Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Оптимизация режимов лиофильного высушивания чумной живой вакцины ЕВ

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Оптимизация режимов лиофильного высушивания чумной живой вакцины ЕВ"

- ул I ' ^

- ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ РСФСР ПО САНИТАРНО-ЭПИДЙ-МОЛОГИЧЕСКОМУ НАДЗОРУ

ВСЕСОЮЗНЫЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ НАУЧНО-ИССЛВДОВАТЕЛЬСКИЯ ПРОТИВОЧУМНЫЙ ИНСТИТУТ "МИКРОБ1

На правах рукописи

I

ПЕЧНИКОВ Николай Евгеньевич

УДК 616.981.452-085.37

ОПТИМИЗАЦИЯ РЕКИМОВ ЛИОФИЛЬНОГО ВЫСУШИВАНИЯ ЧУЖОЙ ЖИЮЙ ВАКЦИНЫ ЕВ

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Саратов - 1991 |

> ' / : -V

■ I ' /

Работа выполнена в Научно-исследовательском противочумнс институте Кавказа и Закавказья

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Тинкер А.И.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

профессор Филиппов А.Ф., доктор медицинских наук, профессор Анисимова Т.Н.

Ведущая организация - Среднеазиатский Научно-исследоват!

ский противочумный институт

Автореферат разослан "^¿х." ^¿г^М^с^^ г Защита состоится " /а ^¿-г^^сЛ-г 1592 г

вчасов на заседании специализированного Совета Д 074.32.01 при Всесоюзном ордена Трудового Красного Знамени научно-иссле; вательском противочумном институте "Микроб" (410071., Саратов, ул.Университетская, 46).

С диссертацией могно ознакомиться в научной библиотеке института "Микроб".

Ученый секрктарь специализированного Совета,

доктор биологических наук Корнеев Г.А

- 3 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблей ы Штод лиофильного высушивания ужэ иного лет как вошэл а повседневную практику для сохранения исходных свойств биологических объектов. В последнее время особенно широко он применяется в связи с разработкой и доступностью высоко эффективного оборудования. Все живые вакцины, в том числе и чумная, выпускаются в лиофильновьсушнном виде. Усовершенствовании способа высушивания посвявдно большое количество работ. Однако все возможности этого метода ещэ не исчерпаны. Шсютря на то, что НГД на чумную вакцину при выпуске обуславливает высокое качество препарата, основный недостатком остается значительная гибель м. к. в процессе хранения.

Известно, что почти все технологические этапы приготовления чумной вакцины довольно глубоко изучены. При это«, с наюэй точки зрения, не уделено должного внимания роли остаточной влажности при длительном хранении препарата. Литературные данные в этом отношении довольно разноречивы. Ряд авторов не отмечает разницы в выживаемости микробов при остаточной влажности от 2,0 цо 5,87. ( К.Е. Долинов, 19ББ; С. Л. Степанова, 1960; ЕЕЗахарина к Л. Ц. Агафонова, 1966" и др.), в том числе и чумной вакцины [А. К. Скуратова, 19Б5; А.ЕКрайнова с соавт., 1958,1960; <L R Шчникова, 197Б). Другие исследователи описывают наличие обратной зависимости между показателем остаточной влажности сухих трепаратов и выживаемостью микробов (С. Г. Колесов, 1S59; 3. И. Бланков, JL Л. Клебанов, 1961; Б. Ы. Париж, 1963, 1968; К-Е.До-шнов, 1969; А.И.Тинкер, 1971; И. Е. Бекер, 1981; А. М. Белоус, t Д. Цветков, 1985; Hover R. 0., 1979).

Анализ литературных данных говорит о том, что медленнее [роисходит гибель при низких показателях остаточной влажности, 'ледователъно, при изготовлении чумной вакцины еще значительным >езервом остается именно это звено, поскольку <СС 42-32ВС-90 до-ускает количество остаточной влаги до 47.. Указанный показатель ыл введен в документации очень давно, когда режимы высушивания умной вакцины отрабатывали на препарате изготовленном на саха-озо-желатиновой среде высушивания.

- < -

По данный К.Е.Долинэва (1989).достигнуть низких величин остаточной влажности можно аа счет интенсификации процесса высушивания. С этой целы: предлагается повысить температуру подогрева ДО 40°С (ЬЛ-СубботиЕЗ, 1957; Б. Ц. Шриж с соавт. 1963).

Таким образом, основной задачей является выяснение максимально допустимой температуры подогрева чумной вакцины при ее лиофилизация.

Следовательно, еуэютск реальные предпосылки тому, что можно оптимизировать режим лксфшгаации чумной вакцины, снизив в 1,5-2 раза процент остаточной влажности в препарате без существенного изменения его качественных характеристик. Этим самым можно добиться стабилизации дозы в период срока годности вакцины.

Решение данной проблемы затрагивает ещэ один аспект, на который ранее практически мало обращли внимания. Все закономерности, связанные с отработкой режимов лиофилизации, применением различных стабилизаторов, степени разрежения во духа, температуры гранения чумной вакцины и т. д. изучали в строго стандартных условиях, связанных с единым объемом ампул (бил) и количеством суспензии в них (2мл). Изменение вместимости сосуда и тем более вида материала контейненров влечет за собой отработку целого ряда параметров. Особе езо актуальным стал вопрос замены бьпарйся тары современной, изготовленной из полимерных материалов. Важным является также и решение вопроса стерильного переноса взвеси из ампулы во флаконы с изотоническим раствором хлорида натрия в соответствии с количеством доз, используемой серии вакцины. Однако все эти проблемы упирается в вопрос сохранения остаточной влажности препарата в контейнерах большого объема, в которых по техническим причинам нельзя создать хотя бы частичное разрежение воздуха.

.г

Все это явилось основанием для изучения режимов лиофилиза-ции чумной вакцины ЕВ, обеспечивающих низкую остаточную влажность препарата, способствующую более полному сохранению ж. м. к. в человекодозе.

г

- 5 -

Цель работы.

Отработать режиш лиофилизации чумной вакцины ЕВ, в зависимости от вида контейнера, обеспечиващие остаточную влажность препарата не выше 2-2,5% и снижение за счет этого гибели ж.м.к. в дозе в период срока годности вакцины.

Задачи исследования:

1. Проанализировать качество коммерческих серий чумной вакцины ЕВ, выпускаемой в НИПЧИ Кавказа и Закавказья, в зависимости от остаточной влажности сухой таблетки.

2. Изучить возможность снижения остаточной влажности чуи-ной вакцины до 2-2,57. в процессе производства за счет интенсивного подогрева препарата на стадии завероэния сушки.

3. Достичь более полного сохранения ж. и. к. в человекодозе вакцины на период срока ее годности.

4. Определить степень повреждения ж. к. к. при использовании различных режимов лиофилизации.

5. Отработать режим лиофилизации в полимерных контейнерах.

Научная новизна и практическая

значим ос ть

Проведен экспертный анализ качества коммерческих серий чум-эй вакцины, выпускаемой НИПЧИ Кавказа и Закавказья. Новыми явился данные о значительном колебании остаточной влажности меж' ампулами разных серий и внутри каждой из них, несмотря на из-товлениэ препарата в строгом соответствии с НГД.

Установлено, что низкие показатели влаги в сухой таблетке зсобствуиг значительному сохранению ж. ы. к. в прививочной дозе сонцу срока годности чумной вакцины и повышают термостабиль-ть препарата особенно при высоких температурах хранения

Впервые разработаны режимы лиофилизации чумной вакцины козью предусматривает для удаления связанной воды подогрев ма-ала до 50°С. Это позволяет получать низкуп остаточную влаж-ь без увеличения общэй продолжительности лиофилизации и сни-я качества препарата.

Впервые разработан новый способ консервации чуной вакцины

в полимерных пакетах, который предусматривает вытеснение газовой среды после лиофилизации за счет тугого скатывания юс и адсорбции диффузной влаги из внешней среды силикагелем во вторичной упаковке (авторское свидетельство N 1510154 от 22 мая,1989г, "Способ консервации чумной вакцины").

Предложена система для ресуспенэирования сухой таблетки и стерильного переноса содержимого ампулы во флакон с изотоническим раствором хлорида натрия в соответствии с количеством чело-векодоз, (авторское свидетельство N 1491522 от 8 марта, 1989г, "Устройство для введения лекарственных веществ).

Разработана нормативно-техническая документация предусмзт-ривающаяя оптимизированный режим лиофилизации чумной вакцины, ( обеспечивапщй низкие показатели остаточной влажности (до 2,51) не зависимо от используемой вакуум-сушльной аппаратуры.

Внедрение, в.практику.

1. Разработан режим лиофилизации чумной вакцины с использованием высоких температур (до 50°С) подогрева материала на конечном этапе:сушки, обеспечивавший содержание остаточной влаги не более 2,5Х (Кашнекия К 2 к регламенту производства вакцины чумной живой сухой N 37-80, утвержденные директором НИПЧИ Кавказа и Закавказья 29 ноября 1990г, согласованные с директором ПЮК им. Л. А. Тарасовича 28 декабря 1990г).

2. Штодическиё приемы, разработанные в процессе выполнения диссертационной' темы используются в производственном отделе НИПЧИ Кавказа и Закавказья.

Апробация работы

Штериалы диссертации доложены на 5 краевой научно-практической конференции, посвященной БО-детию противочумной службе Кавказа (Ставрополь, сентябрь 1985), на 6 краевой научной конференции, посвященной 70-летию Великой Октябрьской Социалистической Революции (Ставрополь, декабрь 1987), на Всесоюзном совещании сотрудников противочумной системы (Саратов, «зрт 1988), на межведомственной конфереции "Актуальные вопросы вакцинопро-филактики особо опасных инфекций"(Киров, март 1991), на межлабораторных конференциях НИПЧИ Кавказа'и Закавказья (Ставрополь,

- 7 - I,;.

