Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка методических подходов к генотипированию штаммов чумного микроба

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Разработка методических подходов к генотипированию штаммов чумного микроба"

На правах рукописи

ГАЕВА Анна Вячеславовна

РАЗРАБОТКА МЕТОДИЧЕСКИХ ПОДХОДОВ К ГЕНОТИПИРОВАНИЮ ШТАММОВ ЧУМНОГО МИКРОБА

03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

1 1 Г.1ар тг

Саратов -2012

005015144

005015144

Работа выполнена в ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научный руководитель:

Официальные оппоненты

Щербаков Анатолий Анисимович доктор биологических наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова» Минсельхоза Российской Федерации, заведующий кафедрой микробиологии, вирусологии и иммунологии

Замараев Валерий Семенович доктор медицинских наук, профессор,

ФКУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора, главный научный сотрудник лаборатории функциональной геномики'

Ведущая организация: ФКУЗ «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Защита состоится » 2012 г. в Д часов на заседании

диссертационного совета Д 208.078.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» (410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»

Автореферат разослан «^ » ^у_2012 г.

Кандидат медицинских наук

Булгакова Елена Германовна

Учёный секретарь диссертационного доктор биологических наук, старший научный сотрудник

Слудский А. А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Чума - одна из наиболее опасных инфекционных болезней человека На протяжении многих веков чумной микроб был причиной массовых эпидемий Документальные подтверждения о массовых поражениях людей во многих странах мира датируются с V века до нашей эры. И в настоящее время чума представляет реальную угрозу, так как является природно-очаговым заболеванием и периодически вызывает эпизоотии в 42 природных очагах Российской Федерации и ближнего зарубежья [Онищенко Г.Г., Кутырев В.В., 2004], а также в других странах мира. По данным ВОЗ в мире ежегодно регистрируется более 2000 случаев заболеваний человека чумой [Plague, WHO, 2009].

Возбудитель чумы обладает высокой фенотипической и генетической изменчивостью, отмеченной рядом исследователей, как для штаммов из разных природных очагов, так и для штаммов, циркулирующих в одном природном очаге [Anisimov А.Р. et al., 2004].

Зарубежные исследователи для внутривидовой дифференциации штаммов чумного микроба используют классификацию, предложенную R. Devignat (1951) Классификация основана на биохимических различиях (способности к ферментации глицерина, редукции нитратов и окислению аммиака) и историко-географическом происхождении штаммов. Согласно данной классификации штаммы чумного микроба распределяют на три биовара: antiqua (античный)' medievalis (средневековый) и orientalis (восточный). Эта классификация не учитывает разнообразие штаммов, выделяемых на территориях Центральной Азии Кавказа, Западной Сибири, Африки. Об этом свидетельствуют опубликованные в последние годы сведения о рамнозопозитивных слабовирулентных штаммах из природных очагов полевочьего типа Китая, которые D. Zhou et al. (2004) выделили в новый биовар microtus, а также ряд публикаций отечественных ученых описывающих разные подвиды чумного микроба из природных очагов на территории России и ближнего зарубежья [Тимофеева Л.А. с соавт., 1974- Елкин Ю.М. с соавт., 1977; Логачев Л.И., 1979; Вершинина Т.Н., 1986].

Классификация, принятая в 1985 г. на Всесоюзном совещании по таксономии чумного микроба, основана на фенотипических свойствах, вирулентности по отношению к лабораторным животным и ландшафтно-географической приуроченности штаммов. Согласно этой классификации все штаммы Yersinia pestis подразделяют на пять подвидов - основной и 4 неосновных (кавказский алтайский, гиссарский и улэгейский) подвида. Штаммы основного подвида с высоким эпидемическим потенциалом вирулентны как для диких, так и для лабораторных животных. Фенотипические характеристики штаммов основного подвида, выделяемых в разных природных очагах, различаются и соответствуют характеристикам какого-либо из биоваров: antiqua, medievalis, orientalis. Штаммы неосновных подвидов избирательно вирулентны для лабораторных животных, их эпидемическая значимость ниже, чем у штаммов основного подвида.

До с их пор широко используются методы индикации, идентификации типирования чумного микроба, основанные на определении различных фенотипических свойств. Нестабильность фенотипа затрудняет интерпретацию результатов, что может привести к ошибочным выводам. Бурное развитие молекулярной генетики в последнее время привело к разработке приемов детекции, идентификации и типирования микроорганизмов, основанных на анализе

структуры генома. Использование более стабильной основы позволит повысить точность индикации, идентификации и типирования штаммов чумного микроба и усовершенствовать фенотипические схемы классификации.

В то же время, каждый молекулярно-генетический подход обладает разной информативностью и еще не описан единственный метод, позволяющий эффективно проводить типирование и служить основой для совершенствования таксономии чумного микроба. Поэтому возникает необходимость в комплексном подходе к решению данной проблемы.

Существуют разные мнения по поводу алгоритмов типирования штаммов чумного микроба. Ю.А. Попов с соавт. (2009), проанализировав материалы по генетическому типированию предложили комплексный алгоритм из четырех этапов генодиагностического анализа штаммов Y. pestis: 1-й этап - определение видовой принадлежности штамма (дифференциация чумного микроба от близкородственных иерсиний) путем проведения моно- и мультилокусных ПЦР и плазмидного скрининга; 2-й этап - выявление и определение распространенности генов, ассоциированных с вирулентностью возбудителя с помощью моно- и мультилокусных ПЦР; 3-й этап - выяснение параметров структурной изменчивости генов вирулентности у штаммов Y. pestis различного происхождения методом секвенирования; 4-й этап - определение принадлежности штаммов к конкретному подвиду, биовару, природному очагу посредством моно-и мультилокусных ПЦР, мультилокусного VNTR анализа и секвенирования генов, кодирующих дифференциальные признаки.

Для повышения эффективности этого алгоритма важен правильный выбор ДНК - мишеней, набор которых может пополняться по мере их выявления и изучения. На основе анализа литературных сведений можно говорить о перспективности сочетания таких высокодискриминирующих методов, как метод вычитающего рестрикционного фингерпринтинга (ВРФ), основанный на полиморфизме длин рестрикционных фрагментов ДНК [Terletski V. et al., 2003, 2004], и метод мультилокусного VNTR анализа (ПЦР - VNTR, сиквенс-VNTR) [Сучков И. Ю. с соавт., 2002, 2004; Pourcel С. et al., 2004; Lowell J. et al., 2005; Li Y. et al., 2009]. ВРФ еще не применялся для типирования штаммов чумного микроба, а варианты VNTR анализа, апробированные на штаммах чумного микроба, обладают либо излишней (по-штаммовой), либо недостаточной (объединяющей штаммы разных подвидов в одну группу) дискриминирующей способностью.

Поэтому выбор ДНК мишеней с тандемными повторами, определяющими подвидовую и очаговую принадлежность штаммов весьма актуален. Сочетание методов, позволяющих судить о внутривидовых вариациях всего генома (вычитающий рестрикционный фингерпринтинг) и отдельных его локусов (VNTR анализ), позволит наиболее эффективно оценивать таксономическое положение изучаемых штаммов чумного микроба, выявлять их эволюционные связи, проводить паспортизацию штаммов.

Цель работы - разработка методических подходов для генетического типирования штаммов чумного микроба на основе VNTR анализа и метода вычитающего рестрикционного фингерпринтинга.

Задачи исследования:

1. Охарактеризовать штаммы чумного микроба, циркулирующие в природных очагах стран СНГ и Монголии, по наличию основных детерминант вирулентности и изучить их фенотипическое проявление. Подобрать штаммы,

полноцепные по составу детерминант вирулентности, на которых будет изучаться эффективность методов генетического типирования.

2. Выбрать потенциальные пары ферментов для проведения вычитающего рестрикционного анализа штаммов чумного микроба и вирулентных штаммов псевдотуберкулезного микроба Проверить эффективность выбранных пар рестриктаз на референтных штаммах.

3. Получить фингерприиты вычитающей рестрикции репрезентативной выборки штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов. Провести компьютерный анализ данных вычитающего рестрикционного фингерпринтинга и оценить эффективность дифференциации штаммов чумного микроба из разных очагов и вирулентных штаммов возбудителя псевдотуберкулеза.

4. Выявить новые вариабельные тандемные нуклеотидные повторы в геноме }'. pestis. Подобрать праймеры к обнаруженным областям с тандемными повторами и оптимизировать параметры амплификации этих областей.

5. Изучить вариабельность выявленных VNTR областей генома штаммов У. pestis разного происхождения и вирулентных штаммов У. pseudotuberculosis. Определить нуклеотидную последовательность фрагментов ДНК, содержащих вариабельные тандемные повторы.

6. Разработать способ VNTR-ПЦР дифференциации штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов с одновременным внутривидовым типированием штаммов чумного микроба. Разработать методический подход к мультиспейсерному сиквенс типированию для идентификации и генотипирования штаммов чумного и псевдотуберкулезного микроба.

7. Оценить эффективность использования метода вычитающего рестрикционного фингерпринтинга, разработанных мультиспейсерного сиквенс типирования и VNTR-ПЦР для дифференциации чумного и псевдотуберкулезного микробов, генетического типирования, усовершенствования схем классификации чумного микроба и эпидемиологического анализа штаммов чумного микроба разного географического происхождения.

