Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изменение биологических свойств чумного микроба при пассировании в макрофагах экспериментальных животных

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Изменение биологических свойств чумного микроба при пассировании в макрофагах экспериментальных животных"

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ САШПАРНО-ЭЩдаШСШОГИ'ЕСКОГО НАДЗОРА .РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Российский научно-исследовательский противочумный институт "Ынкроб"

Не прапах рукописи

ДОРОШЕНКО ЕЛЕНА ПЕТРОВНА

ИЗМЕНЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЛЗТЧ ЧУМНОГО МИКРОБА ш 'ПАСгИРОВДНЩ В МАКРОЭАГАХ гШЕРШНТАЛЬШИ

янвояшх

03.00.07 - микробиология

Автореферат нч соискание ученой етепзни .ланцидвтч медицинских наук

Сарятов - 1994

Работе выполнена в Ростовском-нр-Дону ордена Трудового

Красного знамени научно-исследовательском противочумном институте. '

Научные руководители:

Доктор медицинских наук« ст. н. с. Г.И.Васильева

До«-гор медицинских наук, профессор Х.П.Гакяешко

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профэсйор Л.Н.Ыакаровская

Доктор медиттских наук, профессор • К.Й-Нохин

Ведущая организация: Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт

Защита состоится " /б* М \ 1994 г. на аасвда-нии спепивлиаированного Совета 0745201 по защите диссертация на соискание ученой степени доктора наук при Российском научно-исследовательском противочумном институте "Микроб" (410071, « г.Саратов, Университетская ул., 46).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке института "Микроб".

Автореферат разослан " -У" _ 1994 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета доктор биологических наук, профессор

Г.А.Корнеев

- з -

ОБЩАЯ ХАРМТЕРИСТШСА РАБОТЫ

Актуальность проблещ?. Основными требованиями, предъявляемыми к штаммам чумного микроба в эксперименте, является их им-муногенность и вирулентность, которые ослабляются в процессе хранения в музее и при пересевах на питательных средах (A.J5,Филиппов, 1964; Е.И.Короб нова с соавт.,1964; М.М.®айбич,1968; З.А. Чернова с соапт.,2959; А.И.Тинкор,1971). Аналогичные пронесен присущи и атаммам возбудителей туберкулеза, туляремии, бруцеллеза, сибирской язвы и др. инфекций (Э.М.Жданов,1956; Р.А.Сал-тцкоэ,19б6).

Одним-из ширдкораспросгряненнюс способов, позволяющих сохранить и усилить иммуногешюсть я вирулентность микробов, является пассирование их через'организм экспериментальных кивот-пых'(М.М.Зайбич,1946; Л.В.Самойлова, Л.П.Павлова,1965; А.В.Че-т<омасова,1973). Однако этот метод требует много времени, большого количества животных и но дает полной гарантии получения аелаемых результатов.

•В связи с этии проблема реабилитации биологических свойств ваншшых и вирулентных штаммов чумного микроба продолжает оставаться актуальной.

Известно, что персистеншя внутриклеточных паразитов в клетках макроорганизма мояет приводить к изменению их биологических сюйств(В.М.Бондаренко,19б8; В.Л.Цушяарева, В.Ю.Литвин, 1991). Зто относится и к чумному микробу. Так, по данным Bujfrov/a, Bacon (1956), Cavanaugh, Handall (1959), клетки чумного микроба, первоначально чувствительные к перевариваюцей активности нейтрофилов, попадая в макрофаги, размножаются в них и приобретают устойчивость к последующему фагоцитозу лейкоцитами. Учитывая наши данные о корреляции антифагоиитарной активности у вакцинных штаммов чумного микроба с иммуногенно-стыз, а у вирулентных с уровнем ЛДзд (Г.И.Васильева.с соавт., 1984,1937), а также роль макрофагов в противочумном иммунитете, кок основных клеток, где происходят главные события, определяющие исход взаимодействия чумного микроба с макроорганизмом (Е.И.Коробкова,19бО; И.Юсупов с соавт.,1982; Г.И.Васильев*, . 1990 ; 3uter, 1956; Cavanaugh, aandall, 1959; iiowley, ¡966; Meven, 1985), уместно предположить, что паосиропаниа чумного

- 4 - ,

микроба через макрофаги при содат к усилению имцуногенности вакцинных и вирулентности - вирулентных штаммов,

Цель работа. Изучить влияние размножения чумного микроба в макрофагах на его биологические свойства для раскрытия отдельных механизмов формирования инфекционного и вакцинального процессов и разработки ускоренных методов повдаения иммуноген-ности вакцинных и вирулентности вирулентных, штаммов чумного иикроба с использованием культуры перитонеальных макрофагов ib vxtro.

Задачи исследования:

1.Изучить влияние пассирования субкультур вакцинного штамма чумного микроба в перитонеальных макрофагах морских свинок ' и мшей in vitro на его биологические свойства.

2. Исследовать биологические свойства субкультур вакцинного игамма чумного микроба до и после пассирования через организм морских свинок и ишей in vivo.

3. Выяснить возможные механизмы изменения биологических свойств вакцинного иташа!чумного микроба цри пассировании его через макрофаги in vitro. ,

4. Провести сравнительный анализ активации макрофагов, , индушрованной исходной ? и пассированной субкультурами вакцинного штамма чумного микроба.

. 5. Разработать ускоренный метод гавадения имцуногенности вакцинного штамма чумного микроба с использованием культуры макрофагов in vitro. ... v...^.: "*•'.'.

6. Изучить биологические свойства субкультур вирулентных штаммов чумного микроба до и после-пассирования через перито-неальныо макрофаги in vitro. \

7. Разг гботать способ восстановления вирулентности субкультур вирулентных штаммов ч/много микроба с использованием культуры макрофагов in vitro. 'v;-—-

Научная новизна и теоретическая значимость работы:

Установлено значение•аерсистенши чумного микроба внутри макрофагов в пато- и Чэдмуногенезе чумы.-

Показано, ото субкультуры вакшнного штата чумного микроба, сниаиязие свою вирулентность в процессе хранения, вос-станявлияяпг ве после пассиронация,через иультуру перитоне-вльных макрофагов.-Дс vitro.

Показано, что повшение иыыуноренности- субкультур вакцинного штамма чумного шкроба в процессе пассирования через пе-ритонеальные макрофаги коррелирует с усилением их знгифагоии-тарных свойств, "латентной" и "остаточной" вирулентности.

Расшифрован один из механизмов изменения биологических свойств вакцинного штамма чумного микроба при длительном пассировании в перитонеальных макрофагах, заключающийся в изменении спектра и уровня синтеза ентигеноц.

Впервые выявлено, что субкультуры вакцинного штамма чумного микроба, пассированные через перцтонеальные макрофаги морских свинок, более интенсивно, по сравнению с исходными, усиливают киллернуп активность макрофагов.

Установлено, что размножение вирулентных щтаммов чумного микроба в макрофагах повышает их ькрутентность, устойчивость к фагоцитозу и одтопатический эффект»

Обоснована целесообразность использования нультуры макрофагов in vitro длят решения вопросов пато- и иммуногенеза чумы.

Практическая ценность работу заключается в разработке способов повшения иммукогекности вакцинного штамма и усиления вирулентности вирулентных штаммов чумного микроба, а также культуральных моделей для характеристики биологических свойств чумного микроба. Разработанные модели и методы внедрены в практику научной и производственной работы Ростовского -на-Дону, Ставропольского, Иркутского и Казахского противочумных институтов.

Результаты исследований, представленные в диссертации, использованы при составлении 3-х методических рекомендаций: "Методические рекомендации то определению вирулентности чумного микроба ускоренным методом по индексу завершенности фагоцитоза", "Методические рекомендации по получению и характеристике высокоиммуногенноЯ субкультуры чумного микроба ЕВ", "Методические рекомендации по повышению имцуногенности вакцинных штаммов чу»-ного микроба ускоренным методом".

Положения, выносимые на защиту:

I. Персистенция шумного микроба в перитонеальных макрофагах имеет существенное значение в формировании вакцинного и инфекционного процессов.

- б -

2. Пассирование вакцинного штамма чумного шкроба через перитонеальные макрофаги морских свинок нетояоко изменяет биологические свойства пассируемых бактерий, но и они, в свою очередь, более интенсивно, по сравнению с исходными; воздействуют на макрофаги, вызывая активацию последних, завершающуюся усилением киллерной активности в отношении чумного микроба.

3. Пассирование субкультур вагшишого штамма умного мий-роба в перятонеальных манрофагех морских свинок приводит к изменению его антигенной характеристики, ото является одам из механизмов модуляции биологических свойств чумного микроба.

4. Характер изменения биологических свойств субкультур вакцинного штамма чумного шкроба при пассировании через перитонеальные макрофаги зависит of вида экспериментальных яи-вогнь«, о!1' «старше получена эти «летки.

5. Способ погашения Мцуногешюстн вакцинного штамма чумного микроба и метод восстановления вирулентно сей вирулентных [йашов, снизивших ее в процессе хранения.

Апробашя работы:

Материалы, изложенные в диссертации, обсуждались на:

- I Всесоюзном съезде иммунологов (Сочи,1989);

-2 Международном симпозиуме "Реабилитация иммунной система" (ЦхаятубоД990);

- Международном симпозиуме по аллергологии и клинической иммунологии (Алма-Ата Л992); ..

-У1 Республиканской конференции "Факторы гуморального и клеточного иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях" (Челябинск, 1992)*,

- Всесоюзной конференции "Актуальные вопросы эпидемиологии, профилактики и диагностики особо опасных инфекций" (Став-' рополь.1989); . • .

Публикации; Осношае материалы диссертации опубликованы в 23 научны« работах, в том числе 9 - в центральной.печати.

Об-ъем и структура работ»: Текст работы изложен на 143-х страницах машинописи л Состоит из бведения, обзора литературы, описания материалов й ме¥одое« 3-х глав собственных исследований, заключения, вынодоб и списка литературы. Работа иллюстрирована 12-ю таблицами, 21 рисунком.Библиографический указатель содержи* 133 источников отечественной и 117 - зарубежно? лнтгрптури.

- 7 -СОДШДНИЕ РАБОТЫ ' Материалы и методы. Работа выполнена на 250 беспородных шрских свинках массой 2Г>0-300 р и Ï430 беспородных мылах массой 16-18 г. В работе использовали вакцинный штамп Yersinia pastis ЗУ-76 линии ЩГОЭГ и 5 вирулентных ираммов ï.postijg 363(1/1479); J339Ü204); 92ИР-Ю2); 923ÍP-I34); 231-708(3), полученных из муз«я живых культур Ростовекого-на-Дону противо-чумюго института,

Перитонеальные макрофаги получали от ютдатних я имцуни-зированных животних методом Ы.Р.Кроткоео^ ÍI97Í5. В работе использовали методы;

- пассирования итанмов чумного микроба <терез «рвадирм экспериментальных животных (А.В.Чекомасо з,1973);

- пассирования итаымов чумного шкроба через дарито^еальные макрофаги экспериментальных животных (ГД1,Вэедл.ьевэ, 1938) ;

- спредаления иимуногенности вакцинного штамма чумного микроба (Иетодическив указания "Основы критерия отбора ¡¡ташилс итамиов чумного микроба",Саратов,1976);

- изучения "латентной** вирулентности вакцинного штамма «умного микроба (Н.Г.Пономарев, С.К.Гиззатудлина,1967);

- исследования "остаточной" вирулентности вакпиннопо штамма ЕВ-76 <Е.И.Коробгеова,1964);

- оценки антифагоцитарных и цитопатических свойств штатов чумного шкроба (Г.И.Васильева, 1983);

-. определения вирулентности (ДЦзд) У вирулентных штаммов чумного микроба (И.ПЛшмарин, А.А.Воробьев,19б2).

Для.изучения антигенного состава у субкультур вакцинного штамма чумного микроба определяли антигенный спектр с вомощьо реакции преципитации в геле (Ouchtèrloni ,1958), а также методом перекрестного иммуноэлектрофореэа ( Lawrell ,1966).. Антиген в лиаптах субкультур вакцинного штамма ЕВ-76 .определяли в реакции пассивной гемагглютиняции (Ю.Г.Сучков,i960). Токсичность в Л'лзатэх вшеназванних субкультур выявляли методом титрования на минах и определения Д^ (И.Д.АшиарннД.А. Воробьев,1962). Белок в лизатах, получанных из «валвдчного штамма чумного шкроба, определяли да методу К^с.-.шаа ¿1973).

Действие субкультур вакцинного иг&юш ЕВ-76 на функциональную активность макрофагов оценивали по ях влиянию на тк~

- 8 - '

рофагальную трансформацию мононуклеаров (Т.Л.Демченко с соавт.. 1982), киллерную активность макрофагов (Г.й.Васильева, 1992), конъюгашю лизосом с фагосомаш (КЬаук1п оЬ а1., 1977), изменение индекса перераспределения субпопуляшГ? (Г.И.Васильева, 1990), киплородзависимую метаболическую активность (Л.Е.Асеева с соавт.,1987).

Статистический анализ результатов исследований осуществ-. ляли преимущественно с помощью таблиц для экспресс-обработки экспериментального и клинического материала (Р.Б.С.'релков,. 1980): определяли значения доверительных интервалов (1) для среднего арифметического (М) для уровня достоверности (Р) 99%. Для статистической обработки значений 1шОс0 и ЛД^д определи- • ли и1п птах величины этих показателей (И.П.Акшэрин* -Л. А. Воробье и Л 962) . Корреляционный анализ проводили с помощь» коэффициента Корреляции рангов Спирмена (Е.В.Гублер, А.А.Генкин, 1973).

■ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСЗДЕНИЕ В ходе работы было показано, что длительное пребывание субкультур вакцинного штамма чужого микроба В макрофагах экспериментальных: животных приводит к усилению его биологических свойств, особенно при использовании макрофагов морских свинок. Так, иммуногенность субкультуры гатамма ЕВ-76, пассированной через макрофаги морских свинок, Повышалась До сравнению с исходной, в 80 раз, в то £е время у Пассированной через макрофаги мшей - только в б раз. Полученные данные позволяют еде-. лать заключение( Что йспользосанив для этих целей морских свинок целесообразнее. Следует отметить,'что достоверное по-Еъпенле иы>^шогейности субкультур ватшно го штамма ЕВ-76 при пассировании через макрофаги морских свинок наблюдалось уде . после 5 пассажа. '

При изучении "латентной" вирулентности исходной и пассированных через перитонеальные макрофага различных видов животных субкультур вакнинйого штамма отмечена та яе закономерность: пассирование через макрофаги морских свинок повышает "лятенгнуж* вирулентность в 33 раза, тогда как пассирование . через макрофаги мшей - Только в 5 рчз. .

Аналогичные данные Получены пр» изучении достаточной" гирудентносгн - длительное пребывание вакцинного штамма ЕВ в

_ д _

макрофагах экспериментальных животных повстает их "остаточную" вирулентность, что наиболее выражено при пассажах на макрофагах морских сшшок. Суб;су !ьтуры, пассированные через макрофаги морских свинок, выделялись из места введения, лимфоузлов, печени и селезенки в течение 15 суток, а через макрофаги мышей из ыеета введения, лимфоузлов - п течение 10 суток после подкожного введения.

Наряду с повышением инмуногенности, "остаточной" и "латентной" вирулентности пра пассировании отмечается нарастание антифагоиитарных и читопагических свойств, причем при пассировании через перитонеальше макрофаги морских свинок устойчивость к киллерной активности макрофагов усиливается и нарастает значительно интенсивнее (индек.. завершенности фагоцитоза (113$) изменяется от 0 до -2,6-0,08), чем. при пассажах через макрофаги-мышей (снижение ИЗ® от 0 до -0,9^0,04). 'Та же заксломерность наблюдается и при изучении цитопатического э<ф-фекта (процент поврежденных макрофагов (ГШ) повдаается от Т0£*2,3 до 597-4,0 и от 10^2,3 до 30^-3,7 соответственно)

вотных на его устойчивость к фагоцитозу (I) и цитопа-тический эффект (П).

По оси ординат: ИЗФ (I) и ГШ (П); по оси абсцисс -количество пассажей субкультур вакцинного штамма ЕВ. Условные обозначения: сплошная и пунктирная линии -И34 и ЛЩ субкультур, пассированных через макрофаги морских свинок и мшей со гвотстврлшо.

; - 10 - . ...■-. ■ ; \ Слэдует отметить, что существенно различаясь между собой по устойчивости к киллерной активности макрофагов, исходная и • пассированные субкультуры одинаково легко поглощаются макрофагами. Это, по-видимому, связанос'тем, что антифагоцитарныо свойства чумного микроба определяются его способность» подавлять бактерицидные системы макрофагов, опосредующие завершен-^ ' ность фагоцитоза. ■ ' ' '. '

При анализе изменений И35 пассируемых субкультур в эави- ; сим^сти от кратности пассажей установлена строгая положительная корреляция отих изменений с 1§ 1п0-о в эти же сроки (рис.2).

Рис,2. Зависимость между 1б 11 субкультур вакпинно- "

го штамма чумного микроба ЕВ-76*

По оси ординат справа - 1й ^ , слева - ИЭ5; по осп , абсцисс - количество паспжей.

Учитывая,, что определение И35 занимает 6 часов, а 51 день, целесообразно использовать ИЗЗ как критерий достаточности пассирования штамма ЕВ-76 через макрофаги окспери-ментальных животных, т.к. для разных субкультур может понадобиться различное количество пассеиеЯ для восстановления дачртлогенности.им^ногенные штаммч обычно имеют < -0,6.

- II -

Таким образом, пассирование вакцинного штамма чумного микроба в макрофагах морских свинок восстанавливает его биологические свойства, изменившееся в процессе хранения или длительных пересевов. Пассированные субкультуры обладают высокой "остаточной" к "латентной" вирулентностью, цитопатичесгаш действием и достаточно устойчивы к кнллерной активности макрофагов, что дает возможность„чумному микробу приживляться и размножаться в организме - необходимое условие для формирования напряженного противочумного иммунитета. Иммуногенность пассиро-' ванных субкультур в 'десятки раз вше, чем у исходных.

Механизмы' изменения биологических свойств вакцинного штамма чумного микроба при его персистеиши в макрофагах.в настоящее время не известны. Можно- предполода :ь, что внутримакрофа-гальная локализация способствует усиленному синтезу антигенов чумного микроба, в Фом числе протективньпе. О возможности' такого с'-нтеза свидетельствуют дашше литературы (С.О.Водопьянов, БЛ1.Мишанькин,1990; straloy, Нагиоп, К!84». Pollack еt al., IQ86)., '.•'.';■■.

Исследования, провбденные нами в этом направлении, показали, что пассирование вакцинного штамма чумного микроба через макрофаги морских свинок увеличивает количество антигена §1, определяемое реакцией пассивной гема-гглкугинации, ;на 2 порядка в лизатах субкультур, выращенных при 27°С. Кроме того, * методом двойной диффузионной преципитации в геле с чумной агглютинирующей сывороткой обнаружены дополнительные линии преципитации у субкультур, пассированных через макрофаги морских свинок, выращенных при 28°С. Следует отметить, что аналогичное сравнительное исследование антигенного спектра исходной . и пассированных через перитонеальные макрофаги мдаей субкультур не выявило различий мезду ними. Полученные данные послу-аили основанием для более детального исследования антигенного. . состава субкультур вакцинного штамма ЕВ-75, пассированных через макрофаги морских свинок, методом перекрестносо иммуно-электрофореэа. Проведенные'исследования выявили количественные различия между исходной и пассированной субкультурами, выращенными при 37°С, по б-и антигенам: у 5-и - увеличение площади пиков, иэ 32 пиков идентичных антигенов, у одного - yve-. ньшение. У тех. тсе субкультур, выращенных при 28°С и такхо об-

рязованаих 32 пика идентичных антигенов, кроме количественных изменений у 17-и антигенов, отмечались1.и качественные - появление 5 новых антигенов у пассированной субкультуры, и в то se время исчезновение одного антигена, присутствующего в исходной.

Полученные нами данные подтверждают высказанное другими авторами предположение об усиленном синтезе антигенов чумного микроба при персистенцаи его в макрофагах. Вероятно усиленный садпаз, а тагае перестройка антигенной структуры вакцинного штамма чумного микроба обеспечивают высокую ишуногенность пассированных субкультур. Учитывая наши данные об увеличении количества антигена fil у пассированных субкультур, выраженных при 37 С, по сравнения с исходным, можно предположить, что наряду с другими антигенами, он также ответственен за усиление биологических свойств вакпинного штамма ЕВ-76 при его пер-сисгенпии внутри макрофагов морских свинок.

Проведенные нами исследования установили такне, что пассирование чумного микроба внутри перитонеальных макрофагов морских свинок влияет не только на сами бактерии, но и макрофаги , под их действием приобретает повышенную функциональную. активность. Сравнительная оценка влияния исходной и пассированной субкультур вакцинного штамма ЕВ-76 на макрофагальну» трансформацию моноиито» периферической крови морских свинок показала более существенное изменение этого процесса под действием пассированной субкультуры, особенно на 14-е сутки hoc-ле вакшнапии (44,0-13,2 и 72,1^6,8 соответственНоХтабл.).

Таблица

Сравнительный анализ влияния исходной и пассированной субкультур вакцинного штамма чумного микроба на макрофагальную трансформацию мононуклеаров морских свинок

Субкультуры:Показатель макросагальной трансформации моноцитов

v г^ои о :С у т к и после иммунизации_;

ï.peatls К7;койтроль : 1 : V : 14 : '¿I -

Исходная ÎI,2±2,1 34,Б±6,4 23,6±5,8 44.0*13,2 42,0*12,6 Пассиро- 52,0-4,5 49,7*3,9 72,1*0,8 68,4*6,3 •

донная____■' ' . ■ ■ ' . ' ' ' •

Можно цредполояить, что одним из факторов, обеспечиваю-

щнх болеа высокую ишуиогекиоегь пассирован'-ой субкультуры, является более гираяениая у нее способность ускорять естественной процесс трансформации моноцитов периферической кропи в макрофаги. •

При изучении субпоцуляшонного состава макрофагов, полу-чекнгге при разделении их в градиенте температур, было отмече-по более значительное изменение их композиции после иммунлгд-эди пассированной субкультурой по сравнения с исходной; индекс перераспределения субшпуляшй - 28,0-0и 18,0±1.2 соответственно. Полученные данныэ свидетельствуют, что возмогшим фактором» обусловливающим высокую икнуногенность пассировашгой "Субкультуры, является ее выраженная способность вызывать перз-"распределение субпопулятай.

Сравнительный анализ тгеспородеависимых метаболических процессов в макрофагах морских свинок, ики^унизировэшшх исходной и пассированной субкультурами, при гзаимодействии их с вакцинным штаммом чумного микроба in vitro методой лвданол-оносредовашой хемилшянеспенши (ХЛ) (рис.3) выявил, что под • 600,

500- 1* f ь / / / / / ✓ / У

400 300200 100' - rf- ч V / / t * А / / / / / -

I г! Ш •

Рис. 3.Уровень лпминол-зпвиеимойчХЛ интактных макрофагов (I) и макрофагов морских свинок, имцунизированных исходной (П) и пассированной (Ш) субкультурами вакцинного штамма фмного микроба. ' ■

По оси ординат - уровень ХЛ,Я; иезаптрихованнкв и заштрихованные столбики - ХЙ ответ на введение латекса ди и после контакта с чумным микробом соотгетственно. Уровень ХЛ кктттмчх клеток принимался за ТОО?,

• - 14 -

влиянием нассированноГ* субкультуры наблюдается более сильная , активация макрофагов,, обусловливающая их более высокую устойчивость к су пресс ор«;лу действию чушого микроба на аиергетй-ческиз процесса в этих клетках, чем при введении животным исходной субкультуры.

Сравнительное изучение частоты слияния лизосом с фагосо-маш "при зндопитозе чушого микроба" с макрофагами, получении-' • мн от морских свинок, иммунизированных исходной и пассированной субкультурами,показало, что иммунизация пассированной субкультурой интенсивнее стимулирует слияние лизосом с фаго-сонами, чем премирование экспериментальных животных и сходно;? , субкультурой (92-2,8 и 68-4,2 соответственно).

Из: четно, что завериадщим этапом активации ■ макрофагов является усиление их киллерной активности. Нами выявлено, что введение морским свинкам пассированной субкультуры повышает индекс активации к«ллерной способности макрофагов более существенно, чем примирование их исходной субкультурой, (рис.4).

Рис.4. Киллерная активность макрофагов морских свинок, имму-. .. визированных исходной и пассированной субкультурами.,. вакцинного штамма чумного микроба. По оси ординат - индекс активации макрофагов; по оси • абсцисс - сутки после иммунизации; сплошная и пунктирная линии - макрофаги,животных; иммунизированных пас- , сйромнно^ и исходной субкультурами соответственно.

Таким образом, пассирование вакцинного штамма ЕВ-76 через макрофаги морских свинок не только изменяет биологические свойства пассируемых микробов, но и они, в ело» очередь, более интенсивно, по сравнению с исходними, воздействуют на макрофаги, вызывая значительную аптивашп последних, завершзтацу-' юся усилен!!ем киллерной активности в отношении чумного микпо-ба, которая является определяющим (фактором резистентности организма к «умз• ' , '

При учете выпесказанного становится понятным значение, порсястенши вакцинного штамма чумного микроба п макрофагах для реализации вакишшого процесса.

Полученные даннче представляют но только теоретический, "Йо и практический интерес, т.п. позволяют рекомендовать пассирование субкультур вакцинного штамма ЕВ-76 через макрофаги морских свинок для восстановления иммуногегеюстн, сниженной в процесса хранения.

Проведенные наш исследования показали преимущество такого метода перед общепринятым способом пассирования на экспериментальных животных. Сравнительный анализ влияния разных способов пассирования показал, что в обоих случаях и^еет мпс-то усиление иммуногенности, устойчивости к фагоцитозу, "оста -точно?" и "латентной" вирулентности. Однако наиболее ог :етди-по и в более ранние сроки эти изменения наступают при пассировании тарез макрофаги, чем при пассажах через организм экспериментальных животных.'Пассирование через макрофаги позволяет достигнуть делаемых результатов в 20 раз быстрее, --ген при пассеровании in vivo. Кроме того, предлагаемый нам! сго-. cqí5 более прост, стандартен, экономичен,т.к. позволяет пассировать на макрофагах одного яивотш>го одновременно несколько субкультур.

Культивирование 4-х вирулентных штаиков яу*.тогЬ микроба •S2KP-I02); 923(Р-134); 363(1/1479) и 1339(1204) в перитонс-альных мякрофагах морских евино» внявило изменение их бяодо-гичес? свойств. Внутриклеточное разгаояенне чугаого микроба повшлет их.антифягоштаркыз свойства - ÍD2 приобретяет более низкие, величины и повыдается ЯШ. Тэк, знпадния 5Ш, имзишие место' у разных исходных субкультур от -0,24-0,07 до

- 16 -

-0,60*0,06, после 2-Зх пассажей снизились от -1,75*0,03 до .' -2,60-0,03, а ЯШ повысился от 20^3,3 - 34&*2,9 до 48^3,9 : 87^2,9 соответственно.

Наибольший интерес представляет усиление вирулентности •цуиного шкробв.при разкюз'.ении в макрофагах субкультур вирулентных штаммов. Наиболее демонстративен этот аффект усуб- . культур, существенно снизивших свою вирулентность. Так, субкультура штамма 1339(1204) с ДЦ^ 1800 к.к. (1050-3900 м.к.), через 3 пассажа повысила свою вирулентность более, чем в 24 раза, а через 5 пассажей - в 100 раз. Статистически достоверное повышение вирулентности отмечалось и у субкультур штамма 923СР-Ш), 92КР-Ю2) и 363(1/1479) с 43,5 ; 263,9; и • 82,0 м.к. соответственно (Дй^д снижалось соответственно до 6,0; 45,9 И 20,8 ы.к.).

Результаты наших исследований подтверждают мнение ряда авторов о том, что для фенотишчеекого выражения признака вирулентности необходимы специальные условия, которые; отсутству-вт при культивировании бактерий чуш на искусствеш1ых питательных средах (П.И.Анлсимов с соавт.,1976), Вероятнее всего, разынокение субкультур вирулентных штаммов чуиного микроба в макрофагах приводит к усиленному синтезу антигенов, детерминирующих их вирулентность (С.0.Водопьянов, Б.Н.Мишаиькйн,1990; Бкга1ау, Ыагшоп, 1984; РдИаок ей а1., 1986).

Полученные данные показывают роль размножения вирулентных штаммов чушого микроба внутри макрофагов для реализации инфекционного пропесса. Персистенвдя чушого микроба внутри »5их »леток повшаец его вирулентность и штопатический' эффект, в результате чего разрушается большое колдчество ыакрофагов л развивается иммунодефицит с преимущественным поражением системы мононуклеарных фагоцитов, приводящий к нарушению коопера-шш имцунокомпетентных клеток и отсутствию иммунного ответа. Это, в опою очередь, обеспечивает беспрепятственное размножение и распространение чумного микроба з организме чувствительных к чуме кивотных.

Анализ представленных данных позволяет сделать вывод о существенной роли взаимодействия чушого микроба с макр' ";ага-•т ь реализации вакцинального и инфекционного процессов, а * такае рвкоиендовчть метод пассирования через пери энеальные

макрофаги морских свинок для ускоренного лсьгиеиил ¡рщпюген-ности Лакшиных и восстановления вирулентности вирулентных штаммов чумного микроба. Полученные нами данные открывают новый подход для поиска протективных антигенов чумного микроба и детерминант его вирулентности. \ ' ..

ВЫВОДЫ.' ' ' .

1, Пассирование субкультур вакцинного штамма чушого .ги-кроба ЕВ-75 через перитонеэльныв макрофаги экспериментальных животных приводит к усилении их иицуногенности, устойчивости к фагоцитозу, питопатичестого эффекта, "остаточной" и "латентной" вирулентности. Наиболее отчетливо и в более ранние сроют эти изменения наблюдаются при тассзяах через макрофаги терских спинок.

2, Лерсистенгшл субкультур вакцинного штамма чуй юга микроба внутри перитонеалышх макрофагов морских свинок сопровождается изменением те антигенного спектра.

3, Субкультуры вакшнного штямма Е&-76, пассированные через перитонеэчьныэ макрофаги морских свинок, более интенсивно, по сравнению с исходники, повышая? функциональную активность макрофагов.

' 4. Метод пассирования субкультур вакцинного птаммз кВ~7б через трлтоталътз макрофаги с пяль» потапения нммуногеп-ности имеет судественные преимущества перед способом пассирования через организм экспериментальных животных, т.к. экономичен, прост,и позполяе^достигнуть аелаецого эффекта зна-чителыго- быстрее..

5.'Индекс завершённости фзгоштозп является удобный и цодежннм критерием достаточности пассирования субкультур вакцинного штамма чумного микроба через лериТонеальные макрофаги морских свинок с цёлмг повышения его иымуиогенности.'

6. Пассироешшэ субкультур' вирулентных штаммоЬ чумного микроба в перитонзияьта макрофагах морских свинок приводит к снижению их ЗЩкф и повышению их антифогооттарного а што-пати«5ского дейст&ия.

7. Простым и эффективным способом восстановления вирулентности у субкультур вирулентных штаммов чумного микроба яиляетсч пассирование их через макрофаги морских свинок.

-16 -

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ Ш ТЕИЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Цустовалов В.Л.,Васильева Г .И. »Киселева А.К.,Дорошенко Е.П. Сравнительное изучение иммуногенности и "латентной" вирулентности субкультур вакцинного штамма чушого микроба// Актуал. вопр.ишунол. .аллергол.и дал.биол.:Тез.докл.»Краснодар,1983.-С.56-57. . ;

2. Васильева Г.И. «Дорошенко Е.П. .Киселева А.К. .Пустое? • лов В.Л.Сравнительная характеристика функциональной активности альвеолярных и перитонеальных макрофагов морских свинок// Нурн.микробиол.-1983.-1933.-Н2.-С. 85-85.

3. Цустовалов В.Л..Васильева Г.И..Киселева А.К..Дорошенко Е.П.гченка иммуногенности вакцинного штамма чушого микроба по индексу завершенности фагоцитоза/Дол.биол..генетика и имцунол.йозб.ООИ.:Тез.докл.-Ростов-на-Дону,1984.-С.143-144.

4. Пустовалов В.Л.»Васильева Г.И. «Киселева А.К. .Дорошенко Е.П.Индекс завершенности фагоцитоза как критерий опенки иммуногенности вакцинных штаммов чудаого шкроба//Генетика л ыикробиол.природаоочь.овых инф.-Саратов,1984.-С.44-48.

5. Васильева Г.И. .Дорошенко Е.П. .Киселева А.К. К вопросу о роли макрофагов в механизме противочумного иммунитета// . Теоретические пробл.эпидеыиол.и инф.ишунол.на современном етапе.:Тез.докл.конф.-НйЛьчик,1986.-СЛ13. •

6. Пустовало» В.Л. .Васильева Г.И,.Киселева А.К.Лорошен-ко Е.П. «Таранова В.Н..Ефанова Е.А. .Беспалова И.А- Антигенный состав и антифагоштарные свойства чумного и псевдотуберкулезного микробов/Л!ол.биол.и микробиол.природноочаговых инф. -Саратов.1986.-С.50-56.

7. Васильева Г.И.,Пуотовалов »Кисёлева А.К..Дорошенко Е.П. .Таранова В.Н. Сценка вирулентности штаммов чумного микроба по индексу завершенности фаговдтоза/ЛКурн.микробиол. -1937.-1«.-СЛ17-П8.

8. Васильева Г .И.,Киселева А.К.,Дорошенко. Е.П. .Способ повышения иммуногенности вакцинных штаммов чумного микроба, -А.о.1249939 СССР.-Р3784484/28-14; заявлено 25.08.84. Опубл. 15.03.87.//Открытия.Иеобретеиия.-1987.-»10,-С.294.

9. Васильева Г.И.,Дорооенко Е,П..Киселева А.К.Изм.нение "латентной" вирулентности вакцинного штамма чумного микроба

при длительном размножении внутри макрофя го n//Fypn. мшсробио л. -1988.-Г-9.-С.63-66.

10. Васильева Г.И.¿Доропенко Е,П. .Киселева А.К.Изменение биологических свойств чумного микроба'при длительном внутриклеточном размножении/ТМикробиол. журн. -1988. -Т. 50,!?2.-С.30-33.

11. Васильева Г.И. «Гамлешко ЗС.П, .Киселева А.К. .Дорошенко Е.П. ¿Ткаченпо Л.Н.Роль отдельное популяшШ макрофагов в формировании противочумного ишунитега//ГНЗсесоюзннй съезд имму-нологов.:Тез.докл.-И.,1989.-С.25.

12. Васильева Г.И..Дорошенко Е.П..Киселева А.К. Измене- • ние антифагоцитарних свойств чумного микроба при культивиро-

' вации в макрофагах//Ак?уал вопр.эпидемиол,профилактики и диагностики 00К. :Тез.докл.-Ставрополь,1989.-С,45.

13. Цустовалов В.Л. .Васильева Г.И. .Дорошенко Е.П. .Киселева А.К. ВлиА-ше антифагопитярных свойств субкультур вакшш-ного штамма чумного микроба ЕВ линии ШЙЗГ на их икмуноген-ггость для морских свикок//Актуал.вопр.эпидемиол.,профилактики н диагностики 00И.:Тез.докл.-Ставрополь,1989.-С.60.

14. Васильева Г.И. .Дорошенко Е.П.,Киселева А.К.Йзменешэ иммуногеннолти и антифагоштарнкх свойств вакпщгнопо итэммз чумного микроба при длительном шутриклето'чном размножении^/ Из в. Сев. -Кав.науч. центра, шея .ик.Ьстественные науки, 1990.-М.-С.107-109.

15. Васильева Г.И.,Киселева А.К..Дорошенко Е.П.Применение показателя макрофагэльной трансформации моноцитов крови для опенки иммунного статуса и его характеристика в динамике формирования специфического иммунитета//Реабилитяшя иммунной

^.системы. :Тез..П Меадунар.симпоз.-Цхалтубо.1990.-С.44-45.

16. Васильева Г.И..Ткаченко JI.H. .Гамлешко Х.П.,Дорошенко Е.П. Оиенка иммунного статуса и его характеристика в динамике формирования имкунитета.методом субпопуляшонного анализа макрофагов//Реабилитаиия имзцуняой системы. :Тез. П Мездунар. симпоз ,-Ц-члтубо .-С. 44.17. Васильева Г.И.,Гкаченко ЛЛ1.,Гамлешко X.П..Киселева

А.К..Веркина Л.М..Дороаенко Е.П. Модулирующее действие вакцинного штамма чумного микроба на композицию субпопуяяшП пе-рнтонеальных макрофягов//Актуал. вопр. вакщнопрофялаятики СОИ. -Киров,1991.-С.169-170.

18. Дороиенко E.H.«Васильева Г.И..Киселева Д.К.Способ восстановления вирулентности чушого микроба.-А.С.Щ717630 СССР.-$4825037/13; заявлено 4.04.90 г. Опубл.7.03.92.//Открытия.Изобретения. -1992. -Ш. -С .343.

19. Васильева Г.Й..Варкина Л.М..Дорошенко £,11. Оценка им-.-муногенности субкультур вакцинного штамма чумного микроба по индексу активации ыакрофагов//Организашя згшднадзора за чумой и меры ее профилактики.:Тез.докл.-Алма-Ата, 1992.-Ч.1.-

С.89-90. .

20. Васильева Г.И. .Веркина Л.М. .Дорошенко Е.П.Макрофаги как зфЬекторине клетки противочумного ишунитет'а//Еактори гуморального и клеточного иммунитета при* разл.физиол.и патоя. состоя.«1ях. :Тез.докл./1 Республ. KOiifi. -Челябинск, 1992. -С. 18.

21. Васильева Г.И..Воркина ЛЛ..Киселева А.К..Дорошенко Е.П.Оценка противочумного иммунитета по модуляцли функциональной активности клеток системы мононуклеарных фагоцитов

в иммунном организме/Л!еждунар.симпоз.по аялергол.и клинич. иммунол.:Тез.докл.-Алма-Ата,1992«-С.92.

22. Васильева Г.Й..Ткаченко Л.Н., Дорошенко Е.П. .Киселева А.К. .Гамлещко Х.П..Веркина JI.U. Способ, определения имцуно-генности противочумных вакцин.-A.c.№1818348 CCCP.-fc4S5865I/I3; заявлено 29.10.90 г. Опубд.30.05.93.//Открытия.Изобретения.-I993.-JH20.~C.243. / .

23. Васильева Г .И. .Киселева А.К. .Дорошенко Е.ПЛкияние вакцинного штамма чумного микроба на конъюгацию лизосом с фагосомами в перитонеальнык и альвеолярных ыакрофагаг//Цито-логия.-1993.-*б-7.-С.105-108, .

Подшсано к пвадув 13.10.94 г. Зиша * 33.$

П. ч. 1. Т»ран 100 ежа. 0« печатано ва ротащиштв РШУ г.Рортом-ив^ону 3440id, пер. Ейхвчавнясквй, за