удэ, 1958.-Т. 18.- С. 55-63.

47. Домарадский И.В., Трофименко Н.З., Носкова Л.И. Использование соевых бобов для приготовления кислотного гидролизата // Бюл. по обмену опытом. Производство бактерийных препаратов,- Улан-Удэ, 1961.- Вып.1.-С.7-8.

48. Домарадский И.В., Носкова Л.И., Трофименко Н.З. Сухие питательные среды из кислотных гидролизатов белков крови для культивирования чумного микроба // Докл. Иркутского противоч. ин-та,-Горно-Алтайск, 1963,- Вып.5.- С. 57-58.

49. Дятлов И.А., Волох О.А. Получение S-слоя чумного микроба и возможности его применения // Биотехнология.- 2004.- № 1- С. 20-25.

50. Ефимова Н.П., Каменева М.А. Использование кормовых дрожжей в качестве стимулирующей добавки к питательной среде для культивирования С/, oedematiens II Лаб. дело.- 1974.- № 12.- С. 121-122.

51. Желтенков А.И., Анохина С.В. Влияние фильтрата сарцины на некоторые свойства чумного микроба // Тр. ин-та «Микроб».- 1958.- Вып. 2.-С. 341-346.

52. Зайцев В.В., Зелютков Ю.Г. Способ получения питательной среды для выращивания аэробных бактерий. Пат. 3085 Белоруссия МПК6 С 12 N 1/20.-№ 951023; Заявл. 30.12.95; Опубл. 30.12.99, Бюл№ 1.

53. Заплатина С.И., Юргина З.А., Кондратенко Н.Т., Толстокорова В.И. Применение агаровых казеино-гидролизных сред в производстве противочумной сухой живой вакцины (штамм 1.17): Тр. Ростов н/Д противочум. ин-та.- 1959.- Т. 16.- С. 81-87.

54. Заславский А., Бергер Е. Соевые среды для количественного учета микробов // Лаб. практика.- 1932.- № 3.- С. 11-12.

55. НИИ микробиологии МО РФ (30 ноября-1 декабря, 1998 г.).- Киров, 1998.- С. 299.

56. Ионина С.В. Повышение диагностической эффективности питательных сред для культивирования микобактерий туберкулеза: Автореф. дис. . канд. биол. наук: ин-т эксперим. вет. Сибири и Дал. Востока,2001.-26 с.

57. Инструкция по бактериологическому контролю диагностических питательных сред для чумного микроба.- Саратов, 1984.- 24 с.

58. Казиахмедов З.А., Нуратинов Р.А., Вердиева Э.А., Юзбеков Д.С. Совершенствование питательной среды для индикации микобактерий // Сб. науч. трудов, посвящ. 50-летию Дагестанской противочум. станции.-Махачкала, 2002.- С. 187-190.

59. Канчух А.А., Момот А.Г., Сурнина Н.С., Мелехина А.Ф. Антигенная структура живой противочумной вакцины, приготовленной на средах с кукурузным экстрактом // Там же.- С. 154-155.

60. Карпузиди К.С., Макаровская JI.H. Рост и размножение чумного микроба на среде с лизатом микробов «кормилок» // Тр. Ростов н/Д противочум. ин-та.- 1956.- Т. X.- С. 44-53.

61. Карташова Л.Д., Шеремет О.В. Технология изготовления гидролизата белка отрубей — питательной основы микробиологических сред

62. Разработка и приготовление препаратов медицинской биотехнологии: Тез. конф. (29-30 мая, 1990 г.).- Махачкала, 1990.- Ч.1.- С. 40-41.

63. Карташова Л.Д., Шеремет О.В. Гидролизат белка пшеничных отрубей — новая основа микробиологических питательных сред и его характеристика // Проблемы ООН.- 1994.- № 5 (75).- С.130-138.

64. Касаткин Н.Ф., Ованесова Н.Г., Тынянова В.И. Кукурузный бульон для выращивания возбудителя чумы // Проблемы особо опасных инфекций.-Саратов, 1972.- Вып. 4.- С. 164-166.

65. Касаткин Н.Ф., Ованесова Н.Г., Кириллов Н.Л., Воронежская Л.Г. Кукурузный бульон как заменитель пептонной воды для выделения холерных вибрионов // Проблемы ООИ.- 1978.- № 5.- С. 64-65.

66. Катунина Л.С. Использование липоевой кислоты с целью усовершенствования питательных сред для культивирования чумного микроба: Дис. . канд. биол. наук.- Ставрополь, 2002.- 164 с.

67. Кивман Г.Я., Прядкина М.Д., Гуторова. Н.М. Высушенная гемолизированная кровь как стимулятор роста чумного микроба // Журн. микробиол.- 1955.- № 5.- С. 82-85.

68. Кивман Г.Я., Прядкина М.Д., Гуторова Н.М. Препарат для выделения и стимуляции роста чумных микробов // Журн. микробиол.- 1955.-№ 12.- С. 61-66.

69. Князева В.А. Стимуляция роста чумного микроба фильтратами его бульонной культуры // Тр. ин-та «Микроб».- Саратов, I960.- Вып. 4.- С. 157161.

70. Козлов Ю.А. Питательные среды в медицинской микробиологии.-М.,Медгиз, 1950.-251 с.

71. Комоско Г.В., Ежов А.В., Мохов Д.А., Тетерин В.В. Оптимизация прописи питательной среды для глубинного культивирования вакцинного штамма ЕВР2 Y. pestis // Сб. науч. трудов, посвящ. 75-летию НИИ микробиологии МО РФ.- Киров, 2003.- С. 149-150.

72. Кондрашкова Т.В., Митина Г.С., Курилова JI.C. Изменение азотистого состава гидролизатов Хоттингера при хранении // Проблемы ООИ.- 1969.- № 4.- С. 143-146.

73. Кондрашкова Т.В., Донская Т.Н., Зимарина JI.C. Влияние некоторых минеральных солей на качество и срок годности питательной среды для выращивания чумного микроба // Проблемы особо опасных инфекций.- Саратов, 1978.- Вып. 4.- С. 25-27.

74. Кондрашкова Т.В., Васильева В.И. Возможные пути усовершенствования сред для производства бакпрепаратов против особо опасных инфекций: Биохимия, патофизиология и микробиология особо опасных инфекций.- Саратов, 1983.- С. 3-10.

75. Кондратенко Н.Т., Юргина З.А. Возможности использования агаровых сред, приготовленных из кровяных сгустков, в производстве живой противочумной вакцины // Тр. Ростовского н/Д гос. НИПЧИ.- Ростов, 1960.Т. 17.-С. 146-151.

76. Коробкова Е.И. К биологии Pasteurella pestis. Вариабельность чумных культур после длительного хранения их без пересева // Вестн. микробиол., эпидемиол. и паразитол.- 1936.- Т. XV, вып. 2.- С. 172-184.

77. Коробкова Е.И. Живая противочумная вакцина // Живые вакцины: Сб. тр. межинститутской науч. конф.- М., 1956.- Т. 2.- С. 37-52.

78. Костырко Д.С., Марьяш Ц.Х. Питательные среды из сои // Лаб. практика.- 1932.-№ 3.- С. 10.

79. Красикова М.А. О возможности снижения затрат сырья на изготовление питательных сред, применяемых для диагностики чумного микроба // Матер.УШ науч. конф. противочум. учр. Средней Азии и Казахстана.- Алма-Ата, 1974.- С. 449-451.

80. Красикова М.А., Рогачева А.А. О свойствах гидролизата из микробной массы вакцинного штамма ЕВ // Проблемы особо опасных инфекций.- Саратов, 1974.- Вып. 1 (35).- С. 33-35.

81. Кретович B.JI. Растительные белки и их биосинтез.- М., 1975.- 190с.

82. Куцемакина А.З., Битюкова Е.С. Казеиновый гидролизатный агар как чувствительная среда для выращивания чумного микроба // Тр. Арм. противочум. станции.- 1963.- Вып. 2.- С. 217-222.

83. Лакин Г.Ф. Биометрия.- М., 1990.- 352 с.

84. Ленинджер А. Основы биохимии. / Пер. с анг.- М., 1985.- Т. 2.- С. 445-454.

85. Лискина И.В. О качестве питательных сред, применяемых для диагностики холеры // Проблемы ООИ.- 1977.- № 6 (58).- С. 79.

86. Листериоз. Методические рекомендации (№11).- М., 2001.- 10 с.

87. Лопатина Н.В., Наталич Л.А. Методические подходы к получению вакцинных штаммов чумного микроба с повышенной чувствительностью к лиофилизации // Биотехнология.- 1994.- № 8.- С. 18-20.

88. Маевский М.П., Канатов Ю.В., Брудный Р.А., Васильева З.И., Антонов А.В., Костюковский В.М. Сухая агаровая среда для выделения икультивирования туляремийного микроба // Сб. науч. трудов.- Новороссийск, 1994.-Вып. 1.-С. 223-225.

89. Майский В.Г. Некоторые особенности метаболизма чумного микроба//Журн. микробиол.- 1983.- №11.- С. 108-109.

90. Мартене JI.A. Получение питательных сред из кислотных гидролизатов рыбо-костной муки // Учен. зап. Дагест. н.-и. ин-та по производству питательных сред.- Махачкала, 1964.- вып. 4.- С. 87-97.

91. Мартене JI.A. Плотные агаровые среды из кислотных гидролизатов рыбо-костной муки // Микробиология и иммунология особо опасных инфекций: Сб. науч. работ противочум. учр. страны.- Саратов, 1964.- С. 290-293.

92. Матвеевский Б.Г. Бобы сои как материал для приготовления искусственных питательных сред //Журн.микробиол.-1931.- Т.УЩ, №2.- С. 191.

93. Мельникова В.А., Груббер И.М., Денисова С.В., Скаженик В.Ю. Влияние питательной основы на качество разрабатываемых сред // Там же.-С. 45.

94. Методические рекомендации к контролю питательных сред по биологическим показателям.- М., 1980.- 80 с.

95. Методические указания по применению физико-химических методов контроля питательных сред.- М., 1977.- 18 с.

96. Методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов, вводимых людям: МУ 4.1/4.2.588-96. Москва,1988.- 128 с.

97. Михайлова З.И., Грудинская Е.Г. Соево-дрожжевая среда для приготовления вакцин // Лаб. практика.- 1932.- № 7.- С. 8.

98. Муравьева Н.К., Крайнова А.Н., Маслова О.П. Применение казеиновых сред в вакцинном производстве // Особо опасные и природноочаговые инфекции: Сб. науч. работ противочум. учр М., 1962.- С. 207-211.

99. Муравьева Н.К. Влияние питательной среды и условий культивирования вакцинного штамма на качество чумной живой сухой вакцины ЕВ: Автореф. дис. . канд. мед. наук.- Саратов, 1969.- 21 с.

100. Муромцев С.Н., Колядицкая JI.C., Виноградова И.Н. Опыт применения метода глубинного выращивания в условиях аэрации для производства бруцеллезной инфекции // Журн. микробиол.- 1959.- № 10.- С. 76-78.

101. Мякушко Ю.П., Баранова В.Ф. Соя.- М., 1984.- 332 с.

102. Немецкая P.M., Колесинская Н.И., Трофименко Н.З., Носкова Л.И. Сухие питательные бульоны при производстве чумной вакцины // Проблемы особо опасных инфекций.- Саратов, 1969.- Вып. 3.- С. 205-207.

103. Никитина В.А., Хаертынов С.Х., Салмаков К.М. Использование непищевых белков для приготовления бактериологических питательных сред // Учен. зап. Казанского ордена Ленина гос. ин-та им. Н.Э. Баумана.-1976.-Т. 122.-С. 166-169.

104. Николаев И.И., Чебрикова Е.В., Филиппов А.Ф., Алтухов М.В., Бахрах Е.Э. Опыт применения бульона из кислотного гидролизата казеина в производстве сухой живой чумной вакцины // Проблемы особо опасных инфекций.- Саратов, 1969.- Т.1.- С. 175-181.

105. Николаенко А.Ф. Организация безотходного производства в мясной промышленности.- Киев, 1991.- 245 с.

106. Носкова Л.И., Трофименко Н.З., Колесинская Н.И. Сухой питательный бульон для культивирования чумного микроба в условиях аэрации // Докл. Иркутского противочум. ин-та.-Иркутск, 1963.- Вып.5.-С.59-60.

107. Оленичева JT.C. Пути метаболизма аминокислот у возбудителей чумы и псевдотуберкулеза и некоторые вопросы их регуляции: Автореф. дис. . докт. биол. наук.- Саратов, 1974.- 20 с.

108. Омаров С.М., Баснакьян И.А., Артемьева Г.А. Сухие питательные среды для культивирования пневмококков и менингококков // Журн. микробиол.- 1999.- № 6.- С. 30-33.

109. Пенчуков В.М., Медянников Н.В., Каппушев А.У. Культура больших возможностей.- Ставрополь, 1984.- 28 с.

110. Перт С. Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток.-М., 1978.- 333 с.

111. Поздеев O.K., Покровский В.И. Бактериологические исследования. Медицинская микробиология. М., 1999.- 1200 с.

112. Покровский А.А. Перспективы использования одноклеточных организмов: Медико-биологические исследования углеводородных дрожжей.- М., 1972.- С. 9-58.

113. Поляк М.С., Сухаревич В.И., Сухаревич М.Э. Питательные среды для медицинской микробиологии,- Санкт-Петербург, 2003.- 148 с.

114. Приказ № 1170 от 10 октября 1983 г. Об утверждении нормативов затрат кормов для лабораторных животных в учреждениях здравоохранения.-М., 1983.

115. Регламент производства № 1542-04 Вакцина чумная живая сухая.-Ставрополь, 2004.- 256 с.

116. Рекомендации по современной технологии возделывания сои в Ставропольском крае / Под ред. проф. В.К. Целовальникова. Ставрополь, 2001.-50 с.

117. Рогожин А.З., Васильев П.Г., Тихонов И.В., Грязнева Т.Н., Лиморенко А.П., Маслов С.А., Коломейцев А.В., Коробейников А.Л.,

118. Гулькова О.В., Сирик М.С., Вишняков А.В. Экспериментальное обоснование использования сухих питательных сред в производстве препарата «БИОД-5» // Там же.- С. 166.

119. Розанов Н.И. О применении соевых сред в бактериологической практике // Лаб. практика.- 1932.- № 11.- С. 12.

120. Салпина Л.В., Анисимова Г.И., Шестопалов И.С. Изучение диагностической ценности новой питательной среды для выделения холерного вибриона элективно-дифференциальной сухой (СЭДС) // Проблемы ООИ.- 1994.- № 4 (74).- С. 113-122.

121. Санцевич Н.И., Кадомцев В.М., Аминов Р.И., Денисова С.В., Смирнова Г.А. Разработка питательных сред для культивирования рекомбинантных штаммов Е. coli И Журн. микробиол. 1994.- № 5.- С. 6-10.

122. Самсонов Ф.Б. Влияние некоторых гидролизатов на рост В. pestis // Вест, микробиол., эпидемиол. и паразитол.- Саратов, 1935.- Т. 15, вып. 4.- С. 359-365.

123. Самыкина Л.Н. Поиск новых путей управления микробиологическими процессами на основе регуляторных возможностей дегидрогеназ // Микроорганизмы в сельском хозяйстве: Тез.докл. 4 Всесоюз. науч. конф.- Пущино, 1992.- С. 179.

124. Семчева Н.С., Виноградова И.Н., Плоскирев Н.В. Получение живой бруцеллезной вакцины с применением метода глубинного выращивания // Вакцины и сыворотки. Материалы по производству.- М., 1965.- вып. 3.- С. 55-64.

125. Сенькин А.В., Терентьев Т.Н., Медведев Н.П. Использование желточных сред для повышения высеваемости возбудителя сибирской язвы // Сб. науч. трудов, посвящ. 75-летию НИИ микробиол. МО РФ.- Киров, 2003.-С. 168.

126. Серебряков В.А., Авербух И.Я. К вопросу о применении дрожжевых сред // Лаб. практика.- 1941.- № 4.- С. 7-8.

127. Смирнов И.В., Ценева Г.Я. Культуральные свойства и вирулентность иерсиний // Журн. микробиол.- 1991.- № 9.- С. 13-16.

128. Смирнова В.И. Культивирование бруцелл на питательных средах из китовой муки // Тр. Одесского науч. исслед. ин-та эпидемиол. и микробиол. им. ИИ. Мечникова.- I960.- Т. 4.- С. 57-61.

129. Смирнова Г.А., Раскин Б.М., Мельникова В.А., Целигорова Е.Л. Изучение пептидного и аминокислотного состава различных белковых основ питательных сред // ЖМЭИ- 1985.- № 12.- С. 22-26.

130. Смирнова Г.А. Состояние и перспективы развития сырьевой базы производства питательных сред // Журн. микробиол.- 1991.- № 5.- С. 63-67.

131. Смирнова Е.Б. Биохимический анализ мясного гидролизата, используемый в приготовлении микробиологических сред // Тез. докл. X итоговой науч. конф. молодых ученых и студентов.- Ставрополь, 2002.- С. 413-414.

132. Скородумов A.M. О применении альбуминовой питательной среды для культивирования чумного микроба // Сб. работ противочум. орг. Вост.-Сибирск. края за 1932-1933 г.- М., 1936.- С. 45-46.

133. Соболев A.M. Запасание белка в семенах растений.- М.: Наука, 1985.- ИЗ с.

134. Сорокулова И.Б., Хилько Т.В., Осадчая А.И. Разработка питательной среды для культивирования Lactobacillus plantarum 8R-A3 // Мпфобюл.ж.- 2003.- 65, № 3.- С. 39-45.

