Влияние чумного микроба и его антигенов на функционально-метаболическую активность электрокинетически гетерогенных субпопуляций фагоцитов

Фирстова, Виктория Валерьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние чумного микроба и его антигенов на функционально-метаболическую активность электрокинетически гетерогенных субпопуляций фагоцитов
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние чумного микроба и его антигенов на функционально-метаболическую активность электрокинетически гетерогенных субпопуляций фагоцитов"

2 7

1 ОД ОКТ 1998

На правах рукописи

Фнрстова Виктория Валерьевна

ВЛИЯНИЕ ЧУМНОГО МИКРОБА И ЕГО АНТИГЕНОВ НА ФУНКЦИОНАЛЬНО-МЕТАБОЛИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ЭЛЕКТРОКИНЕТИЧЕСКИ ГЕТЕРОГЕННЫХ СУБПОПУЛЯЦИЙ ФАГОЦИТОВ

03.00.07 - микробиология

14.00.36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саратов -1998

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Российской научней г исследовательском противочумном институте «Микроб» МЗ РФ ис5аеп>тп:см#е.

Научные руководители: !\>уаоис д

доктор медицинских наук, профессор Ледванов М.Ю., - ■ ■ н,р г

кандидат медицинских наук, с.н.с. Стукова Н.Ю. п-.ч/;.'.:,к-т увд-и;.".:

Официальные оппоненты: оп;

Заслуженный деятель науки Российской Федерации, доктор медицинских наук, нрофее-: сор Л.В.Самойлова, 1¿-.Сыте «ьи.

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Г.М.Сергеева''" 1 Ьаш я

Ведущая организация: ■•■>•..■ г л.члч'

Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт 1 4/ г.

Защита состоится « && » Ск^л^Ь* 1998 г. в /0 часов на заседании диссертацц- ■ онного совета Д 074.32.01 Российского научно-исследовательского противочумного ин-стшута «Микроб» по адресу 410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46: ' ■ ■'

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке института «Микроба

Автореферат разослан « » Неи/Л^л1998 г.

Апгур'^К'ийт рг.'■>>■

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор

Г.А.Корнеев -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Совершенствование специфической профилактики чумы является одной из актуальных задач иммунологии. Решение этой проблемы требует комплексного подхода, который включает в себя исследование механизмов формирования противочумного иммунитета. Фундаментатьными исследованиями ряда ученых (Пустовалов B.JI. с соавт.,1984; Васильева Г.И. с соавт., 1990-1998; Ледванов М.Ю. с со-авт., 1990-1997; Наумов A.B. с соавт.,1992) было доказано, что течение вакцинного и инфекционного процессов при чуме в значительной степени зависит от исхода взаимодействия клеток макрофагального звена с возбудителем инфекции.

К настоящему времени изучено влияние чумного микроба и его антигенов на ряд функциональных, метаболических и морфологических изменений клеток системы моно-нуклеарных фагоцитов (СМФ). Современные представления о роли клеток СМФ основываются на их гегерогенности по функциональной активности, экспрессии поверхностных структур, регуляторным и эффекторным свойствам. Мононуклеарные фагоциты выполняют множество функций в большинстве из которых участвует клеточная поверхность и большое количество мембран-связанных плазматических молекул клеток (рецепторы к Fc-чаети иммуноглобулина, к компонентам комплемента, к терминалу сахарных остатков и т.д.). Необычайная сложность проблемы гетерогенности фагоцитарных клеток требует разработки новых нетрадиционных подходов к ее анализу. Одним га методов тестирования функционального состояния клеток СМФ является определение их электрофоретической подвижности (ЭФП), обусловленной величиной электрического заряда клеток. Электрический заряд, структура поверхностной мембраны и функциональные свойства клетки находятся в тесной взаимосвязи. Метод проточного распределительного клеточного электрофореза в свободном потоке дает возможность изучить характер изменений ЭФП клеток под действием на организм или непосредственно на мононуклеарные фагоциты различных антигенов и вакцин. В работах ряда исследователей (Ермакова Г.В.,1982; Корсуков В.Н.,1984; Ледванов М.Ю., 1984; Тихомирова Л.А.,1985; Тихомирова Е.И.,1990) показана возможность использования данного метода в качестве важного иммунологического критерия, характеризующего изменения ЭФП лимфоцитов в процессе иммуногенеза к чуме. Тем не менее, нами не было найдено работ, касающихся динамики изменений ЭФП фагоцитирующих клеток при формировании иммунитета к чуме. Неизвестна популяционная и функциональная гетерогешюсть фагоцитов, различающихся по признаку электрофоретической подвижности. Известно, что популяции клеток СМФ различаются по экспрессии ключевых ферментов окислительного и гликолитического пути метаболизма (Хаитов P.M., 1995). Однако сравнительной оценки биохимических показателей элекгрокинетически гетерогенных популяций фагоцитов при взаимодействии с различными штаммами чумного микроба до настоящего времени не проводилось.

Цель работы: изучить влияние чумного микроба и его антигенов на функционально-метаболическую активность элекгрокинетически гетерогенных популяций фаго-

цитирующих клеток, определить возможность использования показателей электрофоретической подвижности фагоцитов для оценки иммунобиологических свойств чумного микроба и его антигенов, а также иммуномониторинга противочумного вакцинного процесса.

Задачи исследования

1. Изучить влияние иммунизации мышей (беспородных и инбредных) вакцинным штаммом Y.pestis EV на изменение электрофоретической подвижности перитонеальных макрофагов.

2. Определить характер и количественные критерии изменения электрофоретической подвижности перитонеальных макрофагов при взаимодействии in vitro с клетками

Y.pestis EV.

3. Изучить влияние иммунизации мышей и морских свинок основным соматическим и капсульньш антигенами Y.pestis на изменение электрофоретической подвижности перитонеальных макрофагов.

4. Установить изменения электрофоретической подвижности моноцитов крови людей при взаимодействии in vitro с основным соматическим и капсульным антигенами Y.pestis.

5. Провести сравнительный анализ изменений ключевых ферментов пентозофосфатного пути обмена углеводов (глшкозо-6-фосфатдегидрогеназы), цикла Кребса (сукцинатдегидрогеназы) и гликолиза (лактатдещдрогеназы) в электрокинегически гетерогенных фракциях фагоцитов в динамике взаимодействия с основным соматическим и капсульным антигенами Y.pestis.

6. Изучить функциональную активность электрохинетически гетерогенных популяций макрофагов при взаимодействии in vitro с клетками Y.pestis EV.

7. Определить возможность использования показателей электрофоретической подвижности фагоцитов для оценки иммунобиологических свойств чумного микроба и его антигенов, а также для иммуномониторинга противочумного вакцинного процесса.

Научная новизна. Впервые с использованием свободного распределительного клеточного электрофореза в потоке показано, что иммунизация белых мышей вакцинным штаммом Y.pestis EV сопровождается снижением электрофоретической подвижности основного пула перитонеальных макрофагов и появлением электрофоретически гетерогенных популяций. Обнаружено, что изменения электрокинетических свойств макрофагов в процессе иммуногенеза к чуме зависят от генотипа животных. Инбредная линия мышей CC57W реагирует меньшим, по сравнению с беспородными, снижением электрофоретической подвижности (ЭФП) макрофагов. Выявлены характерные для линии CC57W особенности формирования электрофоретически гетерогенных популяций перитонеальных макрофагов.

иммунизированных морских свинок формируют пять электрофоретическм гетерогенных популяций. Иммунизация морских свинок капсулъным антигеном сопровождается резким снижением ЭФП макрофагов и преобладанием трех электрофоретически различающихся популяций клеток.

Новыми являются данные, показавшие, что адгезия макрофагов к стеклу, сопровождающаяся активацией клеток, приводит к фазному изменению ЭФП популяций фагоцитов - снижению ЭФП, сменяющемуся повышением их электрокипетического потенциала. Взаимодействие in vitro макрофагов животных и моноцитов крови людей с клетками и антигенами Y.pestis EV сопровождается характерными изменениями конфигурации кривой распределения макрофагов по электрофорегической подвижности.

Впервые исследован в электрокинетически гетерогенных популяциях фагоцитов характер изменений активности ключевых ферментов углеводного обмена. Показано, что взаимодействие in vitro антигенов чумного микроба с моноцитами крови людей сопровождается снижением их электрофоретической подвижности и увеличением внутриклеточной активности ключевых ферментов пенгозофосфатногс пути обмена углеводов - глкжозо-6-фосфатдегидрогеназы и гиколитичсского пути - лактатдегидрогеназы. Под влиянием капсульного антигена активность сукцинатдегидрогеназы снижается. Внутри общего пула выделенных моноцитов максимальные ферментативные активности регистрируются в субпопуляциях, характеризующихся более высокой электрофоретической подвижностью.

Комплексный анализ функциональной (фагоцитарного индекса и фагоцитарной активности) и метаболической активности различных типов фагоцитов позволил выявить наличие стереотипной реакции мембран в процессе активации клеток, выражающейся в снижении их злектрокинетического потенциала.

На модели взаимодействия (in vivo и in vitro) фагоцитирующих клеток с чумным микробом и его антигенами подтверждена необходимость пересмотра представлений и подходов к оценке роли этих клеток в иммунопатогенезе чумы с учетом их популяцион-ной гетерогенности.

Практическая значимость работы. Определены количественные критерии изменений электрофоретической подвижности макрофагов, нейгрофильных лейкоцитов и моноцитов при контакте in vivo и in vitro с чумным микробом и его антигенами. Расширены границы области практического применения проточного клеточного распределительного электрофореза для изучения функциональной активности отдельных популяций фагоцитирующих клеток. Показана эффективность использования тестирования электрофоретической подвижности фагоцитов для характеристики иммунобиологических свойств антигенов чумного микроба и иммуномониторинга противочумного вакцинного процесса. Метод определения электрофоретической подвижности фагощггирующих клеток (тестирование формирования электрокинетически гетерогенных популяций фагоцитов) рекомендуется для использования на этапах испытания новых или усовершенствованных противочумных вакцинных препаратов, а также при составлении рациональных

схем иммунизации и при экспериментальной разработке патогенетически обоснованных способов иммунокоррекции.

Внедрение. По материалам экспериментальных исследований составлены методические рекомендации: "Оценка гхопуляционного состава клеток системы мононуклеарных фагоцитов методом разделительного клеточного электрофореза", которые были обсуждены и одобрены Ученым Советом РНИПЧИ "Микроб" (протокол №15 от 19 ноября, 1996г), утверждены директором 19 ноября, 1996г. Метод применяется в научных исследованиях на кафедре гистологии (СГМУ), НИИ кардиологии при СМУ, 5-ой детской объединенной инфекционной больницы г.Саратова, о чем имеются соответствующие акты о внедрении. Материалы диссертационного исследования используются при чтении лекций на курсах специализации врачей по особо опасным инфекциям и курсах усовершенствования врачей-бактериологов санитарно-эпидемиологических учреждений России (при институте "Микроб").

Апробация работы. Материалы диссертации представлены: -на межгосударственной научной конференции, посвященной 100-летшо открытия возбудителя чумы, Алматы, 1994;

-на научной конференции, посвященной 60-летию Иркутского ПЧИ, Иркутск,

1994;

-на итоговой научной конференции в РНИПЧИ "Микроб", Саратов, 1994;

-на международной конференции по иммунореабилигации, Дагомыс, 1994;

-на международной конференции "Гомеосгаз и инфекционный процесс", Саратов,

1996;

-на научной конференции "Эколого-эпидемиологический надзор за природно-очаговыми инфекциями в Северном Прикаспии", Астрахань, 1996;

-на научно-практической конференции, посвященной 100-летию образования противочумной службы России, Саратов, 1997;

-на съезде аккушеров-гинеколов, Самара, 1997;

-на Российской научной конференции "Человек и здоровье", С.-Петербург, 1997. Диссертация обсуждена и одобрена на расширенной научной конференции лаборатории иммунологии РосНИПЧИ "Микроб", 1998г..

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 17 научных работ. Объем и структура работы. Диссертация изложена на 156 страницах машинописного текста и содержит: введете, пять глав, заключение, выводы и библиографический указатель, который включает 162 отечественных и 95 иностранных источников. Работа иллюстрирована 20 рисунками и 4 таблицами.

Основные положения, выносимые на защиту.

1.Характеристика основных закономерностей влияния in vivo и in vitro чумного микроба на функционально-метаболическую активность элеирокинетически гетерогенных субпопуляций фагоцитирующих клеток.

2.3ависимость изменения электрокинетических свойств макрофагов в процессе иммуногенеза к чуме от генотипа животных.

3.Новые данные сравнительно1-о анализа электрокинетических свойств макрофа-в, моноцитов, нсйтрофильных лейкоцитов при взаимодействии с основным соматиче-им и капсульным антигенами чумного микроба.

4.Иовые данные сравнительного анализа изменений активности ферментов угле-дного обмена (глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, сукцинатдегидрогеназа, лактатдегид-геназа, малатдегидрогеназа) в электрокинетически гетерогенных субпопуляциях фаготов в динамике иммунногенеза к чуме.

5.У становление обратной коррелятивной зависимости между функционально-таболической активностью фагоцитов и их электрофоретической подвижностью.

6.Доказательства эффективности использования свободного распределительного еточного электрофореза для оценки популяционной гетерогенности и функциональной гивности клеток системы мононуклеарных фагоцитов в динамике иммуногенеза к чуме.

СОДЕРЖАНКЕ РАБОТЫ

1.Материалы и методы

Работа выполнена на лабораторных животных: морских свинках, нелинейных пых мышах, на белых мышах линии CC57W, B10CW 3-4-месячного возраста, сериалом для исследований служили индуцированные перитонеальные макро-ги экспериментальных животных, а также клетки мононуклеарно-фагоцитарной ;темы, выделенные из крови здоровых людей.

Для иммунизации использовали следующие препараты чумного микроба: щинный штамм ЕВ НИИЭГ и его антигены - основной соматический антиген 1'А) чумного микроба, полученный из ацетонвысушенных клеток экстракцией ¡хлоруксусной кислотой (Boivin A. et al.,1933); капсульный антиген (F1), выде-шый по методу Baker Е. et al. (1952) из солевого экстракта ацетонвысушенных ■ток возбудителя чумы в процессе фракционирования сульфатом аммония.

Экспериментальным животным подкожно вводились антигены (20 мкг на шь) или клетки вакцинного штамма ЕВ НИИЭГ (в дозе 5x105 м.кл. на мышь). ;ледуемые показатели фагоцитирующих мононуклеаров определяли в динамике цинпого процесса (in vivo). Часть экспериментов проводили в кратковременной ьтуре мононуклеарных фагоцитов (МФ) при непосредственном взаимодействии оцитов с клетками вакцинного штамма ЕВ НИИЭГ или его антигенами (in о).

Индуцированные перитонеальные макрофаги белых мышей и морских сви-получали по методу Учитель И.Я. (1978).

Моноциты и нейтрофильные лейкоциты крови человека выделяли в соот-:твии с рекомендациями Хейфец Л.Б.(1973).

Определение электрофоретической подвижности (ЭФП) фагоцитирующих коцитов осуществляли на аппарате Elphor VaP-5. Разделение клеток проводили напряжении 500V и силе тока 120mA. Скорость тока буфера в камере состав-з 300 мл/ч, скорость подачи клеток в камеру - 3 мл/ч, в камере разделения

поддерживалась температура +6 °С. Количество клеток в полученных фракциях подсчитывали в камере Горяева, а затем высчитывали процентное содержание фагоцитирующих лейкоцитов во всех фракциях по отношению к общему числу клеток, полученных после разделения. На основе полученных данных строили электрофоретическую кривую, где по оси абсцисс отмечали число фагоцитов (в процентах), а по оси ординат - номера фракций.

Жизнеспособность клеток до и после элскгрофоретического разделения определяли при помощи теста с трепановым синим (1% раствор).

Для определения взаимосвязи между изменениями показателей ЭФП фагоцитирующих лейкоцитов и их функциональной активностью определяли фагоцитарные и биохимические показатели фагоцитов в отдельных фракциях, полученных после сепарации клеточной взвеси на аппарате Elphor VaP-5.

Постановка фагоцитарных реакций. В монослой кратковременной культуры фагоцитов добавляли взвесь 2-суточной агаровой культуры штамма Y.pestis EV НИИЭГ в концентрации 1*106 КОЕ (микробная нагрузка составляла 50 микробных клеток), 3 мл среды 199 и инкубировали в течение 10, 30, 60, 90 минут при 37 °С в водонасыщенной атмосфере, содержащей 5% углекислого газа. Параллельно ставили контроль (клетки инкубировались без добавления штамма чумного микроба). По истечении срока культивирования фагоцитирующие лейкоциты сепарировали на аппарате Elphor VaP-5. Клетки подсчитывали в камере Горяева из каждой фракции, готовили мазки и окрашивали по Романовскому-Гимза. Препараты просматривали в световом микроскопе при увеличении *1350.

Интенсивность фагоцитоза определяли, подсчитывая следующие показатели:

1) фагоцитарный индекс - среднее количество микробов, поглощенное одним фагоцитирующим лейкоцитом;

2) фагоцитарную активность - число активных фагоцитов из 100 сосчитанных.

Определение ферментативной активности клеток СМФ

Активность сукцинатдегидрогеназы, лактатдегидрогеназы, малатдегидроге-назы, глюкозо-б-фосфатдегидрогеназы определяли в отдельных фракциях моноцитов крови человека, полученных после сепарации на аппарате Elphor VaP-5. Клетки разрушались трехкратным замораживанием и оттаиванием, центрифугированием при 3 тыс.об./мин. Активность ферментов определяли в супернатанте с использованием специальных наборов реактивов фирмы «Boehringer Mannheim».

Принцип метода определения активности глюкозо-б-фосфатдегидрогеназы основан на восстановлении НАДФ при окислении глюкозо-б-фосфатдегидрогеназы. По мере образования НАДФН абсорбция при 340нм возрастает. Активность фермента рассчитывалась по таблице и выражалась в U/106 моноцитов.

Определение активности малатдегидро-.геназы основано на превращении под действием глютаматоксалоацетат трансаминазы L-аспартата и а-оксоглютората в L-глютамат и оксалоацетат, последний в присутствии восстановленной формы НАД под действием

малатдегидрогеназы, содержащейся в исследуемом образце, превращается в L-малат. По убыли НАДН, регистрируемой по уменьшению оптической плотности при 340нм, рассчитывалась активность малатдегидрогеназы, выражавшаяся в U/106 моноцитов.

Определение активности лактатдегидрогеназы основано на превращении пирувата в присутствии НАДН под действием лактатдегидрогеназы в L-лакгат. Активность фермера рассчитывалась по понижению поглощения НАДН при 340нм, выражалась в U/106

МОНОЦИТОВ.

Пр1шцип метода определения активности сукцинатдегидрогеназы основан на превращении фруктозы в сорбитол под действием сукцинатдегидрогеназы. Активность фермента рассчитывалась по понижению поглощения НАДН при 340нм, выражалась в U/106 моноцитов.

Статистический анализ. Все результаты, полученные при проведении исследований, обработаны статистически общепринятыми методами. Вычисляли среднюю арифметическую (М), коэффициент достоверности (t), корреляционную зависимость (R).

Расчеты, проведенные в ходе выполнения работы, проводили с применением специальных компьютерных программ.

2.Результаты исследований и их обсуждение.

В результате выполненных исследований получены следующие основные результаты.

Иммунизация мышей вакцинным штаммом Y.pestis EV во все сроки наблюдения приводила к снижению электрофоретической подвижности перитонеальных макрофагов по сравнению с контролем (рис1.). В качестве контроля служили неиммунизированные животные. Уже на 1 сутки иммуногенеза было обнаружено разделение общего пула макрофагов на две субпопуляции. Большая по количеству клеток субпопуляция макрофагов обладала более низкой электрофоретической подвижностью. Наиболее значимое разделение перитонеальных макрофагов на субпопуляции с различной электрофоретической подвижностью было зарегистрировано на 7 и 14 сутки иммуногенеза. На 21 сутки формирования иммунитета к чуме вся популяция перитонеальных макрофагов была представлена одним пулом клеток со значительно сниженной электрофоретической подвижностью по сравнению с контролем.

Обнаруженное нами снижение электрофоретической подвижности макрофагов, вероятно, связано с изменением мозаики поверхностных антигенов. Возможно количество детерминант, несущих отрицательный заряд уменьшается в результате шгтернали-зации мембраны, либо в результате маскировки их вновь образующимися или присоединенными молекулами (иммуноглобулинами, цигскинами и т.д.). Полученные нами данные согласуются с результатами исследований Knyszynski А., 1978; Malkosky М., 1980; Bauer J.,1992, показавших, что снижение отрицательного электрокинетического потенциала клеток системы фагоцитирующих мононуклеаров связано с их активацией. На разных этапах иммуногенеза к чуме в процесс иммунобиологической перестройки, оче-

Контроль

7 сутки

40 л 30 20 -10 -о

.......................

31 41 51 61 71

40 30 -2010 -0

1 ■ | <У | < ■

31 41 51 61 71

1 сутки

14 сутки

40 30 -20 -10 О

I I I ! I I I I I 11/1 I .

31 41 51 61 71

40 30 -20 -10 О

I I I I I I I I И I 1 I

31 41 51 61 71

3 сутки

40 30 20 Н 10 О

I I 1 I I 1 I I 1>ЫГ| II

I I .и

31 41 51 61 71

21 сутки

40 п 30 20 10 О

31 41 51 61 71

Пунктирная линия - клетки, полученные от неиммунизированных животных; сплошная линия - клетки, полученные от иммунизированных животных в различные сроки иммуногенеза. По оси абсцисс - номера фракций; по оси ординат - содержание клеток (%).

Рис.1. Изменение элекгрофоретической подвижности индуцированных перитонеальных макрофагов белых мышей в различные сроки после

иммунизации У.резйзЕУ.

видно, вовлекаются различные субпопуляции клеток системы фагоцитирующих мо-нонуклеаров. Обращает внимание, что к 21 дню (фоку развития максимально выраженного протекгивного иммунитета) наибольший процент клеток системы мононуклеарных фагоцитов у мышей обладал сниженной электрофоретической подвижностью. Последнее, по видимому, свидетельствует о значительной степени генерализации процесса иммунобиологической перестройки под влиянием живой чумной вакцины (штамма ЕВ).

При анализе взаимосвязи изменений электрофоретической подвижности у беспородных мышей и мышей линии СС57\У было отмечено, что линейные мыши реагировали меньшим снижением электрофоретической подвижности макрофагов в ответ на иммунизацию живой чумной вакциной. Контрольная элекгрофореграмма мышей линии СС57\^ была представлена одним пиком выхода клеток, соответствующем 47 и 48 фракциям, которые содержали 44.39 % макрофагов от общего количества. В процессе иммуногенеза наблюдали смещение профилей элекгрофореграмм, но не более чем на 5 фракций. Злек-трофореграммы нелинейных мышей при формировании иммунитета к чуме смещались на 8-10 фракций относительно контроля. К 21 суткам и иммуногенеза наблюдалось повышение ЭФП макрофагов до исходного уровня. Однако данный профиль распределения клеток отличался от контрольного. 58.17 % клеток равномерно распределялись с 45 по 49 фракции, в то время как в контроле 61.31 % макрофагов выходили в трех каналах (46, 47, 48 фракции).Следует отметить, что линия СС57\У является более чувствительной к чумной инфекции и интоксикации, чем беспородные мыши. В результате иммунизации живой чумной вакциной у СС57\Лг-мышей формируется менее выраженный протективный иммунитет, чем у беспородных. Не исключено, что последнее может бьпь связано с недостаточной активацией клеток системы мононуклеарных фагоцитов. Это предположение согласуется с полученными результатами - отсутствие на 21 сутки значительного пула активированных макрофагов, макрофагов с пониженной электрофоретической подвижностью. Электрофоретическое тестирование клеток системы мононуклеарных фагоцитов с определенной степенью достоверности позволяет судить о генетически детерминированном формировании субпопуляционной гетерогенности и доле активированных макрофагов па отдельных этапах иммуногенеза к чуме. Для понимания механизмов развития иммунобиологической перестройки в зараженном или вакцинированном организме необходимо иметь четкие представления об особенностях влияния на макрофаги отдельных компонентов возбудителя. Среди антигенов У.реяНх ЕУ особое значение представляют такие антигены как капсульный и основной соматический. Интерес к их изучению обусловлен не только многообразием их иммунобиологических функций, но и возможностью эффективного применения в составе химической чумной вакцины. Результаты проведенных исследований показали, что иммунизация животных основным соматическим антигеном чумного микроба приводит к снижению ЭФП основной массы макрофагов, по сравнению с контролем (рис.2). К 21 суткам иммуногенеза наблюдалось восстановление элекгрокинетического заряда клеток и даже увеличение его у отдельных субпопуляций макрофагов. Капсульный антиген вызывал более выраженное влияние на клетки

Контроль

40-j 302010-

iiiiii

i 1111111

31 41 51 61 71

7 сутки

40-1 30 -20 10 -I

■ ■ ....... 1 ■

31 41 51 61 71

1 сутки

14 сутки

40-, 302010 0

31 41 51 61 71

40-i д 30

/Мл ю -\1\

i i i i i i i I ■ t'i ■ i lAh i i\ iVi i Q I I I I | | I I I I l/l I I 1У1 I 1>1 I I

31 41 51 61 71

40 -i 30 -20 -10 -0

3 сутки

I I I W^Thi^hÍ^VbJ-

40 30 20 io ^

_i_I.i o

21 сутки

1.1 I I I U/il

31 41 51 61 71

Пунктирная линия - клетки, полученные от неиммуншированных животных; сплошная линия- клетки, полученные от иммунизированных животных капсульным антигеном; жирная линия - основным соматическим антигеном в различные сроки иммуногенеза. По оси абсцисс - номера фракций; по оси ординат - содержание клеток (%)

Рис.2. Изменение электрофоретической подвижности индуцированных першхшеалыгах макрофагов белых мышей в различные сроки после иммунизации капсульным или основным соматическим антигеном чумного микроба.

системы фагоцитирующих мононуклеаров. Это проявлялось как в более значительном снижении ЭФП исследуемых клеток, так и степени их гетерогенности. Полученные нами данные согласуются с предположением Г.И.Васильевой с соавт. (1994) о существовании строгой прямой корреляции между протекгивными свойствами препаратов, используемых для иммунизации против чумы и характером распределения субпопуляций макрофагов.

Наряду с белыми мышами наиболее распространенной экспериментальной моделью изучения противочумного иммунитета является морская свинка. По мнению ряда исследователей процессы иммунобиологической перестройки организма морских свинок при взаимодействии с антигенами чумного микроба наиболее близки к регистрируемым у человека. В связи с этим в сравнительном аспекте исследование влияния капсульного антигена на элекгрокинетические свойства макрофагов было проведено также на морских свинках.

Проведенные нами исследования позволили установить резкое снижение ЭФП перитонеальных макрофагов морских свинок во все сроки иммуногенеза. Максимальное снижете ЭФП МФ наблюдали на 7 сутки. К 21 суткам иммуногенеза регистрировалось некоторое восстановление ЭФП клеток. Важно отметить, что МФ неиммунизированных морских свинок характеризовались большей гетерогенностью по элеюро-кинетическим характеристикам, чем клетки иммунизированных животных. Во все сроки после иммунизации морских свинок наблюдали появление на элекгрофореграммах трех пиков максимального процента выхода клеток, в то время как для элеьорофореграммы контроля было характерно наличие пяти пиков.

Обнаруженные нами изменения электрофоретической подвижности макрофагов при иммунизации мышей живой чумной вакциной могли быть связаны не только с влиянием чумного микроба или различных цитокинов, действующих in situ, но и явиться следствием рециркуляции, миграции и адгезии макрофагов. Для выяснения влияния непосредственного контакта чумного микроба и фагоцитирующих клеток на изменение их электрофоретической подвижности были проведены эксперименты in vitro.

В наших опытах проводилась предварительная адгезия макрофагов на стекло с целью получения монослоя фагоцитов и проведения дальнейшей инкубации с микробными клетками. Для контроля использовались макрофаги, претерпевшие адгезию на стекле в течение того же промежутка времени, что и макрофаги, проинкубированные с Y.pestis EV. Установлено, что интактные макрофаги, находясь в адгезированном состоянии, при последующей электрофоретической сортировке разделялись на ряд субпопуляций, обладающих разной электрофоретической подвижностью. Формирование субпопуляций происходило в динамике нашего наблюдения в течение 360 минут. Полученные нами данные свидетельствуют, что при активации макрофагов происходит их разделение на субпопуляции, обладающие различными функциональными свойствами.

Активация различается не только степенью возбуждения индивидуальных клеток, но и масштабом охвата клеточной популяции в целом. В норме активировано небольшое

количество фагоцитов. Взаимодействие макрофагов с микробными клетками Y.pest is EV сопровождалось изменениями конфигурации кривой распределения макрофагов по элек-трофоретической подвижности уже на 30 минуте исследования. В этот период исследования электрофореграмма была представлена одним пиком выхода клеток, соответствующим 46 фракции, где тестировалось 58,3 % макрофагов. Электрофоретическая кривая распределения клеток контроля характеризовалась двумя пиками максимального выхода клеток - в 42 и 46-47 фракциях, в которых содержание макрофагов составило 6.7 % и 82.5 %, соответственно. Начиная с 60-й минуты исследования наблюдается увеличение гетерогенности клеток по электрофорегическим показателям. Клетки распределяются на четыре основные группы по ЭФП, соответственно, в 44; 46,47; 52 и 55 каналах. В 44 фракции тестировалось 5 % клеток; в 46,47 - 30 %; в 52 - 3.2 % и в 55 фракции - 10,7 %. Основная масса макрофагов приходилась на 46-49 каналы с общей численностью клеток 58,6 %. По сравнению с контролем происходило увеличение численности выхода МФ во фракциях, характеризующихся высокой ЭФП.

В сравнительном аспекте, а также с целыо возможной экстраполяции данньк полученных в эксперименте на организм человека были проведены опыты с использованием моноцитов и нейггрофильных лейкоцитов, выделенных из крови людей. Также как и макрофаги, популяция кнгакгных моноцитов в процессе адгезии на стекло разделяется на субпопуляции, обладающие различной электрофоретической подвижностью.

Взаимодействие моноцитов крови in vitro с Y.pestis EV приводило к значительным сдвигам в состоянии электрокинетических свойств клеток, выражающееся в повышении электрофоретической подвижности моноцитов на 10 минуте инкубации и разделение общего пула на три субпопуляции с разными электрофоретическими свойствами (рис.3). На 30 и 60 минуте взаимодействия моноцитов и Y.pestis EV, также как и в экспериментах на перигонеальных макрофагах экспериментальных животных, наблюдали снижение ЭФП.

Данные, полученные в экспериментах in vitro, свидетельствовали о меньшем влиянии Y.pestis EV и его антигенов на электрофоретическую подвижность моноиукле-арных фагоцитов, чем непосредственно в живом организме. Вероятно, изменения электрофоретической подвижности мононуклеарных фагоцитов в экспериментах in vivo отражают сложный комплекс реакций фагоцитов, обеспечивающих иммунобиологическую перестройку и формирование антиинфекционной резистентности.

Следующий раздел работы был посвящен выяснению взаимосвязи между уровнем электрофоретической подвижности фагоцитирующих лейкоцитов и их функционально-метаболической активностью.

В период взаимодействия нейтрофилов с Y.pestis EV наряду со снижением ЭФП, увеличивалась способность нейтрофилов к фагоцитозу. Нейтрофилы, составившие субпопуляцию с наименьшей ЭФП, обладали наиболее высокими показателями фагоцитарной активности (таблица). Через 30 минут инкубации регистрировалось наличие всего одной субпопуляции нейтрофилов, ЭФП которой была снижена по сравнению с контролем. Фагоцитарный индекс составил в среднем 6.75±0.72 микробных клеток на один

40 30 -20 -10 -0

Контроль, 10

МИНУТ

1 1 ■ ■ ■' ■' ■ ■ ■'1 ■ ■ ■1 ■ ' ' ■

31 41 51 61 71

40 -| 30 -20 -10 -0

10 минут

■' ■ ■1 ■1 ■

31 41 51 61 71

Контроль, 30 минут

30 минут

40 30 20 10 0

■....... 111 и 11 I 11 > 11 11

31 41 51 61 71

40 п 30 -20 -100

■ I 1111^111.

31 41 51 61 71

м11

Контроль, 60 минут

40 п 30 20 10 0

■' ■ ■11 ■ ■' ■' ■ < ■ ■ ■ ■'»1' ■ ■

31 41 51 61 71

60 минут

40 -| 3020 -100

-г

I I I I I I < I Г, ■'!>

31 41 51 61 71

Пунктирная линия - клетки, проинкубированные без микробной взвеси; сплошная линия - клетки, проинкубированные в присутствии клеток У.рейЬ ЕУ. По оси абсцисс - номера фракций; по оси ординат -содержание клеток (%).

Рнс.3. Изменение электрофоретической подвижности моноцитов крови человека в пазличные споки инкубаиии их с кттетками У.пеяНх НУ.

нейтрофил. Почти все клетки субпопуляции находились в состоянии фагоцитоза (94.2%). Взаимодействие нейтрофилоз крови и микробных клеток У.ре.ч№ ЕУ в течение 60 минут характершовалось отсутствием разделения общего пула на субпопуляции и дальнейшим снижением ЭФП. Максимальный выход клеток тестировался в 67 фракции, в которой в основном все нейтрофилы находились в состоянии фагоцитоза (99 %). Число захваченных микробных клеток на один нейтрофил составляло9.2±0.37(р<0.001).

Таблица. Уровень фагоцитарной активности и значение фагоцитарного индекса электрокинетически гетерогенных субпопуляций нейтрофильных лейкоцитов крови людей при взаимодействии с Y.pestis in vitro_

№ канала Сроки исследования

10 минут 30 минут 60 минут

ФА ФИ ФА ФИ ФА ФИ

57 26.1±3.67 0.66±0Д6

58 41.0±1.01 2.25±0.11

59 31.2±2.92 1.85±0.06

60 27.Ot3.74 1.70±0.33

61 33.2±3.39 1.89±0.39 25.2±4.33 0.66±0.21

62 51.0±1.87 2.95±0.09 47.0±8.89 2.82±0.02

63 43.1±2.55 2.54±0.25 60.0±7.42 3.99±0,57

64 50.6±1.17 3.30±0.12 94.2±4.85 5.17±0.93 71.4±0.98 6.4±0.68

65 31.1±4.02 2.20±0.18 74.0±2.76 6.75±0.72 78.0±4.36 6.2±0.21

66 61.4±11.08 4.40±0.71 85.0+5.24 8.0±0.45

67 35.0±12.25 1.64±0.62 99.0±1.01 9.2±0.37

68 8.4±0.93 0.61±0.12 100i0.ll 8.0±0.63

69 99.0±1.01 7.0±0.45

ФА - фагоцитарная активность (%); ФИ - фагоцитарный индекс (м.кл.)

Из полученных данных видно, что гетерогенность нейтрофильных лейкоцитов проявляется лишь на начальных этапах фагоцитоза. Разделение популяции нейтрофилов, очевидно, связано с метаболическими изменениями. Фагоцитоз чумного микроба не сопровождается разделением общего пула нейтрофилов на субпопуляции, однако, происходит изменение электрофорегической подвижности всей популяции нейтрофилов.

В следующем разделе работы был проведен сопоставительный анализ изменений метаболической активности элеюрофоретически-гетерогенных субпопуляций моноцитов крови человека под влиянием антигенов чумного микроба. С этой целью изучались: глюкозо-6-фосфатдещдрогеназа - ключевой фермент пентозофосфатного пути, лактат-дегидрогеназа - ключевой фермент гликолитического пути, малатдещдрогеназа и сук-цинатдегидрогеназа - ферменты цикла Кребса. Обнаруживалась обратная корреляция

между активностью ключевого фермента пентозофосфатного пути обмена углеводов -глюкозо-6-фосфатдепздрогеназы и ЭФП моноцитов. Взаимодействие моноцитов с основным соматическим антигеном сопровождалось снижением активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы на 10 и 30 минуте взаимодействия (рис.4). Кансульный антиген, напротив, увеличивал ферментативную активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы моноцитов во все сроки исследования и снижал элекгрофоретическую подвижность клеток.

Инкубация in vilro моноцитов крови с капсульным антигеном чумного микроба сопровождалась повышением активности фермента цикла Кребса - малатдегидрогеназы и фермента гликолиза - лактатдегидрогеназы. Интересно отметить, что внутри общего пула выделенных клеток субпопуляции с большей ферментативной активностью характеризовались более высокой ЭФП. Активность сукцинатдегидрогеназы снижалась при взаимодействии моноцитов с антигенами чумного микроба (рис.5). Максимальные активности ключевого регуляторного фермента цикла Кребса идентифицировались в высокоподвижных фракциях. Регистрировалась высокая степень коэффициента корреляции (г=0.98±0.01) между активностью сукцинатдегидрогеназы и ЭФП моноцитов.

Таким образом, использование физико-химического метода определения электро-форетической подвижности и биохимических методов определения ферментативной активности позволило дать интегральную общую характеристику изменениям функциональной активности фагоцитирующих клеток при их взаимодействии in vitro и in vivo с чумным микробом и его антигенами. Полученные данные могут иметь важное значение при оценке иммунобиологических свойств разных штаммов и антигенов чумного микроба.

Выводы

1. Иммунизация белых мышей вакцинным штаммом Y.pestis EV сопровождается снижением электрофоретической подвижности основного пула перитоне-альных макрофагов и появлением электрофоретически гетерогенных популяций.

2. Изменения электрокинетических свойств макрофагов в процессе иммуногенеза к чуме зависят от генотипа животных. Инбредная линия мышей CC57W реагирует меньшим, по сравнению с беспородными, снижением электрофоретической подвижности макрофагов. Выявлены характерные для линии CC57W особенности формирования электрофоретически гетерогенных субпопуляций перитоне-альных макрофагов.

3. Адгезия макрофагов к стеклу, сопровождающаяся активацией клеток, приводит к дифференцированному изменению электрофоретической подвижности популяций фагоцитов. Через 60 минут после адгезии наблюдается выраженное снижение электрофоретической подвижности большинства клеток, сменяющееся повышением через 180 и 360 минут.

4. Взаимодействие in vitro макрофагов с клетками Y.pestis EV приводит к значительному изменению конфигурации кривой распределения макрофагов по электрофоретической подвижности. На 60 минуте инкубации тестируются до четырех электрофоретически гетерогенных субпопуляций, одна из которых (46-47

60 минут

Столбики - ферментативная активность (тШЮ кл); линии электрофоретическая подвижность. Пунктирная линия - контроль; сплошн линия - клетки, проинкубированные в присутствии ОСА, жирная -присутствии капсульного антигена.

Рнс. 4. Изменение активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы электрокинетически гетерогенных субпопуляциях моноцитов крови челове при взаимодействии с антигенами чумного микхюба.

и/10 кл

1,2 0,8 0,4 0

и/10 кл

1,2 0,8 0,4 О

30 минут

/ гЬ

—1 111 ь- Н1Ч-- —1 1 -I ч 4 1 1 1 1 г>- 1—

40 30 20 10 О

Столбики - ферментативная активность (ти/10" кл); линии электрофоретическая подвижность. Пунктирная линия - контроль; сплошная линия - клетки, проинкубированные в присутствии ОСА, жирная - в присутствии капсульного антигена.

Рис.5. Изменение активности сукдинатдешярогеназы в электрокинетически гетерогенных субпопуляциях моноцитов крови человека при взаимодействии с антигенами чумного микроба.

фракция - 30 % клеток) обладает резко выраженной высокой электрофоретическо> по д в ижно стью.

5. Иммунизация белых мышей основным соматическим и капеульным ан тигенами чумного микроба вызывает снижение электрофоретической подвижност! основной массы макрофагов, формирующих в большинстве сроков иеследованн: две электрофоретически различающиеся субпопуляции. Капсульный антиген обла дает более выраженной, по сравнению с основным соматическим, способностьк снижать электрофоретическую подвижность фагоцитов.

6. Макрофаги неиммунизированных морских свинок формируют шт электрофоретически гетерогенных субпопуляций. Иммунизация морских евино? капеульным антигеном сопровождается резким снижением электрофоретической подвижностью макрофагов и преобладанием трех элекрофоретически различающихся субпопуляций клеток.

7. Адгезия моноцитов крови людей к стеклу приводит к выраженному дифференцированному изменению электрофоретической подвижности популяций фагоцитов. Спустя 30 минут наблюдается снижение электрофоретической подвижности большинства клеток, разделившихся на 2 субпопуляции. Инкубация in vitro моноцитов человека с антигенами чумного микроба (капеульным FI и основным соматическим) сопровождается снижением электрофоретической подвижности с формированием характерной кривой распределения клеток по данному свойству.

В. Взаимодействие in vitro антигенов чумного микроба с моноцитами крови людей сопровождается снижением их электрофоретической подвижности и увеличением внутриклеточной активности ключевых ферментов пенгозофосфатного пути обмена углеводов - глюкозо-б-фосфатдегидрогеназы и гиколигаческого пути - лактатдегидрогеназы. Под влиянием капсулыюго антигена активность сукцинатдегидрогеназы снижается. Внутри общего пула выделенных моноцитов максимальные ферментативные активности регистрируются в субпопуляциях, характеризующихся более высокой электрофоретической подвижностью.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Стукова Н.Ю., Дроздов И.Г., Попов Ю.А., Шведун Г.П., Самойлова C.B., Кириллина O.A., Булгакова Е.Г., Яшечкин Ю.И., Лазовский Ю.В., Фирстова В.В., Ледва-нов М.Ю. Генетически-детерминированные факторы иммуногенности и вирулентности.// Иммунология и специфическая профилактика ООИ: Материалы Российской научной конф.-Саратов, 21-23 сентября, 1993.- С.70-71.

2. Ледванов М.Ю., Наумов A.B., Дроздов И.Г., Стукова Н.Ю., Емельянова Н.В., Тихонов С.Н., Лазовский Ю.В., Лоцманова Е.Ю., Фирстова В.В., Клапков С.А., Шведун Г.П., Тараненко Т.М., Брандзишевский Ю.В., Попов Ю.А., Куличенко А.Н., Киреев М.Н., Герасимова К.И., Саяпина Л.В., Анисимова Т.Н., Кравцов А.Л., Самойлова C.B., Яшечкин Ю.И. Механизмы формирования клеточного противочумного иммунитета.// Актуальные

1робл. профилакт. особо опасных и природно-очаговых инф. болезн. - Иркутск,- 1994.-D.87-88.

3. Фирстова В.В., Стукова Н.Ю., Лазовский Ю.В., Тихомирова Л.А., Ледваков »110. Тестирование функциональной активности макрофагов в процессе иммуногенеза к туме с использованием свободного распределительного клеточного электрофоре-|а.//Межгос. научн. конф., посвящен. 100-летито открытия возб. чумы.- Алма-Ата.- 6-7 ;ент.,1994.- С.163.

4. Stukova N.Yu., Firstova V.V., Lazovski Yu.V. Functional aktivity test by carrier-free :lectrophoresis of subpopulation of phagocytic mononuclear cells.// International journal of lTimunorehabilitation. Abstracts of the 1st International congress of immunorehabilitation. -1994, Number 1.- Supplement.-P.339.

5. Стукова Н.Ю., Шведун Т.П., Тараненко Т.М,, Гусева Н.П., Фирстова В.В., Дроздов И.Г., Ледванов М.Ю. Функциональное состояние иммунокомпетентных клеток при азаимоденствии с чумным микробом и его антигенами. // Ставрополь,- 11.05.95.

6. Фирстова В.В., Стукова Н.Ю., Тараненко Т.М., Лазовский Ю.В., Тихомирова Л.А., Ледванов М.Ю. Измене1ше электрокинегических свойств меток системы фагоцитирующих мононукпеаров в процессе иммуногенеза к чуме.// Пробл. ООИ.- Саратов 1995,-Вып.2,-С. 159-167.

7.Фирстова В.В., Стукова Н.Ю., Шведун Г.П., Ледванов М.Ю. Элект-рофорегическая подвижность перитонеальных макрофагов морских свинок и мышей в процессе формирования иммунитета к чуме.// Научн. конф. "Актуальные вопр. совр. медицины" ,24-26 апр. ,1996.- Бишкек.

8.Фирстова В.В., Стукова Н.Ю., Шведун Г.П., Ледванов М.Ю. Изменение электрофоретической подвижности мононуклеарных фагоцитов в процессе формирования иммунитета при чуме// Тез. Конф.: «Эколого-эпидем. Надзор за при-родно-очаговыми инф. В Северном Прикаспии»,- Астрахань, 1996.- С.162.

9.Фирстова В.В., Стукова Н.Ю., Чалык Н.Е., Ледванов М.Ю. Изменение активности ферментов углеводного обмена и электрокинетических показателей моноцитов крови человека при взаимодействии с антигенами чумного микроба// Го-меостаз и инф. Проц.: Тез. Докл. Междунар. Конф,- Саратов, 1996,- С337.

10.Фирстова В.В., Стукова Н.Ю., Чалык Н.Е., Ледванов М.Ю. Фагоцитарная активность в электрокинетически гетерогенных популяциях нейтрофилов крови человека при взаимодействии с чумным микробом// Гомеостаз и инф. Проц.: Тез. Докл. Междунар. Конф.- Саратов, 1996.- С336.

11.Фирстова В.В., Стукова Н.Ю., Ледванов М.Ю. Современные представления об электрокинетических свойствах иммунокомпетентных клеток/ Российск. н.-и. противочумн. ин-т «Микроб»,- Саратов, 1996.- 27с. - Библиогр. 83 назв.-Рус,- Деп. В ВИНИТИ 14.01.97, №111-В97.

12.Фирстова В.В., Стукова Н.Ю., Мелещенко Н.Ю. Использование метода распределительного клеточного электрофореза для прогнозирования течения ин-

фекцнонных заболеваний// Самара, «Съезд аккушеров-гинекологов».-1997(октябрь).

13. Фирстова В.В., Стукова Н.Ю., Чалык Н.Е., Мелещенко Н.Ю., Крушешщ-кая Е.Б., Ледванова Т.Ю., Корякина Е.В., Цека Ю.Б. Разработка критериев оценки и прогноза течения различных заболеваний с использованием метода клеточного электрофореза в свободном токе жидкости// Матер. Н.-практ. Конф., посвящ. 100-летию образов противочумн. Службы России.- Саратов, 1997.- Т.1- С.254.

14.Стукова Н.Ю., Емельянова Н.В., Фирстова В.В., Мелещенко Н.Ю., Горь-кова A.B., Ледванов М.Ю. Разработка критериев оценки и прогноза иммунотерапии различных заболеваний с использованием препаратов тимуса// Матер. Науч. Конф. "Человек и здоровье С.-Петербург, 1997 (25-30 мая).- дискета.

15.Емельянова Н.В., Стукова Н.Ю., Цека Ю.А., Фирстова В.В., Клапков С.А., Зайцева И.А., Мелещенко Н.Ю., Ледванов М.Ю. Изучение и коррекция иммуно-дефицитных состояний у больных дифтерией// Матер. Научно-практ. Конф., посвящ. 100-летию образов противочумн. службы России.- Саратов, 1997.- Т.1.-С.209.

16.Стукова Н.Ю., Шведун Г.П., Фирстова В.В., Горькова A.B., Мелещенко Н.Ю., Ледванов М.Ю. Значение процессов фагоцитоза в формировании противочумного иммунитета// Матер. Научно-практ. Конф., посвящ. 100-летию образов противочумн. службы России.- Саратов, 1997.- Т.1.- С.245.

П.Емельянова Н.В., Стукова Н.Ю., Цека Ю.А., Фирстова В.В., Клапков С.А., Зайцева И.А., Мелещенко Н.Ю., Ледванов М.Ю. Изучение и коррекция нарушений функционального состояния лимфоцитов у детей при инфекционных кишечных заболеваний// Матер. Научно-практ. Конф., посвящ. 100-летию образов противочумн. службы России.- Саратов, 1997.- Т.1.- С.210.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Фирстова, Виктория Валерьевна, Саратов

Л' с , —: -о

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Федеральное государственное учреждение «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» МЗ РФ

На правах рукописи

Фирстова Виктория Валерьевна

ВЛИЯНИЕ ЧУМНОГО МИКРОБА И ЕГО АНТИГЕНОВ НА ФУНКЦИОНАЛЬНО-МЕТАБОЛИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ЭЛЕКТРОКИНЕТИЧЕСКИ ГЕТЕРОГЕННЫХ СУБПОПУЛЯЦИЙ

ФАГОЦИТОВ

03.00.07 - микробиология

14.00.36 - аллергология и иммунология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: доктор мед. наук, профессор М.Ю.Ледванов кандидат мед. наук, с.н.с. Н.Ю.Стукова

Саратов - 1998

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ 6

ГЛАВА 1. ЭЛЕКТРОКИНЕТИЧЕСТКИЙ ПОТЕНЦИАЛ КЛЕТОК И ЕГО ИЗМЕНЕНИЕ В ПРОЦЕССЕ ИММУНОГЕНЕЗА (обзор литературы). 14

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. 34

ГЛАВА 3. ИЗМЕНЕНИЕ ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОЙ ПОДВИЖНОСТИ КЛЕТОК СИСТЕМЫ ФАГОЦИТИРУЮЩИХ МОНОНУКЛЕАРОВ В ПРОЦЕССЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ (IN VIVO И IN VITRO) С ВАКЦИННЫМ ШТАММОМ ЧУМНОГО МИКРОБА

3.1. Изменения электрофоретической подвижности макрофагов белых мышей, иммунизированных штаммом У.ревИв EV

3.2. Изменения электрофоретической подвижности макрофагов мышей линии CC57W, иммунизированных Y.pestis EV 4g

3.3. Изменения электрофоретической подвижности макрофагов белых мышей в процессе взаимодействия in

vitro с Y.pestis EV ^

3.4. Изменение электрофоретической подвижности моноцитов крови людей в процессе взаимодействия in vitro

с Y.pestis EV qq

ГЛАВА 4. ИЗМЕНЕНИЯ ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОЙ ПОДВИЖНОСТИ КЛЕТОК СИСТЕМЫ ФАГОЦИТИРУЮЩИХ МОНОНУКЛЕАРОВ ПРИ ВЗАИМОДЕЙСТВИИ IN VIVO И IN VITRO С АНТИГЕНАМИ ЧУМНОГО МИКРОБА 67

4.1. Изменение электрофоретической подвижности индуцированных перитонеальных макрофагов белых мышей в процессе взаимодействия с основным соматическим антигеном чумного микроба in vivo 72

4.2. Изменение электрофоретической подвижности индуцированных перитонеальных макрофагов белых мышей в процессе взаимодействия с антигеном чумного микроба Fl in vivo 76

4.3. Изменение электрофоретической подвижности индуцированных перитонеальных макрофагов морских свинок в процессе взаимодействия с антигеном чумного микроба Fl in vivo 81

4.4. Изменение электрофоретической подвижности моноцитов крови людей в процессе взаимодействия с основным соматическим антигеном чумного микроба in

vitro 84

4.5. Изменение электрофоретической подвижности моноцитов крови людей в процессе взаимодействия in vitro с антигеном чумного микроба FI

Глава 5. ИССЛЕДОВАНИЕ (ПРИ ВЗАИМОДЕЙСТВИИ С Y.PESTIS EV IN VITRO) ФУНКЦИОНАЛЬНО-МЕТАБОЛИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ЭЛЕКТРОФОРЕ-ТИЧЕСКИ ГЕТЕРОГЕННЫХ СУБПОПУЛЯЦИЙ ФАГОЦИТОВ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА

5.1. Исследование (при взаимодействии с Y.pestis EV in vitro) функциональной активности электрокинетически гетерогенных субпопуляций нейтрофильных лейкоцитов

5.2. Исследование (при взаимодействии с антигенами Y.pestis EV in vitro) метаболической активности элек-трофоретически гетерогенных субпопуляций моноцитов 106

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 126

ВЫВОДЫ 138

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

140

УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ

Р1 - капсульный антиген чумного микроба

п - количество экспериментальных моделей

р - вероятность ошибки

г - коэффициент корреляции

Эг - погрешность коэффициента корреляции

Г-6-ФДГ - глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа

ЛДГ - лактатдегидрогеназа

ЛФ - лимфоциты

МДГ - малатдегидрогеназа

Мн - моноциты

МФ - мононуклеарные фагоциты

МФС - система мононуклеарных фагоцитов

НФ - нейтрофильные лейкоциты

ОСА - основной соматический антиген чумного микроба

ПФП - пентозофосфатный путь

СДГ - сукцинатдегидрогеназа

№ Фр - номер фракции

ЭФП - электрофоретическая подвижность

ВВЕДЕНИЕ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Совершенствование специфической профилактики чумы является одной из актуальных задач иммунологии. Решение этой проблемы требует комплексного подхода, который включает в себя исследование механизмов формирования противочумного иммунитета. Фундаментальными исследованиями ряда ученых (Пустовалов В.Л. с соавт.,1984; Васильева Г.И. с соавт.,1990-1998; Ледванов М.Ю. с соавт., 1990-1997; Веркина Л.М., 1994) было доказано, что течение вакцинного и инфекционного процессов при чуме в значительной степени зависит от исхода взаимодействия клеток макрофагального звена с возбудителем инфекции.

К настоящему времени изучено влияние чумного микроба и его антигенов на ряд функциональных, метаболических и морфологических изменений клеток системы мононуклеарных фагоцитов (СМФ). Современные представления о роли клеток СМФ основываются на их гетерогенности по функциональной активности, экспрессии поверхностных структур, регуляторным и эффекторным свойствам. Мононук-леарные фагоциты выполняют множество функций в большинстве из которых участвует клеточная поверхность и большое количество мембран-связанных плазматических молекул клеток (рецепторы к Рс-части иммуноглобулина, к компонентам комплемента, к терминалу сахарных остатков и т.д.). Необычайная сложность проблемы гетерогенности фагоцитарных клеток требует разработки новых нетрадиционных подходов к ее анализу. Одним из методов тестирования функционального состояния клеток СМФ является определение их элек-трофоретической подвижности (ЭФП), обусловленной величиной электрического заряда клеток. Электрический заряд, структура по-

верхностной мембраны и функциональные свойства клетки находятся в тесной взаимосвязи. Метод проточного распределительного клеточного электрофореза в свободном потоке дает возможность изучить характер изменений ЭФП клеток под действием на организм или непосредственно на мононуклеарные фагоциты различных антигенов и вакцин. В работах ряда исследователей (Ермакова Г.В.,1982; Корсуков В.Н.,1984; Ледванов М.Ю., 1984; Тихомирова Л.А.,1985; Тихомирова Е.И.,1990) показана возможность использования данного метода в качестве важного иммунологического критерия, характеризующего изменения ЭФП лимфоцитов в процессе иммуногенеза к чуме. Тем не менее, нами не было найдено работ, касающихся динамики изменений ЭФП фагоцитирующих клеток при формировании иммунитета к чуме. Неизвестна популяционная и функциональная гетерогенность фагоцитов, различающихся по признаку электрофоретиче-ской подвижности. Известно, что популяции клеток СМФ различаются по экспрессии ключевых ферментов окислительного и гликолитиче-ского пути метаболизма (Хаитов P.M., 1995). Однако сравнительной оценки биохимических показателей электрокинетически гетерогенных популяций фагоцитов при взаимодействии с различными штаммами чумного микроба до настоящего времени не проводилось.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ: изучить влияние чумного микроба и его антигенов на функционально-метаболическую активность электрокинетически гетерогенных популяций фагоцитирующих клеток, определить возможность использования показателей электрофоретической подвижности фагоцитов для оценки иммунобиологических свойств чумного микроба и его антигенов, а также иммуномониторинга противочумного вакцинного процесса.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

2. Определить характер и количественные критерии изменения электрофоретической подвижности перитонеальных макрофагов при взаимодействии in vitro с клетками Y.pestis EV.

3. Изучить влияние иммунизации мышей и морских свинок основным соматическим и капсульным антигенами Y.pestis на изменение электрофоретической подвижности перитонеальных макрофагов.

5. Провести сравнительный анализ изменений ключевых ферментов пентозофосфатного пути обмена углеводов (глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы), цикла Кребса (сукцинатдегидрогеназы) и гликолиза (лактатдегидрогеназы) в электрокинетически гетерогенных фракциях фагоцитов в динамике взаимодействия с основным соматическим и капсульным антигенами Y.pestis.

6. Изучить функциональную активность электрокинетически гетерогенных популяций макрофагов при взаимодействии in vitro с клетками Y.pestis EV.

7. Определить возможность использования показателей электрофоретической подвижности фагоцитов для оценки иммунобиологических свойств чумного микроба и его антигенов, а также для иммуномонито-ринга противочумного вакцинного процесса.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые с использованием свободного распределительного клеточного электрофореза в потоке показано, что иммунизация белых мышей вакцинным штаммом Y.pestis EV сопровождается снижением электрофоретической подвижности основного пула перитонеальных макрофагов и появлением электрофоретически гетерогенных популяций. Обнаружено, что изменения электрокинетических свойств макрофагов в процессе иммуногенеза к чуме зависят от генотипа животных. Инбредная линия мышей CC57W реагирует меньшим, по сравнению с беспородными, снижением электрофоретической подвижности (ЭФП) макрофагов. Выявлены характерные для линии CC57W особенности формирования электрофоретически гетерогенных популяций перитонеальных макрофагов.

Впервые установлено, что иммунизация белых мышей основным соматическим и капсульным антигенами чумного микроба вызывает снижение ЭФП основной массы макрофагов, формирующих в большинстве сроков исследования две электрофоретически различающиеся популяции. Капсульный антиген обладает более выраженной, по сравнению с основным соматическим, способностью снижать ЭФП фагоцитов. Макрофаги неиммунизированных морских свинок формируют пять электрофоретически гетерогенных популяций. Иммунизация морских свинок капсульным антигеном сопровождается резким снижением ЭФП макрофагов и преобладанием трех элекрофоретически различающихся популяций клеток.

антигенами Y.pestis EV сопровождается характерными изменениями конфигурации кривой распределения макрофагов по электрофорети-ческой подвижности.

Впервые исследован в электрокинетически гетерогенных популяциях фагоцитов характер изменений активности ключевых ферментов углеводного обмена. Показано, что взаимодействие in vitro антигенов чумного микроба с моноцитами крови людей сопровождается снижением их электрофоретической подвижности и увеличением внутриклеточной активности ключевых ферментов пентозофосфатного пути обмена углеводов - глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и гиколитического пути - лак-татдегидрогеназы. Под влиянием капсульного антигена активность сукци-натдегидрогеназы снижается. Внутри общего пула выделенных моноцитов максимальные ферментативные активности регистрируются в субпопуляциях, характеризующихся более высокой электрофоретической подвижностью.

Комплексный анализ функциональной (фагоцитарного индекса и фагоцитарной активности) и метаболической активности различных типов фагоцитов позволил выявить наличие стереотипной реакции мембран в процессе активации клеток, выражающейся в снижении их электрокинетического потенциала.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Определены количественные критерии изменений электрофоретической подвижности мак-

рофагов, нейтрофильных лейкоцитов и моноцитов при контакте in vivo и in vitro с чумным микробом и его антигенами. Расширены границы области практического применения проточного клеточного распределительного электрофореза для изучения функциональной активности отдельных популяций фагоцитирующих клеток. Показана эффективность использования тестирования электрофоретической подвижности фагоцитов для характеристики иммунобиологических свойств антигенов чумного микроба и иммуномониторинга противочумного вакцинного процесса. Метод определения электрофоретической подвижности фагоцитирующих клеток (тестирование формирования электро-кинетически гетерогенных популяций фагоцитов) рекомендуется для использования на этапах испытания новых или усовершенствованных противочумных вакцинных препаратов, а также при составлении рациональных схем иммунизации и при экспериментальной разработке патогенетически обоснованных способов иммунокоррекции.

ВНЕДРЕНИЕ В ПРАКТИКУ. По материалам экспериментальных исследований составлены методические рекомендации: "Оценка попу-ляционного состава клеток системы мононуклеарных фагоцитов методом разделительного клеточного электрофореза", которые были обсуждены и одобрены Ученым Советом РНИПЧИ "Микроб" (протокол №15 от 19 ноября, 1996г), утверждены директором 19 ноября, 1996г. Метод применяется в научных исследованиях на кафедре гистологии (СГМУ), НИИ кардиологии при СМУ, 5-ой детской объединенной инфекционной больницы г.Саратова, о чем имеются соответствующие акты о внедрении. Материалы диссертационного исследования используются при чтении лекций на курсах специализации врачей по особо опасным инфекциям и курсах усовершенствования врачей-

бактериологов и иммунологов общей медицинской сети (при институте "Микроб").

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

^Характеристика основных закономерностей влияния in vivo и in vitro чумного микроба на функционально-метаболическую активность электрокинетически гетерогенных субпопуляций фагоцитирующих клеток.

2.Зависимость изменения электрокинетических свойств макрофагов в процессе иммуногенеза к чуме от генотипа животных.

3.Новые данные сравнительного анализа электрокинетических свойств макрофагов, моноцитов, нейтрофильных лейкоцитов при взаимодействии с основным соматическим и капсульным антигенами чумного микроба.

4.Новые данные сравнительного анализа изменений активности ферментов углеводного обмена (глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, сукцинатдегидрогеназа, лактатдегидрогеназа, малатдегидрогеназа) в электрокинетически гетерогенных субпопуляциях фагоцитов в динамике иммунногенеза к чуме.

5.Установление обратной коррелятивной зависимости между функционально-метаболической активностью фагоцитов и их электрокинетической подвижностью.

6.Доказательства эффективности использования свободного распределительного клеточного электрофореза для оценки популяцион-ной гетерогенности и функциональной активности клеток системы мо-нонуклеарных фагоцитов в динамике иммуногенеза к чуме.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации представлены: -на межгосударственной научной конференции, посвященной 100-летию открытия возбудителя чумы, Алматы, 1994;

-на научной конференции, посвященной 60-летию Иркутского ПЧИ, Иркутск, 1994;

-на итоговой научной конференции в РНИПЧИ "Микроб", Саратов, 1994;

-на международной конференции по иммунореабилитации, Дагомыс, 1994;

-на международной конференции "Гомеостаз и инфекционный процесс", Саратов, 1996;

-на научно-практической конференции, посвященной 100-летию образования противочумной службы России, Саратов, 1997; -на съезде аккушеров-гинеколов, Самара, 1997; -на Российской научной конференции "Человек и здоровье", С.Петербург, 1997.

Диссертация обсуждена и одобрена на расширенной научной конференции лаборатории иммунологии РосНИПЧИ "Микроб" в 1998г.

ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 17 научных работ.

ГЛАВА 1. ЭЛЕКТРОКИНЕТИЧЕСТКИЙ ПОТЕНЦИАЛ ИММУНОКОМПЕ- I/ ТЕНТНЫХ КЛЕТОК И ЕГО ИЗМЕНЕНИЕ В ПРОЦЕССЕ ИММУНОГЕНЕЗА (обзор литературы)

Явление электрофореза - направленного перемещения электрически заряженных частиц дисперсной фазы в дисперсионной среде под действием внешнего электрического поля, было открыто профессором Московского университета Ф.Ф.Рейссом в 1807 году. Электрокинетические явления, к которым относится электрофорез, обусловлены наличием на границе раздела фаз двойного электрического слоя и способностью диффузной части этого слоя смещаться относительно адсорбционно-связанной его части. Электрический потенциал поверхности, разделяющей подвижную и неподвижную части двойного электрического слоя, носит название электрокинетического или г; (дзета)-потенциала. Частицы дисперсной фазы, находящиеся в буферном растворе, несут определенный суммарный электрический заряд, величина и знак которого зависят от величины pH сре

Информация о работе

Фирстова, Виктория Валерьевна
кандидата биологических наук
Саратов, 1998
ВАК 03.00.07

Диссертация

Влияние чумного микроба и его антигенов на функционально-метаболическую активность электрокинетически гетерогенных субпопуляций фагоцитов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы