Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Использование питательной среды на основе кукурузного экстрата в производстве чумной вакцины ЕВ

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Использование питательной среды на основе кукурузного экстрата в производстве чумной вакцины ЕВ"

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ РОССИИ ПО САНИТАРНО -ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОМУ НАДЗОРУ РОССИЙСКИЙ НАУЧНО - ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ПРОТИВОЧУМНЫЙ ИНСТИТУТ 'МИКРОБ*

На правах рукописи

ГЮЛУШАНЯН КАРИНА СТЕПАНОВНА

УДК 579. 842. 23-085. 371

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ НА ОСНОВЕ КУКУРУЗНОГО ЭКСТРАТА В ПРОИЗВОДСТВЕ ЧУМНОЙ ВАКЦИНЫ ЕВ

03. 00. 07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Саратов - 1994

Работа выполнена- в Ставропольское «аучно-исстедппательском противочумном институте

Научные руководители: доктор тедицинских наук, профессор ГИНКЕР А.И. доктЪп биологических наук МАЙСКИЙ В.Г.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор ФИЛИППОВ А.Ф.; кандидат бичлогических наук, старший научный сотрудник СЕРГЕЕВА Г.М.

Ведущая организация: Ростовский научно-исследовательский противочумный институт

Автореферат разослан "Я& " .

Запета состоится "3/ " 1994г.

в Ю часов на заседании специализированного Совета Д 074.32.01 при Российском научно-исследовательском противочумном институте "МИКРОБ" (410071, г.Саратов, ул.Университетская, 461.

С диссертацией мскнОг ознакомиться в научной библиотеке института "МИКРОБ".

Ученый секретарь специализированного Совета, доктор биологических наук

Г.А.Корчеев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В условиях рыночной экономики приобретает большое значение повышение качества коммерческой продукции и снижение ее себестоимости. Эти требования в полной мере относятся к производству профилактических препаратов, в том числе и к чумной живой вакцине ЕВ. Биотехнология ее довольно хорошо отработана. Однако, еще существуют резервы совершенствования различных этапов изготовления препарата. Прежде всего это касается вопроса увеличения выхода биомассы,которая является исходным сырьем, в значительной мере определяющим качество вакцины. А.М.Бовдаренко с соавторами I1992) было показано, что на этапе замораживания-вцсушкания выявляются дефекты клеток, связанные с процессом культивирования.

Б производстве бактерийных препаратов необходимо иметь среды, обеспечивагацие максимальный выход микробной массы, состоящей из популяции клеток, обладающих всеми типичными свойствами, присущими исходной культуре.

Для получения биомассы в процессе производства экспериментальных и коммерческих серий чумной вакцины бшш использованы различные питательные среды, изготовленные из мяса, рыбы, казеина, кровяных сгустков, кукурузного экстракта, сои, аминопептида и т.д. (Е.И.Коробкова, 1956; Е.Э.Бахрах с соавт., 1960; И.В.До-марадский с "соавт». 1961; Н.Ф.Быстрый с соавт., 1961; И.И.Николаев с соавт., 1964, 1969; А.А.Канчух с соавт., 1964; А.И.Тинкер с соакг., 1966, 1985; Н.К.Муравьева, 1969; А.Ф.Филиппов с соавт., 1970, 1973; М.А.Красикова и А.А.Рогачева с соавт., 1974; Б.Н.Милютин с соавт., 1975; Э.Г.Шпилевая с соавт., 1983; О.В.Шеремет, 1978, 1983; Т.Н.Фунтикова с соавт., 1985 и др.).

Однако, из числа указанных сред в промышленном выпуске чумной вакцины применялись только две среды, из гидролизатов мяса или казеина по Хотткнгеру. В процессе же изготовления препарата в Ставропольском институте в течение 35-летнего периода использованы только мясные среды и попытка замены их казеиновыми соп-рововдалась резким снижением жизнеспособности вакцины. •

Разработка питательных сред для коммерческого выпуска чумной вакцины из других основ по разным причинам не была доведена до конца. Наиболее полно в этом отношении изучены среды, приготовленные на кукурузной основе, которые представляют интерес в связи с возможностью замены дорогостоящего сырья более дешевым непищевым.

Первые попытки использовать кукурузные среды с указанной целью были сделаны А.А.Канчух с соавторами (1961,1964). Они применяли кислотные гидродизаты кукурузного экстракта сгущенного. Качество чучпой вакцины, приготовленной на этой сроде, соответствовало требованиям нормативно-технической документации, но промышленная технология культивирования биомассы не была соблюдена. Микробные клетки выращивали в матрацах.

З.А.Чернова с соавторами (1987) использовала сухую среду Майского-Куцемакиной, созданную ка основе кукурузного экстракта, в процессе производства чужой вакцины в АКМ-Ш. Ими бшг отмечен факт, имеющий решающее значение при выборе коммерческих серий питательной среда, заключающийся в том, что концентрация микробной взвеси вдвое, втрое уступала, а - биологическая, наоборот, вдвое превосходила рост на СМК по сравнению с агаром Хоттингера. Это авторы объясняли тем, что СМК - высокопитательный агар, но с низким содержанием аминного азота. Полученные результаты согласовывались с выводами Э.Г.Шпилевой (1983) о том, что несмотря на

доступность растительных субстратов, они не получили широкого распространения в производстве бакпрепаратов из-за невысокого показателя аминного азота.

Повысить его содержание в среде можно за счет комбинации переработанных продуктов растительного и животного происхождения, богатых белковыми субстратам. На это также указывали Э.А. Чернова с соавторами ^1987).

Сказанное выше делает понятным необходимость изучения возможности конструирования комбинированных питательных срод на основе дешевых я недефищганых веществ, которым является кукурузный экстракт, в сочетании с казеином, аминопептидом и т.д.

В то же время современные требования предусматривают использование наиболее стандартных сухих питательных сред. В процессе производства чумной вакцины ЕВ такие среды до сих пор не применяется, поэтому разработка их является решением еще одной необходимой задачи.

Учитывая, что питательные агары, полученные из кукурузного сырья, обеспечивают рост высокого процента колоний при низких посевных дозах, целесообразно использовать их для определения жизнеспособности клеток в суспензиях.

Следовательно, разработка унифицированной сухой питательной среды на кукурузной основе в сочетании с переварами из белковых непищевых веществ является актуальной проблемой как для накопления биомассы, так и определения жизнеспособности клеток в процессе производства чумной вакцины ЕВ.

Цель работы: конструирование комбинированных питательных сред на основе дешевых и недефицитных веществ, которым является кукурузный экстракт в сочетании с продуктами гидролиза белковой природы и использование их в производстве чум-

ной вакцины ЕВ.

Задачи исследования:

- показать возможность замены агара Хоттингера из мясного гидролизата средой из непищевых основ в процессе производства чумной вакцины ЕВ;

- провести сравнительное изучение продуктивности питательных сред, приготовленных из мяса, кукурузного экстракта, амино-пептида, казеина или их сочетаний;

- приготовить сухую питательную сроду для накопления биомассы чумного микроба из непищевых основ, сравнительно дешевую и соответствующую требованиям для производства профилактических препаратов;

- изготовить экспериментально-производственные серии чумной вакцины ЕВ в промышленных условиях с использованием разработанной среды, определить их качество в соответствии с гГГД и внедрить в практику результаты НИР;

- изучить возможность использования оптимизированной сухой питательной среди для контроля жизнеспособности клеток в процессе производства чумной вакцины ЕВ и внести ее в РП на выпуск препарата.

Научная новизна. Впервые сконструирована стандартная сухаэ кукурузш-казеиковая среда, используемая для накопления биомассы в процессе производства чумной вакцины ЕВ и определения жизнеспособности ее на этапах изготовления и контроля готового препарата.

Впервые предложено для конструирования питательной среды в производстве чумной вакцины ЕВ сочетание основ кукурузного экстракта и казеина, обеспечивающих необходимую потребность в факторах роста бактерий вакцинного штамма, сравнительно дешевое и

исключающее дефицитное высокосортное мясо. Использование сухой среды позволит стандартизировать биотехнологию препарата за счет длительного применения одной серии со строго постоянными параметрами.

На основании комплексного изучения и апробации в условиях производственного отдела показано, что чумная вакцина ЕВ, приготовленная из биомассы, выращенной на кукурузно-казеиновой среде, по всем тестам (культурально-морфологические, биохимические свойства, внешний вид, остаточная влажность, хшзнеспособность, безвредность, иммуногенность и т.д.) соответствовала требованиям ФС 326 ВС-92 и РП № 368-92.

Полученные результаты могут быть использованы и при производстве других профилактических препаратов.

Практическая ценность:

1. Сконструирована сухая кукурузяо-казеиновая питательная среда для производства чумной вакцины ЕВ.

2. Приготовленные экспериментально-производственные серии чумной вакцины ЕВ из биомасс, выращенных на кукурузно-казеиновом агаро,. получили положительное заключение ЛСК ШСК им.Л.А.Тарасе-вича. -

3. На основании результатов исследований включена, в. РП №36892 на вакцину чумную сухая кукурузно-казеиновая питательная среда для:

- выращивания биомассы чумного вакцинного штамма ЕВ;

ч- определения, выживаемости* микробов в биомассе на этапах приготовления препарата и\контроля готовой продукции.

4. По материалам исследований составлены и утверждены 14. 10.87 г на Ученом Совете НИЛЧИ Кавказа и Закавказья "Методические рекомендации по использованию агара из кукурузного экстракта

и СМК (среда В.Г.Майского и А.З.Куцемакиной) на различных этапах контроля при производстве чумной живой сухой вакцины и в СЕК".

5. Данные исследований и положительное заключение ЛСК ГИСК им. Л.А.Тарасевича на качество чумной вакцины ЕВ были использованы в виде дополнительного обоснования для составления изменений 1 2 к РП Д> 37-86 на внедрение сухой посевной производственной культуры.

Материалы диссертации доложены на 6 краевой научной конференции, посвященной 70-летию Великой Октябрьской социалистической революции (г.Ставрополь, 1987), на итоговой научной конференции "Актуальные вопросы эпидемиологии, профилактики и диагностики особо опасных инфекций" С г. Ставрополь, 1989), на областной научной конференции молодых ученых "Эпизоотология, микробио' логия к иммунология" (Ростов-на-Д1ону, 1989), на межлабораторной конференции Ставропольского научно-исследовательского противочумного института (Ставрополь, 1994).

Публикации. Основное содержание отражено в 7 опуб линованных работах.

Положения, выносимые на защиту:

1. Необходимость конструирования сухой питательной среды из непищевого сырья для производства чумной вакцины ЕВ.

2. Оптимальный способ приготовления питательных основ .для агаризованной среды.

3. Отработка условий получения сухой стандартной среды.

4. Штериалы по изучению и внедрению чумной вакцины ЕВ, приготовленной с использованием сухой стандартной питательной среды из непищевого сырья.

5. Возможность использования разработанной питательной ср<

для определения живых микробных меток в биомассе и ресуспензи-рованной чумной вакцине ЕВ.

Структура работы. Диссертация состоит из введения, 1 главы обзора литературы, 5 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы. Работа иллюстрирована 45 таблицами и 1 рисунком, 2 фотографиями. Библиографический указатель содержит 242 литературных источника, в том числе 206 работ отечественных и 36 зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Материалы и методы. В работе были использованы вакцинный штамм чумного микроба ЕВ линии НИИЭГ и вирулентный № 461; питательные основы и среды: основной гидроли-зат мяса (аминный азот 700 мг#), основные ферментативные гидро-лизаты ЭКС — экстракта кукурузного сгущенного (аминный азот 420 М1$) и казеина (аминный азот 420 основные зшслотныс гидро-

лизаты ЭКС (аминный азот 525 мг$) и казеина (аминный азот 450.11$), . основной щелочной гидролизат ЭКС (аминный азот 456 фермен-

тативный гидролизат крови животных (аминный азот 450 ЭКВ

(экстракт кукурузный водорастворимый), мясной бульон Хоттингера (аминный, азот 200±10 мг$ , рН 7,1^0,1), ферментативный кукурузно-казеиновйй бульон (аминный азот 145±10 мг#, рН 7,140,1), тиогли-колевая среда (рН 7,2±0,2), глютаминовая и тиомочевиновая среды высушивания (рН 7,2-0,2); соли и агар-агар в соответствии с ГОСТами, указанными в РП № 37-86.

Основными объектами исследования служили: коммерческие серии чумной вакцины ЕВ, приготовленные из биомассы, выращенной на мясном агаре Хоттингера; экспериментальные серии чумной вакцины ЕВ, приготовленные из биомасс, выращенных на агарах: мясном Хот-

тингера, ферментативном кукурузном, кислотном кукурузном, щелочном кукурузном, кукурузно-аминошптидном, кукурузно-казеиновом; экспериментально-производственные серии чумной вакцины ЕВ, приготовленные из биомасс, выращенных на кукурузных агарах в сочетании с мясным гидролизатом, аминопентидом и казеином (амйнный азот указанных сред 125±25 рН 7,1^0,1).

Экспериментальные и экспериментально-производственные серии чумной вакцины готовили согласно требованиям ТУ 42.14.214-81 и РП № 37-86.

Изучение биологических, культурально-морфологических, иммунологических и физических свойств проводили в соответствии с РП № 37-86, приказом № 31 МЗ СССР от 23.01.83, ТУ 42.14.214.81, ВФС 42-149 ВС 88, ФС 42-326 ВС-Э2 и "Методическими рекомендациями по определению термостабильности живых сухих вакцин и прогнозированию их жизнеспособности в процессе хранения" 11984).

Для приготовления ферментативных гидролизатов мяса и казеина пользовались методами, изложенными в РП № 37-86.

Ферментативный гидролиз ЭКС прово,цили в реакторе при температуре 136±1)°С в течение 9-10 суток и в бутьиях но ускоренному методу при температуре (47±1)°С в течение 3-4 дней с помощью поджелудочной железы крупного рогатого скота при рН 8,1±0,1. Соотношение ЭКС и водопроводной воды составляло 1:1,5.

Кислотный гидролиз ЭКС и казеина осуществляли 2//соляной кислотой в автоклаве при (110-1,О)°С в течение одного часа.

Для приготовления щелочных гидролизатов равные количества ЭКС и 20^-го раствора едкой щелочи перемешивали, через 24 часа добавляли водопроводную воду (на 1 обьем смеси 9 объемов воды) и проводили гидролиз при (36±1)°С в течение 48 часов.

ЭКВ получали из ЭКС IБ.Г.Майский, А.З.Куцемакина, а.с.662583)

Высушивание кукурузно-казеинового агара осуществляли в установке для судки белковых гидролизатов. Для этого ферментативные гидролизаты кукурузного экстракта и казеина соединяли в соотношении 2:1, определяли количество амииного азота и рН. В зависимости от объема смеси гидролизатов и содержания в них амин-ного азота расчитывали окончательный обьем партии, содержащей (125±10) иа$ шинного азота и вносили соответствующее количество солей и агар-агара. Высушивание вели при температуре (80*2)°С, под вакуумом не менее 0,6 атмосфер.

Качество гидролизатов и сухого кукурузно-казеинового агара оценивали согласно Приказу № 31 МЗ СССР от 13.01.83г (сборник инструкций). Прочность студня изучали по методу Валента в соответствии с "Методическими указаниями по применению физико-химических методов контроля питательных сред", М.1977, а показатель эффективности агара - с "Методическими рекомендациями к контролю питательных сред ш биологическим показателям", М.-1980.

Разделение свободных аминокислот, входящих в состав питательных сред, проводили методом бумажной хроматографии в модификации Т.С.Пасхиной (1964).

Материалы статистически обрабатывали методами вариационной статистики (П.И.Сызранцев, 1938; И.П.Ашарин, А.А.Воробьев,1962; В.Ю.Урбах, 1975).

2. Конструирование питательной среды на основе кукурузного экстракта и продуктов белковой природы для выращивания • чумного вакцинного штамма ЕВ

Исследования были начаты с изучения накопительных свойств сухого агара СМК, разработанного В.Г.Майским и А.З.Куцемакиной (а.с. 662583 от 06.10.77) для диагностических целей, с содержанием аминного азота 75 мг%. В среду был добавлен агар-агар до 3%

в качестве дополнительного отвердителя. Данные опытов показали, что урожай м.к. на агаре СМК был в несколько раз ниже, чем на мясном - Хоттингера, что по-нашему мнению было связано с недостаточным содержанием в нем аминного азота, лимитируюцего интен--сивный рост культуры. Был проведен хроматографический анализ содержания некоторых аминокислот в бульоне СМК и Хотткнгера, существенных для роста чумного микроба. Отмечено, что количественное соотношение содержания их в исследуемых бульонах примерно одинаково. В процессе роста вакцинного штамма ЕВ на бульоне СМК содержание глицина и лейцина понижалось более, чем в 2 раза. Аминокислоты фепилаланин и мстионин потреблялись практически полностью. В бульоне Хотткнгера содержание исследованных аминокислот почти не понижалось вследствие предпочтительного использования низкомолекулярных пептидов (В.Г.Майский,А.З.Куцемакина,1978). Таким образом, более низкое содержание аминокислот в готовом бульоне CIVIK по сравнению с бульоном Хоттингера, почти полное их потребление позволили нам считать целесообразным добавление к кукурузной среде других питательных основ, содержащих высокие показатели аминного азота.

В связи с этим, к агару СЖ добавляли разный процент (от 5 до 50) мясного гкдролизата, полученного по методу Хоттингера (MIX). Нами было показано, что повышение аминного азота в СМК до 125 мг# за счет lOfc МГХ увеличивает выход жизнеспособной биомассы до уровня контроля (агар Хоттингера с "показателем аминного азота 125 мг#). Были проведены аналогичные опыты в производственных условиях с использованием АШ-Ш и соблюдением всех требований НТД. В результате подтверждены экспериментальные данные и чудшая вакцина ЕВ соответствовала требованиям ФС и РП.

Однако, мы не могли считать решенной поставленную задачу

иь-за того, что использование мяса не било полностью исключено из цикла производства. В связи с этим, мы сочли целесообразным искать другие источники белка. Б.М.Раскин (1985) считая, что перспективным в конструировании питательных сред может явиться аминопептид, представляюций собой ферментативный или кислотный гидролизат крови животных. С его применением нами было сконструировано 5 видов сред. Одна - из экстракта кукурузного водорастворимого (ЭКВ) с добавлением солей и микроэлементов по прописи Майского, две - в нашей модификации, заключающейся в дополнительном промывании агар-агара сульфитом натрия и увеличении добавки ЭКВ от 40 г/щ до 100 гдя, и две среды - из экстракта кукурузного сгущенного (ЭКС) по прописи Майского и Хоттингера (набор необходимых солей). К указанным средам добавляли аминопептид в соотношениях 4:1; 6:1; 8:1; 20:1. Продуктивность комбинированных агаров и выживаемость м.к. статистически не отличались- от контрольной среды и были не ниже требуемых Р11. Это явилось основанием в следующих экспериментах уменьшить концентрацию аминопептида до 5%.

Таким образом, показано, что добавление к кукурузному агару аминопептида повышало его питательные свойства, но наблюдался значительный расход сырья (ЭКС), который можно было, по-нашему мнению, снизить за счет его гидролиза и соответственно увеличить в нем аминный азот.

Учитывая это, нами были приготовлены ферментативные, кислотные и щелочные гидролизаты ЭКС и из них изготовлены 9 вариантов питательных сред. Наилучшими свойствами по продуктивности и • жизнеспособности выращенной биомассы облапал агар из кукурузного экстракта ферментативного гидролиза. Ферментативный гидролиз кукурузного экстракта повышал показатель аминного азота до(420-

450) что и способствовало значительному улучшению качества среды.

Однако, предыдущие наши исследования показали, что наилучшими свойствами обладали комбинированные среды, приготовленные из кукурузных основ и аминопептида. Поэтому, следующим этапом исследования явились аналогичные прописи агара, в которых кукурузный экстракт был заменен его гидролизатами (ферментативный, кислотный и щелочной). К ним добавляли 1/20 часть аминопептида. Показано, что наилучшие результаты остается при использовании ферментативного перевара с добавлением к нему Ъ% аминопептида. В производственных условиях из биомассы, выращенной на указанном агаре, была приготовлена чумная вакцина ЕВ. Она по всем свойствам полностью отвечала параметрам, заложенным в ФС и РП.

Таким образом, в процессе выпуска коммерческих серий чумной вакцины ЕВ возможно использование комбинированной питательной среды, состоящей из кукурузного гидролизата ферментативного и небольшого количества аминопептида в виде протеиновой добавки. Агар не уступает применяемому в настоящее время мясному агару Хоттингера ни по продуктивности, ни по качеству готового препарата. Этим показана принципиальная возможность замены дефицитных мясных питательных сред экономически более выгодными.

В то же время из-за того, что аминопептид оказался труднодоступным сырьем, целесообразно было продолжить поиски белкового компонента среды для производственных целей.

3. Применение кукурузно-казеинового питательного агара для выращивания биомассы чумного вакцинного штамма ЕВ

Учитывая полученные наш данные, полноценными можно считать комбинированные питательные среды на основе ферментативных гид-ролизатов кукурузного экстракта сгущенного в сочетании с продук-

тами гидролиза белков. В этом отношении целесообразно в качестве добавки испытать перевары казеина, одного Из наиболее ценных пищевых белков, в состав которых входит полный набор незаменимых аминокислот, но в то же время продукта, не так широко используемого по сравнению с мясом. В связи с этим, в настоящем исследовании наш была поставлена задача изучить возможность использования кукурузно-казеинового агара в производстве чумной вакцины.

Приготовленные кукурузные и казеиновые кислотные (.КУШ и КАГК), а также ферментативные (КУЮ и КАГФ) гидролизаты по методу Хоттингера и в нашей модификации, по ускоренному способу ферментации, доводили до (125t 10) мг£ амшшого азота и соединяли в различных соотношениях (1:1; 1:2; 2:1). Оптимальные результаты при исследовании нативкой взвеси были отмечены при использовании комбинированных агаров из КУК? и КАГФ в сочетании 2:1. Выход биомассы с единицы питательной среды и ее жизнеспособность были существенно вше по сравнению с контролем (агаром Хоттингера). После разведения концентрированной микробной массы средой высушивания до 80 млрд в мл наиболее высокое качество вакцинной суспензии лаблкдали при выращивании гл. к. на агаре в том же сочетании из КУЙ и КАГФ, полученных по ускоренному способу.

Основным показателем качества накопительной среды является количество выросшей биокассы, во многом определяемое используемым посевным материалом. С целью объективной оценки разрабатываемой кукурузно-казеиновой среды, нами был изучен указанный этап производственного цикла. Засев среды из КУИ? и KAI^S в соотношении 2:1 осуществляли регидратированным изотоническим раствором хлорида натрия м.к. ООО чумного микроба (вакцинного штамма ЕВ)

или двухсуточной маточной культурой второй генерации в дозе 3,3*10^-10'10® живых м.к. в мл агара. Выросшие клетки смывали тиомчевиновой средой высушивания. Полученные результаты еще раз подтвердили литературные данные о том, что для засева питательных сред с целью получения промышленных количеств микробной биомассы для выпуска профилактических препаратов можно использовать не только разные генерации производственных культур, но и сухой посевной материал.

Поэтому, в следукщей серии опытов мы применяли для засева кукурузно-казеинового агара сухие культуры в указанной выше концентрации. Для дополнительной характеристики сконструированной нами среды изучали ее качество при повторном выращивании. Для этого после первичного культивирования м.к. на кукурузно-казеи-новом агар.е при (27±1 )°С в течение 48 часов биомассу смывали тиомочевиновым стабилизатором. Затем на одну часть агаров наслаивали 9 мл кукурузно-казеинового бульона с содержанием (145±10) М1$ аминного азота, на другую - такое же количество исходного ферментативного перевара с аминным азотом 420 Через 2 часа остатки невпитавшейся жидкости сливали и среды помещали еще на 2-е суток при (27±1)°С. М.к. смывали тиомочевиновой средой высушивания. Полученные данные показали, что независимо от регенерирующего состава (бульон или основа) выход м.к. с мл питательной среды снижался приблизительно на 25$, что указывало на высокий процент ее восстановления. Для окончательного суждения о качестве комбинированного кукурузно-казеинового агара необходимо было приготовить экспериментально-производственные серии чумной вакцины ЕВ в строгом соответствии с требованиями регламента.

С этой цчлью биомассу выращивали на агаре в АКМ-Ш. Среду

с

засовали регидратированными клетками в дозе. 10*10 на мл, что в несколько раз ниже предусмотренной РП № 37-86 на чумную вакцину. Остальные этапы не отличались от производственных.

В результате, экспериментально-производственные серии по морфологии клеток, выживаемости, термостабильности, безвредности, иммуногенности, стерильности, остаточной влажности и т.д.

были идентичны производственным. Что касается общего выхода м.

13

к. с экспериментального агара, он составил 90-10 с одного ап-

а

парата или 7,5'10 с мл питательной среды. Это было существенно выше, чем при коммерческом выпуске чумной вакцины, поскольку

соответствующий выход по данным А.И.Тинкера с соавторами 11993)

я я

составил от 2'10 до 4-10 .

4. Использование сухого кукурузно-казеинового агара для приготовления экспериментальных и экспериментально-производственных серий чумной вакцины ЕВ

Согласно современным требованиям нормативно-технической документации выпуск питательных сред предусмотрен в сухом виде. Для приготовления сухого кукурузно-казеинового питательного агара смешивали 28 л кукурузного экстракта ферментативного гидролиза с содержанием аминного азота 420 ыт% и 14 л казеинового ферментативного гидролизата с содержанием аминного азота 420мг%, что составляло соотношение основ 2/3 к 1/3. К смсси добавляли хлористый натрий - 480 г, натрий фосфорнокислый двузамещенный -320 г, натрий сернистою!слый - 64 г, молибденовокислый аммоний-80 г и агар-агар - 4800 г. Высушивание проводили в установке для сушки белковых гидролизатов, после чего определяли качество сухого кукурузно-казеинового агара по основным показателям: \

\

растворимость, прозрачность и цветность, содержание хлоридов натрия, прочность студня, величина аминного азота, рН, остаточ-

ная платность, показатель эффективности.

После определения соответствия качества агара требуемым параметрам, изучали возможность использования сухой кукурузно-казеиновой среды для накопления биомассы в процессе производства чужой вакцины ЕВ. Опыты проводили с использованием матрацев и АКМ-Ш как при первичном, так и при повторном выращивании биомассы. Из дее готовили экспериментальные и экспериментально-производственные серии чумной вакцины ЕВ. Нами было изучено 11 экспериментальных и 4 экспериментально-производственных серий вакцины из биомасс первичного и повторного выращиваний с исполь зованием как глютаминовой, так и тиомочевиновой сред высушивани Они соответствовали требованиям регламента и у большинства жизнеспособность существенно превышала контрольные образцы. В процессе хранения при (4±2)°С наиболее существенно снизилась жизнеспособность в контрольной серии. Это же подтверждается термостабильностью препаратов, поскольку между указанными показателя ш отмечена прямая зависимость. Результаты исследования иммуно-генных свойств показали, что Ед^ во всех сериях препарата былг значительно ниже верхнего лимита микробов, предусмотренного ФС. Физические свойства препаратов, культурально-морфологические, безвредность, растворимость также укладывались в рамки, предусмотренные НТД.

С целью изучения ростовых свойств сухой кукурузно-казеино-вой среды после длительного хранения (4,5 года) в рефрижератор* при (4^2)°С, нами были повторно приготовлены экспериментальные серии.

Все указанные выше серии чумной вакцины были отправлены в ЛСК Б1СК им. Л.А.Тарасовича на заключение. Данные контрольного института полностью подтвердили наши выводы.

Б заключении следует отметить, что весь коглплекс исследований позволил нам включить в биотехнологию чумной вакцины ЕВ использование сухой кукурузно-казеиновой среды для накопления биомассы, обеспечивающей высокое качество препарата. Кроме этого показано, что применение указанной среды позволит заменить дефицитное мясное сырье дешевыми основами. Внедрение кукурузно-ка-зеинового агара в производство препарата обеспечивает значительный экономический эффект, слагающийся как за счет более низкой стоимости сырья, так и за счет повышения продуктивности агара. Согласно полученным данным, при использовании сконструированной нами среды с одного АКМ-Ш было приготовлено 1367 тысяч подкожных человекодоз вакцины ЕВ, а с мясного агара Хоттингера только 936 тысяч, что на 31,5$ меньше. Внедрение сухой среды способствует стандартизации биотехнологии препарата, обусловленной длительностью применения агара, обеспечивающей его постоянные характеристики.

5. Изучение кукурузно-казеинового агара для определения выживаемости микробов в процессе приготовления чумной вакцины ЕВ

Одним из основных критериев качества чумной вакцины ЕВ является количество в ней живых м.к. Дмзнеспособность изучают культуральным методом, используя плотные питательные среды. В зависимости от качества агаров на них может вырастать неодинаковое количество м.к., в связи с чем в ФС-326 ВС-92 предусмотрены четкие требования дня оценки среды с целью определения количества живых м.к.

В настоящем исследовании изложены результаты экспериментов по изучению возможности применения 2% кукурузно-казеинового агара для определения выживаемости микробов на всех этапах произ-

водства чумной вакцины ЕВ.

Были апробированы 2$ кукурузно-казеиновне агары из жидких и сухих гидролизатов. Выживаемость м.к. определяли в нативной взвеси, т.е. сразу после смыва микробов с агара средой высушивания, через двое суток хранения в рефрижераторе (4±2)°С и разведения ее тем же стабилизатором до предусмотренной документацией концентрации, а также - в готовой продукции.

Показано, что указанные агары соответствовали существующим требованиям.

При оценке качества кукурузно-казеиновых агаров, приготовленных из сухих основ, хранившихся в рефрижераторе при (4±2)°С в течение 4-4,5 лет, показано, что экспериментальные агары не отличались от коммерческого казеиново-дрожжевого (Иркутского), используемого в производстве чумной вакцины. Ни в одном случае не было получено статистически достоверной разницы, что указывало на то, что сконструированная нами сухая среда за 4,5 года хранения практически не утратила своей питательной ценности. •

Были также исследованы ростовые свойства кукурузно-казеи-нового гелеобразного агара, хранившегося в течение года в рефрижераторе при (4±2)°С, т.е. после варки его из сухой основы, таких же агаров СМК и мясного Хоттингера. Показано, что изучаемые агары после их приготовления сохраняют неизменным свое качество в течение полугода при (4±2)°С. В последующие шесть месяцев ростовые свойства кукурузно-казеинового и СМК агаров незначительно снижаются, но мясной - Хоттингера полностью их-утрачивает .

Следовательно, кукурузно-казеиновый агар обладал высокими ростовыми свойствами, отвечавшими требованиям НТД для определения живых м.к. в чумной вакцине ЕВ. На основании этого он был

включен для определения специфической активности препарата в ФС 42-326 ВС-92, а агар СМК рекомендован с этой же целью согласно разработанным нами методическим рекомендациям.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что питательные агары, приготовленные из кукурузного экстракта, содержали низкий показатель аминного азота. Это обусловило более низкий выход биомассы, чем на мясном агаре Хоттингера. Повысить содержание аминного азота в среде можно за счет использования гидролизата кукурузного экстракта. Лучшим агаром по выходу жизнеспособной биомассы был агар, приготовленный из ферментативного перевара, полученного по классической методике Хоттингера. Биомасса, выращенная на средах из щелочных гицролизатов, отличалась очень низким содержанием ЖИВЫХ М.к. ■

2. Показано, что применение агаризоваяной питательной среды из ферментативного перевара кукурузного экстракта и продуктов гидролиза белкоЕой природы (.мясо, аминопептид, казеин) значительно повышало урожайность биомассы чумного штамма КВ. Наилучшими свойства™ обладали ферментативные перевары по сравнению

с кислотными и щелочными.

3. Сконструирован высокпитательный кукурузно-казеиновый агар для выращивания биомассы в процессе производства чумной вакцины ЕВ, состоящий из двух частей ферментативного гидролизата экстракта кукурузного водорастворимого и одной части ферментативного казеина. Агар является полноценным заменителем дорогостоящего дефицитного мясного агара, обеспечивает высокий урожай м.к. и сникает себестоимость продукции. .

4. Разработана технология приготовления сухого кукурузно-

казеинового агара. После соединения всех необходимых ингредиентов (гидролкзаты, агар-агар, соли и т.д.) обезвоживание осуществляли в специальной установке для сушки белковых гидролизатов при температуре 80°С и вакууме 0,6 атм. Сухой материал размельчали с помощью керамических шаров. Готовый агар расфасовывали по 500 г в полиэтиленовые пакеты и опаивали. Качество сухой среды при хранении в рефрижераторе (4±2)°С не снижалось в течение 4,5 лет Серок наблюдения).

5. Чумная вакцина ЕВ, приготовленная из биомассы первичного и повторного выращивания на кукурузно-казеиновом агаре, по всем требованиям соответствует нормативно-технической документации на препарат.

6. Экспериментальные и экспериментально-производственные серии чумной вакцины ЕВ, приготовленные из биомасс, выращенных на кукурузно-казеиновом агаре, получили положительное заключение JICK ГЛСК им.Л.А.Тарасевича. На основании исследований и рекомендаций контрольного института указанная среда включена в

РП №368-92 на вакцину чумную живую сухую в качестве накопительной.

7. Показано, что чувствительность СМК и кукурузно-казеино-вого агаров при определении выживаемости посевной культуры, на-тивной и вакцинной суспензии, готового препарата не уступает мясному агару Хоттингера. На основании этих данных составлены

и утверждены 14.10.87г на Ученом Совете НИДЧИ Кавказа и Закавказья "Методические рекомендации по использованию ai'apa из кукурузного экстракта и СМК Середа В.Г.Майского и А.З.Куцемакиной) на различных этапах контроля при производстве чумной живой сухой вакцины и в ОБК", а также кукурузно-казеиновый агар включен в ФС 42-326 ВС-92 и РП Ji 368-92 с той же целью.

8. Установлено, что чумная вакцина ЕВ, приготовленная на тиомочевиновой и глютаминовой средах высушивания, по всем свойствам была идентична. Полученные данные позволяют рекомендовать включить в документацию на выпуск препарата тиомочевиновый стабилизатор, имекхций в своем составе три ингредиента вместо пяти, входящих в глютамииовый.

СПИСОК РАБОТ, ОИУКкИКОБШЖ 110 ТЕ® ДИССЕРТАЦШ

1. Гшуланян К.С., Чернова Э.А., Майская В.Д., Саркисьян H.A., Охонысо И.А. Возможность повторного культивирования штамма ÜÖ па срсде из кукурузного экстракта //Особо опасные ккфок-цпи яа Кавказе: Тез. докл. У1 науч. кейф-. (декабрь 1987г.).-Ставрополь, 1937.- 4.1.- С.100-102.

2. Гюлушанян К.С., Чернова Э.А., Верховцева Г.Н., Иванова B.'i., Саркксыга H.A., Майская В.Д., Гребенюк A.B. Использование агара из кукурузного экстракта на различных этапах контроля качества вакцины чу-кой живой сухой //Особо опасные инфекции на Кавказе: Тез. докл. У1 науч. копф. (декабрь 1387г.).- Ставрополь, 1987.- Ч.1.- С.102-104.

3. Чернова Э.А., Тиккер А.И., Имуланяп К.С., Печников Н.Е., Новицкая Г.С., Ворховцова Г.И., Майская В.Д., Саркисьян H.A. Возможность использования цптателкаа ерпд из кукурузного экстракта в производстве чудной згавой сухой ВВ //Особо опасные инфекции :ia Кавказе:.Тоз. дога. У1 науч. конф. (декабрь 1987г.).- Ставрополь, 1987.- Ч.П.- С.145-148.

4. Гвдуманяк К.С., Чернова Э.А., Тинкер А.И., Угримов С.А. Использование питательного агара из непищевого сырья для выращивания биомассы //Эпидемиология, микробиология и иммунология: Тез. докл. обл. науч. конф. мол. уч. (17-20 октября 1989г).-Ростов-на-Дону, 1989.- С.19-21.

5. Гшушанян К.С., Чернова Э.А., Остров A.B., Ккдин Е.В., Галенко Г.Н., Майская В.Д., Саркисьян H.A. Подбор гидролизатов для приготовления кукурузно-казеинового агара //Актуальные вопросы эпидемиологии, профилактики и диагностики особо опасных инфекций: Тез. докл. итог. науч. конф. (21-22 декабря 1989г.).-Ставрбполь, 1989.- Ч.1.- С.74-77.

6. Гшушанян К. С., Угримов С.Н., Майская В. Д., Воропаева Л.П. Возможность использования аминопептида при приготовлении комбинированного агара на основе кукурузного экстракта для приготовления чумной вакцины //Актуальные вопросы эпидемиологии, профилактики и диагностики особо опасных инфекций: Тез. докл. итог. науч. конф. (21-22 декабря 1989г.).- Ставрополь, 1989.-Ч.1.- С.77-80.

7. Майская В.Д., Чернова Э.А., Гшушанян К.С., Саркисьян H.A. Совершенствование технологии приготовления чумной живой сухой вакцины ЕВ //Актуальные вопросы эпидемиологии, профилактики и диагностики особо опасных инфекций: Тез.докл. итог.науч. конф. (21-22 декабря 1989г.).- Ставрополь, 1989.- 4.1.-С.168-171.