Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Иммунохимическая и биологическая характеристика модифицированных производных липополисахарида чумного микроба

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Иммунохимическая и биологическая характеристика модифицированных производных липополисахарида чумного микроба"

На правах рукописи

БЕСПАЛОВА Ирина Александровна

ИММУНОХИМИЧЕСКАЯ И БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МОДИФИЦИРОВАННЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ЛИПОПОЛИСАХАРИДА ЧУМНОГО МИКРОБА

03.00.07 - микробиология

Автореферат

.диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

: ' од-

1 1 .. .1

Рсстсв-на-Дсну 1396

- г -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ: Существующая в настоящее время опасность возникновения вспышек чумы в эпидемически неблагополучных районах, усугубляющаяся отсутствием надежных средств специфической профилактики этого особо опасного инфекционного заболевания. не вызывает сомнения в актуальности проблемы поиска потенциальных компонентов противочумных препаратов нового поколения.

Основу полиантигенной вакцины должна составлять смесь охарактеризованных высокоиммуногенных и безвредных для человека антигенов. Одним из перспективных компонентов такой вакцины явля-. ется ЛГ1С, обладающий выраженным иммуномоду.пирующим действием (Бахрах Е. Э.. Вейнблат В. И.. Тараненко Т. М. и др., 1976. Тараненко Т.М.. 1988. Дальвадянц С.М.. Земцова И. Н., Белобородов Р.А. и , др.. 1980). Однако значительная эндотоксическая активность ЛПС служит препятствием его использованию в составе профилактических препаратов, обусловливая необходимость его детоксикации или модификаций. направленных на ослабление патогенных и усиление им-муногенных свойств (Назарова Л. С.. Тараненко Т. М., Исупов И. В., 1994, Станиславский Е. С., 1975, Тараненко Т. М.. Ермакова Г. В., Андреева И.П. и др.. 19S0, Brade H., Brade L., Rietschel Б., 1988. Munford R., 1988).

Известно, что токсичность ЛПС определяется наличием в составе его липида А глшозаминового дисахарида, несущего две фосфатные группировки, 5-Ô жирных кислот и имеющего хотя бы одну ацилоксиацильную связь (Книрель D.A., Кочетков Н.К., 1993, Brade H.'. Brade L.. Rietschel E.. 1988, Munford R.. 1988 ).

В связи с этим, уменьшения или отмены токсичности ЛПС можно достигнуть как путей дезацилирования (Munford R., 1988), так и-дефосфорилирования его молекул (Kotani S., Takada H., TsujImoto M. et al. 1984). При изучении свойств детоксицированных разными способами ЛПС энтеробактерий установлено, что снижение токсичности ЛПС возможно без угнетения иммуностимулирующей активности этого важного компонента наружной мембраны грамотрицатель-ных бактерий (Brade H., Brade L., Rietschel E., 1988, Chedid L., Audibert F., Bona С. et al. 1975, Munford R., Hall C.,1986).

В последние годы показана возможность получения модифицированных форм ЛПС чумного микроба со сниженной токсичностью (Ерма-

нова Г. Б., Тараненно Т.М., Наумов А. Б. и др.. 1992. Гусева И. П., Ермакова Г. Е., Наумов А. В. и др., 1591. Федорова Б. А., Ермакова Г.В., Тараненко Т.М. и др., 1994).

Однако до настолцег-о времени отсутствуют сведения о влиянии различных методов химической детоксикаиии ЛПС чумного микроба на его химический состав и иммунобиологические свойства. Не ясно -значение отдельных структурных компонентов молекулы ЛПС в реализации ее биологической активности. Вместе с тем, получение химически детоксицированных производных ЛПС чумного микроба представляет большой интерес, так как открывает перспективу включения этого антигена в состав профилактических препаратов нового поколения. Это, в свою очередь, требует проведения физико-химического анализа и сравнительного исследования биологических свойств исходного и детоксицированных препаратов ЛПС: токсичности, цито-токсичности, протективности, адъювантности, влияния на ишуно-компетентные клетки, способности индуцировать синтез цитокинов и вызывать гиперчувствительность замедленного типа (ГЗТ). Изучение этих вопросов позволит сделать вывод о целесообразности использования детоксицированных производных ЛПС при конструировании полиантигенных противочумных вакцин.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ: получение и сравнительное изучение физи-ко-хишческих и биологических свойств детоксицированных производных ЛПС чумного микроба для обоснования целесообразности их включения в состав профилактических препаратов, а также разработка клеточных моделей оценки степени детоксикации препаратов ЛПС.

• ОСНОВНЫЕ ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Получить очищенные препараты дезацилированного (ДЛПС) и дефосфорилированного (ЛПСР~) производных ЛПС чумного микроба; изучить структурные изменения и физико-химические свойства полученных препаратов в сравнении с исходным ЛПС.

2. Провести сравнительную оценку токсичности модифицированных препаратов ЛПС и их цитотоксичности в отношении перитонеаль-ных макрофагов (ГШ) ингактнмх экспериментальных животных.

3. Охарактеризовать протективную и адъшантную активности исходного и модифицированных препаратов ЛПС.

4. Изучить взаимодействие ЛПС и его модифицированных производных с клетками системы мононуклеарных фагоцитов (СЫФ).

5.Оценить митогенную активность исходного и модифицированных препаратов ЛПС.

6.Исследовать способность препаратов ЛПС индуцировать продукцию моно- и лиыфокинов (ИЛ-1. ФНО, факторов, активирующих нейтрофилы, ИЛ-2), а также-нейтрофилокинов, влияющих на функциональную активность макрофагов.

7.Изучить способность препаратов ЛПС индуцировать формирование ГЗТ. '

< 8.Осуществить корреляционный анализ взаимозависимости между структурными изменениями, происходящими при химических модификациях молекул ЛПС чушого микроба, и их функциональной активностью.

9. Разработать клеточные модели оценки степени детоксикации препаратов ЛПС чумного микроба.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ:

- Впервые показано, что мягкая щелочная обработка ЛПС чумного микроба наряду с дезацилированием обеспечивает элиминирование фосфорсодержащих групп, соответствующих сигналам -2,0 и +2,7ррт.

- Доказано, что обработка ЛПС чумного микроба плавиковой кислотой не сопровождается изменением жирнокислотного состава молекул, а характеризуется отщеплением фосфорсодержащих групп, дающих сигналы -2,0 и +4,5 ррш.

- Пойазано, что дезацилирование ЛПС снижает токсичность и ци-готоксичность исходного препарата, обеспечивая сохранение его серологической и адъювантной активности и усиление протективных свойств.

- Выявлено, что детоксицированные препараты ЛПС, особенно 1ЛПС, усиливают киллерную активность ПМ экспериментальных животных в опытах In vivo и in vitro в отношении вакцинного штамма iyt.iHoro микроба; активнее, чем исходный препарат, стимулируют йкрофагальную трансформацию моноцитов периферической крови и юрераспределение субпопуляций в суммарном пуле ПМ эксперимен--альных животных.

- установлено, что детоксикация ЛПС сохраняет его способность :ызывать формирование ГЗТ.

- Выявлено, что детоксикация ЛПС, особенно методом дезацили-ования, усиливает митогенную активность препарата.

- Показано, что модифицированные производные ЛПС чумного

микроба являются активными индукторами цитокинов, осуществляют инициацию и регуляцию иммунного ответа макроорганизма.

- Обосновано преимущество детоксикации ЛПС чумного ыикро методом дезацилирования перед методом дефосфорилирования. -ДЛП по сравнению с ЛПСР". менее токсичен и обладает более выраженн иммуностимулирующей активностью. Это подтверждает существован взаимосвязи структурных изменений с биологической активност ЛПС.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ:

Сравнительное изучение физико-химических и биологическ свойств исходного и модифицированных препаратов ЛПС чумного ми роба показало преимущества метода дезацилирования по сравнению дефосфорилированием, что позволяет рекомендовать ДЛПС в качест: одного из потенциальных компонентов профилактических противочу! ных препаратов нового поколения.

Полученные препараты исходного и модифицированных произво, ных ЛПС чумного микроба используются при изучении пато- и иш.г ногенеза чумы.

В Ростовском-на-Дону противочумном институте (РПЧИ) получ( набор МКА к антигенным детерминантам ЛПС чумного микроба, заемные свойства которых продемонстрированы на модели пассивной и ыунизации экспериментальных животных. •

Предложен способ оценки степени детоксикации препаратов Ш с помощью определения их цитотоксичности в отношении ПМ экспер! ментальных животных.

По материалам диссертации оформлены и утверждены Ученым С< ветом РПЧИ два нормативно-технических документа:

1. Инструкция по изготовлению и контролю очищенного липош лисахарида чумного микроба;

2. Инструкция по изготовлению и контролю дезацилированнм лилополисахарида чумного микроба.

ПОЛОЖЕНИЯ. ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Дезацилирование ЛПС чумного микроба путем мягкой щело1 ной обработки сопровождается отщеплением ряда жирных кислот элиминированием фосфорсодержащих групп, соответствующих сигнале -2,0. и +2, 7 ррт.

2. Дефосфорилирование ЛПС чумного микроба путем обрабоп плавиковой кислотой не сопровождается изменением кирнокислотног

- о -

состаза молекул, а характеризуется отщеплением фосфатных групп, соответствующих сигналам -2,0 и +4,5. ррм. '

• 3. Яетоксикацня ЛПС чумного, микроба, особенно методе,'.! дезь-цилирования, сохраняет его серологические и адъюзантные свойства и повышает протективную активность препарата.

4. Детоксицированные препараты ЛПС более интенсивно, по сравнению с исходным, активируют иммунокомпетентные клетки.

5. Модифицированные производные ЛПС чумного микроба являются активны.!» индукторами цитокинов, осуществляющих инициацию и регуляцию иммунного ответа ыакроорганизма.

6. Детсксикация ЛПС сохраняет его способность вызывать формирование ГЗТ.

7. Преимущества детока ¡нации ЛПС чумного микроба, методо;.! дезацилировзния в сравнении с дефосфорилированием, связанные с резки,! снижением токсичности и цитотоксичности ДЛПС при сохранении и дачсе усилении ишуностимулирующей активности исходного препарата.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ:

Материалы, изложенные в диссертации, обсуждены на:

. Международной конференции "Иммунодиагностика, иммунофер-ментный анализ и иммунотерапия" (Витебск, 1995).

- Межгосударственной научной- конференции "Профилактика и мера борьбы с чумой" (Алматы, 1994).

- Межгосударственной научно-практической конференции "Актуальные вопросы профилактики чумы и других инфекционных заболеваний" (Ставрополь, 1994).

- Российской научной конференции "Генетика и биохимия.вирулентности возбудителей 00И" (¡Волгоград, 1992).

- Российской научной конференции "Иммунология и специфичес-чая профилактика 00И" (Саратов, 1993).

- Российской научной конференции "Современные аспекты природной очаговости, эпидемиологии и профилактики 00И" (Омск, 1993)._

- П Путинском Совещании "Культивирование клеток животных и «лрвека" (Пущино,1993).

- Всероссийской конференции "Биосинтез и деградация микробных биополимеров: Фундаментальные ».прикладные аспекты" (Пущино, 1995).

- 12-ой Республиканской конференции "Факторы гуморального клеточного иммунитета при различных физиологических и.патолог ческих состояниях (Челябинск, 1395).

- Первой конференции Северо-Кавказского региона "Совреме ные достижения биотехнологии" (Ставрополь, 1S95).

- VIII Международном конгрессе по иммунологии слизист (Сан-Диего, США. 1995).

- Общеинститутских научных конференций РПЧИ (Ростов-на-Д ну, 1993, 1994).

Диссертация обсуждена и одобрена на общеинститутской конф( ренции РПЧИ.

ПУБЛИКАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ:

Основные положения диссертации отражены в 19 опубликовали работах.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ:

Работа состоит из оглавления, введения, обзора литературь 4 глав собственных исследований,, включающих описание материале ■ и методов и результатов экспериментов, заключения, выводов указателя.литературы, содержащего 23á источника, в том числе £ работ-отечественных и 144 •- зарубежных авторов. Текст диссертаци изложен на 165 страницах машинописного текста и иллюстрирован 1 таблицами и 17 рисунками.

Автор выражает глубокую признательность сотрудникам Инсти тута иммунологии МЗ РФ к. х. н. В. Л. Львову и И. К. Вернер за помощ в исследованиях с применением газожидкостной хроматографии ЯМР-спектроскопии.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Работа выполнена на 160 беспородны морских свинках массой 250-300 г и 1620 беспородных мышах ыассо 16-18 г.

В работе использовали два вакцинных шташа Yersinia pestis EV 76 (линии НИИЗГ) и Otten 106/556 (Era',' Тох", V", W"). а так же вирулентный шгаш 231 (708/3), полученные из музея живы; культур РПЧИ и выращенные на плотной казеиново-гидролизатно] среде (Пустовалов В.Л.,Таранова В.Н., Ларионова Л.В. и др.,1988

ЛПС получали из остатка инактивированной бактериальной мае-

сы чумного микроба после ее водно-солевой экстракции . ЛПС выделяли как классическим методом водно-фенольной экстракции (West-phal 0., Jann К, 1965), так и различными его модификациями (Кульшин В.А.. Яковлев А.П., Аваева С.Н. и др..1987. Беспалова И. А.. 1989). Из водных фаз фенольных экстрактов получали неочищенный ЛПС, лиофилизируемый после диализа. Очистку препарата проводили дифференциальным центрифугированием (10000 g. 1 ч, затем 125000 g. 4-6 ч) и гель-фильтрацией на колонке (LKB, Швеция) с сефадексом G-100 (Pharmacia, Швеция) в присутствии 0,125 M трис-HCl буфера (рН 8,0) с 2,5% дезоксихолата натрия.

ДЛПС получали посредством мягкой щелочной обработки (0,25 M NaOH, 56°С. 2 ч) исходного препарата ЛПС (Goodman L., Sultzer В., 1977) и очищали на коленке с сефадексом G-75.

ЛПСР" получали гидролизом исходного ЛПС в концентрированной плавиковой кислоте (45Ж HF, 4°С, 24-48 ч) (L'vov V. L.. Verner I.K., Muslna L.Yu. et al. 1992).

В полученных препаратах определяли содержание белка по модифицированному методу Лоурй (Duliey J. , Grieve P.. 1975). углеводов (Dubois M., Gilles К., Hamilton I. et al, 1956) и нуклеиновых кислот (Спирин А. С.. 1958).

Для установления химических изменений, происходящих в молекулах ЛПС при изучаемых модификациях, проводили частичный структурный анализ полученных препаратов. Моносахаридный состав препаратов после их кислотного гидролиза определяли с помощью восходящей распределительной хроматографии на бумаге с последующим экрашиванием щелочным раствором окиси серебра (Захарова И.Я., Носенко Л.В., 1982) и газожидкостной хроматографии (Г1Х) ацетатов полиолов на приборе Hewlett Packard 5890 (США) при 150-190°С 10°С/мин). Жирнокислотный состав препаратов ЛПС определяли методом ГЯХ метиловых эфиров жирных кислот на приборе Hewlett Рас-card 5890 (США), соединенном с Ultra-I капиллярной колонкой (25 .1), при ^О-ггб'С (5:С/мин) (L'vovV.L., Vernér I. К., Muslna Yu. et al.,1992). 21 Р-ЯМР-спектры препаратов ЛПС записывали на 1риборе Bruker Physics НХ-250 (Германия).

Электрофорез в 12,5-14% полиакриламидном геле (ПААГ) с 0,155 юдецилсульфата натрия проводили по методу Laemmli (1970). Окра-швание ПААГ-пластин осуществляли серебряным реактивом (Hitc-icock P.,Brown T., 1983, Fomsgaard A., Freudenberg M., Galanos

Е., 1990) и методом двойного окрашивания (Dzandu I., Dell M., Wise G., 1984).

Серологическую активность препаратов исследовали с помощы реакции двойной иммунодиффузии в 1% агаре (Diico) (Ouchterlonj 0.. 1958) с использование лошадиных чумных агглютинирующих сывороток производства Саратовского и Иркутского противочумные институтов.

Летальную токсичность препаратов оценивали по LD50 для мышей, а о протективных свойствах препаратов судили по IaiDSf, дл* мышей (Ашмарин И.П., Воробьев А.А.. 1962).

Ададвантные свойства препаратов ЛПС рценивали по их способности модулировать протективные свойства первой фракции (F1) при совместном введении морским свинкам и мышам.

При изучении взаимодействия препаратов ЛПС с клетками СМЗ определяли: модуляцию показателя макрофагальной трансформации мононуклеаров периферической крови (ПМТШ (Демченко Т.А.. Джаги-нян А.И., Свитина Н.Н., 1982); распределение субпопуляций в суммарном пуле ГШ (Земсков В.М., Родионов C.B., ПантинИ.В., 1985); способность исследуемых препаратов индуцировать ГЗТ по реакции исчезновения макрофагов (РИМ) из перитонеального экссудата животных (Васильева Г.И., 1990) и киллерную активность этих клеток (Васильева Г. И.. Пустовалов В.Л., " Киселева А. К.. 1983). Интенсивность фагоцитоза оценивали по следующим показателям: процент активных макрофагов (ПАШ, фагоцитарный индекс (ФИ) и индекс завершенности фагоцитоза (ИЗФ). Положительные значения ИЗФ указывают на тенденцию к завершенности фагоцитоза (завершенный фагд-цитоз - при ИЗФ +1,0), а отрицательные значения ИЗФ - на его незавершенность. Чем ниже значение ИЗФ, тем незавершеннее фагоцитоз, т.е. интенсивнее размножение микробов внутри макрофагов. Одновременно определяли цитопатическое действие чумного микроба на ПМ по показателю процента поврежденных макрофагов (ППМ).

При изучении взаимодействия препаратов ЛПС с ПМ in vivo морских свинок иммунизировали однократно внутрибрюшинно разными дозами полученных препаратов (1,10 и 100 миг/животное) и взвесью вакцинного штамма Y. pestis EV76 (1 млн м.кл. /животное). Контрольным животным вводили 0,5 ил изотонического раствора хлорида натрия. ПМ получали общепринятым методом (Кроткова М.Р.,1971) и исследовали их в вышеперечисленных тестах в сравнении с контролем.

Цитотонсические свойства препаратов ЛПС изучали на модели ПМ 'экспериментальных животных (Васильева Г.И., Пустовалов В.Л., Дорошенко Е. П.. 1934).

Митогенную активность препаратов ЛПС определяли в реакции бластной трансформации лимфоцитов (РБТЛ) • (Хоробрых В.Б., Понин A.B., Киркин А.Ф. и др., 1983).

Цитокининдуцирущую активность 'полученных препаратов ЛПС исследовали по их способности индуцировать продукцию jjoho- и лимфокинов (ИЛ-Г, ФНО-й. факторов, активирующих нейтрофилы, ИЛ-2), а также нейтрофилокинов, влияющих на функциональную активность макрофагов. •

Активность ФИО оценивали по его цитолитическому действию на клетки-мишени L 929 (трансформированные, фибробласты мышей линии СЗН) (Рахмилевич A.B., Мигдал Т.Л., Пелевина М.А., 1989). ИЛ-1 и лИЛ-2 определяли в РБТЛ по уровню включения 3Н-тимидина в ДНК клеток, о действии факторов, модулирующих активность нейтрофи-лов. и нейтрофилокинов, активирующих макрофаги, судили по их влиянию на экспрессии Fc-рецепторов. фагоцитарную и хемотакси-ческую активности соответствующих клеток и лабильность их лизо-сомных мембран (Васильева Г. И., Киселева А.К., Ткаченко Л. Н. и др., 1995). Действие исследуемых препаратов ЛПС чумного микроба сравнивали с действием классического индуктора цитокинов - ЛПС Е.coiI Olli:В4 (Slgmá, США).

Статистический анализ результатов исследований осуществляли преимущественно с помощью статистических таблиц для экспресс-обработки экспериментального и клинического материала (Стрелков Р.Б., 1980): определяли значения доверительных интервалов (L) среднего арифметического (И) для уровня достоверности (Р) 98%. Для статистической обработки значений IaiD^o определяли минимальные и максимальные значения этого показателя (Ашмарин И.П.. Воробьев А. А., 1962).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В ходе работы было показано, что наилучшим исходным препаратом ЛПС для получения модифицированных производных является ЛПС, выделенный водно-фенольной экстракцией остатка бактериальной массы чумного микроба при 68:'С после водно-солевой экстрак-

ции , и очищенный ультрацентрифугированием и гель-хроматографией на колонке с сефадексом G-100 в присутствии дезоксихолата •натрия . Полученный препарат ЛПС содержит минимальные количества контаминирующих белков и нуклеиновых кислот,- модулирующих иммунобиологическую активность ЛПС. характеризуется иммунохимической и электрофоретической гомогенностью и проявляет себя в ПА-АГ-электрофорезе как типичная К-форма ЛПС, что согласуется с данными других исследователей (Дальвадянц С.М., 1968, Тараненко Т.М., 1988, Федорова В.А., Ермакова Г.В., Тараненко Т.М. и др., 1994, Hartley J., Adams G., Tornabene Т., 1974, Wake A., Morgan H.. 1986).

Сравнительный анализ химического состава и свойств исходного и модифицированных препаратов ЛПС выявил существование различий между ними. Так. ДЛПС отличается от исходного Ж и ЛПСР'хо-рошей растворимостью в воде.и солевых растворах, что очень важно для проявления биологической активности препарата. ДЛПС и ЛПСР", в отличие от продукта уксусно-кислотного гидролиза ЛПС чумного микроба(Davies D.. 1956), сохраняют серологическую активность -в реакции двойной ишунодиффузии в геле обеспечивают появление линий, идентичных фронтам взаимодействия исходного ЛПС и чумной агглютинирующей сыворотки. Это обстоятельство указывает на' отсутствие глубоких структурных нарушений молекул, ведущих к утрате ряда эпитопов, в условиях избранных нами методов детоксикации ЛПС. Однако в ПААГ-электрофорезе с последующим окрашиванием серебряным реактивом модифицированные производные проявляются в виде гомогенных пятен, занимающих меньшую площадь, чем исходный ЛПС, и характеризуются отсутствием высокомолекулярных зон. Эт& можно объяснить уменьшением размера молекул ЛПС при изучаемых модификациях. Методом восходящей хроматографии на бумаге и ГШ установлено, что процессы дезацилирования и дефосфорилирования не сопровождаются изменениями шносахаридного состава ЛПС.

С помощью 31Р-ЯМР-спектроскопии в исходном'препарате ЛПС нами обнаружены Р-содержащие группы, дающие сигналы -2,0, +2,7 i +4,5 ppm. ,

Согласно полученным рблультатаы Ш ЛПС чумного микроба характеризуется небольшим числом входящих в его состав жирных кислот, преобладающей из которых является 3-оксимиристиновая. Обнаруженный факт согласуется с данными других исследователей (Hart-

ley J.. Adams G., Tornabene T., 1974, Dalla Venezía N.. Minka S.. Bruneteau M. et al, 1985). Обработка ЛПС плавиковой кислотой не вызывала изменения состава жирных кислот, а приводила к отщеплению только фосфатных групп, дающих сигналы -2,0 и +4,5 рри. При щелочной обработке ЛПС чумного микроба изменения касались и жирнокислотного состава и фосфатных групп. Наряду с элиминированием Р-содержащих групп, соответствующих сигнала»/ -2,0 и. +2.7 рри, отмечено снижение как общего числа, так и относительного количества отдельных жирных кислот, подтвержденное уменьшением количества и высоты пиков на хроматограммах.

Изменения химического состава модифицированных ЛПС сопровождались изменениями и биологических свойств этих препаратов. Определение их токсичности показало, что ЛПСР" и особенно ДЛПС. в сравнении с исходным ЛПС, характеризуются снижением выраженности этого свойства, подтверждая данные литературы о роли жир: нокислотных остатков и Р-содеркащих груш в проявлении эндоток-.сической активности ЛПС (Книрель Ю.А.', Кочетков Н.К., 1993. Brade H., Brade L., Rietschel E., 1988, Muhford R.,• 1988). Одновременно снижался цитотоксический эффект модифицированных препаратов, • особенно ДЛПС, в отношении ПМ экспериментальных животных (рис. 1). Сравнительный анализ летальной токсичности и цитоток-сичности препаратов ЛПС в отношении ПМ выявил корреляцию между этими показателями. Указанное обстоятельство позволяет рекомендовать определение цитотоксической активности этих препаратов для оценки степени детоксикации ЛПС. Предлагаемый способ сокращает сроки исследования, отличается экономичностью, простотой выполнения и воспроизводимостью результатов.

Снижение летальной 'токсичности и цитотоксичности у модифицированных препаратов сопровождалось повышением их протективных свойств. Так, если исходный ЛПС не проявлял протектирности при последующем введении ни одной из изученных заражающих доз вирулентного штамма чумного микроба, то ДЛПС в дозах 10 и 100 мкг защищал 505? мышей от заражения 5 DCL Y.pestis 231. Более неткая разница в протективности препаратов ЛПС проявлялась при введении их в полном адъюванте Фрейнда и последующем заражении 200 DCL вирулентного штамма У. pestIs. Исходный ЛПС в дозах 25 и 100 мкг/мышь защищал только 12,5% мышей, а ДЛПС в этих же дозах -50% животных.

Рис. 1. Цитотоксичность препаратов ЛПС чумного микроба на модели перитонеальных макрофагов мышей. По оси абсцисс - концентрация препаратов, мкг/мл. По оси ординат - процент поврежденных макрофагов.

Одновременно с увеличением протективной активности проявлялись и адъювантные свойства детоксицированных препаратов. Адъ-ювантный эффект ДППС в" отношении Ф1 чумного микроба вырааен сильнее, чем у исходного ЛПС, и приближается по степени выраженности к действию стандартного препарата адъюванта Фрейнда.

Учитывая, что напряженность противоинфекционного иммунитета зависит от реактивности СЫФ (Громыхина Н.Ю.. Маркова Е. В., Любимов С.Ю. и др.. 1992, Фрейдлин И.С., 1983, Unanue Е., Allen Р., 1987), мы охарактеризовали влияние ролученных препаратов ЛПС на клетки СМФ. При этом оценивали имеющий большое биологическое значение феномен трансформации моноцитов периферической крови, Проведенные исследования выявили имыуносупрессорный эффект высоких доз исходного ЛПС на величину ПМТМ. Детоксицированные производные ЛПС, в отличие от исходного препарата, вызывали возрастание ПМТМ во всех испытанных дозах как у шшей, .гак и у морских свинок (рис. 2).

-"ГЦ—н

п

U гЬ

50

40

30 20

10

ш

i Í 4 ¿>

50 40 30 20 Ю.

i1

14

Ш

25

Рис. 2. Влияние ЛПС (I). Д/ТПС (II) и ЛПСР* (III) чумного микроба на модуляцию ПМТМ мышей (А) и морских-свинок (В). По оси абсцисс - время, после иммунизации, _ сутки. По оси ординат - ПМТМ. . .

1 - контроль; 2.3,4 - X, 10, 100 мкг соответственно.

В последние годы появились сообщения- о перераспределении субпопуляций суммарного пула клеток СМФ под влиянием иммуномоду-ляторов и вакцинных препаратов (Васильева Г.И., 19Э0. Земсков В.М.. Родионов С.В.. Пантин И.В., 1985, Тюкавкина С.Ю., 1994). Изучение этого эффекта препаратов ЛПС на 14-е сутки после их введения мышам и морским свинка« показало, что независимо от до-

Г

зы исходный препарат ЛПС не вызывает перераспределения субпопуляций макрофагов D и А и индекс перераспределения этих субпопуляций остается на "уровне контроля. Введение ДЛПС и ЛПСР" в отличие от исходного препарата ЛПС приводит к перераспределению субпопуляций и возрастанию ИПС, наиболее выраженному при использовании низких доз. детоксицированных производных ЛПС. При этом ЛПСР* менее активен, чем ДЛПС (рис. 3). Учитывая данные о том. что формирование резистентности к чуме характеризуется перераспределением субпопуляиий D и А, а протективные свойства антигенов чумного микроба коррелируют с ИПС, обусловленным этими антигенами (Васильева Г.И., 1590), можно сделать вывод, что детоксикация ЛПС чумного микроба способствует проявлению его иммуностимулирующей и протективной активностей.

Наибольший интерес представляют данные о влиянии препаратов ЛПС на эффекторнуо функцию макрофагов - фагоцитоз. Нами показано. что все изученные препараты ЛПС не отличаются по своему влиянию на поглотительную активность макрофагов, но существенно различаются по эффекту, оказываемому на завершенность фагоцитоза и цитопатическое действие чумного микроба в отношении макрофагов. В то время как исходный ЛПС резко угнетает переваривающую способность макрофагов, ингибирующее действие у ЛПСР" менее выражено, а у ДЛПС практически отсутствует. Кроме того, детоксици-рованные производные ЛПС, в отличие от исходного препарата, не усиливают цитопатическое действие чумного микроба на макрофаги.-Примирование ' морских свинок ДЛПС усиливает переваривающую спо- . собность ГШ иммунных животных в отношении чумного микроба штамма' EV - 76 в той же степени, что и иммунизация этим штаммом чумного микроба, в то время как предобработка животных исходным ЛПС угнетает киллерную активность полученных от них макрофагов (табл. 1). Таким образом. ДЛПС. в отличие от исходного ЛПС. активизирует клетки СМФ, обеспечивая индукцию инициальной фазы иммунного ответа, который при чуме реализуется в первую очередь с участием макрофагов (Васильева Г. И., 1990. Наумов A.B., Ледванов М.Ю., Дроздов И.Г., 1992).

Одним из показателей развивающегося клеточного иммунитета при чуме является ГЗТ (Васильева Г.И., 1990). Исследование способности препаратов ЛПС индуцировать ее формирование с помощью РИМ выявило, что все препараты вызывают развитие ГЗТ (рис.. 4).

-IB-

ID

IOO

80

70

60

50

40

30

V 20

V 3

\ I 10

IOO

Í5 тБ5~

.Рис.3.Влияние ЛПС(1), ДЛПС(2) и ЛПСР"(3) на распределение субпопуляций ПМ мышей (I) и морских свинок (II). По оси абсцисс-доза препарата, мкг; по оси ординат -индекс перераспределения субпопуляций ПМ.

Рис. 4. Способность ЛПСО), ДЛПС(2) и ЛПСР"(3) вызывать реакцию йсчезновения макрофагов из перитонеального экссудата мышей. По оси абсцисс-доза препарата, мкг; по оси ординат-ин-декс исчезновения макрофагов. >.

Таблица 1

Влияние препаратов ЛПС чумного микроба на фагоцитоз У.pestis пеританеальдами макрофагами морских свинок in vitro in vivo

| Наименование' --- ИЗФ Y. pestis

i препарата Otten 106/556

I ЛПС -0.34±G.03

i ЛПСР" -0,29*0,03

1 ДЛПС ■ +0,16*0,02

I - Контроль +0,50±0,04

¡Иммунизирующий препарат ИЗФ У. pestis •EV 76

ЛПС ДЛПС Очищенный ДЛПС У. pestis EV 76 Контроль -0,10i0,01 +0,13±0,02 +0,26-0,03 +0,22±0,02 0

При этой наиболее выраженную степень ее проявления обеспечивал ДЛПС, а наименьшую - исходный ЛПС.Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что детоксикация ЛПС чумного микроба, особенно методом дезавуирования, повышает его роль в формировании клеточного иммунитета к возбудителю чумы.

Известно, что конечный результат иммунизации во многом определяется физическими и биологическими свойствами используемых антигенов, в частности, их способностью индуцировать пролиферацию лимфоцитов (Наумов A.B., Ледванов H.D., Дроздов И.Г., 1992).

Проведенное нами сравнительное исследование митогенной активности препаратов ЛПС показало, что в изученном диапазоне концентраций они стимулируют пролиферацию лимфоцитов селезенки мышей. При этом митогенная активность сравниваемых препаратов в концентрациях-1-10 1.1кг/ил находится примерно на одном уровне, а в концентрации 100 мкг/ыл эффект воздействия препаратов отличается: наиболее высокий индекс стимуляции обеспечивает ДЛПС (4,4), а наименьший - ЛПС (2.3). По-видимому, это обусловлено токсическим эффектом высоких концентраций ЛПС ка лимфоциты. ЛПСР" занимает промеауточное положение между ЛПС и ДЛПС. Таким образом, детоксикация ЛПС чумного микроба, особенно методом де~ зацилирования, повышает его митогенную активность.

Учитывая, что формирование иммунного ответа опосредуется цитокинаии. регулирующими проявление и"интенсивность эффекторных Функций иммуноцитов, мы провели сравнительную оценку цитокинин-дуцирующей активности исходного и модифицированных"препаратов ЛПС чумного микроба. Исследование способности препаратов ЛПС индуцировать синтез монокинов показало разнонаправленный характер влияния препаратов на способность клеток СМФ синтезировать ОДЫ, ФИО-а и факторов, активирующих нейтрофилы. Так, детоксикация ЛПС чумного микроба,•особенно методом дезацилирования, усиливает его ИЛ-1-индуцирующую активность, которая при концентрации ДЛПС 10 мкг/мл достигает стшулирующей активности стандартного индуктора монокинов - ЛПС E.coli. В то же время модифицированные производные ЛПС уступают исходному препарату по ФНО-индуцирующей активности (рис. 5).

• - IS -

Рис. б.Монокининдуцирующая активность ЛПС(1), ДЛПС(2), ЛПСР" (3) чумного микроба и ЛПС Е. col i (4).

По оси абсцисс - концентрация препаратов; по оси ординат -А - индекс стимуляции; В - цитотоксический индекс, %\ заштрихованная полоса - ФНО-активность супернатантов непри-мированных макрофагов (разведение супернатантов 1:10).

Сниженная способность стимулировать продукцию ФНО имеет положительное биологическое значение, так как высокие концентрации ФНО обусловливают проявление иммунопатологических реакций в организме. вплоть до развития шока и летального исхода (Bauss F.,Droge W., Mannel D.. 1987, Beutler В., Milsark J., .Cerami A.. 1985), а невысокие концентрации ФНО стимулируют формирование иммунного ответа.

Проведенные исследования показали, что' детоксицированные производные ЛПС чумного микроба более интенсивно, чем исходный ЛПС, стимулируют продукцию монокинов, усиливающих функции нейт-рофилов: хёмотаксис, экспрессию мембранных Fc-рецепторов, лабильность лизосоиных мембран и, что особенно важно, эффективность фагоцитоза Y. pestis.

В последние годы внимание исследователей привлекают нейтро-филокиш, основной то.чкой приложения которых являются макрофаги (Адаменко Г. П., 1991, 199?. Долгушин И. И., Зурочка А. В., Власов А.В., 1990).. Сравнительный анализ активности супернатантов (СН) 4 нейтрофилов, индуцированных исходным и детоксицированными препаратами ЛПС чумного микроба, выявил, что ДЛПС и ЛПСР* более эффективно, чем исходный ЛПС. стимулируют образование нейтрофило-кинов. . активирующих макрофаги. В частности они увеличивают лабильность лизосомных мембран и. что особенно важно, повышают эффективность фагоцитоза У. рееИз. приобретающего завершенный характер. .Наиболее высокой активностью обладают СН нейтрофилов, индуцированные ДЛПС, имеющим наименьшую токсичность среди изученных препаратов ЛПС чужого микроба (табл. 2). - Таблица 2.Влияние СН нейтрофилов. примированных препаратами ЛПС, на фагоцитарную активность ПМ интактных морских свинок

Индукторы СН , ПАМ ФИ, ИЗФ

ЛПС У. pest is 89±2.0 3,0*0.02 +0.02*0,002

ДЛПС У.pestis 80*2. 4 2.8*0.02 +0.32*0,001

ЛПСР" Y.pestis 82*2,6 2.9*0,04 +0.11*0,004

. ЛПС Е.coll 82*2,6 3.0*0.04 +0,15*0.005

Контроль 80*2, 7 2.8*0.04 -0,03*0.001

Детоксикация ЛПС У. реэШ повышает его способность индуцировать лимфокины, в частности ИЛ-2, обеспечивающего взаимодействие основных иммунокомпетентных клеток в процессе формирования иммунного ответа. Индекс стимуляции РБТЛ при использовании исходного ЛПС и ДТПС (10 шг/мл) - 1,93 и 4,0 соответственно.

Анализируя материалы всех исследований, представленных в диссертации, можно утверждать, что осуществленная наш детоксикация ЛПС чумного микроба, особенно методом дезацилирования, не только не снижает его иммуностимулирующую активность, но по ряду параметров усиливает ее, подтверждая наличие взаимосвязи структуры и функций ЛПС У. резЦв. Оценка иммунобиологической активности детоксицированных производных ЛПС У.резИБ позволяет рекомендовать ДЛПС в качестве одного из потенциальных компонентов противочумных профилактических препаратов нового поколения.

выводы

1. Оптимальным исходным препаратом для получения модифицированных производных ЛПС чумного микроба является ЛПС, выделений водно-фенольной экстракцией при 68"С, очищенный ультрацент-ифугированием и гель-хроматографией на сефадексе С-100 и харак-еризуюшийся минимальным количеством контаминирующих белков и уклеиновых кислот, иммунохимической и злектрофоретической гомо-енностью.

2. Мягкая щелочная обработка исходного ЛПС чумного микроба оэволяег получить дезацилированное производное (Д/1ПС), отличаю-эеся хорошей растворимостью в воде и солевых растворах, а обра-этка плавиковой кислотой - плохо растворимое дефосфорилирован-эе производное (ЛПСР").

3. При мягкой щелочной обработке ЛПС чумного микроба наряду дезацилированием происходит отщепление отдельных фосфорсодер-

щих групп. Обработка ЛПС плавиковой кислотой не вызывает изме-:ния жирнокислотного состава препарата, а характеризуется зли-мированием только Р-содержащих групп.

4: Дезацилирование ЛПС, снижающее токсичность и цитотоксич->сть препарата, обеспечивает сохранение его серологической и гьювантной активности и усиление протективных свойств.

5. Детоксицированные производные ЛПС чумного микроба активе, чем исходный препарат, стимулируют макрофагальную трансфор-цию моноцитов периферической крови, перераспределение субпопу-ций в сварном пуле леритонеальных макрофагов и усиливают их ллерную активность в отношении У. реэПэ.

6. Модифицированные производные ЛПС, особенно ДЛПС, облада-более выраженной митогенной активностью по сравнению с исходи ЛПС и сохраняют способность вызывать формирование гиперчувс-ительности замедленного типа.

7. Детоксицированные производные ЛПС чушого микроба являют-активными индукторами цитокинов, осуществляющих инициацию к гуляцив' иммунного ответа иакроорганизиа.

В. Детоксикация ЛПС чумного микроба методом дезацилирования ;ет преимущества перед дефосфорилированием. ДЛПС по сравнению с ЗР~ иенее токсичен и обладает более выраженной иммуностимуйиру-;й активностью, что подтверждает существование взаимосвязи

л

структурных изменений с функциональной активностью ЛПС Y. pesti

9. Оценка иммунобиологической.активности детоксицированнь производных ЖС чумного микроба позволяет рекомендовать ДЛПС качестве одного из потенциальных компонентов противочумных прс филактических препаратов.

10. Корреляция между летальной токсичностью препаратов ЛПС опытах на экспериментальных животных и цитотоксическиьГдействие в отношении их перитонеальных макрофагов позволяет рекомендоват оценку степени детоксикации липополисахаридных препаратов на мо дели этих клеток In vitro.

СПИСОК работ, опубликованных по теме диссертации

1. Антигенный состав и антифагоцитарные свойства чумного и псевдотуберкулезного микробов (Пустовапов В. Л., Васильева Г. И. ,Д рошенко Е. П..Таранова В.Н..Киселева А.К.,Ефанова Е. А. ). -//Моле биол. и микробиол. природноочаговых инф.-Саратов, 1986.-С.50-56

2. Выделение и исследование некоторых свойств липополисах рида чумного микроба // Вест. Всесоазн. микробиол. об-ва, Росто отд.- 1989.-Вып.1.- С.114-117.

3.- Детоксицированный липополисахарид чумного микроба (Дор шенко Е. П.). - //Генетика и биохимия вирулентности возбудител 00И: Тез. докл. - Волгоград, 1992. - С. 72.

4. Изучение ишуногенных свойств нативного и де'гоксицирова ного, липополисахарида чумного микроба в тесте макрофагальн трансформации моноцитов периферической крови (Васильева Г. И Веркина Л. М.). -//Имыунол. и спец. профил. ООИ: Матер. Рос. н уч.конф. - Саратов, 1993.- С.6-7.

5. Использование клеточных культур для оценки эффективное детоксикации липополисахарида чумного микроба (Васильева Г. И Веркина Л.М., Гамлешко X.П.,Ткаченко Л.Н.).- //Цитология 1994.-N6.-C .548,

6. . Протективная активность дезацилированного липополисахар да чумного микроба (Васильева Г. И.). - //Профил. и меры борьбы чумой: Тез.докл.- Алматы, 1994.- С.75.

7. Изучение ЛПС-индуцированных реакций в культуре иммуноко петентных клеток человека (Ермоленко Т.Д., Алексеева Л. П.)

//Акт. вопр. лрофил. чумы и др. инф. заболев.: Тез. докл.- Ставрополь. 1994.- С. 38-39.

8. Изменение функциональной активности липополисахарида Yersinia pestis, деградированного разными способами обработки (Васильева Г. И.. Веркина Л. М.. Киселева А. К.,. Пятибратов А. М.). - // Биосинтез и деградация микробных биополимеров: фундаментальные и прикладные аспекты: Тез. докл.- Пущино, 1995. - С.

9. Влияние монокинов, - индуцированных вакцинным штаммом чумного микроба, на функцию нейтрофилов (Васильева Г. И., Веркина Л. М., Киселева А.К., Ткаченко Л.Н., Пятибратов А.М.). -//Факторы гуморальн. и клет. иммунитета при разл.физиология, и патологии, состояниях: Тез. докл. - Челябинск, 1995.-"С.26.

10. Монокининдуцирующая активность перевиваемой ыоноцитопо-добной линии клеток U 937 (Васильева Г. И.. Киселева А.К., Ермоленко Т.Д.).-//Соврем.достижения биотехнологии: Тез.докл.-Ставрополь, 1995.- С. 94.

11. Влияние модификации ЛПС Yersinia pestis на его способность "индуцировать монокины, регулирующие функцию нейтрофилов (Васильева Г.И.. Киселева А.К. Ермоленко Т.Д.).-//Соврем.достижения биотехнологии: Тез. докл.- Ставрополь. 1995.- С.95.

12. Моноклональные антитела к липополисахариду (ЛПС) чумного микроба в серологических реакциях (Щербакова Е.В.. Алексеева Л. П.. Пустовалов В.Л.. Лебедева С.А.).- //Соврем, достижения биотехнологии: Тез. докл.- Ставрополь; 1995.- С.98-99.

13. Получение и некоторые свойства модифицированного' производного липополисахарида чумного микроба (Пустовалов В. Л. , Львов В.Л.. Вернер И.К.. Васильева Г.И.).- //Биотехнология.- 1995, N 9-10.- С.31-34. .

14. Монокининдуцирующая активность липополисахарида Yersinia pestis и его детоксицированных производных (Васильева Г.И.. Киселева А.К.. Ермоленко Т.Д.).-//Биотехнология.- "1995,- Я 9-10.--С. 27-30.

15.Сравнительная оценка регулирующего действия монокинов на фагоцитарную активность нейтрофилов при первичном и вторичном иммунном ответе (Васильева Г.И., Киселева А.К., Ткаченко Л.Н., Пятибратов А. М., Веркина Л. М., Ермоленко Т. Д., Дорошенко Е. П.). -Иммунодиагностика, иммуноферментный анализ и иммунотерапия: Тез. докл. междунар. конф.- Витебск, 1995,- C.185-I87.

16. Влияние нейтрофилокинов, индуцированных вакцинным штаммом чумного микроба, на лизосоыальный аппарат макрофагов (Киселева А.К., Васильева Г.И., Дорошенко Е.П., Ермоленко Т.Д., Пятибратов А.М., Веркина Л.М., Ткаченко Л.Н.).-//Иммунодиагностика, ишуноферментный анализ и иммунотерапия: Тез. докл. междунар. нонф.- Витебск, 1995.- С.70-72.

17. Выявление ыонокинов, модулирующих экспрессию рецепторов нейтрифилами в процессе формирования противочумного иммунитета (Ткаченко Л.Н., Киселева А.К., Веркина Л. М., Васильева Г.И..Пятибратов А.М., Ермоленко Т.Д.,Дорошенко Е.П.). -//Иммунодиагностика, ишуноферментный анализ и иммунотерапия: Тез. докл. междунар. конф.-.Витебск, 1995.- С. 158-160.

18. Изучение регулирующей активности неЯтрофилокинов, индуцированных вакцинным штаммом чумного микроба, на функцию макрофагов (Пятибратов A.M.. Киселева А.К.,' Веркина Л.М., Ермоленко Т.Д..Васильева-Г. И., Ткаченко Л.Н.. Дорошенко Е.П.).-//Иммунодиагностика, ишуноферментный анализ и иммунотерапия: Тез. докл. междунар. конф. - Витебск. 1995. - С.229-231.

19. The role of the alveolar macrophages In the formation of mucosal immunity after aerogenic plague vaccination (Vasiljeva G., Kiseleva A.. Verkina L., Doroshenko E., Ermolenko Г., Tyukav-kina S.).-//Clinical Immunology and Immunopathology.- 1395.-Vol.76, Ñ I.'- F. 60.