135. Справочник по микробиологическим питательным средам / Под ред. М.М. Меджидова.- Махачкала, 1989.- 104 с.

136. Степанов В.М. К вопросу о влиянии факторов питания на формирование чумного микроба // Проблемы особо опасных инфекций.-Саратов, 1969.- Вып. 3. (7).- С. 92-95.

137. Степин А.А., Самыгин В.М., Владимцев И.В., Кухтин В.П., Жога JI.K., Каплиев В.И., Романенко С.К. Получение биомассы бацилл методом глубинного периодического культивирования // Биотехнология.- 1994.-№3.-С.31-33.

138. Султанов 3.3., Алиев А.З., Какулина Е.А., Перепелица Л.Г. Основные технические аспекты производства гидролизатов сои // Там же.- С.40-41.

139. Суслова B.C., Романов Г.В., Гагаринская В.В., Бендас Л.Г. Опыт применения кормовых дрожжей для приготовления питательных сред // Лаб. дело.- 1968.- № 3.- С. 170-173.

140. Телишевская Л.Я., Простяков А.П., Цыганкова С.И., Трусова Л.И. Контроль и стандартизация компонентов и питательных сред бактериальных культур // Бюл. Всес. ордена Ленина НИИ эксперим. ветеринарии им. Я.Р. Коваленко.- М.,1983.- № 49.- С. 83-89.

141. Темирханов З.У., Гамилова П.Ш., Сафонова Н.В., Мороз А.Ф., Хазенсон Л.В. Питательная среда для выделения и культивирования кампилобактерий // Журн. микробиол.- 1999.- № 6.- С. 27-30.

142. Тимофеева Л.А., Апарин Г.П., Трофименко Н.З. Потребности в аминокислотах штаммов чумного микроба, выделенных в очагах Сибири // Докл. Иркутского противочум. ин-та.- Иркутск, 1971.- Вып. IX.- С. 43-44.

143. Трифонова А.А. Роль составных частей крови различных животных в питании чумного микроба: Автореф. дис. . канд. мед. наук.-Саратов, 1954.- 18 с.

144. Трифонова А.А. Сравнительное изучение некоторых стимуляторов роста чумного микроба // Тр. ин-та «Микроб».- Саратов, I960.- Вып. 4.-С. 162-167.

145. Трифонова А.А., Тереножкина А.В. Питательная среда из кровяных сгустков для культивирования чумного микроба // Микробиология и иммунология особо опасных инфекций.- Саратов, 1964.- С. 287-290.

146. Трифонова А.А., Кондрашкова Т.В. О приготовлении агара из перевара сгустков крови // Проблемы особо опасных инфекций.- Саратов, 1972.- Вып. 4 (26).- С. 162-163.

147. Трофименко Н.З., Михалева В .Я., Носкова Л.И. Среды из кислотных гидролизатов крови для приготовления противочумной вакцины // Изв. Иркутского гос. науч.-исслед. противоч. ин-та Сибири и Дальнего Востока.- Иркутск, 1962.- Т. 24.- С. 220-224.

148. Трофименко Н.З., Домарадский И.В., Носкова Л.И., Михалева В.Я. Среды из соево-кислотного гидролизата для выращивания чумного микроба // Докл. Иркутского противочум. и.-та.- Иркутск, 1963.- Вып.5.- С. 48-52.

149. Трофименко Н.З., Колесинская Н.И., Носкова Л.И. Среды из ферментативных гидролизатов соевых бобов для выращивания чумного микроба // Проблемы особо опасных инфекций.- 1969.- Вып. 3.- С. 212-213.

150. Туманский В.М. Микробиологические основы диагностики чумы // Тр. науч. конф., посвящ. 25-летию ин-та «Микроб» (август, 1944 г.).-Саратов, 1948.- С. 69-79.

151. Фармакопейная статья № 42-3874-99 Физико-химические, химические, физические и иммунохимические методы контроля иммунобиологических препаратов.- М., 1999.- 70 с.

152. Фармакопейная статья № 42-3407-97 Основа бактериологических питательных сред сухая (Бактофк-МК).- М., 1997.- 10 с.

153. Фармакопейная статья № 42-3520-98 Питательный агар для культивирования микроорганизмов сухой (СПА).- М., 1998,- 7 с.

154. Фармакопейная статья № 42-3505-98 Питательный бульон для культивирования микроорганизмов сухой (СПБ).- М., 1998.- 9 с.

155. Фармакопейная статья № 42-257 ВС-89 Питательный агар для культивирования микроорганизмов (мясо-пептонный агар).- М., 1989.- 6 с.

156. Фармакопейная статья № 42-256 ВС-89 Питательный бульон для культивирования микроорганизмов жидкий (мясо-пептонный бульон).- М., 1989.- 5 с.

157. Фармакопейная статья предприятия № 42-0035-2483-02 Липоевая кислота. Субстанция.- М., 2002.- 11 с.

158. Федорова О.В., Малофеева J1.C., Лобанов Ф.И., Шер А.А. Влияние компонентного состава питательных сред и стерилизации на связывание ионов железа // Биотехнология.- 1991.- № 3.- С. 60-61.

159. Феофилова Е.П. Пигменты микроорганизмов.- М., 1974.- 150 с.

160. Филиппов А.Ф., Кондрашкова Т.В., Муравьева Н.С. Свойства культур чумного микроба, выращенных на средах из аутолизатов рыбы // Проблемы особо опасных инфекций.- Саратов, 1974.- Вып.З.- С. 62-66.

161. Чанпалов П.Ф. Метод изучения рыбных автолизатов путем самопереваривания целой рыбы // Учен. Зап. Дагестанского НИИ по производству питательных сред.- 1956.- Вып. 2.- С. 28-37.

162. Шафран А.С. Применение сои для питательных сред // Журн. микробиол.- 1932.- Т. IX.- № 3.- С. 288.

163. Шевченко Ф.И., Карпова Л.П. Среда для культивирования гонококков при производстве вакцин // Журн. микробиол.- 1939.- № 11-12.-С. 162-164.

164. Шевченко Ф.И. О преимуществах дрожжевого агара при массовом изготовлении вакцин//Журн. микробиол.- 1939.-№ 11-12.- С. 165-168.

165. Шеремет О.В. Характер роста чумного микроба на плотной дрожжевой питательной среде // Проблемы особо опасных инфекций.-Саратов, 1978.- Вып. 4 (62).- С. 28-31.

166. Шеремет О.В., Кондрашева Л.Д. Синтетическая питательная среда для культивирования возбудителя чумы при различной лимитации в стационарную фазу периодической культуры // Там же.- С. 157-158.

167. Шеремет О.В., Карташева Л.Д., Зинченко Л.Н., Терентьев А.Н. Выращивание бактерий Y. pestis при различных лимитирующих воздействиях в стационарную фазу периодической агаровой культуры // ЖМЭИ.- 1994.- № 5.-С. 78-79.

168. Шлегель Г. Общая микробиология.- М.: Мир, 1987.- 566 с.

169. Шпилевая Э.Г., Тинкер А.И., Гончарова М.Н., Таран И.Ф. Культивирование чумного микроба на средах из непищевого сырья в производственных условиях.- Ставрополь, 1993.- 155 е.- Библ.: 428 назв.-Русс.-Деп. в ВИНИТИ 26.02.93, № 478-В 1993.

170. Шульц В.Н., Кудлай Д.Г. Опыт стимуляции роста бруцелл // Микробиол. журн.- Киев, 1947.- Т. IX, № 1.- С. 99.

171. Шунаев В.В. К вопросу о росте В. pestis на крови животных, имеющих видовой иммунитет к чуме // Изв. Иркутск, гос. н.-и. противочум. ин-та Сибири и Дальнего Востока.- 1935.- Т. 2.- С. 12-14.

172. Шунаев В.В., Красикова М.А., Кручинина К.Е., Свиридова Л.С. Кислотные гидролизаты казеина и мяса как основа стандартных питательных сред // Матер, науч. конф. по природной очаговости и профилактике чумы (февр., 1963 г.).- Алма-Ата, 1963.- С. 270-271.

173. Юргина З.А. Применение казеиновых сред для выращивания чумного микроба //Тр. ин-та «Микроб».- I960,- Вып. 4.- С. 508-513.

174. Ящук А.П. Подбор оптимальных питательных сред для выращивания В. pestis. Среда Филдса и ее применение // Вестн. микробиол., эпидемиол. и паразитол.- 1939.- Т. XVIII, вып. 1-2.- С. 34-43.

175. Arntzeen L., Frean I.A. The laboratory diagnosis of plague: "Int. Workshop" Rodent Biol. And Interg. Pest Manag. Aft., Morogoro, Tanzania, 21-25 oct., 1996/Belg. I. zool.- 1997.- Vol. 127.- P. 91-96.

176. Balestra G.M., Misaghi I.J. Increasing the efficiency of the plate counting method for estimating bacterial diversity // J. Microbiol. Meth.- 1997.30, N2.- P. 111-117.

177. Barreto Michael, Critchley Alan Т., Straker Colin J. Extracts from seaweeds can promote fungal growth // J. Basic Microbiol.- 2002.- 45, N 5.- P. 302-310.

178. Barroetabena M.F., Rodriguez M.C., Zhurbenko R. Obtencion de hidrolizado enzimatico de caseina para medios de cultivo. Seminario Cientifico del cenic.- Ciudad Habana, 1988.

179. Berry A., De-Vault J.D., Chakrabarty A.M. High osmolarity is a signal for mucoid and Pseudomonas aeruginosa strains I I J. Bacteriol.- 1989.- Vol. 171, N5.- P. 2312-2317.

180. Bezkorovainy A., Solberg L. Ferrous iron uptake by Bifidobacterium breve // Biol. Trace Elem. Res.- 1989.- Vol. 20, N 3.- P. 251-267.

181. Biorn M. I., Sokol R.A., Iglewski B.N. Influence of iron on yields of exytracellular products in P. aeruginosa culture // J. Bacterid.- 1979.- Vol. 138, N l.-P. 193-200.

182. Bouvet O.M., Pernoud S., Grimont P.A. Temperature-dependent fermentation of D-sorbitol in Esherichia coli 0157:H7 II Appl. Environ. Microbiol.- 1999.- V. 65, N 9.- P. 4245-4257.

183. Brubaker R.R., Surgalla M.L. The effect of Ca and Mg on lysis growth and production of virulence antigens by P. pestis II J. Infect. Dis.- 1964.- Vol. 114.- P. 13-25.

184. Charnetzky W.T., Brubaker R.R. RNA synthesis in Yersinia pestis during growth restriction in calcium deficient medium I I J. Bacteriol.- 1982.- Vol. 149, N3.- P. 1089-1095.

185. Cornelis G., Laroche Y., Balligand G., Sory M.P. Wauters G. Yersinia enterocolitica, a primary model for bacterial invasiveness // Rev. Infect. Dis.-1987.-Vol. 9, N 1.- P. 64-87.

186. Flambard В., Helinck S., Jean R., Vincent J. The contribution of caseins to amino acid suppli for Lactococcus lactis depends on the type of cell envelope proteinase 11 Appl. And Environ. Microbiol.- 1998.- Vol. 64, N 6.- P. 1991-1996.

187. Fukushima H., Gomyoda M. Growth of Yersinia pseudotuberculosis and Yersinia enterocolitica biotype 3B serotype 03 inhibited on cefsulodin-irgosan-novobiocin agar // J. Clin. Microbiol.- 1986.- Vol. 24, N 1,- P. 116-120.

188. Gotshalk G. Метаболизм бактерий / Пер. с англ.-M: Мир, 1982.-310 с.

189. Hayaski К., Seino A., Kasumi Т. Bacteriolytic enzyme produced by Streptomyces sp II J. Ferment Technol.- 1981.- Vol. 59, N 4.- P. 319-323.

190. Herbert D. Studies on the nutrition of P. pestis and factors effecting the growth of isolated cells on an agar surface // Brit. J. Exper. Path.- 1949.- Vol. 30.-P. 509-519.

191. Higuchi K., Carlin C.E. Studies on the nutrition and physiology of Pasteurella pestis. l.A casein hydrolyzate medium for the growth of Pasteurella pestis II J. Bacterid.- 1957.- Vol.37.- P. 122-129.

192. Hymowitz Т., Palmer R.G., Hadley H.H. Seed weight, protein, oil fatty acid relation.- Ships within genye Glycine // Trop. Agric.- 1972.- V. 49, N 3.- P. 245-250.

193. Leighton P.M., Macsween H.M. Yersinia hepatic abscesses subsequent to longterm iron therapy I I J. Amer. Med. Ass.- 1987.- Vol. 257, N 7.- P. 964-965.

194. Macfarlane D.E., Elias-Jones Т.Е. Improved media for the culture of Neisseria gonorrhocea // J. Med. Microbiol.- 1980.- Vol. 13, N 4.- P. 597-607.

195. Marcheva D.S., Nicolova S.F., Rachev R.H., Veljanov D.K. Growth temperature effect on the characteristics of Yersinia pseudotuberculosis catalases // Докл. Болгарской АН.- 1989.- Т. 42, N 6.- С. 93-96.

196. Merck Е. Culture Media Handbook.- Darmstsdt, 1988.- P. 184-188.

197. Meyer K.F., Batchelder A.P. Selective medium in the diagnosis rodent plague // J. Infect. Dis.- 1926.- N 39.- P. 370-385.

198. Miller Russell G., Malolinson Edward. Salmonellae preferential media: Пат. 5871944 США.- The University of Maryland.- N 887274; Опубл. 16.02.99.

199. Morio A., Yukinobu N., Yamada Tetsuya. Protein production by yeast in acidic cultural condition II Agr. And Biol. Chem.- 1978.- Vol. 42,N12.-P.91-92.

200. Mustakas G.C., Sohns V.E. Soy processes, equipment, capital and processing costs. Cereal foods world, 24 8., 1979.- P. 320-339.

201. Naktin J., Beavis K.G. Yersinia enterocolitica and Yersinia pseudotuberculosis II Clin. Lab. Med.- 1999.- Vol. 19, N 3.- P. 523-536.

202. Nimcevic D., Schuster M., Gapes J. R. Solvent production by Clostridium beijerinckii NRRL B, 592 growing on different potato media // Appl. Microbiol., and Biotechnol.- 1998/- Vol. 50, N 4.- P.- 426-428.

203. Oka N., Yoshitace T.,Wada E. Inhibitory effect of manganous ion on nitrifying bacteria // Trans. 14th Int. Congr. Soil Sci., Kyoto, Aug., 1990.- Kyoto, I990.-Vol. 4, N 4.- P. 756-757.

204. Peptones, Hydrolysates and Biological Extracts.- 1986.- P. 1-18.

205. Pinto M.F., Ponsano E.H.G., Castro-Gomez RJ.H. Antibiose relacionada a cultivo de Lactobacillus acidophilus. 1. Selecao de linhageme estudo de meio de cultivo alternative a base de soro de queijo. Arq. // Biol. Tecnol.- 1996.- 39 (2).- P. 247-257.

206. Piroth L., Meyer P., Bielefeld P., Besancenot J.F. Yersinia bacteremia and iron overload // Rev. Med. Interne.- 1997.- Vol. 3, N 12.- P. 932-938.

207. Raw Materials for Culture Media Fermentation // Organotechnie.-La Courneuve, 1989.-N 19.004, 19.501, 19.516, 19.544.

208. Rochenmacher M., James H.A., Seberg S.S. The nutrition and physiology of P. pestis. 1. A chemically defined culture medium for P. pestis // J. Bacteriol.- 1952.- Vol. 63.- P. 788-794.

209. Rroland F.R. Salt-starch lysine deoxycholate agar. A single medium for isolation of sodium and non-sodium dependent enteric gram-negative bacilli // Med. Microbiol, and Immunol.- 1996.- Vol. 163, N 4.- P. 241-249.

210. Russell P., Nelson M., Whittington D., Green M., Eley S.M., Titdall R.W. Laboratori diagnosis of plague // Brit. J. Biomed. Sci.- 1997.- Vol. 54, N 4.-P. 231-236.

211. Sair L. Proteinaceous soy composition and method of preparing: US Patent 2881076, 1959 Griffith Laboratories Incorporation.

212. Schivo Maria Laura, Loi Giovanni, Saddi Barbara, Serra Corrado. Culture medium for insolating and typing helicobacteria, in particular Helicobacter pylori I/ Microbiol S.n.c.- N 98113950.4. Опубл. 10.03.1999.

213. Siems H. Auswahi von Selektivmedien zur Ertassung von Staphylococcus aureus in Lebensmitteln // Lebensmitteltechnic.- 1980.- Bd. 12, N. 6.- S. 71-75.

214. Sokhey S.S. Experimental studies on plague // Ind. J. med. Res.- 1939.-V. 27, N2.-P. 313.

215. Stephens P.J., Johnsos J.A. Direct inoculation into media containing bile salts and antibiotics is unsuitable for the detection of acid/salt stressed Escherichia coli 0157.H7 // Lett. Appl. Microbiol.- 1998.- Vol. 27, N 3.- P. 147151.

216. Todorov S., Gotcheva В., Dousset X., Onno В., Ivanova I. Influence of growth medium on bacteriocin production in Lactobacillus plantarum ST 311/ Biotechnol. And Biotechnol. Equip.- 2000.- 14, N 1.- P. 50-55.

217. Weber C.R. Inheritance and interrelation of some agronomic and chemical characters in an inter specific cross in soy beans, Glycine Max x G. ussuriensis // Agr. Exp. Stat. Bui. Iowa.- 1950.- N 374.

Информация о работе

Старцева, Ольга Леонидовна
кандидата биологических наук
Ставрополь, 2005
ВАК 03.00.23

Диссертация

Совершенствование биотехнологии производства питательных сред для культивирования чумного микроба на основе сырья животного и растительного происхождения - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы