Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Усовершенствование посевного материала и условий засева культуры в процессе производства чумной вакцины

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Усовершенствование посевного материала и условий засева культуры в процессе производства чумной вакцины"



;ударсгвейный комитет рсфср по санитарно-эпидемиологическому надзору

всесоюзный ордена трудового красного знамени научно-исследовательский противочумный институт

'микроб'

На правах рукописи

ИВАНОВА галина филипповна

удк 616. 981. 452-085. 37

УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ПОСЕВНОГО МАТЕРИАЛА И УСЛОВИЙ ЗАСЕВА КУЛЬТУРЫ В ПРОЦЕССЕ ПРОИЗВОДСТВА ЧУМНОЙ ВАКЦИНЫ

ОЗ. 00. 07 - микробиология

автореферат

диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

Саратов - 1991

Работа выполнена в Научно-исследовательском противочумном институте Кавказа и Закавказья

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор ТИНКЕР А.И.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Анисимова Т.И., доктор медицинских наук, профессор Филиппов А.Ф.

Ведущая организация - Среднеазиатский научно-исследовательский противочумный институт

Автореферат разослан "1992 г.

Защита состоится 1992 г

в !часов на заседании специализированного Совета Д 074.32.01 при Всесоюзном ордена Трудового Красного Знамени научно- исследовательском противочумном институте "Микроб" ( 410071, г.Саратов, ул. Университетская, 46 ).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке института "Микроб".

Ученый секретарь специализированного Совета, доктор биологических наук

КОРНЕЕВ Г.А.

I ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. За многие годы коммерческого выпуска чумной вакцины хорошо отработана технология её изготовления. Однако современныэ требования к МИБП предусматривают постоянное совершенствование препаратов, направленное на повышение их качества, максимальное упрощение процесса приготовления и снижение себестоимости продукции. При производстве чумной вакцины согласно нормативно-технической документации значительно растянут этап приготовления материала для засева питательной среды при получении больших объемов бакмассы. Для э™ого производят три пересева производственной культуры на питательных средах (пробирки с агаром Хоттинг-ера, бульон без аэрации и бульон с аэрацией). Вое эти манипуляции занимают 5-6 суток времени. З.И.Коробковой, Л.П.Павловой ( 1964, 1966), А.Ф.Филипповым, Т.И.Анисиуочой ( 1984 ) была высказана мысль о том, что в качестве посепной культуры мож-ьо использовать лиофилизированные микробные клетки, что существенно может упростить данный этап технологического процесса. Использование третьей генерации посевного материала предполагает не только накопление достаточного числа микробных клеток для засева большого количества питательной среды в АКЫ-1Д или реакторе, но и восстановление всех свойств культуры после анабиоза. В то же время литературные данные показывают, что достаточно одной генерации на искуств^кных средах сухих музейных культур, чтобы они приобрели исходные свойств? ( Чернова Э. А. и др., 1969; Печникоза И. В. и др., 1987; Калмыкова Л.И. и др., 1937 и др.).

Можно предполагать, что использование сухих посевных культур является вполне разрешимой проблемой. Реализация её требует довольно широкого' круга исследований для наиболее полной характеристики полученного препарата, что естественно нельзя реаить в одной работе.

Учитывая сказанное, уы считали необходимым сосредоточить свое внимание на ещё слабо изученных вопросах.

Анализ литературных данных и нескольких десятков млн доз чумной вакцины,выпущенной в НИПИ Кавказа и Змсачказья,показал,что способ л/обильного высушивания не гарантирует полной стабильности препарата. Несмотря на выпуск его в соответствии с Н'ВД в строго контролируемых условиях, колебания общей и биологической концентраций в

разных сериях было велико, а в. процессе хранения вакцины в регламентируемых температурных условиях отмечалась значительная гибель микробных клеток, достигающая двух и более раз ( Дертеьа И.И. и др., 1964; Анисимова Т.И.Голубева В.К., 1966; Чернова Э.А., 1967; Тинкер А.И., 1971; Дудутшдова Т.Н., 1977; Кузнецова К.А. и др., 1977; Печникова И.З. и др., 1985; Ракитина Е.Л., 1988 и др. ).

В качестве сухого посевного материала необходимо иметь стандартную культуру, длительно сохраняющую единое количество живых микробных клеток, обеспечивающих инокуляцию более или менее равного числа их в питательную среду. Проблема эта сложная, поскольку требует исследования значительного числа параметров, касающихся режимов высушивания, объема суспензии, вида контейнера, газовой среды при укупорке и т.д.

В связи с этим вполне оправдано наряду с наличием сухого посевного материала оставить в НВД использование производственных культур, но изучить возможность применения их первой генерации, а не третьей, как это заложено в документации.

Однако использование первой генерации требует тщательного изучения всех сеойств чумной вакцины.

Наряду с указанными вопросами важным является сосредоточить внимание на более глубокой характеристике препарата, полученного из биомассы повторного выращивания. Особенно это касается реакто-генности чумной вакцины, поскольку данное выращивание предусматривает двухэтажный рост культуры, каждый сроком 48 1 2 часа с частичным удалением продуктов метаболизма за счет иотрегнации агара осноешм раствором Хоттингера.

Известно,.что чумная вакцина, приготовленная из биомассы повторного выращивания, безвредна и способ её производства внесён в регламент № 37-8о. Однако данных по реактогенности препарата пока ещё недостаточно.

В своей работе мы использовали поэтапность решения поставленных задач. Всё это и явилось основанием для изучения перечисленных вше вопросов.

Цельработы: отработать наиболее оптимальные условия лиофилизации сухого посевного материала, доказать целесообразность использования первой генерации производственной культуры для приготовления чумной вакцины из биомасс первичного и особенно повторного выращиваний, а также изучить реактогенность препарата.

Задачи исследования:

I. Изучить возможность отработки оптимальных условий пркготов-

ления сухого посевного материала.

2. Апробировать сухой посевной материал в процессе производства чумной вакцины.

3. Доказать возможность использования одной генерации производственной культуры при изготовлении чумной вакцины.

4. Сравнить идентичность опытных сер^й препарата с отраслевым стандартным образцом.

5. Приготовить экспериментально-производственные серии чумной вакцины на базе отдела по приготовлению коммерческого препарата, изучить их качество и получить заключение -ЯСК ГИСК км. Л.А. Тара-севича.

о. Утвердить соответствующие изменения к НТД на чумную вакцину.

Научная новизна. Современным требованиям научной новизны и практической значимости отвечают результаты исследований по отработке условий приготовления сухого посевного материала.

Впервые изучена возможность использования одной генерации посевного материала для приготовления чумной вакцины, что сокращает сроки производства одной еярии препарата. Это представляет практическую ценность при выпуске вакцины. При отсутствии сухой посевной культуры можно пользоваться субкультурой одной генерации, что даот выигрыш во времени, равный 4 суткам.

Показано на основании критериев оценки реактогеннссти чумной вакцины по величине П-ОКС, феномену бляшкообразования,показателям лейкоцитов, опаловых кислот, д -липопротеидос, соотношению белноных фракций, что реактогенность препарата, приготовленного из биомассы повторного выращивания идентична отраслеьоиу стандартному образцу.

Полученные результаты могут быть использованы в качестве положительного примера в процессе производства других профилактических препаратов.

Практическая ценность

1. Приготовленные экспериментально-производственные серии чумной вакцины с использованием одной генерации и сухой посевной культуры получили положительное заключение ЛСК ГИСК им. Л.А. Тарасовича.

2. На основании результатов исследований оформлены изменения

$ 2 к РП № 37 - 86 на использование одной генерации посевной культуры, согласованные с директором ГИСК им. Л.А. Тарасевича и утвэрж-дзнные директором НШ1И Кавказа и Закавказья 26 ноября 1990 г.

о

Срок введения изменений в действие с I января 1991 г.

3. В КИПИ Кавказа и Закавказья осуществляется коммерческий выпуск чумной вакцины ЕВ с использованием одной генерации производственной культуры.

4. Данные исследований вошли в инструкцию по приготовлен™

к контролю вакцины чумной комбинированной су?:ой, утвержденную директором ШЛИ Кавказа и Закавказья 1В июня 1990 г.

5. Получено авторское свидетельство № 1598653 от июня 1&90г. "Способ определения степени повреждения бактериальных клеток".

Апробация работы: материалы диссертации доложе-ььг и обсуждены на:

1. 5 краевой научно-практической конференции, посвященной 50-летию противочумной службы Кавказа ( Ставрополь, сонтябрь 1985г.]

2. 6 краевой научной конференции, посвященной 70-летию Великой Октябрьской социалистической революции ( Ставрополь, декабрь 1987 г.). '

3. Межведомственной конференции "Актуальные вопросы вакциЯо-профилактики особо опасных инфекций" ( Киров, март 1591 г.).

4. Межлабораторной .конференции научно-исследовательского противочумного института Кавказа и Закавказья ( Сгаврополь, 1991 г.).

Публикации: основное содержание работы отражено в 3 опубликованных статьях.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы. Работа иллюстрирована 38 таблицами, б рисукка-.'и и 5 Фотографиями. Библиографический указатель содержит 279 литературных источников, в том числе 266 работ отечественных и 12 зарубежных авторов.

Полокенич, выносимые на защиту:

1. Отработка условий приготовления сухого посевного материала.

2. Необходимость использования и ■результаты исследований по применению одной генерации производственной культуры при изготовлении чумной вакцины.

3. Материалы по изучению реактогенности ч}мной вакцины повторного выращивания.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Обзор литературы состоит из одной главы,включающей 4 пункта, в которых дана общая характеристика условий культивирования, лио-филиэации и основные свойства сухих чумных вакцин.

Материалы и методы. В работе были использованы экспериментальные и экспериментально-производственные серии чумной живой сухой вакцины ЕВ, приготовленные из производственных культур одной генерации и сухого посевного материала; экспериментальные и экспериментально-производственные серии сухого посевного материала; отраслевой стандартный образец вакцины чумной сухой ( 0С0 42-28-15-87 П ); маточная культура 1983 года изготовления; штамм ЕВ чумного микроба линии НИИЭГ 1947 года сушки; среды, стабилизаторы, растворы, приготовленные в ЛПС НШИ Кавказа и Закавказья: 3 % агар Хоттингера ( рН 7,1 1 0,1 , аминный азот 125 t 25 мг°£ ), 2 % Иркутский дрожжевой агар рН 7,1 - 0,1),бульон Хоттингера ( рН 7,1 i 0,1, аминный азот 200 Î 10 мг^ ), основной гидролизат по Хоттингеру ( аминный азот 700 - 900 мг% ), глютаминовая ( Ю % сахарозы, I % желатины, 1,5 % глютаминовокислого натрия, 0,5 % тио-мочевины, 0,05 % пептона ) и тиомочевиновая ( 10 t сахарозы, I % желатины, I % тиомочевины ) среды высушивания с рН 7,6 Î 0,2, тио-гликолепая среда рН 7,0 Î'0,2 и 0,9 % раствор хлористого натрия забуференный до рН 6,5 - 7,5.

Экспериментальные и экспериментально-производственные серии чумных вакцин готовили согласно требованиям ТУ 42.14.214-81 и регламента производства № 37-86 с незначительными отклонениями.

Объектами исследований служили морские свинки массой 250-350 г и белые мкпш массой 18-20 г обоего пола. Животных содержали в условиях лаборатории на обычном для них рационе.

Выживаемость микробов в вакцине определяли культуральным методом согласно ТУ 42.14.214-81.

Обезболивание при всех манипуляциях с животными проводили согласно методическим рекомендациям "Обезболивание животных в эксперименте" и "Эвтаназия экспериментальных животных".

Для получения сыворотки забор крови у морских свинок осуществляли из сердца. Подсчет лейкоцитов и бляшкообразующих клеток (БОК) проводили в крови, которую брали из краевой ушной вены.

Уровень содержания в крови морских свинок II—ОКС и их гормо-

нальных фракций изучали согласно методическим рекомендациям "Определение стрессорного действия чумных вакцинных препаратов для оценки их безвредности ( 1980 ).

Накопление аутоантител определяли в РПГА, руководствуясь методическими рекомендациями "Использование теста аутоантителообра-зования для оценки безвредности чумных и холерных вакцин и отбора контингента для вакцинации" ( 1983 ).

Для оценки реактогенносги чумных вакцин использовали показатель БОК, который определяли по методике Н.Н.Клемарсксй ( 1977 ) в модификации Е.Л. Ракитиной и др. ( 1935 ), Лейкоциты в кров»: определяли с использованием унифицированных методов ( приказы МЗ СССР " Об унификации различных лабораторных исследований " № 290 от II.04.1972 г. и № 930 от 15.10.1974 г.). Количество общего белке в сыворотке исследовали по биуретовой реакции. Для определения соотношения белковых фракций пользовались турбидимзтрическлм методом. Пробу на сиалсвыз кислоты ставили пс методу Гесса. Содержание _в-липопротеидов определяли по Бурштейну и С-амай.

Накопление антител выявляли в РПГА с коммерческим ( антигенным, сер^я 13 ) эритроцитарным диагностикумом производства Среднеазиатского научно-исследовательского противочумного института. Серологические реакции ставили с помощью титратора системы Такачи согласно "Инструктивно-методическим материалам по применению серологических методов диагностики при эпизоотолзгическом обследовании природных очагов чумы " ( 1983 ).

Иммуногенность чумных вакцин ЕВ определяли в соответствии с методикой, изложенной в РП $ 37-86. Иммуногенность сухого посевного материала изучали при использовании однооуточной субкультуры второй генерации и ресуслензироЕг-дных микробных клеток.

Аллергическую реакцию ка фракцию Г чумного микроба у морских свинок, вакцинированных приготовленными нами вакцинами ЕВ определяли, согласуясь с результатами экспериментов А.Ф. Филиппова и др. ( 1977 ).

Изучение биологических и физических свойств было проведено в соответствии о РП },"» 37-86.

Наличие Сат и Са" вариантов приготовленных препаратов изучали на магниево-оксалатлом агаре Хигучи-Смита ( 1961 ) согласно рекомендациям В.В. Акимовича и др. ( 1964, 1965 ).

9

а

Наличие спонтанных мутантов к рифампицину, стрептомицину, чали-диксовоЯ кислоте определяли по методике, описанной Э.Г. Шпилевой и др. ( 1978 ).

Результаты исследова н*и й и их обсуждение. Метод лиофильного высушивания биологических препаратов обладает большими возможностями. С его помощью микроорганизмы можно сохранять многие десятилетия.

В настоящее время известны факторы, влияющие на качество высушиваемых объектов. Анализ опубликованных литературных данных показывает, что большое значение имеют условия культивирования штаммов, фазы роста, физическое состояние, температура и скорость замораживания суспензии, защитная среда, оптическая концентрация, режимы ли-офилизации, вид и объем контейнера, количество материала, газовая ореда и т.д. ( Бахрах Е.Э. и др., 1951; Николаев Н.И. и др.,1954; Дроздовская Ф.К. и др., 1966; Филиппов А.Ф. и др., 1966, 1970, 1985: Тинкер А.И. и др., 1964, 1971, 1989; Печникова И.В., 1964, 1957; Фунтияова Т.Н., 1977; Анисимова Т.И., 1970 и др. 7.

Учитывая сказанное, перед нами стала задача определить, какие из указанных условий лиофилизации необходимо исследовать для приготовления концентрированных сухих посевных культур. Поскольку в процессе усовершенствования технологии чумной вакцины достаточно хорошо отработаны условия культивирования, фазы роста, стабилизаторы и т.п., мы считали необходимым в соответствии с поставленной целью изучить влияние максимальной плотности микробов, объем суспензии, вид контейнеров и режимы лиофилизации.

Однако для решения этой задачи предварительно надо было экспериментальным путем определить количество микробных клеток в высушенном материале, достаточное для засева промышленных объемов питательной среды в АКМ-Ш или реакторе.

Для этого нами было использовано математическое моделирование опытов с дальнейшей обработкой результатов на ЭБМ. Данные показа.™, что оптимальной дозой для засева питательном среды без ущербе для выхода биомассы можно считать 100 млн ж.м.к. в I ««л посевного материала при общей концентрации не выше I млрд м.к. В процессе приготовления опытных серий сухого посевного материала была использована широкая вариабельность эксперимента. Для выращивания биомассы брали агары Хоттингера, кукурузный с добавлением 5 % и 17 % аминопептида,

кукурузно-казеиновый; засев их в АКМ-Ш осуществляли односуточной бульонной субкультурой первой или второй генераций, регидратированными микробными клетками отраслевого стандартного образца. Суспензию доводили до 100, 200 у 300 млрд/мл, разливали по 2,4,6,8,10, 25 и 50 мл в ампулы 1ИПВ-6 и 20-мл безвакуумные, 20-мл пенициллино-вые и ЮО-мл флаконы, замораживали столбиком в скошенном виде и пристеночно при -40 - -50 °С от 18 до 72 часов, высушивали в камерах КС-30 и ТГ-5 различными режимами, укупоривали флаконы несколькими способами под воздухом и ампулы опаивали под вакуумом (табл.1).

Свойства препаратов изучали сразу после приготовления и на этапах хранения. В качестве основного критерия при отборе оптимального варианта являлась жизнеспособность, хотя в опытных образцах исследовали ещё растворимость, внешний вид, наличие посторонних примесей, остаточную влажность, иммуногенность. Было установлено, что из всего многообразия условий постановки опытов существенными оказались два фактора: концентрация микробных клеток в суспензии и газовая среда контейнера. Как видно из данных таблицы 2, выявлена очень четкая"закономерность: при концентрации выше 100 млрд м.к. в I мл суспензии происходила интенсивная гибель их как в процессе высушивания, так и при хранении. Эти данные согласуются с описанными ранее И.В. Печниковой ( 1974 ). По нашему мнению причиной тому могут служить два фактора: несбалансированность защитной среды с количеством микробов в суспензии или усиленная гибель их за счет активного столкновения молекул пара с более плотно расположенными клетками в замороженном блоке при сублимационной сушке. В процессе хранения препаратов была значительнее гибель микробных клеток в атмосфере воздуха по сравнению с вакуумом. В то же время в пеницил-линовых флаконах, укупоренных под воздухом, термостабильность повышалась при увеличении объема суспензии, несмотря на то, что в них процент остаточной влажности был в 1,5-2 раза выше ( табл. 3 ). Теоретически это можно объяснить уменьшением объема воздуха при возрастающей массе микробов и соответственно торможением окислительных процессов. Аналогичные результаты были получены при лиофи-лизации посевного материала в объеме 50 мл в ЮО-мл флаконах, замороженных равномерно по стенкам,укупоренных под воздухом. В них жизнеспособность суспензии находилась почти на уровне образцов, опаянных под вакуумом. Однако в дальнейшем такой посевной материал

Параметры отрабэт::и сухого посевного материала

Таблица I

Вариант

Объем : Объём :Оптическая¡Газовая, л Л : Режим лиофилизации

:длТ?тёль-- -.-конечная" " :мГ' :%/мл гнзра ¡вания | кость, --ература

• ! ! ! ! ; С

Тип

супильной камеры

I Ампулы 6 2 100 вахуук скошено 30 45 КС/30

2 н 6 4 100 вакуум 30 45 —

3 п б 4 200 вакуум Н 30 45

4 — 20 ТО 100 воздух « 30 45

5 — 20 10 200 воздух « 30 45

6 20 10 300 воздух п 30 45 п

7 Флаконы 20 о 100 воздух столби- 30 30 л

8 20 4 100 воздух ком.^ 30 37 «

9 и 20 5 100 воздух __ и_ 30 45 и

10 г 20 8 100 возду:; __ !Т_ 30 50

II п 20 10 100 воздух Гт 30 55

12 100 25 200 воздух пристеночно 44 30 ТГ-5

13 100 25 200 воздух столбиком 48 35 г.

14 г» 100 50 100 воздух пристеночно 48 25 и

0Г~

Примечание: суспензию замораживали 18-72 час при -40 + -50

Таблица 2

Жизнеспособность сухого посевного материала в зависимости от концентрации м.к. и газовой среда контейнеров

Вид ; Объём ; Объем Оптича скалГаз о вая: Кол-во ж.м.к., %

контей- :конгей-:суслен- :концентра-:среда в:- --~ 33"

нера : нера, :зии,мл :ция, , :контей-: : ч®£®3

" мл : ¡млрд/мл :нере : су^ки : о р

• • • 0-о С

¡млрд-'мл

Ампулы 6 4 100 вакуум

п б 4 200 вакуум

н 20 10 100 воздух

ъ 20 10 200 воздух

п 20 10 300 воздух

25,3±3,6 4,610,1 30,52:1,4 3,610,4 4,5-0,2

16,5^1,6 0,210,04 7,310,6 0,1^0,04 0,210,04

Примечание: средние данные 3 серий

Таблица -3

Влияние остаточной влажности и объема суспензии на термостабильность сухого посевного материала

Вид : Объем : Объем :0птическая|Газовая Остаточная -Трпмпп™-

! \ ^пен"ощектра-:среда в :элажиость :б®Сость,

нера .ьера, .зли, .ция, .контеи- а .

:мл :мл :млрд/мл :нере : " \ '

Флаконы 20 2 100 воздух 1,4 3,4

п 20 4 100 воздух 1,4 7Д

и 20 6 100 воздух 1,7 7,6

« 20 8 100 воздух 2,6 8,6

20 10 100 воздух 2,7 10,0

Примечание: средние- данные 3 серий

не был использован, из-за трудности его приготовления в условиях нашего эксперимента.

У^тыъая, что минимальной посевной дозой лиофилизированной культуры является 100 млн я.м.к. в I мл суспензии при общей.концентрации не выше I млрд микробов, мы рассчитали необходимое количество фасовочных единиц для зр.сева АКМ-Ш. При розливе 10 мл суспензии в пешциллиновые флаконы достаточно 2-х после высушивания, с уменьшением объема материала до 4 мл количэство их достигает 7, а в процессе хранения з течение 29-32 месяцев от о до 53. При высушивании посевной культуры по 4 мл в ампулах ШПВ-5 и опаянных под вакуумом соответственно указанным срокам необходимо 5 и 8 ампул.

По всем остальным свойствам ( растворимость, внешний вид, остаточная влажность, иммуногониость ) посевной материал был на уровне требований, предъявляемых к производственным культурам технической документацией на выпуск чумной вакцины.

Таким образом, показана принципиальная возможность приготовления сухого посевного материала, который можно длительно хранить и использоват!. при относительно низкой жизнеспособности. В этом случае для засева АКМ-Ш необходимо довольно большоз количество контейнеров.

Результаты опытов явились основанием для приготовления экспериментально-производственных серий сухого посевного материала и апробации его при выпуске коммерческих серий вакцины.(табл. 4).

Таблица 4

Характеристика экспериментально-производственных серий сухого посевного материала для приготовления чумной вакцчны ЕВ

Вид контейнера Параметры ' Ампулы Флаконы

I : 2 3

Объем контейнера, мл Объем суспензии, мл Кол-во Ж.М.К., % пселе высушивания б 4 30.611,5 20 8 24,8*0,5 20 . 10 25,Ш,2

черзз 21 мес. хранения при 0-б°С 27,5*0,6 6,4*0,1 7,6*0,9

----т----- _ __ ---. 3

Остаточная влажность, % 1,7 1.1 1,2

Термостабильность, сут. 35,4 13,2 13,9

Кнмуногенность по ВД^о»

субкультура:

морские свинки . 400 396 804

белые мыши 4343 5072 5545

ресуспензированше клетки:

морские свинки 1Е63 1051 655

белые мьши 9943 8741 6506

Примечание: средние данные & определекий.

Биомассу выращивали на агаре Хоттянгерг. в АКЫ-Ш, смывали гля-таминовым стабилизатором, разводили до 100 млрд/мл, разливали по 4 мл в ампулы ШПВ-6, по 8 и 10 мл в пенициллиновыу фпаконы, вксу-шивали разными режимами до остаточной влажности 1,1 - 1,7 %, Ампулы опаивали под вакуумом, флаконы укупоривали под стерильным воздухом. Сразу после лиофилизации жизнеспособность была в пределах 24,6^0,5 - 30,6^1,5 5С, в процессе хранения в течение 21 мзся-ца при 0-6 °С в ампулах гибели ы.к. не отмечено, а в пенициллине-вых флаконах она была значительной. Аналогичные данные получены и по термостабильгюстй серий. Икыуногенность субкультур посевного материала соответствовала требованиям регламента и была несколько вьше по сравнению с вакцинацией рзсуспензированными микробами.

По всем остальным свойствам результаты совпадали с требованиями НТД на чумкую вакцину.

В процессе апробации сухого посевного материала быйо проведено два выращизания на агаре Хоттикгера в АКЫ-Ш, В первом - в качестве посевного материала использовали 12 ампул 0С0 ( по 2 мл суспензии ) и вс втором - 4 ампулы ( пс 4 мл суг.пензии ) приготовленных нами образцов.

Из биомассы первого АКН-Ш приготовили 2 серии чумной сакцкны из первичного к повторного выращиваний на тиомочевиновом стабилизаторе, а из второго АКН-И - 3 серии так ке из первичного и цов-торного выращиваний на глютаминовой ергде высушивания.

Результаты показали, что указанные варианты препаратов по всем свойствам соответствовали НТД на чумкую вакцину.

Нами был проведен значительный объём исследований по отработке способов приготовления сухого посевного материала, однако мы так и не добились длительного хранения необходимого для засева питательной среды в АКЫ-Щ количества ж.м.к., лиофилизирован-ньгх в одном контейнере. Применение нескольких ампул или флаконов для этой цели не соответствует требованиям, предъявляемым к современной технологии изготовления лекарственных или профилактических веществ, предназначенных для парэнтерального введения. Идеальная технология требует свести к минимуму все этапы, чреватые загрязнением продукта посторонней микрофлорой. При этом результаты наших экспериментов совпадают с аналогичными исследованиями М.А. Гладус и др. ( 1978 ), которые при засеве питательной среды в АКЫ-Ш использовали 6 ампул сибиреязвенного сухого посевного материала.

Несмотря на хорошо отработанные условия лиофилизации чумной вакцины, разлитой по 2 мл в ампулы 1ШВ-6, многие исследователи отмечаяг гибель м.к. в препарате при 0-6'^С хранения через 2,3 года в 2 - 4 и более раз. Всё это указывает на то, что с помощью лиофильного высушивания нельзя добиться полной стабилизации свойств биообъектов. Поэтому в производственной документации на чумную вакцину необходимо предусмотреть дополнительно два технологических варианта. Первый - регламентация хранения сухих посевных культур при температуре -20 -40 С с целью резкого торможения химических реакций, протекающих в высушенных м.к., но он затруднен из-за того, что уже через два-три дня необходимо отключать низкотемпературные холодильники, а материал переставлять в другой. Второй вариант более приемлем в производстве. Ввести в ФС и РП параллельно использованию сухого посевного материала одну генерацию производственной культуры. В РП 37-86 для засева АКМ-Ш была предусмотрена третья её генерация. Применение сухого посевного материала не влияло на качество вакцины. Следовательно, теоретически мы предположили, что первую генерацию субкультуры можно использовать с указанной выше целью. Однако для внедрения изменений в практику необходимо было провести целый комплекс исследований, всесторонне характеризующих коммерческий препарат чумной вакцины. Для этого были приготовлены в АКМ-Ш 4 экспериментальные серии, а также по 3 экспериментально-производственные серии чумной вакцины

из биомасс первичного и повторного выращиваний на агаре Хоттингера. Во все:: вариантах в качестве посевного материала использовали первую генерацию производственной культуры. Контролем служил ОСО. Культурально-морФологические сройства, растворимость, жизнеспособность, иммуногенность и безвредность экспериментальных серий чумной вакцины не имели отклонений от требований НТД.

Экспериментальные серии также по всем указанным выше свойствам соответствовали ОСО чумной вакцины ( табл. 5 ). В качестве дополнительной характеристики изучали иммунобиологические показатели, приживаемость, клеточный состав, морфологию микробов в электронном микроскопе.

Таблица 5

Характеристика чумной вакцины ЕЕ, приготовленной с использованием первой генерации производственной культуры

Посевной материал

I генеоашш

3 генерация -..-.¿ОСОТ—

Серия

Цикл выращивания

экопери- экспериментально-ментальная производственная

производственная

первичный , первич- повторны? ный |

пеоЕичнык

Кол-во серий (определений)

4/1£ 28.11 1,1

3/9

3/9

2/6

Кол-во ж.м.к.$ после высушивания

через 12-42 мес.

при 0-6 °С 24,91 1,8

Остаточная влажность,^ 1,8

Термост&бильчость, сут. 17,0

Иммуногенность го ВД50, ж.м.к.

морские свинки 2497

белые мышк 13253

39,011,0 33,110,7 38,912,7 38,е11,0 38,111,7 38,912,7

1,7

19,6

5193 5276

2,0 19,6

7194 12811

1,8

19,0

4173 3177

Гитры антител в крови.морских свинок и белых мышей, величина

| инфильтрата у морских свинок при в/к введении фракции I и приживаемость м.к. в первичном комплексе были у животных на уровне вакцинации контрольными сериями препарата. Аналогичные результаты получены при исследовании числа колоний на среде Хигучи-Смита и количества спонтанных мутантов по отношению к рифампнннму, стрептомицину и налидиксовой кислоте. Ультраструктура клеток опытных и контрольных образцов однотипна для всех просмотренных препаратов и независима от способа приготовления вакцин.

Учитывая, что при повторном выращивании в препарат мечет попасть значительно большее количество продуктов метаболизма по сравнению с первичным, мы провели пелнГ комплекс исследований по изучению реактогенности чумной закцины. приготовленной из биомассы повторного выращивания с использованием перкой генерации производственной культуры.

Результата экспериментов показали, что изменения количества П-ОКС, бляшко образующих клеток, лейкоцитов, спало пых кислот, липопротеидов, общего белка и белковых фракций, выянв<нмке ••:••.:;!-ной из биомассы повторного вьращирания и отраслевым стандартным образцом идентичны.

В заключение следует отметить, что весь комплекс исследований позволяет рекомендовать биотехнологию сухего посевного мачериялч, обеспечивающего приготовление высокого качества чумной вакцины. Кро^е этого нами показано, что использование перво:5 генерации производственной культуры вместо третьей также значительно сокращает ( на 4 суток ) время подготовки посевного материала и не изменяет свойств препарата по сравнению с отраслевым стандартным образцом. Указанные изменения включены в РП р 37-86 на чумкуп вакцину и п настоящее время используются в промессе производства её в НИПИ Кавказа и Закавказья.

ВЫВОДЫ

I. Установлено, что б процессе лиофилизации сухих покерных культур для производства чумной вакцины ЕВ увеличение концентрации микробных клеток до 200-300 млрд мл резка, снижает жизнеспособность препарата. Вид контейнера ( ампулы б и 20 мл, Флаконы 20 и 100 мл ) и об-,ем суспензии < 2, 4, 6, 8, 10, 25 и 50 мл ) не влияют на количество живых микробов после высушивания. Их гибель в

процессе хранения при 0 - 6 °С в основном связанная с газовой средой контейнеров, лучше микроорганизмы выживают в вакууме, хуже -в атмосфере воздуха.

2. Разработаны режимы лиофилизации сухих посевных культур в аппаратах КС-30 и ТГ-5: длительность высушивания в ампулах и пени-циллиновых флаконах составляет 30 часов; изменение температуры материала от -50°С в начале процесса до 30 + 55 °С в конце в зависимости от объема суспензии (2 - 10 мл ); длительность сушки в 100 - мл флаконах (25 - 50 мл суспензии ) - 44 - 48 часов при разнице температур материала от - 25 °С до 35°С. Предварительное за-мараживание в низкотемпературных столах при -40 -¡- -50 °С до 72 часов.

3. Установлено, что оптимальными условиями для приготовления сухого посевного материала являются концентрация микробных клеток 100 млрд/мл, объем суспензии 4 мл в ампулах ШПВ-6, опаянных под вакуумом и остаточная влажность не выше 2.%.

4. Качество сухого посевного материала соответствует требованиям нормативно-технической документации для производственной культуры чумного вакцинного штамма ЕЗ,

5. Чумная вакцина, приготовленная из биомассы, выращенной с использованием сухой производственной культуры, по всем требованиям соответствует ФС-42-326 ВС-90 и РП № 37-86.

6. Для снижения риска загрязнения посевной суспензии при применении нескольких контейнеров с лиофилизированными производственными культурами предложено использовать и первую генерацию производственной культуры.

7. Установлено, что чумные вакцины из биомасс первичного и повторного выращиваний, приготовленные с использованием первой генерации произ>ч.\"ггвенной культуры, по основным (культурально-морфологические, жизнеспособность, иммуногенность, термостабильность, остаточная влажность, внешний вид ) и дополнительным ( ультраструктура, приживаемость,реактогенность и т. д. ) свойствам находились на уровне отраслевого стандартного образца и соответствовали требованиям НТД."

8. Разработаны и утверждены изменения № 2 к РП № 37-86 на использование первой генерации производственной культуры (срок ввода в действие 01.01.91.г.)

9.Предложено использование сухого посевного материала для выращивания биомассы с целью приготовления фракции I чумного микроба, что внесено в "Инструкцию по приготовлении и контролю вакцины чумной комбинированной сухой", утвержденную дирктором НИШ Кавказа и Закавказья 18 июня 1990 г.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Рахитика Е.Д., Тинкер А.И., Щедрин В.И., Иванова Г.Ф. Использование показателя бляпшообразуоднх клеток для оценки ре-актогенности чумных Еакцин /'/'Актуальные вопросы иммунодиагностики особо опасных инфекций: Тез. докл. всесоюз. науч.-практ. конф.-Ставрополь, IS86, ч.2,_ С. 53-56. ДСП.

2.Ракитина Е.Л., Тинкер А.И., Гончарова М.Н., Иванова Г.<5. Серологические и клинико-биохшические показатели у морских звинок, иммунизированных разными дозами чумной вакцины ЕВ // Там же.-

С. 56 - 59.

3. Иванова Г.Ф., Печникова И.Б., Печкшчов Н.Е. Опыт использования сухого посевного материала для получения биомассы чумкых вакцинных штаммов в экспериментальных целях /' Особо опасные инфекции на Кавказе: Тез. докл. 6 краев, науч. конф., посвященной 70-летия Великой Октябрьской соц. революции (дек. 1987).- Ставрополь, 1987, ч. I.- С. I3d-l4l.ДСП.

4. Иванова Г.ф., Тинкер А.И., Несис Й.А., Печников». И.В. Использование метода математического планирования эксперимента для изучения влияния посевной дозы на выход биомассы чумного вакцинного штамма ЕВ /7 Там же.- С.141-144.

5. Иванова Г.Ф., Верховцева Г.Н., Новицкая Г.С., Саркисьян H.A. Шпилевая Э.Г., Дагаева Р.Качество чумной живой сухой вакцины ЕЕ, приготовленной с использованном различного посевного материала штамма ЕВ // Актуальные вопросы эпидемиологии, профилактики и диагностики особо опасных инфекций: Тез. докл.•итоговой науч. конф.-Ставрополь, ч. I.- С.113-115.

6. Иванова Г.5., Печников Н.Е., Гюлушанян К.С., Сергеева Г.М.; Верховцева Г.Н., Новицкая Г.С., Хорошенький А.Г., Дагаева P.S. Сгособы приготовления сухого посевного материала для производства чумной вакцины ЕБ // Там не.- C.II5-II6.

7. Бондаречко А.И., Иванова Г.Ф. Изучение ультраструктуры клеток чумной вакцины при использовании ь процессе её изготовления сухих посевных культур и производственных культур первой генерации // Там же.- С. 21-23.

8. Ракитина 2.Л,, Иванова Г.Ф. Изучение реактогенности чумной вакцины, приготовленной с использованием сухого посевного материала и первой генерации производственной культуры // Там же.-С. 37-40.

Зак. 1« 19 10/01-1992 г. Тираж 100.

отпечатано в отделе операпганой печати Ставропольского краевого управления статиитики г. Ставропо!»*., ул. Пушкина, 4