1986, 19В8, 1989, 1991.

Публикации

Основное содержание работы отражено в 12 опубликованных работах.

Объем и структура работы.

Диссертация изложена на 1Б7 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы (1 глава), собственных исследований (4 главы), заключения'и выводов. Материалы диссертации иллюстрированы 29 таблицами и 23 рисунками. Библиографический указатель включает 165 наименований источников отечественных и зарубежных авторов. t

Положения выносимые , н а защиту

1. Результаты исследований по применению; режима лиофилиза-ции,предусматривающего подогрев материала''на последнем этапе сушки до 50 Ъ.

2. ^териалы изучения термостабильности чумной вакцины ЕВ с низкими показателями остатожной влажности.

3. Данные о возможности стандартизации чумной 2 вакцины ЕВ

«

по показателю остаточной влажности. •-.-■4. Использование способа лиофильного высушивания чумной вакцины ЕВ в полимерных контейнерах.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ -

Материалы и методы исследований

Оьектаии исследования явились 59 экспериментальных и более 700 коммерческих серий чумной живой сухой вакцины ER Для определения иммуногенности, использовали 1157 белых мышей массой 18 -20г и 1649 морских свинок - 25О-350г.

Выращивание биомассы вакцинного иггаьаа проводили на твердых питательных средах: агар Хоттингера и агар ХЬттингера с добавлением кукурузного экстракта (Э. А. Чернова с соавт. ,1987), в матрацах и в АКЫ-Ш согласно ТУ 42.14 N 20-75.

Стабилизацию микробов вакцинного оггамма перед высушиванием осуществляли с помощью СЯ, СЖГ и СЖГТП сред1 ^высушивания.

Вакцинную суспензию доводили до необходимой концентрации бактерий и разливали в ампулы по 1-2мл, во флаконы и полимерные

контейнеры в обгеме 2, б, 10, 20 и ЗОих. Замораживание проводили в низкотемпературных столах HS-280 в течение 6-24ч при температуре -40-50 Ъ и высушивали в сублимационных- аппаратах KS-30 и ТГ-Б. ''

Вакцину лиофилиэировали разными режимами, варьируя, в основном, величиной подогрева материала (30, 35, 40, 45, 50, 55, 60^) на конечном этапе сушки в течение 1-4ч. в некоторых сериях чумной вакцины более низких показателей остаточной влаги добивались за счет значительного увеличения времени удаления связанной влаги при относительно низких температурах (30 °С).

Ампулы с препаратом герметизировали под вакуумом, в атмосфере азота и сухого воздуха, укупорку 100мл флаконов осуществляли под азотом (ГОСТ 9293-74) с помощью сконструированного нами устройства, на которое получено авторское свидетельство N427902 от 24.10.1985.

Учитывая наличие в азоте влаги (5-1Ср3г/см3 ), мы дополнительно проводили осушку, сконструировав для этого 5 специальных систем, включающих влагопоглощащие фильтры и низкотемпературные конденсаторы.

Высушивание и герметизации вакцины в полимерных контейне-ч pax типа Темакон" и "Компопласт" проводили согласно разработанному нами способу,описанному в авторском свидетельстве N 1Б10154 от 22 мая 1989. Герметизацию осуществляли в атмосфере азота путем заваривания отводного штуцера. Непосредственно перед этим контейнер прокатывали! и сворачивали в рулон для умэнывэния объема азота в нем. Подготовленные таким образом контейнеры с высушенным препаратом помещали во вторичную упаковку с сорбентом влаги (силикагель). ,

Для определения кислорода в газовой среде использовали прибор "Оксиметр".

Изучение качества экспериментальных, экспериментально-производственных и ОСО серий препарата проводили в соответствии с приказом N 31 U3 СССР от 13.01.83r, BSC N 42149 ВО-88, методическими рекомендациями (КВ.Шчникова с соавт., 1985) в сравнении с отраслевым стандартным образцом вакцины чумной живой су-

хой (ОСО 42-23-15-870 П), а обадэй концентрации бактерий во взвеси - на фотоколоримэтре иЕиан-120,,| в кювете с длиной оптического пути ■ 5,025ш, при длине волны БЗОнм.

Для количественной оценки гомогенности чумной вакцины ЕВ использовали метод предложенный Б. А. Итоном с соавторами(19б5).

Оценку повреждахщего действия испытуемых режимов лиофилизации проводили по увеличение проницаемости клеточной стенки и цитоплазштических мембран для антибиотикрв, детергентов, красителей (Б.Г.Вальков, Т.В.Плешакова, 1986) со отношению к регламентируемому режиму, исходной популяции и прогреву в жидкой фазе, а так же по методике описанной в авторском свидетельстве "Способ определения клеточных повреждений" N 4625874/25 (А.И. Бондаренко с соавт. ,1988).

Для автоматизации расчетов по тершстайильности нами разработана оригинальная програмю для вычисления константы скорости отмирания на програшруеыом микрокалькуляторе НК-54.

Экспериментальные данные - обрабатывали методами вариационной статистики (ИКСызранцев, 1938; К. П. Ашарин, А. А. Воробьев, 1962; В-ПУрбах, 1975; Е. П. Таьйовцев с соавт., 1969).

Результаты н их "обсуждение.

Существует возможность снижения влаги в вакцине за счет подбора режимов лиофилизации. Для чего необходимо либо значительное увеличение времени отторжения связанной воды, либо резкая интенсификация подогрева без удлинения обирго срока лиофилизации. Первый путь мало приемлем из-за удорожания продукта и ухудшения технологичности производства. Теоретически целесообразно снизить остаточную влажность за счет интенсивного подогрева материала на заключительном этапе сушки.

КгЕестко, что гибель м. к. при высоких температурах связана с денатурацией бедка. Однако, согласно данным Харркса (1956), порог ее резко повышается, когда подвод температуры осуществляют к обезвоженным биообъектам. Подтверждением тому явились данные Л Л. Субботиной (1957) и ЕМ.Шрижа (196|3), которые при высушивании профилактических препаратов на Заключительном этапе увеличивали подогрев до 40-50Я2, не снижая их качества.

В:е это явилось основанием для разработки режимов лиофили-зации чумной вакцины ЕВ, обеспечивапцих низ кус остаточную влажность независимо от конструктивных особенностей сушильной аппаратуры. Оптимизация 'режимов высушивания связана еще с одним аспектом, которому до настоящего времени не уделяется должного внимания. Это вид и объем контейнеров, применяемых для лиофили-зации чумной вакцины. Традиционно ее выпускают в 6мл ампулах ШПВ-6 по 2мл суспензии. Для использования вакцину ресуспензиру-ют в ампуле.и затем переносят во флаконы с заранее подготовленным количеством изотонического раствора хлорида натрия в соответствии с количеством человеко-доз в ампуле. Такое приготовление прививочного материала требует стерильных условий, которые не всегда могут быть обеспечены в местах иммунизации.

Анализ коммерческих серий чумной вакцины показал, что с уменьшением остаточной влажности сухой таблетки до 2-2, Ъ7. существенно возрастает.терюстабильность препарата (табл.1).

. ,:г . ■ • • Таблица 1 -

Зависимость термостабильности чумной живой сухой вакцины ЕВ от величины остаточной влажености (по данным производственного отдела 1978 - 1983 гг.)

V -3

Остаточная: К-10 при :Термостаб: влажность : 37°С-14с^гТ: при 37 Ъ : 7. : ', : сутки :

: Прогноз на 0-6°С :Кол-во

Т :-------------------:опреде

-з

: К* 10 : годы : лений

2.0-2,5 56, 2,6-3,0 61,

3.1-3,5 83, 3,6-4,0 87,

7+3,8 13,8+0,9

8+4,2 11,7+0,7

6+6,2 9,4+0,4

7+4,0 8,3+0,4

- 0,20+0,01

1,8 0,25«),01

4.4 0,30+0,02

5.5 0,30+0,02

9,7+0,6 30

8,6+0,5 34

6,7+0,3 48

5,8+р,3 17

Однако количество серий, выпущенных за 10 летний период, с низкой остаточной влажностью (до 22) составляло всего лишь 3,631 от общего их числа. Все остальные серии вакцины имели более высокое влагосодержание. Наблюдался довольно большой разброс указанного показателя не только между ампулами различных серий пре-

парата, но и внутри одной и той да серии. Связано это, по-видимому, с тем, что в реглашнтированном режиме диофилизацки допускаются значительные отклонения параметров. Например, при жестком ограничении температуры подогрева не выш 28°С, длительность ее может колебаться в довольно широких пределах и, как показал анализ, четко влияет на отторжение связанной воды. Чем дольше осуществляется этот процесс, тем ыеныта остается влаги в сухой таблетке. Отшчена также корреляция между общей, биологической концентрацией ы.к. и остаточной влажностью препарата (табл.2)

Таблица 2

Влияние концентрации м. к. в чумной вакцине ЕВ на жизнеспособность и остаточную влажность препарата

Остаточ- : Стандарт,: Выживае- :К-10 при :Терыоста- : : Кол-ная влах-: : мость, :37 °С :бильность,: Т :-во

ность, 7. : млрд/мл : X : 14 суток : сутки : : серий

глютаминовая среда высушивания:

2.0-2,5 70,9+2,4 39,9+1,0 68,6+4,7 10,Б;НЭ,3 - 11 2,6-3,0 62,9+2,4 37,1+1,4 82,3+3,7 9,7+1,9 0,4 7

3.1-3,5 61,1+3,1 43,3+1,1 108,4+8,6 6,7+0,6 3,8 9

тиомочевиновая среда высушивания

2.0-2,5 77,9+4,1 37,5+3,3 43,6+4,0 17,0+1,6 - 7 2,6-3,0 79,3+4,0 33,0+2,7 55,8+6,9 14,1+2,4 1,0 7

3.1-3,5 83,3+3,8 33,8+2,7 63,6+7,2 11,5+1,2 2,8 6

Большой разброс между показателями влаги в таблетке у разных ампул одной серии приводил, вероятно, к неодинаковой гибели в них м. к. Это, скорее всего, явилось причиной нивелировки данных жизнеспособности рекламационных образцов вакцины с разной остаточной влажностью, сохранявшихся при 0-6°С -5, 7 и 10 лет.

При анализе коммерческих серий препарата была выявлена зависимость между жизнеспособностью и остаточной влажностьи при хранении их в термос-тате (37+1°С) и отсутствовала таковая в условиях холодильника (О-б'Ъ). Эти данные представляют большой

практический интерес, поскольку были отмечены неоспоримые преимущества препарата с низким содержанием остаточной влаги при высоких температурах хранения, обуславливающих гибель и. к. во много десятков раз скорее, чем в холодильнике, С другой стороны необходимо было с помощью эксперимента подтвердить данные получение при анализе производственных серий.

С этой целью нами было изучено влияние различных режимов лиофилизации чумной вакцины на ее качество. Основным фактором варьирования была температура, при которой осуществляли досушивание препарата на последних этапах лиофилизации.

Таблица 3

Характеристика чумной живой сухой вакцины ЕВ в зависимости от режимов высушивания и питательной основы

Вари-: Став-: Вгах-: Процент живых микробных клеток :

ант :дарт :ность:---------:----------------------------:

: млрд/: Z : после : при 37*^3 хранения : К*10

°С :ил : : сушки :--------------■--------------:

: : : : 20сут. : 24сут. : 28сут. :

вакцина выращенная на кукурузном экстракте в ШЫП

30 100 2,6 40,2+2,8 7,7+0,4 6,6+0,2 5,5+0,2 78,9

35 _ т*_ 2,2 37,0+2,7 9,6+0,3 7,8+0,2 6,3+0,2 65,0

40 1.8 35,7+2,2 11,2+0,5 8,3+0,3 7,2+0,2 55,3

45 _ п_ 1,5 34,0+1,7 15,8+2,0 12,9+1,7 9,8+0,6 36,6

вакцина выращенная на агаре Хоттингера в матрацах

30 60 2,6 43,2+2,8 7,3+0,4 • 5,7+0,4 4,0+0,4 84,8

35 . И. 2,2 39,8+1,9 12,0+0,6 7,1+0,1 5,9+0,6 67,2

40 1.6 36,1+1,6 13,4+0,7 10,0+0,8 7,9+0,4 47,3

45 1,5 35,6+2,6 16,0+0,5 12,3+0,9 10,0+0,9 38,0

Шрвую серию опытов проводили в аппарате ТГ-5, конструктивной особенностью которого является раздельное выполнение камер сублиматора и конденсатора. Результаты экспериментов представленных в таблицах 3 и 4 показали, что сразу после лиофилиза-

ции снижение остаточной влажности в вакцине коррелировало с температурой подогрева материала

Таблица 4

Зависимость жизнеспособности и терюстабильности вакцины высушенной по 1мл от режима лиофилязации, остаточной влажности и среды высушязанкя

Вариант : Елаж-: Процент живых микробных клеток : -з

: ность:------------------------------------: К 10

: (Т.) : после : 37 С : 57 С : : : сушки : 14 су?. : 2 сут.

СЯ -35 О 1,8 30,3+1,8 0,5+0,1 0,03+0,004 180

Кр - 61 1000

-40 С 0,9 26,8+2,3 0,4+0,1 0,03+0,005 181

Кр 67 893

-45 С 0,7 21,4+0,1 0,5+0,1 0,03+0,002 167

Кр - - 43 713

СЯГ -35 С 1,6 42,9+3,0 4,5+0,3 0,4+0,03 114

Кр - 9,5 107

-40 С 1,0 34,7+1,5 7,6+0,5 2,0+0,2 70

Кр . - - .4,6 17

-45 С 0,8 31,5+2,4 7,2+0,5 2,8+0,3 61

Кр - 4,4 11

СШТП-35 С 1,6 43,3+1,4 4,5+0,4 0,3+0,02 120

Кр - - 9,6 144 -

-40 С 1,0 30,6+1,8 8,840,5 2,7+0,4 60

Кр - - 3,5 11 -

-45 С 0,8 29,7+0,1 11,8+1,1 3,2+0,3 54

Кр - 2,5 9

ГЬдъем ее от 30-35 С до 40-45 С способствовал снижению остаточной влажности, примерно, з 1,5-2,0 раза. При этом отсутст-

вовала достоверная раз нищ во влагосодержании при 40 Я? и 45°С подогрева. Соответственно снижению остаточной влажности в препарате резко повышалась териостабильность его в процессе хранения при 37 °С и Б7°С.

Учитывая сказанное необходимо было проверить полученные результаты в камере другого типа. В связи с чем вторая серия опытов проведена в аппарате КБ-30, в котором совмещэны в одном объеме сублиматор и десублиматор. Сублиматор в КБ-30 представлен тремя полками, что дало возможность в ьс ушивать одну и тужз партию бакмассы тремя разными способами.

Таблица Б

Динамика жизнеспособности в процессе хранения чумной вакцины ЕВ при 37°С в зависимости от режима высушивания и остаточной влажности

Время : Режимы высушивания

хранения :----------------------------------------------------

37°С, сут: ЗО^С : ЗО'Ъ* : 35'Ъ : 40^ : 45°С

выживаемость, X

0 45,5+1,1 40,+01,1 42,8+1,2 39,7+1,6 37,8+1,9

4 27,1+1,5 22,+20,9 25,6+1,5 25,0+1,5 30,1+1,8

8 16,4+1,5 15,+21,0 18,3+0,7 18,8+0,7 22,5+1,3

12 11,5+0,4 10,+00,6 14,6+0,8 14,3+0,5 17,3+0,5

16 9,0+0,4 6,+20,4 11,4+0,6 12,0+0,6 13,8+0,3

20 6,6+0,4 Б,+20,4 9,1+0,4 9,4+0,7 11,5+0,7

24 4,9+0,2 3,9+0,2 7,1+0,4 7,2+0,7 9,3+0,8

28 3,1+0,5 2,0+0,2 6,1+0,2 6,6+0,7 6,6+0,6

остаточная влажность, /*

3,5+0,2 2,8+0,1 2,1+0,1 1,0+0,1 1,6+0,1

константа скорости отмирания

35,3+1,6 98,3+5,6 75,5+3,4 67,0+6,5 56,7+6,9 термостабильность, сутки

7,2 7,0 9,1 10,0 12,2

Режимы лиофилизации в этих опытах были такими же, как в предыдущих, за исключением дополнительного варианта (в таблице помечен *), в котором подогрев осуществляли при 28^3, но длитель ность его увеличивали на 35ч. (табл. 5).

В этих опытах получены аналогичные предыдущим результаты, однако откачана более высокая тераостабильность на среде СЖГ по сравнению с СЖГТП.

С целью поиска оптимального зарианта эксперименты осуществляли по ортогональному центральному композиционному плану методом математического моделирования (Лисенкоа А.Е ,1979). Даннш по жизнеспособности чумной вакцины после лиофклкгацки расчитывали в зависимости от трех факторов: температуры и длительности ее воздействия в период удаления связанной влаги, а также интенсивности гибели м. к. в процессе гранения при 37 "Ъ.

Результаты показали, что при оптимальном режиме лиофилиза-цгаГ температура подогрева в последние два часа сушки должна бьггь в пределах БО°С. • Это позволяет, независим? от конструктивных особенностей аппаратуры, получать низкие показатели остаточной влажности препарата.

Учитывая, что в процессе приготовления чумной вакцины были использованы высокие температурь-, экспериментальные серии изучали з соответствии с требованиям;! НТД и по ряду дополнительных признаков. При этом показано, что повышение температуры в процессе высушивания от 30 °С до Б5°С не влияло на культураль-но-морфслсгические, биохимические, иммуксгекные свойства, количество хм.к. .безвредность, здепзшй вид таблетки и т.д.

Поскольку известно, что гашражкванке-высушивание, в первую очередь повреждают клеточную стекку и цитоплазиатические мембраны (А. Ы. Белоус, Ц. Д. Цветков, 1985; Я И. Морозов с соавт., 1986 :: др.) мы обратили особое внимание влиянию наших режимов ка указанные структуры клетск. Данные показали,что опытные ре-

высуЕивак;'л клялись дсг.олг-лгг&льнымк факторами способствующие: изменениям морфологии структур клеток.

На основании сказанного выше, нами было приготовлено пять зкперкиентально-производстзенЕых сер;й чунной вакцины ЕВ, кото-

рье изучили в соответствии с существующими требованиями и отослали в ЖК ГИСК им. Л. А. Тарасевича. На них было получено положительное заключение, ¡после чего составлены и утверждены изменения режима сушки в РП N 37-86.

Цри зпидосложнекиях может создаться такое положение, когда невозможно будет обеспечить стерильных условий, для приготовления прививочного материала. В этих случаях желательно выпускать препарат во флаконах, объем которых позволил бы разводить суспензии в соответствии с количеством п/к и в/к человекодоз. Наиболее целесообразно использовать для этого 100ид флаконы. Нами отработаны режимы сушки в указанных контейнерах, обеспечивающие качество препарата в соответствии с НГД. Основная проблема заключалась в сохранении жизнеспособности вакцины в процессе срока годности препарата, поскольку известно, что кислород губительно действует на м. к. В данном случае складывались неблагоприятные условия, поскольку на малый объем, сухой таблетки (2мл) приходился очень большой объем воздуха. .Учитывая это, флаконы герметизировали под азотом.: Однако мы встретились с другой проблемой, решить которую так и не удалось. Согласно ГОСТ азот содержит довольно высокое количество водяньа паров, которые быстро адсорбируются сухой таблеткой. В итоге вакцина увлажнялась до значительных пределов (4,9-6,6X), что приводило к быстрой инактивации ж.м.к.. Различию способы осушки азота (силикатель, низкотемпературная ловушка, подогрев и т.д.) не привели к желаемому результату. Поэтому небходимо было изыскивать другой путь указанной-задачи. Для уизньоэЕИЯ объема азота, а следовательно, и количества водяных паров использовали полимерные контейнеры емкостью 500 и 300мл., В них, впервые в мировой практике отработаны режимы вьсушивания и способы сохранения ж. м. к..

Данные экспериментов показали, что добавление во вторичную упаковку сорбента влаги уменьшало кинетику отмирания ж. м. к. в процессе хранения приблизительно в 15 раз (табл.7)

Кроме этого, с целью решения указанной проблемы нами предложено специальная система для стерильного переноса суспензии из ампулы во флакон с изотоническим раствором хлорида натрия в

Таблица 7

Выживаемость к остаточная глалср.остъ чумной вакцины ЕВ лиофилизированной в полимерных контейнерах "Гекакой"

Кол-ве: После серий,': сушки образ-: цсв :

Е процессе хранения

57 °С 2 сут.

27 °С 14 сут.

: Условные

---------: обозна-

0-8°С : чения 12 мес. :

выживаемость микробов, %

2,9+0,4 3,3+1,6, 1,4+0,3 (-)

14,8 12,8 , 29,7

1,953,7 1 ,2*0,?'\ 25,0+0,4 (+}

19,2 2,3 '' 1,7 остаточная влажность, %

1,3+0,2 4,5+0,3 жидкая (-)

3,2 0

1,3+0,1 1,8+0,2 2,-4+0,8 (+)

2,8 2,1 1,6

5/47 42,2+2,3 Кр

3/32 26,7+4,7

Кр -

5/47 Кр 3/32 Кр

4,2+0,1 3,7+0,3

Примечание:(-; контейнеры без вторичной'упаковки

(+) контейнеры зс вторичной упаковке с силикагелем соответствии с количеством человекодоз. Таким образом, проведенные эксперименты способствовали не только поныоэнюо качества чумкой вакцины, а плач-; ес-хргкгння ьекснуалзного числа л. и. к. , в приз;;вочноЯ доге з период срока годности препарата, но к значительной стандартизации его в пределах более узкего диапазона остаточной влажности

ПоЕсазекке термостабклькостк чумной закцины за счет снижения влаги кыгет большое практическое значение, поскольку с одной стороны в перспективе не предвидится в блихейши будущем реализация приказа 1С СССБ и от 18 ноября 1983г об организации ка твррзггерг^т страны "хелодовс-й ц*пк" при транспортировке и храччпкк ¡ЛСП, с другой стороны чумная вакцина до кгстояпрго вреиэкк не вкоочека в действие указанного документа.

- 18 -

ВЫВОДЫ

1. Анаши около 700 коммерческих серий чумной вакцины ЕВ, выпущэнных в НИШИ Кавказа и Закавказья показал, что снижение остаточной влажности препарата до 2,0-2,52 по сравнении с 3,1-4,02 существенно повышает его термостабильность; остаточная влажность значительно колеблется не только в разных сериях вакцины, но и между ампулами одной серии; на о-тмечено корреляции ж. «с к. и остаточной влажностью в рекламационных образцах, сохранявшихся до 10 лет при 0-6 °Ь.

2. Разработан универсальный режим высушивания чумной вакцины ЕВ, обеспечивающий снижение остаточной влажности до 2,57, независимо от конструктивных особенностей аппаратуры. Он преду-сьатривает подогрев материала в процессе удаления связанной влаги до 4Б-50°С в течение 2-3 часов, при общей продолжительности лиофилизации двух миллилитров суспензии в ампулах ШПВ-6 -24-28ч.

3. Качество препарата высушенного в условиях интенсивного подогреза материала по жизнеспособности, имыуногенности и другим свойствами соответствовало требованиям РП N 37-89 и ФС 42-32 ВС-90. ^

4. Оптимизированный режим лиофилизации не влиял на морфологию клеток чумной вакцины ЕЕ Вэ отмечено увеличения проницаемости клеточной стенки и цитоплазматических мембран для антибиотиков, детергентов и красителей. При электронной микроскопии на ультратонких срезах степень и соотношение поврежденных клеток к неизмененным, находилось на уровне коммерческого препарата.

5. Предложен режим лиофилизации чумной вакцины ЕВ в объеме

2 и 12мл в 100мл флаконах, обеспечивающий жизнеспособность и остаточную влажность в соответствии с требованиями НГД. Показано, что гибель микробных клеток в- 100мл флаконах укупоренных под азотом, в процессе хранения при 0-6°С была в десятки раз выше, чем в 6мл ампулах ШПВ-6, опаянных под вакуумом или азотом. Это связано с сорбцией воды из атмосферы азота и соответственно значительным увлажнением сухой таблетки во флаконе.

6. Впервые разработан способ консервирования чумной вакцины ЕЕ, включающий предварительную расфасовку суспензии в контей-

нер пз полимерного материала, лшфялизацию, скатывание его в рулон и размещение во вторичную упаковку с сорбентом влаги. Это " позволяет избавиться от бъющейся тары и отказаться от опреацни по переносу взвеси во флакон для последующего использования.

7. Цредложэко устройство для стерильного растворения ашу-лироганной вакцины на основе модифицированной £ястеш для внутривенных вливаний, с целью переноса во флакон и приготовления суспезии в соответствии с количеством человеко-доз для под- и внутрикожного применения. Предложение решает проблему асептического приготовления вакцины в полевых условиях.

8. Утверждены изменения N 2 (срок введения с 01.01,91 г) к РП N 37-86 по режиму лиофилизации чумной вакцины. Получены авторские свидетельства N 1510154 от 22мая 1989г на способ консервирования чумной вакцины и N 1491522 от 8 марта 1959г на устройство 2Еедекия лекарственных вещэств.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОЕАНЕЫХ Ш ТЕЬЕ Д^ЕИАДЛЙ

1. Шчников Я Е. Определение оптической концентрации чумной вакцины ЕВ на фэтоколориштре ЕИАН-120 //Особо опасные инфекции на Кавказе: /Тез. докл. V краев, науч. -практич. конф., посвяя 50-летив образования противочумной службы Кавказа, 17-19 сентября 1985, Еып. 2, Ставрополь, 1985, С. 195-197,

2. Тинкер А. И. , Вэрховцева Г. Е, Пзчкинов Е Е. Ешяние газовой среды на выживаемость ыгс-фобоз а чумной вакцине ЕВ при длительном ее хранении. Там же. С. 247-249.

3. Андреев А. В., Шчников Е Е. Приспособление для удержания пробки иад горлышком флакона перед укупоркой в лиофильных кадрах. Авторское свидетельство на изобретение N 1260332, 1986.

4. Шчников ЕЕ., Тинкер А.И., Еерховцева Г.Е, Новицкая Г. Е , Еудыка Д. А. Влияние температурных режимов лиофилизации на качество чумной вакцины ЕЕ /'/Особо опасные инфекции на Кавказе/ Тез. докл. 6 краен, науч. -практич. конф. п^сеящ. 70-лети»

Вэлкксй Окт. соц. революции, декабрь 1987, 4 2, Ставрополь, 1987, С. 46-50. j„.

5. Шчников Е ¿Л,1 Ткнкер А. И. Изучение возможности использования полишрных контейнеров в процессе приготовления, хране-ннз и применения чумной живой сухой вакцины ЕЗ // Tau же. С. БО-52.

6. Хорошенький А. Г., Шчников Е Е., Тинкер А. И. Определе-нке возможности высушивания и хрзкеЕия чушой вакцины ЕВ в lOOuï флаконах //Там же, С. 128-130.

7. Чэрнова Э. А., Танкер А. И., Голуезняе Е. С., Шчников Е 2. Новицкая Г. С., Вэрхозцава Г. Е , 1ййская Е Д., Саркисьян Е А. Возможность использования питательных сред из кукурузного экстракта в производства чумной вакцнны // Там же, С. 145-147.

8. Тинкер А. И., Шчников Е Е. Устройство для введения лекарственных вещэств. -Авторское свидетельство на изобретение N 1491522, 1989.

9. Шчников Е Е., Тинкер А. К Способ консервирования чумной живой сухой вакцины. -Авторское свидетельство на изобретение N 1510154, 1989.

. 10. Шчников Е Е., Вондарекко А. й. , йзроЕенький А. Г. Устойчивость цитоплазматических мембран к глубокому обезвоживании в процессе лиофильного .вьсушивания //Актуальные вопросы зяидеми-ол., проф. и диага.-i'особо опасных инфекций:/Тез. докл. итоговой науч. конф. (21-22 декабря 1989).-Стазрополь, 1989, Ч. 2, 0.19 -

22. ;,, ,

11. Шчников ЕЕ., Вэрховцева Г. Е , Шкрзсоз А.Д., Охонько И. А. Отработка релиза, лаофилпзгцкк чумной гакцгны с низкой остаточной влажностью.//Там же, С.22-24.

12. Яорогонький А. Г., Шчников Е Е. Опыт пристеночного замораживания чумной вакцины //Там же, С. 108-108.

»«к. NM3 Подп. к 13.12.91 ТИР. ХОР 8Ка.

Ротапринт СГ6, cre^onw^. л, .Ломоносова 8