Разработка биотехнологических аспектов повышения иммуногенности вакцинного штамма Yersinia pestis EV НИИЭГ

Голова, Алина Борисовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка биотехнологических аспектов повышения иммуногенности вакцинного штамма Yersinia pestis EV НИИЭГ
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Разработка биотехнологических аспектов повышения иммуногенности вакцинного штамма Yersinia pestis EV НИИЭГ"

На правах рукописи

Голова Алина Борисовна

РАЗРАБОТКА БИОТЕХНОЛОГІІЧЕСКИХ АСПЕКТОВ ПОВЫШЕНИЯ ІІММУНОГЕШГОСТИ ВАКЦИННОГО ШТАММА Yersiniapestis EV НІІІОГ

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии) 03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

- 7 ИЮН 2G12

Саратов-2012

005045509

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Саратовский научно-исследовательский ветеринарный институт Российской академии сельскохозяйственных наук

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор

Федорова Валентина Анатольевна кандидат биологических наук Мотан Владимир Леонидович

Официальные оппоненты:

Дыкман Лев Абрамович

доктор биологических наук, старший научный сотрудник

ФГБУН Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН

ведущий научный сотрудник лаборатории иммунохимии

Елисеев Юрий Юрьевич

доктор медицинских наук, профессор

ГБОУ ВПО «Саратовский государственный медицинский университет им. В.И. Разумовского»

заведующий кафедрой общей гигиены и экологии

Ведущая организация: ФБУН Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии

Защита диссертации состоится « 22 » июня 2012 г. в 12°° часов на заседании диссертационного совета Д 220.061.04 при ФГОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова» по адресу: 410005, г. Саратов, ул. Соколовая, 335, диссертационный зал.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова» по адресу: 410005, г. Саратов, ул. Соколовая, 335.

Автореферат разослан мая 2012 г.

Отзывы на автореферат направлять по адресу: 410012, г. Саратов, Театральная пл., 1, ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова», ученому секретарю диссертационного совета.

Ученый секретарь диссертационного совета Л

доктор биологических наук, профессор лв- Карпунина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Как известно, живая чумная вакцина (ЖЧВ) на основе ат-тенуированного пгтамма Yersinia pestis EV линии НИИЭГ успешно применяется для специфической профилактики чумы у людей и животных на протяжении более 70 лет в нашей стране и в ряде стран СНГ (Салтыкова, Файбич, 1975; Айкимбаев с соавт., 2003; Feodorova, Corbel, 2009). До настоящего времени эта вакцина остается наиболее эффективным и единственным лицензированным профилактическим противочумным препаратом (Салтыкова, Файбич, 1975; Russell et al, 1995; Titball, Williamson, 2001, 2004; Медуницын, 2004; Бывалов, Кутырев, 2011; Книрель с соавт., 2011; Feodorova, Motín, 2011 и др.). Важным преимуществом ЖЧВ является ее способность уже после однократной прививки относительно быстро (в течение 3-4 дней) индуцировать специфический иммунитет против основных форм (бубонной и легочной) чумной инфекции (Самойлова, 1963; Исупов, Белобородое, 1995).

Выращивание экспериментально-производственного вакцинного штамма EV НИИЭГ для производства ЖЧВ на рутинных питательпых средах in vitro, равно как и длительное масштабированное культивирование в биотехнологии производства противочумных профилактических препаратов зачастую обеспечивает выраженное снижение его иммуногенности (Салтыкова, Файбич, 1975; Алимов, 1984; Дятлов,

1986). Это связывают, как правило, с быстрой адаптацией чумных бактерий к условиям существования вне чувствительного макроорганизма и утрата так называемой «остаточной вирулентности» штамма, непосредственно обеспечивающей его иммуно-генность (Салтыкова, Файбич, 1975; Анисимова с соавт., 2002; Промышленный регламент № 01897080-01-04 на производство «Вакцины чумной живой»). Восстановление иммуногенности проводится путем анимализации - многократного пассирования субкультур штамма EV НИИЭГ через организм морской свинки (Прядкина, Журба, 1966; Салтыкова, Файбич, 1975; Промышленный регламент № 01897080-01-04), что требует длительного времени, большого количества лабораторных животных и не поддается стандартизации ввиду использования в работе аутбредных биомоделей. Другой важной биотехнологической задачей при экспериментально-производственном выращивании пггамма-продуцента ЖЧВ является разработка режимов, обеспечивающих высокий выход бактериальной массы (Шеремет с соавт.,

1987). Согласно нормативной документации (Промышленный регламент № 0189708001-04), для приготовления вакцины EV НИИЭГ микробные клетки данного штамма культивируют in vitro при температуре 28 °С на обычных бактериологических сре-

дах, производных гидролизатов Хоттингера (ГХ) или казеина. Однако биосинтез ряда важных для индукции специфического иммунитета антигенов Y. pestis наблюдается при температуре 37 °С, требует наличия в среде выращивания ряда дополнительных питательных компонентов и, в случае их отсутствия, сопровождается при выращивании микробных клеток в рутинных условиях in vitro заметным снижением активности роста чумных бактерий (Алутин, 1974; Наумов, Кондрашин, 1980; Brubaker, 1991). В литературе существуют многочисленные доказательства активизации пролиферации чумных бактерий при температуре 37 °С в условиях in vivo в организме чувствительных к чуме млекопитающих (Бахрах с соавт., 1969; Алутин, 1974; Perry, 1997). Очевидно, что заложенный в биотехнологию производства ЖЧВ режим выращивания штамма-продуцента принципиально отличается от условий внутренней среды макроорганизма млекопитающего, где на стадиях бактериемии и септицемии наблюдается наиболее бурное размножение микробных клеток. Сообщалось об определенных модификациях антигенной структуры чумного микроба в этот период, в частности, снижении продукции капсульного антигена Ф1, как у вирулентных штаммов возбудителя чумы, так и у бактерий Y. pestis EV76 - «прародителя» вакцинного штамма EV НИИЭГ (Burrows, Bacon, 1956; Brubaker, 1991). Остается неизвестным, имеет ли место изменение биосинтеза и других антигенов возбудителя чумы, задействованных в реализацию вирулентности и иммуногенносги данного патогена - активатора плаз-миногена (Pia), «мышиного» токсина (Ymt) и лштополисахарида (ЛПС). Вместе с тем, модификация продукции антигенов может объяснить относительно невысокую нейтрализующую активность противочумных антител, образующихся в макроорганизме вакцинируемого в результате иммунизации клетками вакцинного штамма EV НИИЭГ после их выращивания в регламентированном режиме при температуре 28 °С ввиду отсутствия в условиях in vivo на поверхности чумного микроба антигенов, синтезируемых in vitro на обычных бактериологических средах и невозможности индукции к этим антигенам протективных антител. Следовательно, оптимизация композиции протективных антигенов в препарате ЖЧВ должна способствовать повышению ее относительно невысокой иммуногенпости.

Цель работы - разработка оптимальных биотехнологических режимов выращивания экспериментально-производственного вакцинного штамма EV НИИЭГ, обеспечивающих повышение его иммуногенносги благодаря созданию эффективной антигенной композиции препарата живой чумной вакцины.

Задачи исследования:

1. Разработать оптимальные биотехнологические режимы выращивания in vitro бактерий экспериментально-производственного вакцинного штамма EV НИИЭГ для увеличения выхода микробной биомассы с единицы объема среды и повышения иммуногенности в лабораторных испытаниях (в сравнительных экспериментах с применением регламентированных питательных сред).

2. Исследовать влияние режимов выращивания на биосинтез и иммунореактивность основных специфических полипептидов и ЛПС вакцинного штамма EV НИИЭГ.

3. Исследовать биосинтез антигенов Ф1, Pia, Ymt и ЛПС штаммом-продуцентом ЖЧВ при выращивании в биотехнологических режимах, имитирующих условия паразитирования чумных бактерий в организме чувствительного млекопитающего in vivo.

4. Изучить в сравнительных экспериментах пролиферативную активность, биосинтез и иммунореактивность вакцинного штамма EV НИИЭГ, его изогенных вариантов, авирулентных и вирулентных штаммов чумных бактерий, выращенных в различных биотехнологических режимах.

5. Разработать более эффективную антигенную композицию препарата ЖЧВ.

6. Разработать модель экстрацеллюлярной среды млекопитающих in vitro для практического применения в биотехнологии производства ЖЧВ.

продуцента (не менее 80% выживших от экспериментальной чумы аутбредных мышей) по сравнению с регламентированным режимом культивирования штамма-продуцента (не более 45,5% выживших биомоделей). Новыми являются сведения о направленном биосинтезе бактериями вакцинного штамма EV НИИЭГ в указанных условиях in vitro антигенов с м.м. 44,2±2 и 83,1±2 кДа, способных на мышиной модели индуцировать высокий уровень специфического иммунитета к экспериментальной чуме. По данным иммунохимического анализа указанные полипептиды были локализованы на поверхности микробных клеток EV НИИЭГ и могли активно секретиро-ваться в среду культивирования, обладали серологическим родством с антигеном белковой природы вирулентного штамма Y. pestis 231 с м.м. 26,3-28,8 кДа, но продуцировались бактериями экспериментально-производственного штамма EV НИИЭГ в меньших количествах (в 2-4 раза) по сравнению с клетками вирулентного штамма.

Перспективным является также возможность повышения иммуногенности вакцинного штамма EV НИИЭГ (до 70% выживших мышей) при выращивании его в биотехнологических режимах с применением регламентированных бактериологических сред на основе ГХ, дополненных ионами Са2+ (2,5 мМ).

Разработана модель экстрацеллюлярной среды чувствительных к чуме млекопитающих. Показана принципиальная возможность имитирования in vitro ранней стадии взаимодействия чумных бактерий с макроорганизмом хозяина до контакта с клеткой-мишенью. Приоритетными являются сведения о развитии в этот период капсулонеза-висимого типа резистентности чумного микроба к фагоцитозу, которые могут служить основополагающим фундаментом усовершенствования ЖЧВ на основе вакцинного штамма EV НИИЭГ равно как и конструирования новых эффективных профилактических противочумных препаратов. Полученные данные являются перспективным для разработки оптимальной антигенной композиции новой субьединичной вакцины для быстрого купирования чумной инфекции у привитых в ранние сроки после заражения путем использования вышеуказанных антигенов.

приближенных к эксграцеллюлярной среде млекопитающих, и обладающих, по-видимому, высокой протективпой активностью, указанный биотехнологический подход позволил почти в два раза повысить иммуногенность и в восемь раз иммунореак-тивность штамма-продуцента.

По материалам диссертации разработаны и утверждены директором ГНУ Саратовский НИВИ Россельхозакадемии (от 16 марта 2012 г.) «Методические рекомендации по оптимизации биотехнологического режима выращивания бактерий штамма Y. pestis EV НИИЭГ - продуцента живой чумной вакцины для повышения выхода клеточной биомассы».

Материалы исследований используются при чтении курса лекций по биотехнологии и микробиологии ФГБОУ ВПО «Саратовский ГАУ».

Связь работы с научными программами. Настоящая работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 03-04-48067 «Молекулярная организация и струкгурно-функциональная характеристика биомолекул, детерминирующих вирулентность патогенных иерсиний», проектов ВП/ISTC #3853 «Живые бактериальные вакцины: сравнительный анализ иммунного ответа человека и биомоделей» и «Изучение антибактериального иммунитета» (Университет Техаса, г. Галвестон, UTMB, субконтракт No. 11-082).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработаны и оптимизированы биотехнологические режимы выращивания бактерий экспериментально-производственного штамма EV НИИЭГ, основанные на имитации in vitro условий паразитирования возбудителя чумы in vivo в организме чувствительных млекопитающих и позволяющие существенно (в 3,5-4,2 раза) повысить клеточный урожай ЖЧВ.

2. Выращивание клеток штамма EV НИИЭГ, продуцента ЖЧВ, в биотехнологических режимах с применением регламентированной среды бульон Хотгингера (БХ), дополненной ионами Са2+ (2,5 мМ) в сочетании с 0,1% глюкозы или только ионами Са2+ (2,5 мМ), обеспечивает больший (в 2,8-3,7 раза) выход биомассы вакцинного штамма EV НИИЭГ, чем при использовании той же среды без указанных ингредиентов.

3. Установлены выраженные различия в составе антигенной композиции и имму-ногенности ЖЧВ на основе вакцинного штамма EV НИИЭГ в зависимости от режима его культивирования in vitro.

4. Выращивание пггамма-продуцента EV НИИЭГ в биотехнологическом режиме in vitro, приближенном к экстрацеллюлярной среде макроорганизма хозяина in vivo, обусловливает модификацию биосинтеза специфических антигенов чумного микроба — Ф1, Pía, Ymt, изменение фенотипических активностей, ЛИС и направленную продукцию протективных полипептидов с м.м. 44,2±2 и 83,1±2 кДа Более эффективная композиция вакцинного препарата позволила существенно (с 45% до 80%) повысить иммуногенность и в восемь раз иммунореактивность штамма EV НИИЭГ.

5. Применение синтетической среды RPMI на основных стадиях биотехнологического процесса приготовления чумной вакцины EV НИИЭГ (этапах подготовки маточной культуры, посевного материала, накопительной культуры и т.д.) в перспективе позволит стандартизировать биотехнологию ее масштабированного производства, направленного на приготовление готового препарата с высокой иммуногенной активностью.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на: Научно-практической конференции «Природно-очаговые ООИ на юге России, их профилактика и лабораторная диагностика», (Астрахань, 2001); Первой региональной конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой», (Саратов, 2002); III конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины, (Москва, 2004); Всероссийской научно-практической конференции «Медицинская микробиология - XXI век», (Саратов, 2004); Научно-практической конференции, посвященной 70-летию Противочумного центра «Противочумные учреждения России и их роль в обеспечении эпидемиологического благополучия населения страны», (Москва, 2004); П конференции студентов, молодых ученых и специалистов «Современные проблемы науки и образования», (Хургада, Египет, 2005); VI межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств: проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях», (Волгоград, 2005); Международном Вакцинном Конгрессе, (Амстердам, Нидерланды, 2007); Германо-Российском форуме по биотехнологии, (Новосибирск, 2009); Международной научно-практической конференции «Современные проблемы инфекционной патологии человека», (Минск, Беларусь, 2009); VI международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» в рамках IV Российского медицинского форума, (Москва, 2009); III Всероссийской научно-

практической конференции с международным участием «Инфекции, обусловленные иерсиниями», (Санкт-Петербург, 2011).

Личный вклад соискателя заключается в самостоятельном проведении экспериментальных исследований, обработке и интерпретации полученных результатов. Постановка задач исследовапий осуществлялась научными руководителями д-ром мед. наук, профессором В.А. Федоровой, канд. биол. наук В.Л. Мотиным.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 работ, из них 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (2 главы), собственных исследований (4 главы), заключения, выводов и списка использованных литературных источников, включающего 416 источников, из них зарубежных - 148. Работа изложена на 200 страницах, содержит 10 таблиц и 16 рисунков.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Объект, материалы и методы исследований. В работе использовали эталонный экспериментально-производственный вакцинный штамм У. ревШ ЕУ НИИЭГ, полученный из ГИСК им. Л.А. Тарасевича, в отдельных экспериментах (совместно с ГИСК им. Л.А. Тарасевича) - пять его изогенных производных (КМ-215, КМ-216, КМ-217, КМ-218, КМ-225, КМ-226), 9 природных и генетически модифицированных штаммов чумного микроба с разным плазмидным составом, в том числе, вирулентный штамм У. 231 (1ЛЭ50 для белых мышей = 6 КОЕ).

Для накопления биомассы штамма ЕУ НИИЭГ - продуцента ЖЧВ, применяли различные биотехнологические режимы выращивания с использованием бульона Хотгангера (БХ) (РосНИПЧИ «Микроб», Саратов) или среды ЯРМ1 («Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов», Москва). В зависимости от цели эксперимента, питательные среды дополняли 2,5 мМ ионов кальция (СаС12) и/или 5,5 мМ глюкозы. Посевы инкубировали стационарно при температуре 28 °С в течение 48 ч или при этой же температуре первые 24 ч с последующим культивированием при температуре 37 °С еще 18-24 ч. Взвеси бактерий в концентрации 1 * 109 м.кл./мл готовили стандартным методом (Наумов, Самойлова, 1992). Пролиферативную активность бактерий оценивали по индексу пролиферации (ИП) (Теоёогоуа, Оеу<1апаш, 2001). Для постановки иммуноферментного анализа к бактериальным суспензиям добавляли мер-тиолят натрия до конечной концентрации 0,002% или 2% формальдегида.

Влияние экспериментальных биотехнологических режимов выращивания на основные биологические свойства бактерий исследовали классическими микробиологическими и иммунохимическими методами. Продукцию основных видоспецифических антигенов с иммуногенной активностью - Ф1, Pia, Ymt, изучали в непрямом варианте дот-иммуноанализа (ДИА) с препаратами коммерческих чумных диагностических иммуноглобулинов (ЧДИ) или моноклональных антител (МКА) к Ф1, к ЛПС (синтезируемых производственными линиями гибридом Y.p.FI.D3.B2.Sp., Y.p.LPS.A6.Sp.) и к Pia как показано ранее (Feodorova, Devdariani, 2000). Реакцию оценивали визуально по наличию и интенсивности цветного сигнала. Формирование капсулоподобной субстанции исследовали методом Бурри-Гинса, у клеток EV НИИЭГ — также методом трансмиссионной электронной микроскопии (эксперименты выполнены совместно с проф., д-ром биол. наук Н.П. Конновым и канд. биол. наук О.С. Кузнецовым). Фибри-нолитическую активность изучали общепринятым методом лизиса сгустков фибрина (Наумов, Самойлова, 1982), фосфолипазную — методом И.А. Кузьмиченко и Ф.К. Дроздовской (1977). Антигенную активность определяли сравнением в ТИФА титров специфических гомологичных антител в сыворотках мышей BALB/c, иммунизированных цельными клетками Y. pestis EV НИИЭГ или 231, выращенными в различных биотехнологических режимах. Результаты учитывали по оптической плотности образцов при длине волны 405 нм, считая позитивными лунки, в которых интенсивность сигнала в два раза и более превышала контрольные образцы; иммуноген-ность (лабораторные испытания) осуществляли путем подкожного заражения белых аутбредных мышей весом 18-20 г в возрасте 8-12 недель м. кл. вирулентного штамма Y. pestis 231 в дозе 50 DCL (на базе ГИСК им. JI.A. Тарасевича). Предварительно биомоделей иммунизировали внутрибрюшинно трехкратно с 14-дневным интервалом возрастающими дозами м. кл. EV НИИЭГ (1 х 105; 2 х 105; 4 х 105 КОЕ), выращенных в соответствующих биотехнологических режимах. Для индукции иммунного ответа к поверхностно локализованным антигенам чумных бактерий и предотвращения дальнейших модификаций антигенной структуры в организме биомоделей в случае вакцинации живыми м. кл. штамма-продуцента ЖЧВ, бактериальную взвесь обрабатывали мертиолатом натрия до конечной концентрации 0,002%. Антигенную композицию и иммунореактивность исследовали в 12,5% ПААГ-SDS (Laemmli, 1970) и методом иммуноблоттинга (Towbin et al., 1984). Элекгрофоретическое разделение нативных или протеолитически обработанных цельно-клеточных лизагов Y. pestis EV НИИЭГ, 231, КМ-218 (бесплазмидный вариант) проводили с последующей окраской гелей

Coomassie Brilliant Blue или ионами серебра (Tsai, Frasch, 1982; Feodorova, Devdariani, 2001).

Сгатисгическую обработку полученных результатов осуществляли по И.П. Аш-марину, A.A. Воробьеву (1962).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Разработка оптимального технологического режима выращивания in vitro бактерий экспериментально-производственного вакцинного штамма EV НИИЭГ и его изогенных производных Начальным этапом нашей работы явилось конструирование питательной среды и оптимизация режима выращивания бактерий вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ для повышения его пролиферативной активности. Поскольку и при аппаратном культивировании, и в случае наращивания биомассы в небольших объемах (пробирки, матрацы и т.д.), более быстрый рост микробов этого штамма отмечался на жидких средах (около 18 ч) или бифазных условиях (~ 28 ч), но не на плотных питательных средах (до 34-36 ч), а ростовые качества сред на основе гидролизата Хотгингера были признаны лучшими (Николаев, 1964; Бахрах, 1966; Филиппов, 1970; Муравьева, 1969), первоначально бактерии выращивали в БХ. Для имитации внутренней среды млекопитающих в БХ добавляли ионы Ca21" (БХС) и/или глюкозы (БХСГ и БХГ, соответственно) в концентрациях, соответствующих физиологическому содержанию этих компонентов в сыворотке крови млекопитающих (Логинов, 1983). БХ без добавок использовали в качестве контроля. Как видно из таблицы 1, присутствие в БХ указанных ингредиентов значительно стимулировало пролиферацию чумных бактерий. Особенно эффективным оказалось добавление ионов Са2+ - ИП штамма EV НИИЭГ в этих условиях увеличился по сравнению с контролем более, чем в 3,5 раза, а при со-четапном добавлении с глюкозой — почти в 3 раза.

Бактериологические среды по своему составу значительно отличаются от внутренней среды макроорганизма и не могут в полной мере обеспечить питательные потребности чумных бактерий даже при добавлении в них дополнительных питательных компонентов (Николаев, 1964; Бахрах, 1966; Муравьева, 1969; Филиппов, 1970). Поэтому мы использовали среду RPMI с четко сбалансированным составом, изото-ничную сыворотке крови чувствительных к чуме млекопитающих, богатую витаминами и содержащую 16 из 17 (кроме аланина) аминокислот, необходимых для обеспечения питательных потребностей чумных бактерий при выращивании in vitro, удвоенную концентрацию глюкозы (11,1 мМ) и 0,42 мМ ионов Са2+. При культивировании

клеток EV НИИЭГ на этой среде ИП штамма возрастал почти в четыре раза по сравнению с рутинной бактериологической средой БХ (без добавок). Добавление в среду культивирования ионов Са2+ и/или глюкозы также было эффективным. Наибольший стимулирующий эффект наблюдался при совместном использовании указанных ингредиентов в ростовой среде (табл. 1). Иммуногенность вакцинного штамма EV НИИЭГ связывают с его «остаточной вирулентностью», т.е. способностью приживаться и размножаться в месте аппликации и ограниченное время обсеменять регионарные лимфузлы и внутренние органы вакцинируемого (Салтыков, Чалисов, 1974). Поэтому нами исследовалось влияние сходных биотехнологических режимов на пролиферацию типичного вирулентного штамма К pestis 231. Судя по полученным данным (табл. 1), выращивание бактерий этого штамма на БХ с добавками и без них выявило ту же закономерность, что была установлена нами на предыдущем этапе для цггамма-продуцента ЖЧВ. Так, самый богатый клеточный урожай был зафиксирован на БХС и БХСГ, на БХГ ИП оказался несколько ниже. При выращивании на RPMI с добавками и без них регистрировалось значительное (почти в пять раз) увеличение ИП бактерий Y. pestis 231 по сравнению с контролем (БХ), хотя присутствие добавок в среде RPMI существенно не влияло на клеточный урожай этого штамма чумного микроба. При этом способность вирулентного штамма активно пролиферировать в указанных биотехнологических режимах была в 1,5 — 2 раза выше, чем у вакцинного. Это, видимо, связано с разницей между инфекционным и вакцинальным процессами, вызываемыми этими штаммами в организме чувствительных млекопитающих (Самойлова, 1963).

Выращивание в сходных биотехнологических режимах изогенных производных вакцинного штамма EV НИИЭГ или природных вариантов Y. pestis оказалось менее эффективно (ИП бактерий всех использованных нами штаммов 1,2 - 1,8).

Таким образом, выращивание штамма-продуцента ЖЧВ в биотехнологических режимах, основанных на моделировании in vitro условий, приближенных к экстра-целлюлярной среде организма млекопитающих in vivo, позволило значительно повысить выход микробной биомассы вакцинного штамма Е V НИИЭГ. Применение RPMI и/или БХ с добавлением ионов Са2+/глюкозы в адекватной концентрации в качестве среды культивирования обеспечило выход большей биомассы вакцинного штамма EV НИИЭГ по сравнению с обычной бактериологической средой (БХ) без дополнительных ингредиентов.

Изучение и иммунохимическая характеристика биосинтеза основных специфических антигенов вакцинным штаммом EV НИИЭГ, выращенным в различных биотехнологических режимах

Поскольку наиболее важным параметром оценки качества любой вакцины является ее иммуногенность (Фунтикова, 1977; Алимов, 1984; Шеремет с соавт., 1987; Гюлушанян, 1994; Глик, Пастернак, 2002), одним из критериев оптимизации технологического режима выращивания штамма-продуцента является его способность продуцировать протективные антигены. Поэтому мы исследовали продукцию вакцинным штаммом EV НИИЭГ Ф1, Pia и Ymt - основных видоспецифических антигенов, задействованных как в индукции специфического протективного иммунитета, так и в проявлении вирулентных свойств возбудителя чумы (Вейнблат, 1980; Шеремет с соавт., 1987), а также ассоциированные с этими антигенами фенотипические свойства Y. pestis.

В мазках, приготовленных методом Бурри-Гинса из культуры штамма-продуцента ЖЧВ, выращенного на БХ без добавок (контроль), выявлялась типичная капсулоподобная субстанция. При остальных режимах выращивания наблюдалось снижение продукции капсульной субстанции (БХС или БХГ) вплоть до появления в популяции бактерий только бескапсульных вариантов (БХСГ или RPMI с или без добавок). Принципиальных отличий у вирулентного штамма 231 от картины капсу-лообразования вакцинного штамма не было. Полученные данные были подтверждены методом электронной трансмиссионной микроскопии (рис. 1). В условиях, приближенных к внеклеточной среде макроорганизма, чумные бактерии штамма-продуцента ЖЧВ были практически полностью лишены капсулы, которая сохранялась на наружной клеточной стенке в виде небольших островков (рис. 1Б).

Наличие фосфолипазной активности, характерной для Ymt, регистрировалось только в случае выращивания штамма-продуцента ЖЧВ и бактерий 231 штамма на

Рис. 1. Электронные микрофотографии (негативное контрастирование, ув. 240000) бактерий У. ревНэ ЕУ, выращенных на обычной питательной среде (БХ) (А) или КРМ1 (Б) при температуре 37°С. Масштаб 0,2 мкм.

БХ без дополнительных ингредиентов. Добавление ионов Са2+ и/или глюкозы или использование RPMI полностью ингибировало указанную активность (табл. 1).

При выращивании на БХ, БХС или БХГ у бактерий штамма EV НИИЭГ практически полностью сохранялась фибринолитическая активность Pia протеазы, которая, однако, не выявлялась наБХСГ или RPMI независимо от дополнительных ингредиентов. Для вирулентного штамма получены сходные данные (табл. 1).

В ДИА с ЧДИ, содержащими в пуле диагностических иммуноглобулинов антитела к продуктам специфических для возбудителя чумы плазмидных репликонов (pFra и pPst) (Титенко, 1985), у штамма-продуцента ЖЧВ было обнаружено снижение биосинтеза одного, двух или всех трех изучаемых антигенов (Ф1, Ymt и Pia) в зависимости от использованного биотехнологического режима. Поскольку Ф1 обнаруживается на поверхности клеточной стенки и в культуральной жидкости (ЮК) бактерий EV НИИЭГ (Кириллина, 1992; Федорова, 2004), объектом исследования в ДИА являлись обе эти субстанции. Так, клетки EV НИИЭГ, выращенные на БХ, БХС или БХСГ, давали положительную реакцию, а на БХГ интенсивность сигнала в ДИА была заметно сниженной. В КЖ антигены обнаруживались только при выращивании бактерий EV НИИЭГ на БХ без добавок (контроль) аналогично экспериментам (Федорова, 2004). При выращивании бактерий на RPMI сигнал отсутствовал полностью как при анализе м. кл., так и в КЖ) бактерий. Сходные результаты, а также доказательства изменения эпитопной специфичности отдельных антигенных детерминант Ф1 и Pia, были получены в ДИА с гомологичными МКА. В этом случае в ДИА использовали только м. кл. бактерий вакцинного или вирулентного штаммов чумного микроба Для подтверждения данных ДИА мы проводили сравнительный анализ электрофоре-тических профилей клеточных лизатов бактерий штамма-продуцента ЖЧВ, выращенного в разных биотехнологических режимах в 12,5% ПААГ-SDS. Как и предполагалось, только в клеточном лизате штамма EV НИИЭГ после выращивания на БХ без добавок четко определялись полосы, соответствующие по мол. массе (17,8±2 кДа) мономеру Ф1 (СаП), Pia (33±2 кДа) и Ymt (61±2 кДа). В остальных треках эти полосы практически отсутствовали или визуализировались как минорные линии, что указывало на значительное снижение биосинтеза каждого из антигенов при выращивании штамма-продуцента ЖЧВ в других биотехнологических режимах.

Таблица 1 - Влияние режимов выращивания на пролиферацию и основные фенотипические свойства штаммов У. резШ

Штаммы Среда Добавление к Количество Индекс Продукция капсулы Фибринолитическая Фосфо- МКА

чумного культи- среде живых проли- активность липаз к

микроба вирования 2,5 5,5 мМ бактерий фера- Бактерио- Реакция Нали- Реакция с ная ЛПС

мМ глюкозы (пх 109), ции* скопически сМКАв чие МКАв актив-

Са2+ м. кл. ДИА сгустка ДИА ность

ЕУ БХ - - 11,2 1,0 + + - +• + +

БХ + - 41,8 3,7 + + - + - +

БХ - + 17,0 1,5 ± + - + - +

БХ + + 31,6 2,8 - ± + - - +

КРМ1 - - 39,2 3,5 - - + - - ±

ЯРМ1 + - 37,4 3,3 - - + - - ±

ЯРМ1 - + 37,3 3,3 - - + - - ±

Ю>М1 + + 46,9 4,2 - - + - - ±

231 БХ - - 7,7 1,0 + + - + + +

БХ + - 13,1 1,7 + + - + - +

БХ - + 10,6 1,4 ± + - + - +

БХ + + 12,6 1,6 - - + - - ±

ЯРМ1 - - 39,3 5,1 - - + - - ±

ЯРМ1 + - 40,0 5,2 - - + - - ±

ЯРМ1 - + 38,0 4,9 - - + - - ±

ЯРМ1 + + 40,3 5,2 - - + - - +

Примечание: * - индекс пролиферации - соотношение концентрации бактерий данного штамма, выращенных на соответствующей среде с или без добавок и на БХ без добавок (контроль); «+»- положительная реакция; «-»- отрицательная реакция;

«±» - слабая (следовая) положительная реакция чуть выше отрицательного контроля.

При исследовании биосинтеза Ф1, Ymt и Р1а в ДИА с ЧДИ аналогичный феномен наблюдался у природных вирулентных и авирулентных цггаммов Y pestis, несущих хота бы одну из двух плазмид, видоспецифических для возбудителя чумы, но не у изогенных вариантов EV НИИЭГ.

Поскольку повышение температуры с 26-28 °С до 37 "С у Y. pestis сопровождается биосинтезом in vitro преимущественно менее токсичного четырехацильного яипида А вместо шестиацильного с большей токсичностью (26-28 °С) (Гремякова с соавт., 1992; Kawahara et al., 2002; Dentovskaya et al., 2008) нами исследовано влияние биотехнологических режимов на иммунореактивность антигенов углеводной природы у штамма-продуцента ЖЧВ (м. кл. и КЖ бактерий вирулентного штамма 231 как контроль) в ДИА с МКА А6, продуцируемых гибридомой и направленных к консервативному эпитопу Y. pestis, общему для коровой части ЛИС, липида А и ОСА (ЕСА) (Федорова, 1994; 2004). Обнаружено, что МКА А6 реагировали позитивно с м. кл. и КЖ штамма EV НИИЭГ, выращенного на БХ, БХС или БХСГ. Более слабый цветной сигнал в ДИА или его полное отсутствие регистрировалось с м. кл. или КЖ бактерий EV НИИЭГ, соответственно, после их роста на RPMI.

В 12,5% ПААГ-SDS депротеинизиро- 1 2 3 4 5 6

ванных клеточных лизатов штамма EV НИИЭГ и его бесплазмидного варианта КМ-218, выращенных на БХ (контроль),

БХС или RPMI, только в контрольных _л ^_

электрофоретических профилях бактерий обоих штаммов, помимо низкомолекулярных быстромигрирующих диффузных зон,

идентифицированных ранее как липид А - рис 2 Электрофореграмма депротеи-

кор (Bengoechea et al., 2002; 2004), обна- низированных цельноклеточных лиза-

руживались, средне- и высокомолекуляр- тов ^ Pestis EV НИИ')! (1 - 3) и v Y. pestis КМ-218 (4 - 6), выращенных

ные компоненты (рис. 2, дорожки 1, 4), при 37° с на БХ без дополнительных

предположительно связанные с ЕСА ингредиентов (1; 4), с добавлением

т. .. ,, , , 1 по-? с л 2,5мМ Са2+(3; 6) или RPMI (2; 5).

(Whitfield et al, 1997; Feodorova,

Devdariani, 2001; 2002; Prior, Titball, 2002;

Raetz, Whietfield, 2002). Добавление Ca2+ в среду частично ингибировало биосинтез последних: на электрофореграмме полностью отсутствовали высокомолекулярные углеводные компоненты (рис. 2, дорожки 3, 6). В режимах, приближенных к внекле-

точным условиям in vivo, выявлялись только низкомолекулярные зоны (рис. 2, дорожки 2, 5).

Разработка эффективной антигенной композиции вакцинного штамма EV НИИЭГ - продуцента ЖЧВ

При сравнении протективного потенциала штамма EV НИИЭГ по способности защищать белых мышей от экспериментальной чумы установлено значительное увеличение иммуногенности штамма-продуцента ЖЧВ после его выращивания в биотехнологических режимах с применением БХС или RPMI - в обоих случаях выживало значительно большее (по крайней мере, в 1,5-1,8 раза) количество животных (табл. 2).

Таблица 2 - Влияние биотехнологического режима на иммуногенные свойства штамма-продуцента ЖЧВ

Иммунизирующий агент Питательная среда Добавление Са2+ Количество выживших мышей Продолжительность жизни погибших мышей (дни), М ± m

Абс.* %

Бактерии штамма EV НИИЭГ БХ - 5/11 45,5 4,3 ± 0,6

БХ + 7/10 70,0 4,0 ± 0**

RPMI - 8/10 80,0 4,5 + 0**

Физ. раствор (контроль) - - 0/5 0 4,2 ± 0,97

Примечание: * - в числителе/знаменателе - кол-во выживших мышей/общее количество зараженных мышей в этой группе;

** - животные погибли в один день.

е>

БХ БХС RPMÍ

секстин

Рис. 3. Иммунореактивность мышиных антисывороток к клеткам ЕУ НИИЭГ, выращенным на БХ, БХС или на Ю?М1 в непрямом ТИФА с применением гомологичных сенситинов.

При сравнении антигенной активности штамма-продуцента ЖЧВ обнаружено выраженное изменение титров гомологичных антител в сыворотках мышей BALB/c к м. кл. штамма в зависимости от биотехнологических режимов выращивания - повышение в восемь раз на БХС или снижение в четыре раза на RPMI (рис. 3).

С помощью иммуноблоттинга, нами идентифицированы конкретные иммуноре-активные антигены штамма-продуцента ЖЧВ, обеспечившие в исследованиях высокий уровень специфического иммунитета против экспериментальной чумы (рис. 4). Положительная реакция в контрольных образцах цельноклеточных лизатов клеток К pestis EV НИИЭГ, выращенных на БХ, визуализировалась с белковыми полосами, соответствующими по м.м. Cafl - мономеру Ф1 (17,5±2 кДа), Pia (33±2 кДа) и Ymt (61±2 кДа), а также дополнительно четырем белкам с м.м. 29,9±2; 63,1±2; 65,31±2 и 77,6±2 кДа (мы обозначили их №№ 3, 8, 9, 10, соответственно).

Рис. 4. Иммуноблоттинг электрофоретически разделенных в 12,5% ПААГ-SDS цельноклеточных лизатов У. pestis EV НИИЭГ (дорожки 1; 2; 3) и Y. pestis 231 (дорожка 4), выращенных на БХ (дорожка 3), БХС (дорожка 1) или RPMI (дорожки 2; 4) и ЧДИ (А) или 231-RPMI (В).

В блотгограммах цельноклеточных лизатов бактерий, выращенных на БХС, также регистрировалась положительная, но менее выраженная реакция с Cafl и Pia, а также белками № 8-10. С Ymt и белком № 3 визуазировались более мажорные линии (рис. 4, дорожка 1).В этом же треке выявлялся целый ряд го 6 дополнительных полипептидов с м.м. 21,4±2; 23,9±2; 26,3-28,8±2; 39,8±2; 44,2±2; 48,4±2 кДа (№№ 1, 2, 5, 6, 7, 11, соответственно). Положительной реакции с лизатами бактерий как вакцинного, так и вирулентного штаммов Y. pestis 231 (использован в качестве контрольного), выра-

щенных на срсдс ЯРМ1, зарегистрировано не было (рис. 4, дорожки 2 и 4, соответственно).

В иммуноблоте с аналогичными лизатами с мышиной антисывороткой к клеткам вирулентного штамма 231, выращенного на КРМ1, в треках ЕУ НИИЭГ (контроль -БХ) визуализировались следовая реакция с СаП и белком № 7, а также выраженное взаимодействие с белками № 10 и № 12 с м.м. 83,1±2 кДа (рис. 4, дорожка 3). Реакция с другими антигенами отсутствовала. В треках с лизатами ЕУ НИИЭГ после роста БХС и ЯРМ1 мы обнаружили положительную реакцию только с белком № 7 (рис. 4, дорожка 1) или, помимо данного антигена, также с белком № 12. С лизатами штамма 231, выращенного на КРМ1, выявлялась одна мажорная линия специфического взаимодействия с белком, обладающим м.м. 26,3-28,8 кДа (рис. 4, дорожка 4). Видимо, именно этот антиген обладал серологическим родством у бактерий вакцинного и вирулентного штаммов и был задействован, наряду с белками № 7 и № 12, в обеспечении высокого уровня протекции иммунных мышей от экспериментальной чумы.

Таким образом, сравнительное изучение влияния режимов выращивания на им-муногенность и продукцию штаммом-продуцентом ЖЧВ основных видоспецифиче-ских антигенов с протективными свойствами показало существенное преимущество биотехнологических подходов, основанных на моделировании стадии контакта чумных бактерий с клеткой-мишенью в организме чувствительных млекопитающих. При этом повышение иммуногенности сопровождалось изменением продукции иммуноре-активных антигенов в зависимости от условий культивирования штамма ЕУ НИИЭГ и появлением специфических антигенных субсгашщй, способных индуцировать у биомоделей выработку нейтрализующих протективных антител в высоких титрах.

Использованный в настоящей работе биотехнологический режим выращивания вакцинного штамма ЕУ НИИЭГ может способствовать оптимизации антигенной композиции вакцинного препарата для индукции эффективного специфического противочумного иммунитета.

Выводы

1. Продемонстрирована эффективность использования биотехнологических режимов выращивания экспериментально-производственного штамма У. ЕУ НИИЭГ с применением БХ, обогащенного ионами кальция и/или глюкозой, и синтетической среды ЯРМ1-1640 с аналогичными добавками и без них для получения клеточного урожая вакцинного штамма ЕУ НИИЭГ значительно (в 3,5-4,2 раза) пре-

вышающего таковой при использовании рутинных регламентированных условий культивирования на БХ без добавок.

2. Доказана перспективность использования RPMI-1640 для имитации in vitro условий паразитирования чумного микроба in vivo, что позволяет детально исследовать особенности взаимодействия чумного микроба с макроорганизмом и выявить конкретные антигены, синтезируемые клетками вакцинного (белки с м.м. 44,2±2 и 83,1±2 кДа) и вирулентного (белок с м.м. 26,3-28,8 кДа) штаммов У. pestis на ранних стадиях вакцинного и инфекционного процессов.

3. Охарактеризован антигенный состав вакцинного штамма EV НИИЭГ и изменение продукции основных видоспецифических антигенов с иммуногенной активностью, Ф1, Pia и Ymt, а также ЛПС, при культивировании его в различных биотехнологических режимах с использованием комплекса современных и классических микробиологических и иммунохимических методов.

4. Благодаря использованию нового оригинального биотехнологического режима культивирования вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ, повышены показатели его иммунореакгивносги (в восемь раз) и иммуногенности (с 45% до 80%) за счет модификации антигенной структуры пггамма-продуцента ЖЧВ.

5. Показана эффективность использования для приготовления ЖЧВ синтетической питательной среды RPMI-1640, которая обеспечивает стандартизацию биотехнологии масштабированного производства вакцины и повышение иммуногенности штамма-продуцента.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Влияние условий культивирования на пролиферативную и антигенную активности штаммов Yersinia pestis с различным плазмидным составом / В.А. Федорова, А.Б. Голова, 3.JI. Девдариани [и др.] // Природно-очаговые ООИ на юге России, их профилактика и лабораторная диагностика: сборник научных трудов. Астрахань, 2001. С. 165-167.

2. Федорова В.А., Голова А.Б., Девдариани З.Л. Влияние среды культивирования на синтез Yersinia pestis основных видоспецифических антигенов // Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой: материалы первой региональной конференции молодых ученых. Саратов. 2002, С. 41-42.

3. Особенности синтеза капсульной субстанции Yersinia pestis / А.Б. Голова, В.А. Федорова, З.Л. Девдариаии [и др.] // Фундаментальные науки и прогресс

клинической медицины: сборник тезисов НИЦ им. Сеченова III конф. молодых ученых России с международным участием. Москва, 2004. С. 166.

4. Иммунореактивность штаммоз Yersinia pestis с различным плазмидным составом в зависимости от условий культивирования / В.А. Федорова, А.Б. Голова, З.Л. Девдариани [и др.] // Медицинская микробиология - XXI век: материалы всероссийской научно-практической конференции. Саратов, 2004. С. 228-229.

5. Модификация полисахаридных цепей углеводсодержащих антигенов патогенных иерсиний в зависимости от условий культивирования бактерий / В.А. Федорова, А.В. Петрова, З.Л. Девдариани, А.Б. Голова [и др.] // Противочумные учреждения России и их роль в обеспечении эпидемиологического благополучия населения страны: материалы конференции, посвященной 70-летию Противочумного центра. Москва, 2004. С. 164.

6. Feodorova V.A., Golova А.В. Antigenic and phenotypic modification of Yersinia pestis in conditions simulating mammalian bloodstream // Journal of Medical Microbiology. 2005. Vol. 54. P. 435-441.

7. Изучение интра- и экстрацеллюлярной резистентности возбудителя чумы: модификация антигенной структуры / В А. Федорова, А.В. Петрова, А.Б. Голова [и др.] // Современные наукоемкие технологии: материалы II конференции студентов, молодых ученых и специалистов: современные проблемы науки и образования. Хургада (Египет), 2005. № 1. С. 73.

8. Федорова В.А., Голова А.Б. Внеклеточная резистентность возбудителя чумы к фагоцитозу // Вестник Академии Медицинских Наук. 2005. № 10. С. 19-25.

9. Голова А.Б., Федорова В.А., Девдариани З.Л. Диагностическая значимость антител к антигенам, синтезируемым Yersinia pestis в экстрацеллюлярных условиях // Проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях: санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств: материалы VI межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ. Волгоград, 2005. С. 219-220.

10. Feodorova V.A., Golova А.В. New Method of Induction of an Enhanced Immunity to Experimental Plague in Mouse Model // Vaccine Congress. 2007. Amsterdam. The Netherlands. P. 10.

11.Feodorova V.A., Golova A.B. Biotechnological approach for optimization of plague vaccine production // Материалы Германо-Российского форума по биотехнологии. Новосибирск, 2009. С. 19.

12. Федорова В.А., Голова А.Б. Биотехнологические аспекты создания эффективной антигенной композиции чумной вакцины с повышенной иммуногенностью // Сборник научных трудов: современные проблемы инфекционной патологии. Минск, 2009. Вып. 2. С. 531-535.

13. Федорова В.А., Панькина Л.Н., Голова А.Б. Перспективы создания эффективных безопасных противочумных вакцин нового поколения // Молекулярная медицина и биобезопасность в рамках IV Российского медицинского форума: сборник материалов VI международной конференция. Москва, 2009. С. 232-234.

14. Оптимизация биотехнологического режима выращивания вакцинного штамма EV НИИЭГ для повышения иммуногенности и иммунореактивности чумной вакцины / В.А. Федорова, А.Б. Голова, В.Л. Мотин [и др.] // Инфекции, обусловленные иерсиниями: III Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием. Санкт-Петербург, 2011. С. 111-113.

Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Подписано в печать 18.05.2012

Гарнитура Times. Печать Riso. _Усл. печ. л. 1,00. Тираж 100 экз. Заказ 0180 _

Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии ИП «Экспресс тиражирование» 410005, Саратов, Пугачёвская, 161, офис 320 8 27-26-93

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Голова, Алина Борисовна

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ГЛАВА 1. Характеристика профилактических противочумных препаратов.

1.1. Противочумные вакцины: классификация, основные принципы разработки, антигенная композиция профилактических препаратов, эффективность практического применения.

1.2. Методы культивирования вакцинных штаммов для приготовления противочумных профилактических препаратов.

1.3. Особенности режима выращивания аттенуированного штамма

ЕУ НИИЭГ в биотехнологии производства живой чумной вакцины.

ГЛАВА 2. Антигены чумного микроба и особенности иммуно- и патогенеза чумы.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 3. Объект, материалы и методы исследований.

3.1. Бактериальные штаммы и биотехнологические режимы их экспериментального выращивания.

3.2. Реактивы и растворы.

3.3. Оборудование и приборы.

3.4. Методы изучения влияния биотехнологических режимов выращивания на биосинтез и иммунореактивность основных иммуногенов, а также антигенную композицию бактерий У. резИя.

3.4.1. Влияние экспериментальных биотехнологических режимов выращивания на продукцию вакцинным штаммом ЕУ НИИЭГ основных антигенов с иммуногенной активностью.

3.4.2. Изучение влияния биотехнологических условий выращивания на антигенную активность бактерий У. резйБ.

3.4.3. Изучение влияния биотехнологических режимов выращивания на антигенную композицию и иммунореактивность бактерий Y. pestis методом иммуноблоттинга.

3.5. Методы оценки влияния биотехнологических условий экспериментального выращивания на основные фенотипические характеристики вакцинного штамма EV НИИЭГ.

3.5.1. Определение фибринолитической активности.

3.5.2. Определение фосфолипазной активности.

3.5.3. Определение капсулы.

3.6. Электрофорез.

3.7. Лабораторные животные.

3.8. Статистические методы.

ГЛАВА 4. Разработка оптимального технологического режима выращивания in vitro бактерий экспериментально-производственного вакцинного штамма EV НИИЭГ и его изогенных производных.

4.1. Оптимизация режима выращивания бактерий вакцинного штамма EV НИИЭГ in vitro для увеличения микробной биомассы.

4.2. Сравнительная оценка пролиферативной активности бактерий изогенных производных вакцинного штамма EV НИИЭГ при выращивании на регламентированных и экспериментальных питательных средах.

ГЛАВА 5. Изучение и иммунохимическая характеристика биосинтеза основных специфических антигенов вакцинным штаммом

EV НИИЭГ, выращенным в различных биотехнологических режимах.

5.1. Изучение капсулообразующей, фосфолипазной и фибринолитической активностей бактерий вакцинного штамма EV

НИИЭГ, выращенных в различных биотехнологических режимах.

5.1.1. Изучение капсулообразования.

5.1.2. Изучение фосфолипазной активности.

5.1.3. Изучение фибринолитической активности.

5.2. Изучение влияния режима выращивания на биосинтез основных антигенов, обеспечивающих иммуногенные и специфические свойства бактерий вакцинного штамма

EV НИИЭГ, с применением гибридомной биотехнологии.

5.3. Изучение влияния режима выращивания на биосинтез и иммунореактивность антигенов вакцинного штамма EV НИИЭГ углеводной природы.

ГЛАВА 6. Разработка эффективной антигенной композиции вакцинного штамма EV НИИЭГ.

6.1. Сравнительный анализ иммуногенности вакцинного штамма EV НИИЭГ, выращенного в различных биотехнологических режимах (лабораторные испытания).

6.2. Сравнительное изучение иммунореактивности вакцинного штамма EV НИИЭГ, выращенного в различных биотехнологических режимах.

6.3. Иммунохимическая характеристика антигенной композиции вакцинного штамма EV НИИЭГ в зависимости от биотехнологии-ческого режима выращивания бактерий.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка биотехнологических аспектов повышения иммуногенности вакцинного штамма Yersinia pestis EV НИИЭГ"

Актуальность темы. Как известно, живая чумная вакцина (ЖЧВ) на основе аттенуированного штамма Yersinia pestis ЕV линии НИИЭГ успешно применяется для специфической профилактики чумы у людей и животных на протяжении более 70 лет в нашей стране и в ряде стран СНГ (Салтыкова, Файбич, 1975; Айкимбаев с соавт., 2003; Feodorova, Corbel, 2009). До настоящего времени эта вакцина остается наиболее эффективным и единственным лицензированным профилактическим противочумным препаратом (Салтыкова, Файбич, 1975; Russell et al., 1995; Titball, Williamson, 2001, 2004; Медуницын, 2004; Бывалов, Кутырев, 2011; Книрель с соавт., 2011; Feodorova, Motin, 2011 и др.). Важным преимуществом ЖЧВ является ее способность уже после однократной прививки относительно быстро (в течение 3-4 дней) индуцировать специфический иммунитет против основных форм (бубонной и легочной) чумной инфекции (Самойлова, 1963; Исупов, Белобородов, 1995).

Выращивание экспериментально-производственного вакцинного штамма EV НИИЭГ для производства ЖЧВ на рутинных питательных средах in vitro, равно как и длительное масштабированное культивирование в биотехнологии производства противочумных профилактических препаратов зачастую обеспечивает выраженное снижение его иммуногенности (Салтыкова, Файбич, 1975; Алимов, 1984; Дятлов, 1986). Это связывают, как правило, с быстрой адаптацией чумных бактерий к условиям существования вне чувствительного макроорганизма и утрата так называемой «остаточной вирулентности» штамма, непосредственно обеспечивающей его иммуногенность (Салтыкова, Файбич, 1975; Анисимова с соавт., 2002; Промышленный регламент № 01897080-01-04 на производство «Вакцины чумной живой»). Восстановление иммуногенности проводится путем анимализации - многократного пассирования субкультур штамма EV НИИЭГ через организм морской свинки (Прядкина, Журба, 1966; Салтыкова, Файбич, 1975; Промышленный регламент № 01897080-01-04), что требует длительного времени, большого количества лабораторных животных и не поддается стандартизации ввиду использования в работе аутбредных биомоделей. Другой важной биотехнологической задачей при экспериментально-производственном выращивании штамма-продуцента ЖЧВ является разработка режимов, обеспечивающих высокий выход бактериальной массы (Шеремет с соавт., 1987). Согласно нормативной документации (Промышленный регламент № 01897080-01-04), для приготовления вакцины EY НИИЭГ микробные клетки данного штамма культивируют in vitro при температуре 28 °С на обычных бактериологических средах, производных гидролизатов Хоттингера (ГХ) или казеина. Однако биосинтез ряда важных для индукции специфического иммунитета антигенов Y. pestis наблюдается при температуре 37 °С, требует наличия в среде выращивания ряда дополнительных питательных компонентов и, в случае их отсутствия, сопровождается при выращивании микробных клеток в рутинных условиях in vitro заметным снижением активности роста чумных бактерий (Алутин, 1974; Наумов, Кондрашин, 1980; Brubaker, 1991). В литературе существуют многочисленные доказательства активизации пролиферации чумных бактерий при температуре 37 °С в условиях in vivo в организме чувствительных к чуме млекопитающих (Бахрах с соавт., 1969; Алутин, 1974; Perry, 1997). Очевидно, что заложенный в биотехнологию производства ЖЧВ режим выращивания штамма-продуцента принципиально отличается от условий внутренней среды макроорганизма млекопитающего, где на стадиях бактериемии и септицемии наблюдается наиболее бурное размножение микробных клеток. Сообщалось об определенных модификациях антигенной структуры чумного микроба в этот период, в частности, снижении продукции капсульного антигена Ф1, как у вирулентных штаммов возбудителя чумы, так и у бактерий Y. pestis EV76 -«прародителя» вакцинного штамма EV НИИЭГ (Burrows, Bacon, 1956; Brubaker, 1991). Остается неизвестным, имеет ли место изменение биосинтеза и других антигенов возбудителя чумы, задействованных в реализацию вирулентности и иммуногенности данного патогена - активатора плазминогена (Pia), «мышиного» токсина (Ymt) и липополисахарида (ЛПС). Вместе с тем, модификация продукции антигенов может объяснить относительно невысокую нейтрализующую активность противочумных антител, образующихся в макроорганизме вакцинируемого в результате иммунизации клетками вакцинного штамма EV НИИЭГ после их выращивания в регламентированном режиме при температуре 28 °С ввиду отсутствия в условиях in vivo на поверхности чумного микроба антигенов, синтезируемых in vitro на обычных бактериологических средах и невозможности индукции к этим антигенам протективных антител. Следовательно, оптимизация композиции протективных антигенов в препарате ЖЧВ должна способствовать повышению ее относительно невысокой иммуногенности.

Цель работы - разработка оптимальных биотехнологических режимов выращивания экспериментально-производственного вакцинного штамма EV НИИЭГ, обеспечивающих повышение его иммуногенности благодаря созданию эффективной антигенной композиции препарата живой чумной вакцины. Задачи исследования:

5. Разработать более эффективную антигенную композицию препарата ЖЧВ.

Научная новизна. Впервые разработаны и детально изучены биотехнологические режимы выращивания экспериментально-производственного штамма EV НИИЭГ, основанные на имитации in vitro условий паразитирования чумных бактерий in vivo в сравнении с регламентированными питательными средами. С помощью специфических антител показано, что выращивание микробов вакцинного штамма EV НИИЭГ в биотехнологическом режиме, приближенном к внутренней среде макроорганизма хозяина, сопровождается у штамма-продуцента модификацией биосинтеза Ф1, Pia, Ymt, ассоциированных с ними фенотипических активностей и ЛИС. Аналогичный феномен обнаружен при культивировании в сходном биотехнологическом режиме природных вирулентных и авирулентных штаммов Y. pestis, несущих хотя бы одну из двух плазмид, видоспецифических для чумного микроба, но не изогенных вариантов EV НИИЭГ. Разработанный биотехнологический режим выращивания вакцинного штамма EV НИИЭГ с применением синтетической среды RPMI-1640 (RPMI), симулирующей экстрацеллюлярную среду чувствительных к чуме млекопитающих, обеспечивал значительное повышение иммуногенности штамма-продуцента (не менее 80% выживших от экспериментальной чумы аутбредных мышей) по сравнению с регламентированным режимом культивирования штамма-продуцента (не более 45,5% выживших биомоделей). Новыми являются сведения о направленном биосинтезе бактериями вакцинного штамма EV НИИЭГ в указанных условиях in vitro антигенов с м.м. 44,2±2 и 83,1 ±2 кДа, способных на мышиной модели индуцировать высокий уровень специфического иммунитета к экспериментальной чуме. По данным иммунохимического анализа указанные полипептиды были локализованы на поверхности микробных клеток EV НИИЭГ и могли активно секретироваться в среду культивирования, обладали серологическим родством с антигеном белковой природы вирулентного штамма Y. pestis 231 с м.м. 26,3-28,8 кДа, но продуцировались бактериями экспериментально-производственного штамма EV

НИИЭГ в меньших количествах (в 2-4 раза) по сравнению с клетками вирулентного штамма.

Ca (2,5 мМ).

Разработана модель экстрацеллюлярной среды чувствительных к чуме млекопитающих. Показана принципиальная возможность имитирования in vitro ранней стадии взаимодействия чумных бактерий с макроорганизмом хозяина до контакта с клеткой-мишенью. Приоритетными являются сведения о развитии в этот период капсулонезависимого типа резистентности чумного микроба к фагоцитозу, которые могут служить основополагающим фундаментом усовершенствования ЖЧВ на основе вакцинного штамма EV НИИЭГ равно как и конструирования новых эффективных профилактических противочумных препаратов. Полученные данные являются перспективным для разработки оптимальной антигенной композиции новой субъединичной вакцины для быстрого купирования чумной инфекции у привитых в ранние сроки после заражения путем использования вышеуказанных антигенов.

Практическая значимость работы. Разработаны эффективные биотехнологические режимы выращивания бактерий экспериментально-производственного вакцинного штамма EV НИИЭГ, позволяющие почти четырехкратно повысить выход микробной биомассы в условиях in vitro. Благодаря оптимизации продукции вакцинным штаммом известных полипептидов с иммуногенной активностью, Ф1, Pia, Ymt, эндотоксина (ЛПС) и ряда других антигенных субстанций, а также направленной индукции биосинтеза белков с м.м. 44,2±2 и 83,1±2 кДа, выявленных только в условиях, приближенных к экстрацеллюлярной среде млекопитающих, и обладающих, по-видимому, высокой протективной активностью, указанный биотехнологический подход позволил почти в два раза повысить иммуногенность и в восемь раз иммунореактивность штамма-продуцента.

По материалам диссертации разработаны и утверждены директором ГНУ Саратовский НИВИ Россельхозакадемии (от 16 марта 2012 г.) «Методические рекомендации по оптимизации биотехнологического режима выращивания бактерий штамма Г. pestis EV НИИЭГ - продуцента живой чумной вакцины для повышения выхода клеточной биомассы».

Связь работы с научными программами. Настоящая работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 03-04-48067 «Молекулярная организация и структурно-функциональная характеристика биомолекул, детерминирующих вирулентность патогенных иерсиний», проектов BII/ISTC #3853 «Живые бактериальные вакцины: сравнительный анализ иммунного ответа человека и биомоделей» и «Изучение антибактериального иммунитета» (Университет Техаса, г. Галвестон, UTMB, субконтракт No. 11-082), а также Федеральной Целевой Программы по теме «Разработка когерентно-оптических биосенсоров на генетическом, клеточном и организменном уровнях организации» (соглашение № 14.В37.21.0563).

Основные положения, выносимые на защиту:

2. Выращивание клеток штамма EV НИИЭГ, продуцента ЖЧВ, в биотехнологических режимах с применением регламентированной среды бульон Хоттингера (БХ), дополненной ионами

Са (2,5 мМ) в сочетании с 0,1% глюкозы или только ионами Са (2,5 мМ), обеспечивает больший (в 2,8-3,7 раза) выход биомассы вакцинного штамма EV НИИЭГ, чем при использовании той же среды без указанных ингредиентов.

3. Установлены выраженные различия в составе антигенной композиции и иммуногенности ЖЧВ на основе вакцинного штамма EV НИИЭГ в зависимости от режима его культивирования in vitro.

4. Выращивание штамм а-продуцента EV НИИЭГ в биотехнологическом режиме in vitro, приближенном к экстрацеллюлярной среде макроорганизма хозяина in vivo, обусловливает модификацию биосинтеза специфических антигенов чумного микроба - Ф1, Pia, Ymt, изменение фенотипических активностей, ЛПС и направленную продукцию протективных полипептидов с м.м. 44,2±2 и 83,1±2 кДа. Более эффективная композиция вакцинного препарата позволила существенно (с 45% до 80%) повысить иммуногенность и в восемь раз иммунореактивность штамма EV НИИЭГ.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на:

Научно-практической конференции «Природно-очаговые ООИ на юге России, их профилактика и лабораторная диагностика», Астрахань, 2001;

Первой региональной конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой», Саратов, 2002;

III конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины», Москва, 2004;

Всероссийской научно-практической конференции «Медицинская микробиология - XXI век», Саратов, 2004;

Научно-практической конференции, посвященной 70-летию Противочумного центра «Противочумные учреждения России и их роль в обеспечении эпидемиологического благополучия населения страны», Москва, 2004;

II конференция студентов, молодых ученых и специалистов «Современные проблемы науки и образования», Хургада, Египет, 2005;

VI межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств: проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях», Волгоград, 2005;

Международном Вакцинном Конгрессе, 9-11 декабря 2007, Амстердам, Нидерланды;

Германо-Российском форуме по биотехнологии, Новосибирск, 2009;

Международной научно-практической конференции «Современные проблемы инфекционной патологии человека», Минск, Беларусь;

VI международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» в рамках IV Российского медицинского форума, Москва, 2009;

III Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Инфекции, обусловленные иерсиниями», Санкт-Петербург, 2011 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 работ, из них 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (2 главы), собственных исследований (4 глав), заключения, выводов и списка использованных литературных источников, включающего 416 источников, из них зарубежных - 148. Объем диссертации составляет 200 страниц текста, содержит 10 таблиц и 16 рисунков.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Голова, Алина Борисовна

ВЫВОДЫ

1. Продемонстрирована эффективность использования биотехнологических режимов выращивания экспериментально-производственного штамма Yersinia pestis EV НИИЭГ с применением бульона Хоттингера, обогащенного ионами кальция и/или глюкозой, и RPMI-1640 с аналогичными добавками и без них для получения клеточного урожая вакцинного штамма значительно превышающего таковой при использовании рутинных условий культивирования.

2. Доказана перспективность использования RPMI-1640 для имитации in vitro условий паразитирования чумного микроба in vivo, что позволяет изучить особенности взаимодействия Y. pestis с организмом хозяина и определить конкретные антигены, синтезируемые клетками вакцинного и вирулентного штаммов чумного микроба на ранних стадиях вакцинного и инфекционного процессов.

3. Охарактеризован антигенный состав вакцинного штамма EV НИИЭГ при культивировании его в различных биотехнологических режимах с использованием комплекса современных и классических микробиологических и иммунохимических методов.

4. Благодаря использованию нового оригинального биотехнологического режима культивирования вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ, повышены показатели его иммунореактивности и иммуногенности живой чумной вакцины за счет модификации антигенной структуры штамма-продуцента.

5. Показана эффективность использования для приготовления живой чумной вакцины синтетической питательной среды RPMI-1640, которая обеспечивает стандартизацию биотехнологии масштабированного производства вакцины и повышение иммуногенности штамма-продуцента.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Живая чумная вакцина, для производства которой используется аттенуированный штамм Y. pestis EV НИИЭГ, применяется в России с 1942 года для специфической профилактики чумы. Она является эффективной и единственной лицензированной вакциной для иммунизации людей. Эта вакцина способна вызывать специфический иммунитет после однократной прививки против бубонной и легочной чумы.

Для производства живой чумной вакцины используется экспериментально-производственный вакцинный штамм EV линии НИИЭГ, у которого в процессе длительного масштабированного культивирования с использованием рутинных питательных сред может снижаться иммуногенность. Повышение иммуногенности проводится с помощью анимализации. Это требует затрат времени, большого количества лабораторных животных и не поддается стандартизации ввиду использования в работе аутбредных биомоделей.

Культивирование вакцинного штамма EV в регламентированных условиях, по-видимому, не обеспечивает биосинтеза ряда важных для индукции специфического иммунитета антигенов, т.к. принципиально отличается от условий внутренней среды организма млекопитающего. Этим объясняется относительно невысокая иммуногенность ЖЧВ и сравнительно низкая активность противочумных антител, образующихся у вакцинируемых.

Как известно, одним из современных подходов является моделирование in vitro отдельных стадий иммуногенеза бактерий in vivo (Фаллер, Шилдс, 2004) для обеспечения условий, наиболее близких к среде их естественного паразитирования. Это позволит разработать биотехнологические режимы выращивания, направленные на создание более благоприятных условий роста микроба чумы равно как и направленного биосинтеза конкретных антигенов, которые экспрессируются бактериями вакцинного штамма EV НИИЭГ вне клетки-мишени и обладают высокой протективной активностью за счет способности вызывать индукцию нейтрализующих антител.

Целью настоящей работы явилась разработка оптимальных биотехнологических режимов выращивания экспериментально-производственного вакцинного штамма ЕУ НИИЭГ, обеспечивающих повышение его иммуногенности за счет создания эффективной антигенной композиции препарата живой чумной вакцины.

Начальным этапом нашей работы явилось конструирование питательной среды и оптимизация режима выращивания бактерий вакцинного штамма У ЕУ НИИЭГ для повышения пролиферативной активности в перспективе обеспечивающего увеличения выхода микробной биомассы чумного микроба. Первоначально бактерии вакцинного штамма выращивали на БХ, повысив температуру культивирования до 37 °С. При этом наблюдалась невысокая ростовая активность в первые сутки роста, а увеличение инкубации до 48 часов способствовало накоплению незначительного количества биомассы.

9 4

Затем БХ обогащали 2,5 мМ Са и/или 5,5 мМ глюкозы, рН 7,2, в количествах, соответствующих физиологическому содержанию этих компонентов в сыворотке крови млекопитающих (Логинов, 1983), и культивировали бактерии У резШ ЕУ НИИЭГ в том же температурном режиме. Как выяснилось, присутствие дополнительных ингредиентов значительно (в 33,7 раза) стимулировало пролиферацию чумных бактерий.

На следующем этапе при выращивании штамма У. резНя ЕУ НИИЭГ мы использовали среду ЯРШ, близкую по составу к сыворотке крови. Пролиферативная активность У. реБЙБ ЕУ НИИЭГ на данной среде по сравнению с БХ (без добавок) возрастала в 3,5 - 4,2 раза. Добавление ионов кальция и глюкозы по отдельности в среду культивирования также было эффективным по сравнению с БХ (ИП=3,3). При совместном использовании указанных ингредиентов в ростовой среде наблюдался наибольший стимулирующий эффект (ИП=4,2).

Таким образом, БХ, дополненный адекватными количествами ионов Са2+ или в комбинации кальция и глюкозы может служить удовлетворительной средой для получения большего клеточного урожая вакцинного штамма ЕУ НИИЭГ. Среда КРМ1 с дополнительными ингредиентами и без них способствовала активному размножению чумного микроба и являлась, на наш взгляд, более подходящей чем рутинная бактериологическая среда, питательной средой для имитации in vitro экстрацеллюлярной среды организма млекопитающих, позволяющей значительно повысить выход микробной биомассы вакцинного штамма EV НИИЭГ.

Чтобы установить, являются ли характерные для штамма Y. pestis EV НИИЭГ закономерности роста на обогащенных питательных средах аналогичными для его изогенных производных со сниженной вирулентностью, которые потенциально могут быть использованы для производственных целей, в указанных биотехнологических режимах выращивали моноплазмидные и бесплазмидный варианты чумного микроба. Выращивали штаммы в биотехнологических режимах обеспечивших высокий клеточный урожай в предыдущих экспериментах. Оказалось, что все использованные штаммы лишь незначительно повышали свою пролиферативную активность (ИП не превышал 1,8). Не было отмечено существенного влияния при добавлении в среду дополнительных ингредиентов. В целом у всех дериватов чумного микроба пролиферативная активность была ниже, как минимум в 2,5 раза, чем у вакцинного штамма EV НИИЭГ.

На следующем этапе работы изучали влияние подобранных нами биотехнологических режимов выращивания на пролиферацию чумных бактерий, обладающих полноценными вирулентными свойствами. Культивирование бактерий штамма Y. pestis 231 на БХ с добавками и без них выявило ту же закономерность, что была установлена нами на предыдущем этапе для вакцинного штамма EV НИИЭГ. На среде RPMI общее увеличение пролиферативной активности чумных бактерий оказалось в 4,9-5,2 раза выше по сравнению с контролем (БХ).

Выбранный нами подход повышения ростовой активности бактерий EV НИИЭГ путем моделирования условий, приближенных к экстрацеллюлярной среде организма млекопитающих, в целом оказался успешным. Выращивание чумных бактерий на RPMI и/или БХ с добавлением ионов кальция/глюкозы в адекватной концентрации обеспечило выход большей биомассы вакцинного штамма EV НИИЭГ по сравнению с обычной бактериологической средой (БХ) без дополнительных ингредиентов.

Затем исследовали продукцию штаммами Y. pestis EV НИИЭГ и 231 каждого из основных протективных антигенов и ассоциированных с ними фенотипических характеристик с применением разработанных нами на предыдущем этапе биотехнологических режимов.

При изучении продукции капсулы было установлено, что на БХ при добавлении кальция, глюкозы или обоих ингредиентов наблюдалась гетерогенная популяция бактерий обоих штаммов, т.е. как с капсулой, так и без нее, в отличие от БХ без добавок, на котором все клетки чумного микроба формировали типичную капсулу. В случае сочетанного добавления в БХ ионов кальция и глюкозы, а также на среде RPMI в препарате визуализировались только бескапсульные варианты микробных клеток штамма EV НИИЭГ. Эти данные были подтвеждены данными электронной трансмиссионной микроскопии (Коннов с соавт., 2002).

Наличие фосфолипазной и фибринолитической активностей регистрировалось только в случае выращивания обоих штаммов на БХ без дополнительных ингредиентов. При выращивании обоих штаммов на БХ с добавками и среде RPMI независимо от наличия или отсутствия в ней дополнительных ингредиентов у чумного микроба вакцинного и вирулентного штаммов указанные активности отсутствовали.

Изучение биосинтеза антигенов Ф1, Ymt и Pia, определяющих вышеописанные фенотипические активности, осуществляли методом ДИА. Оказалось, что у бактерий вакцинного штамма изменения в биосинтезе исследуемых антигенов оказались несколько менее выраженными, чем у вирулентного. Так, клетки EV НИИЭГ, выращенные на БХ без/с дополнительными ионами кальция и/или глюкозы, давали положительную реакцию в ДИА с ЧДИ, хотя при добавлении в БХ только глюкозы интенсивность сигнала была заметно сниженной. В случае выращивания бактерий на RPMI сигнал отсутствовал полностью как при анализе микробных клеток, так и культуральной жидкости вакцинного штамма EV НИИЭГ.

На клетках Y. pestis 231 соответствующие антигены определялись после культивирования микробов на БХ без добавок и с дополнительными количествами кальция или глюкозы, но не в случае добавления в питательную среду их комбинации. При исследовании культуральной жидкости данного штамма следовая реакция отмечена в контрольных пробах (БХ без добавок), а также в образцах БХ с дополнительным содержанием глюкозы. В ДИА с микробными клетками и образцами культуральной жидкости с использованием в качестве ростовой среды RPMI независимо от присутствия в ней дополнительных количеств Ca и глюкозы специфическое взаимодействие отсутствовало. Полученные результаты указывали на выраженное снижение биосинтеза Ф1, Ymt и Pia в использованных нами биотехнологических режимах выращивания бактерий вакцинного и вирулентного штаммов чумного микроба.

На следующем этапе исследования в сходном варианте ДИА нами были использованы МКА к Ф1 (D3.B2), продуцируемые производственной линией гибридомы Y.p.FI.D3.B2.Sp. (Анисимов с соавт., 1983; Айкимбаев с соавт., 1986; Девдариани с соавт., 1986; Девдариани, 1993). Положительная реакция в ДИА отмечалась с клетками Y. pestis EV НИИЭГ после их выращивания на БХ без/с добавлением кальция и глюкозы, тогда как после культивирования данного штамма на БХ с добавлением и кальция, и глюкозы визуализировалась слабая следовая реакция. При использовании в ДИА бактерий EV НИИЭГ, выращенных на RPM3, регистрировалась отрицательная реакция.

При тестировании в ДИА клеток вакцинного штамма EV НИИЭГ после культивирования на RPMI или БХ с добавлением комбинации кальция и глюкозы с применением МКА к Pia, полученных и охарактеризованных ранее (Федорова, Девдариани, 1999; Feodorova, Devdariani, 2000; Федорова, Девдариани, 2001; Федорова, 2004), получены отрицательные результаты. Аналогичная закономерность наблюдалась при исследовании бактерий вирулентного штамма 231.

При исследовании в 12,5% ПААГ-SDS в клеточных лизатах бактерий вакцинного штамма, выращенных на БХ, четко определялись мажорные полосы, соответствующие по мол. массе (17,8±2 кДа) мономеру Ф1 - Cafl, а также Pia (33±2 кДа) и Ymt (61±2 к Да). При добавлении в БХ кальция соответствующие линии в лизатах были менее выраженными, в то время как после культивирования на RPMI эти полосы практически отсутствовали. На наш взгляд, это указывает на значительное снижение биосинтеза каждого из антигенов в случае выращивания бактерий вакцинного штамма в условиях, приближенных к внеклеточной среде млекопитающих.

Исследование панели изогенных вариантов вакцинного штамма EV НИИЭГ, авирулентных и вирулентных штаммов возбудителя чумы в непрямом варианте ДИА с ЧДИ показало, что практически все исследованные микроорганизмы, независимо от комбинации собственных плазмид, давали сходную реакцию в ДИА без четкой взаимосвязи с режимом выращивания бактерий.

Таким образом, полученные результаты указывали на снижение биосинтеза Ф1 и/или Pia и/или Ymt в случае культивирования бактерий вакцинного экспериментального штамма EV НИИЭГ на среде RPMI, имитирующей внутреннюю среду макроорганизма хозяина. Аналогичный феномен наблюдался при использовании данного биотехнологического режима выращивания для культивирования природных вирулентных и авирулентных штаммов Y. pestis, несущих хотя бы одну из двух плазмид, видоспецифических для возбудителя чумы. У изогенных вариантов EV НИИЭГ такого феномена обнаружить не удалось.

Из литературных данных известно, что структура и иммунобиологические свойства молекулы ЛПС чумного микроба может изменяться в зависимости от температуры выращивания и состава питательной среды (Гремякова, 2004). В то же время неизвестно влияние режима выращивания на структуру ОСА (ЕСА) бактерий чумы. Этот антиген в определенном соотношении с Ф1, благодаря выраженным свойствам активировать специфическую резистентность к чуме, был предложен в качестве основного компонента химической чумной вакцины (Дальвадянц с соавт., 2003; 2005; 2006). В связи с вышеизложенным на наш взгляд было важным исследовать влияние режима выращивания на биосинтез указанных антигенов вакцинным экспериментально-производственным штаммом EV НИИЭГ. В своей работе мы исследовали микробные клетки и культуральную жидкость вакцинного штамма EV НИИЭГ, выращенного в восьми биотехнологических режимах как указано выше. В непрямом ДИА использовали МКА А6, продуцируемые гибридомой Y.p.LPS.Aó.Sp. и направленные к консервативному эпитопу Y. pestis, общему для коровой части, липида А и ОСА (Федорова, 2004). МКА А6 реагировали позитивно с микробами вакцинного штамма EV НИИЭГ, выращенными БХ независимо от присутствия в ней дополнительных количеств ионов Са2+ и/или глюкозы, тогда как выращивание тех же бактерий на среде RPMI обеспечивало более слабый цветной сигнал. Более слабая реакция наблюдалась при использовании в ДИА культуральной жидкости штамма, выращенного на БХ с добавками, и отрицательная - в случае тестирования культуральной жидкости бактерий EV НИИЭГ после культивирования на RPMI. Сходная реакция зарегистрирована в ДИА с клетками и образцами культуральной жидкости бактерий вирулентного штамма 231. Результаты ДИА в полной мере согласовывались с данными электрофоретического исследования депротеинизированных клеточных лизатов вакцинного штамма EV НИИЭГ и его бесплазмидного изогенного производного КМ-218, выращенных в БХ (контроль) или RPMI без или с добавлением кальция в 12,5% ПААГ-SDS. При культивировании микробов чумы в среде, приближенной к внеклеточным условиях in vivo, наблюдалось принципиальное изменение электрофоретических профилей по сравнению с выращиванием на БХ. Если в последнем случае в электрофоретических профилях бактерий обоих штаммов, выращенных на рутинной среде (БХ), можно было обнаружить, помимо низкомолекулярных быстромигрирующих диффузных зон (идентифицированных ранее как липид А - кор (Bengoechea et al., 2002; 2004), средне- и высокомолекулярные углеводные компоненты, предположительно связанные с ЕСА, то в первом выявлялись только небольшие низкомолекулярные зоны. Это, вероятно, указывало на практически полное прекращение биосинтеза фрагментов ЛПС, несущих специфические для Y. pestis антигенные детерминанты, и, видимо, демаскировку неспецифических, имеющих серологическое родство с клетками и тканями организма человека эпитопов (Жуков-Вережников с соавт., 1972; Бочко, Некляев, 1979).

Полученные нами результаты согласуются с опубликованными данными ряда авторов, показавших, что культивирование чумных бактерий при температуре хозяина 37 °С обеспечивает значительное снижение биосинтеза основных компонентов ЛПС чумного микроба и других патогенных иерсиний, в первую очередь липида А и кора (Gremyakova et al., 2002; Kawahara et al., 2002; Skurnik, Bengoechea, 2003; Анисимов, Книрель, Дентовская).

Таким образом, полученные в настоящем исследовании результаты в совокупности с данными литературы свидетельствуют о существенном влиянии биотехнологического режима выращивания вакцинного штамма EV НИИЭГ на биосинтез ЛПС и основных видоспецифических антигенов возбудителя чумы (Ф1, Ymt, Pía), обеспечивающих иммунный ответ на вакцину EV НИИЭГ, а также проявление ассоциированных с данными антигенами фенотипических характеристик - капсулообразующей, фосфолипазной и фибринолитической активностей Y. pestis. Наиболее выраженная модификация антигенной структуры бактерий EV НИИЭГ наблюдалась при культивировании чумного микроба на средах, имитирующих экстрацеллюлярную среду млекопитающих.

Задача следующего этапа исследования состояла в экспериментальной проверке гипотезы, предполагающей возможность создания у биомоделей более высокого уровня протекции против экспериментальной чумы путем направленной индукции иммунного ответа к антигенам, синтезируемым чумными бактериями во внеклеточных условиях кровяного русла млекопитающих на ранней стадии контакта клеток вирулентного штамма Y. pestis с клеткой-мишенью in vivo, нейтрализации чумных бактерий в самом начале развития инфекционного процесса и быстрого прекращения болезни. С этой целью мы проводили сравнение протективного потенциала вакцинного штамма EV НИИЭГ, выращенного в различных биотехнологических режимах: рутинном, на БХ, или БХ с добавлением 2,5 мМ ионов кальция, или RPMI. Выбор именно этих биотехнологических режимов был обусловлен наиболее показательными изменениями в пролиферативной активности, фенотипических свойств и биосинтеза основных видоспецифических антигенов, выявленных нами ранее.

Таким образом, выращивание бактерий вакцинного штамма EV НИИЭГ в биотехнологическом режиме, основанном на имитации экстрацеллюлярных условий чувствительных к чуме млекопитающих способствовало выраженному (по крайней мере, в 1,5-1,8 раза) увеличению количества животных, выживших после экспериментальной чумы.

На следующем этапе сравнивали антигенную активность бактерий вакцинного штамма, выращенных в разных биотехнологических режимах, по способности индуцировать специфические антитела в организме биомоделей.

Таким образом, выращивание бактерий вакцинного штамма EV НИИЭГ в различных биотехнологических режимах существенно влияло на их иммунореактивность. Преимуществом использования режима культивирования, основанного на использовании условий, имитирующих раннюю стадию контакта чумных бактерий с макроорганизмом, является возможность индукции более высокого титра противочумных антител.

Получение панели мышиных противочумных антител позволило перейти к реализации одной из главных задач настоящей диссертационной работы -изучению влияния режима выращивания вакцинного штамма EV НИИЭГ на продукцию антигенов, обеспечивающих протективный иммунный ответ, а также идентификацию конкретных иммунореактивных/иммунодоминантных антигенов Y. pestis, обеспечивших в наших исследованиях высокий уровень специфического иммунитета против экспериментальной чумы. Для решения поставленной задачи использовали иммуноблот по методу Towbin Н. et al. (1979). Согласно полученным данным положительная реакция в контрольных образцах цельноклеточных лизатов клеток Y. pestis EV НИИЭГ, выращенных на БХ, визуализировалась с белковыми полосами, соответствующими по м.м. Cafl - мономеру Ф1 (17,5±2 кДа), Pia (33±2 кДа) и Ymt (61±2 кДа), а также дополнительно четырем белкам с м.м. 29,9±2; 63,1±2; 65,3±2 и 77,6±2 кДа (мы обозначили их №№ 3, 8, 9, 10, соответственно). В блоттограммах цельноклеточных лизатов бактерий, выращенных на БХ с дополнительным Са2+, также регистрировалась положительная, но менее выраженная реакция с Cafl и Pia, а также белками № 8-10. С Ymt и белком № 3 визуазировались более мажорные линии. В этом же треке выявлялся целый ряд из 6 дополнительных полипептидов с м.м. 21,4±2; 24±2; 26,3-28,8±2; 39,8±2; 44,2±2; 48,4±2 кДа (№№ 1, 2, 5, 6, 7, 11, соответственно). Положительной реакции с лизатами бактерий как вакцинного, так и вирулентного штаммов Г. ре>чШ 231 (использован в качестве контрольного), выращенных на среде ИРМ!, зарегистрировано не было.

Поскольку в иммуноблоте цельно-клеточных лизатов ЕУ-БХ, ЕУ-КРМ1, 231-БХ и 231-11РМ1 с мышиными антисыворотками к ЕУ-11РМ1 специфическая реакция с конкретными антигенами почти полностью блокировалась неспецифическим связыванием с белком наружной клеточной стенки с м.м. ~ 40±2 кДа, идентифицированном ранее как порин (Фомичева, 1996; Новикова с соавт., 1996), на следующем этапе в иммуноблоте с аналогичными лизатами мы использовали мышиную антисыворотку к клеткам вирулентного штамма 231-ЯРМ1.

В этом случае на блоттограммах ЕУ-БХ и антител к 231-11РМ1 визуализировались следовая реакция с СаП и белком № 7, а также выраженное взаимодействие с белками № 10 и № 12 с м.м. 83,1±2 кДа. Реакция с другими антигенами отсутствовала. В треках с лизатами ЕУ-БХС и ЕУ-КРМ1 мы обнаружили положительную реакцию только с белком № 7 или, помимо данного антигена, также с белком № 12. С лизатами 231-КРМ1 выявлялась одна мажорная линия специфического взаимодействия с белком, обладающим м.м. 26,3-28,8 кДа. Видимо, именно этот антиген обеспечивал высокий уровень протекции иммунных мышей от экспериментальной чумы.

Таким образом, сравнительное изучение влияния режимов выращивания на иммуногенность вакцины ЕУ НИИЭГ и продукцию вакцинным штаммом основных видоспецифических антигенов с протективными свойствами показало существенное преимущество биотехнологических подходов, основанных на моделировании стадий контакта чумных бактерий с клеткой-мишенью в организме чувствительных млекопитающих. При этом повышение иммуногенности сопровождалось изменением продукции иммунореактивных антигенов в зависимости от условий культивирования штамма ЕУ НИИЭГ и появлением некоторых антигенных субстанций, способных индуцировать у мышей BALB/c выработку нейтрализующих протективных антител в высоких титрах.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Голова, Алина Борисовна, Саратов

1. Акимович В.В. Антигенная структура бактерий чумы, зависимых и независимых при 37 °С от ионов кальция / В.В. Акимович и др. // Вопросы микробиологии и лабораторной диагностики особо опасных инфекций. Саратов, 1965. С. 3-8.

2. Акимович В.В. Использование среды Джексона-Берроуза и Хигучи-Смита для селекции бактерий чумы с различной степенью вирулентности /В.В. Акимович и др. // Вопросы микробиологии и лабораторной диагностики особо опасных инфекций. Саратов, 1965. С. 44-49.

3. Акимович В.В. Использование среды Хигучи-Смита для некоторых характеристик вакцинных штаммов чумного микроба /В.В. Акимович, Н.Г. Пономарев // Микробиология и иммунология особо опасных инфекций. Саратов, 1964. С. 50-54.

4. Акимович В.В. Роль некоторых антигенов в вирулентности, токсичности, иммуногенности и аллергенности чумного микроба /В.В. Акимович и др. // Материалы конференции, посвященной 50-летию института «Микроб». Саратов, 1968. С. 101-103.

5. Александров Н.И. Активная специфическая профилактика инфекционных заболеваний и пути ее усовершенствования / Н.И. Александров, Н.Е. Гефен. М.: Военное изд-во МО СССР, 1962. С. 94.

6. Алимов А.Ф. Изучение роста штаммов ЕВ и К-1 чумного микроба на этапах приготовления посевного материала в бутылях с аэрацией бульона и в стационарных условиях / А.Ф. Алимов и др.; Саратов, 1983. II с. -Деп. в ВНИИМИ МЗ СССР, № Д6785.

7. Алимов А.Ф. Кинетика роста штаммов ЕВ и К-1 в условиях производства чумной живой вакцины на первом и втором этапах приготовления посевной культуры / А.Ф. Алимов и др.; Саратов, 1983. II с. Деп. в ВНИИМИ МЗ СССР, № 6802-83.

8. Алимов А.Ф. Разработка оптимальной технологической схемы массового аппаратного культивирования авирулентных высокоиммуногенныхштаммов чумного микроба: автореф. дисс. . канд. мед. наук / А.Ф. Алимов.- Саратов, 1984. 17 с.

9. Алтарева Н.Д. и др. // Труды научно-исслед. ин-та «Микроб». Саратов, 1958.В.2. С.68.

10. Ю.Алутин И.М. Влияние температуры окружающей среды на биологическую активность возбудителя чумы: автореф. дисс. . канд. мед. наук / И.М. Алутин. Саратов, 1974. - 22 с.

11. П.Анисимов А.П. Серовариация капсульного антигена возбудителя чумы / А.П. Анисимов, Н.М. Захарова // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология 1992. - № 9-10. - С. 26-29.

12. Анисимов П.И. Изменение свойств вакцинного штамма ЕВ при пассажах через организм монгольских пищух / П.И. Анисимов и др. // Проблемы особо опасных инфекций. Саратов, 1969. - Вып.1. - С. 68-74.

13. Анисимов П.И. Некоторые физико-химические особенности капсульного белка чумного микроба / П.И. Анисимов и др. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 1987. - № 2. - С. 24-27.

14. Апарин Т.П. Микробиология чумы / Т.П. Апарин, Е.П. Голубинский -Иркутск, 1989.-С. 28.

15. Арыкпаева У.Т. Потребности в факторах роста при 37 °С у бактерий чумы из разных природных очагов СССР / У.Т. Арыкпаева // Проблемы особо опасных инфекций. Саратов, 1979, № 3, с. 64-65.

16. Асяев A.A. Опыт сублимационного высушивания вакцины чумной живой на лиофилизационных установках камерного типа / A.A. Асяев и др. -Екатеринбург, 1999. С. 9-10.

17. Ашмарин И.П. Статистические методы в микробиологических исследованиях / И.П. Ашмарин, A.A. Воробьев. Л.: Медгиз, 1962.

18. Баскакьян И. А. Некоторые аспекты интенсификации производства бактерийных препаратов / И.А. Баскакьян, Л.Н. Запорожцев // ЖМЭИ. -1976. -№ 11. -С. 30-34.

19. Баскакьян И.А. Патология и физиология микробов. Сообщение I. Общие вопросы / И.А. Баскакьян, В.М. Боровкова, С.Н. Кузьмин // ЖМЭИ. -1981. №9. С. 14-19.

20. Басова H.H. К изучению иммунотормозящего действия фракции I чумного микроба / H.H. Басова, Л.Г. Герасюк // Профилактика особо опасных инфекций: тезисы докладов межинститутской научной конференции Ростов-на-Дону, 1963. - С. 17-18.

21. Бахрах Е.Э. Влияние условий культивирования на рост чумного микроба, его химический состав и способность к синтезу специфических компонентов / Е.Э. Бахрах и др. /'/' Саратов, 1969.- 16 с.

22. Бахрах Е.Э. К характеристике соматических антигенов чумного микроба / Е.Э. Бахрах и др.//ЖМЭИ. 1972.-№9.- С. 101-105.

23. Бахрах Е.Э. О структуре соматических антигенов чумного микроба / Е.Э. Бахрах // Вестник Акад. мед. наук СССР. М.: Медицина, 1973. - № 11. -С. 71-76.

24. Бахрах Е.Э. Соматические полисахаридсодержащие антигены чумного микроба / Е.Э. Бахрах, В.И. Вейнблат // ЖМЭИ. 1972. - № 3. - С.12-16.

25. Бахрах Е.Э., Зависимость роста чумного микроба от наличия в питательной среде азотистых веществ / Е.Э. Бахрах, А.Н. Крайнова, А.П. Михайлова // Труды института «Микроб», 1951, вып.1, С. 168-173.

26. Бахрах Е.Э., Значение физико-химического состояния питательной среды в производстве живой чумной вакцины / Е.Э. Бахрах, Ф.К. Дроздовская, Н.К. Муравьева // Биохимия микробов и иммунохимия. Горький, 1966, с.32-33.

27. Бахрах Е.Э., Иммунохимическая идентификация двух соматических полисахаридосодержащих антигенов чумного микроба / Е.Э. Бахрах, В.И. Вейнблат // Проблемы особо опасных инфекций. Саратов, 1969. - Вып.6. - С.82-87.

28. Безопасность работы с микроорганизмами I-II группами патогенности (опасности). Санитарно-эпидемиологические правила. СП 1.3.1285-03.2003.

29. Вельская H.A. Изучение некоторых физико-химических свойств водорастворимых белков чумных бактерий: автореф. дисс. . канд. мед. наук / H.A. Бельская. Саратов, 1975. - 17 с.

30. Биологические мембраны. Методы. / Под ред. Дж. Финдлея, У. Эванза. -М.: Мир, 1990.- 132 с.

31. Бойд У. Основы иммунологии / У. Бойд. М., 1969. - 280 с.

32. Боровикова Т.П. Характеристика специфических полисахаридсодержащих комплексов субкультур штамма ЕВ чумного микроба: автореф. дис. . канд. биол. наук / Т.П. Боровикова.- Саратов, 1972.-20 с.

33. Бочко Г. М., Некляев В. Н. // Бюл. эксперим. биол. мед. 1979. - № 9. - С. 317-319.

34. Будыка Д.А. Научно-методические основы совершенствования живой чумной вакцины: автореф. дис. . д-ра мед. наук // Ростов-на-Дону, 2002. -32 с.

35. Булгакова Е.Г. Функциональное картирование плазмиды пестициногенности чумного микроба: автореф. дисс. . канд. мед. наук / Е.Г. Булгакова. Саратов, 1991.- 20 с.

36. Быстрый Н.Ф. О некоторых факторах способствующих удлинению выживаемости микробных тел в сухой живой противочумной вакцине / Н.Ф. Быстрый и др. // Сборник научных работ. Махачкала, 1961. - С. 153-163.

37. Васильева Г.И. Взаимодействия Yersinia pestis с клетками системы мононуклеарных фагоцитов в реализации вакцинного и инфекционного процессов: автореф. дис. . д-ра биол. наук / Г.И. Васильева. Саратов, 1990.-40 с.

38. Вейблат В.А. Влияние отдельных компонентов питательной среды на синтез некоторых антигенов чумным микробом / В.А. Вейблат, Н.П. Борисова // Профилактика особо опасных инфекций. Саратов, 1968. Вып. 2. С. 126-130.

39. Вейнблат В.А. Влияние условий культивирования на синтез чумным микробом некоторых антигенов: автореферат дис. . канд. мед. наук / В.А. Вейнблат. Саратов, 1968. - 20 с.

40. Вейнблат В.А. Получение капсульного антигена из живых чумных микробов / В.А. Вейнблат, М.С. Веренков, A.C. Васенин // Тезисы Всесоюзной конференции «Иммунология и иммунопрофилактика чумы и холеры» Саратов, 1980. - С. 36-39.

41. Вейнблат В.А. Характеристика препаратов капсульного антигена, выделенных из бульонной культуры штамма ЕВ Yersinia pestis / В.А. Вейнблат и др. // ЖМЭИ. 1985. - № 4. - С. 19-23.

42. Видяева H.A. Изучение экспрессии белков внешней мембраны, кодируемых плазмидой кальцийзависимости Yersinia pestis: автореф. дис. . канд. биол. наук / H.A. Видяева. Саратов, 1992. с. 22.

43. Гетерогенность препаратов фибринолизина чумного микроба по данным физико-химического анализа / Н.И. Лупикова и др. // Деп. в ВИНИТИ 02.06.92, № 1819-В92.

44. Глик Б. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. / Б. Глик, Дж. Пастернак. М.: Мир. - 2002. -589 с.

45. Гончаров А.Ю. Структурно-функциональная огранизация участка ДНК pYT плазмиды, ответственного за синтез фракции 1 чумного микроба: автореф. дис. . канд. биол. наук / А.Ю. Гончаров. Саратов, 1995. - 20 с.

46. Гремякова Т.А. Сравнительная характеристика препаратов капсульного антигена Fl Yersinia pestis, полученных из штаммов-продуцентов с различной структурой липополисахаридов / Т.А. Гремякова и др. // ЖМЭИ. 1994. - № 3. - С. 10-14.

47. Гремякова Т.А. Структурно-функциональная вариабельность антигенов Yersinia pestis и методология конструирования противочумныхиммунопрофилактических препаратов: автореф. дис.докт. мед. наук /

48. Т.А. Гремякова. Москва, 2004. - 38 с.

49. Грубер И.М. I Всесоюзное рабочее совещание по проблеме «Управление процессом культивирования патогенных микроорганизмов» / И.М. Грубер, Н.В. Волкова // ЖМЭИ, 1976, №6. С. 146-148.

50. Гюлушанян К.С. Использование питательной среды на основе кукурузного экстракта в производстве чумной вакцины EV: автореф. дис. . канд. биол. наук / К.С. Гюлушанян. Ставрополь, 1994. - 20 с.

51. Дальвадянц С.М. Характеристика соматических антигенов чумного микроба, изолированных по методу Буавена и Вестфаля-Людерица: автореф. дис. . канд. мед. наук / С.М. Дальвадянц. Саратов, 1968. - 22 с.

52. Девдариани З.Л. Состояние и перспективы совершенствования вакцинопрофилактики особо опасных бактериальных инфекций при чрезвычайных ситуациях / З.Л. Девдариани, И.Г. Дроздов, В.В. Кутырев // Волгоград, 2005. С. 227.

53. Дентовская C.B. Структурное разнообразие и эндотоксическая активность липополисахарида Yersinia pestis / C.B. Дентовская и др. // Биохимия. 2008.-Т. 73.-С. 237-246.

54. Домарадская Т.И. Метаболизм чумного микроба при глубинном культивировании / Домарадская Т.И., Джапаридзе М.Н. / 6 съезд Всес. микробиол. об-ва «На главных путях науч.-техн. прогресса» Рига, 1980. Т. З.С. 3-4.

55. Домарадский И.В. Биохимия и генетика возбудителя чумы / И.В. Домарадский, Е.П. Голубинский, Ю.Г. Сучков // М.: Медицина, 1974. 165 с.

56. Домарадский И.В. Использование соевых бобов для приготовления кислотного гидролизата / И.В. Домарадский, Н.З. Трофименко, Л.И. Носкова // Бюлл. по обмену опытом производ. бак. препаратов. Улан-Удэ, 1961.-Вып. 1.-С. 7-8.

57. Домарадский И.В. Лизис фибрина крови человека и животных чумным микробом / И.В. Домарадский, Г.А. Яромюк // Бюл. экспериментальной биологии и медицины 1960. - № 7. - С. 51-54.

58. Домарадский И.В. О коагуляции плазмы чумным и псевдотуберкулезным микробами / И.В. Домарадский и др. // Бюл. эксперим. биол. и мед. -1963. -№ 7.-С. 79-82.

59. Домарадский И.В. Очерки патогенеза чумы / И.В. Домарадский. М.: Медицина, 1966. 271 с.

60. Домарадский И.В. Чума / И.В. Домарадский- М.: Медицина, 1998. 265 с.

61. Донская Т.Н. Использование солей железа в качестве стимулятора роста чумного микроба / Т.Н. Донская и др. // Лабораторное Дело. -1983. № 3. -С. 57-59.

62. Донская Т.Н. Соли железа как стимулятор роста чумного микроба / Т.Н. Донская и др. // Информ. бюлл. изобрет. и рац. предложений. Саратов, 1977. № 5. - С.14-15.

63. Донская Т.Н., Питательные среды из немясных основ для выращивания чумного микроба / Т.Н. Донская, Л.С. Зимарина // Закл. Отчет. Саратов, 1976. С. 57.

64. Дробышева Т.М. Ахромогенные варианты различных субкультур чумного микроба ЕВ / Т.М. Дробышева // Профилактика особо опасных инфекций. Саратов, 1977, вып. 3, с. 50-55.

65. Дробышева Т.М. Влияние селективных факторов хозяина на популяционную изменчивость чумного микроба / Т.М. Дробышева // Проблемы особо опасных инфекций. Саратов, 1974, вып. 5, с. 134-139.

66. Дроздовская Ф.К. Биохимические основы производства сухой живой чумной вакцины / Ф.К. Дроздовская. Саратов, 1977. - 46 с.

67. Дроздовская Ф.К. Изменение интенсивности дыхания чумного микроба при глубинном выращивании и в процессе хранения его в высушенномсостоянии / Ф.К. Дроздовская и др. // Проблемы особо опасных инфекций. Саратов, 1969. № 1. С. 186-188.

68. Дроздовская Ф.К. Некоторые вопросы углеводно-фосфорного обмена микробов чумы и псевдотуберкулеза и влияние глюкозы на рост возбудителя чумы в условиях аэрации: автореф. дисс. . канд. биол. наук / Ф.К. Дроздовская. Саратов, 1977. - 46 с.

69. Дроздовская Ф.К., Изменение ТТХ-редуктазной активности в цикле развития аэрируемой культуры чумного микроба / Ф.К. Дроздовская, Л.И. Глушко // Проблемы особо опасных инфекций. Саратов, 1971. № 5. С. 109-113.

70. Дубичев А.Г. Некоторые особенности белок-белковых взаимодействий в молекулах капсульного антигена чумного микроба / А.Г. Дубичев и др. // Микробиология, иммунология и биохимия особо опасных инфекций. -Саратов, 1987. С. 41-45.

71. Дудукалова Т.Н., и др. Опыт выращивания штамма ЕВ глубинным методом в реакторе / Т.Н. Дудукалова и др. // ООИ на Кавказе. -Ставрополь, 1970. Вып. 1. С. 102-105.

72. Дятлов И.А. Исследование условий культивирования чумного микроба в многофазных системах: автореф. дисс. . канд. мед. наук / И.А. Дятлов. -Саратов, 1986.-20 с.

73. Дятлов И.А. Получение основных антигенов чумного микроба при многоциклических процессах культивирования / Дятлов И.А. и др. // Актуальные вопросы профилактики инфекционных заболеваний. Киров, 1991.-С. 156-157.

74. Дятлов И.А. Утилизация глюкозы культурами штаммов EV и К-1 чумного микроба / И.А. Дятлов, А.Ф. Филиппов // Микробиология, иммунология и биохимия особо опасных инфекций. Саратов, 1987. С. 24-26.

75. Егоров A.M. Теория и практика иммуноферментного анализа / A.M. Егоров и др. М.: Высш. шк., 1991.-319с.

76. Езепчук Ю.В. Биомолекулярные основы патогенности бактерий / Ю.В. Езепчук- М.: Наука, 1977. 108 с.

77. Езепчук Ю.В. Патогенность как функция биомолекул / Ю.В. Езепчук. -М.: Медицина, 1985.- 150 с.

78. Езепчук Ю.В. Стратегия возбудителя в организме хозяина / Ю.В. Езепчук. -Л., 1987.-93 с.

79. Ерман Б.А. Качество агара Хоттингера в зависимости от сроков хранения / Б.А. Ерман // Известия Иркутского противочумного института Сибири и Дальнего Востока. 1959. - Т. 20. - С. 331-334.

80. Жданова Л.Г. Значение исследований по физиологии патогенных микроорганизмов в вакцинном производстве / Л.Г. Жданова // Вакцинно-сывоторочное дело. Состояние и перспективы развития. М., 1979. С. 8287.

81. Ждан-Пушкина С.М. Основы роста микроорганизмов / С.М. Ждан-Пушкина. Изд-во Ленингр. ун-та. 1983. - С. 187.

82. Жемчугов В.Е. Некоторые данные об иммуногенности культур чумного микроба, выращенных в двухфазной системе / В.Е. Жемчугов, А.Ф. Филиппов. Саратов, 1982.- 8 с. Деп. В ВНИИМИ МЗ СССР, № 5469-82. Реф.: РЖ Мед. Реф. Журн. Разд.3,1982, №12, 3626.

83. Жуков-Вережников H.H. Иммунология чумы / H.H. Жуков-Вережников -М.: Медгиз, 1940. 226 с.

84. Жуков-Вережников H.H., Адамов А.К., Анисимов П.И. и др. // Бюл. эксперим. биол. мед. 1972. - № 4. - С. 63-65.

85. Журба М.Д. Об изменчивости чумного вакцинного штамма ЕВ / М.Д. Журба, М.Д. Прядкина, Г.Ф. Абрамова // ЖМЭИ. 1966. № 4. - С. 64-67.

86. Захарова И.Я. Методы изучения микробных полисахаридов / И .Я. Захарова, JI.B. Косенко. Киев, 1982. 236 с.

87. Золотарев Л.Г. Изучение локализации антигена FI Yersinia pestis EV иммуноферритиновым методом / Л.Г. Золотарев // ЖМЭИ. 1983. - № 7. - С. 62-64.

88. Иванов В.Н. Клеточный цикл микроорганизмов и гетерогенность их популяций / В.Н. Иванов, Г.А. Угодчиков. Киев: Наукова думка, 1984. -280 с.

89. Иванова Г.Ф. Сравнительное изучение эффективности вакцин, полученных из биомасс, выращенных при (21±1) °С / Г.Ф. Иванова и др. -Киров, 1998. С. 103-104.

90. Исследования по иммунизации против чумы. Сообщение 4. Опыт ревакцинации волонтеров «химической» и живой чумной вакцинами / С.М. Дальвадянц и др. // Проблемы особо опасных инфекций. Саратов, 2006. № 1 (91). С. 57-61.

91. Исупов И.В. Патоморфологические аспекты доклинических испытаний различных вакцин против чумы, сибирской язвы и холеры / И.В. Исупов, С.А. Бугоркова, В.В. Кутырев. Саратов, 2004. 124 с.

92. Исупов И.В. Экспериментальная патоморфология при использовании живой чумной вакцины / И.В. Исупов, P.A. Белобородов. -Саратов, 1995. 108 с.

93. Канчух A.A. Изучение живой противочумной вакцины, приготовленной на средах с кукурузным экстрактом / A.A. Канчух и др. // Микробиология и иммунология особо опасных инфекций: сб. науч. работ противочум. учр. страны. Саратов, 1964. - С. 131-137.

94. Касаткин Н.Ф. Клеточный состав возбудителя чумы / Н.Ф. Касаткин // Доклад Иркутского противочумного ин-та. 1963. Вып. 6. С. 47-48.

95. Квашнина A.C. Фибринолизины бактерий. Феномен резистентности при чуме. Сообщение III. / A.C. Квашнина // ЖМЭИ. 1948. - № 7. - С. 66-69.

96. Квашнина A.C. Фибринолизины бактерий. Фибринолитические свойства чумной палочки. Сообщение I. / A.C. Квашнина // Труды Ростовского-н/Д. противочумн. ин-та. 1941. - Т. 2. - С. 70-77.

97. Квашнина A.C. Фибринолизины микроорганизмов: автореф. дисс. . докт. мед. наук / A.C. Квашнина. Ростов-на-Дону, 1959. - 40 с.

98. Кетти Д. Получение поликлональных антител и контроль их качества / Д. Кетти, Ч. Райкундалия.- М.: Мир, 1991. 234 с.

99. Кириллина O.A. Физическое картирование ДНК плазмиды pFra чумного микроба, клонирование области, ответственной за синтез капсульного антигена: автореф. дис. . канд. биол. наук / O.A. Кириллина Саратов, 1992. - 22 с.

100. Книрель Ю.А. В борьбе за контролем над чумой / Ю.А. Книрель, В .А. Фёдорова, А.П. Анисимов // Вестник РАН. 2011. - № 1. - С. 33-42.

101. Книрель Ю.А. Строение липополисахаридов грамотрицательных бактерий. 1. Общая характеристика липополисахаридов и структура липида А (Обзор) / Ю.А. Книрель, Н.К. Кочетков // Биохимия. 1993. - Т. 58, вып. 2.-С. 166-181.

102. Книрель Ю.А. Строение липополисахаридов грамотрицательных бактерий. II. Структура кора (Обзор) / Ю.А. Книрель, Н.К. Кочетков // Там же.-С. 182-201.

103. Книрель Ю.А. Строение липополисахаридов грамотрицательных бактерий. III. Структура О-специфических полисахаридов (Обзор) / Ю.А. Книрель, Н.К. Кочетков // Там же. 1994. - Т. 59, вып. 12. - С. 1784-1851.

104. Козлов Ю.А. Питательные среды в медицинской микробиологии / Ю.А. Козлов. Москва, 1950. 145 с.

105. Коннов Н.П. . / Н.П. Коннов // Проблемы особо опасных инфекций. Саратов, 2002. - № 1. - С. 90-95.

106. Коробкова Е.И. Живая противочумная вакцина / Е.И. Коробкова. М.: Медгиз, 1956. 156 с.

107. Коробов В.И. Получение очищенных препаратов V и W антигенов чумного микроба и их характеристика: автореф. дис. . канд. биол. наук /

108. B.И. Коробов. Ленинград, 1986. 20 с.

109. Коробова О.В. Изучение влияния условий культивирования на биосинтез V- и W- антигенов у штамма EV НИИЭГ чумного микроба // Проблемы специфической профилакт. чумы и холеры. Саратов, 1985.1. C. 10-14.

110. Коротяев А.И. Механизмы саморегуляции бактериальной клетки. М., 1973,272 с.

111. Кравченко Н.П. Изучение декарбоксилазной активности возбудителя чумы / Н.П. Кравченко, В.М. Степанов // Мат-лы 8 научн. конф. противочумн. учрежд. Средней Азии и Казахстана. Алма-Ата, 1974. С. 20-22.

112. Красикова М.А. О возможности снижения затрат сырья на изготовление питательной среды, применяемых для диагностики чумного микроба / М.А. Красикова // Мат-лы 8 научн. конф. противочумн. учрежд. Средней Азии и Казахстана. Алма-Ата, 1974. С. 449-451.

113. Красикова М.А., Мусина А.Г., Егорова Р.П. О снижении концентрации крови гемолизированной в питательной среде в 10 раз / М.А. Красикова, А.Г. Мусина, Р.П. Егорова // Информ., бюлл. изобрет. и рац. предложений. Алма-Ата, 1978. №2. С. 11.

114. Красикова М.А., Рогачева A.A. О свойствах гидролизата из микробной массы вакцинного штамма ЕВ / М.А. Красикова, A.A. Рогачева // Проблемы особо опасных инфекций. Саратов, 1974. - Вып. 1 (35).-С. 33-35.

115. Криг Н. Твердая культура / Н. Криг, Ф. Герхард // Методы общей бактериологии. М.: Мир, 1983. - Т.1. - С. 356-373.

116. Кузьмиченко И.А. Аэробное окисление глюкозы генетически родственными субкультурами чумного микроба, отличающимися зависимостью от кальция / И.А. Кузьмиченко // Микробиология и иммунология ООИ. Саратов, 1968. С. 197-201.

117. Кузьмиченко И.А. Фосфолипазная активность чумного микроба / И.А. Кузьмиченко, Ф.К. Дроздовская // Проблемы ООИ. Саратов, 1977. -Вып. 6(58).-С. 21-24.

118. Кузьмиченко И.А. Электрофоретический анализ растворимых дегидрогеназ чумного и псевдотуберкулезного микробов / И.А. Кузьмиченко, A.B. Наумов // Биотехнология, иммунология и биохимия особо опасных инфекций. Саратов, 1989. С. 14-16.

119. Куимова Т.Ф Влияние условий культивирования и фаз роста на морфологию и ультраструктуру различных микроорганизмов при ферментациях / Куимова Т.Ф // Итоги науки и техники. ВИНИТИ, микробиология. 1984. Т. 13. С. 3-99.

120. Кутырев B.B. Генетический анализ факторов вирулентности возбудителя чумы: автореф. дис. . докт. мед. наук / В.В. Кутырев. -Саратов, 1992. С. 36.

121. Кутырев В.В. Современное состояние научных исследований в области вакцинопрофилактики особо опасных бактериальных инфекций / В.В. Кутырев, З.Л. Девдариани, Л.В. Саяпина // Проблемы особо опасных инфекций. Саратов, 2006. - В. 2. - С. 18-24.

122. Кэтти Д. Антитела. Методы / Под. ред. Д. Кэтти. Т. 1-2. М.: Мир, 1991.

123. Лебединский В.А. Ингаляционный аэрогенный метод вакцинации / В.А. Лебединский. М., 1971. С. 79-86.

124. Леви М.И. Модифицированная агаровая среда Хигучи и Смита для изучения клеточного состава чумного микроба / М.И. Левй, Н.Ф. Касаткин // Микробиология и иммунология ООИ. Саратов, 1964. С. 44-50.

125. Ленская Г.Н. О живой противочумной вакцине / Г.Н. Ленская // Живые вакцины. М., 1956. Т. 2. - С. 53-55.

126. Липатова Е.С. Влияние усиленной аэрации с pH на рост чумного микроба / Липатова Е.С. // Материалы 5 научн. конф. противочумных учреждений Средней Азии и Казахстана. Алма-Ата, 1967. - С. 223-224.

127. Лобанов В.Н. Патологическая анатомия и патогенез чумы у человека / В.Н. Лобанов. М.: Медгиз, 1956. - С. 254.

128. Логинов A.B. Физиология с основами анатомии человека / A.B. Логинов. Москва, 1983. С. 156.

129. Лясоцкий Л.Л. Использование среды 199 в качестве стимулятора роста чумного микроба / Л.Л. Лясоцкий // Инф. бюл. изобретений и рац. предложений. Иркутск, 1982. № 12. С. 5.

130. Малинина З.Е. Изучение роста чумного микроба на средах Хигучи-Смита / З.Е. Малинина // ПООИ. Саратов, 1969. Вып. 5, с. 38-43.

131. Мартиневский И.Л. Об изменчивости и некоторых свойствах различных линий вакцинного штамма ЕВ / И.Л. Мартиневский // ПООИ. -Саратов, 1977. Вып. 3, с. 65-66.

132. Медуницын Н.В. . / Н.В. Медуницын, В.И. Покровский. М.: ГЕОТАР-Медиа, 2005. - 528 с.

133. Медуницын Н.В. Вакцинология / Н.В. Медуницын. М.: Триада-Х, 2004.-236 с.

134. Мельникова В.А. Синтез важнейших макромолекулярных соединений в различных условиях культивирования микроорганизмов / В.А. Мельникова, И.А. Баскакьян // Журнал микробиологии. 1973. №4. -С. 98-104.

135. Меньшов П.И. Влияние солей металлов на выход Ф1 чумного микроба / П.И. Меньшов // М-лы 6 научн. конф. противочумн. учрежд. Средней Азии и Казахстана. Алма-Ата, 1969. - Вып. 1. - С. 61-63.

136. Месробяну J1. Физиология бактерий / J1. Месробяну, Э. Пэунеску. -Бухарест, Меридиане, 1963. 807 с.

137. Милютин В.Н. Новая питательная среда из углеводородных дрожжей для выращивания патогенных микробов / В.Н. Милютин и др. // Проблемы особо опасных инфекций. Саратов, 1975. - Вып. 6 (46). - С. 30-34.

138. Михалева В.Я. Зависимость жизнеспособности микроба в противочумной вакцине от возраста посевной аэрированной культуры / В.Я. Михалева, Н.И. Колесинская, P.M. Нечетская // Докл. Иркутского противочумного ин-та. 1963. Вып. 5. - С. 36-40.

139. Мишанькин М.Б. Структурно-функциональная характеристика «мышиного» токсина чумного микроба: автореф. дис. . канд. мед. наук / М.Б. Мишанькин. Ростов-на-Дону, 1997. - 20 с.

140. Муравьева H.K. Влияние питательной среды и условий культивирования вакцинного штамма на качество чумной живой сухой вакцины EV: автореф. дисс. . канд. мед. наук / Н.К. Муравьева. -Саратов, 1969. 21 с.

141. Муравьева Н.К. Филиппов А.Ф., Павлова Л.П. Изучение условий возникновения ахромогенного варианта штамма ЕВ / Н.К. Муравьева, А.Ф. Филиппов, Л.П. Павлова// ЖМЭИ. 1969. - № 6. - С. 121-125.

142. Наумов A.B. Метаболические аспекты вирулентности чумного микроба / A.B. Наумов, Ю.И. Кондрашин // Иммунология и иммунопрофилактика чумы и холеры. Саратов, 1980. С. 3-6.

143. Наумов A.B. Руководство по профилактике чумы / A.B. Наумов, Л.В. Самойлова. Саратов, 1992. - С. 219-221.

144. Нечецкая P.M. Динамика размножения штамма ЕВ чумного микроба в жидкой среде в условиях аэрации / P.M. Нечецкая и др. // Докл. Иркутск, противочумн. ин-та. Иркутск, 1963. Вып. 5. С.45-47.

145. Николаев Н.И. Изучение условий культивирования вакцинного штамма ЕВ глубинным методом / Н.И. Николаев и др. // Микробиология и иммунология ООИ. Саратов, 1974. № 3. С. 70-75.

146. Николаев Н.И. Изучение условий культивирования вакцинного штамма ЕВ глубинным методом / Н.И. Николаев и др. // Микробиология и иммунология особо опасных инфекций: сб. науч. работ противочумных учреждений страны. Саратов, 1964. - С. 260-266.

147. Николаев Н.И. Опыт применения бульона в производстве сухой живой чумной вакцины / Н.И. Николаев и др. // Проблемы особо опасных инфекций. Саратов, 1969. - Вып. 1. - С. 175-181.

148. Николаев Н.И. Пути изыскания эффективной противочумной вакцины / Н.И. Николаев // Профилактика особо опасных болезней. -Ростов-на-Дону, 1963. С. 44-45.

149. Николаев Н.И. Руководство по профилактике чумы / Н.И. Николаев. -Саратов, 1972. С. 123.

150. Новикова О.Д. Антигенные свойства поринов наружной мембраны рода иерсиний / О.Д. Новикова и др. // БЭМБ 1996. - № 6. - С. 657660.

151. Новые методы иммуноанализа / Под ред. Коллинза У.П. М.: Мир, 1991.271 с.

152. Оленичева J1.C. Пути метаболизма аминокислот у возбудителей чумы и псевдотуберкулеза и некоторые вопросы их регуляции: автореф. дисс. . докт. биол. наук / JI.C. Оленичева.- Саратов, 1974. 34 с.

153. Орлов Г.С. Дальнейшее совершенствование глубинного культивирования при 37°С возбудителя чумы / Г.С. Орлов // Мед. журнал Узбекистана, 1982. № 3. С. 51-53.

154. Палагин А.Ю. Фибринолизин чумного микроба: биохимические и иммунохимические аспекты: автореф. дис. . канд. биол. наук / А.Ю. Палагин. Саратов, 1993. - 20 с.

155. Перестройки оперона капсулопродукции, приводящие к Fra-фенотипу / Бобров А.Г. и др. // Матер, научн.-практич. конф., посвящ. 100-летию образования противочумной службы России (16-18 сент. 1997.). Саратов, 1997. - Т. 2. - С. 15.

156. Перт С. Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток / С. Дж. Перт. М., 1978.-331 с.

157. Петров Р.В. Иммунология / Р.В. Петров М.: Медицина, 1982.

158. Петрова A.B. Молекулярное моделирование внутрифаголизосомальной среды макрофагов млекопитающих для изучения антигенов, синтезируемых патогенными иерсиниями: автореф. дис. . канд. мед. наук / A.B. Петрова. Саратов, 2006. - 20 с.

159. Печникова И.В. Изучение клеточного состава микробной популяции вакцинного штамма ЕВ / И.В. Печникова, Н.М. Харькова // Иммунология и иммунопрофилактика чумы и холеры. Саратов, 1980. С. 18-20.

160. Покровская М.П. Цитологический метод изучения механизма иммунитета / М.П. Покровская, JI.C. Каганова. Медгиз. Свердловск, 1947. С. 134.

161. Пол У. Иммунология: В 3-х т. Т. 1-3. / У. Пол. М.: Мир, 1987-1989. 548 с.

162. Пономарев Н.Г. Использование среды Хигучи-Смита для улучшения иммуногенных свойств чумных вакцинных штаммов / Н.Г. Пономарев // ЖМЭИ. 1965. № 10. - С. 43-47.

163. Пономарев Н.Г. Отбор иммуногенных субкультур из популяции вакцинного штамма ЕВ НИИЭГ / Н.Г. Пономарев и др. // ПООИ. Саратов, 1972. Вып. 3. С. 133-137.

164. Практикум по микробиологии / Под ред. А.И. Нетрусова М., 2005. 265 с.

165. Промышленный регламент № 01897080-01-04 на производство «Вакцины чумной живой, лиофилизат для приготовления суспензии для инъекций, накожного скарификационного нанесения и ингаляций». Регистрационный номер ГИСК им. JI.A. Тарасевича № ПР 1542-04.

166. Прядкина М.Д. К вопросу об изменчивости вакцинного штамма EV возбудителя чумы / М.Д. Прядкина, М.Д. Журба, Г.Ф. Абрамова // Материалы межинститутской науч. конф., поев. пам. J1.A. Тарасевича. -М., 1965. С. 170-172.

167. Пустовалов В Л. Изучение антигенного состава чумного микроба методом диффузионной преципитации в агаре / B.JI. Пустовалов и др. // Особо опасные и природноочаговые инфекции. М.: Медгиз, 1962. - С. 140-149.

168. Работнова И. JI. Рост и развитие микробных культур / И.Л. Работнова, И.И. Иванова // Успехи микробиологии. М., 1974. Вып.7. С. 67-107.

169. Работнова И.Л. Об изучении физиологического состояния исследуемых микроорганизмов / И.Л. Работнова // Микробиология. 1959, 28, 4, с.482-487.

170. Работнова И.Л. Хемостатное культивирование и ингибирование роста микроорганизмов / И.Л. Работнова, И.Н. Позмогова. М.: Наука, 1979. С. 207.

171. Рахимов М.М. Роль ионов кальция в проявлении каталитической активности фосфолипазы D / М.М. Рахимов и др. // Биохимия. 1982. -Т. 47, вып. 10.-С. 1649-1662.

172. Регламент производства "Иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие чумные антикапсульные моноклональные сухие" № 11-86(90);

173. Ройт А. Иммунология / А. Ройт, Дж. Бростофф, Д. Мейл. М.: Мир, 2000. 1097 с.

174. Роль составных частей крови человека и различных видов животных в питании чумного микроба / Трифонова A.A. // Вопросы микробиологии и лабораторной диагностики ООИ. Саратов. 1965. С. 117-118.

175. Руднев Т.П. Антропозоонозы / Т.П. Руднев. М.: Медицина, 1970. -211 с.

176. Руднев Т.П. Клиника чумы / Г.П. Руднев. Медгиз. M.-JL, 1940. 140 с.

177. Рычков P.C. Биотехнология /P.C. Рычков, В.Г. Попов. М.: Наука, 1984. - С.13-20.

178. Салтыков P.A. О стабильности биологических признаков вакцинных штаммов P. pestis: автореф. дисс. . канд. мед. наук / P.A. Салтыков М., 1947. - 25 с.

179. Салтыкова P.A. Опыт 30-летнего изучения стабильности свойств чумного вакцинного штамма ЕВ в СССР / P.A. Салтыкова, М.М. Файбич // ЖМЭИ. 1975. - № 6. - С. 3-8.

180. Самойлова J1.B. Динамика развития иммунитета к чуме после прививки живой вакциной и особенности иммуногенеза при этой вакцинации: автореф. дисс. . канд. мед. наук / J1.B. Самойлова. -Саратов, 1963. 24 с.

181. Сердобинцев J1.H. Полиморфизм капсульного антигена чумного микроба: автореф. дисс. . канд. мед. наук / JI.H. Сердобинцев. Саратов, 1984.- 19 с.

182. Синичкина H.A. Фосфолипаза Д чумного микроба и ее действие на биологические мембраны восприимчивых к чуме животных: автореф. дис. . канд. мед. наук / H.A. Синичкина. Саратов, 1993. - 22 с.

183. Смирнов С.Г. Проблема биологического времени и некоторые физико-химические закономерности развития прокариотов / С.Г. Смирнов, К.К. Смирнов. -Пущино, 1984. 16 с.

184. Список использованных литературых источников

185. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования / Под ред. М.О. Биргера М.: Медицина, 1982. 280 с.

186. Степанов В.М. Изучение влияния различных источников углерода на рост возбудителя чумы / В.М. Степанов // М-лы 7 научн. конф. противочумн. учрежд. Средней Азии и Казахстана. Алма-Ата, 1971. С. 61-63.

187. Страчунский JI.C. Антибиотикорезистентность как угроза национальной безопасности / JI.C. Страчунский // Биотехнология: состояние и перспективы развития. Ч. 1. - М., 2005. - С. 25.

188. Супотницкий М.В. Очерки истории чумы / М.В. Супотницкий, Н.С. Супотницкая. Кн. 1; 2. М.: Вузовская книга, 2006. - 220 с.

189. Сучков Ю.Г. Изменчивость некоторых свойств вакцинного штамма ЕВ чумного микроба / Ю.Г. Сучков и др. // ПООИ, 1972. Вып. 4. С. 1116.

190. Тараненко Т.М. Иммунохимическая и иммунобиологическая характеристика «бифазных» культур штамма EV чумного микроба / Т.М. Тараненко и др. // Актуальные вопросы лабораторной диагностики и биохимии возбудителей чумы и холеры. Саратов, 1984. С. 47-53.

191. Тараненко Т.М. Углеводсодержащие антигены чумного и псевдотуберкулезного микробов. Теоретические и прикладные аспекты: автореф. дисс. . докт. биол. наук / Т.М. Тараненко. Саратов, 1988. - 34 с.

192. Терентьева Л.И. Вопросы питания возбудителя чумы в связи с культивированием на искусственных питательных средах: автореф. дисс. . канд. биол. наук / Л.И. Терентьева. Алма-Ата, 1971. - 46 с.

193. Тинкер А.И. Выживаемость микробов в производственных сериях чумной вакцины ЕВ, приготовленных на жидких и плотных питательных средах / А.И. Тинкер и др. // ПООИ. Саратов, 1971. Вып. 2. С. 67-71.

194. Тинкер А.И. Снижение оптической и биологической концентрации чумной вакцины ЕВ в процессе сублимационного высушивания / А.И. Тинкер, Г.Н. Дудукалова, А.Д. Некрасов // ПООИ. Саратов, 1973, Вып. 6. С. 78-83.

195. Тинкер А.И. Сравнительное изучение качества экспериментальных серий чумной живой сухой вакцины ЕВ, приготовленной на плотной и жидкой питательных средах / Тинкер А.И. и др. // ПООИ. 1973. Вып.1. С. 87-91.

196. Тинкер И.С. Экспериментальное изучение иммунологической эффективности некоторых фракций чумного микроба / И.С. Тинкер и др. // Профилакт. ООИ: тезисы докл. межинститутск. научн. конф. 20-22 ноябр. Ростов-на-Дону, 1963. - С. 10-12.

197. Титенко М.М. Исследование антигенов, специфичных для возбудителя чумы, с целью совершенствования методов диагностики: автореф. дисс. . канд. мед. наук / М.М. Титенко. Саратов, 1985. - 21 с.

198. Трифонова A.A. Изучение свойств чумного микроба в аэрированных бульонных культурах / A.A. Трифонова, И.И. Дертева // Труды ин-та «Микроб». 1958. Вып.2. С. 315-322.

199. Туманский В.М. Микробиология / В.М. Туманский // М.: Медгиз, 1958. 268 с.

200. Тынянова В.И. Токсин чумного микроба и его структурно-функциональная организация / В.И. Тынянова и др. // Мат-лы научно-практ. конф., поев. 100-летию противочумн. службы России. Саратов, 1997.-Т. 2. - С.138.

201. Тюлембаев М.А. Влияние аминокислот, витаминов, урацила и некоторых солей на синтез фракции I чумного микроба / М.А. Тюлембаев, Б.Б. Атчабаров, О.С. Соорбеков // Патологическая физиология, иммунология и аллергология ООИ. Саратов, 1984. - С. 27-30.

202. Уильяме В. Физическая химия для биологов / В. Уильяме, X. Уильяме. Мир, 1976. 600 с.

203. Учебно-методическое пособие по лабораторной диагностике и изучению биологических свойств чумного микроба и возбудителей некоторых других природноочаговых инфекций / Под ред. Лемешевой

204. Л.Б. Изд-во Иркутского государственного научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока, 1972.

205. Файбич М.М., Корнеев Р.В. // Сборник работ научно-исслед. ин-та эпидемиологии и гигиены. М., 1947, в.2, с.58.

206. Фаллер Д.М. Молекулярная биология клетки. Руководство для врачей. / Д.М. Фаллер, Д. Шилдс. Москва, Бином-Пресс, 2004. 304 с.

207. Федоров В.Н. Профилактика чумы / В.Н. Федоров, И.И. Рогозин, Б.К. Фенюк. М: Медгиз, 1955. - 103 с.

208. Федорова В.А. Иммунохимическая характеристика липополисахарида Vibrio cholerae 0139 сероварианта и диагностическая значимость полученных к нему антител / В.А. Федорова и др. // Биотехнология. 1996. - № 11. - С. 33-37.

209. Федорова В.А. Иммунохимическая характеристика фракции I штаммов Yersinia pestis, дефектных по гену caf 1М / В.А. Федорова, З.Л. Девдариани // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология.2002.-№ 1.-С. 12-17.

210. Федорова В.А. Использование моноклональных антител для серотипирования штаммов Yersinia pseudotuberculosis, изолированных на территории Саратовской области / В.А. Федорова и др. // Биотехнология. 2003. -№ 1. - С. 91-96.

211. Федорова В.А. Получение и научно-прикладное значение моноклональных антител к липополисахариду Yersinia pestis: автореф. дис. . канд. мед. наук / В.А. Федорова. Саратов, 1994. - 20 с.

212. Федорова В.А. Теоретико-экспериментальные аспекты изучения белковых и углеводсодержащих антигенов возбудителей чумы и холеры сиспользованием поли- и моноклональных антител: автореф. дис. . докт. мед. наук / В.А. Федорова. Саратов, 2004. - 34 с.

213. Федорова В.А. Характеристика фибринолизина чумного микроба с помощью моноклональных антител / В.А. Федорова, 3.J1. Девдариани // Молекул, генетика, микробиология и вирусол. 1999. - № 3. - С. 21-26.

214. Филиппов А.Ф. Изучение влияния степени расщепления белка питательной среды на свойства микробов в глубинных и агаровых культурах штамма ЕВ / А.Ф. Филиппов и др. // Проблемы особо опасных инфекций. Саратов, 1970. - Вып. 3. - С. 189-192.

215. Филиппов А.Ф. Культивирование чумного микроба и холерного вибриона на агаре в аппаратах АКМ-Ш / А.Ф. Филиппов и др. // ПООИ,- Саратов, 1970а. Вып. I (II). С. 158-163.

216. Филиппов А.Ф. Многофазные питательные среды и перспективы их применения для выращивания чумного микроба / А.Ф. Филиппов, В.Е. Жемчугов // Микробиология и биохимия возбудителей особо опасных инфекций. Саратов, 1982. С. 36-41.

217. Филиппов А.Ф. Электрометрический контроль pH в глубинной культуре вакцинного штамма чумного микроба / А.Ф. Филиппов, Г.А. Никитин // ПООИ. Саратов, 1974. - С. 70-75.

218. Филиппов А.Ф., Кондрашкова Т.В., Муравьева Н.К. и др. Выращивание культур чумного микроба на средах из аутолизатов рыбы / А.Ф. Филиппов и др. // Проблемы особо опасных инфекций. Саратов, 1973.-Вып. 6.-С. 74-77.

219. Фомичева O.A. Разработка иммуноферментного анализа для лабораторной диагностики псевдотуберкулеза: автореф. дис. . канд. биол. наук / O.A. Фомичева. Саратов, 1996. - 20 с.

220. Фримель Г. Иммунологические методы / Г. Фримель. М.: Медицина, 1987.-280 с.

221. Фунтикова Т.Н. Оценка продуктивности некоторых питательных сред для получения производственных объемов биомассы штамма ЕВ при 28 °С и 37 °С / Фунтикова Т.Н. и др. // Особо опасные инфекции на

222. Кавказе: тез. докл. 5 краев, науч.-практ. конф. 17-19 сент. Ставрополь, 1985.-С. 272-275.

223. Фунтикова Т.Н. Сравнительное изучение чумной живой сухой вакцины ЕВ, приготовленной из агаровых и бульонных культур: автореф. дис. . канд. биол. наук / Т.Н. Фунтикова. Саратов, 1977. - 16 с.

224. Харькова Н.М. Влияние ионов железа на рост и некоторые биологические свойства вакцинного штамма ЕВ чумного микроба: автореф. дисс. . канд. биол. наук / Н.М. Харькова. Ставрополь, 1973. -20 с.

225. Цецхладзе Н.С. Активная и пассивная иммунизация и ее сочетанное применение с антибактериальными препаратами при экспериментальной чуме: автореф. дисс. . канд. биол. наук / Н.С. Цецхладзе. Ростов-на-Дону, 1998.-20 с.

226. Чалисов И.А. . / Груденков A.C. // Сборник работ научно-исслед. ин-та эпидемиологии и гигиены. М., 1947, в.2, с.92.

227. Чекомасова A.B. Пассажи через организм животных как метод стабилизации свойств вакцинных штаммов чумного микроба: автореф. дисс. . канд. биол. наук / A.B. Чекомасова. Ростов-на-Дону, 1973. - 20 с.

228. Черепанов П.А. Клонирование и детальное картирование FRA-YMT-области и плазмиды pFra Yersinia pestis / П.А. Черепанов и др. // Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. 1991. - № 12. - С. 19-25.

229. Чернова Э.А. Актуальные вопросы эпидемиологии, профилактики и диагностики особо опасных инфекций. 4.1. - Ставрополь, 1969. - С. 120-126.

230. Чернова Э.А. Изучение неоднородности клеточного состава различных вариантов штамма ЕВ по отношению к глицерину и рамнозе / Э.А. Чернова, В.Ф. Иванова, В.Д. Майская // ПООИ. 1975, вып.1, с. 128129.

231. Чернова Э.А. Свойства различных субкультур штамма ЕВ / Э.А. Чернова, В.Ф. Иванова, В.Д. Майская // ПООИ. 1974. № 2, с. 132-137.

232. Черномордик Л.В. Биомедицинские приложения электрического пробоя клеточных мембран / Л.В. Черномордик // Успехи современной биологии. 1985. Т. 99, с. 67-82.

233. Шанина Л.Н. Иммуногенные свойства атоксичных и лишенных капсульного антигена бактерий чумы в зависимости от их отношения при 37 °С к ионам Са и характеристика роста на среде с гемином / Л.Н. Шанина // ПООИ. 1968. Вып. 2. С. 91-95.

234. Шапошникова В.Н. Основные физико-химические закономерности обмена веществ микроорганизмов. М.: Наука, 1968. - 123 с.

235. Шеремет О.В. Иммуногенность чумного микроба, выращенного на некоторых питательных средах при 28 °С и 37 °С / О.В. Шеремет и др. // ЖМЭИ. 1987. - С. 63-68.

236. Шеремет О.В. Характер роста чумного микроба на плотной дрожжевой питательной среде / О.В. Шеремет // Проблемы особо опасных инфекций. Саратов, 1978. - Вып. 4 (62). - С. 28-31.

237. Шлегель Г. Общая микробиология / Г. Шлегель. М.: Мир, 1972.476 с.

238. Шунаев В.В. О методе глубинного выращивания вакцинных штаммов чумного микроба 1 и 17 / В.В. Шунаев, М.А. Красикова, Е.С. Валяева // Труды среднеаз. противочумн. ин-та. 1959. Т. 6. С. 107-113.

239. Эссель А.Е. К характеристике цитопатических свойств кишечной палочки в зависимости от фазы развития популяции / А.Е. Эссель, Ю.П. Царевский // ЖМЭИ. 1972. № 6. С. 40-43.

240. Яромюк Г.А. Фибринолитические свойства чумного микроба и природа его фибринолитической субстанции: автореф. дисс. . канд. мед. наук / Г.А. Яромюк. Иркутск, 1964. - 20 с.

241. A comparison of plague vaccine, USP and EV76 vaccine induced protection against Yersinia pestis in a murine model / P. Russell et. al. // Vaccine.- 1995.-Vol. 13.-P. 1551 1558.

242. A new gene of the fl operon of Y.pestis involved in the capsule biogenesis / A.V. Karlishev et. al. // FEBS Letters. 1992. - Vol. 297. - P. 77 -80.

243. A Yersinia pestis lpxM-mutant live vaccine induces enhanced immunity against bubonic plague in mice and guinea pigs / V.A. Feodorova et. al. // Vaccine. 2007. - Vol. 25, N 44. - P. 7620 - 7628.

244. Acker G. Localization of enterobacterial common antigen in Yersinia enterocolitica by the immunoferritin technique / G. Acker, W. Knapp, К. Wartenberg, H. Mayer // J. Bacteriol. 1981. - Vol. 147(2). - P. 602 - 611.

245. Active immunization with recombinant V antigen from Yersinia pestis protects mice against plague / Leary S.E.C. et. al. // Infect. Immun. 1995. -Vol. 63.-P. 2854-2858.

246. Anisimov A.P. Intraspecies and temperature-dependent variations in susceptibility of Yersinia pestis to the bactericidal action of serum and to polymyxin В / A.P. Anisimov et. al. // Infect. Immun. 2005. - Vol. 73, N 11.-P. 7324-31.

247. Antigenic structure of P. pestis and the isolation of a crystalline antigen / E.E. Bacer // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1947. - Vol. 64, N8.-P. 139-141.

248. Bengoechea, J.A. Regulation of O-antigen biosynthesis in Yersinia enterocolitica / J.A. Bengoechea // In Proceedings of the 8th International Symposium on Yersinia. 2002. - P. - 29.

249. Bennet L.G. Characterization of the Antigenic subunits of the Envelope Protein of Yersinia pestis / L.G. Bennet, T.G. Tornabene // J. Bacteriol. 1974. -Vol. 117, N 1.-P. 48-54.

250. Boivin A. Technique pour la preparation des polyosides microbiens spécifiques / A. Boivin, J. Mesrobeanu, L. Mesrobeanu // Comp. Rend. Soc. Biol. 1933. - Vol. 113. - P. 490 - 492.

251. Bolin I. Expression of the temperature-inducible outer membrane proteins of yersinia /1. Bolin, D.A. Portnoy, H. Wolf-Watz // Infect. Immun. -1985. Vol. 48. - P. 234 - 240.

252. Boyce R. Metabolism of P. pestis: I. Metabolism of and incorporation into cells of some sugars and other carbon sources by growing cultures under shahen conditions / R. Boyce, A. Inamdar, K. Canapathi // Indian. J. Biochem. -1964.-Vol. l.P. 26.

253. Brownlow WJ. Nutrition of P. pestis in chemi cally defined media at temperatures of 36°C / W.J. Brownlow, G.E. Wessman // J. Bacteriol. 1960. -Vol. 79, 2.-P. 299-304.

254. Brubaker R. Yersinia pestis / R. Brubaker // 2000, MI 48824-1101. -USA.

255. Brubaker R.R. Expression of virulence in Yersinia / R.R. Brubaker // In. Microbiology. 1979. - P. 168 - 171.

256. Brubaker R.R. Factors promoting acute and chronic diseases caused by Yersinia / R.R. Brubaker // Clin. Microbiol. Rev. 1991. - Vol. 4. - P. 309 -324.

257. Brubaker R.R. Influence of Na+, dicarboxylic amino acids, and pH in modulating the low-calcium response of Yersinia pestis / R.R. Brubaker // Infect. Immun. 2005. - Vol. 73. - P. 4743 - 4752.

258. Brubaker R.R. Mutation rate to nonpigmentation in Pasteurella pestis / R.R. Brubaker // J. Bacteriol. 1969. - Vol. 98. - P. 1404 - 1406.

259. Brubaker R.R. Pasterella pestis: Role of pestiein I and Ipon in Experimental Plague / R.R. Brubaker, E.D. Beesley, M.J. Surgalla // Science. -1965. Vol. 149. - P. 422 - 424.

260. Brubaker R.R. Pasteurella pestis: Role of pestiein I and Ipon in Experimental Plague / R.R. Brubaker, E.D. Beesley, M.J. Surgalla // Science. -1965.-Vol. 149.-P. 422-424.

261. Brubaker R.R. Proteolysis of V antigen from Yersinia pestis / R.R. Brubaker, A.K. Sample, D.Z. Yu // Microb. Pathogen. 1987. - Vol. 2. - P. 49 -62.

262. Brubaker R.R. The effect of Ca2+ and Mg2+ on lysis, growth and production of virulence antigen Pasteurella pestis / R.R. Brubaker, M.J. Surgalla // J. Infect. Dis. 1964. - Vol. 144. - P. 13 - 25.

263. Brubaker R.R. The genus Yersinia: biochemistry and genetics of virulence / R.R. Brubaker // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1972. - Vol. 57. -P. Ill - 158.

264. Brubaker R.R. The V antigen of yersiniae: an overview / R.R. Brubaker // Contrib. Microbiol. Immunol. 1991. - Vol. 12. - P. 127 - 133.

265. Burrows T.W. An antigen determining virulence in Pasteurella pestis / T.W. Burrows//Nature. 1956.-Vol. 177. - P. 426 - 427.

266. Burrows T.W. Genetics of virulence in bacteria (P. pestis) / T.W. Burrows // Brit. Med. Bui. 1962. - Vol. 18. - P. 69 - 73.

267. Burrows T.W. The basis of virulence in Pasteurella pestis: an antigen determining virulence / T.W. Burrows, G.A. Bacon /'/' Brit. J. Exp. Pathol. -1956.-Vol. 37.-P. 481 -493.

268. Burrows T.W. The basis of virulence in Pasteurella pestis: the development of resistance to phagocytosis in vitro / T.W. Burrows, G.A. Bacon //Br. J. Exp. Pathol. 1956. - Vol. 37. - P. 286 - 299.

269. Burrows T.W. Virulence of Pasteurella pestis and immunity to plague / T.W. Burrows // Ergeb. Microbiol. Immun. Exp. Ther. 1963. - Vol. 37. - P. 59 - 113.

270. Butler T. Plague and other Yersinia infections / T. Butler // Plenum. Med. Book. Comp. 1983. - P. 137.

271. Characterization of a mouse model of plague after aerosolization of Yersinia pestis C092 / S.L. Agar et. al. // Microbiology. 2008. - Vol. 154 (Pt 7). - P. 1939- 1948.

272. Characterization of native and modified Yersinia pestis pH6 antigen / T.A. Gremyakova et. al. // Nederlands Tijdshrift voor Medische Microbiological. 1998. - Vol. 6. -P. 19.

273. Chu A.J. Extracellular Ca(2+) suppresses endotoxin-inducible tissue factor activation in monocytic THP-1 cells / A.J. Chu, M.J. Fox, J.K. Prasad // Cell Biochem. Funct. 2000. - Vol. 18, N 1. - P. 67 - 73.

274. D27-pLpxL, an avirulent strain of Yersinia pestis, primes T cells that protect against pneumonic plague / F.M. Szaba et. al. // Infect Immun. 2009. - Vol. 77, N 10. - P. 4295 - 4304.

275. Dentovskaya S.V. Functional characterization and biological significance of Yersinia pestis lipopolysaccharide biosynthesis genes / S.V. Dentovskaya et. al. // Biochemistry (Mose). 2011. - Vol. 76, N.7. - P. 80822.

276. DNA sequencing and analysis of the low-Ca -response plasmid pCDl of Yersinia pestis KIM5 / R.D. Perry et. al. // Infect. Immun. 1998. - Vol. 66.-P. 4611 -4623.

277. Easterbrook T.J. Studies on the immunogenicity of the Pia protein from Yersinia pestis / T.J. Easterbrook, K. Reddin, A. Robinson, N. Modi // Contrib. Microbiol. Immunol. 1995. Vol. 13. - P. 214 -215.

278. Effect of deletion of the lpxM gene on virulence and vaccine potential of Yersinia pestis in mice / A.P. Anisimov et. al. // J. Med. Microbiol. 2007. -Vol. 56(Pt 4).-P. 443 -453.

279. Effective plague vaccination via oral delivery of plant cells expressing FI-V antigens in chloroplasts / P.A. Arien et. al. // Infect. Immun. 2008. -Vol. 76(8).-P. 3640-3650.

280. Efremenko V.l. Molecular organization and functions of the protein toxins of the causative agents of cholera and plague / V.l. Efremenko // Zh. Mikrobiol. Epidemiol. Immunobiol. 1983. - Vol. 11. - P. 7 - 13.

281. Environmental conditions the populations dynamics and the refention of virulence of P. pestis. The role of carbon dioxide / E.A. Delwiche et. al. // J. Bacteriol. 1959. - Vol. 77, N 3. - P. 355 - 360.

282. Expression, characterization, and mutagenesis of the Yersinia pestis murine toxin, a phospholipase D superfamily member / A.E. Rudolph et. al. // J. Biol. Chem.- 1999.-Vol. 274, 17. P. 11824 - 11831.

283. Factors influencing the goss of virulence in P. pestis / J.E. Ogg et. al. // J. Bacteriol. 1958. - Vol. 76. - P. 185 - 191.

284. Fallman M. Cellular mechanism of bacterial internalization counteracted by Yersinia / M. Fallman, A. Gustavsson // Int. Rev. Cytol. 2005. - Vol. 246. -P. 135 - 188.

285. Fathman C.G. (1984). Long-term cultures of immunocompetent cells / C.G. Fathman, F.W. Fitch // In Fundamental Immunology. 1984. - Vol. 3. P. 296-319.

286. Feodorova V. A. New genes involved in Yersinia pestis Fraction I biosynthesis / V.A. Feodorova, Z.L. Devdariani // J. Med. Microbiol. 2001. Vol. 50.-P. 969-978.

287. Feodorova V.A. Adjuvant effect of anti-idiotypic antibodies to Yersinia pestis lipopolysaccharide / V.A. Feodorova, Z.L. Devdariani, L.S. Nazarova // J. Med. Microbiol. 1999. - Vol. 48, N 8. - 751 - 756.

288. Feodorova V.A. Development, characterisation and diagnostic application of monoclonal antibodies against Yersinia pestis fibrinolysin and coagulase / V.A. Feodorova, Z.L. Devdariani // J. Med. Microbiol. 2000. -Vol. 49, N3,-P. 261 -269.

289. Feodorova V.A. Expression of acid-stable proteins and modified lipopolysaccharide of Yersinia pestis in acidic growth medium / V.A. Feodorova, Z.L. Devdariani // J. Med. Microbiol. 2001. - Vol. 50. - P. 979 -985.

290. Feodorova V.A. Immunogeneity and structural organization of some pLCR-encoded proteins of Yersinia pestis / V.A. Feodorova, Z.L. Devdariani // J. Med. Microbiol. 2001. - Vol. 50. - P. 13 - 22.

291. Feodorova V.A. New genes involved in Yersinia pestis fraction I biosynthesis / V.A. Feodorova, Z.L. Devdariani // J. Med. Microbiol. 2001. -Vol. 50.-P. 969-978.

292. Feodorova V.A. Prospects for new plague vaccines / V.A. Feodorova, M.J. Corbel // Exp. Rev. Vaccine. 2009. - Vol. 8. - P. 1721 - 1738.

293. Feodorova V.A. The interaction of Yersinia pestis with erythrocytes / V.A. Feodorova, Z.L. Devdariani // J. Med. Microbiol. 2002. - Vol. 51. - P. 150 - 158.

294. Glycosphingoiipid-bloting: an immunolojical detection procedure after separation by thin layer chromatography (JIM 03169 )/ H. Towbin et. al. // J. Immunol. Meth. 1984. - Vol. 72. - P. 471 - 479.

295. Higuchi K. Studies on the nutrition and physiology of Pasteurella pestis / K. Higuchi, L.L. Kupferberg, J.L. Smith // J. Bacteriol. 1959. - Vol. 77. - P. 317-321.

296. Higuchi K. Studies on the nutrition and physiology of Pasteurella pestis. IV. A differential plating medium for the estimation of the mutation rate toavirulence / K. Higuchi, J.L. Smith // J. Bacteriol. 1961. - Vol. 81. - P. 605 -608.

297. Huang X.Z. The pH 6 antigen is an antiplahocytic factor produced by Yersinia pestis independent of Yersinia outer proteins and capsule antigen / X.Z. Huang, L.E. Lindler // Infect. Immun. 2004. - Vol. 72. - P. 7212 -7219.

298. Human antilipid A monoclonal antibodies bind to human B cells and the I antigen on cord red blood cells / N.M. Bhat et. al. // J. Immunol. 1993. -Vol. 151, N 9. - P. 5011-5021.

299. Identification of Yersinia pestis with varied plasmid composition using monoclonal and polyclonal fluorescent immunoglobulins / Z.L. Devdariani et. al. // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1993. - Vol. 6, N 6. - P. 31 - 36.

300. Identification of Yersinia pestis with varied plasmid composition using monoclonal and polyclonal fluorescent immunoglobulins / Z.L. Devdariani et. al. // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1993. - Vol 6. - P. 31 - 36.

301. Immune response to Yersinia outer proteins and other Yersinia pestis antigens after experimental plague infection in mice / G.E. Benner et. al. // Infect. Immun. 1999. - Vol. 67(4). - P. 1922 - 1928.

302. Immunobiological activity of the Yops encoded by pCad of Yersinia pestis / A.N. Mikerov et. al. // In Problems of Particularly Dangerous Diseases. 1998.-P. 137-141.

303. Janeway C.A. Immunobiology. The immune system in health and disease / C.A. Janeway, P. Travers // Current. Biol. Ltd. 1997.

304. Kabir S. (1989). Antigenic analysis of Vibrio cholerae Ol by crossed Immunoelectrophoresis / S. Kabir // Zentralbl. Bakteriol. Mikrobiol. 1989. -Vol. 270.-P. 361 -372.

305. Kadis S. The murine toxin of Pasteurella pestis: a study in its development / S. Kadis, T.S. Montie, S.L. Ajl. // Bacteriol. Rev. 1966. - Vol. 30,N l.-P. 177- 191.

306. Kolle N. Die active Immunisierung gegen Pest mittels abgeschwächter Kulturem / N. Kolle, R. Otto // Deutsch. Med. Woch. 1903. - Vol. 28. - P. 493 - 494.

307. Kiljunen S. Identification of the lipopolysaccharide core of Yersinia pestis and Yersinia pseudotuberculosis as the receptor for bacteriophage cpAl 122 / S. Kiljunen et. al. // J. Bacteriol. 2011. - Vol. 193, N 18. - P. 4963-72.

308. Knirel Y.A. Relationship of the lipopolysaccharide structure of Yersinia pestis to resistance to antimicrobial factors / Y.A. Knirel et. al. // Adv Exp Med Biol. 2007. - Vol. 603. - P. 88-96.

309. Knirel Y.A. Structural features and structural variability of the lipopolysaccharide of Yersinia pestis, the cause of plague / Y.A. Knirel et. al. // J. Endotoxin Res. 2006. Vol. 12, N 1. - P. 3-9.

310. Kupferberg L.L. Role of calcium ions in the stimulation of growth of virulent strains of Past, pestis / L.L. Kupferberg, K. Higuchi // J. Bact. 1958. -Vol. 76,N l.-P. 120-121.

311. Laemmli U.K. Cleavage of Structural Proteins during the assembly of the Head of Bacteriophage T 4 / U.K. Laemmli // Nature. 1970. - Vol. 227. -P. 680-685.

312. Lawton W.D. Biosynthesis and purification of V- and W-antigens in Pasteurella pestis / W.D. Lawton, R.L. Erdman, M.J. Surgalla // J. Immunol. -1963.-Vol. 91.-P. 179 184.

313. Leung K.Y. Yop M inhibits platelet aggregation and is nessesary for virulence of Yersinia pestis in mice / K.Y. Leung, B.S. Reisner, S.C. Straley // Infect. Immun. 1990. - Vol. 58. - P. 3262 - 3271.

314. Lindler L.E. Yersinia pestis pH6 antigen forms fimbriae and is induced by intracellular association with macrophages / L.E. Lindler, B.D. Tall // Mol. Microbiol. 1993.-Vol. 8.-P. 311 -324.

315. Lipid A acylation and bacterial resistance against vertebrate antimicrobial peptides Cell / L. Guo // 1998. Vol. 95. - P. 189 - 198.

316. Madison R.R. Fibrinolytic specificity of Basilius pestis / R.R. Madison // Proc. Soc. Exptl. Biol. Med. 1936. - Vol. 34. - P. 301 - 302.

317. Mazza G. Immune response to plasmid- and chromosome-encoded Yersinia antigens / G. Mazza, A.E. Karu, D.T. Kingsbury // Infect. Immun. -1985.-Vol. 48.-P. 676-685.

318. McDonough K.A. Yersinia pestis specific DNA fragment encodes temperature-dependent coagulase and fibrinolysin-associated phenotypes / K.A. McDonough, S.A. Falcow // Mol. Microbiol. - 1989. - Vol. 3. - P. 767 -775.

319. Mehigh R.J. Major stable peptides of Yersinia pestis synthesized during the low-calcium response / R.J. Mehigh, R.R. Brubaker // Infect. Immun. -1993.-Vol. 61.-P. 13-22.

320. Modification of the structure and activity of lipid A in Yersinia pestis lipopolysaccharide by growth temperature / K. Kawahara // Infect. Immun. -2002. Vol. 70, N 8. - P. 4092 - 4098.

321. Modulation of the protective properties of plague vaccine preparations by monophosphoryl Upid A / T.A. Gremyakova et. al. // Nederlands Tijdshrift voor Medische Microbiological. 1998. Vol. 6. - P. 35.

322. Molecular basis of themagnesium deprivation response in Salmonella typhimurium: identification of PhoP-regulated genes / F.C. Soncini et. al. // J. Bacteriol. 1996. - Vol. 178. - P. 5092 - 5099.

323. Molecular modeling of the steric structure of the envelope Fl antigen of Yersinia pestis / V. Zav'yalov et. al. // Immunol. Lett. 1995. - Vol. 45. - P. 19-22.

324. Montie T.C. Properties and pharmacological action of plague murine toxin / T.C. Montie // Pharmacol. Ther. 1981. - Vol. 12. - P. 491 - 499.

325. Mortlock R. Glucose-6-phosphate dehydrogenase and 6-phosphogluconate dehydrogenase activities of Pasteurella pestis and P.pseudotuberculosis / R. Mortlock, R. Brubaker // J. Bact. 1962. - Vol. 84. P. 1122- 1123.

326. Motin V.L. V antigen-polyhistidine fusion peptide: binding to LcrH and active immunity against plague / V.L. Motin, Y.A. Nedialkov, R.R. Brubaker // Infect. Immun. 1996. - Vol. 64. - P. 4313 - 4318.

327. Murine toxin of Yersinia pestis shows phospholipase D activity but is not required for virulence in mice / J. Hinnebusch et. al. // Int. J. Med. Microbiol. 2000. - Vol. 290, N 4-5. - P. 483 - 487.

328. Nakajima R. Suppression of cytokines in mice by protein A-V antigen fusion peptide and restoration of synthesis by active immunization / R. Nakajima, V.L. Motin, R.R. Brubaker // Infect. Immun. 1995. - Vol. 63. - P. 3021 - 3029.

329. Ouchterlony O. Antigen-antibody reactions in gels. IV. Types of reactions in coordinated systems of diffusion / O. Ouchterlony // Acta Pathol, et Microbiol. Scand. 1953. - Vol. 32. - P. 231 - 240.

330. Passive immunity to yersinia mediated by anti-recombinant V antigen and protein A-V antigen fusion peptide / V.L. Motin et. al. // Infect. Immun. 1994. - Vol. 62. - P. 4192 - 4201.

331. Plague immunization. I. Past and present trends / K.F. Meyer et. al. // J. Infect. 1974. - Vol. 129. - P. 13 - 18.

332. Plague in Kazakhstan at the present time / A. Aikimbajev et. al. // Przegl. Epidemiol. 2003. Vol. 57(4). - P. 593 - 598.

333. Plantderived recombinant FI, V of the innate and adaptive immune system / G. Del. Prete et. al. // Int. J. Immunopathtol. Pharmacol. 2009. -Vol. 22.-P. 133 - 143.

334. Plant-made subunit vaccine against pneumonic and bubonic plague is orally immunogenic in mice / M.L. Alvarez et. al. // Vaccine. 2006. Vol. 24. - P. 2477 - 2490.

335. Pleiotropic effects of the lpxM mutation in Yersinia pestis resulting in modification of the biosynthesis of major immunoreactive antigens / V.A. Feodorova et. al. // Vaccine. 2009. - Vol. 27, N 16. - P. 2240 - 2250.

336. Possible plasmid-mediated tissue invasiveness in Yersinia enterocolitica / D.L. Zink et. al. // Nature. 1980. - Vol. 283 - P. 224 - 225.

337. Prior J.L. Monoclonal antibodies against Yersinia pestis lipopolysaccharide detect bacteria cultured at 28°C or 37°C / J.L. Prior, R.W. Titball // Molecul. Cell. Probes. 2002. - Vol. 16, N 1. - P. 251 - 256.

338. Protective efficacy of recombinant Yersinia outer proteins against bubonic plague caused by encapsulated and nonencapsulated Yersinia pestis / G.P.Andrews et. al. // Infect. Immun. 1999. - Vol. 67. - P. 1533 - 1537.

339. Proteomic characterization of Yersinia pestis virulence / B.A. Chromy et. al. // J. Bacteriol. 2005. - Vol. 187, N 23. - P. 8172 - 8180.

340. Purification and protective efficacy of monomeric and modified Yersinia pestis capsular Fl-V antigen fusion proteins for vaccination against plague / J.L. Goodin et. al. // Protein Expr. Purif. 2007. - Vol. 53, N 1. - P. 63 - 79.

341. Raetz C. R. H., Whietfield C. Lipopolysaccharide endotoxins / C.R.H. Raetz, C. Whietfield // Annu. Rev. Biochem. 2002. - Vol. 71, N 3. - P. 635 -700.

342. Ramon G. De l'influence sur la toxine pesteuse des filtrats de culture de B. subtilis, de Pénicillium notatum, d'Actinomyces griseus / G. Ramon, G. Girard, R. Richov // C. R. acad. Sei. Vol. 224. - P. 1259 - 1264.

343. Regulation of pH6 antigen expression in Yersinia pestis / P.A. Cherepanov et. al. // Nederlands Tijdshrifit voor Medische Microbiological. -1988.-Vol. 6.-P. 8.

344. Role of Mg2+ and pH in the modification of Salmonella lipid A after endocytosis by macrophage tumour cells / H.S. Gibbons et. al. // Mol. Microbiol. 2005. - Vol. 55. - P. 425 - 40.

345. Role of Yersinia murine toxin in survival of Yersinia pestis in the midgut of the flea vector / B.J. Hinnebusch et. al. // Science. 2002. - Vol. 296, N 5568.-P.733 - 735.

346. Rosqvist R. Increased virulence of Yersinia pseudotuberculosis by two independent mutations / R. Rosqvist, M. Skurnik, H. Wolf-Watz // Nature. -1988.-Vol. 334. P. 522-525.

347. Rosqvist R. Target cell contact triggers expression and polarized transfer of Yersinia YopE cytotoxin into mammalian cells / R. Rosqvist, K.E. Magnusson, H. Wolf-Watz // EMBO. 1994. - Vol. 13. - P. 964 - 972.

348. Rowland S. The morphology of the plague bacillus / S. Rowland // J. Hyg. Plague Suppl. 1914. - Vol. 13. - P. 418 - 422.

349. Santer M. Metabolic reactions of P. pestis. III. The hexose monophosphate shunt in the growth of P.pestis / M. Santer, S. Ajl // J. Bact. -1955.-Vol. 69.-P. 713-718.

350. Schütze H. Studies on B. pestis antigens as prophylactic agents / H. Schütze // Brit. J. Exp. Pathol. 1939. - Vol. 20, N 31. - P. 235 - 244.

351. Schütze H. Studies on B. pestis antigens. III. The prophylactic value of the envelope and somatic antigens of B. pestis / H. Schütze // Bull. J. Exp. Pathol. 1932. - Vol. 13. - P. 293 - 298.

352. Skurnik M. The biosynthesis and biological role of lipopolysaccharide O-antigens of pathogenic Yersiniae / M. Skurnik, J.A. Bengoechea // Carbohydr. Res. 2003. - Vol. 338, N 23. - P. 2521 - 2529.

353. Skurnik M. The biosynthesis and biological role of lipopolysaccharide O-antigens of pathogenic Yersinia / M. Skurnik, J.A. Bengoechea // Carbohydr. Res. 2003. - Vol. 338. - P. 2521 - 2529.

354. Smith P.N. / P.N. Smith // J. Infect. Dis. 1959. - Vol. 104, N 1. - P. 85 -91.

355. Stevenson W.D.H. Experiments on the onset of immunity after inoculation with Haffkine s anti-plague vaccine / W.D.H. Stevenson, R.J. Kapadia // Ref.: Col. Bakt., I. Abt. 1925. - Vol. 79. - P. 545.

356. Straley S. Cytoplasmic and membrane proteins of Yersinia cultivated under conditions simulating mammalian intracellular environment / S. Straley, R. Brubaker // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1981. - Vol. 78. - P. 1224 - 1228.

357. Straley S.C. Differential clearence and host pathogen interaction of YopE- and YopK- YopL- Yersinia pestis in BALB/c mice / S.C. Straley, M.L. Cibull // Infect. Immun. 1989. - Vol. 57. - P. 1200 - 1210.

358. Straley S.C. Yops of Yersinia spp. pathogenic for humans / S.C. Straley, E. Skrzypek, G.V. Piano, J.B. Bliska // Infect. Immun. 1993. - Vol. 61. - P. 3105-3110.

359. Strong P.B. Studies in plague immunity Philipp / P.B. Strong // Y. Sei. -1906. Vol. l.-P. 501.

360. Studies on immunization againet plague. 1. The isolation of and characterisation of the soluble antigen of P. pestis / E.E. Bacer et. al. // J. Immunol. 1952.-Vol. 68, N2.-P. 131 - 145.

361. Suomalainen M. Temperature-induced changes in the lipopolysaccharide of Yersinia pestis affect plasminogen activation by the pla surface protease / M. Suomalainen et. al. // Infect Immun. 2010. - Vol. 78, N 6. - P. 2644-52.

362. Telepnev M.V. Tetraacylated lipopolysaccharide of Yersinia pestis can inhibit multiple Toll-like receptor-mediated signaling pathways in humandendritic cells. / M.V. Telepnev et. al. // J. Infect. Dis. 2009. - Vol. 200. N 11.-P. 1694-702.

363. Temporal global changes in gene expression during temperature transition in Yersinia pestis / V.L. Motin et. al. // J. Bacteriol. -2004. Vol. 186.-P. 6298-6305.

364. The core structure of the lipopolysaccharide of Yersinia pestis strain KM 218. Influence of growth temperature / T.A. Gremyakova et. al. // Adv. Exp. Med. Biol. 2002. - Vol. 529. - P. 229 - 231.

365. The Oxoid Manual of Cultural Media, ingredients and other laboratory services. OXOID Ltd., UK. - Fifth edition. - 1982.

366. The plague: disease and vaccine / P. Michel et. al. // Dakar. Med. -1992.-Vol. 37.-P. 183- 189.

367. The role of multiplication of Pasteurella pestis in mononuclear phagocytes in the pathogenesis of flea-born plague / D.C. Cavanaugh, R. Randall // J. Immunol. 1959. - Vol. 83. - P. 348 - 363.

368. The structure of the cyclic enterobacterial common antigen (ECA) from Yersinia pestis / E.V. Vinogradov et. al. // Carbohydr. Res. 1994. - Vol. 258,N2.-P. 223 -232.

369. The virulence plasmid of Yersinia, an antihost genome / G.R. Cornelis et. al. //Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998. - Vol. 62. - P. 1315 - 1352.

370. Titball R.W. Vaccination against bubonic and pneumonic plague / R.W. Titball, E.D. Williamson//Vaccine.-2001.-Vol. 19.-P. 4175 -4184.

371. Titball R.W. Yersinia pestis (plague) vaccines / R.W. Titball, E.D. Williamson // Exp. Opin. Biol. Ther. 2004. - Vol. 4, N 6. - P. 965 - 973.

372. Towbin H. Electrophoretic transfer of proteins from poliacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications / H. Towbin, T. Staehelin, J. Gordon // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. - Vol. 76. - P. 4350 -4354.

373. Tsai C.M. A sensitive silver stain for detecting lipopolysaccharides in polyacrylamide gels / C.M. Tsai, C.F. Frasch // Anal. Biochem. 1982. - Vol. 119. - P. 115 - 119.

374. Tsukano H. The effect of an iron drug on the growth of plague microorganisms in vitro and in guinea pig skin jap / H. Tsukano, M. Yamamoto, A. Wake // J. Med. Sei and Biol. 1972. - Vol. 25, N 2, P. 85 - 93.

375. Vaccination with plasmid DNA Expressing the Yersinia pestis capsular protein Fl protects mice against plague / H. Grosfeld et. al. // Adv. Exp. Med. Biol. 2003. -Vol. 529. - P. 423 - 424.

376. Virulence factors of Yersinia pestis are overcome by a strong lipopolysaccharide response / S.W. Montiny // Nat. Immunol. 2006. - Vol. 7, N 10.-P. 1066-1073.

377. Walker R.V. Plague toxins. A critical review / R.V. Walker // Curr. Top Microbiol. Immunol. 1967. - Vol. 41. - P. 23 - 42.

378. Wang X. Lipopoly saccharide: Biosynthetic pathway and structure modification / X. Wang, P.J. Quinn // Prog. Lipid Res. 2010. - Vol. 49, N 2. -P. 97- 107.

379. Whitfield C. Modulation of the surface polimerlipid A-core ligase and by determinants of polimer chain lenght / C. Whitfield, P.A. Amor, R. Koplin // Mol. Microbiol. 1997. - Vol. 23, N 4. - P. 629 - 638.

380. Williams J.E. Use of an enzyme-linked immunosorbent assay to measure antigenaemia during acute plague / J.E. Williams et. al. // Bull WHO. 1984. -Vol. 62.-P. 463-466.

381. Williams R.C.G. Effects of Fraction I from Yersinia pestis on phagocytosis in vitro / R.C.G. Williams, H.Q.P. Gewürz // J. Infect. Diseases. -1972.-Vol. 126.-P. 235 -241.

382. Williamson E.D. Plague vaccines. In: S.A. Plotkin, W.A. Orenstein, P.A. Offit (ed.) / E.D. Williamson, A.J. Simpson, R.W. Titball // Vaccines. 2008. -P. 519- 529.

383. Wu Lien-teh. A. treatise on pneumonic plague. Geneva, 1926.

384. Yersinia pestis pH6 antigen: genetic, biochemical, and virulence characterization of a protein involved in the pathogenesis of bubonic plague / Lindler L.E. et. al. // Infect. Immun. 1990. - Vol. 58. - P. 2569 - 2577.

385. Yop H of Yersinia pseudotuberculosis interrupts early phosphotyrosine signaling associated with phagocytosis / K. Andersson et. al. // Mol. Microbiol. 1996. - Vol. 20. - P. 1057 - 1069.

Информация о работе

Голова, Алина Борисовна
кандидата биологических наук
Саратов, 2012
ВАК 03.01.06

Диссертация

Разработка биотехнологических аспектов повышения иммуногенности вакцинного штамма Yersinia pestis EV НИИЭГ - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы