Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Углеводсодержащие антигены чумного и псевдотуберкулезного микробов

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Углеводсодержащие антигены чумного и псевдотуберкулезного микробов"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР

Всесоюзный ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт "Микроб"

/4

На правах рукописи

ТАРАНЕНКО Татьяна Михайловна

УДК (61б.981Л52+616-002.71):576:576.809.7

УШВОДСОДЕРЖАЩИЕ АНТИГЕНЫ ЧУМНОГО И ПСЕВД0ТУБЕРКУЛЕЗН0Г0 МИКРОБОВ

(теоретические и прикладные аспекты) 03.00.07 - микробиология

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени доктора биологических

наук

ЫМ

Саратов - 1988

Рабою выполнена во Всесоюзном ордена Трудового Краоного Знамени научно-исследовательском противочумном институте "Микроб"

Научные консультанты: доктор медицинских наук, профеосор ФИЛИППОВ А.Ф.; доктор медицинских наук, старший научный сотрудник НАУМОВ' A.B.

Официальные оппоненты: доктор биологических и медицинских наук, член-корреспондент АМН СССР Домарадский И.В.; доктор биологических наук, профессор Драновская Е.А.; доктор медицинских наук, профессор Проценко. O.A.

Ведущая организация - Научно-исследовательский противочумный институт Кавказа и Закавказья.

Автореферат разослан "_" _ 198 г.

Защита состоится "_" _ 198 г.

в "_" часов на заседании специализированного совета

Д 074.32.01 по защите диссертаций на соискание учёной степени доктора наук при Всесоюзном ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательской противочумном институте "Микроб"

(4I060I, г.Саратов, Университетская, 46).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке института "Микроб"

Ученый секретарь специализированного совета, доктор медицинских наук,

профессор Филиппов А.Ф.

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблей и. Благодаря сложным И важный функциям микробных полисахаридов как индукторов биологических программ системы иммунитета использование кх оказалось весьма перспективный в практической плане в качестве компонентов вакцин, адъювантов, противоопухолевых препаратов и неспецифических стимуляторов.

На фоне несомненно болыаих досгиаений в изучении химического строения и иммунобиологических свойств антигенных липополисахари-дов сальмонелл, иигелл и эшерихий ( Sinniona, 1966 ; Luderitz е.а., I97I, 1982; Kowalewska, Romenosrska, 1977; Дмитриев, 1977, 1987; Захарова, 1980; Тийаков, Петровская, 1980; Brade, Galanee, 1983; Книрель, 1985;и др.) каш представления об углеводсодеркащих антигенах возбудителя чумы еде не достаточны. В то se зремя выделение и изучение соматических полисахаридсодеркащих антигенов чумных бактерий представляют значительный теоретический и практический интерес в связи с несомненной ролью их в иммунитете против чумы (Куков-Бережников, 1940', Домарадский.и др., 1962; lawton, Sur-gaiia, 1963; Акимович и др., 1968; Дальвадянц, 1968, 1978; Barber, Eylan, 1971; Вейнблат и др., 1977; Адамов, 1978).

Проводившиеся во ВНИПЧИ "Микроб" о 1956 года систематические исследования специфических полисахаридсодеркащих фракций чумного микроба позволили сделать определенные выводы о характера структуры его О-антигена. Было показано, что бактерии чумы, существующие в-'в-форме и сохраняющие при этом вирулентность, характеризуются наличием разобщенной структуры липополисахарида; они синтезируют недостроенный центральный стеркень липополисахарида (глико-липид, или R -ЛПС^и самостоятельно функционирующие з метке 0-боковые цепи. Указанные фрагменты комплексного О-антигена, получившие соответственно названия липополисахарид (1ПС) и "основной"

соматический антиген (ОСА), раздельно извлекались из вакцинного штамка S7 чумного шкроба (Бахрах, 1972, 1973; Бахрах, Вейнблат, 1972; Бахрах и др., 1972).

Имеющиеся теоретические обобщения были сделаны для отдельных штатов к з основном относились к итамму EV . Представляло несом-иеннкй интерес исследование особенностей структурной организации 0-анк:гека у бактерий чумы с разными биологическими свойствами и выделенных в разных природных очагах. Совершенно отсутствовали сведения о соматических антигенах возбудителя чумы, изолированных из s-форм бактерий. Бьши недостаточно изучены особенности структуры соматического О-антигена у я-фори близкородственного возбудителя псевдотуберкулеза. Требовали существенной разработки методы получения и стандартизации очищенных антигенных препаратов ССА и ДПС. Оставались открытыми практические вопросы, касающиеся усовершенствования иммунодиагностического аллергена пестина ПЛ, содержащего в своей составе специфические углеводные компоненты ОСА и ЛИС. В этом плане были недостаточно отработаны вопросы биотехнологии и физико-химических параметров очищэнного препарата, не были проведены испытания-на людях, отсутствовала лабораторная документация на изготовление и применение аллергена. Возник также вопрос о целесообразности использования пестина как иммунодиагностического препарата не только in vivo, но и in vitro.

Учитывая то обстоятельство, что углезодсодврзащие антигены чумного и псевдотуберкулёзного микробов (OCA, ЛЛС, пестин и псевдот туберкулин) находят все более иярокое применение в практике здравоохранения как компоненты диагностических и профилактических препаратов ( Филиппов и др., '1977; Дальвадянц и др.,1978; Самойлова и др., .1983; Бывалов и др., 1984; Царев, 1984), новые данные, касающиеся их физико-химической природы в сопоставлении с иммунобиологическими свойствами,могут быть использованы для решения

практических задач по выявлении атипичных штаммов и созданию вакцин против чумы и препаратов, выявляющих иммунитет.

Цель работы - комплексное исследование физико-химической природы и биологической активности углеводсодержащих антигенов и их специфических полисахаридов у возбудителей чумы и псевдотуберкулеза и оценка возможности использования полученных данных для конструирования профилактических и диагностических препаратов и идентификации атипичных штаммов чумного микроба.

Задачи исследования: I/ разработать оптимальную стандартную технологию выделения и очистки отдельных углов одсодераащих соматических антигенных комплексов чумного и псевдотуберкулёзного микроба - ОСА, ЛПС, аллергена пестина ПП; 2/ изучить физико-химическую природу и моносахаридный состав препаратов ОСА и ЛПС, изолированных из штаммов чумного микроба с разными биологическими свойствами, включая гладкие варианты, и выделенных в рззличных природных очагах; 3/ определить структуру специфических полисахаридсодераещих антигенов возбудителя псевдотуберкуле-аа, находящегося в шероховатой форме диссоциации; V исследовать физико-химические свойства и специфическую активность в эксперименте очинённого препарата пестина ПП; 5/ изучить иммунобиологические и иммунохимические свойства углеводсодержащих антигенных препаратов ОСА и ЛПС для выявления их роли в формировании патогенеза и иммуноаллергической перестройки макроорганизма при чуме; б/ провести апробации безвредности и специфической активности нового аллергена пестина ПП на людях в тестах in vivo и in vitro.

Научная новизна. Впервые исследована структура О-антигена чумного микроба у штаммов с разными биологическими свойствами, включая ахромогенность, антибиотикоустойчивость, аук-сотрофность и вирулентность, выделенных в разных природных очагах, а также у штаммов в s -форме диссоциации. На значительном коли-

честве штатов изучены особенности строения липополисахарида у к -вариантов возбудителя псевдотуберкулеза.

Показано, что в отличие от псевдотуберкулезных бактерий, находящихся в г -форме и синтезирующих полную структуру 0-соматиче-ского антигена, для исследованных культур чумного микроба, независимо от биологических свойств и фазы диссоциации, и для и -форм псевдотуберкулезных бактерий характерна разобщенность центрального стергня и О-специфических боковых цепей в липополисахариде. Для шташов чумного микроба, находящихся в з-форце диссоциации, выявлены дефектные изменения ионосахаридного состава специфических полисахаридов. Впервые в О-специфических структурах ЛПС у вирулентных и иимуногенных культур возбудителя чумы обнаружены 3,6-дидезо-ксигексозп, являющиеся маркерами О-специфичности. Установлено принципиальное сходство по общему химическому и ыоносахаридному составу у препаратов ОСА, изолированных из и -форм чумных и псевдо-туберкулезшх бактерий, открывающее возможность использования последних как компонентов профилактических препаратов против чуш.

Предложен ускоренный способ выявления структурных особенностей липополисахарадов у бактерий чуш и псевдотуберкулеза по наличию альдогептозы непосредственно в экстрактах, минуя стадию выделения, очистки и анализа специфических полисахаридов. Научная новизна метода заключается в использовании при изучении атипичных и переходных штаммов и при отборе полноценных в антиген.Гом отношении культур, пригодных для получения типовых псевдотуберкулезных агглютинирующих сывороток. Разработаны научно-методические основы выделения очищенных углеводсодержацих препаратов ОСА и ЛЕС возбудителей чуш и псевдотуберкулеза с определенными физико-химическими параметрами. Стандартизованы методики проведения их физико-химического и шшуяохишшеского анализа.

Получены новые данные по ввделению из пестина 1Ш компонента, который более четко, чей исходный препарат, выявляет не только

аллергическую перестройку организма в результате вакцинации, но и резистентность его к чуме. Исследована физико-химическая к иммунобиологическая природа его в эксперименте. Новый очищенный пестин апробирован на людях. Впервые показана возмояность аллерго-диагностики при чуме с препаратами пестина in vitro з тесте ППН.

Полученные результаты явились теоретической основой для выхода материалов в практику.

Практическая ценность. Разработанные нами методы вопли в "Методическое пособие по биохимии, генетике и молекулярной биологии возбудителей чуш и псевдотуберкулеза", утвержденное ГУКИ МЗ СССР 12 декабря 1985 г., и в "Методические рекомендации по физико-химическому анализу ряда антигенных структур воз* •

будителя чумы", утверздеиные директором ВНИПЧИ "Микроб" I? декабря 1977 г. Перечисленные методические документы и стандартные антигенные препараты ОСА и ЛПС используются в практике ВНИПЧИ "Микроб" и НИПЧИ Кавказа и Закавказья.

На аллерген пестин Ш1 усовершенствованный составлена и утверждена документация в виде технических условий (ТУ 42.КВС III--??) и изменений к лабораторному регламенту (fö 107, утверждены КВС 30 июня 1977 г.). Группой специалистов с участием автора успешно прове дена широкая апробация пестина ПП на иммунизированных против чумы добровольцах (408 чел.); подтверждены высокая специфичность, полная безвредность и биологическая активность препарата при внутри-кожном введении. Пестин испытан и получил подоаительную оценку в исследованиях Волгоградского ПЧИ при проверке иммуноаллергиче-ской перестройки у вакцинированных протиз чуш людей (550 добровольцев) .

В течение многих лет изготовляемый нами аллерген пестин ПП неизменно пользуется широким спросом исследователей противочумной системы, разрабатывающих различные аспекты иммуноаллергической

-7 -

переотройки при чуме in vivo и in vitro.

Апробация работы и публикации.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на 3-й Всесоюзной биохимическом съезде (Рига, 1974), на 7-и Всесоюзной микробиологической съезде (Алиа-Ата, 1985), на Всесоюзных конференциях по химии и биохимии углеводов (Ростов-на-Дону, 1977; Тбилиси, 1987), на Всесоюзной конференции "Иммунология и иммунопрофилактика чумы и холеры" (Саратов, 1980), на Всесоюзной конференции по спектроскопии биополимеров (Харьков, 1981), на Всесоюзной конференции "Профилактика природиоочаговых инфекций" (Ставрополь, 1983), на ХУ Пермской областной научно-технической конференции по спектроскопии (Пермь, 1976), на рабочем совещании "Биохимия клеточной поверхности грамотрицательных микроорганизмов" (Саратов, 1984), на рабочем совещании специалистов биохимиков, генетиков и молекулярных биологов противочумных институтов (Саратов, 1985), на традиционных ежегодных научных конференциях института "Микроб", посвященных дню рождения В.И.Ленина.

Материалы диссертации вошли в 8 научных отчетов (1975-1985 гг.) по законченным НИР, выполнявшимся'в соответствии с планами Министерства здравоохранения СССР. Диссертация обсуждена и одобрена на расширенной конференции института "Микроб". По теме диссертации опубликовано 52 научные работы в издательствах, соответствующих требованиям пункта 2.7 Положения.

Структура работы. Диссертация состоит из введения, I главы обзора литературы, описания материалов и методов, 4 глав, отражающих результаты собственных исследований по теме, заключения и выводов, иллюстрирована 48 таблицами и 16 рисунками. Указатель литературы содержит 444 отечественных и 161 иностранный источников.

Экспериментальные результаты, представленные в диссертации,по-

лучены лично диссертантом, под его руководством и в соавторстве о сотрудниками лабораторий биохимии, противочумных вакцин, микробиологии и иммунологии чумы, патогистологии, диагностических сывороток, лаборатории для экспериментов с зараженными животными ВНИПЧИ "Микроб", отдела микробиологии Среднеазиатского ПЧИ, экспериментальной лаборатории чумных вакцин Ставропольского ПЧИ и кафадри теоретической физики Саратовского педагогического института.

Положения, выносящиеся на защиту.

1. Новые данные об особенностях структуры и моносахаридного состава углеводсодеряащих антигенов чумного микроба, выделенных из культя? штаммов, принадлежащих к разным природным очаг'ам и различающихся по биологическим свойствам, включая ахроыогенность, анти-биотикоустойчивость, ауксотрофность, вирулентность и морфологию колоний.

2. Заключение о наличии у возбудителя чуш универсальной структуры ЛПС с разобщенными коровой частью и О-специфическими цепями.

3. Данные, характеризующие общность строения ЛПС и близость химического состава его специфических полисахаридных компонентов у возбудителей чумы и псевдотуберкулеза, находящихся в и -форме дио-социации.

Материалы научно-методического обоснования выделения, очистки и физико-химического анализа углеводсордержащих антигенов возбудителей чуш и псевдотуберкулеза.

5. Характеристика физико-химической природы и иммунобиологический свойств, биотехнология очищенного усовершенствованного аллергена песчина ПП и возможности его использования как иимунодиагностиче-ского препарата во внутрикожной пробе и в тесте ППН на людях, лабораторных животных и диких грызунах.

П. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Штаммы. Основная часть экспериментов выполнена на модели

' вакцинного штамма т линии ШИЭГ; использованы также его мутанты с разними биологическими свойствами: Е72,етазф. ЗЬ1-Г 61' еу-252 и Е\г Дсслодованн внсокоиммуногениый штамма К-1 и его ахромогешшй и антибиотикоустойчивда варианты (6), полученные под воздействием н -метил- н'-нитро- н -пктрозогуанкдзша. В работе изучено еще 46 культур возбудителя чуш, в том числе с разными биологическими свойствам, включая вирулентные штаммы (5), ауксо-тробпые мутанты, завистлив от аминокислот, азотистых оснований и витаминов (14"), находящиеся в Э -форте диссоциации (4) и выделенные из разных природных очагов (8). Среда исследованных штатов возбудителя псевдотуберкулоза (51) находились эталонные культуры пяти серовароз Таля (5), из коллекций Моллярв (14) и института "Микроб" (5), японский штата! 110 У1 серовара, "новообразованные" культуры (3), штаммы, выделенные от больных (5), грызунов (8), эктопаразитов (3), и атипичные штаммы, выделенные на холмогорье Бадхыз (7).

Микробиологические методы. Бактериальную массу возбудителя чумы, необходимую для выделения углеводсодер-нащих антигенов, получали при выращивании на агаре Хоттингера при 28 °С в течение 2 суток в матрацах или аппаратным способом в АК1.1-Ш. Описаны особенности культивирования при многократных поресевах в бифазной среде (Тараненко и др., 1984),.на агаровой среде из кормовых дрсдзей (Филиппов, Тараненко и др., 1985), а также условия выращивания чумного микроба, связанные с получением гладких вариантов (Суров, Суриков, Тараненко, 1978). Выращивание бактерий псевдотуберкулеза производили на матрацах с агаром Хоттннгора (рй 7,2) в течение 48 ч. Дня получения культур в и-йазе диссоциации выращивание производили попеременно на агаре к бульоне при 28 °С. Стабильная и-популяция бактерий Формировалась на 6-9-г.1 пассане. Сохранение в-фазы достигалось в процессе выращивания при темпе-

• ратуре 20-22 °С на свежем (влажном) агаре. В работе использовали нативнне или ацетонвысушенные клетки бактерий.

Препаративные методы. Описаны модифицирован-ныо автором методы вцдоления и очистки ОСА путем экстракции трихлор-уксусной кислотой - ТХУ (Суров. Таранэнко и др.,1379) и ЛИС экстракцией смесью водного фенола, хлороформа и петролейного эфира (Бахрах, Вейнблат, Таранонко и др. ,1976). ЛПС выделяли также по методу Weatphal е.а. (1952) в модификации Вейнблата с соавт.(1972), экстрагируя ацетонвысушенныэ клетки водно-фенольной смесью. Аллерген пес-тин Ш выделяли из нативной бактериальной .массы чумного микроба в процессе гидролиза разбавленной уксусной кислотой по методу white (1936), модифицированному нами (Тараленко, .Павлова, 1966). Описана разработанная автором методика получения нового пестина путам очистки старого препарата голь-фильтрацией на.колонке, с сефадексом G -50

• (Тараненко, 1968; Бахрах, Тараненко и др., 1971). öl извлекали из ацетонвысушенных клеток по Baker е.а. (1952) или из центрифугата "бифазной" культуры фракционирования сульфатом аммония (Тараненко и др., 1984). Для очистки углеводсодеркащих антигенов использовали общепринятые приемы гель-хромагографии (Детэрман, 1970) и скоростного центрифугирования.

Химичесхие и физико-химические методы. Белок определяли по Лоури, нуклеиновые кислоты - по Спирину (1958), редуцирующие вещества - по Хагедорну-Менсену, полисахариды - антроновым методом ( Shilds, Burnett, I960), гексо-за^таны - по методу Эльсона и Моргана в модификации Гладышева (1956), гептозы - по Dische (1953) в модификации Osborn (1963), 3-ДвЗОКСИОКТуЛОЗОНОВуЮ КИСЛОТУ (КДО) - ПО методу Waraw-dekar и Saslew (1959), модифицированному Dröge е.а. (1970), 3,6-дидезоксигексозы - по цветной периодатно-2-тиобарбитуровой реакции ( Dröge е.а. 197О), содержание общих липидов - по Ба-лахозскому (1953), липида А - по методу, описанному Adama

•и Singh (1970). Определение моносахаридного и аминокислотного состава фракций проводили методом одномерной восходящей хроматографии kg бумаге (Егорова, 1963; Пасхика, 1964). Описана модифицированная автором методика идентификации моносахаридов в тонком слое (Та-раненко и др., 1973). Для выяснения химического состава и структурных особенностей антигенных компонентов использовали разработанный автором метод КС-спектроскопии в твердых растворах бромистого калия (Таранепко и др., 1972; Ковалев и др., 1976, 1981). Для изучения очищенных фракций использовали методы диск-электрофореза ( Davis, 1964) и изоэлектрического фокусирования (Ригли, 1974). Молекулярную массу определяли по Детерману (1970). Для выделения и изучения специфических углеводов использовали различные методы гидролиза и приемы химической модификации ( Rreemen, 1942; Деревицкая, 1969; Kochetkov е.а., 1970; Lehrer е.а., 1972; Васильева, Энтина, IS75).

Серологические методы. Для обнаружения отдельных антигенов применяли реакцию иммунодиффузии в агаре по. Ouchterlcny (1953). О содержании специфического полисахарида, детерминирующего серологическую активность ОСА. и истина ПИ, судили по реакции преципитации в геле (Тараненко, 1968). Содоряание Gl определяли в РИГА и РНАт, ЛПС - в РНАт с формалинизированными бараньими эритроцитами, сенсибилизированными "щелочным" липополи-сахаридом чумного микроба (Вейнблат, 1968), "мышиного", токсина -в реакции иммунодиффузии с антитоксической сывороткой, любезно предоставленной Т.Н.Домарадской. .

Биологические методы.. Токсичность ЛПС определяли в опытах на белых цыиах путем внутрибршинного зведения различных доз препаратов. Испытание аллергенных свойств проводили , in vivo путем постановки внутрикояных проб и проб на лапках и in vitro в тесте 1ШН (показатель повреждения нейтрофнлов).

Реакции на внутрикодное введение у морских свинок и людей оценивали по интенсивности покраснения, наличию отека и инфильтрата (Павлова, 1964) или только по среднему диаметру конной реакции в месте введения; у диких грызунов измеряли толщину складки кохи на месте реакции. Результаты на лапках оценивали по степени их утолщения .(Узенцов и др., 1981). Постановку-теста ППН проводили по методике, описанной Фрадкиным с соавт. (1980). Изучение влияния антигенных препаратов на дыхание митохондрий проводили по методике Бахрах с 'соавт. (1971).

Статистическую обработку полученных данных проводили общепринятыми методами, рассчитывая средние арифметические величины, их средние ошибки,доверительные интервалы и достоверность различий по * -критерию Стыодента (Сызранцев, 1938; Беленький, 1959; Авшарин, Воробьев, 1962; Сепетлиев, 1968). рассчитывали по формуле Кербера в модификации Ашмарина и Воробьева (1962). В отдельных опытах вычисляли коэффициент корреляции г (Рокицкий, 1973).

Ш. УГЛЕВОДСОДЕРЖАЩИЕ СОМАТИЧЕСКИЕ АНТИГЕНЫ (ОСА И ЛПС) ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ЧУМЫ И ПСЕЗДОТУБЕРКУЛЕЗА

Для понимания иммуногенных и патогенных свойств возбудителя чуш необходимо знание физико-химической природы и функциональных особенностей основных антигенных структур клетки. Угловодеодержа-щи е биополимеры бактерий, располоаенные в основном в наружных.слоях клеточной стенки, функционируют з качестве структурных компонентов клетки, а в комплексе с полипептидами, белками и липидами з случае инфекции взаимодействуют с макроорганизмом, выполняя в зависимости от химического строения роль антигенов и иммуномодуляторов.

В свете современных представлений о строении липополксахаридов я-форм грамнегативных бактерий и их я-мутантов изолированные из штамма еу антигенные структуры ОСА и ЛПС модно отождествить

с раздельно существующими в клетке фрагментами липополисахарида, характерными для к-мутантов (Бахрах и др., 1972). В отличие от исходного штамма ст у его псевдотуберкулезоподобного мутанта ЕТМ происходит синтез полной структуры ШЮ за счет инверсии 0-специфи-ческой части (ОСА) в центральный полисахарид (Бахрах и др.,1972).

В связи с вышеизложенным ш считали целесообразным продолжить исследования, направив основное внимание на изучение специфических полисахаридов у штаммов возбудителя чумы с разными биологическими свойствами и выделенных в различных природных очагах.

В качестве объектов исследования, предназначенных для выделения и последующего изучения углеводсодернащих антигенов, были взяты штаммы возбудителя чуш с разными биологическими характеристиками: типичные вакцинные штаммы и их мутантные формы, утратившие способность синтезировать некоторые антигенные компоненты клетки, ахромо-генные и антибиотикоусгойчивые варианты; типичные по своим культу-радьным и биологическим свойствам штампы из различных природных очагов чумы и их ахромогенные, авирулентные и ауксотрофные мутанты; штаммы, находящиеся в разной форме диссоциации (образующие н- и з -формы колоний), и другие штаммы, различающиеся в основном по степени вирулентности для лабораторных животных. Среди исследованных штаммов возбудителя псевдотуберкулеза были типичные шести различных сероваров Таля штаммы из коллекций Молляре и музея зшвых культур института "Микроб", так называемые "новообразованные" штаммы, штаммы, выделенные ое больных, грызунов и эктопаразитов, и атипичные штаммы, выделенные на-холмогорье Бадхыз.

Одной из основных задач исследования явилась разработка методов выделения и очистки антигенных углеводсодергащих фракций, стандартизация некоторых методик изучения химического состава углеводного компонента.

В основе выделения ОСА лежит метод экстрагирования живых или ацетонзысуаенных клеток трихлоруксусной кислотой по Буавену. В дан-

них условиях в экстракт переходят антигенноактивные компоненты, выявляемые в реакции преципитации о чумными кроличьей и лошадиной агглютинирующими сыворотками. Были отработаны условия проведения экстракции для сырых и ацетонвысушенных клеток, выделения препарата из экстракта-в процессе осаждения ацетоном или лиофилизации и получения из него специфического полисахарида путем гель-фильтрации на ультрагеле АсА-44 или сефадексе 0-75. При выделении ЛПС по методу Вестфаля были отработаны условия предварительной экстракции клеток солевым раствором и методика очистки препарата в процессе гель-филмрации на колонке с сефарозой 23 и 4В. Наиа модификация метода Галаноса, связанная с отсутствием необходимой аппаратуры, состояла в замене этапа ультрацентрифугкрозания диализом и «

последующим осаждением этиловым спиртом.

В процессе исследования углеводной части антигенов стандартизованы и модифицированы известные методы определения углеводов, характерных для липополисахаридов грамнегативных бактерий - альдо-гептозы, КДО и 3,6-дидезоксигексоз. Разработана методика тонкослойной хроматографии в силикагеле. для определения моносахаридного состава.

Самостоятельным методическим разделом исследований явилась разработка методики проведения ЙК-спектроскопии. Был выбран метод запрессовки антигенных образцов в твердую иммерсионную среду, з качестве которой использовали оптически чистый КЗ? . Экспериментально установлено, что оптимальной технологией приготовления образцов, дающей воспроизводимые результаты, является приготовление таблеток под давлением 600-700 Ша с содержанием препарата в твердом растворе КВг 0,5 Исследовали диапазон волновых чисел на спектрофотометре та -20 от 400 до 3700 см-1 при скоростях сканирования от 10 до 64 см~*/нин.

Мы ИЗУЧИЛИ ОбЩИЙ ЗШЦИЧбСКИЙ И ЦОНОСЭХЭрМДНЫЙ СОСТЭВ ДВУХ 8НТИ-*

генноактивных углеводсодержащих компонентов возбудителя чуцц (ОСА

и ЛПС) у штаммов с разными биологическими свойствами или выделенных в различных природных очагах чумы. Всего исследовано 60 культур с учетом разных форм диссоциации, различий по антибиотикоустойчивости, зависимости от факторов роста и других биологических вариантов одного и того же штамма.

В результате проведенных исследований было показано, что ä отличие от шести сероваров псевдотуберкулезного микроба у штаммов возбудителя чумы, выделенных из разных природных очагов и независимо от их биологических свойств (ахромогенность, антибиотикоустойчивость, вирулентность, ауксотрофность), ОСА и ЛПС раздельно существуют в клетке и могут быть изолированы разными методами, что дает нам основание считать установленный факт универсальным для возбудителя чумы. Таким образом, самостоятельно функционирующие в клетке ОСА и ЛПС можно отождествить с фрагментами липополисахарида: О-специфи-ческими цепями (ОСА) и центральным полисахаридом ( к-ЛПС), характерными для ß-мутантов ( Lüderitz s.a., 1982; Езепчук, '1985).

В процессе изучения различий в моносахаридном составе специфических полисахаридов установлено, что для штаммов EV и K-I воздействие стрептомицина и других антибиотиков, мономицина, пенициллина, тетрациклина, как правило, не затрагивает структуры специфического R-ЛПС клеточной стенки чумного микроба. В то же время для штамма EV под воздействием стрептомицина и у полирезистентного мутанта K-I ( str1, реп1" tstrr) наблюдаются изменения как в моно-сахаридном составе ОСА, так и в содержании, отдельных углеводов (снижение во всех случаях содёржания глюкозамина), сопровождающиеся в конечном счете снижением серологической активности. Есть данные, что лекарственная устойчивость у бактерий нередко приводит к изменениям химической композиции оболочки, направленным главным образом в сторону снижения антигенной полноценности (Лебедева, Воропаева, i960; Stanislavskii е.а., 1971). По мнению последователей (Кудлай И др., 1972; Bayer, Leive, 1977), устойчивость

к стрептомицину может быть вызвана изменением общей проницаемости клеточной стенки, а- также может явиться следствием изменения тех структур клетки, на которые непосредственно действует антибиотик.

Вполне определенные изменения в моносахаридном составе ОСА наблюдались нами и у ахроыогенных вариантов е7 и Н-1 чумного микроба. В этом случае в отличие от родительских штаммов ОСА не содержит глюкозы и фукозы, а содержание галактозы и ксилозы в нем заметно увеличивается и сопровождается некоторым повышением серологической активности. Причем сопоставительный анализ этих изменений и антигенных свойств показал, что, хотя сыворотки кроликов, иммунизированных ахромогенными вариантами, не отличаются от исходных по спектру антител к ОСА и ЛЕС, они обладают более низкой протективной

4

активностью или ее полной утратой, вероятнее всего, за очет снижения титра антител к Ф1 и ФП или их отсутствия (Малинина, Тараненко и др., 1986).. .

У ряда ауксотрофных мутантов вирулентного штамма А1435 чумного микроба независимо от различных потребностей в аминокислотах (8-Глу' 54-Гис"", П6-Глу~, 38-0рн", П-Лей~, 99-Про~, 785-Вал", 69-Вал", Лей"), азотистых основаниях (490-Урац", 68-Ксан", 550-Ксан", Урац", 713-Дит", Урац") и витаминах (88-никотинамид~) наблюдается, напротив, достаточно стабильная и полноценная по моносахаридному составу структура специфической углеводной части как у ЛЛС (гептоза, КДО, глюкоза, гексозашн), так и у ОСА (галактоза, глюкоза, фукоза, гексозамин). Как оказалось, такие мутанты наряду с потерей вирулентности сохраняют высокие иммуногенные свойства (Степанов, 1975),

Б этой связи интересно отметить тот факт, что почти у всех ауксотрофных мутантов штамма А1435, так же как и у исходного шташа, в их ТХУ-экстрактах после 5-часового гидролиза I н. серной кислотой по окраске с тиобарбитуровой кислотой и методом ТСХ на пластинках с силикагелем идентифицировались быстродвижущиеся сахара по типу 3-6-дидезоксигексоз. Указанное наблюдение, служащее ещё одним до-

казательством принадлежности полисахаридного компонента ОСА к О-спе-ц;;фкческой боковой цела липополисахарида (Бахрах и др., 1972), мо-язиться основой для разработки методов дифференциальной диагностики чумного и псевдотуберкулезного микробов и выявления атипичных форм и эволюционных связей.

Рассмотрение в совокупности данных, полученных при изучении фи-з::ко-химкческих к иммунохиыических свойств соматических антигенов, изолированных из гладкой формы возбудителя чумы, показало, что морфологически выраженные s-варианты чушого микроба, как и его типичные Е -формы, не способны к синтезу полной структуры липополисахарида, как это имеет место у большинства грамнегативных бактерий. Гладкие варианты чумного микроба сохраняют способность к синтезу двух самостоятельно функционирующих специфических углевод-содеркащих антигенов ОСА и ЛПС, характерных для типичных патогенных и ишуногенных форм чумного микроба. Результаты сравнительного иимунохишческого анализа препаратов ОСА, выделенных из штаммов I0I/I46, 102/147 и.АЫП-3270, не выявили существенных различий в их общем химическом и моносахаридном составе. Во всех образцах были идентифицированы галактоза, глюкоза, рибоза, В то гее время сопоставительный анализ показал, что в отличие от штамма ev, у антигенов гладких вариантов наблюдаются дефицитные изменения моно-сахаридного состава не только в ОСА, но и л ЛПС. Так, в ОСА штамма 394-КагЫп резко снизилось содержание глюкозы"(Р^0,05), а для ЛЯС всех исследованных культур, находящихся в гладкой форме (AJffl-3270, 394 - Harbin, I0I/I46, 102/147, K-I - келтый вар.), было , характерно снижение серологической активности, которое для послед- I них трех коррелировало с утратой или снижением содержания некоторых углеводных компонентов (глюкозы," глвкозамина). Полученные результаты свидетельствуют о том, что для чумного микроба различная морфология колоний в процессе диссоциации не определяет общепринятого для грамнегативных.бактерий характера структуры О-антигена.

Диссоциация чумного микроба, как форма изменчивости, впервые описанная А.А.Безсоновой и Г.Н.Ленской (1929), нашла достаточное отражение в литературе (Ленская, 1946; Коробкова, 1956; Туманский, 1958). Вместе с тем значение диссоциации для существования микроба чумы в естественных условиях представляется сомнительным. Обнаруженная дефектная по моносахаридкому составу и серологическим свойствам структура антигенных препаратов ОСА и ЛПС у гладких вариантов помогает понять невозможность циркуляции 3-форм чумного микроба в естественных условиях как регрессивных форм изменчивости.

Анализ моносахаридного состава ОСА и ЛПС у штаммов возбудителя чумы, выделенных из разных природных очагов (Закавказское Нагорье, Горный Алтай, Среднеазиатские Пустынный и Горный очаги, СевероЗападный Прикаспий), не выявил существенных различий между ними в зависимости от их эколого-географической принадлежности. Исключением явились атипичные культуры, выделенные в Теджен-Мургабском Междуречье, природа и происхождение которых долгое время оставались предметом научной дискуссии. Известно, что эта группа бактерий имеет ряд общих черт с возбудителями чумы и псевдотуберкулеза, Большинство исследователей относит их к микробам псевдотуберкуле-эа (Акимович и др., 1968; Вейнблах, 1968; Мартиневский, 1969; Ларина, Чибрикова, 1971; Гольдфарб, 1977).

По нашим данным, четкие различия в структуре липополисахарида у этой группы бактерий коррелировали с их морфологическими особенностями. В ВСУ-экстрактах культур, находящихся в оз -форме (штаммы 223, 1380, 1920), одновременно с сахарами, обнаруженными в штамме 746 ( н-форма), идентифицированы 3,6-дидезоксигексоза, КДО и липидный компонент, что вместе с их эндотоксической активностью свидетельствуес о синтезе Б -формами бадхызских штаммов полной структуры липополисахарида.

При этом показано, что,подобно бактериям псевдотуберкулеза грызунов (Оводов и др., 1971),из культур 1380 и 1920, находящих-

ся в оэ-форме диссоциации, могут быть выделены два липополисаха-рида, различающиеся прочностью связи с клеточными структурами: поверхностны;! - ЛПС-1, извлекаемый 2,5 % раствором Нае1, и прочнссвязашай - ЖС-П, экстрагируемый горячим водным фенолом. ЛПС-1 в отличие от ЛПС-П не имеет в своем составе липида А и соде пг/лт незначительное'количество альдогептозы и 3,6-дидезоксигек-созы. Вместе с том очень низкое содержание е ЛПС этих штаммов альдогептозы (I % в ЛПС-1 и 15 % в ЖС-П; содержание альдогептозы в ЛПС штамма ЕУ составляет 27-30 %), на наш взгляд, -не позволяет отнести их к типичным бактериям псевдотуберкулеза.

Изучение и^тунохкмпческих свойств, физико-химического и моно-сахар::дкого состава соматических антигенов псевдотуберкулезных бактерий, находящихся в разных фазах диссоциации, показало, что в отличие от Б-форм, у которых синтезируется типичный для энте-робахтериЗ трехкомионентный эндотоксин ( Затив1взоп е.а,, 1974; Шошиев и др., 1977), для и -фора возбудителя псевдотуберкулеза, подобно чумному микробу, характерна разобщенная структура О-сэматического антигена, когда антигенный кошонент, несущий О-спецпфичность, самостоятельно существует в клетке. В этом случае при экстракции по Буазену из и -фор,! бактерий псевдотуберкулеза (штаммы И!, 1У, 2199, 53, 56, 70) извлекается только О-спе-щйический материал, в то время как из гладких вариантов (1У- 03 23913, 445Э ) при тех же условиях может.быть выделен липопо-лисахарид.с полноценной структурой, т.е. О-специфический компонент вместе с центральны!.! полисахаридом и липидом А токсичный для мышей. Анатиз таких О-специфических полисахаридов, выделенных из шероховатых вариантов псевдотуберкулезного микроба, обнаружил присутствие в них пентоз и гексоз, таких как галактоза, глюкоза, майю за, ксилоза, рибоза, и отсутствие 3,6-дадезокси-гексоз, липида А и углеводных компонентов, характерных для цент-

рального полисахарида - альдогептозы и КДО, и в целом свидетельствует о структурном сходстве выделенного О-специфического материала н -вариантов псевдотуберкулезных бактерий с препаратами ОСА чумного микроба. Близость химической структуры специфического полисахарида ОСА у двух родственных видов бактерий проявляется и серологически: препарат ОСА в реакции иммунодиффузии с чумными агглютинирующими сыворотками дает зону идентичности.

Что касается я -ЛПС псевдотуберкулезных бактерий, то они,подобно гликолипидам грамнегативных бактерий и в том числе Е-ЛПС чумного микроба,могли быть выделены чз клеток фенолсодерзащими смесями. Анализ специфических н-ЛПС, изолированных из шероховатых культур штаммов Ш, 1У, 53, 56, 70 Т.рвеш1о1:иЪегси1о81з, выязил ха-«

рактерные для этого класса соединений углеводные компоненты - гек-созамин, альдогептозу в виде двух изомеров (ь- и и -глицер- б -манногептоза), КДО и набор нейтральных пентоз и гексоз. При этом в их моносахаридном составе, так же как и в препарата ОСА н-ва-риантов возбудителя псевдотуберкулеза, не выявлено заметных отличий, коррелирующих со штаммовой принадлежностью. Анализ ПК-спектров обнаружил во всех препаратах наличие максимумов при 1730, 2850 и 2920 см-1, характерных для липида А. Все Н-ЛПС токсичны'для белых мыией. Характерно также, что Н-ЛПС чумных и псевдотуберкулезных бактерий серологически идентичны.

Учитывая близость химического состава и серологическую общность чумного и псевдотуберкулезного микробов, а также принимая во внимание такие качества возбудителя псевдотуберкулеза, как меньшая по сравнению с возбудителем чумы требовательность к питательной среде и более высокие урожайность культуры и выход препаратов ОСА, можно говорить о преимуществе псевдотуберкулезного микроба как источника ОСА. На это ранее указывал И.В.ДомарадскиЙ с соавт. (1962), показавший, что и-антигены псевдотуберкулезного микроба

.более иммуногенны и предохраняют как от псевдотуберсулеза, так и от чумы. Правильность таких выводов подкрепляется также исследованиями С.М.Дальвадянца с соавт. (1972, 1976, 1977) и Е.А.Царева (1984), показавшими возможность использования бактерий У.pseudotuberculosis, находящихся в н-форме диссоциации, для выделения углеводсодержащих препаратов, пригодных для конструирования химических вакцин и аллергенов в целях иммунопрофилактики чумы.

Знание обнаруженных нами в процессе иммунохимического исследования особенностей химического строения соматических антигенов возбудителей чумы и псовдотуберкулеза использовано для отбора полноценных в антигенном отношении культур, пригодных для получения псевдотуберкулезных агглютинирующих сывороток. Нами предложен ускоренный» относительно простой спектрофотометрический способ определения синтеза клетками полноценного липополисахарида по наличию сахара-аяьдогептозы непосредственно в экстрактах после обработки клеток 0,25 н. ТХУ (при 4 °С в течение 3 ч) и I н. (при 100 °С 5 ч), минуя стадию выделения и очистки препаратов. Всего исследовано III культур штаммов обоих видов. Наличие или отсутствие в экстракте альдогептозы (как компонента центрального стержня) свидетельствует о способности исследуемого штамма к синтезу полной или разобщенной структуры липополисахарида. Метод испытан и для определения структурных особенностей ЖС у некоторых представителей грамнегативных бактерий. Подобно Y.pseudotuberculosis, наличие В ТХУ-экстрактах у представителей Escherichia, Shigella, Salmonella и vibrio' альдогептозы как маркера полной структуры ЖС ассоциируется с гладкой формой колоний.

Для более надежного отбора штаммов возбудителя псевдотуберку-лаза с полноценной структурой ДПС одновременно с определением альдогептозы в тех же экстрактах проводили дополнительно определение 3,6-дидезоксигексоз. Анализ экстрактов на содержание двух

указанных специфических для ЛПС моносахаридов у 25 культур чумного и 42 культур псевдотуберкулезного микробов показал, что одновременное наличие в ТХУ-экстракте альдогептозы ( д £505.545 0,01) и 3,6-дидезоксигексоз ( дЕ5з2-5бо^ свидетельствует о синтезе клотка'.'.и О-соматического антигена с полной структурой ЛПС и коррелирует с типичной для псевдотуберкулезного микроба 3-й 08 -формой колоний.

Резюмируя данный раздел работы, мозно сделать следующие основные выводы: I/ разработаны методические основы выделения, очистки и стандартизации углеводсодераащих антигенов.возбудителей чумы и псевдотуберкулеза; 2/ для культур штаммов чумного микроба, выделенных из разных природных очагов, независимо от их биологических свойств - ахромогенности, антибиотикоустойчивости, ауксотрофности, вирулентности, морфологии колоний, подобно н -мутантам грамнегатив-ных бактерий, характерна разобщенность центральной коровой и О-спе-цифической частей в ЛПС; 3/ указанные биологические особенности культур коррелируют с изменениями моносахаридного состава О-спё-цифической части, извлекаемой в виде ОСА; 4/ структура специфического полисахаридного компонента коровой части, гликолипида (в-ЛПС) у изученных штаммов возбудителя чумы более стабильна; 5/ для н-форм псевдотуберкулезных бактерий в отличие от 8 -форм также характерна разобщенная структура ЛПС и гомология с возбудителем чумы по моносахаридному составу его специфических полисахаридов; б/ разработан ускоренный способ выявления разобщенности центральной части и боковых цепей ЛПС у чумных и псездотуберкулез-ных бактерий по наличию альдогептозы непосредственно в экстрактах.

1У. АЛЛЕРГЕН ПЕСтН ПП - ЕЮТЕХНОЛОПШ И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКАЯ ПРИРОДА

Одним из разделов работы явились исследования, направленные на отработку биотехнологии и улучшение качества аллергена пестина ПП,

широко используемого как иммуиодиагностический препарат для постановки внугрикожной пробы (Коробкова и др., 1961; Самойлова и др., 1963, 1970; Девдариани и др., 1977; Филиппов и др., 1977). Вместе с тем изучение иымунохимической природы пестина тесно переплетается с исследованием углеводсодержащих компонентов ОСА и ЛПС чумного микроба, поскольку известно, что оба они в гаптенизированной форме входят в состав пестина ПП (Бахрах, Таранеико, 1968).

В процессе изучения оообенностей биотехнологии аллергена пестина ПП показано, что этот препарат, первоначально выделяемый из вакцинного штамма Е7 чумного микроба, может-быть изолирован также из его генетически родственной субкультуры ЕТ-2 (Ф1~, Т~) и из штамма К-1. Сравнительное изучение выделенных из этих культур чумного микроба пестинов показало, что по общему химическому составу, моносахаридному спектру и специфической биологической активности во внутрикожной пробе оба препарата почти не отличаются от стандартного пестина, выделяемого из штамма Е7 (ясные положительные реакции у вакцинированных шш перенесших контрольное заражение морских свинок наблюдались для Е7 - в 100, для ЕУ-2 - 93 и для К-1 - 96,6 % случаев).

На модели штампа ет показано, что в практике получения аллергена пестина ПП, помимо обычной периодической культуры чумного микроба, выращенной в аппарате АКЫ-Ш на агаре Хоттингера, можот быть использована культура второго смыва, получаемая при дополнительном подращивании без возобновления посева, а также культуры, выращенные на плотной питательной среде в процессе непрерывных многократных пересевов. Указанные методы культивирования обеспечивают получение не только качественного и стандартного по химическому составу и специфической активности аллергена пестина ПП, но, как известно, с успехом используются для производства живой чумной вакцины (Филиппов и др., 1969, 1982). Экспериментально установлено, что для выделения полноценного стандартного аллергена пестина ПП может

быть также использована биомасса чумного микроба, выращенная в двухфазной системе из мясных сред Хогтннгера (агар-бульон). Получаемая при таком способе "бифазная" культура полноценна и по синтезу основных антигенных компонентов - Ф1, ОСА, "мышиного" токсина и ЛПС. Эти исследования способствуют существенному повышению экономической эффективности и технологичности методик выделения антигенных препаратов.

Аналогичные результаты по содержанию в клетках указанных антигенных компонентов получены и для культуры штамма еу, выращенной на непищевой питательной среде из дрожжевых гидролизатов. Получаемая в этом случае на агаре из кормовых дрожжей биомасса чумного микроба полноценна по содержанию Ф1, ОСА, ЛПС и "мышиного" токсина и пригодна для получения стандартного аллергена пестина ПП (средние диаметры инфильтратов статистически не различались, Р>0,05).

Исследования по очистке от балластных веществ и выяснению физико-химической природы специфически активного начала пестина в плане стандартизации к улучшения его качеств выявили биологическую гетерогенность препарата, обусловленную различной физико-химической природой составляющих его компонентов. Было показано, что его фрагмент 1а, извлекаемый в процессе гель-фильтрации на сефадексе а-50, содержащий специфический полисахарид, несущий серологическую специфичность "основного" соматического антигена, имеет несомненное преимущество перед исходным пестиноы ПП. Оно заключается в демонстративности выявления кожной аллергической реактивности (Р< 0,05) у вакцинированных морских свинок, коррелирующей с приобретенной резистентностью к чуме. Указанный фрагмент пестина ГШ как более совершенный иммунодиагностический препарат с точки зрения повышения эффективности выявления уровня ишуноаллергической перестройки- организма при чуме предложен для внедрения в практику.

Проведение физико-химического анализа очищенного усовершенствованного пестина обнаружило его сложную диссоциативную природу,

выявляемую методами гель-фильтрации и изоэлектрофокусирования. По химическому составу диссоцианты, как » исходный пестиц, представляют собой кислотоустойчивые термостабшшше гликопептиды о молекулярными массами, находящимися в пределах 30^50 кД.

Выявленная кислотоустойчивая и термостабильная природа пес тина характерна, как известно, и для большинства бактериальных аллергенов белковой, полипептидной или комплексной (белок-полисахарид) природы, таких как туберкулин (ОкаДа е.а., 1963; Дегтяренко, Розанов, 1966), антраксин (Фрадкин, 1978), аллерген бруцеллезного (Ерунова, 1976) и туляремийного микробов (Рунова и др., 1973), энтеробактерий (Цуверкалов, 1961; Старикова, 1962; Маянский,1977) и холерного вибриона (Ефимов и др., 1975).

Вместе с тем, подтверждая высокую кислотоустойчивость аллер-генноактивных пептидов, выделенных из бактерий чумы, туляремии и сибирской язвы, В.Ф.Рунова показала, что эти компоненты клетки, участвующие в формировании аллергических реакций, устойчивы также и к щелочному воздействию. В связи с этим ею был разработан универсальный метод щелочного экстрагирования микробной масоы для получения стандартных аллергенов возбудителей особо опасных инфекций (Рунова, Гавриленкова, 1970).

Как показали наши эксперименты, биологическая активность пести-на, регистрируемая при помощи внутрикожной пробы, обусловлена полипептидной частью, разрушение которой происходит под воздействием протаолигического фермента проназы и сопровождается заметным (Р<0,001) снижением аллергенной активности препарата.

Таким образом, на основании проведенных исследований сделаны следующие выводы: I/ в процессе отработки биотехнологии аллергена пестина ПИ показана возможность выделения препарата из нескольких штаммов-продуцентов ( ст,Е7-2 и К-1), пригодность для получения биомассы различных способов культивирования (периодический и

много циклический), возможность использования непищевой питательной среда из гидролизата кормопых дрожжей; 2/ показана физико-химическая и иммунобиологическая гетерогенность аллергена пестина; 3/ путем гель-фильтрации на сефадексе G -50 из пестина ПП выделен очищенный углеводсодержащий препарат со специфичностью ОСА, более эффективно выявляющий во внутрикожной пробе иммуноаллергичёскую перестройку организма при чуме; 4/ установлена сложная кислотоустойчивая, диссоциативная природа очищенного пестина^ являющегося гликопептидом, у которого биологическая активность связана с белковой частью.

У. 1ШУН0ЫШ0ПШЖИЕ И ИММУКОХИМИЧЕСКИВ СВОЙСТВА УГЛЕШДСОДЕШАЩХ АНТИГЕНОВ

Для решения практических задач, стоящих перед иммунопрофилактикой чумы и псевдотуберкулеза, важно было материалы по физико-химической характеристике углеводсодержащих антигенов сопоставить с их ролью биологически активных биополимеров в развитии иммуно-<5иохимичоских.и патогенетических процессов в макроорганизме. Будучи компонентами R-липополисахарида, углеводсодержащие антигены чумного микроба, ОСА, ЛПС и препараты пестина, привлекают внимание исследователей в силу неослабевающего интереса широкого круга специалистов во всем мире к эндотоксинам, что связано о многообразием явлений и процессов, возникающих у животных и человека при их введении ( Kim, Chung, 1986; Nowotny е.а., 1986).

Как считают многие авторы (Джапаридзе, 1968; Walker, 1968; Мохин, 1970; Albizo, Surgalla, 1970; Butler е.а., 1973), тепло эндотоксину возбудителя чумы благодаря присущим ему свойствам, таким как пирогенность, летальная токсичность, феномен Шварцмана, гиперчувствительность, антигенность, принадлежит ведущая роль в патогенезе чумы. Пат.ш были проведены исследования, допол-

няющие и расширяющие представления об антигенных, токсических, аллергенных свойствах и некоторых других проявлениях биологической активности углеводсодержащих антигенов возбудителя чумы и псевдогубаркулёза.

Наши результаты изучения токсичности липополиаахаридов, изолированных из чумных (штаммы еу, 101/146, 102/14?) и псевдотуберкулезных бактерий (штаммы 56 и 70 в и -форме) путем экстрагирования смесью водного фенола, хлороформа и петролейного эфира в сопоставлении с ЛПС, полученным классическим водно-фенольныы методом, показали, что все препараты н-ЛПС независимо от способа экстракции обладали выраженной летальной токсичностью для белых мышей, характерной для эндотоксинов грамнегативных бактерий. Наблюдаемая при этом более низкая токсичнооть препаратов, полученных по методу Галаноса ( - 574 мкг), по сравнению с методом

Вестфаля (- 223 мкг), по-видимому, овязана с более низкой растворимостью их в солевом растворе.

В процессе изучения функций митохондрий, выделенных из печени и сердца белых крыс, нами было показано, что полноценный ЛПС из 3 -формы Т.рвеи<1о1;иЪегси1оз1а, так же как ОСА чумного микроба, несущий О-йпецифический материал, вызывает резкое угнетение дыхания митохондрий при использовании в качестве субстрата малата, <)- -кетоглютарата и цитрата. Подобные наблюдения о способности ЛПС изменять дыхание митохондрий у чувствительных к эндотоксину животных отмечены и для других микроорганизмов (Васильев и др., 1984). Проведенное нами более детальное исследование показало, что нарушение поглощения кислорода митохондриями вызывает компонент ОСА глкколептидной природы, имеющий сродство к антителам кроличьего типа.

Как известно, наличие выраженного иммунотропного эффекта объясняет широкое использование углеводсодержащих микробных анти-

генов в качестве "зонда" при исследовании разнообразных иммунологических явлений. Белки и полипептиды в отличие от тинуснезави-симых полисахаридных антигенов, как правило, способны специфически активировать Т-систему лимфоцитов, ответственных за реакции гиперчувствительности замедленного типа. С этих позиций легко можно объяснить выраженный митогенный эффект по отношению к тимоцитан мышей, наблюдавшийся нами под действием аллергенноактивных фракций чумного микроба пестина ПП и Ф1.

Изучение аллергенных свойств во внутрикожной пробе по величине кожной реакции и анализу гистологического материала показало, что по сравнению с пестином и Ф1 у препаратов ОСА и ЛПС проявляется слабая аллергенная активность.

В результате изучения антигенных свойств ОСА разработана схема получения специфической сыворотки путем иммунизации кроликов при внутривенном 5-7-кратном введении препарата в общей сложности в количестве 100-140 мкг.

Таким образом, углеводсодержащим антигенам чумного и псавдо-туберкулезного микробов присущи разнообразные иммунобиологические свойства - аллергенная и антигенная активность, летальная токсичность, способность ингибировать дыхание митохондрий и вызывать митогенный эффект по отношению к Т-лимфоцитам.

У1. ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАН® УГЛЕВОДСОДЕРШЩ АНТИГЕНОВ

Представленные нами результаты изучения физико-химических и иммунобиологических свойств очищенных углеводсодержащих антигенных субстанций чумного и псевдотуберкулезного микробов свидетельствуют в целом об их участии в выработке специфического иммунитета, сопровождающегося аллергическими проявлениями, коррелирующими с приобретенной резистентностью. В качестве иммунодиагностн-

чоского препарата для внутрикожной пробы нами предложен усовершенствованный углеводсодержащий аллерген пестин ПП.

В данной главе приведены результаты лабораторного изучения пестина усовершенствованного и испытания его безвредности и специфической активности на лодях, а также результаты использования этого препарата для изучения взаимоотношений кожной аллергической реактивности и резистентности к чуме у диких грызунов и для исследования имиуноаллергической перестройки в тесте ППН.

Испытание на лабораторных животных показало полную безвредность усовершенствованного пестина для белых мышей и возможность снижения дозы для внутрикожного введения морским свинкам по сравнению с применяемым ранее препаратом в 3-5 раз (с 300-500 до 100'мкг).

В плане внедрения пестина усовершенствованного в практику здравоохранения нами было проведено испытание препарата на группе добровольцев (45 человек, из них 8 - непривитые против чумы, а остальные 37 - вакцинированиые однократно, многократно, подкожно и накокно). Испытание показало безвредность и высокую специфическую активность аллергена. В этих же наблюдениях установлено, что использованная при внутрикожном введении доза равная 10 мкг, сниженная по сравнению со старым препаратом в 3-4 раза, должна быть подвергнута дальнейшей титрации. В последующих испытаниях пестина в ограниченных наблюдениях на 363 волонтерах доза препарата была снижена до 5 мкг. При введении такой минимально эффективной дозы в 88 % случаев*чёрез месяц после вакцинации регистрировалась

о

аллергическая перестройка у однократно вакцинированных 3-10 м.к. накожно при отсутствии положительных реакций у непривитых. Подтверждена возможность постановки внутрикожной пробы с пестином' не только шприцевым способом, но и с помощью безыгольного иньек-тора. В целом результаты наших испытаний на людях дают основание рекомендовать новый пропарат пестина для более широкого внедре-

ния в практику.

По данным В.М.Свистунова (Волгоградский ПЧИ), применение пес-тина усовершенствованного с целью проверки имнуноаллергической перестройки у вакцинированных людей в испытаниях на 550 волонтерах, включая и детей в возрасте от 2 до 15 лет, показало целесорбраз-нооть использования препарата во внугрикохной пробе для выявления иммунологической эффективности противочумной вакцинации. Состояние гиперчувствительности регистрировали через 3-6 месяцев (сроки наблюдения) в 60-65 % случаев. В основном преобладали реакции средней выраженности. Причем иммунизирующие дозы (1*10®, 2*Ю8 и З'Ю8 м.к.), способ вакцинации (шприцевой или безыгольный) и возраст (7-60 лет) привитых не влияли на частоту и интенсивность кожных реакций. В ответ на введение пестина у людей не наблюдалось лимфангоитов и каких-либо других осложнений.

Учитывая, что на современном этапе развития теоретической и прикладной иммунологии особую актуальность приобретает поиск и разработка дополнительных методов аллергодиагностики, исключающих введение в организм любого, даже максимально очищенного аллергена, нами была изучена возможность выявления специфической иммуноаллер-гической перестройки у вакцинированных претив чумы лабораторных животных и людей in vitro в тесте ППН. Как известно, такая диагностика характеризуется весьма существенными преимуществами - полной безвредностью, экспрессностью и создает условия для динамического наблюдения. В результате проведенных исследований показана принципиальная возможность использования пропаратов пестина ПП (традиционного и нового усовершенствованного) для выявления гиперчувствительности у вакцинированных против чумы лабораторных животных (48 морских свинок и 22 белые мыши) и людей (54 человека) в тесто ППН. -В процессе постановки пробы был предложен простой способ взятия крови с помощью микротитратора и отработана оптимальная рзбочая доза пестина (500 икг/мл). Полученные нами результаты

(средний индекс ППН у иммунизированных животных 0,4, у интакгных -менее 0,1) открывают перспективы использования показателя повреждений нейтрофилов в диагностических целях при зпизоотологическом обследовании природных очагов чумы.

Для оценки состояния эпизоотического процесса на энзоотичной по чуме территории, с нашей точки зрения, могло быть полезным также и знание особенностей аллергической перестройки у разных видов диких грызунов при инфицировании их бактериями чумы. Нами проведены исследования на больших песчанках и малых сусликах с использованием в качестве аллергена препаратов пестииа ПП и 01. У больших песчанок (í>00) наиболее отчетливая сенсибилизация, регистрируемая пробами на лапках, отмечалась к 01. Что касается малых сусликов (293), то состояние гиперчувствительности у них лучше выявлялось при внутрикожнои введении, причем не только Ф1, но и пестина ПП. Характерно, что положительные аллергические пробы наблюдались преимущественно у зверьков с антителами к 01. Таким образом, показано, что аллергические пробы в тестах ln vivo могут бить использованы для изучения происходящей аллергической перестройки у диких грызунов, имевших контакт с возбудителем чумы.

Препараты пестин ПП и Ф1 были с успехом использованы для изучения взаимоотношений аллергии и иммунитета при противочумной вакцинации в условиях нарушения нормального хода иммуногенеза. в опытах на морских свинках, иммунизированных штаммом ev чумного микроба в,¡условиях торможения иммуногенеза стрептомицином, подтверждено наличие тесной положительной корреляции между интеи-. сивносгыо кожных реакций на Ф1 и пестин ПП и резистентностью к чуме. В специальном опыте при одновременной постановке нескольких конных проб наблюдалось закономерное, на наш взгляд, ослабление интенсивности кожных реакций. Эту возможность снижения размеров кохно-аллергической реакции при одновременной постановке несколь-

них кожных проб с одним и тем же или разными аллергенами чумного микроба, безусловно, следует учитывать в практической работе.

Таким образом, результаты проведенных испытаний на людях во внутрикожной пробе дают основание рекомендовать усовершенствованный пестин для широкого внедрения в практику. Вместе с этим показана принципиальная возможность использования препаратов постина ПП для выявления гиперчувствительности у вакцинированных против чумы лабораторных животных и людей in vitro в тесте ППН. Полученные данные открывают перспективы использования показателя повреждения нейтрофилов в диагностических целях при эпизоотическом обследовании природных очагов чумы.

Обобщая весь представленный в работе материал, следует отметить, что результаты комплексного изучения углеводсодержащих антигенов чумного и псевдотуберкулезного микробов, касающиеся физико-химической природы, специфики моносахаридного состава у штаммов с разными биологическими свойствами и характеристики иммунобиологической активности, являются вкладом в разработку теоретических основ химической природы антигенной специфичности. Полученные результаты могут быть использованы в практической работе для характеристики полноценных и атипичных штаммов. Разработана методика аллергодиаг-ностики с препаратами пестина in vivo и in vitro. Наши данные открывают также перспективы дальнейшего широкого изучения молекулярной организации специфических полисахаридов с целью использования их как компонентов химических вакцин против чумы.

ВЫВОДЫ

I." У возбудителя чумы независимо от различий в биологических свойствах: ахрокогенности, антибиотикоустойчивости, ауксотрофнос-ти, вирулентности, формы колоний - и принадлежности к разным природным очагам выявлена единая структурная организация липог.олиса-

харида (ЛПС), при которой его специфические полисахаридные компоненты - "коровая часть" (и -ЛПС) и несущий О-специфичность "основной" соматический антиген (ОСА) самостоятельно функционируют в клетке и могут быть выделены в виде двух отдельных антигенных компонентов.

2. Показано, что проявление ряда биологических свойств возбудителя чумы коррелируют с изменениями в моносахаридном составе антигенов. У антибиотикоустойчивых культур (особенно с комплексной ус-тойчивоотью) и у ахромогенных вариантов наблюдается исчезновение или заметное снижение содержания отдельных углеводов; зти изменения касаются только несущего О-специфичность ОСА и коррелируют со снижением его серологической активности. У гладких вариантов дефектные изменения моносахаридного состава, сопровождающиеся снижением серологической активности, наблюдаются у обоих препаратов ОСА и ЛПС.

У ауксотрофных по аминокислотам, азотистым основаниям и витаминам иммуногенных мутантов констатирована полноценная по моносахаридно-му составу структура ОСА; в составе их моносахаридов впервые обнаружен неидентифицированный углевод типа 3,6-дезоксигексоз как маркер О-специфичности.

3. В отличие от 3-форм для н-форм псевдотуберкулезных бактерий, подобно возбудителю чумы, характерна разобщенная структура липополисахарида. Выявленное принципиальное сходство структурной

организации специфического полисахарида у препаратов ОСА и -форм в

чумных и псевдотуберкулезных бактерий открывает возможность использования последних как компонентов профилактических препаратов против чумы.

4. Научно обоснованы и разработаны новые методические приемы выделения, очистки и физико-химического анализа соматических антигенов чумного и псевдотуберкулезного микробов и их специфической

углеводной части, чю обусловило возможность получения стандартных высокоактивных антигенных препаратов ОСА и ЛПС. Разработан ускоренный способ выявления структурных особенностей липополисахари-да чумных и псевдотуберкулезных бактерий по наличию альдогепто-зы непосредственно в ТХУ-экстрактах, минуя стадию выделение, очистки и анализа препаратов. Методика может быть использована для изучения атипичных и переходных штаммов, отбора полноценных в антигенном отношении культур, пригодных для получения псевдотуберкулезных агглютинирующих сывороток.

5. Разработана научно обоснованная биотехнология углеводсодер-жзщего аллергенного препарата пестина ПП (полисахаридно-полипеп-тидного). Установлено, что для получения полноценного пестпна могут быть использованы различные штаммы-продуценты ( е7, еу-2 и К-1), способы культивирования (периодический, многоциклический) и питательные среды (агар Хоттингера и непищевая среда из гидро-лизата кормовых дрожжей).

6. Предложен способ получения очищенного аллергена пестина ПП путем колоночной гель-хроматографии. Показано, что новый пестин со специфичностью ОСА более эффективно выявляет во внутрикожной пробе . иымуггоаллергаческую перестройку организма'лри чуме, является гликопептидон, имеет кислотоустойчивую диссоциативную природу, характерную для большинства бактериальных аллергенов. Путем ферментативной модификации пестина показана ведущая роль его белковой части в проявлении аллергенной активности.

7. Установлена безвредность и высокая специфическая активность нового пестина в эксперименте на лабораторных животных и в испытаниях на людях. Б процессе проверки препарата на группе добровольцев (45.чел.) и в ограниченных испытаниях (363 чел.) показана возможность снижения дозы для внутрикоаного применения в 4-8 раз; при введении минимально эффективной дозы равной 5 мкг аллергиче-

екая перестройка регистрируется у 88 % однократно вакцинированных. Представлены материалы, свидетельствующие об использовании внутрикожной пробы с пестином для выявления сенсибилизации к чуме в природных очагах у малых сусликов.

8. Для выявления гиперчувствительности у вакцинированных лабораторных животных и людей in vitro разработана методика аллер-годиагностики в тесте ППН (показатель повреждения нейтрофилов).

9. Представлена характеристика иммунобиологических свойств углеводсодержащих антигенов. Показано, что все препараты R -ДПС чумного и псевдотуберкулезного микробов, изолированные разными способами, обладают выраженной летальной токсичностью. Выявлена способность компонента ОСА чумного микроба, проявляющего сродотво к антителам в -типа, угнетать дыхание митохондрий у восприимчивых к чуме животных; к данному компоненту#разработан оригинальный способ получения кроличьих сывороток. У препаратов пестина

и Ф1 в отличие от Т-независимого ЛПС установлен митогенный эффект по отношению к Т-лиифоцитам мышей.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ •

1. Тараненко Т.Ы., Боровикова Т.П., Филиппов А.Ф., Бахрах Е.З. Характеристика пестинов, выделенных из генетически родственных субкультур чумного микроба с различным антигенным спект-ром//Пробл. особо опасных инф.-1970.- Вып.6(16).- С.105-109.

2. Тараненко Т.М., Филиппов А.Ф., Андреева И.П. Иммунохимиче-ская характеристика культуры ЕВ чумного микроба, полученной

при повторном выращивании в АКМ-Щ на плотной.питательной среде //Пробл. особо опасных инф.-1971.-Вып.4(20).- С.62-66.

3. Дальвадянц С.М., Мартене I.A., Тараненко Т.М., Джапаридзе Ü.H. Некоторые свойства компонентов, выделенных из препарата "основного" соматического антигена//Пробл.особо опасных инф,-1972.- Вып.4(26).- С.17-20.

\

4. Тараненко Т.М., Дальвадянц С.М., Боровикова Т.П., Ковалев Й.Ф., Дернова B.C. Использовании ИК-спэкгроскогош дая изучения хгаягчэского состава антигенов чумного и псевдотубвркулезного юж-робов//Пробл.особо опасных инф.-1972.-Вып.1(23).- С.37-41.

5. Джапаридзе'М.Н., Мартене Л.А., Дальвадянц С.М., Егорова В.Д., Тараненко Т.М. Действие комплексных соматических антдгоиов чумного и псевдотуберкулезного микробов на дыхание митохондрий сердца и П9чени//Мз1тохондрш1.- М. :Наука, 1973.- С.94-97.

6. Тараненко Т.М., Вейнблат В.И., Бах pax Е.Э., Марнина З.Е., Орлова Л.С., Андреева И.П. Сравнительная характеристика соматических полпсахаридсодерзалщх антигенов, изолированных из штата ЕВ и его стрвптомициноустойчивого варианта// Антибиотики,- 1973.-

№ 3,- С.213-216.

■ 7. Белобородов P.A., Тараненко Т.М., Бахрах Е.Э., Филиппов А.Ф., Зубова М.В., '.Муравьева Н.К. Зависимость уровня кожной гзшер-чувствительности к компонентам пестина Ш от приобретенной' резистентности'к чуме у морских свинок//Пробл.особо опасных ен$.-1973,-ВШ1.5(33).- С.27-31. . .

8. Узенцов С.А., Кузнецова Л.И., Г.5ороз В.П., Филиппов А.Ф., Белобородов P.A., Тараненко Т.М. Кожная реактивность к аллергенам чумного микроба у иммунных морских свинок при одновременной постановке нескольких кожных проб//Пробл.особо опасных инф.-1973.-Еып.4(32).- С.62-67.

9. Тараненко Т.М., Филиппов А.Ф. Характеристика пестина Ш1, изолированного из вакцинных штаммов чушого микроба ЕВ и К-1//Пробл. особо опасных инф.- 1974.- Вып. 2(36).-С. 137-139.

10. Тараненко Т.М., Дальвадащ С.М., Андреева И.П. Очистка

и иммушшмичэское исследование лшополисахарида, изолированного из бескапсульногои атоксичного штамма чумного кпсроба//Пробл. особо опасных инф.- 1974.- Bmi.5(39).- С.49-52.

11. Белобородов P.A., Узонцов С.А., Тараненко Т.М. Кожная аллергическая реактивность при иммунитете к чумэ у морских свинок// Аллергия как сошгально-гигкегшческая проблема: Tp.CI.ffl.- Саратов, 1974.-. Т.89(106).-.С. 196-199.

12. Бахрах Е.Э., Тараненко Т.М., Вэйнблат В.И., Гольдфарб Л.М., Калинина З.Е. Особенности строения специфических полисахаридов чумных бактвркй//Тратий Всесовз.биохим.съезд: Реф.науч.сообц.-Рига, 1974.- Т.I.- С.167.

13. Боровикова Т.П., Бахрах Е.Э., Вейнблат В.И., Тараненко Т.М., Белобородов P.A. Иммунохимическоэ изучение соматических антигенов, выделенных из шташа ЕВ чумного микроба и его псевдотубар-кулезоподобвого варианта ЕВ^У/Вторая конф.Белорус.биохим. об-ва, посвящ. 1000-летию г.Витебска.- Витебск, 1974,- С.252-254.

14. Малинина З.Е., Муравьева Н.К., Дудкова В.К., Гольдфарб Л.М., Тараненко Т.М. Ахромогенный вариант живой чумной вакцины К-1//Пробл.особо опаоных инф.- 1974.-.Вып.5(39).- G.57-60.

15. Белобородов P.A., Тараненко Т.М., Бахрах Е.Э., Муравьева Н.К., Дудкова В.К., Филиппов А.Ф. Эффективность компонентов пестика Ш при определении корреляции аллергической реактивности и приобретенной резистентности к чуме//Пробл.особо опасных инф.-1974.-г Вып.6(40).- С.51-54.

16. Ковалев И.Ф., Тараненко Т.М,, Дернова B.C., Применение. ИК-спектроскопии для изучения структуры антигенов возбудителей особо опасных инфекций//Тез.докл.на 15 Перм. обл.. .. науч.. -техн. конф. по спектроскопии,- Пермь, 1976,- С.5-6.

17. Бахрах Е.Э., Вейнблат В.И., Тараненко Т.М., Дальвадянц С.М., Гольдфарб Л.М. Методы выделения и очистки соматических антигенов чумных бактврий//Нрофидакт. особо опасных инф.- Саратов,- 1976.-Вып.1,- С.131-139.

18. Узенцов С.А., Белобородов P.A., Исупов И.В., Иванов Н.Р., Тараненко Т.М. Некоторые способы оценки иммунологической эффективности живых чумных вакцин в эксперименте и на животных/Дригерия оценки иммунол. ■ эффектив. и безопасн. бак. вакцин: Тез.докл. на конф.- М., 1976,- C.I2I-I23.

19. Узенцов С.А., Зубова М.В., Филиппов А.Ф., Тараненко Т.М., Брандзишвский Ю.В.г Мороз В.П. Взаимоотношения кожной аллергической реактивности и резистентности к чуме у морских свинок при торможении иммуногенеза страптомипином//Профилакт.особо опасных инф.- Саратов, 1976.- Вып.1.- С.95-100.

20. Тараненко Т.М., Бахрах Е.Э., Степанов В.М. К характеристике специфических полисахаридов вирулентного штамма x.peatis и его ауксотрофных ыутантов//Тез.докл.У1 Всвсогаз.конф. по химии и биохимии углеводов,- М., 1977,- C.90-9I.

21. Тараненко Т.М., Бахрах Е.Э., Калинина З.Е., Андреева И.П. Особенности строения соматических антигенов, изолированных из вакцинных штаммов ЕВ и K-I и их ахротогенных вариантов//Профилахт. особо опасных инф.- Саратов, 1977.- Вып.З.- С.64-68.

22. Тараненко Т.М., Гольдфарб Л.М., Бахрах Е.Э., Андреева И.П. Иммунохимкчаская характеристика соматических антигенов, изолированных из культур, выделенных на территории Тедаен-Мургабского" шяду-рвчья//Профилакт. особо опасных тф.- Саратов: СГУ, 1977.- Бып.З.-С. 68-72.

23. Тарананко Т.М. „ Бахрах Е.Э., Гольдфарб Л.М., Андреева И.П. К характеристика липошшгеахарвдов, изолированных из культур, выделанных на Холмогорье Бадхыз//Пробл.особо опасных инф.- 1977.-Вып.6(58).- C.I7-20.

24. Дертева И.И., Бахрах Е.Э., Тараненко Т.М., Котгаша Т.А. Иммунохимичосков исследование R-специфического липополисахарвда холэрньа вибрпонов//Пробл. особо опасных инф,- 1977.- Вш.3(55).-С.45-48.

' 25. Вейнблат В.И., Болобородов P.A., Узенцов С.А., Тарананко Т.М., Бахрах Е.Э. Аллергенные свойства лшополнеахарода, "основного" соматического и капсульного антигенов чумных бактарий//Пробл. особо опасных инф.- 1977.- Выи.4(56).- С.20-23.

26. Бахрах Е.Э., Тараненко'Т.М., Гольдфарб Л.М., Земцова'И.Н., Классовский Л.Н., Кондрашин Ю.И., Машшна З.Е., Степанов В.М., Андреева И.П, Особенности строения соматических антигенов чумных бактарий//Пробл. о собо опасных инф,- 1977.- Вып.4(56).-С. 70-71.

27. Суров B.C., Суриков H.H., Тараненко Т.М„.Сравнительная ишунохимичеекая характеристика "основного" соматического'антигена, изолированного из оз- и • or -фор.» возбудителя чумы//Пробл.особо опасных инф.- 1978.-.Вып.3(61).- С.9-12. . .

28. Тараненко Т.М., Степанов В.М., Айкимбаев A.M., Ковалев И.'З., Дернова B.C. К характерпстике полисахаридсодершцих соматических антигенов, изолированных из штамма K-I чумного' микроба и его антя-биотикдустойчивых варяантов//Аятибкотиет.-1978.- Л.10,- С.918-922.

29. Узенцов С.А., Белобородов P.A., Пономарев Н.Г., Брандзксев-ский Ю.В., Шаманок Т.П., Зубова М.В., Сэроглазов В.В., Тараненко Т.М., Иванов B.C., Самарин Е.Г. Особенности аллергической реактив-

ности у больших песчанок к антигенам чумного микроба в экспери-ыенте//Состояние и перспективы профилакт.'чумы: Тез.докл. на Все союз. конф.-. Саратов, I978.-C.I73-I75.

30. Суров B.C., Тараненко Т.М. Сравнительное исследование липополисахаридов, продуцируемых os- и os-формами возбудителя чумы//Пробл.особо опасных инф.- 1979.- Вып.1(65).- С.5-8.

31. Суров B.C., Тараненко Т.М., Суриков H.H. Структура и физико-химическая характеристика "основного" соматического антигена, изолированного из B-форм возбудителя псевдотуберкулеза// Пробл. особо опасных инф.- 1979.- Вып.1(65).- C.9-I2.

32. Тараненко Т.М,, Андреева И.П. Исследование структуры и функции пестина Ш с помощью проназц/ДМЭИ.-1980,- .'« 4.-C.IÛ2-I03.

33. Суров B.C., Тараненко Т.М., Горшкова Р.П. Иымунохимическое изучение липополисахаридов, изолированных из' R-форм псевдотуберкулезных бактэрий//Иымунол.и иммунопрофшгакт. чумы и холеры: Тез.докл. на Всесоюз.конф.- Саратов,, 1980,- С.48-50.

34. Тараненко'Т.М., Гольдфарб Л.М., Степанов В.М., Наумов A.B., Андреева И.П. Формы диссоциации и структура соматических антигенов у чумного микроба//Иммунол.и иммунопрофилакт. чумы и холеры: Тез.докл.на Всесоюз. конф.т- Саратов, 1980.- C.3I-34. .

35. Ковалев И.Ф., Тараненко Т.М., Дарнова B.C., Наумов A.B. Использование ИК-спекгроскопии для изучения структуры бактериальных белков//Тез.докл. на 1У Всесоюз. конф. по спектроскопии биополимеров.- Харьков, 1981,- С.88-89.. . .

36. Филиппов А.Ф;, Девдариани З.Л., Тараненко Т.М., Белоборо-дов P.A., Узенцов С.А. Испнтание безвредности а специфической активности усовершенствованного пестина ПП у добровольцев.- Саратов, 1981,- 11с.- Деп.во ВНИИМИ МЗ СССР, К 4337-CI.- Реф. в: Мед. реф. журн.- Радд.-З.- 1981.- № 12.- 3773. . .

37. Узенцов СД., Шаыанек Т.П., Белобородов P.A., Пономарев Н.Г., Брандзишевский Ю.В., Сероглазов В.В., Тараненко Т.М., Иванов B.C., Самарин Е.Г., Речкина Г.Ф. Изучение аллергической реактивности у больших песчанок, зараженных возбудителем чумы//Патол. физиол. особо опасных инф.- Саратов, 1981,- C.I06-III.

38. Тараненко Т.М., Наумов A.B., Андреева И.П. К вопросу о мак рот л окулярной организации и физико-химической природе пасти-

на//Микробиол.' и биохимия возбудит, особо опасных инф.- Саратов, 1982.- С.33-36.

39. Тараненко Т.М., Гольдфарб Л.М., Наумов A.B., Андреева И.П. Особоняости строения соматических антигенов псевдотуборку-лезннх бактерий в н- и s -форкс/Л{м?лунол.и профшгакт. особо опасных инф.- Саратов, 1982,- С.43-49.

■40. Тараненко Т.М., Гольдфарб Л.М., Наумов A.B., Андреева -И.П. Ускоренный метод выявления структурных особенностей липо-полисахарида по наличию альдогептозы у бактерий чума и псевдо-туберкулеза//Лаб.дело.- 1982,- И 12.- С.46-47. . '

41. Тараненко Т.М., Гольдфарб Л.М., Наумов A.B., Андреева И.П., Дертева И.И., Веренков М.С. Ускоренный метод выявления особенностей структуры липополисахаридов у бактерий чумы и псевдотуберку-леза//7 Всесоюз.конф. по химии и биохимии углеводов: Тез.докл.-Пущяно, 1982.- С.115-116.

42. Девдариани З.Л., Филиппов А.Ф., Тараненко Т.М. Изучение иммуноаллергнческой перестройки организма привитых против чумы лабораторных животных с помощыо теста ППН//Профилакт.природно-очаговых инф.- Ставрополь, 1983,- C.I90-I9I. . .

■ 43. Дертева И.И;, Тараненко Т.М., Веренков М.С., Чижиньков А.П., Андреева И.П. Характеристика эталонных штаммов'псевдогу-беркулезннх микробов шести сороваров//Вопр.профилакт.природно-очаговых инф,- Саратов, 1983.- C.47-5I. . .

44. Узенцов С.А., Белобородов P.A., Ералдзишевский Ю.В., Серо-глазов В.В., Пономарев Н.Г., Филиппов А.Ф., Войнблат В.И., Тараненко Т.М. Аллергичоская реактивность-у иммунизированных и зараженных бактериями чумы малых сусликов.-1 Саратов", 1983.- 12с.-Деп. во ЕНИИМЙ МЗ СССР, № 6800-83.- Реф.в: Мед.реф. журп,-Разд. .3.-1983,- J5 12.- 3717.

■ 45. Тараненко Т.М., Филиппов А.Ф.,'Жемчугов В,Е., Андреева И.П. Иммунохимическая и иммунобиологическая характеристика "би-фазных" культур штамма ЕВ чумного микрэба//Акгуал. вопр. лаб. диагн. и биохимии возбудит, чумн и холеры,- Саратов, 1984.-С.47-53.

46. Тараненко Т.М., Войнблат В.И. Современные представления о структуре. О-соматичесного ачтягеяа чумного мшс|юба/Л1ммунохим. и лаб. диагн. особо опасных инф.- Саратов, 1985.- С.7-15.

47. Вейнблат В.И., Тараненко Т.М., Наумов A.B. Антигены возбудителя чумы: функции, выделение, структура//Достижения микробиологии -практике//Тез;УП съезда Всесоюз. микробиол. об-ва,-Алма-Ата, 1985,- Т.1.тС.9. , .

• 48. Тараненко Т.М., Суров B.C., Белобородов P.A., Пономарев Н.Г. Изучение токсических свойств лшополисахаридов, изолированных из чумных и псевдотуберкулезных-бактерий.- Саратов, 1985.-9с.-'Деп. в ШНИТИ 20.08.85, № 6122.- Реф.в: Рй Биология.-

1985.- 12Ц331 Деп. . .

49. Малинина З.Е., Тараненко Т.М., Дальвадянц С.М. Спектр антител и протективная активность сывороток кроликов, иммунизированных типичными и ахромогенными вариантами возбудителя чумы// Механизмы формирования иммунитета к особо опасным инф.- Саратов,

1986.- С.53-59.

■ 50. Девдариани З.Д., Филиппов А.Ф., Шиганоза Л.Б., Тараненко Т.М. Применение микротитратора "Такачи".для постановки теста * ШН//Лаб. дело.- 1986.- № 4.- С.240-242.

51. Боровикова Т.П., Тараненко Т.М., Филиппов А.Ф. К характеристике пестиков, выделенных из генетически родственных cyd- " культур штамма ЕВ чумного микроба с различным антигенным спектром.- Саратов, 1987,- 9с.- Деп. в ВИНИТИ 15.05.87, К 3469.-Реф.в:. КК Биология.- 1987.- 9Ц461 Деп. .

■52. Тараненко Т.М., Сердобинцев Л.Н., Андреева И.П., Наумов A.B. Физико-химическая и иммунохимическая характеристика специфического полисахарида чумного микроба//Тез.докл.на УШ Всесоюз. конф. по химии и биохимии углеводов.- Тбилиси, 1987.- C.I29.

нг SRfPS Тирйш /¿У яяия*£Л?±

Типография № 6 п-о „Полиграфист"