Микрофлуориметрическое исследование в потоке гетерогеннных популяций бактерий Y. pestis и клеток иммунной системы инфицированных чумой лабораторных животных

Кравцов, Александр Леонидович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Микрофлуориметрическое исследование в потоке гетерогеннных популяций бактерий Y. pestis и клеток иммунной системы инфицированных чумой лабораторных животных
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Микрофлуориметрическое исследование в потоке гетерогеннных популяций бактерий Y. pestis и клеток иммунной системы инфицированных чумой лабораторных животных"

га од

2 ПОП Щ1

На правах рукописи

КРАВЦОВ Александр Леонидович

МИКРОФЛ У ОРИ МЕТРИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ В ПОТОКЕ ГЕТЕРОГЕННЫХ ПОПУЛЯЦИЙ БАКТЕРИЙ

У.РЕБТ^ И КЛЕТОК ИММУННОЙ СИСТЕМЫ ИНФИЦИРОВАННЫХ ЧУМОЙ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ

03.00.07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Саратов 1997

Научные консультанты:

доктор медицинских паук, профессор С.Л. Короикпн

Официальные оппоненты: доктор медицинских паук, профессор Д.Ф.Зыкпн доктор биологических паук, доцент В.И.Панасенко доктор медицинских наук, профессор 13.И. Веннблат

Ведущая организация: Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт

Автореферат разослан «14» ноября 1997 г. Защита состоится «18» декабря 1997 г. в 13 часов на заседании специализированного Совета Д 074.32.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Российском научно-исследовательском противочумном пнститз'те «Микроб» ( 410005 г. Саратов, ул. Университетская, 46).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РосНИПЧИ

«Микроб».

Ученый секретарь Диссертационного Совета,

доктор биологических наук, профессор Г.А.Корнеев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изыскание путей и способов борьбы iyмной инфекцией по-прежнему остается актуальной проблемой, четное решение которой неразрывно связано с исследованием иетического аппарата » антигенных свойств чумного кроба,изменяющихся в природных условиях, в организме ;пернменталышх животных и в процессе культивирования 1.И. Жуков-Вережннков,1940; И.В.Домарадскнй, 1967; В.И. ннблат, (974; П. И. Анпснмов, 1990; Л.В. Самойлова, (990; С.А. ■бедева с соавт.,1993; О.В. Шеремет, i994; И.А. Дятлов, А.Ф. нлпипов, 1994/, а также сизучеппемтопких клеточных механизмов алпзацнпестественного н приобретенногопротнвоч}'мпогоиммунитета Е.И.Коробкова, 1960; Г.Г. Коробков, 1967; Н.В. Олькова, 1974; .М.Пени,1985; Е.И. Тихомирова, 1989; Г.И. Васильева,1990; В.Исуповссоавт., 1990; Л.С.Назарова ссоавт., 1990; Н.Ю.Стукова, 91; М.Ю.Ледванов, 1993/.

В последние годы нарастающий ноток сообщений о неоднородности ктерпальных популяций по состоянию генетического аппарата □держанию ДИК на клетку от 1 до 4 и более полных хромосом), овнго продукции на клетку суммарного белка и специфических верхностных антигенов, а также о зависимости степени этой однородности от стадгш роста культуры и вирулентности тогенных микроорганизмов/Н.В. Steenetal., 1980,1982; E.Boye al., 1983; R.L. Tyndall et al., 1985; A.P. Phillips,K.L. Martin, 87; O.A. Адамов, A.Л. Кравцов с соавт., 1995/, заставляет думаться о необходимости и практической значимости количественног о нтроля за содержанием биологически активных веществ в ктериях Y. pestis на дифференциальном уровне - по большой (борке отдельных клеточных элементов.

На функциональной гетерогенности основываются также временные представления о роли различных типов клеток иммунной стемы при чуме и других инфекциях, ответственных за реализацию ецифическнх / В.М.Земсков,1989; Г.И. Васильева, 1990; А.В яумов с соавт., 1092; М.Ю. Ледваиов, 1993/'и иеспецифнческих D.A. Bassetal., 1983; C-F. Bassoe et al., 1984/механизмов защиты, гемотря на противоречивость взглядов относительно причин

(|)y 11 Kill к) 11 cL'i 111 it) i i нтдпородпипн популяции бактерий п клеток пммуино системы микроорганизма, в настоящее время общепризнана актуальность псследоиаппм, направленных ма изучение процесса клеточного взаимодействия с: учетом этого явления, так как усреднение результатов анализа может привести к потере информации и к ошибочным выводам /II.S Knitli, 1982; М. Lepoivrf al., 1986; Г.И. Васильепа, 1990/.

Для изучения гетерогенных клеточных взвесей применяй фракционирование их на субпопуляции с помощью различны препаративных методов. Однако, чтобы избежать больших клеточны потерь, достигающих иногда до 50 % исходного суммарного пула, также недостаточно изученных сдвигов в клеточных параметрах па влиянием препаративных процедур, исследователи все чаще отдак предпочтение альтернативным цитологическим методам контроля г функциональными параметрами фенотипически неоднородны клеточных популяций, основанным на принципе импульсно проточной цитометрин биологически активных внутриклеточны веществ /M.R. Loken, 1980; W.R. Abrams et al., 1983; C-F. Basse et al., 1984; K.A. Muirhead et al., 1985; E. Engli et al., 1992/.

Эта качественно новая технология клеточного анализ: позволяющая быстро получать, рассчитывать и сравнивать профил статистических распределений десятков тысяч отдельных клеток г самым различным биохимическим и морфологическим показателям на протяжен пи 30 лет специально создавалась для изучения процессе клеточного взаимодействия in vivo и in vitro на субпопуляционно! уровне. Результаты многочисленных испытаний проточной микр< флуориметрии при контроле за иммунным статусом пациентов в процессе ииднвидз'альной терапии гемобластозов и онкологически заболеваний, а также при их дифференциальной диагностике прогнозировании, доказали более высокую информатнвност] достоверность и производительность этой технологии по сравнена с субъективными морфологическими и усредненными биохимическим методами исследования /O.D. Laerum, Т. Farsund, 1981; Н. Kruth, 1982; В.Л. Исаков с соавт., 1988/.

В 80-х годах, с внедрением импульсной проточной цитометри в микробиологию и инфекционную иммунологию, открылись новь горизонты для дальнейшего совершенствования лабораторис диагностики, иммунопрофилактики и лечения иифекцнонны

заболеваний • Е. Boye et aL, 1983; К.А. Muirhead, 1985/. В части (кти, к общепризнанным уникальным возможностям микрофлуори-метрнческого анализа относятся: самая быстрая детекция и специфическая идентификация микроорганизмов в крови и пробах из объектов внешней среды с порогом чувствительности (О3 м.к./мл /J.D.Mansour et al., 1985/; контроль за процессом репликации ДНК и профилем распледеления бактерий но числу хромосом в оптически неплотных культурах для быстрой оценки чувствительности к антибиотикам без наращивания бактериальной массы /Н.В. Steenetal., 1982; O.V. Martinez et al., 1982/; дифференцирование вирулентных и авлрулентных штаммов патогенных бактерий по долевому соотношению в стационарных культурах клеток с низким и высоким содержанием хромосом и специфических поверхностных антигенов /R.L. Tyndall et al., 1985/; обнаружение in vivo и in vitro эукариотических клеток, зараженных внутриклеточными паразитами (бактерии и вирусы) с разрешающей способностью 5 % в суммарном пуле /J.Dunn et al., 1978; J.W. Whaun et al., 1983/, a также автоматический динамический контроль за показателями фагоцитарной реакции на субпоиуляционном уровне в культурах макрофагов/А.В. Филатов с соавт., 1983; М. Lepoivre et al., 1986/ и лейкоцитов /D.A. Bass et al., 1983; C-F. Bassoe et al., 1984/.

Являясь в настоящее время одной из самых информативных и перспективных технологий клеточного анализа /К.А. Muirhead et al.,1985; А.И.Полетаев с соавт., 1987; В.Л.Исаков с соавт.,1988 /, проточная микрофлуорнметрия не применялась для изучения бактерий Y. pestis, а также для исследования функциональных сдвигов в клетках иммунной системы вакцинированных и зараженных чумой лабораторных животных.

Цель работы: создание экспериментально-методической основы для контроля за функциональными сдвигами в неоднородных культурах бактерий Y.pestis и гетерогенных популяциях клеток иммунной системы инфицированного чумой макроорганизма на уровне больших выборок отдельных клеточных элементов.

Основные задачи исследования:

1. Провести комплексное исследование возможностей современных автоматических мнкрофлуорнметрнческнх систем и цитологических методов контроля за физиологическим состоянием

прокариотпчсских н эукарпотпческих клеток « фепотипич гетерогенных популяциях.

2. Оптимизировать условия процесса измерения содержания Л суммарного белка п специфических поверхностных антигет бактериях Y. peslis, а также автоматической сортировки отдель клеток неоднородной бактериальной взвеси по этим параметр импульсном режиме анализа.

3. Исследовать и сравнить состояние генетического аипа[ клеток чумного микроба в оптически плотной стационарной куль* и в лаг-фазе роста бактериальной нопуляцин. Установить xapai воздействия ингпбнрующен дозы антибиотика стрептомицина процесс перераспределения отдельных бактерии по клеточному ци в оптически неплотных взвесях.

4. Разработать быстрый способ идентификации кле чумного микроба, основанный на принципе автоматической сортиро гомологичных и гетерологнчных микроорганизмов в потоке уровню интенсивности ах иммунофлуоресценцни. Исследов возможность использования результатов количествешь пммунофлуоресцентного налнза для дифференцирования штам! возбудителя чумы с различными илазмидными профилями.

5. Установить долевое распределение перитонеальных макрофа в организме ннтактных морских свинок по фазам клеточного цик Оптимизировать условия детекции ДНК бактерий Y.pestis внут активных макрофагов и разработать способ проточно-ци' флуориметрнческого мониторинга за уровнем содержания ДН1< инфицированных чумой фагоцитах для контроля за характерол неходом фагоцитарной реакции в условиях in vitro.

6. Разработать способ контроля за уровнем пролиферативн активности лейкоцитов в крови и органах иммунной систе( инфицированных чумой лабораторных животных, основанный определении относительного количества клеток гетерогенного пу на стадиях синтеза ДНК, предмитоза и митоза. Исследовать сравнить сдвиги по этому показателю при чумном вакцинальном остром инфекционном процессах.

7. Провести на уровне отдельных клеток и их субпопуляцн в одинаковых условиях измерения, сравнительное псследоваш состояния лнзосомалыюго аппарата лейкоцитов в цельной Kpoi людей, некоторых видов чувствительных к чуме грызунов

нечувствительных к заражению чумой крупных млекопитающих (собак н лошадей).

8. Изучить сдвиги в цнтофлуорпметрпческнх показателях активности хроматина и лизосомальной системы лейкоцитов крови у лабораторных животных, иммунизированных штаммами У. резНэ, отличающимися по нлазмндиому составу и уровню нммуногенностн.

Научная новизна. Впервые с использованием проточно-цитофлуориметрического измерения относительного содержания ДНК в отдельных бактериях У.реэиз установлена возможность контроля за перераспределением их по клеточному циклу в процессе культивирования, за степенью неоднородности популяции клеток чумного микроба по состоянию генетического аппарата отдельных клеточных элементов. Обнаружено, что при отсутствии в среде антибиотика стрептомнцнна, ннгибнрующего процесс размножения клеток вакцинного штамма ЕВ, уровень содержания ДНК в подавляющей доле бактерий У. pest¡s (не менее 50 %) увеличивается в 2-4 раза в интервале времени от 3 до б ч - до перехода кулмуры из стационарной в быструю экспоненциальную фазу роста. К 6 ч культивирования в оптнческн неплотных бактериальных взвесях зарегистрировано появление клеток с повышенным содержанием суммарного белка и специфических поверхностых антигенов, детерминируемых плазмндой рРга чумного микроба.

Впервые разработан быстрый способ идентификации клеток У. реБМэ и их дифференциальной диагностики от близкородственных бактерий псевдотуберкулеза, основанный на измерении интенсивности иммунофлуоресценцнн и на автоматической сортировке десятков тысяч отдельных бактерий по этому параметру не на 4 субъективных З'ровня (от «+» до «+-Н-+» при люминесцентной мнкроскопнн), а на 512 одинаковых количественных уровней интенсивности свечения (каналов амплитудного анализатора импульсов). Установлено, что сравнительный анализ профилен статистических распределений отдельных клеток чумного микроба но содержанию специфических поверхностных аитпгеиов до и после 6 ч подращивания при 37°С позволяет дифференцировать штаммы изогенной системы, лишенные рРга и/либо рРз!:, от полноценного по плазмндному составу вакцинного штамма ЕВ.

Впервые в 0111,11 ах с нерптонеальпымн макрофага1> культиинрусмымп in vitro с чумным микробом, оптнмнэнрова условия процесса намерения, позволяющие обнаруживать появле! бактериальной ДИК в активных фагоцитах на фоне постоянн содержания ДИК (2с) в псактниных диплоидных макрофаг Разработан способ мониторинга развития фагоцитоза ну идентификации нарастания поглощения микробов, их внутрнклеточн переваривания, а также за счет автоматического дифференцнрова! фагоцитов с неповрежденными п поврежденными ядрами 110 ypoi интенсивности ДИК флуоресценции.

Установлено, что динамика изменении относительного ко чества ДНК в макрофагах в условиях in vivo и in vitro завн от вирулентности штамма чумного микроба.

Впервые разработан микрофлуориметрлческий метод контроля in v за уровнем активности процесса пролиферации нммунокомпетенти клеток у инфицированных чумой лабораторных жнвотш учитывающий характер долевого распределения их в гетерогеш популяции на стадиях Gt/Go, S 11 G2+M клеточного цикла качестве показателя степени интенсивности процесса репродук1 лейкоцитов в вакцинированном и зараженном чумой оргаипз уровня иммунологической реагируемостн со стороны иммуш системы в ответ на антнгепную стимуляцию, предложено нспользов сдвиги в относительном количестве ДНК-сннтезирующих н делящп: клеток (S+G2+M, в %). Установлено, что формированию нриобрет ного иротивочз'много иммунитета у морских свинок, иммуннзнропаки протектнвной дозой вакцинного штамма ЕВ чумного мнкро предшествуют умеренные сдвиги (1,5-2 раза) по этому показате в крови и органах иммунной системы, в отличие от резкого непрерывного повышения уровня пролифератнвной активно! нммунокомпетентных клеток (в 4-6 раз) у зараженных особе первые трое суток развития острого чумного инфекцношг процесса с летальным исходом на 3-5 сутки.

Впервые с использованием автоматического мнкрофлуо-риметрическ анализа проведено сравнительное исследование состояли лнзосомального аппарата лейкоцитов крови людей, пяти вп; чувствительных к чуме грызунов, а также двух нечувствительны заражению 43'мой крупных млекопитающих.

У собак и лошадей, в отличие от человека и грызунов, об

ружепо две губпонуляцни грапулоцнтшз кропи с различным содержанием лизосом на клетку - наличие очень высокой степени неоднородности по состоянию лпзосомального аппарата в суммарном пуле лейкоцитов. Для всех чувствительных к чуме лабораторных грызунов, кроме однородности суммарного пула фагоцитов по лпзосомальным свойствам, характерен дефицит лизосомальных гранул в фагоцитах крови по сравнению с людьми, собаками и лошадьми.

Установлено, что низкий уровень аккумуляции молекул флуорохрома акридинового оранжевого в лизосомах фагоцитов грызунов (особенно мышей) коррелирует с дефицитом в них азурофпльиых гранул, несущих лейкоцитарнуюэластазу ЕСЗ.4.21.11. Уровень активности эластазы, выполняющей физиологическую функцию гидролиза гидрофобных термостабильных структурных белков бактерий в фагоцитах, более чем на порядок различается у высокочувствительных и нечувствительных к чуме видов животных. Для изученной группы лабораторных грызунов (мышей, морских свинок, крыс и кроликов) этот биохимический показатель строго коррелирует с интенсивностью внутриклеточного киллинга чумного микроба лейкоцитами крови и с уровнем их видовой естественной резистентности к чуме.

Впервые в процессе формирования противочумного иммунитета Зг лабораторных животных, с использованием микрофлуоримет-рнческого анализа, обнаружены конформационные изменения в ДНК лейкоцитов крови, связанные с функциональной активацией их центрального генетического аппарата (хроматина), а также сдвиги в лизосомальном аппарате фагоцитов на субнопуляционном з'ровне.

Установлено, что характер клеточной реакции по этим двум параметрам в условиях in vivo зависит от плазмидного профиля и уровня иммуногенностц штамма изогенной системы, используемого для иммунизации лабораторных животных. Только у двух наиболее протективных штаммов КМ 226 и ЕВ НИИЭГ, одновременно несущих pFra и pCad, независимо от вида чувствительного к чуне организма, выявлена способность активировать центральный генетический аппарат иммунокомпетеитных клеток в стерильной фазе иммуногенеза.

Практическая значимость работы заключается в разработке н внедрении в практику научных исследований новых принципов

и методов клеточного анализа, учитывающих функциональные параметры большого числи пндноидуалышх клеток в сложных re терогеппых популяциях: для лабораторной диагностики чумногс микроба п характеристики сиененн неоднородности культур возбудителя чумы по антигенным свойствам и состоянию генетического аппарата клеточных элементов; для оценки воздействия штаммов Y. peslis с различными биологическими свойствами на организм восприимчивых к чуме животных но уровню сдвигов е нролнфератпвпой активности лейкоцитов крови и центральных органов иммунной системы, а также но способности их активировать, лнбе повреждать хроматин иммунокомнетентных клеток; для контроля за характером и исходом фагоцитарной реакции в условиях in vitre с использованием профилей ДНК-гистограмм; для сравнительного исследования состояния лизосомалыюго аппарата лейкоцитов крови на субпопуляционном уровне у животных с различной естественной резистентностью к чуме и контроля за сдвигами пс этому показателю при чумном вакцинальном и инфекционном процессах.

По материалам диссертационной работы оформлено две заявки на изобретения, на которые Государственным Комитетом СССР по делам открытии и изобретений выданы авторские свидетельства: "Способ постановки реакции иммунофлуоресценции" N 1220176 от 22.11.85 г. и "Способ оценки фагоцитоза" N1522923 от 15.07.89 г.

Результаты исследований, представленные в диссертации, использованы при разработке методических рекомендаций:

1) •«Определение синтезирующих ДНК и делящихся клеток методом проточной цитометрии» (утверждены МЗ СССР 28 июня 1988 г.);

2) «Быстрая оценка специфической активности иммуноглобулинов диагностических чумных люмннеецпрующнх методом импульсной проточной цитометрин (утверждены Ученым советом РосНИПЧИ «Микроб» 26 октября 1987 г.);

3) 4 Быстрая оценка модулирующего действия фосфолипазы Д чумного микроба на клетки крови с помощью проточной цнтометрии» (утверждены Ученым советом РосНИПЧИ «Микроб» 30 июня 1992 г.).

Методы, разработанные в ходе выполнения диссертационной работы, включены в методическое пособие « Современные методы диагностики особо опасных инфекции н способы их применения»,

утвержденное ГС У Минздрава СССР 25 сентября 1991 г., а также в руководство «Иммунология чумы» (Саратов, 1992). Они включены в учебную программу, используемую при чтении лекции на курсах специализации и повышения квалификации врачей и биологов по особо опасным инфекциям при Рос11И11ЧИ « Микроб» (лицензия N 16-098 выдана Государственным Комитетом России по высшему образованию).

Априбацпя работы и публикации. Материалы диссертации доложены и обсуждены на: Всесоюзной конференции «Молекулярная биология, генетика н иммунология возбудителен ООИ (Ростов-на-Дону, 1984 ); Всесоюзном симпозиуме, посвященном 60 -летию Тбилисского НИИ ВС (Тбилиси, 1984); Всесоюзном совещании молодых ученых противочумных учреждении СССР (Саратов, 1986); Всесоюзной научной конференции «Механизмы нротивоинфекционного иммунитета (Саратов, 1987); III Республиканской конференции «Автоматизация цитологических исследований (Киев, 1988); Всесоюзной научно-практической конференции (Владивосток, 1989); научной конференции «Лабораторные животные для медико-биологических и бнотехнологнческих исследований (Москва, 1990); II Международном симпозиуме «Реабилитация иммунной системы» (Цхалтубо, 1990); Всесоюзной конференции «Молекулярные механизмы развития инфекционных заболевании» (Звенигород, 1990); научной конференции « Актуальные вопросы вакцинонрофнлактикн при ООИ (Киров,1992); 8-ом Международном конгрессе иммунологов (Будапешт, 1992); Российской научной конференции «Генетика и биохимия вирулентности возбудителен особо опасных инфекций» (Волгоград, 1992); Российской конференции «Иммунология и специфическая профилактика ООИ (Саратов, 1993); 1-м Интернациональном конгрессе но нммунореабнлитации (Цхалтубо, 1994); Интернациональном симпозиуме по новым методам исследования н стандартизации в микробиологии (Словакия, 1996); VII сьезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 1997); научных конференциях Российского научно-исследовательского противочумного института «Микроб».

Материалы диссертации вошли в научные отчеты по законченным НИР, выполнявшимся в соответствии с планами Министерства здравоохранения в период с 1985 по 1996 год. Они

опубликованы в 50 научных работах, и том числе в центральной п зарубежной печати.

Объем н структура работы. Диссертация изложена на 239 стр.машинописи, иллюстрирована 8 таблицами и 38 рисунками, состоит из введения, I главы обзора литературы, описания материалов и методов, 4 глав, отражающих результаты собственных исследований по теме, заключения и выводов. Указатель литературы содержит 115 отечественных и 136 иностранных источников.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Оптимальные условия проточной микрофлуорнметрип в отдельных клетках уровня содержания ДНК, лнзосом и специфических поверхностных антигенов для получения информации о степени и характере неоднородности клеточных популяций по этим параметрам на субпокуляционном уровне.

2. Существование различий в состоянии генетического аппарата у бактерий вакцинного штамма ЕВ Y.pestis в оптически плотной стационарной культуре н в лаг-фазе роста популяции при концентрациях ниже 108 м.к./мл. Возможность использования проточной цитометрии для контроля за перераспределением клеток чумного микроба по клеточном}' циклу в процессе культивирования.

3. Количественное измерение в потоке уровня интенсивности иммунофлуоресценции десятков тысяч отдельных бактерий Y.pestis, автоматическая сортировка клеточных элементов по этому параметру с построением иммунофлуоресцентных гистограмм - быстрый и эффективный способ их специфической идентификации и дифференциальной диагностики от близкородственных бактерий псевдотуберкулеза, а также дифференцирования полноценных по плазмидному составу штаммов возбудителя чумы от штаммов, дефектных по признакам pFra и pPst.

4. Вирулентный штамм 231 чумного микроба, в отличие от вакцинного ЕВ НИИЭГ, повреждает хроматин нммунокомпетентных клеток и нарушает регуляцию умеренного процесса репродукции лейкоцитов в организме зараженных чумой животных. Это отражается в достоверном повышении вариации по уровню содержанию ДНК на клетку в диплоидной субпопуляции лейкоцитов, а также в быстром и резком нарастании относительного количества ДНК-сннтезирующих

и делящихся клеток в крови и органах иммунной системы.

5. Доказательства возможности осуществлять мониторинг развития фагоцитоза чумного микроба in vitro с помощью нроточ-поцитофлуориметрического определения в фагоцитах содержания ДНК. Информативность профилей ДНК-гистограмм сточки зрения дифференцирования вакцинного н вирулентного штаммов чумного микроба по уровню геиотокснчности, а также прогнозирования исхода фагоцитарной реакции.

6. Существование дефицита лнзосом, способных к аккумуляции флуорохрома акридинового оранжевого, в фагоцитах крови грызунов, в отличие от людей, собак и лошадей. Особенность устройства на субпопуляционном уровне лизосомалыюго аппарата гранулоцитов крови у нечувствительных к чуме крупных млекопитающих, отличающая их от человека и грызунов.

7. Наличие у наиболее протектнвных вакцинных штаммов чумного микроба КМ 226 и ЕВ НИИЭГ, одновременно несущих pFra и pCad, способности активировать центральный генетический аппарат (хроматин) лейкоцитов крови мышей и морских свинок в стерильной фазе иммуногенеза и отсутствие такой способности у б менее протектнвных штаммов изогенной системы с иными илазмнд-ными профилями.

При выполнении раздела работы, связанного с изучением воздействия бактерий Y.Pestis на клетки иммунной системы макроорганизма, осуществлялось тесное сотрудничество со специалистами различных лабораторий РосНИПЧИ "Микроб" (Т.Ю.Ледванова, H.A. Синичкина, Н.И.Луникова, Г.В.Ермакова, Г.П.Шведун) и Гиска им Л.А.Тарасевнча (Л.В.Саяпина, Т.И.Анисимова), атакжеНИИЭМ им Н.Ф.Гамалеи (Г.Б.Кириличева, И.Г.Батурина) п клиники гематологии Саратовского медицинского университета (О.Е.Царева, В.Ю.Степанова). Всем им автор выражает глубокую благодарность за методическую помощь в опытах на различных видах лабораторных животных. Автор выражает глубокую признательность и благодарность член-корреспондентам АЕН, докторам медицинских наук, профессорам A.B. Наумову и Ледванову М.Ю. за поддержку и ценные советы в процессе выполнения и написания диссертационной работы.

СОДЕРЖАНИЕ РАНО ТЫ

Материалы п методы исследовании. Работа выполнена использованием полноценного по илазмидному составу вакц ного штамма Y. pesiis 1£В НИИЭГ, семи его изогеиных пропзвод] с различными плазмидными профилями (табл.О, а Tai вирулентного штамма Y. pestis 231. В опытах по специфичес идентификации клеток чумного микроба для контроля нспользов штамм E.coli К 12 и шесть штаммов Y. psedotuberculosis I-V сероваров.

В качестве основных экспериментальных животных нспользов морских свинок и беспородных белых мышей. Кроме того, сранителыюм изучении состояния лизосомалыюго аппарг лейкоцитов объектом исследования служили здоровые люди, болы лимфобластиым и мнелобластиым лейкозами, а так экспериментальные животные с различным уровнем естествен! резистентности к чуме /Н.В.Олькова, 1974/, в нейтрофилах кр которых обнарз'жены видовые различия в степени активно биохимического маркера воспаления - эластазы ЕС 3.4.21.11 /J Vassalli et al., 1978; В.М. Ashe, М. Zimmerman, 1982/ : лннейн мыши C57BL/6J, BALB/c п СВА, кролики, золотистые хомя белые крысы, собаки н лошади.

Чз'мные микробы выращивали на агаре и бульоне Хоттингера ( 7,2) при 28 и 37 0 С в течение 24-48 ч.Из оптически плотных t цнонарных культур методом последовательных разведений товнли бактериальные взвеси различной концентрации д мнкрофлз'орнметрическнх исследований и для опытов на лабораторн животных. Кроме того, исследовали клетки 43'много микроб лаг-фазе роста из оптически неплотных культур, которые получг пз'тем пересева бактерий в концентрации 10 7 м.к./мл па 100 жидкой питательной среды LB (Difco) и подращивания (в отсз'тсте н с антибиотиком стрептомицином в дозе 100 мкг/мл) в течение i с аэрацией на шуттель-аппаратс. Пробы для мнкрофлуариметрическ* анализа отбирали в объеме 2,0 мл через каждые 30 мин культивирован] Изучались сдвиги в профилях распределения отдельных клет чумного микроба по уровню содержания ДНК и суммарного бел: а также по содержанию специфических поверхностных антигет Применяли разработанные для решения этих задач специфичен

методы окраски бактерий смесыо бромида этпдпя и митрамицина (Serva) но ДНК /II.П. Steen et al., 1980/' и раствором флуоресцииианзотноцнаната (Serva) но бел«}' / K.J. Mutter, Н.Е. Eipel, 1979/. Для нммунофл}'оресцептиогоокрашивания применяли коммерческие полнклональные препараты иммуноглобулинов диагностических чумных люминесцирующнх (ИДЧЛ), обеспечивающие специфическое свечение гомологичных pPst+,pFra+ бактерии Y.pestis па +++ и ++++ в опытах по люминесцентной микроскопии мазков/М.М.Титенкос соавт., 1984; З.Л. Девдариани, В.А. Федорова, 1995/. Выбирали серии ИДЧЛ, прошедшие предварительный контроль на активность и специфичность в лаборатории ГИСК им. Л.А. Тарасевнча и имеющие оптимальные рабочие красящие титры 1:32 и 1:64. Окраску бактериальных взвесей ИДЧЛ проводили с учетом инструкции по применению препарата и методических рекомендации М. Ingram et al.(1982), Е. Sahar et al. (1983), A.P. Phillips, K.L. Martin (1987) по проточному автоматическому иммунофлуоресцентному анализу и детекции патогенных бактерий в объеме пробы /А.Л. Кравцов с соавт., 1988 /.

В качестве иммуногенов в опытах на лабораторных животных применяли /А.В. Наумов с соавт.,1992/: капельный антиген чумиого микроба (подкожно, в дозе 100 мкг по белку для мышей); чумную живую вакцину ЕВ и вакцинные штаммы изогенной системы (подкожно, для мышеи - 5 х 104 м.к., для морских свинок -3 х 105 м.к.). Морских свннок инфицировали одинаковыми дозами вакцинного и вирулентного штаммов Y. pestís (подкожно 103 м.к. и внутрибрюшннно 10' м.к.) для сравнительногомикрофлуо-риметрнческого исследования реакции in vivo со стороны генетического и лизосомалыюго аппаратов клеток иммунной системы.

Данные микрофлуорпл/етрического анализа сопоставляли с результатами биологического метода оценки нммуногенности использованных в работе вакцинных штаммов по показателям напряженности (LD50) и индекса иммунитета (ИИ), любезно предоставленными нашим соавтором /'G. Shvedune et al., 1996; Г.П. Шведун с соавт., 1997 /.

У человека и ннтактных экспериментальных животных объектом исследования служила суммарная фракция лейкоцитов цельной крови. У ннтактных, нммуиизнрованных н зараженных лабораторных

грызуноп изучали также лимфоциты крови и лпмфопдных органон, выделенные центрифугированием в градиенте плотности верографнна /М.ЮЛедиано», Д.К. Адамов, 1986 , , перитонеальные макрофаги н суммарные фракции клеток перптонсалыюго лкссудата. Культуры макрофагов, инфицированные бактериями Y.pestis, получали по методу Г.И. Васильевой (1990) с небольшой модификацией для мнкрофлуориметрического исследования /АЛ. Кравцов, T.IO Ледванова с соавт., 1994; Т.Ю. Ледванова, А.Л. Кравцов с соавт., 1997/.

Профили распределения клеток иммунной системы животных но клеточному циклу (ДНК-гистограммы) получали путем количественного измерения уровня свечения каждого из клеточных элементов в области спектра свыше 550 им после специфической окраски по ДНК смесью бромида этндия и митрамицина (1:1) по методу В. Barlogie et al. (1976).

Для исследования функционального состояния лейкоцитов экспериментальных животных по показателям уровня активности хроматина и лизосомалыюго аппарата использовали метод M.R. Melamed et al. (1972, 1973,1974), основанный на окраске цельной крови человека акридиновым оранжевым. Количественный уровень содержания лнзосом на клетку в условных единицах свечения (каналах) определяли из профилей гистограмм методом W.R. Abrams et al. (1983).

Измерение уровня интенсивности флуоресценции в отдельных клетках ДНК, белка, лнзосом и комплексов антиген-антитело

проводили на импульсном проточном цитофлуориметре 1СР 22 (PHYWE, Германия) с ртутной лампой в качестве источника света возбуждения флуоресценции. Оптические схемы для оптимального возбуждения и выделения флуоресцентного излучения смеси этндиум бромида и митрамицина, флуоресциинаизотиоциапата и акридинового оранжевого выбирали согласно D.C. Peters (1979), K.J. 11 utter, U.E. Eipel (1979) и M.R. Melamed et al. (1972) соответственно.

Автоматическую сортировк}' импульсов по амплитуде (клеток но относительном}' уровню свечения измеряемых в них веществ) проводили с помощью многоканальных анализаторов Canberra 8100 (USA) и Ortho Instruments (USA). В зависимости от требуемой разрешающей способности, выбирали от 512 до 4096 условных

уровней относительного свечения (каналов). Результаты анализа представляли в виде гистограмм п цптограмм - статистических распределений клеток но содержанию исследуемых параметров в условных единицах измерения. Расчет долевого соотношения в гетерогенной популяции клеток с низким и высоким содержанием измеряемого параметра (в каналах с низкими и высокими номерами), доли субпопуляций в суммарном пуле (площадей пиков на гистогамме по отношению к ее общей площади) проводили при помощи курсора на экране дисплея анализатора и специального интегрирующего устройства ,/ W.R. Abrams et al., 1983 /.

Долевое соотношение лимфоцитов и макрофагов на стадиях G1 / Go, S и G2+M клеточного цикла определяли из профилей ДНК гистограмм с использовании математической модели H. Baisch et al.(1975), а также с помощью метода « отражений», разработанного В. Barlogie et al. (1976) и основанного на принципе симметричности профилен гауссовских распределений Gl/Go. Коэффициенты вариации частотных распределений клеточных элементов по уровню содержания на клетку измеряемого параметра вычисляли (в %) по формуле M J. McCutcheon, R.G.Miller (1979).

Статистический анализ результатов исследований осуществляли с помощью таблиц для экспресс-обработки экспериментального и клинического материала /Е.В.Монцепичуте-Эрингене, 1964/: опре-деляли средине ошибки (ш), значения доверительных интервалов и уровень достоверности различий (Р) среднего арифметического (М).

Результаты исследований.

1. Исследование гетерогенности бактерий Y. pestis ЕВ по уровню содержания ДНК и белка на клетку в стационарной и лаг фазах роста.

Известно, что при переходе популяции бактерий E.coli из стационарной в быструю экспоненциальную фазу роста клетки с низким содержанием ДНК (от 1 до 2 полных хромосом) заменяются на клетки, несущие от 2 до 4 и более хромосом, способные синтезировать повышенное количество белка и поверхностных антигенов. Степень неоднородности бактериальной культз'ры по состоянию генетического аппарата п лаг-фазе роста резко воз-

растает. Эту информацию на дифференциальном уровне впервые удалось получить только с помощью импульсной проточной микрофлуориметрии / 11.В. Steen el al.,1982; E.ßoye et al., 1983/. Поэтому, представляло интерес проведение аналогичных проточных мпкрофлуорпметрнчеекпх исследований на бактериях Y. pestis, способных изменять своп биологические свойства при попадании нх из оптически плотной стационарной культуры в макроорганизм /Н.И. Жуков-Вережников,1940; И.В. Домарадскнй, 1967; A.B. Наумов с соавт. ,1992/.

Были изучены параметры, влияющие на интенсивность специфической ДНК-флуоресценции бактерий в потоке и на разрешающую способность процесса построения профилей распределения их по клеточному циклу. Выбор смеси красителей бромида этидия н мнтрампцнна, обеспечивающей самый высокий квантовый выход при измерении содержания ДНК и построении ДНК гистограмм в автоматических мнкрофлуориметрнческих системах с ртутной лампой ,/D.C. Peters, 1979/, а также оптимизация параметров самого процесса измерения (напряжение на фотодетекторе не менее 700 вольт; объектив с увеличением х 100 и аипертурой 1.3; скорость ламинарного потока не менее 4 мл/мин; деление импульсов ДНК-флуоресценцни на 2048 каналов; и т.д.) позволили добиться высоко Ii чувствительности и разрешающей способности в опытах с бактериями Y. pestis. Для оптически неплотных взвесей с концентрацией 10' м.к./мл скорость анализа и сортировки бактерий в потоке по уровню свечения ДНК составила не менее 40 000 м.к./мии.

М икроф л j'opn метрические исследования позволили выявить характерную особенность оптически плотных стационарных культур вакцинного штамма ЕВ чумного микроба, однородных по состоянию генетического аппарата клеточных элементов (рис. 1 А) и включающих 91,4 ±3,2 % бактерий сотносителыю низким уровнем содержания ДНК на клетку (менее 30 усл.ед.). В лаг-фазе роста популяции, в процессе подращивания на жидкой среде LB прн интенсивной аэрации, ситуация резко изменялась в интервале времени от 3 до б ч культивирования. Доля бактерий с низким содержанием ДНК понижалась в суммарном пуле до 35,4 +5,6 % (р < 0,001), появлялись клетки с интенсивной ДНК-флуоресценцней и культура приобретала очень высокую степень гетерогенности по состоянию генетического

Содержание ДНК на клетку в у.е. (от О до 200 при С0=Е048)

р|[о. 1 Прц|)1Л1 отатиотнчасгаа распределений отдельная бзкгерлй У.резИз по уровни ¡р!К-$лусресиенша в оптически плотной стационарной куль туре (А) и через В ч в лаг-<азе роста при 37- С (В).

СБ - количество кэналст а зказштсрг одт/зосв !'/готеп !:!1те.'!ЯЕ!!ости муорешвг.шо!), ¡ипэльзугу.ых зля эгтсма-ПИвОКОЯ ?ср«1рОИ!Н Я391СЯ ГЭГ9рСГеи:!СЙ популягн.

Содержание белка на клетку з у.е. |луо-ресценцда ФИТЦ (от 0 цо 200 при С3=2048)

нк. ; Правили статистических распределен)«! отдельных «легок У.резШ ЕВ по уровня содержания белка а оптически плотно)! стационарной культуре, м-раленной при £3- С (А), и через 6 ч подрадшгз-ния при 37- С (В).

аппарата (рис. 1 И).

Таким образом, попадая в условия отсутствия дефици питательных веществ /О.В. Шеремет, 1994. и размножаясь концентрациях более близких к концентрациям in vivo /А., Кокушкип с coaur., 1994/, бактерии Y. pestis быстро переходи в состояние с активированным генетическим аппаратом.Через ( подращивания в суммарном пуле появлялись микроорганизм синтезирующие повышенное количество белка на клетку (рис. ! Клетки с повышенным содержанием ДНК не появлялись в культу в лаг-фазе ее роста, если питательная среда, используемая д подращивания, содержала стрептомицин в ингибпрующей дозе 1 мкг/мл /А.Л. Кравцов, Н.И. Костылева, 1994/.

Полученные данные свидетельствуют, что микрофлуор метрический контроль на дифференциальном уровне за процесс репликации ДНК в клетках чумного микроба при его культивирован на питательных средах перспективен с точки зрения изучен закономерностей влияния на этот процесс различных ингибитор (в том числе антибиотиков) и стимуляторов роста, а также в пла стандартизации параметров клеточных культур, используемых д вакцинации и заражения животных. При решении этих задач в опыт на других микроорганизмах автоматическое микрофлуорнметрическ оборудование уже широко используется за рубежом /Е. Boye et а

1983 /.

2. Исследование гетерогенности штаммов Y. pestis ЕВ с рг личным плазмидным составом в реакции иммунофлуоресцеици

В процессе проведения исследований установлена высок эффективность использования проточной микрофлуориметрии д обнаружения клеток чумного микроба в чистых и смешанш культурах с гетерологичнымн микроорганизмами, для нх быстр< дифференциальной диагностики от близкородственных бактер1 псевдотуберкулеза грызунов. На рис. 3 показан результат автоматического иммунофлуоресцеитного анализа в потоке взвес бактерий Y. pestis и Y. pseudotuberculosis, обработанных снециф ческой чумной люмннесцируюшей сывороткой. В отличие от клет чумного микроба, бактерии нсевдотуберкулеза не обладали спецнфич( ким свечением и автоматически не учитывались при построении

УРОЕИЬ Н1ВДКМЛУОРЕСЦЕНЦИН в у.е. от О до 512 при CG=1024 Рпс. 3 Уровень флуоресиенцш в потоке клеток чумного микроба, вщащенннх при Ё8-' С (А,Б), и близкородственных бактерий псевцотуберкулега ( Б) после окраски cneifliliweciraii чумноя диагностической лкминесцируюией оиворотаой.

Примечание: Иммунофлуоресиентние гистограммы получены в опытах со взвесями гомологичных бактерии Ю® м.к./нл (.1), 10^ м.к./м (Б) в сравнешш а 10' м.к./ил блиаиородстаемшх микроорганизмов (В).

Н, I

100 г

О 3 6 8 10 48

ЕГ'ЕИЯ КУЛЬТИВЮОВАНИЯ, а ч.

Рио. 4 Перераспределение баягерш) 1. pestis ЕВ по уровни продукции спетсгических поверхности! аитнгеииз на оташм ускорения роста периоппчеипои иультури при 37 - 0.

9В бактерии о относите."» но мвпии уровнен сиеш|ичес-ксй шшунойлуореоиенцш - менее 50 у.е., характерным .гля ¿0 клеток oimmcnii плшшп взвеси, яира-!цеииоП при 23- 0.

ЕЗ - пмкройы с повиееннын уровнен спарфмесксЛ ичауиа-{лусре^нешиш - от EÖ до 51Е у. е.

Н - доля нлэток а сужарнон гегеисгениоа пуле 21

иммуиофлуоресцентпых гистограмм. Для ТОП), чтобы днффереи цировать бактерии чумы от бактерий псеидотуберкулеза, достаточнг было всего 5 мин с момента получения проб на анализ, включая врем; на окраску и сам процесс измерения.

Быстроты получения результата достигали засчет автоматического измерения уровня интенсивности пммунофлуоресценцин десяткоI тысяч отдельных бактерии непосредственно в растворе мечены? антител, что возможно только в импульсном режиме анализа /Е БаЬаг е(. а!., 1983 /.

На начальном этапе работы все опыты проводили с использова ниембактериальных взвесей, приготовленных из оптически плотны; стационарных культур, так как для определения порога чувствительности метода (104 м.к./мл) нх готовили путем последовательного разведения стандартных миллиардных суспензий В дальнейшем, учитывая результаты экспериментов по измерении количества ДНК и белка в бактериях чумы в лаг-фазе роста проводили опыты с клетками вакцинного штамма ЕВ НИИЭГ до ] после кратковременного подращивания исходных культур на среде Ы прн37°С в условиях интенсивной аэрации. К б ч культивировать отмечали характерное перераспределение бактерий в суммарном пул по антигенным свойствам, достоверное увеличение доли клеток > повышенной интенсивностью специфической пммунофлуоресценцин

Популяция переходила в совсем иное функциональноI состояние и ентз'ация практически не менялась через 8 н 10 ч рост; (рис. 4).

Результаты сравнительного иммунофлуоресцентного анализ; нзогенных производных штамма ЕВ с различным плазмидньн составом до и через 6 ч подращивания показали, что такие сдвиг; в профилях пммунофлуоресцентных гистограмм, связанные достоверным повышен нем уровня сиецифическо! нммунофлуоресценцнну определенной доли бактерий в суммарно» гетерогенном пуле, характерны для рРга+ штаммов У. реэШ (рпс. 5) Аналогичные изменения в интенсивности специфической иммуно флуоресценции у клеток вакцинного штамма ЕВ чумного микроб были выявлены Л.В. Самойловой с соавт. (1990) через 3-6 1 роста исходной бактериальной культуры внутри диффузионной камеры Подращивание бактерий в среде организма морских свинок пред ложено использовать для повышения чувствительности и достс

ИНТЕНСИВНОСТЬ тчгаШУОРЕСЩЖКИ в у.е. ( от О до 512)

Рно. 5 Статистические профили распределения по уровни специфической иммуна$луорееценцго! в больших выборках бактерий штаммов Y. pestis с раалнчнш плаашаннм шставом до (справа) и после (слева) 6-тл часового поцрашнвашш сташшиарной 2Q-' кул&туры при 37'-'' С.

Йтаниы Y.pestis: а - ЕВ ШШЗГ (pFra+,pCsd+,pPst+) ;

б - KM 216 (pFfa~,pCaiif,pPst+);

в - KM 225 (pFra*.pCad~,pPst~);

г - KM 218 (pFra ,pCad ,pPst~).

верности серологических методов диагностики чумного микроба. При наличии н лаборатории мнкрофлуориметрнческого оборудова пня, согласно нашим данным, достаточно подращивания клеток чумного микроба не в организме дорогостоящих экспернменталь ных животных, а на жидкой питательной среде LB (Difco) в уело внях аэрации.

Иммуиофлуоресцентпые гистограммы, представленные на рис.5 наглядно отражают возможности проточной микрофлуориметрш с точки зрения дифференцирования штаммов чумного микроб; с различными антигенными свойствами. Данные о< информативности люминесцентно-серологического метода диагностики чумы полученные при количественном нммунофлуоресцентном анализ! больших выборок отдельных клеток, подтверждаются выводам! М.М. Тнтенкоссоает.( 1984), сделанными ранее на основе результата люминесцентной микроскопии мазков.

3.Разработка цнтофлуориметрического способа контрол) за уровнем пролифератнвной активности пммунокомпетентны: клеток в вакцинированном и зараженном чуыоИ организме

В настоящее время проточная цитометрня является единственны! методом, способным исследовать процесс пролиферацш эукарнотическнх клеток с учетом их долевого соотношения на все: стадиях клеточного цикла - Gl/'Go, S и G2+M /' L.A. Smets е al., 1976; P.D. Utsinger et al.,1977; В.Л. Исаков с соавт., 1988/ и оценивать степень генотокснчности различных препаратов и отношению к непролнфернрующей диплоидной клеточной фрак ции, составляющей подавляющую долю (от 60 до 99 %) в гетерогенном пуле любых клеток макроорганизма /D.G.Marmei R.W. Steele, 1983/.

Нами впервые было проведено сравнительное нсследовани воздействия клеток вакцинного и вирулентного штаммов чумног микроба на процесс пролиферации лейкоцитов в организм вакцинированных и зараженных чумой животных с использование! импз'льсной проточной мнкрофлуориметрнн.

Были установлены оптимальные параметры процесса измерени уровня содержания ДПК в лейкоцитах лабораторных животных

(напряжение на фотодетекторе 550 вольт; скорость ламинарного потока не менее 4 мл . мин п т.д.), обеспечивающие построение ДНК гистограмм с коэффициентами вариации диплоидных инков /во не более 5 %, а также четкое дифференцирование отдельных клеток по фазам мнтотнческого цикла (рис.6). Значения отношений номеров каналов макснмумоп теграилоидных и диплоидных инков на гистограммах, отражающие линейность процесса преобразования количества внутриклеточной ДНК в соответствующий электрический сигнал на выходе фотодетектора /Т. 1лпс1то е1 а1., 1979/, отличались от реальных значений 4с/2с = 2,0 не более чем на ),5 %.

Обнаружено, что суммарная доля клеточных элементов на стадиях синтеза ДНК, пред митоза и митоза (5-Ю2+М) в крови £1 органах иммунной системы лабораторных грызунов различна (рис. 6), но для особей каждого вида (мышей, морских свинок и кроликов) поддерживается в отсутствии антигенной стимуляции на неизменном и строго определенном уровне. Выявлены достоверные различия в исходном уровне пролифератнвной активности лейкоцитов, а также в соотношении их на стадиях Б и 02+М клеточного цикла в крови и костном мозге у человека и лабораторных грызунов. Установлено, что наиболее близкой моделью к человеку по этим показателям является морская свинка.

После иммунизации морских свинок клетками живой чумной вакцины ЕВ, у всех исследуемых особен отмечали умеренное повышение пролифератнвной активности иммунокомпетентных клеток в крови, лимфатических узлах и селезенке в первые трое суток иммуногенеза (1,5 - 2 раза). Такая клеточная реакция со стороны иммунной системы организма сохранялась на протяжении всего периода иммунологической перестройки с формированием приобретенной резистентности к чуме /Л. В. Саяпина, А.Л. Кравцов с соавт., 1989, 1990 /. Для острого чумного инфекционного процесса с летальным исходом на 3-5 сутки было характерно резкое увеличение (в 4-6 раз) доли синтезирующих ДНК (Э) и делящихся (в2+М) клеточных элементов в крови и органах иммунной системы (рнс. 7).

Согласно современным представлениям о характере сдвигов в уровне пролиферативной активности лейкоцитов при хроническом и остром инфекционных процессах /Г.И. Кознпец с соавт., 1982/ это свидетельствует о способности клеток вирулентного штамма чумного микроба нарушать регуляцию умеренного процесса репро-

о 6ч

ксстш'Л мсег

(И/Яо- 63, И- *

з - 25,2 * 02+М - 13,4 *

б, кровь

ал'/Ча- 92,8 £ а - г,7 * 02+М • »,5 ^

КРОВЬ

ШШ'ШШЕСХИЕ У2ЛЫ

01/йо - 89,-I Б - 1,3 2 02+М - 9,6 #

УРОВЕНЬ ДНК-Ш0РЕСЦЕН1Ш в у.е. (от 0 до 512 при С8=1024)

Рис. 8 Результаты проточной ншро&яуориметрии ДИК отдельных лейкоцитов мореной свинки в неодиородии популяциях с различной пролиферагивной активностью и неодинаковым распределением и по клеточному шилу.

Примечание: результат анализа лейкоцитов крови приведен при оптимальней - 4,5 мл/мин (В) и иеоптимачьной - 2,-; мл/мин (В) скорости ламинарного пиона в проточной камере

НОРН4 УрмизЕб У рее(13 ^31

Рис. 7 Сдвиги в уровне пра.щйераттаной активности лейкоцитов крови н органов' иммунной системы морских свинок в ответ на заражение вирулентным штанном У. резЫз в сравнент со аттгтт в ответ на иммунизации живши клетками вакцинного итанна ЕВ. 0 - кровь □-селезенка

И - лимфатические узлы Дашше получены на 3-й сутки после полкошэго заражения и иммунизации интаятных вдштнл овинакошш дозами - по 10-* м. к.

дукцпи пммунокомметсптпых клеток и микроорганизме.

Бактерии вирулентного штамма Y.pestis 231 после внутри-брюшинной инъекции их интактпым морским свинкам, в отличие от клеток штамма ЕВ, оказывали выраженное генотоксическое воздействие in vivo па диплоидные клетки перитонеалышго экссудата (рнс. 8). Это отражалось в трехкратном повышении коэффициентов вариации диплоидных ннкоп на Д11 К-гнстограммах клеток зараженных особей (с 2,9 ± 0,05 % до 8,4 + 1,4 %, р<0,001) за 2 суток до их гибели от инфекции. В этот период (на 1-е сутки), у всех иммунизированных животных вариация в уровне свечения ядер диплоидных лейкоцитов и макрофагов достоверно не отличалась от нормы (2,9 ± 0,05 % и 3,2 ± 0,08 %, р > 0,05).

Внутренним контролем, позволяющим полностью исключить влияние на результат измерения каких-либо других факторов, кроме биологических свойств возбудителя чумы, служили обычно используемые для этой цели ядерные куриные эритроциты (1СР стандарт), которые смешивали /О. Alabaster et al., 1978 / с суммарной фракцией клеток перитонеального экссудата морских свинок перед окраской их по ДНК флуоресцирующими красителями.

На основании проведенных исследований,

цнтофлуорнметрнческиепоказатели уровня пролнферативной активности лейкоцитов рекомендованы/А.Л. Кравцов, Л.В. Саяпинас соавт., 1989/ и вместе с другими клеточными и гуморальными показателями иммунного статуса используются в настоящее время для контроля за процессом противочумной иммунологической перестройки у людей / К.И. Герасимова, 1990/, а также для оценки in vitro степени геиотокспчности препаратов антигенов чумного микроба по отношению к нммуиокомпетентным клеткам человека и животных /Г.В. Ермакова, Н.Г1. Гусева, А.Л. Кравцов с соавт., 1991; Н.А. Снничкнна, А.Л. Кравцов с соавт.,1992; A.V. Naumov et al.,1992; MYu. Ledvanov et al., 1994 /.

4. Проточная мнкрофлуориметрия ДИК перитонеальных макрофагов, инфицированных бактериями Y.pestis in vitro.

Сообщения в печати о способности проточной цитометрин проводить диагностику внутриклеточных паразитов путем детекции в зараженных зукарнотнческнх клетках ДНК вирусов и бактерий

■I0- а дак-гастогракмн, отраяаиацне различное воздействие ín vivo бактерш! вакшншга (Б) и вирулентного (В) штаммов Y. pesfcis на центральный генетический аппарат диплоидной íparnmt клеток перитонезльного экссудата интактньгх морских свинок (А).

Примечание: По оси абсцисс - уровень ДНК-$луоресценцш на клетку в у.е. (каналах от 0 до 1024 при СВ=4095), а по оси ординат -количество клеток (импульсов) на канал от 0 до 10:". Шфэ nos , яаедой гистограммой (в центре) - это суммарное число исследованных клеточных элементов. Пиии слева на гистограммах А,В,В соответствуют куриннн эритроцитам ( "внутренний" контроль).

Данные получены через S0 ч после Евдшбрвкшного введения морским свитам ajaemasux доз ( 107 н.к.) вакцины ЕВ, либо вирулентного штамма Е31.

/ J. Du mi et al.,1978; J.W. Jacobberger et al., 1983; J.M.Whaun et al., 1983/, побудили нас; к проведению исследований, направленных на обнаружение Д1IK бактерий Y. pestis внутри макрофагов, а также на инструментальную детекцию с помощью ДМ К гистограмм хорошо известных различий в уровне цнтопатического эффекта на фагоциты у вакцинного п вирулентного штаммов возбудителя чумы в системе in vitro / ПИ. Васильева, 1990 /.

Условия измерения подбирали таким образом (4096 каналов в анализаторе импульсов и напряжение на фотодетекторе 550 вольт), чтобы максимум диплоидного пика макрофагов на контрольных ДНК-гистограммах учитывался в каналах с номерами близкими к 400. Поскольку это значение соответствует степени различий в относительном уровне ДНК-флуоресценцип диплоидного лимфоцита кровп человека и отдельной бактерии Е. coli после окраски их смесыо бромида этпдня и митрамнцина /H.B.Steen, E.Boye, 1980 /, можно было ожидать, что поглощение активным диплоидным фагоцитом морской свинки одной бактернн чумы вызовет смещение профиля пика Gl/Go на ДНК-гисторамме вправо на 1 канал, двух - на 2 канала, и т.д.

Исходная контрольная популяция пернтонеальных макрофагов морской свинки включала 96 % диплоидных клеток с абсолютно одинаковым количеством ДНК (2с), которые всегда учитывались цнтометром в виде очень узкого н симметричного гауссовского распределения Gl/Go с коэффициентом вариации не более 3 % (рис.9).

Через час после добавления бактерий Y.pestis в культуру макрофагов, когда происходит ианболее интенсивный захват чумных микробов фагоцитами но данным микроскопии мазков /Г.И. Васильева, 1990; Т.Ю. Ледванова, А.Л. Кравцов с соавт.,1997/, относительно контроля наблюдали характерное смещение правого склона на диплоидных пиках ДНК гистограмм /'J.Dunn et al., 1978 / - появление в популяции активных фагоцитов с различным числом поглощенных бактерий. К 6 ч культивирования ядра определенной части клеток (65,2 + 6,7 %) разрушались под влиянием цнтопатического эффекта вирулентных бактерий , а через 8 ч все 100 % клеточных элементов полностью утрачивали исходно высокий уровень свечения ДНК, характерный для ядер интактных неповрежденных фагоцитов. В опытах с вакциной ЕВ, профили

ДНК-гистограмм через 6 и 8 ч возвращались к исходному симметричном)' виду, что указывало, наоборот, на процесс гидролиза бактериальной ДНК внутри макрофагов п на тенденцию фагоцитарной реакции к завершенности. Ядра фагоцитов в опытах с клетками вакцины полностью сохраняли исходно высокий уровень свечения (рис. 9).

IIa основании результатов проведенных мнкрофлуоримет-рнческих исследований разработан принципиально новый высокоэффективный способ мониторинга развития фагоцитарной реакции in vitro / Л.Д. Кравцов с соавт., 1994 /, позволяющий регистрировать ее исход в зависимости от биологических свойств клеток У.pestis и осуществлять быстрое дифференцирование вакцинного и вирулентного штаммов чумного микроба по характерным профилям ДН К-гистограмм.

ДНК-гистограммы на рис. 9 показаны для сроков, традиционно нспользумых при расчете показателей фагоцитарной реакции в опытах с бактериями Y. pestis /В.Л. Пустовалов с соавт., 1983; Г.И. Васильева, 1990/. Однако, с помощью мнкрофлуориметрнческого анализа возможен динамический контроль за культурой инфицированных чумой фагоцитов с любым необходимым промежутком времени. Установлено наличие строгой корреляции между показателями фагоцитарной реакции, рассчитанными из ДНК гистограмм, и данными визуального микроскопического анализа /Т.Ю. Ледванова, А.Л.Кравцов с соавт., 1994,1997; Т.Ю.Ледванова, 1995 /.

Преимущество проточной цнтометрии заключается в быстроте получения результата , в полной автоматизации длительного и очень трудоемкого процесса визуального исследования фагоцитоза. Данные представляются в виде наглядной количественной информации, которая очень удобна для сравнительного исследования бактерий Y. pestis с различными биологическими свойствами.

Разработанный нами способ оценки фагоцитоза отличается от других уже известных и широко используемых автоматических проточно-цнтофлуориметрических методов исследования фагоцитарной реакции / A.B. Филатов с соавт.,1983; C-F. Bassoe et al.,1984/. Для измерении используются бактерии и клетки иммунной системы, убитые н фиксированные 70%-ным этанолом после их взаимодействия в культуре, а не взвеси предварительно убитых микроорганизмов и живых фагоцитов. Поэтому, он пригоден для экспериментов с вирулентными штаммами патогенных бактерий, а также для контроля

СОЯЕРШГОЕ ДНК НА КЛЕТКУ в у.е (каналах) (от О до 1024 при CG= 4096)

Pjig. 9 результаты шжрсфуоршетрии Днк манро|агов в процессе фагоцитоза in vitro клеток вирулентного 231 н вакцинного ЕВ штаммов Y. pesfcis. Примечание: контроль -1ч (™1) и 8 ч (45); опыт с 231-1 ч (Ф2), Б ч (Ш), 8 ч ($4); опит с ЕВ - 1 ч ($6), 6 ч (Ф7>, 8 ч (И). AM - активные макрофаги; РН - разрушенные макро$агн с поврежденным}! ядрами.

л а исходом процесса взаимодействия их с макрофагами и лейкоцитами в условиях in vitro.

5.Сравнительный мнкрофлуориметрнческое исследование состояния лизосомального аппарата фагоцитов кровн человека, лабораторных грызунов н некоторых нечувствительных к чуме видов животных.

В настоящее время метод импульсной проточной мнкро-флуориметрни позволяет очень быстро получить профиль статистического распределения лейкоцитов цельной крови человека (через 8 мни после выделения О, 1 мл ) по уровню содержания на клетку лнзосомальных гранул, что широко используется в клинической практике для автоматического определения лейкоцитарной формулы, дифференциальной диагностики гемобластозов, а также для прогнозирования осложнений, вызываемых генерализацией воспаления при инфекциях /M.R. Melamed et а!., 1973, 1974; C-F. Bassoe et al., 1984; Т. Nakagava et ai., 1981; W.R. Abrams et al., 1983 /.

Однако, несмотря на то, что этот профиль (ниже по тексту -просто гистограмма) хорошо известен и состоит из трех четко разделенных пиков, соответствующих лимфоцитам, моноцитам, граиулоцитам (слева направо - рис.10) и несущих информацию о строго определенной степени различий в состоянии лизосомального аппарата трех типов зрелых клеток иммунной системы человека /M.R. Melamed et al., 1972,1973 /, к моменту начала нашей работы проточная микрофлуориметрия не применялась для сравнительного исследования состояния лизосомального аппарата лейкоцитов цельной крови у животных.

В экспериментах с лейкоцитами кровн здоровых людей и больных гемобластозами, проведенных на базе клиники гематологии Саратовского медицинского университета, были оптимизированы условия измерения, позволяющие получать характерные для здорового человека гистограммы не на лазерном приборе / M.R. Melamed et al., 1972, 1973/, а на приборе принципиально иной конструкции - с ртутной лампой в качестве источника света при возбуждении флз'оресценции акридинового оранжевого / АЛ. Кравцов с соавт.,1995/. В этих условиях, в сравнении с лейкоцитами человека, впервые были исследованы видовые особенности

СОДЕРЖАНИЕ ЛАОСОМ НА КЛЕТКУ в у. е. ( от О до 512 при CG=512)

Ргс 10 Статистические профили распределения лейкоцитов цельной крови чтааштгел&ниж к чуме грызунов по по уровню содержания лизосом на клетку в условиях измерения оптимальных для лейкоцитов крови человека.

Примечание: пик слева на каждой гистограмме соответствует лт.йошггам крови; справа - фагошгш с различным садерданием лизооом и неошшаковим продаием распределения по лизосомальным свойствам на субпопу-ляшкзпном уровне.

устройства па субиопуляциошюм з'ровне ли.чосомальиого аппарата лейкоцитов кропи у чувствительных к чуме грызунов и двух видов нечувствительных к заражению чумой крупных млекопитающих.

Оказалось, что способностью к аккз'мз'ляцни большого количества акридинового оранжевого в лнзосомах обладают только фагоциты крови человека, а также нечувствительных к чуме собак и лошадей. При анализе в потоке суммарных фракций лейкоцитов крови этих трех видов получали гистограммы стремя инками, соответствз'ющимн трем типам клеток с различным содержанием лнзосомальных гранул (лимфоциты + две субпопуляцин фагоцитов). Нейтрофнлы крови учитывались по уровню свечения в каналах с высок ими номерами -от 198 до 600 усл.единиц (рис.И).

11а гистограммах лейкоцитов людей четко выделялся моно-цитарный ник (в центре - от 5 до 8 %, 86 усл.единнц.). Зрелые гранулоцпты учитывались в виде однородной популяции клеток (справа - около 60 %, 198 усл. единиц). Два приблизительно равных инка фагоцитов на гистограммах лейкоцитов крови собак и лошадей (по 30 - 35 % в суммарном пуле) - это две субпопуляцин гранз'лоцитов с различным з'стройством лнзосомального аппарата (рис. 11). Относительная доля моноцитов в лейкоцитарных фракциях у этих двух видов не превышает 5 % / В.Н. Никитин, 1949/.

Фагоциты крови всех изученных нами восприимчивых к чуме грызунов обладали слабым свечением в красной области спектра, котороемало отличалось от свечения лимфоцитов. На гистограммах лейкоцитов кровн морских свинок, крыс н кроликов строился только одни инк фагоцитов (нейтрофнлов) н все клетки учитывались в каналах с достоверно (р < 0,001) более низкими номерами (рис. 10), чем у людей, собак и лошадей (менее 100 усл. единиц).

В З'словпях измерения, оптимальных для клеток человека, фагоциты кровн мышей обладали самым низким уровнем содержания лнзосом на клеткз'. Мыши были единственным видом животных (в исследованной группе), в суммарной фракции лейкоцитов кровн которых полностью отсз'тстповало разделение по уровню свечения лнзосом между лимфоцитами и фагоцитами (рис.10 и рис.11). Причем, это характерно для всех мышей, независимо от их генотипа. В отлнчпе от морских свинок и людей, лнзосомальные гранз'лы, способные к адсорбции акридинового оранжевого, в большом количестве содержатся у мышей, но данным мпкрофлуорпметрнн,

ГО ПЭс

'< Б" О и с: и

о о о

ы ы :ы

си го

5:С И

Я <0

Й Я

Я "О

•13 ф

я о о

■а

о ф

КЗ

о о

а щ

Ч й ТЭ И

к И

:э я

о си

м о ¡3 о

м §

ф ¡3

(0 о.

:с я

К р

"Е2 И

£ к

а ц

а а

►н ов

хз •• си

ас си

гс о;

и К ¡В £?

3 а

>-1 сз

■<з о

СП о

|| X СП я Н" о ГО

я о

§ ш

■а ф я •

<в

а 1

Ф о I 1л

И" рд '

х Еа

б й ■а к р;

(-3

а си

ф ф |

У I

М »5

и-'

I (Й

кУ Й о

8 вс

я §

Количество клеток на канал

к §

■а

а Я

¿'5 Й

М 3

я ч

•■ы< и: о

и Я Р о

го '»л

н А

го Ф

н м

•а я

ф -м

СП

О СП

м Кз

гз ч:Э

Л X

Ф о и 'О

§ Й $ я

СИ

' I

Ее

а у?

Ьз

р Ьа -П Ь] О ф си 1.3 и

О, |и '■<

В Я и

» ч

О си ЬЙ

Щ " к! 3

II в и §

§ 8 8 •< ь

а Я ■ «*

10! ьэ ы ф и

ц м си ■ Ч

1< о

0 ы >1 -о •а Я та ¡5 т ф о гм т о

.а -э & ¡5 ш

8 11 & Й Л

| й а & I

а .в <1' ■

н § ы я

¡в Ч

1 | ' =

га й М

н те м р м Ф м сг

Ж о " К о П ст о

& В м а В

Количество клеток на

яанал

■I

Я 3

в фагоцитах брюшной полости - в псрнтонеальных макрофагах / А.Л. Кравцов с соавт., 1995 /.

Из всех изученных нами видов животных только лошади абсолютно нечувствительны к чуме как в экспериментальных, так и в природных условиях. Собаки нечувствительны лишь к экспериментальному заражению бактериями У. резЫэ / В.М. Туманскин, 1948/.Цитофлуорпметрнческин анализ выявил наличие в периферической крови лошадей субнопз'ляцни гранулоцитов кровн с самым высоким содержания лизосом на клетку. Уровень свечения клеток этой субнопуляцпн в 3 раза превышал уровень свечения нен грофилов крови людей и собак (рис. 11).

Если сравнивать высокочувствительных к чуме грызунов не с человеком, а с лошадьми, то дефицит содержания лнзосомальных гранул в фагоцитах кровн мышей и морских свинок очень высок (в 20 и 10 раз соответственно). Поэтому, понижая напряжение на фотодетекторе (с 720 до 640 вольт), выбрали режим измерения, при котором прибор автоматически не учитывал относительно слабые сигналы флуоресценции от лизосом фагоцитов крови мышей и морских свинок. В этом режиме воспринимались только интенсивные сигналы от гранулоцитов крови люден, собак и лошадей, что отражало особенность з'стронства лизосомального аппарата лейкоцитов кровн крупных млекопитающих, отличающую их от высокочувствительных к чуме грызунов, и обеспечивало возможность регистрации различий }' людей и нечувствительных к чуме видов по этомз' показателю на субнонуляционном уровне в суммарной гранз'лоцитарной фракции (рис. 12).

Таким образом, на основании результатов проведенных сравнительных мнкрофлз'орнметрических исследований можно з'тверждать, что по урошио содержания лизосом в фагоцитах крови, человек значительно ближе к собакам и лошадям, чем к двз'м видам грызз'нов, используемым в качестве экспериментальных моделей. Кроме того, относительное количество гранулоцитов в кровн людей и двух нечз'вствительных к чуме видов животных составляет 60-70 %, а зг морских свннок и мышей не более 30-40 % /13. И. Никитин, 1949; П.П. Сахаров с соавт., 1952/.

Восприимчивого к чуме человека объединяет со всеми из)'чен-ными грызунами отсутствие разделения клеток грапулоцнтарнон фракции по состоянию лизосомального аппарата па две равные

субпопуляции. Хотя у люде», как известно, существует две равные субиолуляции гранулоцитов, фагоцитирующие бактерии независимо друг от друга за счет рецепторов к lgG и комплементу / C-F. Bassoe et al., 1984 /.

Наличие в крови собак и лошадей высокой степени неоднородности клеток первой линии защиты по лизосомалъным свойствам, двух субпопуляций гранулоцитов с неодинаковым устройством лизосомального аппарата (рис. 12) имеет, по-видимому, важное функциональное значение, связанное с явлением их видовой естественной нечувствительности к чумной инфекции.

Возбудитель чумы относится к микроорганизмам с очень высоким содержанием аланина в структурных белках /И.А. Дятлов, А.Ф. Филиппов, 1994 / и, в частности, в термостабильном капсульном антигене/П.И. Анисимов с соавт., 1987 /. В процессе выполнения работы выявлена строгая корреляция между спепепыо аккумуляции красителя акридинового оранжевого в лизосомах фагоцитов, интенсивностью внутриклеточного киллинга чумных микробов лейкоцитами крови и внутриклеточной активностью лейкоцитарной эластазы ЕС 3.4.21.11 (рис. 13), предназначенной для гидролиза пептидов Ala-Ala-Pro-Ala в гидрофобных белках патогенных бактерий / J. Blondin, A. Janoff, 1976; М. Zimmerman et al., 1977; J.D. Vassalli et al., 1978; B.M. Ashe, M. Zimmerman, 1982; W.R. Abrams et al., 1983; J.G. Bieth, 1986 /.

Эластаза составляет у людей 90 %, а у морских свинок 15 % в суммарном пуле нейтральных лейкоцитарных протеиназ / B.M. Ashe, М. Zimmerman, 1982 /.Утрата способности лейкоцитов человека к продукции этого фермента (менее 1/10 нормы - синдром Чиди-ака-Хигашн) сопровождается резким снижением уровня естественной резистентности к инфекциям при всех остальных нормальных клеточных и гуморальных показателях иммунного статуса / J.D. Vassalli et al.,1978,/. Уровень активности эластазы в лейкоцитах нечувствительных к чуме собак (рис.13) в 2 раза, выше чем у людей и на 1-3 порядка выше, чем у высокочувствительных к чуме морских свинок (в 12 раз) и мышей (в 200 - 3000 раз в зависимости от генотипа).

Обнаруженные нами трехкратные различия в уровне содержания лизосом в граиулоцитах людей и лошадей, подтверждаются результатами биохимических исследований о присутствии в

oo :s ta го —*

to о ta r-f M

►4 es <o

h-». О с eu 43

о if^

О о я

- .. О м _

СО -J СО

Й -í?

ш Çfl

3 ñ

•a о

£13 -с?

о о a о

00 VD

Hi о ои u КЗ со о S Ж зс ж

ш Cl ч or cu « ч о о

¡J я w Ed ч Ы •Е Я ■а

га О u го ы •Ö тз

О • a с» о Б а н >& <ï>

о 'O iL*- № х а Oí о w ta

i M С/! ш ьэ ►I й

n X" S S со а S

н—■ Eï а в го :ы 23 щ X ■Б

ш ai С5 M о Üu

( 3 СО С п

X X •a X ^ □ о

ro о X ГО го Т5 ч а го

СО x о г: со J3 'Н О X

1 •XI 3 ч с rvl ГО 1< Ii га и X о Е X ■а

3 at о го <0 го о

о t-d э ш Ч X SE X и

1 S CD га Ш а ч ■а

11** O, -i о И в M о

■CT ja ä ч 5

Ш О В) го го on я X

=3 W fi s f—■ я 1 S X р 1 Ф

a ш tD œ M g О О ч ГО m

•а я О о о •а

cu BJ a Я 5 •3 ч № s ä •в 5

ta CD •о о s о э

>-3 -S ш ч La

tu щ >)■ а, СВ •а Ей ra

ÍJ -S □ К » о S

СV ы ч О я Я w 3 Е

а 'si О Си

Ü) H ü п в S a

О ш s го

ы со 'а CS о

3 О с со ч ш ru a: о о

И r¡ a ■ "S ш •а ч

«1 О о ä X л с* а

UE'' х о Э о

Я 'го ^ ГО H cil

ГО m да о X ЕЗ

'a Я M и о и ЕС ¡o

Ч В о 3 ta X о

X Й tu ш а -i Ш 1 т i

1 t—> ш о

►a 1 h-*

Коэффициент естественной резистентности к чуме.

Уровень аккумуляции АО в ллзосомах фагоцитов в условных единица! (каналах).

Активность лейкоцитарной 1Ш чумиих шпфобоп зластази по отношанго к а лейкоцитах крови активности ее у лидей, в

о ■»»

лизосомах нептрофилои нечувствительного к чуме вида трех различных ферментов с эластазнон активностью для более эффективного гидролиза фагоцитированных белковых ант игенов в патологических условиях. Только одни из этих трех энзимов синтезируется в лейкоцитах человека и функционирует в значительно более узком диапазоне pli / Л. Koj et al., 1976; A. Dubin et al., 1976 /.

Физиологическая функция эластазы может приобретать енлыю выраженные патологические аспекты (состояние шока, острое гемморагпческое воспаление, разручленне эластина легочной ткани п комплемента сыворотки крови) при массовой гибели лейкоцитов in vivo, а также под влиянием эндотоксинов грамиегативных бактерий и иммобплнзпрованных иммунных комплексов /J.G.13ieth,1986/. Результаты проведенных нами исследований указывают на необходимость контроля за этим общепризнанным биохимическим маркером воспаления /В.Л. Доценко с соавт., 1994 / при изучении чумного вакцинального н инфекционного процессов. В настоящее время созданы пролонгированные ингибиторы патогенного эффекта эластазы, способные предотвратить генерализацию воспаления и летальный исход при некоторых острых инфекционных заболеваниях /Н.И. Ларионова с соавт., 1994 /.

6. Изучение реакции хроматина п лизосомалыюго аппарата лейкоцитов лабораторных животных в ответ на иммунизацию вакцинными штаммами чумного микроба с различным плазмид-ным составом и уровнем пммуногенностн.

Иммуностимулирующие препараты, обладающие иммуногеннымн свойствами, способны вызывать структурную перестройку в хроматине нммунокомпетентных клеток, предшествующую и сопутствующую процессам синтеза биологически активных веществ, необходимых им для кооперативного функционирования в процессе иммуногенеза. Клетки с активированным хроматином обладают резко повышенным уровнем флуоресценции комплексов АО-ДИК в зеленой области спектра. Появленпеих в гетерогенной популяции лейкоцитов отражается на мнкрофлуориметрическнх цнтограммах и широко используется на практике в качестве показателя наличия или отсутствия реагируемостп иммунной системы на антигенную стимуляцию / L.A. Smets, 1975; Z.Darzynkiewicz et al.,1976; С. Gilí et al., 1976; M.M.Shapiro,198f/.

Представляло интерес сравнительное изучение реакции хроматина лейкоцитов мышей и морских спинок в отпет на иммунизацию их вакципнммп штаммами Y.pcstîsc различными антигенными свойствами, сопоставление этих данных с результатами экспериментов по заражению вакцинированных животных, которые параллельно проводились нашим соавтором /'G.Slivedime et al. Í996; Г.П. Шведз'Н с соавт., 1997/'.

Двухпараметрнческии микрофлуориметрнческий анализ каждого из лейкоцитов крови одновременно п двух областях спектра (от 515 до 580 им и свыше 630 им) позволил обнаружить, что иммунизация лабораторных животных наиболее нммуногенными штаммами чумного микроба ЕВ ПИИЭГ и КМ 226, несущими рРга и pCad, вызывает характерную клеточную реакцию в условиях in vivo. Только в ответ на эти два штамма, в стерильной фазе иммуногенеза регистрировали появление в периферической крови мышей и морских свинок лейкоцитов с повышенным уровнем свечения лизосомальных гранул при одновременном увеличении степени активности центрального генетического аппарата иммунокомпетентных клеток (табл.1 и табл.2). Различные типы реакции клеток иммунной системы, которые возникали у мышей (рис.14) и морских свинок (рис. 15) в зависимости от антигенных свойств штаммов Y. pestis, отражали двухпараметрнческне цнтограммы, где каждой точке (клетке) соответствовала вершина вектора. Координаты этого вектора одновременно отражали уровень красного свечения лнзосом (ось абсцисс) и зеленого свечения ядра (ось ординат) в каждом из клеточных элементов.

Лейкоциты с активированным хроматином и с повышенным свечением лизосомальных гранул появлялись в крови мышей (реакции типа III и IV), иммунизированных ЕВ и КМ 226, через сутки и присутствовали в гетерогенной фракции цельной крови на протяжении всего периода иммуногенеза (до 3-х недель). Другие, менее протективные штаммы, либо совсем не вызывали активации хроматина лейкоцитов (реакция I тина) на фоне повышения активности их лнзосомальной системы (pCad-,pFra-), либо активировали хроматин клеточных элементов, но только в нестерильной фазе иммуногенеза (моноплазмидные pFra+ и pCad+). Штамм КМ 226, лишенный pl'st, вызывал самую интенсивную ответиуюклеточную реакцию у мышей но двум исследуемым

Тавл.1 Изиенеш в структуре хроматина и в состоши лизосомального аппарата иммунокомпетентннх клвток крови имей в различные сроки после иммунизации ганнанн чумного микрова, отдича»-(икисз по пшиидноиу пробили и уровни инмуногенности.

Втанн Y-pEstis Плазнидный : 1-е сутки 3-е сутки 21-е сутки LD 50 lt«K IUI

: TP КИЗ*, X : Ш X TP : КИЗ», X : КШ, X TP : ЮШ, X : КШ, X

КОНТРОЛЬ : - 3,4 t 1,8 : 2,3 i 1,5 - : 2,2t0,6 : 3,6 t 0,8 - ¡ 2,9+1,1 : 2,8+1,0 - -

КН 226 pfra pCad :III 16,2 t 3,6 : 24,3 í 6,5 IV : 45,6+11,2 : 33,1+ 8,5 III: 14,0+7,6 : 18,2í2,4 215480 19.584

ЕВ ШЗГ pFra pCad pPstilll 9,8 ± 1,6 : 8,2 + 2,6 IV : 17,5+7,1 : 12,8+. 3,4 III: 10,114,3 : 12,7+3,1 100000 9.690

№225 pFra siII 20,3 i 4,6 : 27,0 +10,2 IV : 51,0+12,2 : 40,3+11,3 I : 4,3tl,3 1: 39,4t9,2 26100 2.373

№227 pFra pPst : II 28,3 + 9,2 ; 4,6 + 2,6 i 11:40,2+9,0 : 5,lil,7 1 I : 3,1+0,8 t: 23,7*10,1 21553 1.959

КН £15 pCad pPst ¡ I 4,6+1,4 i : 32,3 + 9,5 Ills 11,1+6,5 : 15,5*3,3 I : 3,5tl,4 1: 17,1+4,3 21513 1.334

КН 217 pCad : I 3,9il,l i : 27,3 + 7,7 II : 9,6+3.0 : 3,4+1,6 * - : 4,0+0,6 3,3+0,9 1 14679 619

№216 pPst ; I 5,2t2,4 i : SH,1 +8,5 I : 1,8+0,4 i: 28,2i7,8 - : 2,6i0,2 I: 5,4H,8 1 6812 750

№218 : I 3,0tl,2 1 : 28,6 + 9,2 I: 2,5+0,9«: 7,4+1,2 - : 6,4+2,8 it: 2,1+0,7 1 '8254 909

ТР - тип реакции клеточных1 элементов (смотри рис. 1ч) ЮВ$ - клетки с интенсивной зеленой флуоресценцией хроматина учитывали на гистограммах

в оеласти свше 100 каналов ,лрн СБ=2048 и наприенни ¿80 вольт на ♦отодетекторе 1 Ш'Л - клетки с повыеиной красной флуоресценцией тосом учитшали на гистограммах

в оеласти csuie 100 каналов при С8=2048 и наприенни 720 вольт на |отодетекторе 2 I - показатель не отличало от соответствуадего показател« у интактных контрольных

ihbothux (Р > 0,(6 ). И.И.- индекс иммунитета (Г-П- Введун, АЛ- Кравцов с соавт.,1997).

Тавл. 2 Результаты опытов по мнкрофлуоринетричесшу анализу в потоке cdctdjhui хроматина и лизосонального аппарата лейкоцитов крови морских свинок, иммунизированных вакцинными ■танками Y* pestis, отличаетимиса по плазниднону пробил» и уровня протективности* '

Итамн Y.pestis

1-е сутки

3-е сутки

30-е сутки

TP : ЙШ, X : Ш, X ! Ш : TP : КПЗ», X : №, X : Ш : TP : К1Ш, X s Ш, X : Ш

КОНТРОЛЬ -

ев тог II

КН £26 II

№ 215 I

т 216 III

кн 217 I

КН 213 III

КМ 225 II

КН 227 II

1,3*0,5 1,2*0,7« 2,010.6» 3,1*1,7» 2, ¿¿1,0»

2,9*1,1» 2,WO,Я

1,8*0,6» 1,6±0,31

33,4+5,8 70,5*8,1 82,0*9,5 79,а+й,б 64,6+7,В

77,3*6,1 31,0+6,3

73,4*8,0 65,3*5,7

318*52 164*34 188*38 305*65» 192+28 (1) 618*66*(1) 299+33» 225+43 (5) 608+52*(1) 215*35 176+28

1,5*0,3 9,6+1,6 8,8*1,3 10,1+0,7 18,0+1,6

39,6+8,4

82,0+5,5

75,2*10,4

85,4+3,0

85,5+6,5

I 3,4+1,2» 77,7+4,9 III 1,6+0,2» 65,8+2,2

II 2,2+0,4» 84,1+3,5

313+45 -

173141 IV

196*32 IV

162+24 -

215+21 II

275*31» II

211*27 (2) -

518*30*(1)

200*20 -

306*32» -

2,1+0,5 22,2*6,4 10,6+2,8 2,4+0,8» 1,8Ю,6»

44,2*6,8

76,8+7,2

65,4+6,2

41,1*7,7»

57,0+4,7

323*35 202*84

згтв

298*42»

гог+за

3,3*0,7» 60,4+4,2 190+26

2,3+1,41 36,6*9.01 230*351

5,8*2,6» 48,8+6,6» 303*41»

4,6+2,21 37,5*6,11 292+46»

TP - тип реакции лейкоцитов на ватмця» (штри рис- 15)

ИШ, КШ и » - как и в табл- 1 для опытов с миани. Исходные -¿начет показател« ЙКФ около 40 X - гранулоцитн-МФ - значение максимума пика красной флуоресценции лизосом фагоцитов в условных единицах (каналах) на гистограммах. * - оЕозначены случая наличия двух гранулоцнтарных пиксш на гистограмме, а р!доя (цифра) - это долевое соотногение двух сувполулщий фагоците» в периферической крови*

Показатели (И ± » ) расчитаны из 6 опытов с кров tu 6 осовей. Олазнидный профиль вакцинных наймов смотри в тавл. 1* Измерение уровня свечени! лизосом проводили путем делени! входного сигнала не на 512 (рис* 10), а на 2048 каналов-И-И.- индекс иммунитета (Г*П* Шведун, А*Л* Кравцов с саавт.,1997)-

КОНТРОЛЬ

Рис. 14 Четыре типа реакций ядерного хроматина и лизосомаль-ного аппарата в иммунокомпетентных клетках нишей в ответ на иммунизации изогенными производными вакцинного штамма ЕВ чумного микроба с различным плаз шипим составом и уровнем шнуногенности.

Примечание: на кащдрй фотографии (цитограыме) по оси абсцисс-содержание лизосон на клетку в у.е. (каналах), а по оси ордзшат-уровень активности хроматина в у.е. зеленой флуоресценции АО.

В крови мышей до антигенной стимуляцда (нонтроль) отсутствуют клеточные элементы с повышенной интенсивностью флуоресценции (более 100 у.е.) как в зеленой (вше горизонтальной линии), тан и в красной (справа от вертикальной линии) областях спектра.

I - активация лизосомалыгаго аппарата лейкоцитов крови без реакции со стороны хроматина иккушжонпетентных клеток II - активация хроматина лейкоцитов без появления в крови

клеток с активированный лнзосональкнн аппаратом III - появление в крови лейкоцитов с активированным хромзтннон н лнаосональнын аппаратом (¡II = I + II) ¡V - активация хроматика и зшосоыального аппарата одновременно в катаем из клеточных элементов (VI = I х II)

Интенсивность красной фгуореспегашя .плюсом на метит в условии едагоша! (канала! от 0 до 1П2().

Рис. 15 Четыре типа реакций ядерного хроматша и лпзоссиаль-ного аппарата лейкоцитов крови морских свинок'В отпэт на иыыуииашм шогешшми прогаашпшми вакцинного шта-| ина ЕВ чумного микроба с различным плаамшшм составом

I !1 уровне;! шмунагенности.

, Примечание: в крсвл норсюп свинок, в отлмне от миаеи | (рис. 14), ро антнгениои стимуляции (контроль! имеется око' ло 40 клеток (нейтройиов) со ссеченнэн лгзвсои более 100 ! у.е. ( справа от вертикально]! линию. ! I - грамулпшгюэ без ганенения в лнзосомзлмюм аппарате и хроматине клеточнид элементов: II - грану лошггаз при дегра-нуллшт '1агошггов (Дег.Гр.) и этсутствш! геакшш со стороны , генетического аппарата шиунЬкомпетентныя платок: III -гранудсшиоз и псяяланке субпопуллшш ,1агки:тов с повшаенным свечением лнзосом (АнГр). Акпзашя хроматина в клетках отсутствует: IV - появление в крови исяопуиезроз с актн-ятфсвэншги :{гачат!я:о!1 и ляоссмалшгч зппасатсн (лк.Л). 1 - лкйжята: Гс. - ггасу.ташги ивавн. 45

параметрам и обладал более высокой мммуноггнностыо по сравнению с полноценным по нлазмндному составу ппаммом ЕВ НМИЭГ (табл. 1).

На 1-е п 3-и сутки иммуногенеза отмечали интенсивную реакцию со стороны генетического аппарата иммунокомнетентных клеток мышей в ответ на все pFra+ вакцинные штаммы чумного микроба, включая моионлазмпдиый КМ 225 (табл.1). Возможно, это связано с самым высоким дефицитом лнзосом в гранулоцитах крови у этого вида грызунов, с самым низким уровнем активности в них лейкоцитарной эластазы (рис. 13), играющей ключевую роль в расщеплении структурных белков на поверхности грамнегатлвных микроорганизмов / J. Blondín, Л. Janoff, 1976 /'. В ответ на иммунизацию чумной вакциной, в периферическую кровь мышей, как известно, очень быстро мигрируют лпзосомосодержагцие мононуклеарные фагоциты и Тлнмфоциты киллеры, обладающие повышенной пролиферативной активностью /Л.С. Назарова с соавт., 1990; Е.И. Тихомирова, 1990; Г.И. Васильева, 1990 /.

У морских свинок через сутки после нмм}'ннзации pFra+ штаммами нзогенной системы отмечали повышение в крови относительной доли гранулоцитов (гранулоцитоз), а также характерную их дегрануляцшо (реакция 11 типа), выражающуюся в достоверном, двухкратном снижении з'ровня свечения лизосом фагоцитов в красной области спектра относительно нормы (рис.15 и табл.2). Такие сдвиги на микрофлуориметрических гистограммах возникают, как известно, при воспалительном процессе, когда гидролиз антигенов бактерий (белков и лнпопротендов) нейтральными лейкоцитарными протеиназамн сопровождается повреждением азурофнльных гранул нейтрофнлов /' W.R. Abrains et al., 1983 /. Несмотря на одинаковый характер сдвигов в лнзосомальном аппарате нейтрофнлов под влиянием четырех штаммов, имеющих pFra, только КМ 226 и ЕВ, несущие также pCad, активировали хроматин иммунокомпетентных клеток (реакция IV) в стерильной фазе вакцинального процесса и предохраняли свинок от заражения (табл.2).

Лнэосомальнын аппарат нейтрофнлов крови морских свинок в З'словиях гранулоцитоза (рис. 15) не реагировал на бесфракционные штаммы pFra-, pCad+ (реакция I), а при иммунизации их штаммами pFra-, pCad- отмечали появление субпопуляции гранулоцитов с резко повышенным свечением лнзосом на клетку (реакция Ш). Это

клеточные элементы с активированным лизосомальным аппаратом, в которых идет процесс образования фаголизосом ■ И.С.Френдлнн с соавт., 1980 ,/. Бактерии штаммов с такими плазмндными профилями наиболее быстро поглощаются п перевариваются (фагоцитами / Л.М. Куклева, O.A. Процепко,1985 /. В условиях in vivo они не активировали генетический аппарат иммунокомпетентных клеток и не предохраняли морских свинок от заражения (табл.2).

Активацию генетического аппарата лейкоцитов морских свинок в стерильной фазе в ответ на протективные для них штаммы ЕВ НИИЭГи КМ 226 может объяснить предположение, что она возникает под влиянием антигенов, синтез которых предопределен хромосомными генами н внехромосомнымн генами плаэмпды pCad. Возможно эти антигены, экранированные и защищенные капсулой (ОСА, мембранные белки, V и W ), проявляют свои известные по отношению к морским свинкам нммуногенные свойства / A.B. Наумов с соавт., 1992/ лишь после расщепления капсульного антигена нейтральными протенназами граиулоцитов, обладающими у животных этого вида более высокой гидролитической активностью, чем у мышей (рис.13). Моноплазмндный штамм pFra+ (КМ 225) совсем не активировал хроматин иммунокомпетентных клеток морских свинок. Бесфракцнонные штаммы, имеющие pPst и pCad, вызывали реакцию хроматина лейкоцитов в нестерильной фазе (на 3-н суткн), которая исчезала спустя 4 недели после иммунизации (табл. 2).

Разработанные нами цитофлуорнметрические показатели уровня реагируемости иммунной системы in vivo по степени активации хроматина и лизосомалыюго аппарата лейкоцитов цельной крови / А.Л. Кравцов с соавт., 1990 /' используются в настоящее время в лаборатории иммунологии РосНИПЧИ «Микроб» для контроля за процессом иммунологической перестройки у людей, иммунизированных живой чумной вакциной / II.Г. Симонова, И.Г. Дроздов, А.Л. Кравцов с соавт., 1990; А.В.Наумов с соавт., 1992; Ю.В.Лазовский, 1994/.

Активация хроматина иммунокомпетентных клеток является универсальным механизмом нх ответной реакции на протективные антигены, независящим от вида чувствительного организма. Практическое использование этого показателя может быть особенно актуально в условиях невозможности определения уровня

пммуногенностн чумной вакцины для люден биологическим методом, а также недостаточности данных по оценке антнтелогенеза как критерия иммунологической реагируемости на чумной микроб /A.B. Наумов с соавт., 1992; M.Yu. Ledvanov et al., 1994 /.

ВЫВОДЫ:

1. Проточная мнкрофлуориметрия относительного уровня содержания ДНК в большом количестве отдельных бактерий Y. pestisобеспечивает возможность получения информации остепени неоднородности популяции клеток 43'много микроба по состоянию их генетического аппарата. Контроль за перераспределением бактерий по клеточному цикл}' возможен в лаг-фазе роста в оптически неплотных культурах с концентрацией ниже 10 8 м.к./мл.

2. Стационарная культура вакцинного штамма ЕВ чумного микроба однородна по функциональным параметрам отдельных клеточных элементов и включает не менее 90 % бактерий с относительно низким з'ровнем содержания ДНК и белка. В лаг-фазе роста, в интервале времени от 3 до 6 ч, происходит переход бактериальной попз'ляцни в гетерогенное состояние, который полностью ннгибирз'егся при наличии в исходной кз'льтз'ре стрептомицина в дозе 100 мкг/мл.

3. Разработан быстрый п высокоэффективный способ идентификации бактерий Y.pestis и дифференцирования их от близкородственных бактерии псевдотз'беркз'леза, основанный на количественном измерении интенсивности иммз'нофлз'оресценции отдельных клеточных элементов в потоке со скоростью 1 ООО м.к./с и автоматической сортировке их по этому показателю на 512 одинаковых электронных з'ровней относительного свечения (каналов).

Установлена возможность построения наглядных статистических профилей распределения десятков тысяч отдельных клеток чзгмного микроба по уровню специфической иммзчюфлуоресценцни в неоднородных бактериальных кз'льтурах.

4. Сравнительный анализ иммунофлуоресцентных гистограмм бактерий Y.pestis до п через 6 ч подращивания клеток 28° стационарной кз'льтз'ры при 37°С позволяет в опытах с коммерческим препаратом ч}'мной поливалентной диагностической люмннеецнрующей сыворотки дифференцировать pPst+,pFra+ штаммы чумного микроба от штаммов

изогеннои системы, дефектных по признакам pFra и pPst.

5.Оптимизированы условия измерения относительного содержания /IHK в иммунокомпетентных клетках лабораторных грызунов, а также определения долевого соотношения их на стадиях Gl /Go, S, G2+M клеточного никла в крови и органах иммунной системы с учетом степени неоднородности по уровню содержания ДНК на клетку в диплоидной фракции. Установлено, что в отсутствии антигенной стимуляции исходную пролнферативуго активность лейкоцитов in vivo отражает показатель S+G2+M (в %), который для каждого из органов иммунной системы поддерживается на различном, но строго определенном и неизменном уровне.

6. Вирулентный штамм Y.pestis 231, в отличне от вакцинного ЕВ, обладает генотоксичностыо но отношению к клеткам иммунной системы макроорганпзма, вызывая появление неоднородности по уровню содержания ДНК в субпопуляции с исходно одинаковым (2с) значением этого показателя, а также нарушает in vivo регуляцию умеренного процесса репродукции лейкоцитов, индуцируя в первые трое суток после заражения резкое повышение уровня их пролиферативной активности (в 4-6 раз) в крови, лимфатических узлах и селезенке.

7. Разработан способ оценки фагоцитоза, основанный на проточно-микрофлуориметрическом контролеза уровнем содержания ДНК в макрофагах, культивируемых in vitro с чумным микробом, на регистрации процессов накопления и разрушения в фагоцитах микробной ДНК, а тагсясе на детекции фагоцитов с поврежденным хроматином, обладающих пониженным уровнем ДНК флуоресценции. Установлено, что динамика изменений внутриклеточной ДНК в макрофагах зависит от вирулентности штамма Y. pestis и исхода фагоцитарной реакции.

8. Разработан и стандартизирован способ сравнительного исследования на субпопуляцнонном уровне состояния лизосомального аппарата лейкоцитов у экспериментальных животных, основанный на количественном измерении интенсивности флуоресценции лизосом лейкоцитов непосредственно в цельной кровн и на построении статистических профилей распределения десятков тысяч отдельных клеток по уровню содержания лизосомальных гранул.

9. В отличие от людей, собак и лошадей для всех лабораторных грызунов (особенно для мышей) характерен сильно выраженный

дефицит лп.юсомальных гранул п (фагоцитах крови. Люди п нечувствительные к экспериментальной чуме собаки по уровню содержания лм.юсом и лейкоцитах занимают промежуточное положение между грызунами и абсолютно нечувствительными к чуме лошадьми. Разделение суммарного пула гранулоцптов на две субнопуляцни с различным состоянием лплосомального аппарата существует только у двух нечувствительных к чуме крупных млекопитающих.

10. Иммунизация мышеи и морских свинок наиболее протектнвнымн штаммами Y. pestis ED (pPst+,pCad+,pFra+) и КМ 226 (pPst-,pCad+, pFra+) вызывает повышение активности центрального генетического аппарата лейкоцитов в стерильной фазе иммуногенеза. Изогенные производные вакцинного штамма ЕВ с иными плазмидными профилями не активируют хроматин иммунокомпетентных клеток (pCad-,pFra-), либо активируют его только в нестерильной фазе вакцинального процесса (моиоплазмидный pFra+ - у мышей, но не у морских свинок).

11. На ранней стадии противочумного вакцинального процесса (на 1-е сутки), в ответ на иммунизацию всеми pFra+ штаммами изогенной системы в крови морских свинок достоверно увеличивается относительное количество фагоцитов (граиулоцитоз), обладающих пониженным з'ровнем свечения лизосом на клетку, а в крови мышей, наоборот, появляются фагоциты (макрофаги) с повышенной интенсивностью свечения лизосом в красной области спектра.

СПИСОК РАБОТ,ОПУБЛИКОВАННЫХ IIO ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Анисимов П.И..Кравцов А.Л., .Мареев В.И.,Белобородое P.A. Изучение первичного иммунологического ответа лимфоцитов белых мышей на введение фракции 1 чумного микроба методом проточной цнтофлуориметрнн // Молекул, биол. и генетика возбудит, особо опасных ннф.- Саратов, 1982.- Ч.2.- С.3-7.

2. Кравцов А.Л ., Наумов A.B. Метод импульсной проточной

цнтометрин и его возможности в изучении особо опасных

инфекций//Акт. вопр. лаб.диагностики и биохимии возбудит, чумы нхолеры.- Саратов, 1984,- С.3-11.

3. Кравцов А.Л., ЛедвановМ.Ю., Наумов A.B. и др. Использование

метода проточной цмтофлуорнметрпн для регистрации нролифератнвного ответа лимфоцитов животных на антигенную стимуляцию .' Тез.докл. Псесоюзн. конф. «Молекул, биол., генетика и нммунол. возбудит, особо опасных миф.».- Ростов-н/Д., 1984.-С.117-118.

4. Ледванов М.Ю.,Кравцов Л.Л., llaj'Mon A.B. Использование метода проточной цитофлуориметрни для оценки действия вакцинных препаратов //Акт.вопр.бактериофагии и прикладной нммунол.: Матер.Всесоюзн. снм11.,посвя1Ц.60-лети1оТбилисского НИИ вакцин и сывороток.- Тбилиси, 1984.- С.456-458.

5. Кравцов А. Л., ПилиненкоТ.Ю., Коровкин С.А., Наумов A.B. Способ оценки фагоцитоза: A.c. 1522923 СССР, МКИ G 01 N 33/ 53.-N 4014143/14; Заявл. 19.11.1985; Опубл.28.02.94,Бюл.М4 // Изобретения .-1994.-N4.-C.187.

6. Ледванов М.Ю., Адамов А.К., Кравцов А.Л., Наумов A.B. Влияние иммунизации холерной вакциной на синтез ДНК в лимфоцитах // Механизмы формнров. иммунитета к особо опасным инф,- Саратов, 1986.- С.76-85.

7. Ледванов М.Ю., Тихонов Н.Г., Адамов А.К., Наумов A.B., Кравцов А.Л. н др. Распределение лимфоцитов по фазам клеточного цикла в популяциях Т,В, D ,0 в крови людей и в органах иммунной системы животных, вакцинированных против холеры // Журн.микробиол.,эпидемиол. н иммунобиол.ИЭвб.-МО.- С.80-85.

8. Кравцов А.Л., Ледванова Т.Ю., Сергеева Г.М., Коровкин С.А. О различном воздействии клеток вакцинного н вирулентного штаммов чумного микроба иа структуру хроматина лейкоцитов зараженных животных // Мнкробиол.и биохимия особо опасных инф..- Саратов, 1988.- С.47-53.

9. Кравцов А.Л., Наумов A.B., Коровкин С.А. Метод количественного определения специфической активности иммуноглобулинов диагностических чумных люмннесцирующих методом импульсной проточной цитофлуориметрни // Лаб.дело,-1988.- N12.-С.59-62.

10. Кравцов А.Л. Использование метода импульсной проточной цитофлуориметрни для быстрого обнаружения и идентификации чумного микроба // Автореф. дисс. ... канд. биол. наук.-Саратов, 1989. -33 с. -(ДСП).

11. Кравцов А.Л., Ледванов М.Ю., Саягшна Л.В., Аннсимова

т.н.

Определение ДНК синтезирующих н делящихся клеток методом проточит! цнтофлуорнметрнн (Метод, рекоменд.).- Саратов, 198.9.-18с.

12. Синичкина 11.Л., Кравцов А.Л., Кузьмнченко Ii.А. Реакция лимфоцитов крови восприимчивых к чуме животных на введение фосфолипаэы Д чумного микроба // Энидемнол., микробнол. п иммунол. бактернал. и впрусн. инф.: Тез. докл. обл. научи, конф.молодых ученых.-Ростов-н/Д, 1989.- С.41-42.

13. Саяшша Л.В., Кравцов A.JI., Ледванов М.Ю. Изучение иммунологической реактивности при чуме вакцинированных и зараженных морских свинок методами проточной цнтофлуориметрип и розеткообразовання // Акт. вонр. эпидемпол., нрофилакт. и диагност, особо опасных ннф.: Тез. докл. итоговой научи, конф.-Ставрополь, 1989.-С.53-54,- (ДСП).

14. Ледоаиоп М.Ю., НаумовА.В., Герасимова К.И., КраоцовА.Л., Стукова М.Ю. Биоэнергетические процессы в лимфоцитах при формировании иммунитета /,/ Первый Всесоюзн. иммунол. съезд (Сочи): Тез. н стенд.сообщ,- М., 1989.-Т.2.-С. 156.

15. Саяпнна Л.В., Кравцов А.Л., Анисимова Т.И. Изучение методом проточной цнтофлуорнметрнн нммз'нологнческой реактивности морских свинок, вакцинированных против чумы // Факторы клет. и гумор. иммунитета при различных физиол. ипатологнч. состояниях: Тез. докл. X научи, конф.- Челябинск, 1990.- С. 128-129.

16. Саяпнна Л.В., Кравцов А.Л. Цитофлуориметрический метод изучения механизма иммунитета и инфекции при чуне / / Молекул, механизмы развития инф. забол. : Тез. докл. Всесоюзн. конф.- Звенигород, 1990.-С. 103.

17. Кравцов А.Л., Наумов A.B., Коровкин С.А. и др. Использование двухцветной цнтофлуорнметрнн в потоке для быстрого обнаружения и количественной оценки изменений в функциональной активности лейкоцитов в процессе иммуногенеза при чуме // Микробиол. биохим. н специфпч. профилакт. карантин, ннф,- Саратов, 1990.-С.66-74.

18. Синичкина H.A., Кравцов А.Л., Кузьмнченко И.А., Задумнна С.Ю. Изменение функционального состояния лейкоцитов крови белых крыс под воздействием фосфолнпазы Д чумного

микроба // Гам же.-С.52-59.

19. Спмоиоиа 11. Г., Дроздов И.Г., Крапп»» АЛ. илр. Состояние хроматина лимфоцитов крови людей, иммунизированных живой чумной вакциной / / Факторы клет. и гумор. иммунитета при различных физнол. ппагологпч. состояниях: Тез. докл. X Всесоюзн. конф.- Челябинск, 1990.-С. 130-131.

20. Симонова II.Г., Дроздов И.Г., Кравцоп А.Л., Шведун Г.П. Процессы активации хроматина лимфоцитов крови у людей, иммунизированных живой чумной вакциной// Молек. механ. развития ниф. забол.: Тез. докл. Всесоюзн. конф.-Звенигород, 1990.-С. 107.

21. Шведун Г.П., Кравцов АЛ., Ледванов М.Ю., Проценко O.A. Влияниеплазмид вирулентности на функцнанальную активность лейкоцитов в процессе иммуногенеза прн чуме /'/ Там же. -С.127-128.

22. Кирнлличева Г.Б., Богомолова Н.В., Евстраиова И.В., Ермакова Г.В., Кравцов А. Л. и др. Особенности нммуномодулирующего действия DaGO у мышей различных линий // Взаимодействие нервн. и нммун. систем: Тез. докл. V Всесоюзн. сими. - Ростов-н/Д, 1990.-С.98.

23. Ледванов М.Ю., Наумов A.B., Герасимова К.И., Симонова Н.Г., Стукова И.Ю., Емельянова Н.В., Кравцов А.Л., Дроздов И.Г.Клнннко-нммунологические методы диагностики и прогнозирования эффективности нммуиореабнлнтацнн людей с вторичными поствакцинальными нммуиодефиннтамп // Реабнл. нммун. системы: Тез. докл. 1 Интернац. конгр. -Цхалтубо,1990,- С.35.

24. Ледванов М.Ю., Стукова II.Ю., Емельянова II.В., Симонова Н.Г., Таран В.И., Лазовский IO.В., Кулнченко М.А., Тихомирова Л .А., Шведун Г.П., Кравцов А.Л., Брандзншевскнй Ю.В. Использование лабораторных животных в экспериментах по созданию систем иммунологического мониторинга вакцинного и инфекционного процессов прн чуме // Лаборагор. животные для мед.-бнол. и биотехнол. исследований: Тез. докл. Всесоюзн.копеji.- М.,1990.-С.109.

25. Синичкина H.A., Кравцов А.Л., Куэьмичетсо H.A. и др. .Характер (флуоресценции лейкоцитов кропи под влиянием фосфолипазыД и некоторых антигенов чумного микроба/'/' Актуал. проблемы н задачи биохимии, днагп. и иммунопрофил. особо опас-

пых миф.-Саратов,1991,- С.23-27.

26. Гусева U.U., Ермакова Г.В., Кравцов А.Л., Наумов A.B. Цитотоксическое действие лнпополнсахарнда чумного микроба н его липосомалыюп формы па лимфоциты крови мышей // Там же,-С. 35-38.

27. Ермакова Г.В., Гусева Н.П., Кравцов А.Л., Наумов A.B. Снижение токсического действия лнпополисахарнда чумного микроба, модифицированного липосомон // Матер. Росс. naj'4H. конф."Генетика и биохимия вирулентности возбудителен особо опасных инфекций".- Волгоград, 1992.-С.92.

28. Naumov A.V., Ermakova G.\'., Lupikova N.I., Guseva N.P., Kravtsov A.L., Taranenko T.M., Veinblat V.l. Testing of functional interaction of immune system cells and Plague microbe antigens // Abstracts 1-st Intern.Conference on Immunorehabilitation. - Sochi, Dagomys.-1992.-Tskhal tubo, 1992. - P. 117-118

29. Синичкина II.А.,Кравцов А.Л., Наумов A.B., Кузьмнченко И. А. и др. Сравнительный цитофлуориметрнческнй анализ лейкоцитов крови морских свинок при воздействии фосфолипазы Д и некоторых антигенов возбудителя чумы// Журн. микробиол., эпндемиол. и иммунобиол.-1992.-N11-12.- С.52-54.

30. Ермакова Г.В., Гусева Н.П., Кравцов А.Л., Наумов A.B. Нейтрализация токсического действия липополисахарида Yersinia pestis,модифицированного липосомой,- Деп. в ВИНИТИ 11.02.93.-N332-B93.

31. Кравцов А.Л., Шведун Г.П., Ледванов М.Ю. О действии продуктов плазмид Y. pestis на лейкоциты крови морских свинок в процессе иммз'ногенеза при чуме по данным цнтофлуориметрического анализа ,// Пробл. особо опасных ннф.- Саратов, 1993.- Вып.3(73).-С. 135-146.

32. Саяпнна Л.В., АнисимоваТ.И., Кравцов А.Л. и др. Изучение иммунного статуса организма морских свинок в динамике чумного инфекционного процесса // Иммунол. н спецнфич. профилакт. особо опасных ннф.: Матер. Росс, научн. конф.-Саратов, 1993.- С.58-59.

33. Шведз'н Г.П., Кравцов А.Л. Регистрация изменений в хроматине и лизосомах лейкоцитов, происходящих под влиянием противочумной вакцинации // Там же.- С.42-43.

34. Кравцов А.Л., Кирнллнчева Г.Б., Ермакова Г.В., Ломова

Т.М. Результат!!! сравнительного цитофлуорнметрического анализа клеток неритоиеалъиого экссудата беспородных мышей и мышей генетически чистых линий. Дегрануляция макрофагов под влиянием "мышиного" токсина //' Там же,- С.41-42.

35. Батурина И.Г., Наумов А.В., Тараненко Т.М., Ледванов М.Ю., Кравцов А.Л. и др. Особенности иммуномодулирующей активности капсулыюго антигена чумного микроба у мышей различных линий //Там же.-С.5-6.

36. Шведун Г.П., Стз'кова Н.Ю., Кравцов А.Л., Ледванов М.Ю. Биофизические методы исследования функционального значения продуктов синтеза генов, детерминирующих иммуногенез прн чуме // Там же.- С.80.

37. Ермакова Г.В., Кравцов А.Л., Тараненко Т.М. Использование проточной цитофлуориметрнн для изучения цитотоксического действия липополисахаридов Yersinia pestis // Матер. Межгосударств, научи, коиф."Проблемы н меры борьбы с чумой", посвящ. 100-летию открытия чумы.- Алматы, 1994.-С.91-92.

38. Кравцов А.Л., Костылева Н.И. Результаты цнтометрии ДНК бактерий Yersinia pestis в процессе роста на среде,не содержащей и содержащей стрептомицин // Пробл. особо опасных инф.-Саратов,1994,- Вып.5 (75).- С.97-106.

39. Ледванова Т.Ю., Кравцов А.Л., Коровкин С.А. и др. Способ оценки фагоцитоза чумного микроба с использованием проточной цитофлуорнметрии //Актуал. пробл. профнлакт. особо опасных и природноочаг. пнф. бол.: Тез. докл. научн. конф., посвящ. 60-летнго Иркутского ПЧИ,- Иркутск, 1994.-С.89.

40. LupikovaN.I., Ermakova G.V., Kravfcsov A.L., SinichkinaN.A. Immunomodulating effect of Y.pestis antigen structures containing lipid components // lnt.J.lmmunoreabilit.-1994.-Nl.-Suppl.-P.211-212.

41. Ledvanov M.Yu., Stukova N.Yu., Drozdov I.G., Lazovski Yu.V., Tichonov S.N., LedvanovaT.Yu., TaranenkoT.M., Kravtsov A.L. etal. Investigation of neutrophil chromatin and lisosomal activity by flow cytometry// Ibid.- P.204.

42. Кравцов А.Л., Ледванова T.JO. Цитометрия ДНК макрофагов в культурах,инфицированных бактериями Y.pestis.-Деп.в ВИНИТИ 24.05.95,- N 1489-В95,- 13с.

43. Кравцов А.Л., Кпрплличева Г. 15., Царева О.Е., Степанова

B.Ю. Сравнительный цитофлуориметрическнй анализ лнзосом с активностью эластазы ,мнелонероксндазы п лнзоинмав гранулоцитах и клетках системы моноиуклеарных фагоцитов мышей .морских свинок и человека // 11робл. особо опасных инф.-Саратов, 1995,-Вып.1(77).- С.123-134.

44. Кравцов А. Л., I НведупГ.П. Особенности клеточной реакции у мышей на иммунизацию субкультурами вакцинного штамма чумного микроба с различными антигенными свойствами. Структурные изменения в хроматине как показатель иммуногенности.- Деп. в ВИНИТИ 21.08.95,- N 2476-В95.-14с.

45. Кравцов A.JI., Наумов А.В., Коровкнн С.А. Качественные различия в лизосомальном аппарате фагоцитов крови у восприимчивых и резистентных к чуме видов животных, связанные с содержанием трипснноподобной протеин азы. Результа-тысравнительного микрофлуориметрического анализа с фагоцитами человека,- Деп. в ВИНИТИ 25.01.96.-N 306-В96,- 12с.

46. Кравцов А.Л., Наумов А.В., Коровкии С.А. Различия в лизосомальном аппарате фагоцитов кровн резистентных и восприимчивых к чуме видов животных на субпопуляционном уровне, связанные с содержанием трипснноподобной протеиназы // Экол.-эпидемич. надзор за природно-очагов. инф. в сев. Прикаспии.- Астрахань, 1996. -С. 164-166.

47. Shvedun G., Kravtzov A., StukovaN., LedvanovМ. Revealing of Y.pestis antigens role in promoting of cell immunity by biophysical methods // Internat. Symp. on novel methods and standartization in microbiology.-Kosice, Slovak Republic, 1996.-P.33.

48. Sayapina L., Shvedune G., Anisimova T. ,Ledvanov- M., Sergeeva G., Kravtzov A. Preclinical tests of harmlessness and activity therapeitic vaccines against especially dangerous infections //Ibid.-P.20.

49. Ледванова T.IO., Кравцов А.Л., Тараненко T.M., Коровкнн

C.А.Осуществление мониторинга развития фагоцитоза Y.pestis с использованием метода проточной цнтофлуориметрии // Матер.VI] съезда Всеросс. общ. эпидемпол., микробнол. и паразитол,- М., 1997.-Т. 1.- С.299-300.

50. Шведун Г.П., Кравцов А.Л., Стукова Н.Ю., Ледваиов М.Ю. Иммунологическая активность , цнтофлуориметрический и

Информация о работе

Кравцов, Александр Леонидович
доктора биологических наук
Саратов, 1997
ВАК 03.00.07

Автореферат

Микрофлуориметрическое исследование в потоке гетерогеннных популяций бактерий Y. pestis и клеток иммунной системы инфицированных чумой лабораторных животных - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы