Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка электронномикроскопического способа количественного определения поврежденных клеток чумной вакцины ЕВ

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Разработка электронномикроскопического способа количественного определения поврежденных клеток чумной вакцины ЕВ"

ОД

На правах рукописи УДК 579.842.23-097:537.533.35

БОНДАРЕНКО АНДРЕЙ ИВАНОВИЧ

РА ЗРАБОТКА ЭЛЕКТРОННОМИКРОСКОПИЧЕСКОГО

СПОСОБА КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОВРЕЖДЕННЫХ КЛЕТОК ЧУМНОЙ ВАКЦИНЫ ЕВ

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

На правах рукописи УДК 579.842.23-097:537.533.35

БОНДАРЕНКО АНДРЕЙ ИВАНОВИЧ

РАЗРАБОТКА ЭЛБКТРОННОМИКЮСКОПИЧЕСКОГО

СПОСОБА КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОВРЕЖДЕННЫХ КЛЕТОК ЧУМНОЙ ВАКЦИНЫ ЕВ

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Работа выполнена в Ставропольском научно-исследовательско! противочумном институте

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессо Тинкер А.И., доктор медицинских наук, профессор Локтев НА.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессо Анисимова Т.И., заслуженный деятель науки, доктор медицински наук, профессор Филиппов А.Ф.

Ведущая организация, Ростовский научно-исследовательский прс тиочумный институт

Защита состоится 21.06.1995г. в 13-00 на заседании диссертационног совета Д 074.32.01 при Российском научно-исследовательском прс тавочумном институте "Микроб" (410610, Саратов, ул. Университет екая, 46)

Автореферат разослан /У.рГ 1995 г.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке институт "Микроб"

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Корнеев ГА.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Производство рофилактических бактериальных препаратов является сложным [ногофакторным процессом, в том числе и чумной живой вакцн-ы. Биотехнология ее хорошо разработана, но несмотря на четко егламентированные почти все этапы изготовления отмечается чень широкая вариабельность жизнеспособности коммерческих ерий чумной вакцины, от 25 до 50% (Ракитния Р i !Г22;. т^нг.

«•-«"■!•!*?!:,: 132 ¿¿ьигкт ^т факюров.

стречгпсщихся как в процессе её приготовления, гак и хранения \нисимова Т.И., Голубева В.К., 1966; Тинкер А.И. с соавт., 1966: Филиппов А.Ф., 1964 и др.). Общепринятым методом изучения живых 1икробных клеток является культуральный, основанный на способ-ости их расти на искусственных питательных средах. Считается, то такие особи наиболее полноценны, хотя известно, что популяция леток чумной вакцины ЕВ неоднородна и содержит микробы, кото-ым присущи элементы жизнедеятельности, но они потеряли способ-ость к образованию колоний на агаре (Тинкер А.И.. 19"!). Поэтому ажной проблемой остается дальнейшее исследование изменений ло-уляции штамма ЕВ. особенно, в зависимости от факторов, связанных производственным циклом.

Многочисленные данные литературы показывают, что все этапы производства вакцинных препаратов в тон или иной степени оказывают губительное влияние на микроорганизмы. В то жё время анализ показывает, что наиболее вредным поздейсгвиям подвергаются тираничные системы клетки, коюрые играют важную роль и жизнеобеспечении микробов (Стейннер Р. с соавт.. 19^9: КагаваЯ.. 1985 и др). Подтверждением сказанному служат данные В. Калаус. ЗЛавличек (1987), показывающие, что основной мишенью для повреждений являются клеточная стенка (КС) и цитоплазматичеекая мембрана (ЦПМ). При этом М.Д.Нусимов (1982; считает, что при разрыве ЦПМ еще возможны репарационные процессы, но при разрыве КС обязательно происходит их гиосль. По мнению Д.К.Осфовского с соавторами (1983) нарушение структуры и функции прямо или косвенно отражается на жизнеспособности микробов, вплоть до необратимых процессов, приводящих к летальному их исходу.

Р.И. Кузьмина с соавторами (1987) считают, что учет повреж дения мембранных структур, определяемых элестронномикроско пически, может служить надежным ориентиром при выборе способг и режима криоконсервации и сушки. Однако следует учитывать, чте проблема повреждений клеток после различных физических воздей ствий изучена широко, но аналогичных исследований, связанных ( лиофилизацией мало (Плешакова Т.В., 1992). Это в полной мере относится и к биотехнологии чумной вакцины. За более чем 50-летни£ период ее разработки такого рода исследования практически отсутствуют, хотя они представляют не только теоретический интерес, не и сугубо практическое значение, поскольку позволяют более объективно оценить качество популяции вакцинного штамма, выявить наличие и роль поврежденных и разрушенных клеток, определить наиболее уязвимые места биотехнологического процесса и разработать информативный тест для отработки оптимальных режимов производства препарата. Этим и определяется актуальность проблемы.

Цель работы. Разработать с помощью электронно-микроскопического исследования тест количественного определения поврежденных бактериальных клеток чумного вакцинного штамма ЕВ. изучить условия их образования в процессе производственного цикла,регидратации препарата и хранения суспензии.

Задачии сследования:

1. Дать ультраструктурную характеристику повреждений бактериальных клеток штамма ЕВ.

2. Разработать объективный и информативный количественный тест повреждения КС и ЦПМ микробов чумной вакцины ЕВ.

3. Изучить влияние некоторых этапов производства чумной вакцины ЕВ на повреждаемость микробных клеток.

4. Исследовать значение процесса регидратации сухой таблетки и условий хранения суспензии на повреждение клеток вакцинного штамма ЕВ.

5. Выработать рекомендации для использования теста повреждения КС и ЦПМ в процессе отработки и совершенствования биотехнологии чумной вакцины.

Науч-н ая новизна. Впервые показано, что в процессе производства чумной вакцины ЕВ происходит повреждение КС и ЦПМ микробных клеток. Установлена зависимость между количеством поврежденных клеток и степенью воздействия некоторых этапов биотехнологии препарата. Быстрая воспроизводимость pe-i

ультатов позволяет предложить дополнительный экспресс-метод :отпроля качества полуфабрикатов. Разработанный способ и поученные результаты существенно расширили представления о не-»днородности популяции клеток чумного вакцинного штамма ЕВ и юзволяют дать более полную качественную характеристику исполь-уемому препарату. Полученные результаты могут быть использова-1Ы в качестве положительного примера для разработки аналогичного методического приема в процессе создания или совершен-твования других бактеоиалкнм* пргп^рагс.^.

Пу^к1ическкм е и с с т I.

На основании результатов исследования разработаны:

1. "Способ определения степени повреждения бактериальных леток" с помощью электронной микроскопии в процессе производ-тва для экспресс-анализа состояния клеток и отработки биотехноло-ических режимов приготовления бактериальных вакцин. Способ ащищен авторским свидетельством N 1598653 от 8 июня 1990 г.

2. Методические рекомендации "Способ количественного опре-[еления поврежденных бактериальных клеток вакцинного штамма ¿В", утвержденные 28 мая 1992 г. Ученым Советом СНИПЧИ. Ука-анные методические приемы широко применяются в производствен-юй и научной деятельности лаборатории чумных вакцин Ставро-юльского научно-исследовательского противочумного института.

3. Данные исследований использованы, как дополнительный »бъективный тест при составлении изменений к регламенту произ-юдства чумной живой сухой вакцины на внедрение тиомочсвиновой реды высушивания с увеличением срока годности препарата до 5 [ет.

Апробация работы: материалы диссертации доложены и >бсуждены на:

1. Межведомственной научной конференции "Актуальные во-гросы профилактики особо опасных инфекционных заболеваний" Киров, 1991).

2. Совместном совещании "Вопросы стандартизации получения I оценки качества чумных к сибиреязвенных вакцин" (Киров, 1992).

3. Российской научной конференции "Иммунология и специ->ическая профилактика особо опасных инфекций" (Саратов, 1993).

4. Межгосударственной научной конференции "Профилактика и !еры борьбы с чумой" посвященной 100-летию открытия возбудителя чумы (Алматы, 1994).

Заказ № 928

5. Итоговой научной конференции, посвященной 100-летию от крытия возбудителя чумы (Ставрополь, 1994).

Публикации: основное содержание работы отражено в < опубликованных статьях.

Объем и структура р а б о т ы. Диссертация состоит и: введения, Г главы обзора литературы, 5 глав собственных исследо ваний, заключения, выводов, списка литературы. Работа иллю стрирована 21 таблицей и 20 рисунками. Библиографически» указа тель содержит 242 литературных источника, в том числе 192 рабо' отечественных и 50 зарубежных авторов.

Положения, выносимые на защиту:

1. Способ количественного определения поврежденных бактери альных клеток чумного вакцинного штамма ЕВ до и после лиофили зации.

2. Влияние этапов производства чумной вакцины ЕВ (условш культивирования биомассы, защитные среды и т.д.) на повреждае мость микробных клеток.

3. Значение процесса регидратации сухой таблетки чумной вакцины ЕВ, длительности и температуры хранения суспензии для образования поврежденных микробов.

4. Характеристика популяции клеток в прививочной доз; чумной вакцины ЕВ, основанная на определении структурных и метаболических повреждений микробов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Обзор литературы состоит из одной главы, включающей 6 пунктов, в которых дана общая характеристика этапов производства бактериальных вакцин и их влияния на жизнеспособность и повреждаемость микробных клеток.

Материалы и методы. В работе использовали коммерческие живые сухие вакцины ЕВ, полученные из производственного отдела Ставропольского научно-исследовательского противочумного института, и экспериментальные, приготовленные соответственно с задачами экспериментов.

Штамм ЕВ по культуральным, морфологическим и серологическим признакам - типичный чумной микроб океанической разновидности. Не разлагает глицерин, дульцит, лактозу, рамнозу, сахарозу. Он ферментирует арабинозу, глюкозу, ксилозу, мальтозу-маннит, продуцирует пестицин 1, проявляет фибринолитическую I

¿0 '

шазмокоагулирующую активность. Штамм ЕВ имеет все известные нтигены чумного микроба.

Коммерческие серии чумной вакиины ЕВ готовили из биомассы, 1ыращенноп на 3% агаре Хоттингера с содержанием амин ною азота 25+25 мг%, рН-7,1+0,1.

Экспериментальные вакцины готовили согласно требованиям ГУ-42.14.214-81 и РП N 204-81, РП N 37-86. Бактериальную массу (Ыращивали как в АКМ-Ш, так и в матрацах на агаре Хоттингера >Н-7,1±0,1.

Длл Ьырашикямия ^акгсри^иьной массы применили У-. агар <отт5Ш1сра о содержанием аминного азота 50, 100, 150 мг%. 3% 1гар СМК (Майский В.Г. и Куцемакина А.З., 1979), 3% агар Хоттнн-■ера с добавлением 0,5 мг% липоевой кислоты. Согласно условиям зпытовмикроорганизмы культивировали в течение 28, 48. 60, 72 ¡асов при температурах 22± 1°С и 27± 1 °С.

В качестве защитных сред использовали: плотаминовую (10*' ¡зхарозы, 1% желатины, !,5% птютаминовокислого натрия 0.5-г тио-лочевины, 1% пептона), тиомочевиновую (10е'-, сахарозы, 1 - жела-:ины, 1% тиомочевины), тиомочевиновую с добавлением курантила ),3, 1,0, 3%, полиэтиленгликоль с молекулярной массой 6000 и добавлением (З-аланина 0,5, 1,0, 2,0, 3.0 : ОЬ-изолейцина в таких же сонцентрациях; Ь-пролина 0,5, 1,0, 2.и ; глютамата натрия 0.5, 1.0, £,0%; диметилсульфоксида 0,5 и 1,0% . Бактериальную массу разлизали по 2, 4 мл в ампулы (тип ШПВ, ГОСТ 18 122-~5) и 20 мл пе-шциллиновые флаконы по 6, 8, 10 мл, замораживали в холодиль-гой камере при - 30°С в течение 20-24 часов. Суспензии сушили в самерном аппарате ТГ-5 по режиму, соответствующему требованиям регламента N 204-81 на производство чумной вакцины. Укупорку 1мпул проводили под вакуумом, флаконов - под сухим воздухом.

В суспензиях определяли оптическую концентрацию микробных клеток визуальным методом с помощью ОСО мутности 42-28-59-?5-П ГИСК им. Л.А. Тарасевича, принимая 10 единиц мутности эк-зивалентными 1 млрд м.к./мл. Количество живых микробов определяли согласно ТУ 42.14.214.81. ВФС N 42-!-!9 ВС-88 и ФС 42-326 ВС-92. Содержание ампулы или флакона ресуспендировали добав-иением 0,9, 1,8, 3,6, 5,4, 7,2, 9,0 мл охлажденного 0,9% раствора хлорида натрия в зависимости от объема высушенного материала. Этим ке раствором суспензии десятикратно разводили в пробирках до 10 I 10 и соответственно по 0,1 мл засевали на чашки с агаром, равно-

*

мерно распределяя жидкость по его поверхности. Посевы инкубиро вали в термостате при температуре 27±1°С в течение 3-4 суток. Про цент выросших колоний вычисляли для каждого образца, принима5 за 100% количество засеянных м.к. согласно определению их с по мощью ОСО мутности.

Для изучения ультраструхтурьi клеток штамма ЕВ использовал! культуры, выращенные на агаре Хотгингера рН - 7,1+0,1 в матрацал и в АКМ-Ш при температуре 27±1°С в течение 48 часов. Клетки смывали 0,9% раствором хлористого натрия, 0,2М фосфатным буфером средой высушивания, после чего их отмывали 0,2М фосфатным буфером центрифугированием в настольной центрифуге при 400С об/мин в течение 10-15 мнн. Клеточные осадки фиксировали 2,5% раствором глутарового альдегида в течение 30 мин. и затем 1% раствором осмиевой кислоты в течение 1,5 часов. Отмывку от фиксаторов проводили 0,2М фосфатным буфером центрифугированием при 4000 об/мин в течение 10-15 мин. дважды. Клеточные осадки обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации: 30%, 50%, 70% по 30 мин. в каждом. После 70% спирта клеточные осадки заключали в 2% агар Дифко предварительно расплавленный и остуженный до 45-50°С. Нарезанные агаровые кубики с клетками, размерами стороны приблизительно 1 мм, обезвоживали в 96% спирте в течение 30 мин. и дважды в 100% спирте по 30 мин. в каждом. Обезвоживание завершали в двух сменах ацетона по 30 мин. Агаровые кубики пропитывали заливочной смесью из четырехкомпонентной смолы ERL-4206 (Serv a, ФРГ). Данную смесь разводили ацетоном в соотношении 1:1 и заливали агаровые кубики, помещенные в чистые пенициллиновые флаконы, закрывали резиновыми крышками, которые герметизировали. Пропитку проводили в термостате при температуре 50-60°С в течение 14-18 часов. На следующие сутки агаровые кубики высушивали на фильтровальной бумаге и погружали в заливочную смесь смолы ERL-4206. Полимеризацию блоков проводили в термостате при температуре 50-60°С в течение 24-48 часов.

Ультратонкие срезы готовили на ультрамикротоме LKB-4028 (Швеция) и помещали на медные сетки диаметром 3 мм, покрытые пленкой из 0,2% раствора формвара фирмы "Serva" (ФРГ)- Окраску срезов проводили 4% водным раствором уранилацетата и цитратом свинца фирмы "Serva" (ФРГ)- Просмотр препаратов осуществляли в электронном микроскопе JEM 100sx фирмы "JEOL" (Япония).

Вакцинные препараты в ампулах растворяли ! ,8 мл 0,9% рас-БОра хлористого натрия и после полного растворения проводили лмывание от среды высушивания 0,2М фосфатным буфером цент-жфугированием при 4000 об/мин в течение 10-15 мин. Дальней-нее приготовление препаратов для электронномикроскопических ис-ледований не отличалось от вышеописанной схемы.

В качестве лабораторных животных использовали беспородных юрских свинок.

Для статистичеп^пй ^г-збс^н ¿.аннк.г мЯ..» рг^раСтана ко«-

^ютсрная прщраммя "МИШТСТАТ' на основе методики, предложенной И .А. Ойвиным (1960). Программа включает в себя опреде-[ение достоверности различий путем сравнения двух или более рядов [исел, определение достоверности различий при альтернативном Базировании и корреляционный анализ. Результаты статистической »бработки представлены, как в числовой, так и в графической форме.

Результаты исследований и их обсуждение. 1есмотря на достигнутые успехи в конструировании синтетических и юлусинтетических профилактических препаратов в нашей стране до [астоящего времени используется живая чумная вакцина из штамма 5В. Строгое соблюдение отработанных параметров приготовления 1репарата обеспечивает высокое его качество. Однако практика ползала, что вынужденная замена одного или нескольких ингредиен-ов из числа аналогов, или смена оборудования такого же наз-[ачения на более современное и т.д., требует тщательной и довольно уштельной отработки режимов. По мнению В.Ф. Дашенко и И.Г. оворунова (1993) существует проблема экспресс-определения ачества полуфабрикатов и готовой чумной вакцины ЕВ. Учитывая казанное, перед нами стала задача разработать современный, лег-:о воспроизводимый информативный метод определения качества ¡иомассы и лиофилизированной чумной вакцины ЕВ для быстрой >ценки ее биотехнологии. Исследования были начаты с ультраструк-урной характеристики микробов и отработки методики определения говрежденных клеток. Полученные результаты до заморажикания-ысушивания согласовывались с известными данными А.А. Авакяна соавторами (1972), Н.П. Коннова с соавторами (1975) и др. После казанного воздействия часть клеток популяции претерпевала уль-раструктурные изменения. Изучение влияния этапов производства :ивых бактериальных вакцин методом ультратонких срезов позво-яет выявить "мишени" воздействия, но не дает возможности ко-

Заказ № 928

личественно оценить действие каждого фактора в отдельности н; популяцию в целом. Для количественного учета поврежденных кле ток была модифицирована методика, приведенная в книге В.И. Би рюзовой с соавторами (1963), смысл которой заключался в том, чт< клетки с нарушением целостности КС и ЦПМ контрастировали^ значительно хуже из-за частичной или полной утраты цитоплазмы что и служило критерием определения поврежденных микробов Препараты просматривали под электронным микроскопом. П< проценту поврежденных клеток судили о качестве популяции. Эт< дало возможность дать более полную ей оценку в сочетании с куль туральным методом, разделив клетки на три категории: структура неразрушенные, но качественно различные - полноценные, дающи рост на искусственных питательных средах и метаболически дефект ные, не образующие колоний на агаре, а также поврежденные с на личием совокупности вышеописанных изменений. Поскольку по врежденные клетки встречались в микробных взвесях, которые н подвергались каким-либо физическим воздействиям, то с доста точной степенью уверенности можно сказать, что они возникали ] результате аутолитических процессов. Для апробации способа ко личественного определения поврежденных клеток проведено иссле дование 16 коммерческих серий чумной вакцины ЕВ до и после и: лиофилнзации. Показано, что в нативной суспензии при высоко! жизнеспособности микробов отмечен сравнительно низкий процен поврежденных (3,3) (табл. 1 и 2). После замораживания (-50°С) 1 оттаивании (37°С) суспензии резко повысилось число поврежденны; клеток (24,2%), что не наблюдали после лиофилизации (7,5%). Пр1 снижении приблизительно в 2 раза живых клеток количество по врежденных увеличивалось в 2,5 раза.

Факты свидетельствуют о том, что лиофилизация, устраняя этап от таивания, защищает бактерии от его губительного действия. Такш образом, нами отмечена закономерность между снижением впо пуляции живых клсюк и увеличением поврежденных. При этом пр| изошло повышение количества промежуточных форм, у которых от сугствоьали признаки повреждений. В силу резкого сдвига метабс лических процессов эти микробные клетки утратили способность ро ста на питательных средах.

Учитывая полученные результаты в дальнейших исследования разработанный нами тест необходимо было проверить в процесс усовершенствования этапов производства вакцины для подгвержде

Таблица I

Общая и биологическая концентрация 16 коммерческих серий |умной вакцины ЕВ (по данным производственного отдела )

<ол-во Кол-по Концентрация микробных клеток

серий наблюдений общая, млрд/мл биологическая, 'Л

1

ЛО КЫ№ ноше лио-

шивания филизации шивания филизацни

16 576 81±0 75±0 . 55,1+0,5 34,5=1,1

Таблица 2

Повреждаемость микробов в ¡6 коммерческих сериях ¡умной вакцины ЕВ до и после лиофилизацни

Кол-нс серий Количество поврежденных клеток,%

до замораживания -оттаивания после замораживания-оттаивания посте лиофилизацни

16 3.3±0,5 24,211,2 7,5гО,9

шя целесообразности его использования. Наибольшее внимание эыло уделено накоплению биомассы вакцинного штамма ЕВ, поскольку известно, что во многом этот этап определяет физиологическое состояние микробов и при лнофилизации происходит селекция клеток, в результате которой выживают наиболее стойкие.

Большинство исследователей считают, что наивысшей ксеро- и герморезистентностью микробы обладают б стационарной фазе ро-лга. При этом Т.Н. Фунтикова (1977), на основании анализа большого производственного материала пришла к выводу, что при одинаковой длительности выращивания биомассы чумного штамма ЕВ на Ьгаре в АКМ-Ш смывают ее не только в стационарной, но и в конце Логарифмической фазе роста. В связи с этим мы провели серию экс-

периментов по выращиванию биомассы на агаре Хотгингера раз личной питательной ценности (50, 100, 150 мг% аминного азота) I матрацах при длительности культивирования 48, 60 и 72 часа. Пс степени накопления биомассы и ее жизнеспособности полученньи результаты довольно четко укладывались в известные закономерности.

При использовании среды с 50 мг% аминного азота стационарная фаза наступает позже, к 60 часам роста. При увеличение аминного азота до 100 и 150 мг% соответственно популяция через 6С и 48 часов находится уже в фазе гибели клеток. Очевидно, что высокопитательные среды способствуют более быстрому развитию клеточной популяции, но и более быстрому ее старению за счет накопления продуктов метаболизма и истощения среды. Ксерорези-стентность микробов, т.е. способность переносить процесс обезвоживания коррелировала с фазами роста популяции. В логарифмической и фазе гибели клеток они были менее устойчивы к лио-фильному высушиванию, чем в стационарной. Аналогичные данные получены после определения количества поврежденных клеток, которых было меньше в стационарной фазе роста. Параллельно с интенсивной гибелью клеток при замораживании-высушивании происходило увеличение числа поврежденных (рис. 1).

Таким образом, наши опыты подтвердили выводы Т.Н. Фунти-ковой (1977) о том, что при использовании агара Хотгингера с содержанием аминного азота 125+25 мг% популяция может находиться через 48 часов роста на разных фазах развития. Поэтому несмотря на то, что АКМ-Ш коренным образом упростил технологию выращивания биомассы и явился принципиально новым этапом в производстве вакцин, применение его имеет существенный недостаток: отсутствие возможности управлять процессом культивирования микробов.

Устранить этот недостаток, по-видимому, можно внедрением результатов исследований А.Ф. Филиппова с соавторами (1985), предложивших использовать в АКМ-Ш бифазное выращивание (агар -бульон).

Известно, что оптимальной температурой для роста чумного микроба считается 27±1°С. Однако в литературе имеются данные И.М. Алугина (1974) о том, что снижение температуры до 22± 1 °С способствует повышению жизнеспособности биомассы штамма ЕВ. Это представляет большой практический интерес при приготовле-

11,00010,800 10,60010,400-

I

l

10,20010,0009,800 -9,600 -

A

В

/

7" -

- /

£

Ж

60

li

% Jl

час

A - 50 Б - ¡00 В - 150 мг% аминного азота в агаре ■ 1 ■ " - концентрация микробов «■■•- живые

(до лиофилизации)

--- концентрация микробов ----живые

—•— - поврежденные

(после лиофилизации)

Рис. 1. Общая концентрация, выживаемость и повреждаемость никробных клеток до и после высушивания чумной вакцины ЕВ в

зависимости от питательной ценности агара и длительности выращи-зания биомассы

нии чумной вакцины, так как позволяет увеличить выход ко личества человекодоз, используя один и тот же объем биомассы Поэтому в данной серии экспериментов изучали влияние температур культивирования 22±1°С и 27±|°С и длительности выращивания 28 48 и 72 часа на выход микробной массы штамма ЕВ, жизнеспособ ность и повреждаемость клеток до и после лиофилизации. Следуе* отметить, что к 48 часам при вышеуказанных температурах вы растает максимально одинаковое количество биомассы, но числс живых особей было статистически достоверно выше при более низ кой температуре. После сушки оставалась такая же закономерность Изучение количества поврежденных клеток показало, что их былс также существенно меньше при 22± I "С. Увеличение сроков выращн вания штамма ЕВ до 72 часов при 27±1°С приводило к резком} подъему поврежденных клеток, что было связано с разными фазам! развития популяции. При 22±1°С происходило удлинение фаз роста а при 27±1°С они были короче. К 72 часам наблюдали усиленнук гибель микробов (рис. 2).

Такую же закономерность отмечали при использовании разны> питательных сред. Добавление к агару Хотгингера липоевой кисло ты в качестве стимулятора роста обеспечивало более высокий выхо; жизнеспособных клеток, чем без нее, а на агаре СМК получала обратный эффект. Процент живых микробов в сухом препарате быт достоверно выше в первом случае, а поврежденных клеток, примерно, в 5,5 раз во втором.

Наиболее мощным фактором, защищающим клепки от губительного действия лиофилизации являются среды высушивания. Е настоящее время в процессе приготовления чумной вакцины ЕВ используют гшотаминовую среду, которая обладает хорошими про-тективными свойствами. Однако в литературе имеются данные, которые указывают, что добавление к стабилизаторам различных аминокислот и осмопротекторов повышает устойчивость клеток к лиофилизации (Конев C.B., Руденок А.Н., 1973; Чуйко В.А.. 1989; Плешакова Т.В., 1992 и др.). В наших опытах в качестве основы бы; выбран полимер Г1ЭГ-6000 в сочетании с вышеуказанными ингредиентами. Результаты показали, что существует корреляция между отклонениями стандарта при высушивании и образованием поврежденных клеток в препарате. Резкое снижение общей концентрации i 1,7-4,5 раза приводило почти к 100% повреждению микробов. Не зависимо от механизма действия, входящих в стабилизатор соедине

1-8

I 1.200 ! 1.000 -10,80010.600 -10.400 -10,20010,0009.800 -9.600 -9.400 -

*

/

48 60 "2 48 60

А-22г!;С Б - 2"г ГС

* концентрация микробов ™ *=* живые поврежденные

(до лиофилизацин)

- концентрация микробов---живые — ■ --поврежденные

(после лиофилизации')

72 час

Рис. 2. Общая концентрация, выживаемость и повреждаемость клеток вакцинного штамма ЕВ до н после лиофнлнзацни ь зависимости от температуры и длительности выращивания

ний, за исключением СЖТ-основы, практически отсутствовала зе щита клеток от гибели.

Учитывая, что тиомочевиновая среда обладала хорошими за щитными свойствами (отсутствие снижения общей концентрацш высокая жизнеспособность и низкая повреждаемость) целесообразн было включить ее в документацию на выпуск чумной вакцины ЕВ. < этой целью нами в качестве дополнительного критерия были изучен! жизнеспособность и повреждаемость микробов в рекламационны образцах через 6-7 лет хранения. Показано, что по этим показа« лям СЖГТП- н СЖТ-препараты были идентичны. Наши результат! были использованы в обосновании на соответствующее изменение регламент производства чумной вакцины ЕВ.

В последующих экспериментах также было отмечено, что уве личение концентрации (до 300 млрд/мл), объема (свыше 6 мл) мик ровных клеток в контейнере и укупорка их под воздухом приводит, статистически достоверному снижению жизнеспособности и уве личению повреждаемости микробов. Аналогичные результаты был! получены и при хранении регидратированной вакцины в течение ! часов при 21±1°С и 28±1°С.

Анализируя весь цикл проведенных исследований следует отме тить, что четко прослеживалась взаимосвязь между качеством био массы или сухого препарата и количеством поврежденных особей Механизм образования их, по-видимому, различен в процесс! приготовления чумной вакцины ЕВ и сохранения ее в регидрати рованном состоянии. После смыва микробной массы с питательно! среды количество поврежденных клеток невысокое и появление и> вероятнее всего связано с аутолитическими процессами. Этим же об условлено наличие дефектных микробов в ресуспендированном со стоянии. С повышением температуры хранения процент их резке возрастает. В процессе замораживания-высушивания бактерии получают повреждения в результате механического разрушения КС 1: ЦПМ, а в ряде случаев из-за образования гипертонических растворов.

На основании полученных результатов понятно, что наибольший интерес представляет характеристика прививочной дозы, вводимой человеку, то есть соотношение полноценных клеток, дающих рост на питательных средах и "балласта", который представляет со-1 бой неразрушенные бактерии, но с метаболическими дефектами и структурно поврежденные. С этой точки зрения нами были оценены

?чультаты экспериментов. Получена общая закономерность, чем

лше жизнеспособность биомассы и соответственно сухого препара-I, тем меньше "балластных" клеток приходится на 300 млн живых икробов, составляющих одну подкожную человекодозу. При этом гмечено, если вакцина приготовлена в наиболее оптимальных уело-■■1ях (стационарная фаза роста кулыуры, низкая темперагура имра-щъапня, высокое качество питательной среды, сбалансированные шппные среды и т.д.), то прививочная доза содержит не только

riincHiPlihMo ма ими Iidjumn", ш, >. ¡'.'.¿Г.С, ГГ."CÜ^XC!!.*".

теток (рис. 3). Однако при нарушении какого-либо из этапов iex-:нюгического процесса в прививочной дозе, наоборот, резко увешивается число поврежденных микробов. Теоретически они не тасгвуют в формировании иммунитета, что подтверждается литера-/рными данными и нашими исследованиями. Так А.И. Тинкер 971) показал, что в процессе длительного хранения чумной вакци-[д ЕВ при увеличении "балласта" в прививочной дозе в виде биохи-ически активных и клеток с необратимыми изменениями их струк-/ры, иммуно! енность fipenapa'ia снижалась. В пользу юго. что клеь t с повреждениями КС и ЦПМ не участвуют в иммуногенезе свиде-•льстую] данные А.Г. Золотарева с соавторами (1983), которые шгают. что синтез компонентов фракции I осуществляется на ЦПМ. также A.A. Нестеренко с соавторами ( 1987). отметившие элимина-ию в орг анизме морских свинок микробов ниамма ИВ с дефектами ,1JM.

В наших экспериментах было установлено, чем больше повреж-:1шых клеток в вакцинном препарате, тем нише ппр белка в ре-щратпруюшей жидкое т. Сравнительная оценка действия ком ерчсской (контроль) и эк с п е р и м е ига л ы i о й (опыт) вакцин на ор-ишзм лабораторных животных по некоторым энзимогистохи-ическим показателям позволило ус1'ановить, что более высокая ак-iBHocTi» кислой фосфатллы (КФ) была после иммунизации животных сспериментальной вакциной. Ото, очевидно связано с повышенной ;гн!еннон налрузкой на организм лабораторных животных. Пока-пель проницаемости лизосомных мембран (ПЛМ) был также выше зеле иммунизации животных экспериментальной вакциной, что 111 детел ьство вал о о повышении лябилизирующего эффекта в отно-енин лизосомных мембран.

Таким образом, большой комплекс многолетних исследований жазал, что разработанный нами электронномикроскопический

млн мл

1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200

А Б В СЖГТП

- живые 1 1 -поврежденные [ | - промежуточные [|Щ - количество чел,доз А - 240 млн Б - 300 млн В - 360 млн

Рис. 3. Количестгво человекодоз. живых, поврежденных и промежуточных форм клеток в дозе в зависимости от среды высушивания чумной вакцны ЕВ

юсоб определения поврежденных клеток чумного штамма ЕВ и су-ой вакцины можно использовать для экспресс-анализа биотех-ологии процесса приготовления и совершенствования препарата.

ВЫВОДЫ

1. Впервые разработан объективный и информативный элек-ронномикроскопический тест определения поврежденных клеток

РА основанный на регистрации клеток нарушение,.', целостности ■ (}!*/! м л» и I, иг.:: "С.ТН' и*

тсутствием цитоплазматического содержимого. Для количественной ценки поврежденных клеток в популяции учитывается совокупность писанных признаков. Метод может быть использован доя экспресс-нализа этапов биотехнологии чумной вакцины ЕВ. Способ защищен авторским свидетельством N 1598653 от 8 июня 1990 г.

2. Установлено, что одним из наиболее повреждающих факторов влястся процесс оттаивания замороженной суспензии, который бла-одаря особенности высушивания не имеет места при лиофилизации, оскольку удаление подавляющего большинства влахи происходит а счет сублимации. Это значительно нивелирует отрицательное лияние лиофильного высушивания, что подтверждается снижением оврежденных клеток в сухом препарате.

3. Показано, что наиболее высокая устойчивость клеток по ко-нчесгву жизнеспособных и поврежденных к процессу лиофилизации риходится на стационарную фазу роста популяции.

4. Установлено, что максимальное накопление биомассы при емиературах выращивания 22^Г'С и 27+_1"С на агаре Хоппнгсра роисходило к 48 часам культивирования. Процент и фактическое исло живых микробов было выше при 22+ Г'С выращивания клеток, аналогичная закономерность по жизнеспособности сохранилась и осле лиофилизации чумной вакцины ЕВ. Соответственно обнаруже-а более низкая повреждаемость .микробов в процессе заморажива-иявысушивания.

5. Отмечена корреляция в iipr.Mi.ecce замораживания-ысушивания между снижениями общей и биологической концентра-иями микробов в чумной вакцине ЕВ и увеличением поврежденных леток.

6. Анализ изучения количества поврежденных особей в чумной акцине ЕВ подтверждает, что наиболее важным фактором, защищающим клетки при лиофилизации являются среды высушивания.

Количество поврежденных микробов в препаратах, высушенных ! глютаминовом и тиомочевиновом стабилизаторах, было в одинако вых пределах, что явилось существенным дополнительным критериен при внедрении в производство СЖТ-вакцины.

7. Установлено, что повышение концентрации и объема микроб ных клеток в суспензии, а также наличие воздуха в контейнере, при водит к снижению жизнеспособности и увеличению повреждаемосп чумной вакцины ЕВ.

8. Показано, что популяцию чумной вакцины ЕВ можно четкс разделить на полноценные особи, способные давать рост на пита тельных средах, а также метаболически и структурно поврежденные.

9. Гистоэнзимохимическим исследованием установлено, что по вышение активности КФ в исследуемых клеточных элементах регио нарных лимфатических узлов и селезенки зависит от динамики вак цинного процесса и от количества поврежденных клеток в препарате ПЛМ в клетках периферических органов иммуногенеза была болс< значительна при воздействии чумной вакцины ЕВ с повышенным количеством поврежденных клеток.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССПРГАЦИИ

1. Бондаренко А.И., Иванова Г.Ф. Изучение ультраструктурь клеток чумной вакцины при использовании в процессе ее'изгот овления сухих посевных культур и производственных культур первой генерации// Актуальные вопросы эпидемиологии, профилактики н диагностики особо опасных инфекций: Тез. докл. итоговой науч конф. (21-22 декабря 1989). - Ставрополь, 1989. - ч.1. - С.21-23.

2. Бондаренко А.И., Тнпкер Л.И. Разработка олектронномикро-скопического теста определения повреждений чумной вакцины// Гам же.-С. 19-21.

3. Бондаренко Л.И., Типкер Л.И. Разработка элсктроппомикро-скопического тсста количественного определения поврежденных бактериальных клеток/ Ставропольский п.-и. противочумный нп-г. -Ставрополь, 1991.- 16 с. - Леи. ВИНИТИ 07.05.91 N 1870-И91.

4. Бондаренко А.И., Тинкер А.И., Гончарова М.П., Иванова Г.Ф., Будыка Д.А., Булгакова 11.К. Повреждаемость микробо^ чумной вакцины ЕВ в зависимости от условий выращивания биомассы// Тез. докл. материалы межгосударственной науч. коиф "Профилактика н меры борьбы с чумой", посвящ. ЮО-леттпо откры

я возбудителя чумы (6-7 сентября 1994 г.. Алматы). - Алматы, 1994.

:.и.

5. Новиков A.C., Бондаренко А.И. Архитектура пограничных стем клетей и ее значение в эволюции форм жизни/ Ставрополь-ий н.-и. противочумный ин-т. - Ставрополь, 1992. - 30 с. - Деп. ШИТИ 11.11.92 N 3228-В92.

6. Печников Н.Е., Бондаренко А.И., Хорошенький А.Г. ?mÜ4Hbt>wi^ xs^orr.Ta?««»-tичы/сша v глубокому обезвожи-нию в процессе лиофилыюю высушивания." «гтуяикныс uonpcci: идемиологии, профилактики и диагностики особо опасных инфек-й: Тез. Докл. итоговой науч. конф. (21-22 декабря 1989). - Ставро-ль, 1989.-4.2.-С. 19-21.

7. Тинкер А.И., Будыка Д.А., Гончарова М.Н., Печников Н.Е., »ндаренко А.И., Шпилевая Э.Г., Проскурина В.А., Гайдина В.В., »ебенюк A.B., Юндин Е.В., Фунтикова Т.Н., Иванова Г.Ф., Таран В., Борздова И.Ю., Годзевич Л.Г. Влияние возраста культуры на еро- и терморезистентность/ Ставропольский н.-и. противочумный -т. - Ставрополь, 1993. - 27 с. - Деп. ВИНИТИ 07.06.93 N I536-B93.

8. Тинкер А.И., Гончарова М.П., Будыка Д.А., Шпилевая Э.Г'., »ндаренко А.И., Катунина Л .С. Влияние условий выращивания омассы на жизнеспособность чумной вакцины ЕВ// Тез. докл. ма-риалы межгосударственной науч. конф. "Профилактика и меры рьбы с чумой", посвящ. 100-летию открытия возбудителя чумы (6-7 тгября 1994 г., Алматы). - Алматы, 1994. - С. 137.

9. Тинкер А.И., Иванова Г.Ф., Бондаренко А.И., Саркисьян А., Будыка Д.А., Шпилевая Э.Г. Влияние состава среды высуиш-ния на жизнеспособность чумной вакцины ЕВ при длительном анении//Там же. - С. 137-138.