Научная новизна работы

Получена характеристика штаммов У. pestis из природных очагов стран СНГ и Монголии по особенностям фенотипа и распространенности детерминант вирулентности - области пигментации и плазмиды кальцийзависимости. Показано, что в некоторых природных очагах (Дагестанский равнинно-предгорный, Зауральский степной и Волго-Уральский песчаный) циркулируют группы штаммов с повышенной частотой утраты детерминант вирулентности как хромосомнэй, так и плазмидной локализации.

Впервые получены молекулярные портреты штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов с помощью метода вычитающего рестрикционного фингерпринтинга и показана корреляция фингерпринтов штаммов чумного микроба с их подвидовой принадлежностью, а в ряде случаев- с очаговой принадлежностью.

Впервые на основе VNTR областей межгенных пространств A«iG-YP01967, YP01967-araE, YP0196I-YP01960 разработан способ мультиспейсерного сиквенс типирования штаммов чумного микроба, позволяющий проводить дифференциацию штаммов чумного и псевдотуберкулезного микроба и определять подвидовую. очаговую и мезоочаговуго принадлежность штаммов чумного микроба.

Показано, что разработанный способ мультиспейсерного сиквенс типирования эффективен при типировании штаммов псевдотуберкулезного микроба.

Теоретически обосновано и экспериментально установлено, что усовершенствование классификационных систем, основанных на феиотипических характеристиках, не всегда позволяющих четко определить принадлежность штаммов чумного микроба к очагу и мезоочагу, возможно на основе комплексного использования методов мультиспейсерного сиквенс типирования и вычитающего рестрикционного фингерпринтинга

Удачный выбор ДНК-мишеней и молекулярно-генетических методик, основанных на мультиспейсерном сиквенс типировании и вычитающем рестрикционном фингерпринтинга позволили охарактеризовать особенности генетической структуры таласских штаммов чумного микроба. Определено, что генотипы таласских штаммов имеют уникальную генетическую формулу по строению вариабельных участков /iu/G-YPOI967 и YP0196I-YP01960. В ходе кластерного анализа методом попарного невзвешенного группирования с арифметическим усреднением (UPGMA) определена наибольшая близость штаммов таласской группы к штаммам неосновных подвидов.

По результатам работы получен патент на изобретение, зарегистрированное в государственном реестре интеллектуальной собственности Российской Федерации: «Способ дифференциации чумного и псевдотуберкулёзного микробов с одновременной внутривидовой дифференциацией штаммов чумного микроба» №2332464.

Практическая значимость работы

Разработана VNTR-ПЦР, использующая в качестве ДНК-мишени hutG -YP01967 область, для дифференциации штаммов чумного и псевдотуберкулезного микроба и одновременного внутривидового типирования штаммов чумного микроба. Очевидно, что использование данного метода в практической работе учреждений Роспотребнадзора имеет экономическое преимущество.

По результатам работы составлены методические рекомендации: «Выделение и очистка геномной ДНК Yersinia pestis, пригодной для тонких молекулярно-биологических экспериментов», «Способ межвидовой и внутривидовой дифференциации патогенных иерсиний (Yersinia pestis, У. pseudotuberculosis) с определением их потенциальной вирулентности», одобренные Учёным советом и утвержденные директором Российского научно-исследовательского противочумного института «Микроб» (протоколы № 2 от 17. 04. 2007 г., № 7 от 12. 12. 2008 г., соответственно).

Положения, выносимые на защиту:

1. Для оценки эффективности методов генетического типирования создана референс-панель штаммов чумного микроба, отобранных из различных ландшафтно-географических областей, с полным набором детерминант вирулентности.

2. Метод вычитающего рестрикционного фингерпринтинга эффективен для внутривидового типирования штаммов чумного микроба. Подобранная комбинация эндонуклеаз рестрикции EcoRI - Paul позволяет получать молекулярные портреты штаммов чумного микроба, отражающие их подвидовую и очаговую принадлежность.

3. Мультиспейсерное сиквенс типирование на основе трех VNTR областей хромосомы: /таЮ-УР01967, YP01967-a™E, YPO1961-YPO I960 позволяет

дифференцировать штаммы чумного и псевдотуберкулезного микроба, определять подвидовую, очаговую и мезоочаговую принадлежность штаммов чумного микроба.

4. VNTR - ПЦР с праймерами TAN1-TAN2 дифференцирует штаммы чумного и псевдотуберкулезного микроба, а также штаммы чумного микроба, принадлежащие к разным подвидам и циркулирующие в разных природных очагах.

5. Кластеры генотипов, полученные методами вычитающего рестрикционного фингерпринтинга и мультиспсйсерного сиквеис типирования, полностью коррелируют с существующей подвидовой классификацией чумного микроба и показывают неоднородность большинства подвидов в соответствии с очаговой принадлежностью.

6. Генотипы штаммов чумного микроба Таласской группы, полученные методами вычитающего рестрикционного фингерпринтинга и мультиспейсерного сиквеис типирования, имеют существенные отличия от генотипов штаммов известных подвидов, что позволяет выделить их в отдельный внутривидовой таксон.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены на следующих конференциях: II Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Инфекции, обусловленные иерсиниями» (Санкт-Петербург, 2006); IX съезд Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007); X Всероссийская медико-биологическая конференция молодых исследователей "Человек и его здоровье" (Санкт-Петербург, 2007); Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Генодиагностика инфекционных заболеваний — 2007» («Молекулярная диагностика - 2007» Москва, 2007), Международная школа - конференция «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (посвященная 40-летию создания ГосНИИгенетика, Москва -Пущино, 2008), XII Всероссийская медико - биологическая научная конференция молодых исследователей «Фундаментальная наука и клиническая медицина» (Санкт-Петербург. 2009). Так же результаты исследования были представлены и доложены на ежегодных итоговых конференциях РосНИПЧИ «Микроб» (Саратов, 2005, 2006, 2007, 2008, 2009 гг.).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ, из которых 4 опубликованы в рекомендованных ВАК РФ изданиях.

Структура и объем диссертации

Диссертация представлена на 173 страницах машинописного текста, состоит из введения, главы обзора литературы, семи глав собственных исследований (в том числе, одной главы с описанием материалов и методов), заключения и выводов. Работа иллюстрирована 13 таблицами и 21 рисунком. Библиографический указатель содержит 163 источника, из них 51 отечественная и 112 зарубежных работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы. Работа выполнена на 214 штаммах Yersiniapestis и 68 штаммах Yersinia pseudotuberculosis (Государственная коллекция патогенных бактерий ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб»). Для работы были отобраны штаммы основного, алтайского, гиссарского. кавказского, улэгейского подвидов и таласской группы (в соответствии с классификацией, принятой на Совещании по таксономии и

номенклатуре чумного микроба в Саратове, 1985 г.) из соответствующих природных очагов чумы. Все исследования на штаммах чумного и псевдотуберкулезного микробов проводились в соответствии с требованиями Санитарных правил 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами HI групп патогенности (опасности)» и Санитарных правил 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней».

Методы. Микробиологические методы

Феиотипические свойства штаммов определяли в соответствии с рекомендациями руководства «Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней» (2009).

Признак пигментации (Hms) у штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов определяли, высевая взвесь 18-часовой агаровой культуры исследуемого штамма на поверхность полусинтетической среды с Конго красным (среда Hnsd).

Выделение геномной ДНК проводили лизоцим - фенольным методом с некоторыми модификациями и дополнениями [Terletski V. et al. ,2003]. Ггнетические методы

Скрининг плазмидной ДНК осуществляли по методике Kado С. и Liu S.-T. (1981).

Рестрикционный анализ осуществляли в соответствии с рекомендациями Маниатиса Т. с соавт. (1984). Для генетического типирования штаммов методом ВРФ и получения маркеров использовали эндонуклеазы рестрикции фирмы «MBI Fermentas» (Литва).

Вычитающий рестрикционный фингерпринтинг проводили согласно процедуре, описанной Terletski V. et al. (2003). Подбор пар ферментов рестрикции проводили с помощью компьютерной программы Gene Runner (V.3.00). Определение количества сайтов узнавания для ферментов вычитания проводили на известных нуклеотидных последовательностях геномов штаммов чумного микроба биовара Orientalis (С092, AL 590842), биовара Medievalis (KIM, АЕ 009952) и псевдотуберкулезного микроба IP32953 (NC_006155) представленных в базе данных NCBI GenBank.

Приготовление проб ДНК проводили согласно методическим указаниям 1.3.2569-09. «Организация работ лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности» (Москва, 2009).

Анализ геномов бактерий проводили с использованием нуклеотидных последовательностей генетической базы данных NCBI GenBank, программы Mega 4.0, алгоритма BLAST. Подбор праймеров осуществляли с помощью программы PrimerExpress. Праймеры синтезированы фирмами «Литех», «Биоссет» (Россия). ПЦР проводили в микропробирках объемом 0,6 мл на программируемых термоциклерах Терцик МС 2 («ДНК-технология». Россия) и БИС - 2 («Вектор», Россия).

Продукты ПЦР анализировали методом электрофореза в 1 - 3 % агарозном или 6% полиакриламидном гелях. Для документирования полученных результатов гели сканировали с помощью системы «GelDoc 2000» («BioRad», США).

Определение нуклеотидной последовательности ПЦР-образцов проводили на генетическом анализаторе модели "CEQ 8000"' (Beckman Coulter, США). В работе

использовали необходимый набор реагентов и расходных материалов согласно руководству к прибору, методикам подготовки проб и постановки ПЦР с "DTCS Quick Start Kit". Для проведения секвенировамия и обработки полученных результатов использовалось программное обеспечение "CEQ 8000 Series Genetic Analysis System Software v. 9.0", "MEGA 4.0".

Компьютерно — математические методы обработки экспериментальных данных.

Для обработки графических данных ВРФ анализа и кластеризации штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов использовали программу Quantity One v 4.5. («BioRad», CILIA). Для кластеризации штаммов чумного микроба с учетам полиморфизма аллелей исследованных трех VNTR областей использовали программу Mega 4.0. Группирование штаммов и построение дендрограмм проводили при помощи невзвешенного парно-группового метода (UPGMA).

Степень вариабельности локуса оценивали определением индекса разнообразия Нея (Nei's Diversity Index, Di) [Adair D.M. et al., 2000]. Оценку разрешающей силы системы типирования (Discriminating Power. D) производили по формуле, определяющей индекс Симпсона [Hunter P., Gaston M., 1988].

Результаты исследовании

Для определения эффективности методов молекулярного типирования нами подобрана и охарактеризована коллекция штаммов чумного микроба по признакам, ассоциированным с вирулентностью: пигментсорбции, зависимости роста от ионов Са2+, а также чувствительности к пестицину. Набор из 214 штаммов, циркулирующих в 39 природных очагах стран СНГ и 4 аймаках Монголии, включает практически все разнообразие штаммов чумного микроба, встречающихся на обозначенных территориях, а потому может быть использован при определении эффективности методов молекулярного типирования. Изученные штаммы неосновных подвидов, а также таласской группы проявляют высокую стабильность сохранения признаков, связанных с вирулентностью. Лишь небольшое количество штаммов неосновных подвидов утратило плазмиду кальцийзависимости. Штаммы основного подвида из разных природных очагов проявляют значительную разницу в стабильности сохранения признаков, связанных с вирулентностью и плазмидного состава. Выявлены природные очаги чумы (Дагестанский равнинно-предгорный. Зауральский степной, Волго-Уральский песчаный), в которых циркулируют группы штаммов с повышенной частотой утраты детерминант вирулентности (области пигментации и плазмидных репликонов).

Типированпе патогенных иерешшп методом вычитающего рестрикционного фингерпринтинга (ВРФ)

Вычитающий рестрикционный фингерпринтинг выбран нами из группы методов генетического типирования, основанных на полиморфизме длин рестрикционных фрагментов, как наиболее удобный для оценки внутривидового геномного полиморфизма штаммов (высокая разрешающая способность, воспроизводимость, относительно низкая стоимость). Существенным моментом в данном методе генетического типирования является подбор комбинации эндонуклеаз рестрикции, которая позволит получить оптимальную картину распределения фрагментов ДНК и обеспечит высокий уровень дискриминации между штаммами. Подбор эндонуклеаз рестрикции, которые могут быть использованы в качестве вычитающего ферменту проводили с применением

программы Gene Runner. Для анализа использовали последовательности генома штаммов биовара Onentalis (С092) и биовара Medievalis (KIM), представленных в базе данных NCBI GenBank. При тестировании 26 ферментов вычитания на референтных штаммах чумного микроба установлено, что наиболее удачные варианты фингерпринтов получались при использовании комбинации рестриктаз «детекции - вычитания» ficoRI - Paul.

Для выяснения гетерогенности ВРФ профилей у штаммов, относящихся к одному подвиду, но выделенных в разных природных очагах, нами проведен анализ 101 штамма чумного микроба. Сравнение полиморфизма фингерпринтов чумного и псевдотуберкулезного микроба проведено с привлечением 27 штаммов псевдотуберкулезного микроба. В результате проведенной работы были получены ВРФ профили штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов. Штаммы основного подвида, выделенные в различных природных очагах (Джейранчельский равнинно-предгорный, Ленинаканский, Присеванский, Тувинский (горные), Сарыджазский. Муюнкумский пустынный. Прикаспийский песчаный), формировали различные геноварианты, соответствующие отдельному природному очагу. Исключение составили штаммы Верхненарынского, Аксайского и Алайского очагов, которые обнаружили идентичные ВРФ профили (рисунок 1 и 2). При генотипировании 6 штаммов из Терско-Сунженского очага нами выявлено два геноварианта - один характерен для штаммов, относящихся к основному подвиду, а другой - штаммов кавказского подвида. Также различия в ВРФ профилях обнаружили штаммы из Северо-Приаральского, Мангышлакского (по 2 геноварианта) и Приаральско-Каракумского (3 геноварианта) очагов.

Рисунок 1 - ВРФ профили штаммов чумного микроба основного подвида из разных природных очагов.

1 - 7937, 2 - 10439, 3 - КМ872, 4 - 550, 5 - 4635, 6 - 1252, 7 - А1763, 8-111,9 -М1245, 10 - 106, 11 -М956, 12 - 88/134, 13 - 4/692. 14- 693, 15 -А1837. 16-И3205, 17 -1771. 18 - А744. 19 -М986, 20 - А1486. М - маркер X/ EcoRI+HindHI (фрагменты 564, 831. 947. 1375. 1584 п.н.)

Для штаммов алтайского подвида выявлены два типа ВРФ профилей: один геновариант включал штаммы из Алтайского горного очага, второй геновариант определен для штамма из Монголии. У штаммов улэгейского подвида также определено два геноварианта. которые коррелировали с природными очагами

Рисунок 2 - Схема ВРФ профилей штаммов чумного микроба основного (А) и неосновных (Б) подвидов из разных природных очагов.

1- 231(708) (Аксайский высокогорный), 2 - ИЗ 102 (Монголия), 3 - И3205 (Тувинский горный), 4 - КМ921 (С631) (Центрально-Кавказский), 5 - КМ872 (С527) (Джейранчель), 6 - КМ873 (С528) (Прикаспийский песчаный), 7 - М956 ( Волго-Урапьский песчаный), 8 - А1763 (Приаральско-Каракумский), 9 - И1270 (Забайкальский); Т - группа таласских штаммов, А — алтайский подвид. У — улэгейский подвид, Г - гиссарский подвид, К - кавказский подвид.

ВРФ профили штаммов псевдотуберкулезного микроба при использовании пары рестриктаз EcoRJ - Paul отличались по распределению фрагментов от ВРФ профилей штаммов чумного микроба. Коэффициент подобия между штаммами псевдотуберкулезного микроба (от 60%) оказался ниже, чем между штаммами чумного микроба (от 78%).

Таким образом. проведенный анализ штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов разного происхождения показал возможность внутривидовой дифференциации штаммов этих микроорганизмов методом вычитающего рестрикционного фингерпринтинга при эпидемиологическом анализе вспышек и завозных случаев инфекции. Кластерные группы ВРФ фингерпринтов соответствуют подвидам штаммов чумного микроба по фенотипической классификации.

Типирование патогенных иерсиний на основе четырех VNTR локусов

В настоящее время для исследования вида Y. pestis активно используется метод, основанный на анализе нескольких хромосомных локусов с вариабельным числом тандемных повторов (VNTR локусов), называемый MLVA [Le Flèche P. et al., 2001; Klevytska A. et al., 2001]. У выявленных в геноме чумного микроба 43 VNTR локусов в работе Klevytska А. с соавт. (2001) обнаружен различный уровень полиморфизма. Рядом исследователей подобраны различные комбинации VNTR локусов для генотипирования и филогенетического анализа [Сучков И.10. с соавт.. 2004; Lowell J. L. et al., 2007; Kingston J. et al., 2009: Li Y. et al., 2009]. Несмотря на высокую разрешающую способность данных систем генетического типирования, не всегда удается различать штаммы с одинаковым MLVA генотипом. В связи с этим, мы считаем целесообразным дополнение MLVA

секвенированием полученных аллелей. Ранее в нашей лаборатории при сравнительном ПЦР-скрининге /7U/G-YP01950 региона области пигментации чумного микроба у референтных штаммов пяти подвидов и таласской группы штаммов, а также штаммов У. pseudotuberculosis Mollaret I (I серотип) и А2526 (1 серотип) выявлены два вариабельных участка, содержащие VNTR последовательности: /ntfG-YP01967 (I VNTR), расположенный перед областью пигментации, YP0196I-YP01960 (III VNTR), расположенный в области пигментации [Сухоносов И. Ю., 2009]. Эти участки и, дополнительно, участок YP01967-oniE (II VNTR) по данным NCBI GenBank, содержат тандемные повторы, поэтому были проверены нами в качестве ДНК - мишеней при MST типировании.

В данной работе методом MST типирования с помощью праймеров TAN1-TAN2, HSI37—HSI38, HSI69-HSI70 натри VNTR области изучено распространение аллелей данных локусов и проведено типирование 170 штаммов чумного микроба, выделенных в 39 различных природных очагах стран СНГ и 4 аймаках Монголии. Также было исследовано 68 штаммов псевдотуберкулезного микроба, выделенных в разное время в различных географических регионах из разнообразных источников.

При изучении области hutG - YP01967 нами выявлено 20 аллелей в использованной выборке штаммов чумного микроба и 5 аллелей дополнительно при исследовании известных нуклеотидных последовательностей, депонированных в GenBank штаммов биоваров antiqua, medievalis, orientalis, microtus. На основе секвенирования данных аллелей у исследованных нами штаммов удалось провести дифференциацию на разных уровнях. Первый уровень - четкая дифференциация между видами Y. pestis и К pseudotuberculosis. Штаммы псевдотуберкулезного микроба отличаются от штаммов чумного микроба не только по количеству повторов первого и второго VNTR локусов I VNTR области и единичным нуклеотидным заменам в тандемных повторах, но и наличием уникальной вставки 363 п.н. между первым и вторым VNTR локусами этой области.

Второй уровень дифференциации - подвидовой. Для каждого подвида характерен свой набор аллелей. Штаммы основного подвида содержат только полные тандемные повторы. У штаммов основного подвида в первом локусе количество повторов варьировало от 4 до 9, во втором локусе всегда присутствовали 3 повтора; данная группа штаммов чумного микроба включала аллели IVN1 - IVN 6. Аллели всех штаммов неосновных подвидов отличаются от аллелей штаммов основных подвидов наличием разного количества неполных повторов. В зависимости от количества полных и неполных повторов у штаммов неосновных подвидов обнаружены разные аллели. Для штаммов алтайского подвида характерны аллели IVN 9, IVN 10, 1VN 11, для штаммов удэгейского подвида - аллели IVN 7, IVN 8, IVN 12. Штаммы гиссарского подвида несут аллели IVN 14 и IVN 15. У штаммов таласской группы выявлен характерный аллель IVN 13. Особенность аллелей штаммов, относящихся к кавказскому подвиду, состоит в присутствии IS 285 элемента во втором локусе у всех штаммов, кроме выделенных в Восточно-Кавказском высокогорном очаге. Для штаммов данного подвида определены аллели IVN 16, IVN 17, IVN 18, IVN 19, IVN 20.

Третий уровень дифференциации обеспечивает определение очаговой и мезоочаговой принадлежности. Ранее нами было показано, что каждому подвиду соответствует несколько аллелей I VNTR области. Установлена четкая корреляция

УЫТЯ аллелей с очаговой и мезоочаговой принадлежностью штаммов. Это касается в первую очередь штаммов неосновных подвидов, несколько в меньшей степени - штаммов основных подвидов.

Важно, что I УЫТЯ область расположена вне области пигментации, поэтому ее можно определить у всех выделяемых штаммов, в том числе и Нгщ" мутантов чумного микроба.

На основе I УЫТЛ области нами разработан способ дифференциации штаммов чумного и псевдотуберкулезного микроба и внутривидового типирования штаммов чумного микроба методом ПЦР. Полученные продукты амплификации разделяются в 3% агарозном или 6% полиакриламидном геле (рисунок 3). Принадлежность штамма к виду К./ж^м, конкретному подвиду и природному очагу определяют по размеру образовавшегося фрагмента ДНК. Для того чтобы интерпретация результатов была максимально простой предложен набор маркеров из фрагментов ДНК референтных штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов известного размера

' у

основной 3

Рисунок 3 - Электрофореграмма фрагментов ДНК, полученных при ПЦР анализе штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов разного происхождения с использованием праймеров TAN 1-TAN2 (3% агарозньтй гель). Ml, М2 - маркеры из фрагментов ДНК референтных штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов, г - штамм гиссарского подвида, а - штаммы алтайского подвида, у - штамм улэгейского подвида, к - штаммы кавказского подвида, «основной» - штаммы основного подвида из разных природных очагов.

Вариабельную область ! VNTR в MST системе дополняет II VNTR область (YPO1967 - агиЕ). Нами выявлены 6 аллелей этой области у штаммов чумного микроба, циркулирующих на территории стран СНГ и Монголии. Наиболее распространенным оказался IIVN 1 аллель. Введение этой области в MST систему усилило дифференцирующие возможности относительно штаммов основного подвида из Аксайского высокогорного очага, штаммов алтайского и кавказского

подвида, позволило различать штаммы кавказского подвида из Ленитканского горного и Терско-Сунжеиского низкогорного очагов.

Область III VNTR (YP01960 - YP01961) обладает достаточно высоким уровнем вариабельности для штаммов чумного микроба (выявлено 12 аллелей). Используя эту область как ДНК — мишень можно проводить подвидовую дифференциацию, но не такую четкую, как при использовании I VNTR области. В тоже время, аллели штаммов улэгейского подвида коррелировали с географическим регионом выделения. Отдельные аллели обнаружены нами для штаммов таласской группы, а также для штаммов основного подвида из Таукумского пустынного очага. Необходимость включения III VNTR области в MST систему вызвана как ее дополнительными возможностями для дифференциации штаммов из разных очагов, так и для усиления дифференцирующих свойств системы на мезоочаговом уровне.

Проведенный нами анализ показал, что в качестве ДНК - мишени максимальными дифференцирующими свойствами обладает hutG - YP01967 вариабельная область. Использование двух других областей повышает разрешающую способность метода, увеличивая количество аллелей, соответствующих очаговой и мезоочаговой принадлежности штаммов. Только сочетание трех VNTR областей в системе MST дает оптимальные результаты типирования. Индекс дискриминационной силы системы типирования штаммов чумного микроба с использованием MST метода с применением трех исследованных вариабельных областей оказался высоким и составил 0,83.

Впервые для каждого подвида (по фенотипической классификации) чумного микроба выявлены строго определенные MST типы, которые внутри подвидов дифференцируются в соответствии с очаговой и мезоочаговой принадлежностью (таблица 1). Использование предложенной MST системы с высокой степенью достоверности определяет источник происхождения изолята, дает возможность проводить быструю идентификацию свежевыделенных штаммов в чрезвычайных ситуациях.

Таблица 1. Распространение вьивленных генотипов чумного микроба разных подвидов по природным очагам

MST тип Формула генотипа Подвид Прнроднын очаг

1 IVN 1, IIVN 1, IIIVN 1 Основной Таукумский пустынный

2 IVN 1, IIVN 1, IIIVN 2 Основной Все очаги песчаночьего и сусликового типа (кроме 37, 38)

3 IVN 1, IIVN lb, IIIVN 2 Основной Прибапхашский пустынный

4 IVN 1, IIVN 1, IIIVN 3 Основной Кызылкумский пустынный

5 IVN 2, IIVN 1, IIIVN 3 Основной Забайкальский степной

6 IVN 2, IIVN 1, IIIVN 4 Основной -II-

7 IVN 2, IIVN 1, IIIVN 5 Основной Тувинский горный (Толайлыгский мезоочаг)

8 1УЫЗ, ПУЫ 1ЛПУЫ5 Основной Тувинский горный (Саглинский мезоочаг)

9 1УЫЗ, ПУЫ 1, ШУИ 7 Основной Сарыджазский высокогорный (Кокпакский мезоочаг)

10 1УЫЗ, ПУЫ 1а, Ш\ПМ 4 Основной Алайский высокогорный

11 1УЫЗ, ПУЫ 1а, ШУМ 5 Основной Аксайский высокогорный (Восточный Аксай)

12 3, П\ПМ 1а, ШУЫ 5а Основной Аксайский высокогорный (Центральный Аксай)

13 1УЫ 4, ПУЫ 1, ШУЫ 7 Основной Верхненарынский высокогорный (Болгартский мезоочаг)

14 1УЫ 5, ПУМ 1ЛИУЫ6 Основной Верхненарынский высокогорный (Акшийракский мезоочаг)

15 1УЫ 6, ПУЫ 1, ШУЫ 6 Основной Верхненарынский высокогорный

16 1УЫ 6, ПУЫ 1а, ШУЫ 5 Основной Аксайский высокогорный (Западный Аксай)

17 1УЫ 7, ПУМ 1, ШУЫ 4а Удэгейский Южно-Гобийский аймак, Монголия

18 ГУЫ8, ПУЫ 1, ШУЫ 5Ь Удэгейский Баян-Улэгейский аймак, Монголия

19 1УЫ 9, ПУЫ 1с, ШУЫ За Алтайский Алтайский горный (Кош-Агачский район)

20 1УЫ 10, ПУЫ 1с, ШУЫ За Алтайский Алтайский горный (Уландрик)

21 1УЫ 11,НУЫ 1с, ШУЫ За Алтайский Аймак Убурхангай, Монголия

22 1УЫ 12, ПУЫ 1, ШУЫ За Удэгейский Аймак Убурхангай, Монголия

23 1УЫ 13, ПУЫ 1, ШУЫ 8 Таласская группа Таласский высокогорный

24 1УЫ 14, ПУЫ 1, ШУЫ За Гиссарский Гиссарский высокогорный

25 1УЫ 15, ПУЫ 1,ШУЫ За Гиссарский -II-

26 1УЫ 16, ПУЫ 2, ШУЫ 2 Кавказский Восточно - Кавказский высокогорный

27 1УЫ 17, ПУЫ 2, ШУЫ 4 Кавказский Ленинаканский горный

28 1УЫ 17, ИУЫЗ, ШУЫЗ Кавказский Терско-Сунженский низкогорный

29 1УЫ 18, ПУЫ 2, ШУЫЗ Кавказский Присеванский горный

30 1УЫ 19, ПУЫ 2, ШУЫЗ Кавказский Зангезуро-Карабахский горный

31 1УЫ20, ПУЫ 2, ШУЫ За Кавказский Приараксинский низкогорный

Определение сиквенс типов на основе изученных вариабельных областей у штаммов псевдотуберкулезного микроба показало, что I УЫТЯ область штаммов

псевдотуберкулезного микроба состоит из двух локусов, как и у штаммов чумного микроба. Сравнение в программе BLAST аллелей штаммов, геномы которых представлены в GenBank, и анализ наших данных показали, что локус 1 содержит 2 повтора с заменой седьмого нуклеотида А на С во втором повторе, локус 2 -уникальную вставку 363 п.н., характерную для всех штаммов псевдотуберкулезного микроба и несколько повторов. Однако, в отличие от аллелей штаммов чумного микроба, повторы второго локуса часто содержат единичные нуклеотидные замены, что создает дополнительные вариации ачлелей данной области.

Среди изученных штаммов псевдотуберкулезного микроба по структурной организации региона hutG - aruЕ выделена группа штаммов, циркулирующих на холмогорье Бадхыз. Эти штаммы относят к 03 серотипу. ПЦР анализ показал, что у них, как и у остальных изученных штаммов 03 серотипа, отсутствуют гены YP01967 и cirtiE. С помощью праймеров TAN2 (из области межгенного пространства hutG - YP01967) и HSI61 (из области гена aruЕ) получены продукты ПЦР со всеми штаммами 03 серотипа и методом секвенирования определены границы делеции. Показано, что делеция не захватывает I VNTR область, но II VNTR область у данной группы штаммов отсутствует. Такая же делеция характерна еще для трех изученных штаммов 03 серотипа (Аст 2, Аст 207 и 343), выделенных в г. Астрахань и Карачаево-Черкесской области, соответственно.

Различия в структурной организации I VNTR области у исследованных штаммов псевдотуберкулезного микроба связаны не только с количеством и составом тандемных повторов, но с девятью единичными нуклеотидными заменами в уникальной вставке 363 п.н. Причем первые три замены встречаются только у штаммов 03 серотипа. Для того чтобы выяснить корреляцию сиквенс типов с географическим регионом или конкретной вспышкой нужны исследования свежевыделенных штаммов.

В аллелях II VNTR области штаммов псевдотуберкулезного микроба выявлены 15 нуклеотидных замен вне области повторов, которые отличают их от штаммов чумного микроба и между собой. Большинство штамшв псевдотуберкулезного микроба как и доминирующая группа штаммов чумного микроба, содержит всего два повтора. По количеству повторов (от 2 до 6) и нуклеотидным заменам внутри них в данной вариабельной области нами выявлено 6 аллелей. Учет нуклеотидных замен вокруг II VNTR области увеличивает число аллелей. У штаммов 03 серотипа, как уже упоминалось, эта область отсутствует, что позволяет легко отличать их от штаммов других серотипов.

При секвенировании III VNTR области штаммов псевдотуберкулезного микроба нами обнаружено 9 аллелей, различающихся по количеству повторов (от 2 до 11). Семь нуклеотидных замен и одна вставка нуклеотида увеличивают дискриминирующие качества этой области. Всего 2 повтора обнаружено у штамма, выделенного в Китае. Примечательно, что 11 повторов были характерны только для штаммов из Туркмении, выделенных па холмогорье Бадхыз. Среди бадхыхких штаммов выделяют еще и группу штаммов с тремя повторами. Такое же количество повторов обнаружено у трех штаммов 03 серотипа, выделенных в других областях. При этом для всех бадхызских штаммов нуклеотидные последовательности областей, окружающих тандемные повторы, идентичны и отличаются от последовательностей у штаммов 03 серотипа, выделенных в других

регионах. Таким образом, III VNTR области присущ полиморфизм как на уровне серотипов, так, вероятно, и на уровне географического распространения.

Индекс полиморфизма по изученным областям для штаммов псевдотуберкулезного микроба составил: для I VNTR - 0,6, для II VNTR - 0.5. для III VNTR-0,84.

По трем VNTR областям без учета единичных нуклеотидных замен вне повторов штаммы Mollaret I, 7Арм„ 3(71), выделенные в разных местах, имеют одинаковый генотип, но, учитывая единичные нуклеотидные замены, штамм 3(71) отличается от двух других. Штаммы, принадлежащие к одному серотапу, выделенные в одном регионе, имеют одинаковый MST тин (включая и единичные нуклеотидные замены). Это, например, штаммы, выделенные в Алма-Ате: А5, А17, А2526 и группа штаммов, выделенных во Владивостоке: 10В, 312, 50-73,15-73, а также бадхызские штаммы 03 серотипа, образующие группы из двух MST типов. Штаммы 03 серотипа из Астрахани с тремя повторами имеют одно отличие в нуклеотидной последовательности от бадхызских штаммов.

MST типирование штаммов псевдотуберкулезного микроба на основе трех изученных VNTR областей обладает высокими дискриминирующими свойствами и позволяет выяснять серотип и географическую область распространения штаммов.

Таким образом, полученные на основании поиска in silico данные о ранее не использованных для генетического типирования VNTR областей генома чумного микроба hutG - YP01967 (I VNTR), расположенной перед областью пигментации; YP01967 - aruE (II VNTR), YP01961-YP01960 (III VNTR), расположенных в области пигментации, позволили разработать праймеры для их амплификации и обнаружить разную степень вариабельности изучаемых локусов у изолятов как чумного, так и псевдотуберкулезного микробов из географически отдаленных областей. Анализ полученных данных показал, что использование комбинации трех изученных областей обеспечивает высокую разрешающую способность для генетического анализа и типирования штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов. Значительное разнообразие аллелей каждого локуса и их комбинации позволяют добиться большой точности в определении степени генетического родства изучаемых штаммов.

Сравнение фенотнпическнх и генотнпнческнх схем классификации чумного микроба.

Сопоставление результатов проведенного генетического типирования методами ВРФ и MST с использованием трех изученных вариабельных областей с фенотипическими классификационными схемами вида Y.pestis показало, что штаммы каждого неосновного подвида, как и штаммы из разных природных очагов, принадлежащих к одному подвиду, демонстрировали отдельный MST тип. Для штаммов основного подвида определены MST 1-16 типы, штаммы алтайского подвида отнесены к MST 19-21 типам, для штаммов гиссарского подвида установлены MST 24 и MST 25 типы, штаммы удэгейского подвида принадлежали MST 17, 18, 22 типам, а штаммы кавказского подвида-MST 26 -31.

Особое внимание привлекает группа штаммов из Таласского высокогорного очага, которая не включена в существующую отечественную классификацию вида Y. pestis. Штаммы таласской группы из Бешташского участка Таласского высокогорного очага имеют MST генотип, близкий но не идентичный MST генотипам штаммов неосновных подвидов, сразу по двум вариабельным областям. Результаты MST и ВРФ типирования и характерный фенотип (глицериннозитивны,

рамнозопозитивны, вирулентны для белых мышей и авирулентны или слабо вирулентны для морских свинок) позволяет говорить об этой группе штаммов как об отдельном внутривидовом таксоне.

На основе полученных данных по вариабельности трех VNTR областей построена дендрограмма, отражающая генетическое родство изученных штаммов. Как видно на рисунке 4. штаммы чумного микроба распределились на две основные ветви: верхнюю, включающую штаммы основного, гиссарского, удэгейского, алтайского подвидов и группу таласских штаммов и нижнюю, в которую вошли штаммы только кавказского подвида. Всего определено 7 крупных групп. Первая группа содержит штаммы основного подвида из очагов степных и пустынных зон, а также равнинно-предгорных и горных очагов Кавказа. Вторая группа включает штаммы основного подвида из Забайкальского степного, Тувинского горного, Аксайского и Алайского высокогорных очагов. Третья группа представлена штаммом удэгейского подвида из Южно-Гобийского аймака Монголии. В четвертую группу вошли штаммы основного подвида из высокогорных очагов: Сарыджазского. Верхненарынского и Аксайского. Пятая группа включает штаммы неосновных подвидов: алтайского, гиссарского, удэгейского подвидов, а также штаммы кавказского подвида из Восточно-Кавказского высокогорного очага. Шестая группа содержит только штаммы, выделенные на территории Бешташского участка Таласского очага. Кластеризация штаммов по данным MST анализа выделяет штаммы из Таласского очага в отдельную ветвь. В то время как штаммы из Гиссарского, Алтайского очагов и Монголии (удэгейской подвид) представляющие соответствующие неосновные подвиды входят в одну крупную группу и проявляют большее родство между собой, чем с таласскими штаммами. В седьмую группу вошли штаммы кавказского подвида из Присеванского горного, Приараксинского низкогорного, Зангезуро-Карабахского горного, Терско-Сунженского низкогорного и Ленинаканского горного очагов. Своеобразие штаммов кавказского подвида, которое ранее соотносилось, прежде всего, с отсутствием плазмиды пестициногенности и чувствительностью к пестицину, проявилось и при MST анализе, отделяя эти штаммы от остальных в самостоятельную ветвь. Кластеризация штаммов чумного микроба по данным MST анализа с использованием трех изученных VNTR областей отражает деление сначала на подвиды (основной - неосновные), затем на очаги и мезоочаги, показывая с одной стороны генетические различия, с другой -генетическую близость отдельных групп.

3174 МЧМ1 М9Д4

природ И blil очаг

ЛЖКНЙ IIVI I ЫИШ.1Й

II II чара. [ 1.СШ- Кн(М м мскч Прнаральскн-Каракумт Маш МШ.1ЯКГКИЙ пустит

Сспсро-Приари.и.ский »vi ( атро-ИрнирямскпИ (fvc VciHipu-Kiif

Jaypa.iMKuft cfriiuoii

i3Vp'4.ILCKilii С1СЛ1ЮЙ

B0;)I0-УраЛЬСКИИ IICC Во.нГс Уральский нос

Дал'йрактельскяй ряннпнпй-аргмоупмИ Джсйрнпчсльский рапшшпо-нрс.иnpiu.iil

Ми.:1 ь< ко- Кяриба хс ки »

К'обмп аискпи рашпшш.-прси ирный

11.WXS

ИЗООХ 2i

С092 (СспНлпк)

катз >»

й рипиишм-прс.иорпый wiopnuu

Нриараксинский ннжмтрный I грскп-Супжеигкш) няжо горный Терски-Сунженский шикогорнын

Цпи ралмнс-Канкязскнй кмсакпшриый Пркбалхишскнй пуоыннмй Гаукумск ий ir

Забайкальский стенной Лксийскнн высокогорный Лксанский высокогорный Тувинский Iliplll.n'l ЛлаЙСкПП ВЫСОКО! орпый VlXMCKUH КЫСОКОПфНЫЙ

Mo«

чч. Кинп.У г,

ЧЮОКОиВэдк)

Монголия, Южно-Гобнискнм аймак Керхшшармнскнй иысокоюриый ВсрХНСНЯрЫИСКНЙ 11ЫСОК01 opllblii Сярыажак'ккй высокогорный Исрунснирыпсьия имсокшарпын Всрмюнярыискни КЫСоКОГОриМЙ Гисгзрскнй высокогорный Гиесарскнй пысокогори ы й Косш'ПкьКаякаккии высокшорпый )4iio-ICaiKijcKiiji высокогорный

ЛЛТйМСКИМ горный Л.1 ЩЙСКИ)! горный Алтайски й гор им и Таласский нысокш ирный Таласский высокш орпый Приссианский трный I Ipiicesu иски н парный Приараксниский нижшорный Прилракгимгкнц шокогорный Чпнпмури-Карнйахск-нй i орта и Jnur «vpo-KapafiavcKBii трный

алтайский алтайский

Рисунок 4 - Дендрограмма генетического родства и MST типы штаммов чумного микроба на основе трех изученных VNTR областей.

При использовании метода MST определены характерные генотипы для штаммов чумного микроба, которые позволяют проводить внутривидовую дифференциацию вида Г. peslis, устанавливать подвиды, а также проводить генетическое типирование штаммов из отдельных природных очагов и, в ряде случаев, мезоочагов, определяя с высокой степенью достоверности источник происхождения изолята. Подготовлены последовательности ДНК штаммов чумного микроба разного происхождения для создания компьютерной базы данных. Различия в составе данных участков у штаммов, относящихся к разным подвидам и выделенных из разных природных очагов, обеспечивают внутривидовую классификацию штаммов чумного микроба па генетическом уровне и возможность быстрой идентификации свежевыделенных штаммов в чрезвычайных ситуациях.

Таким образом, результаты, полученные с использованием двух предложенных методов молекулярного типирования (ВРФ и MST) подтверждают фенотипическую классификацию, подразделяющую штаммы чумного микроба на подвиды и открывают перспективы ее усовершенствования.

Подводя итоги выше сказанному, можно утверждать, что сочетание методов, определяющих внутривидовые вариации всего генома (вычитающий рестрикционный фингерпринтинг) и отдельных его локусов (VNTR анализ), позволяет наиболее эффективно оценивать таксономическое положение изучаемых штаммов чумного микроба. В эпидемиологических исследованиях применение данного сочетания позволит проводить паспортизацию штаммов, выявлять геномный полиморфизм штаммов чумного микроба из разных природных очагов. Разработанная MST система не исключает дополнение другими ДНК-мишенями, увеличивающими ее типирующие свойства в отношении очаговой принадлежности штаммов из очагов сусликового и песчаночьего типа и мезоочаговой принадлежности из зарубежных очагов, а также определения наличия факторов вирулентности у исследуемых штаммов, а значит и степени их опасности.

ВЫВОДЫ

1. Предложенная референс-панель штаммов чумного микроба из природных очагов стран СНГ позволяет оценивать эффективность методов генетического типирования.

2. Впервые проведен анализ штаммов чумного микроба с использованием метода вычитающего рестрикционного фингерпринтинга. Полученные фингерпринты распределяют штаммы на группы, соответствующие подвидам по фенотипической классификации, и очаговой принадлежности. Показаны высокие дискриминирующие способности метода в определении очаговой принадлежности штаммов основного подвида.

3. Разработан методический подход мультиспейсерного сиквенс типирования, позволяющий проводить идентификацию, определение подвида, очаговой и мезоочаговой принадлежности штаммов чумного микроба и внутривидовое типирование штаммов псевдотуберкулезного микроба. Оптимальные дискриминирующие свойства установлены для штаммов неосновных подвидов и штаммов основного подвида из природных очагов Западной Сибири и Тянь-Шаня.

4. Разработана монолокусная УЫТЯ - ПЦР, которая позволяет одновременно дифференцировать штаммы чумного и псевдотуберкулезного микроба, определять подвидовую и очаговую принадлежность штаммов чумного микроба.

5. Применение вычитающего рестрикционного фингерпринтинга и мультиспейсерного сиквенс типирования позволяет эффективно оценивать таксономическое положение изучаемых штаммов чумного микроба, проводить паспортизацию штаммов, выявлять геномный полиморфизм штаммов чумного микроба из разных природных очагов. Каждому подвиду и таласской группе штаммов соответствуют строго определенные генотипы.

6. С помощью мультиспейсерного сиквенс типирования и вычитающего рестрикционного фингерпринтинга получены генетические доказательства обособленности штаммов таласской группы от штаммов известных подвидов и возможности выделения этой группы в отдельный внутривидовой таксон.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Гаева А.В., Видяева Н.А., Проценко О.А., Кутырев В.В. Особенности штаммов Yersinia pseudotuberculosis, выделенных в различных природных очагах // Проблемы особо опасных инфекций. - 2002. - № 1(83) - С 5 14 (журнал из перечня ВАК).

2 Гаева А.В., Анисимова Л.В., Киреев М.Н, Булгакова Е.Г., Кутырев В В Изучение типирующих возможностей метода вычитающего рестрикционного фингерпринтинга для штаммов чумного микроба // Инфекции, обусловленные иерсиниями: Матер. II Всерос. науч. - практ. конф. - С-Петербург, 2006 - С 61-62

3 Булгакова Е.Г., Гаева А.В., Сухоносов И.Ю., Краснов Я.М., Гусева Н.П., Киреев М.Н., Анисимова Л.В., Новичкова Л.А., Кутырев В.В. Молекулярно-генетические портреты штаммов возбудителя чумы // Матер. IX съезда Всерос. науч.-практ. об-ва эпидемиол., микробиол. и паразитол. - М., 2007,-Т.З. - С. 17-18

4 Булгакова Е.Г., Гаева А.В., Сухоносов И.Ю., Краснов Я.М., Гусева НП Анисимова Л.В., Новичкова Л.А., Кутырев В.В. Разработка способа дифференциации чумного и псевдотуберкулезного микробов с одновременной внутривидовой дифференциацией штаммов чумного микроба II Генодиагностика инф. болезней (Мол. диагностика): Матер. VI Всерос. науч.-практ конф -

М„ 2007.-Т. 1.-С. 353-354. '

5. Гаева А.В, Булгакова Е.Г., Сухоносов И.Ю., Краснов Я.М., Гусева НП Анисимова Л.В., Новичкова Л.А., Кутырев В.В. Индикация и внугривидовм дифференциация вирулентных и авирулентных штаммов Yersinia pestis // Вестник российской военно-медицинской академии. - СПб., 2008 - № 3(23) Приложение 2. - Ч. II. - С. 322. "

6. Булгакова Е.Г., Краснов Я.М., Гаева А.В., Сухоносов И.Ю., Гусева Н П Анисимова Л.В., Новичкова Л.А., Кутырев В.В. Молекулярное типирование штаммов чумного микроба разного происхождения // Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными заболеваниями на территории государств участников СНГ: Матер. IX Межгос. науч.-практ конф государств - участников СНГ. - Волгоград, 2008. - С. 40-42.

7. Гаева А.В., Булгакова Е.Г. Использование метода вычитающего рестрикционного фингерпринтинга для типирования штаммов чумного микроба //

енетика микроорганизмов и биотехнология: Матер. Междунар. школы-конф посвященной 40-летию создания ГосНИИгенетика. - Москва - Пущино, 2008. -С. 119" 120.

8. Булгакова Е.Г., Гаева А.В., Сухоносов И.Ю., Краснов Я.М., Гусева НП Кутырев В.В. Способ дифференциации чумного и псевдотуберкулезного микробов с одновременной внутривидовой дифференциацией штаммов чумного микроба. RU, № 2332464 С1, опубл. 27.08.2008, Бюл. № 24.

9. Гаева А.В. Мультилокусный сиквенс VNTR анализ штаммов чумного микроба полевочьей разновидности // Материалы XII Всероссийской медико-биологическои науч. конференции молодых исследователей «Фундаментальная наука и клиническая медицина». - Санкт-Петербург. 2009. - С. 80

10. Гаева А.В., Булгакова Е.Г., Киреев М.Н., Анисимова Л.В., Новичкова Л.А., Кутырев В.В. Внутривидовая дифференциация и определение очаговой принадлежности штаммов чумного микроба методом вычитающего рестрикционного фингерпринтинга II Проблемы особо опасных инфекций. -2010. - № 4 (106). - С.28-31 (журнал in перечня ВАК).

11. Гаева А.В., Булгакова Е.Г., Сухоносов И.Ю., Анисимова Л.В., Новичкова JI.A., Кутырев В.В. Идентификация и внутривидовое типмрованне штаммов чумного микроба с определением их потенциальной вирулентности методом ПЦР // Проблемы особо опасных инфекций. - 2011. - № 2 (108). - С.36-41(журнал из перечня ВАК).

12. Булгакова Е.Г., Краснов Я.М., Гаева А.В., Сухоносов И.Ю., Анисимова Л.В., Новичкова Л.А., Гусева Н.П., Кутырев В.В. Особенности проявления признака пигментации и структурные различия генов hms оперона у штаммов Yersinia pestis и Yersinia pseudotuberculosis разного происхождения И Проблемы особо опасных инфекций. - 2011. - № 2 (108). - С.30-35(журнал из перечня ВАК).

13. Гаева А.В., Булгакова Е.Г., Краснов Я.М., Сухоносов И.Ю., Анисимова Л.В., Новичкова Л.А, Кутырев В.В. MST типирование штаммов Yersinia pestis разного происхождения II Современные технологии обеспечения биологической безопасности: Матер, науч. - практ. школы - конф. молодых ученых и специалистов науч.-исслед. организаций Роспотребнадзора. - Оболенск 2011 -С.98-100.

Подписано к печати 6.02.12. Формат 60x84 1/16. Бумага офисная. Печать офсетная. Гарнитура Тайме. Усл. п. л. 1,0. Тираж 100 экз. Отпечатано на полиграфическом оборудовании ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. 410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гаева, Анна Вячеславовна, Саратов

61 12-3/786

ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО НАДЗОРУ В СФЕРЕ ЗАЩИТЫ ПРАВ ПОТРЕБИТЕЛЕЙ И БЛАГОПОЛУЧИЯ ЧЕЛОВЕКА ФКУЗ РОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ПРОТИВОЧУМНЫЙ ИНСТИТУТ «МИКРОБ»

На правах рукописи

ГАЕВА Анна Вячеславовна

РАЗРАБОТКА МЕТОДИЧЕСКИХ ПОДХОДОВ К ГЕНОТИПИРОВАНИЮ ШТАММОВ ЧУМНОГО МИКРОБА

03.02.03 - микробиология

диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: кандидат медицинских наук Е.Г. Булгакова

Саратов-2012

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ 4

ВВЕДЕНИЕ 5

ГЛАВА 1 .ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 13

1.1 .Методы генотипирования бактерий. 13

1 ^.Идентификация и генотипирование патогенных иерсиний. 24

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 38

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 38

2.1 .Бактериальные штаммы 3 8

2.2.Питательные среды, препараты и реактивы 52

2.3.Методы исследований 54

2.3.1. Бактериологические методы 54

2.3.2. Генетические методы 55

2.3.3. Методы статистической обработки материала 59 ГЛАВА 3. ФЕНОТИПИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММОВ 61 ЧУМНОГО И ПСЕВДОТУБЕРКУЛЕЗНОГО МИКРОБОВ ПО ПРИЗНАКАМ, СВЯЗАННЫМ С ВИРУЛЕНТНОСТЬЮ

ГЛАВА 4. ТИПИРОВАНИЕ ПАТОГЕННЫХ ИЕРСИНИЙ МЕТОДОМ 72 ВЫЧИТАЮЩЕГО РЕСТРИКЦИОННОГО ФИНГЕРПРИНТИНГА

4.1. Выбор потенциальных пар эндонуклеаз рестрикции для 73 вычитающего рестрикционного фингерпринтинга патогенных иерсиний

4.2. Изучение дискриминирующих возможностей метода вычитающего 75 рестрикционного фингерпринтинга при использовании EcoRI - Paul

пары эндонуклеаз рестрикции

4.3. Паспортизация штаммов чумного микроба различного 78 происхождения на основе вычитающих рестрикционных фингерпринтов

4.4. Компьютерный анализ данных вычитающего рестрикционного 82 фингерпринтинга штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов ГЛАВА 5. ТИПИРОВАНИЕ ПАТОГЕННЫХ ИЕРСИНИЙ НА ОСНОВЕ 87

ЧЕТЫРЕХ VNTR ЛОКУСОВ

5.1. Поиск новых вариабельных областей генома чумного микроба 87

5.2. ПЦР - VNTR анализ штаммов чумного микроба разного 90 происхождения и вирулентных штаммов псевдотуберкулезного микроба

5.2.1. Изучение вариабельности I VNTR области у штаммов чумного и 91 псевдотуберкулезного микробов

5.2.2. Изучение вариабельности II VNTR области у штаммов чумного и 96 псевдотуберкулезного микробов

5.2.3. Изучение вариабельности III VNTR области у штаммов чумного и 97 псевдотуберкулезного микробов

5.3. Определение сиквенс типов вариабельных областей штаммов 99 чумного микроба разного происхождения

5.4. Сиквенс типы вариабельных областей вирулентных штаммов 116 псевдотуберкулезного микроба

ГЛАВА 6. РАЗРАБОТКА СПОСОБА ИДЕНТИФИКАЦИИ И 123

ВНУТРИВИДОВОГО VNTR ТИПИРОВАНИЯ ШТАММОВ ЧУМНОГО МИКРОБА

6.1. Условия проведения ПЦР с праймерами TAN I-TAN 2 и подбор 124 гелей для разделения продуктов амплификации

6.2. Создание маркеров на основе фрагментов ДНК, полученных с ДНК 125 референтных штаммов чумного микроба разного происхождения

6.3. Учет и интерпретация результатов ПЦР анализа 128 ГЛАВА 7. СРАВНЕНИЕ ФЕНОТИПИЧЕСКИХ И ГЕНОТИПИЧЕСКИХ 131 СХЕМ КЛАССИФИКАЦИИ ЧУМНОГО МИКРОБА

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 142

ВЫВОДЫ 152

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 154

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВРФ - вычитающий рестрикционный фингерпринтинг

кДа - килодальтон

КОЕ - колониеобразующая единица

Мда - мегадальтон

м.к. - микробная клетка

н.о. - не определялось

ПЦР - полимеразная ¡цепная реакция

п.н. - пара нуклеотидов

т.п.н. - тысяча пар нуклеотидов

ЭДТА - этилендиаминтетраацетат Na

BLAST - Basic Local Alignment Searching Tool

dNTP- дезоксинуклеотидтрифосфат (deoxynucleotidtriphosphate)

Hms - признак пигментации (hemin storage)

hms - оперон, отвечающий за сорбцию гемина

MLST- мультилокусное секвенирование (multilocus sequence typing)

MLVA - мультилокусный VNTR анализ (multilocus VNTR analysis)

MST - мультиспейсерное сиквенс типирование (multispacer sequence typing)

pgm - область пигментации хромосомы (pigmentation locus)

A pgm - делеция области пигментации

PFGE - электрофорез в пульсирующем поле (pulsed-field gel electrophoresis)

Psn - чувствительность штамма к действию пестицина (pesticin sensitivity)

Pst - признак продукции пестицина (pesticin production)

pst — структурный ген, кодирующий синтез пестицина

IVN - аллель I VNTR области

IIVN - аллель II VNTR области

IIIVN - аллель III VNTR области

VNTR - область с вариабельным числом тандемных повторов (various number tandemrepeat)

ВВЕДЕНИЕ

Чума - одна из наиболее опасных инфекционных болезней человека. Документальные подтверждения о массовых поражениях людей во многих странах мира датируются с V века до нашей эры. И в настоящее время чума представляет реальную угрозу, так как является природно-очаговым заболеванием и периодически вызывает эпизоотии в 42 природных очагах Российской Федерации и ближнего зарубежья, а также в других странах мира [29]. По данным ВОЗ в мире ежегодно регистрируется более 2000 случаев заболеваний человека чумой [158].

Возбудитель чумы обладает высокой фенотипической и генетической изменчивостью, отмеченной рядом исследователей, как для штаммов из разных природных очагов, так и для штаммов, циркулирующих в одном природном очаге [58].

Зарубежные исследователи для внутривидовой дифференциации штаммов чумного микроба используют классификацию, предложенную R. Devignat (1951). Классификация основана на биохимических различиях (способности к ферментации глицерина, редукции нитратов и окислению аммиака) и историко-географическом происхождении штаммов, разделяя их на три биовара: antiqua (античный), medievalis (средневековый) и orientalis (восточный). Эта классификация не учитывает разнообразие штаммов, выделяемых на территориях Центральной Азии, Кавказа, Западной Сибири, Африки. Об этом свидетельствуют опубликованные в последние годы сведения о рамнозопозитивных слабовирулентных штаммах из природных очагов полевочьего типа Китая, которые D. Zhou et al. (2004) выделили в новый биовар microtus, а также ряд публикаций отечественных ученых, описывающих разные подвиды чумного микроба из природных очагов на территории России и ближнего зарубежья [9, 17, 28, 43].

Классификация, принятая в 1985 г. на Всесоюзном совещании по таксономии чумного микроба, основана на фенотипических свойствах,

вирулентности по отношению к лабораторным животным и ландшафтно-географической приуроченности. Согласно этой классификации все штаммы Yersinia pestis подразделяют на пять подвидов - основной и 4 неосновных (кавказский, алтайский, гиссарский и улэгейский). Штаммы основного подвида с большим эпидемическим потенциалом высоковирулентны как для диких, так и для лабораторных животных. Фенотипические характеристики штаммов основного подвида, выделяемых в разных природных очагах, различаются и соответствуют характеристикам какого-либо из биоваров: antiqua, medievalis, orientalis. Штаммы неосновных подвидов избирательно вирулентны для лабораторных животных, их эпидемическая значимость ниже, чем у штаммов основного подвида.

До сих пор широко используются методы индикации, идентификации, типирования чумного микроба, основанные на определении различных фенотипических свойств. Нестабильность фенотипа затрудняет интерпретацию результатов, что может привести к ошибочным выводам. Бурное развитие молекулярной генетики в последнее время привело к разработке приемов детекции, идентификации и типирования микроорганизмов, основанных на анализе структуры генома. Использование более стабильной генетической основы позволит повысить точность идентификации и типирования штаммов чумного микроба и усовершенствовать фенотипические схемы классификации.

В то же время, каждый молекулярно-генетический подход обладает разной информативностью и еще не описан единственный метод, позволяющий эффективно проводить типирование и служить основой для совершенствования таксономии чумного микроба. Поэтому возникает необходимость в комплексном подходе к решению данной проблемы.

Для повышения эффективности генетического типирования бактерий важен правильный выбор ДНК - мишеней, набор которых может пополняться по мере их выявления и изучения. На основе анализа литературных сведений по эффективности отдельных методов генотипирования можно говорить о

перспективности сочетания таких высокодискриминирующих методов как метод вычитающего рестрикционного фингерпринтинга (ВРФ) и метод мультилокусного VNTR анализа (ПЦР - VNTR, сиквенс-VNTR). ВРФ еще не применялся для типирования штаммов чумного микроба, а варианты VNTR анализа, апробированные на штаммах чумного микроба, обладают либо излишней (по-штаммовой), либо недостаточной (объединяющей штаммы разных подвидов в одну группу) дискриминирующей способностью [38, 39, 109,112, ИЗ, 127].

Поэтому выбор ДНК мишени с тандемными повторами, определяющими подвидовую и очаговую принадлежность штаммов весьма актуален. Сочетание методов, позволяющих судить о внутривидовых вариациях всего генома (вычитающий рестрикционный фингерпринтинг) и отдельных его локусов (VNTR анализ), позволит наиболее эффективно оценивать таксономическое положение изучаемых штаммов чумного микроба, выявлять их эволюционные связи, проводить паспортизацию штаммов.

Цель работы - разработка методических подходов для генетического типирования штаммов чумного микроба на основе VNTR анализа и метода вычитающего рестрикционного фингерпринтинга. Основные задачи исследования:

1. Охарактеризовать штаммы чумного микроба, циркулирующие в природных очагах стран СНГ и Монголии, по наличию основных детерминант вирулентности и изучить их фенотипическое проявление. Подобрать штаммы, полноценные по составу детерминант вирулентности, на которых будет изучаться эффективность методов генетического типирования.

2. Выбрать потенциальные пары ферментов для проведения вычитающего рестрикционного анализа штаммов чумного микроба и вирулентных штаммов псевдотуберкулезного микроба. Проверить эффективность выбранных пар рестриктаз на референтных штаммах.

3. Получить фингерприиты вычитающей рестрикции репрезентативной выборки штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов. Провести компьютерный анализ данных вычитающего рестрикционного фингерпринтинга и оценить эффективность дифференциации штаммов чумного микроба из разных очагов и вирулентных штаммов возбудителя псевдотуберкулеза.

4. Выявить новые вариабельные тандемные нуклеотидные повторы в геноме Y. pestis. Подобрать праймеры к обнаруженным областям с тандемными повторами и оптимизировать параметры амплификации этих областей.

5. Изучить вариабельность выявленных VNTR областей генома штаммов Y. pestis разного происхождения и вирулентных штаммов Y. pseudotuberculosis. Определить нуклеотидную последовательность фрагментов ДНК, содержащих вариабельные тандемные повторы.

6. Разработать способ VNTR-ПЦР дифференциации штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов с одновременным внутривидовым типированием штаммов чумного микроба. Разработать методический подход к мультиспейсерному сиквенс типированию для идентификации и генотипирования штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов.

7. Оценить эффективность использования метода вычитающего рестрикционного фингерпринтинга, разработанных мультиспейсерного сиквенс типирования и VNTR-ПЦР для дифференциации чумного и псевдотуберкулезного микробов, генетического типирования, усовершенствования схем классификации чумного микроба и эпидемиологического анализа штаммов чумного микроба разного географического происхождения.

Научная новизна работы

Получена характеристика штаммов Y. pestis из природных очагов стран СНГ и Монголии по особенностям фенотипа и распространенности детерминант вирулентности - области пигментации и плазмиды

кальцийзависимости. Показано, что в некоторых природных очагах (Дагестанский равнинно-предгорный, Зауральский степной и Волго-Уральский песчаный) циркулируют штаммы с повышенной частотой утраты детерминант вирулентности как хромосомной, так и плазмидной локализации.

Впервые получены молекулярные портреты штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов с помощью метода вычитающего рестрикционного фингерпринтинга и показана корреляция фингерпринтов штаммов чумного микроба с их подвидовой принадлежностью, а в ряде случаев - с очаговой принадлежностью.

Впервые на основе УШИ областей межгенных пространств /шЮ-УР01967, УР01967-агиЕ, УР01961-УР01960 разработан способ мультиспейсерного сиквенс типирования штаммов чумного микроба, позволяющий проводить дифференциацию штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов и определять подвидовую, очаговую и мезоочаговую принадлежность штаммов чумного микроба.

Показано, что разработанный способ мультиспейсерного сиквенс типирования эффективен при генетическом типировании штаммов псевдотуберкулезного микроба.

Теоретически обосновано и экспериментально установлено, что усовершенствование классификационных систем, основанных на фенотипических характеристиках, не всегда позволяющих четко определить принадлежность штаммов чумного микроба к очагу и мезоочагу, возможно на основе комплексного использования методов мультиспейсерного сиквенс типирования и вычитающего рестрикционного фингерпринтинга.

Удачный выбор ДНК-мишеней и молекулярно-генетических методик, основанных на мультиспейсерном сиквенс типировании и вычитающем рестрикционном фингерпринтинге, позволили охарактеризовать особенности генетической структуры таласских штаммов чумного микроба. Определено, что генотипы таласских штаммов имеют уникальную генетическую формулу по

строению вариабельных участков /zwiG-YP01967 и YP01961-YP01960. В ходе кластерного анализа методом попарного невзвешенного группирования с арифметическим усреднением (UPGMA) определена наибольшая близость штаммов таласской группы к штаммам неосновных подвидов.

По результатам работы получен патент на изобретение, зарегистрированное в государственном реестре интеллектуальной собственности Российской Федерации: «Способ дифференциации чумного и псевдотуберкулезного микробов с одновременной внутривидовой дифференциацией штаммов чумного микроба» № 2332464. Практическая значимость работы

Разработана VNTR-ПЦР, использующая в качестве ДНК-мишени hutG -YP01967 область, для дифференциации штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов и одновременного внутривидового типирования штаммов чумного микроба. Очевидно, что использование данного метода в практической работе учреждений Роспотребнадзора имеет экономическое преимущество. По результатам работы составлены методические рекомендации: «Выделение и очистка геномной ДНК Yersinia pestis, пригодной для тонких молекулярно-биологических экспериментов» (протокол № 2 от 17. 04. 2007 г.), «Способ межвидовой и внутривидовой дифференциации патогенных иерсиний (Yersinia pestis, Y. pseudotuberculosis) с определением их потенциальной вирулентности» (протокол № 7 от 12. 12. 2008 г.), одобренные Учёным советом Российского научно-исследовательского противочумного института «Микроб», утвержденные директором Российского научно-исследовательского противочумного института «Микроб». Положения, выносимые на защиту:

1. Для оценки эффективности методов генетического типирования создана референс-панель штаммов чумного микроба, отобранных из различных ландшафтно-географических областей, с полным набором детерминант вирулентности.

и

2. Метод вычитающего рестрикционного фингерпринтинга эффективен для внутривидового типирования штаммов чумного микроба. Подобранная комбинация эндонуклеаз рестрикции EcoRI - Paul позволяет получать молекулярные портреты штаммов чумного микроба, отражающие их подвидовую и очаговую принадлежность.

3. Мультиспейсерное сиквенс типирование на основе трех VNTR областей хромосомы: /zwíG-YP01967, УР01967-ягиЕ, YP01961-YP01960 позволяет дифференцировать штаммы чумного и псевдотуберкулезного микроба, определять подвидовую, очаговую и мезоочаговую принадлежность штаммов чумного микроба.

4. VNTR - ПЦР с праймерами TAN 1 - TAN 2 дифференцирует штаммы чумного и псевдотуберкулезного микробов, а также штаммы чумного микроба, принадлежащие к разным подвидам и циркулирующие в разных природных очагах.

5. Кластеры генотипов, полученные методами вычитающего рестрикционного фингерпринтинга и мультиспейсерного сиквенс типирования, полностью коррелируют с существующей подвидовой классификацией чумного микроба и показывают неоднородность большинства подвидов в соответствии с очаговой принадлежностью.

6. Генотипы штаммов чумного микроба таласской группы, полученные методами вычитающего рестрикционного фингерпринтинга и мультиспейсерного сиквенс типирования, имеют существенные отличия от генотипов штаммов известных подвидов, что позволяет выделить их в отдельный внутривидовой таксон.

Апробация работы.

Материалы диссертации представлены на следующих конференциях: II Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Инфекции, обусловленные иерсиниями» (Санкт-Петербург, 2006); IX съезд Всероссийского научно-практического общества эпидемиол