Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Теоретическое и научно-методическое обоснование использования белковых фракций чумного микроба при создании новых диагностических препаратов и тест-систем

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Зайцев, Александр Алексеевич

ВВЕДЕНИЕ

глава 1. обзор литературы

1.1. Основные этапы в изучении белков чумного микроба

1.2. Электрофоретический анализ белков чумного микроба

1.3. Иммунохимический анализ белков возбудителя чумы

1.4. Антигены чумного микроба, используемые при конструировании диагностических препаратов

1.5. Серологическая диагностика и индикация чумного микроба и специфических чумных иммуноглобулинов

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

глава 2. материалы и методы

2.1. Штаммы бактерий, использованные в работе

2.2. Бактериологические методы

2.3. Биологические методы

2.4. Биохимические методы

2.5. Иммунохимические и иммунологические методы

2.5.1. Агглютинационные тесты

2.5.2. Реакции иммунопреципитации

2.5.3. Гемагглютинационые тесты

2.5.4. Иммуноферментный анализ

2.5.5. Иммунолатексные тесты

2.6. Методы генетического анализа

2.7. Методы статистической обработки

глава 3. физико-химический анализ белков чумного микроба

3.1. Электрофоретический спектр водорастворимых белков 69 чумного микроба

3.2. Электрофоретический анализ суммарной фракции водо- 75 растворимых и мембранных белков чумного микроба

3.3. Влияние температуры культивирования на биосинтез 77 белковых биополимеров чумного микроба

3.4. Перспективы использования протеинограмм для внутривидовой дифференциации чумного микроба

3.5. Использование протеинограмм белковых биополимеров для дифференциальной диагностики чумы от других видов иерсиний

глава 4. иммунохимический анализ водорастворимых белков 97 чумного микроба

4.1. Серологическая активность фракции I чумного 97 Микроба

4.2. Серологическая активность фракции II чумного 127 микроба

4.3. Перспективы применения РИД для серодиагностики 130 штаммов чумного микроба

ГЛАВА 5. оптимизация биотехнологии приготовления чумных 138 антигенных диагностикумов на основе фракции i и перспективы их использования для диагностики чумы

5.1. Конструирование и использование диагностикума чум- 139 ного полиакролеинового антигенного на основе фракции I

5.2. Оптимизация биотехнологии изготовления диагности- 152 кума чумного антигенного пероксидазного и перспективы использования его в конкурентном варианте ТИФА «П»

глава 6. оптимизация биотехнологии приготовления чумных 161 иммуноглобулиновых диагностикумов и тест-систем, а также перспективы их использования для серодиагностики чумы

6.1. Особенности приготовления диагностикумов полиакро- 162 леиновых чумных иммуноглобулиновых

6.2. Оптимизация условий постановки серологических ре- 168 акций с полиакролеиновыми чумными антительными диагностикумами

6.3. Сравнительный анализ чувствительности и специфич- 175 ности чумных полиакролеиновых диагностикумов на основе моно- и поликлональных антител

6.4. Оптимизация экспресс-диагностики капсульного 178 антигена (Ф1) чумного микроба в иммуносуспензионных реакциях

6.5. Сравнительный анализ перспектив серодиагностики 195 капсульного антигена возбудителя чумы в иммуно-суспензионных реакциях и иммуноферментном анализе

6.6. Использование РСНАг для поиска антител к Ф1 чумно- 209 го микроба в сыворотках животных

6.7. Перспективы совершенствования серодиагностики 214 фракции I чумного микроба с помощью магноиммуно-сорбентов

6.8. Разработка и перспективы использования метода не- 218 прямого иммунофлуоресцентного анализа для диагностики чумного микроба

6.9. Биотехнология получения и использования иммуноглобулинов для серодиагностики безфракционных(Ф1~) штаммов чумного микроба

глава 7. биотехнологические аспекш оптимизации биосинте- 234 за фракции i и использования различных тест-систем для серодиагностики чумы в объектах внешней среды и обнаружения генов, кодирующих биосинтез специфических антигенов возбудителя чумы

7.1. Влияние факторов внешней среды на специфичность и 235 чувствительность иммуносуспензионных и иммунофер-ментных серологических реакций

7.2. Некоторые особенности влияния температуры культи- 248 вирования бактерий чумы на продукцию капсульного антигена (Ф1)

7.3. Перспективы оптимизации серодиагностики чумы с по- 255 мощью биомоделей

Введение Диссертация по биологии, на тему "Теоретическое и научно-методическое обоснование использования белковых фракций чумного микроба при создании новых диагностических препаратов и тест-систем"

Актуальность проблемы. Существующие природные очаги чумы обусловливают необходимость систематического контроля за степенью их активности и характером эпизоотического проявления. Без этих данных невозможно осуществление эффективного эпиднадзора и предупреждение заболеваемости людей чумой. Помимо этого, особое значение приобрела проблема биотерроризма, которая диктует необходимость совершенствования методов экспресс-диагностики для работы в обычных условиях и чрезвычайных ситуациях в лабораториях СПЭБ и CHJIK.

Для проведения эпизоотологического контроля и работы в чрезвычайных ситуациях необходимо располагать набором по возможности методически простых, но высокочувствительных и высокоспецифичных методов лабораторной диагностики. Одно из направлений, позволяющее решать эти вопросы, связано с изучением и совершенствованием диагностики и индикации чумного микроба, анализ состава и структуры антигенов которого помогает проводить внутривидовую дифференциацию штаммов, совершенствовать серодиагностику чумы (Вейнблат В.И., 1974; Канатов Ю.В., 1974; Леви М.И., 1985; Анисимов П.И. с соавт., 1986; Анисимов А.П. с соавт., 1992; Щербаков A.A., 1991 и др.). В то же время необходимо проведение дальнейших исследований, направленных на изучение белковых биополимеров возбудителя чумы, определяющих видоспецифичность возбудителя.

Хотя первые работы, посвященные иммунохимическому анализу биополимеров чумного микроба в реакции иммунодиффузии (Пустовалов B.JI. с соавт., 1962; Lawton W.D. et al., I960 и др.) и физико-химическому анализу в диск-электрофорезе (Hudson B.W. et al., 1970 и др.), появились относительно давно, до настоящего времени четко не определена дальнейшая перспектива использования этих методов для лабораторной диагностики чумы. Очевидно, что необходимо продолжить изучение структуры и свойств биополимеров с помощью современных методов иммунохимического и физико-химического анализа.

С помощью серологической диагностики выявляют природные очаги чумы и устанавливают их границы, изучают активность эпизоотического процесса, осуществляют экспресс-диагностику в чрезвычайных ситуациях. Преимущественно для этих целей до настоящего времени широко используют эритроцитарные диагно-стикумы, которые во многом оправдали себя (Канатов Ю.В., 1974; Кузнецова К.А. и Леви М.И., 1983; Атшабар Б.Б. с со-авт., 2000 и др.).

В процессе широкого использования гемагглютинационных тестов для серодиагностики возбудителя чумы выявлены и их недостатки: нестандартность эритроцитарных диагностикумов (Леви М.И. с соавт., 1982), отсутствие абсолютной специфичности для диагностикума чумного эритроцитарного поликлональ-ного (Айманова О.Я. с соавт., 1986; Малецкая О.В. с соавт., 1986), возможность получения неспецифического результата за счет наличия в исследуемом материале протеолитических ферментов (Сучков Ю.Г. с соавт., 1984 и др.), гетероагглютини-нов (Топорков В.П. с соавт., 1980) или некоторых химических примесей (Ходаковская В.Н. с соавт., 1986).

Получение моноклональных антител (МКА) к фракции I (Ф1) дало возможность повысить специфичность гемагглютинационных тестов (Айманова О.Я. с соавт., 1986; Темиралиева Г.А. с соавт., 1986). Однако некоторые недостатки гемагглютинационных тестов, связанные с использованием эритроцитов, остались.

Одно из направлений дальнейшей оптимизации серодиагностики возбудителя чумы связано с разработкой ТИФА для обнаружения антигена как на поликлональных антителах «П» к Ф1 (Голубинский Е.П. с соавт., 1980, 1986; Рудник М.П., 1985; Дробков В.И. с соавт., 1991; Рудник М.П. с соавт., 1999 и др.), так и на МКА к Ф1 - ТИФА «М» (Леви М.И. с соавт., 1984, 1987; Коссе Л.В. 'с соавт., 1992 и др.), а также ТИФА для обнаружения противочумных антител (Венгеров Ю.Ю. с соавт., 1987; Рудник М.П. с соавт., 1999 и др.).

В настоящее время предложено уже более 10 разных вариантов ТИФА для серодиагностики чумы, обладающих высокой чувствительностью и специфичностью. Несмотря на это, ТИФА редко используется в практике, что, по-видимому, связано с трудоемкостью и неэкономичностью этого метода. Очевидно, что назрела необходимость более подробного анализа целесообразности использования различных вариантов ТИФА для серодиагностики чумы.

Совершенствование диагностических препаратов и методов серодиагностики чумы определяется не только необходимостью повышения чувствительности и специфичности, но и стремлением к упрощению их постановки, что особенно важно в чрезвычайных ситуациях. Положительный опыт использования полиакролеиновых микросфер в РНСА, вместо эритроцитов в гемагглютинационных тестах (Лукин Ю.В. с соавт., 1985, 1986; Зайцев A.A. с со-авт., 1989; Рудник М.П. с соавт., 1993, 1999, 2001 и др.), дает надежду на успешное решение этих задач и определяет необходимость разработки антительных и антигенных полиакролеиновых препаратов для проведения серологического анализа на чуму. Необходимо дальнейшее изучение перспектив практического использования этих препаратов.

В связи с тем, что для серодиагностики чумы уже предложено более 20 вариантов реакций с разными диагностикумами и тест-системами, назрела необходимость в глобальном пересмотре тактики серодиагностики с выбором наиболее перспективных направлений.

К сожалению, до настоящего времени все еще слабым звеном в экспресс-диагностике чумы является серодиагностика штаммов с измененной структурой фракции I (Ф1~) .

Дальнейшего изучения требуют факторы, влияющие на условия биосинтеза Ф1 и других биополимеров, с целью оптимизации серодиагностики чумы.

Цель исследования. Изучение белковых биополимеров чумного микроба с целью теоретического и научно - методического обоснования использования их в биотехнологических процессах при создании новых диагностических иммуносуспензионных и иммуноферментных тест - систем, направленных на совершенствование экспресс-диагностики и индикации чумного микроба, а также специфических чумных иммуноглобулинов.

Основные задачи исследования:

1. Охарактеризовать методом диск-электрофореза водорастворимые и мембранные фракции белковых биополимеров чумного микроба. Определить наиболее простые и высокоинформативные методы получения и анализа протеинограмм. Изучить'перспективы применения диск-электрофореза для внутривидовой дифференциации и уточнения филогенетического положения атипичных штаммов.

2. Изучить в совокупности физико-химические и иммунохими-ческие свойства фракции I чумного микроба для объяснения целесообразности применения различных диагностических препаратов с целью серологического обнаружения этого антигена.

3. Разработать биотехнологию изготовления диагностикумов полиакролеиновых чумных иммуноглобулиновых и диагностикума полиакролеинового чумного антигенного на основе фракции I, а также способов постановки реакций с ними и ускоренных вариантов учета результатов.

4. Повысить чувствительность и демонстративность результатов иммуноферментных реакций для экспресс-диагностики чумного микроба за счет конструирования латексных магноиммуно-сорбентов в качестве твердой фазы и использования перокси-дазных иммуноферментных конъюгатов.

5. Разработать биотехнологию приготовления конъюгата фракции I чумного микроба с пероксидазой и оптимизировать схему постановки конкурентного варианта ТИФА для обнаружения капсульного антигена возбудителя чумы и его гаптена.

6. Определить перспективы применения иммуноферментных тест-систем для индикации афракционных штаммов возбудителя чумы сочетано с другими методами.

7. Проанализировать методики культивирования чумных бактерий на искусственных питательных средах с целью оптимизации биосинтеза фракции I. Усовершенствовать для этой цели и выделения чумного микроба способы постановки биологических проб.

8. Изучить перспективы применения предлагаемых диагностикумов и тест-систем для традиционного лабораторного анализа и экспресс-диагностики в условиях работы СПЭБ и СНЛК.

Научная новизна:

1. Дана сравнительная характеристика различным вариантам получения протеинограмм водорастворимых и мембранных белков чумного микроба. Представлены новые данные о составе и элек-трофоретических свойствах общих и отдельных фракций белковых биополимеров возбудителя чумы. Разработан простой и высокоинформативный метод получения протеинограмм для эпизоотоло-гического и эпидемиологического маркирования штаммов чумного микроба. На основании анализа различных вариантов протеинограмм показано, что изученные в работе «новообразованные» штаммы следует считать не псевдотуберкулезными, а атипичными чумными.

2 . Представлены новые данные о физико-химических и имму-нохимических свойствах фракции I чумного микроба. На их основе дано объяснение целесообразности применения различных диагностических препаратов и тест-систем с целью иммунологического обнаружения этого антигена в прикладных микробиологических исследованиях.

3. Разработана биотехнология приготовления диагностикума полиакролеинового чумного антигенного. Приоритетность вышеизложенного подтверждается патентом на изобретение РФ «Способ получения диагностикума суспензионного чумного антигенного на основе фракции I», № 2199750 от 27.02.2003 г. Изучены перспективы его использования для обнаружения противочумных антител и фракции I в серологических реакциях.

4. Оптимизированы параметры и биотехнология получения диагностикумов полиакролеиновых иммуноглобулиновых на основе поли - и моноклональных антител к Ф1, приоритетность чего подтверждается патентом на изобретение РФ «Способ получения латексного диагностикума»,№2012888 от 15.05.1994 г. Разработана оригинальная методика постановки серологических реакций с ними в прикладной микробиологии, приоритетность которой подтверждена патентом на изобретение РФ «Способ постановки реакции латексной агглютинации», № 2198407 от 10.02.2003 г. У представленных диагностических препаратов выявлены уникальные свойства, позволяющие рекомендовать их для индикации и ускоренной идентификации в лабораториях СПЭБ и СНЛК. Приоритетность вышеизложенного подтверждена 3 патентами на изобретение РФ: «Способ серодиагностики кап-сульного антигена чумного микроба», № 2092852 от 10.10.1997 г., «Способ индикации бактериальных антигенов», № 2101356 от 10.01.1998 г. и «Способ индикации бактериальных антигенов», № 2102761 от 20.01.1998 г.

5. Впервые получена иммуноферментная чумная тест-система по типу двойного антительного сэндвича на основе полиакро-леиновых магноиммуносорбентов и иммуноферментного конъюга-та. Показана перспектива ее использования для обнаружения в объектах внешней среды Ф1 во взвесях Y. pestis концентрацией 1*102 - 1-Ю3 м.к./мл. (патент на изобретение РФ «Способ получения магноиммунсорбента для обнаружения бактериальных антигенов», № 2246968 от 27.02.2005 г.).

Разработана биотехнологическая схема приготовления тест-системы по типу двойного антительного сэндвича на основе алюмосиликатных магноиммуносорбентов и пероксидазного иммунолипосомного конъюгата. Предложено ее использовать для обнаружения в объектах внешней среды Ф1 во взвесях Y. pestis концентрацией 1-102 - 1«103 м.к./мл.

6. Разработана биотехнология приготовления тест-системы для обнаружения чумных бактерий непрямым методом .флуоресцирующих антител и определены перспективы ее применения для экспресс-диагностики.

7. Проведен сравнительный анализ чувствительности и специфичности различных иммуносуспензионных и иммуноферментных тест-систем при изучении "штаммов чумного микроба и других близкородственных микробов, суспензий внутренних органов животных, павших от чумной инфекции, а также материала из объектов внешней среды (почвы) на наличие Ф1 чумного микроба. Определена степень их экономичности и параметры практического использования.

8. Получены МКА к 43 КД антигену чумного микроба и изучены перспективы их использования для серодиагностики без-фракционных штаммов. Определена целесообразность сочетанного использования на определенных этапах исследования для экспресс-диагностики Ф1~ штаммов возбудителя чумы метода флуоресцирующих антител (МФА) и серологических методов с полиме-разной цепной реакцией (ПЦР). Предложен новый способ обнаружения чумного микроба в объектах внешней среды, защищенный патентом на изобретение РФ «Способ обнаружения чумного микроба в объектах внешней среды», № 2149407 от 20.05.2000 г., сочетающий усовершенствованную постановку биологической пробы с ПЦР, МФА и серологическим анализом.

9. Оптимизированы методики подращивания чумных бактерий на искусственных питательных средах с целью накопления фракции Ф1. Усовершенствован для этой цели способ постановки биологической пробы, приоритетность чего подтверждена патентом на изобретение РФ «Способ лабораторной диагностики чумы», № 2077591 от 20.04.1997 г. Дополнительная модификация вышеуказанного способа позволяет восстанавливать биосинтез фракции I у штаммов чумного микроба, утративших этот признак в результате фенотипической изменчивости, на что получен патент на изобретение РФ «Способ восстановления способности к биосинтезу капсульного антигена чумного микроба», № 2155962 от 10.09.2000 г.

Теоретическая и практическая значимость результатов исследований.

Основные результаты диссертации отражены в 2-х инструк- , тивно-методических документах федерального и 14-ти учрежденческого или регионального уровня внедрения.

1. Из различных вариантов получения протеинограмм выбран простой и высокоинформативный способ подготовки штаммов У. реБЬ1Б для диск-электрофореза и проведения его, который включен в «Методические рекомендации по внутривидовой дифференциации чумного микроба с помощью электрофореза белков» (одобрены Ученым советом и утверждены директором СтавНИПЧИ, протокол № 5 от' 31.05.1999 г.). Предлагаемый метод имеет большие перспективы использования в качестве маркера для штаммов чумного микроба при эпизоотологическом и эпидемиологическом анализах в прикладной микробиологии.

Благодаря использованию различных вариантов диск-электрофореза уточнено филогенетическое положение некоторых «новообразованных» штаммов.

2. В «Методических рекомендациях по изучению свежевыде-ленных штаммов чумного микроба из Центрально-Кавказского природного очага чумы» (одобрены Ученым советом и утверждены директором СтавНИПЧИ, протокол № 5 от 30.05.2002 г.), «Методических рекомендациях по индикации возбудителей особо опасных инфекционных заболеваний (чума, туляремия, бруцеллез, сибирская язва, холера) в СПЭБ и СНИК в условиях чрезвычайных ситуаций» (одобрены Ученым советом и утверждены зам. директора по научной работе СтавНИПЧИ, протокол № 2 от 27.02.2003 г.) и «Методических рекомендациях по индикации и первичной идентификации фракционных и афракционных штаммов чумного микроба в условиях работы СНЛК» (одобрены Ученым советом и утверждены зам. директора по научной работе СтавНИПЧИ, протокол № 10 от 27.11.2003 г.) предложены схемы, определяющие перспективы использования различных вариантов иммуносуспензионных диагностикумов и тест-систем ТИФА для серодиагностики чумы при эпизоотологическом обследовании и в чрезвычайных ситуациях, из которых вытекают потребности в этих диагностических препаратах. Данные схемы конкретно показывают, какие из них и по каким технологиям необходимо производить, а также наиболее целесообразно использовать в первую или во вторую очередь на разных этапах исследования и в зависимости от изучаемого материала. Оптимизация серодиагностики чумы в пределах предложенных схем позволит при экономии материальных средств на производство препаратов получать наиболее достоверные результаты.

Разработанные диагностические критерии оценки эпизоото-логической ситуации на основе сочетанности признаков по иммунологическим тестам, схема оценки и информативности методов, критерии целесообразности выбора приемов лабораторного анализа при эпизоотологическом обследовании природных очагов чумы включены в «Методические рекомендации по оценке информативности методов диагностики при эпизоотологическом обследовании природных очагов чумы» (утверждены Госкомсанэпиднад-зором РФ в 1995 г.).

3. Разработанные и усовершенствованные способы приготовления диагностических препаратов использованы при составлении «Методических рекомендаций по получению и контролю диаг-ностикума суспензионного чумного моноклонального сухого к Ф1 антигену возбудителя чумы (одобрены Ученым советом и утверждены директором Института биомедицинской технологии, г.

Москва, протокол № 13 от 13.09.1988 г.), «Инструкции по изготовлению и контролю диагностикума суспензионного чумного моноклонального сухого к Ф1-антигену возбудителя чумы» (одобрены Ученым советом и утверждены директором СтавНИПЧИ, протокол № 5 от 11.05.1989 г.), «Регламента производства, ФСП и инструкции по применению на диагностикум полиакролеи-новый чумной иммуноглобулиновый жидкий» (одобрены Ученым советом и утверждены директором СтавНИПЧИ, протокол № 8 от 26.09.2002 г.), «Инструкции по изготовлению и контролю тест-системы диагностической для определения возбудителей чумы, сапа, мелиоидоза, туляремии, бруцеллеза, сибирской язвы непрямым иммунофлуоресцентным методом (одобрены Ученым советом и утверждены директором СтавНИПЧИ, протокол № 13 от 23.11.1990 г.), «Регламента производства, ФСП и инструкции по применению на тест-систему иммуноферментную липосомальную для выявления возбудителя чумы с помощью магноиммуносорбен-тов» (одобрены Ученым советом и утверждены директором СтавНИПЧИ, протокол № 5 от 27.05.2005 г.), «Методических рекомендаций по иммобилизации в липосомы веществ различной химической природы. Стерилизация и стабилизация липосом» (утверждены первым заместителем министра здравоохранения РФ, главным государственным санитарным врачем России Г.Г. Они-щенко 06.04. 2002 г.).

Оптимизированные способы постановки серологических реакций отражены в «Методических рекомендациях по применению диагностикума чумного полиакролеинового иммуноглобулинового (поликлонального) в серологических реакциях» (одобрены Ученым советом и утверждены директором СтавНИПЧИ, протокол № 5 от 30.05.1994 г.) и «Методических рекомендациях по ускоренному учету РИГА при поиске капсульного антигена чумного микроба» (одобрены Ученым советом и утверждены директором СтавНИПЧИ, протокол № 7 от 26.09.1997 г.).

4. Усовершенствованные способы подготовки материала через биопробу для серологического исследования использованы в «Методических рекомендациях по раннему выделению и идентификации возбудителя чумы из объектов, содержащих единичные клетки этого микроба» (одобрены Ученым советом и утверждены директором СтавНИПЧИ, протокол № 2 от 26.02.1993 г.), «Методических рекомендациях по раннему выявлению и идентификации возбудителя чумы с измененными свойствами» (одобрены Ученым советом и утверждены директором СтавНИПЧИ, протокол № 12 от 28.12.1998 г.) и «Методических рекомендациях по обнаружению афракционных штаммов чумного микроба в организме лабораторных животных» (одобрены Ученым советом и утверждены директором СтавНИПЧИ, протокол № 5 от 20.05.2003 г.).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Научно - методическое обоснование применения различных вариантов диск-электрофореза для изучения белковых биополимеров чумного микроба и использования его для дифференциальной диагностики штаммов.

2. Методические приемы конструирования суспензионных, иммуноферментных и иммунофлуоресцентных диагностикумов и тест - систем, обеспечивающих высокую эффективность обнаружения капсульного антигена (Ф1) возбудителя чумы и антител к нему в экспериментальных и полевых условиях.

3. Научно - методические основы биотехнологии изготовления твердофазных микрогранулированных композиционных аффинных полиакролеиновых магносорбентов для избирательного концентрирования чумного микроба и его капсульного антигена с последующим определением в экспрессных методах (ТИФА, количественном иммунофлуоресцентным анализе - КИФА, ПЦР).

4. Методические подходы совершенствования способов подготовки материала, содержащего чумной микроб для последующего изучения серологическими и иммунолюминесцентными методами.

5. Научно - методическое обоснование использования им-муносуспензионных, иммуноферментных и иммунофлуоресцентных диагностикумов и тест - систем на этапах индикации и идентификации чумного микроба в полевых условиях и условиях работы СПЭБ и СНЛК.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на Всесоюзной конференции «Актуальные вопросы иммунодиагностики особо опасных инфекций» (Ставрополь, 1986); на научной конференции «Моноклональные антитела в изучении и диагностике природноочаговых заболеваний» (Ростов-на-Дону, 1989); на Российской научной конференции «Иммунология и специфическая профилактика особо опасных инфекций» (Саратов, 1993); на научно-практической конференции «60 лет противочумной службы Кавказа» (Ставрополь, 1995); на научно-практической конференции, посвященной 75-летию санэпидслужбы России «Здоровье населения и среда обитания» (Ставрополь, 1997); научно-практической конференции, посвященной 100-летию образования противочумной службы России (Саратов, 1997); на юбилейной научной конференции, посвященной 70-летию НИИ микробиологии МО РФ «Диагностика, лечение, профилактика опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология. Ветеринария» (Киров, 1998); на региональной научно-практической конференции «Актуальные вопросы особо опасных инфекций» (Нальчик, 2000); на научно-практической конференции «Противоэпидемическое обеспечение населения в условиях возникновения чрезвычайных ситуаций в Северо-Кавказском регионе» (Ставрополь, 2001); на межлабораторных конференциях Ставропольского научно-исследовательского противочумного института (Ставрополь, 2004, 2005).

Публикации. Основное содержание диссертации отражено в 44 опубликованных научных работах "(в ведущих научных журналах, рекомендуемых ВАК - 5 статей, депонированных - 15 статей, в 10 патентах РФ на изобретения, в иностранных журналах - 4 публикации).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, б глав собственных исследований, заключения, выводов, списка использованной литературы, включающего 274 работы отечественных и 41 работу зарубежных авторов, практических рекомендаций. Работа изложена на 343 страницах компьютерного текста, содержит 26 таблиц и 79 рисунков .

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Зайцев, Александр Алексеевич

288 ВЫВОДЫ

1. Протеинограммы водорастворимых и мембранных белков чумных микробов, культивируемых при фиксированной температуре (б, 28, 37°С) , являются характерным и стабильным признаком для каждого штамма. Спектр белковых биополимеров, изолированных из клеток возбудителя чумы, может насчитывать свыше 4 0 зон при диск-электрофорезе в 7-10 % полиакриламидном геле в присутствии 0,1% доду-цилсульфата натрия, что позволяет его использовать для изучения внутривидовой изменчивости штаммов и в качестве эпидемиологического и эпизоотологического маркеров.

2. Сочетанное применение диск-электрофореза белков микроорганизмов и иммунохимического анализа водно-солевых экстрактов бактерий в реакции иммунодиффузии в агаре позволило установить чумную природу 8 изученных «новообразованных» штаммов, отдифференцировав их от близкородственных псевдотуберкулезных.

3. Использование эритроцитарных и латексных поли- и моноклональных иммуноглобулиновых диагностикумов к фракции I чумного микроба в иммуносуспензионных реакциях позволяет эффективно обнаруживать в штаммах и объектах внешней среды нативный капсульный антиген (Ф1) возбудителя чумы с подтверждением специфичности результата в реакциях торможения. В случаях необходимости уточнения специфичности результата целесообразно использовать твердофазный иммуноферментный анализ и реакцию нейтрализации антител.

Подверженная обработке кипячением фракция I чумного микроба диссоциирует на отдельные олигомеры, обнаружить которые удается только в реакциях нейтрализации антител и твердофазном иммуноферментном анализе.

4. Впервые разработана биотехнология приготовления диагностикума суспензионного чумного антигенного путем сенсибилизации при комнатной температуре 100 мг окрашенных пиронином - Г полиакролеиновых микросфер размером 1,2-1,8 мкм 0,1-0,3 мг фракцией I в течение 3 ч при рН 7,0-7,4, с последующим прогреванием смеси до 70-80°С и дополнительным перемешиванием в течение 30-40 мин, и отделением несвязавшихся биополимеров центрифугированием. Полученный диагностикум в реакции непрямой суспензионной агглютинации на стекле выявляет высокоаффинные антитела к фракции I чумного микроба в течение 2-5 мин.

5. Конъюгация 5 мг фермента пероксидазы с равным количеством прогретой при 70-80°С в течение 30-40 мин фракцией I чумного микроба обеспечивает получение стабильного препарата с рабочим разведением до 1:2000, сохраняющим свои свойства после лиофилизации свыше 1,5 лет. В конкурентном варианте твердофазного иммунофер-ментного анализа полученный конъюгат позволяет выявлять 20-40 нг/мл фракции I и ее гаптена или 1"10б-1'107 м.к./мл чумного микроба.

6. Разработана биотехнология получения диагностикумов суспензионных чумных иммуноглобулиновых путем сенсибилизации 1 мл 5% взвеси полиакролеиновых частиц 150 мкг поли- или моноклональных антител к фракции I чумного микроба. Для обеспечения стабильности препарата после ковалентной фиксации на носителе специфических иммуноглобулинов препарат обрабатывали 2,5 % раствором инертно— го протеина (альбумина). Консервирование диагностикума осуществляли 1% формалином или азидом натрия в конечной концентрации 1:500, а также путем лиофильного высушивания. Диагностикум сохранял свою специфическую активность в течение 1 года (срок наблюдения). Чувствительность отдельных серий препаратов позволяла обнаруживать чумной микроб в концентрации 31,2 тыс. - 312 тыс. м.к./мл или 0,6-2,5 нг/мл фракции I чумного микроба.

7. Оптимизирована биотехнология постановки серологических реакций макро- и микрометодом с полиакролеиновы-ми чумными антительными и антигенными диагностикумами, обеспечивающая стабильность и воспроизводимость результатов. Для этого следует использовать впервые разработанную разводящую жидкость, состоящую из 0,05 М фосфатного - солевого буфера рН 7,0-7,4, содержащую неполный гидролизат белка куриного яйца в разведении 1:50-1:100 и неионный детергент твин-8 0 в конечной концентрации 1:50000-1:100000. Для ускорения времени учета серологических реакций при вывлении фракции I чумного микроба целесообразно использовать малое увеличение светового микроскопа для определения формирования латексного агг-лютината в течение 5-25 мин или лазерный денситометр, при прохождении луча которого через слой полиакролеино-вых частиц начало их конгломерации можно наблюдать через 1-2 мин от времени постановки реакции.

8. Биотехнология получения магнитных иммуносорбентных частиц путем включения оксида железа в полиакролеиновые микросферы с последующей сенсибилизацией их чумными иммуноглобулинами к фракции I обеспечила получение магни-тоуправляемого диагностикума, способного фиксировать на своей поверхности капсульный антиген и клетки возбудителя чумы, находящиеся в нестерильной почве. После удаления несвязавшихся с магноиммуносорбентами посторонних частиц и биополимеров путем сепарации микросфер с помощью магнитного поля возбудитель чумы обнаруживался в иммуноферментном анализе с чувствительностью 1"102-1"103 м.к./мл.

9. Для повышения чувствительности иммунофлуоресцирующей тест-системы, с целью выявления в мазках клеток чумного микроба, их последовательно обрабатывают кроличьей сывороткой к фракции I чумного микроба в разведении 1:100-1:200, инкубируют 20-30 мин, промывают, и прокрашивают люминесцирующими антивидовыми (антикроличьими) бараньими иммуноглобулинами в рабочем разведении в течение 20-30 мин. Такая диагностическая люминес-цирующая тест-система позволяет специфически обнаруживать только чумной микроб в концентрации 1"106-1"107 м.к./мл.

10. Методом гибридомной технологии впервые получены моноклональные антитела к белковому антигену возбудителя чумы с мол. массой 43 КД. Показано, что последний имеет одинаковое строение у чумного и псевдотуберкулезного микробов независимо от температуры выращивания, но отличается от схожего по строению антигена возбудителя кишечного иерсиниоза. Исследуемый антиген стабильно выявлялся у штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов с использованием моноклональных антител в непрямом методе флуоресцирующих антител и твердофазном иммуноферментном анализе с пероксидазными и пенициллиназными конъюгатами.

11. Определены различные параметры культивирования чумного микроба на жидких и плотных питательных средах с целью максимального накопления фракции I и установлена оптимальная температура для этих целей в 37°С.

Для совершенствования микробиологического анализа впервые разработана схема постановки биологического метода, позволяющая восстанавливать биосинтез фракции I у штаммов чумного микроба, утративших его в результате фенотипической изменчивости, а также способ постановки биологической пробы, позволяющий в течение 24-48 ч накапливать в зараженном животном единичные клетки чумного микроба, включая слабовирулентные, до количества, достаточного для их обнаружения в различных серологических реакциях и методом полимеразной цепной реакции.

12. Разработанный алгоритм использования коммерче--ских чумных диагностических препаратов, а также диагно-стикумов и тест-систем, полученных в ходе выполнения диссертационной работы, и предложенных приемов постановки биологического метода, позволяет достоверно выявлять в различных объектах внешней среды в минимальной концентрации чумной микроб, имеющий различный антигенный состав и степень вирулентности в лабораториях специализированных противоэпидемических бригад и сети наблюдения и лабораторного контроля.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные нами исследования показали, что чумной микроб синтезирует в препаративных количествах не менее 27 нативных белковых биополимеров. Это установлено путем сочетанного последовательного применения гель-фильтрации и диск-электрофореза.

Согласно полученным данным, большое значение имеет метод применяемый для изучения белковых протеинограмм. Использование для этих целей методики B.W. Hudson et al. (1970), в основе которой лежит экстракция водорастворимых белков из ацетоновых порошков и проведение электрофореза по B.J. Davis (1964), позволило нам на протеинограммах обнаруживать до 7-8 мажорных и дополнительно несколько минорных белковых зон, что, в принципе, согласуется с их данными. В то же время, по нашему мнению, от метода постановки диск-электрофореза в трубочках, предложенного B.W. Hudson et al. (1970) и использованного в последующих работах для сравнительного изучения протеинограмм разных штаммов возбудителя чумы (Hudson B.W. et al., 1973; 1975; 1976 и др.), в настоящее время следует отказаться. Дело в том, что при проведении диск-электрофореза в трубочках трудно создать идентичные условия для каждой пробы (штамма). Поэтому такой анализ необходимо проводить только в пластинчатых ПААГ.

Дополнительное использование 1% ДСНа для обработки проб и 0,1% ДСНа в ПААГ при проведении диск-электрофореза позволило нам оптимизировать эту методику. После такой обработки на пластинах полиакриламидно-го геля четко прокрашивалось до 16-18 белковых зон, что значительно повысило вероятность выявления различий между штаммами и субкультурами. Несмотря на это, данный метод не получил широкого практического использования. Дело в том, что высушивание бактериальных клеток ацетоном и последующая экстракция водорастворимых белков занимает много времени с учетом работы с соблюдением противоэпидемического режима (в среднем 1 месяц). Поэтому этот трудоемкий метод был заменен на простой и быстро воспроизводимый, где обработку взвесей микробных клеток проводили в присутствии 1% ДСНа на кипящей водяной бане. После 20-30 мин такой обработки обеззараженные пробы были пригодны для исследования в ПААГ с 0,1% ДСНа. В результате на протеинограммах четко прокрашивалось 30 - 40 и более белковых зон. Этот метод позволяет одновременно проводить сравнительный анализ по водорастворимым и мембранным белкам, что повышает вероятность выявления различий между штаммами возбудителя чумы. Поэтому мы считаем, что этому методу следует отдать предпочтение при первичном анализе протеинограмм.

Проведенные исследования показали, что в одних случаях различия между штаммами могут лучше выявляться при проведении диск-электрофореза в нативных условиях, а в других - в денатурирующих условиях. Следовательно, нужно не противопоставлять разные методы диск-электрофореза друг другу, а использовать их в зависимости от цели исследования.

В процессе работы установлено, что температурный фактор существенно влияет на биосинтез биополимеров и соответственно структуры протеинограмм, полученных в нативных и денатурирующих условиях. Особенно четко такие различия видны при культивировании взвесей микробных клеток чумного микроба соответственно при б, 28 и 37°С. Поэтому при подготовке взвесей для электрофореза следует четко придерживаться только одного температурного режима.

Согласно полученным нами данным, протеинограмма является характерным и стабильным признаком для штамма чумного микроба по типу «отпечатков пальцев». Основные характерные черты у протеинограмм могут сохраняться даже при изменении некоторых биохимических свойств у субкультур. Поэтому мы считаем, что использование протеинограмм в качестве эпидемиологического и эпизоотологического маркеров имеет большие перспективы при эпизо-отологическом обследовании и в условиях работы CHJIK.

Применение метода диск-электрофореза позволило нам уточнить таксономическое положение у группы атипичных штаммов возбудителя чумы. В процессе изменчивости эти штаммы утеряли часть признаков, характерных для чумного микроба и наоборот приобрели признаки, типичные для возбудителя псевдотуберкулеза (Михайлова P.C. с соавт., 1966 и др.). По мнению H.H. Жукова-Вережникова с соавт. (1963), Г.Н. Ленской (1946), P.C. Михайловой с соавт. (1976) и др., селекция таких и подобных «новообразованных» или «псевдотуберкулезоподобных» штаммов указывает на переход чумного микроба в псевдотуберкулезный. Но Л.Н. Классовский и Ю.Г. Сучков (1982) считают, что такая видообразующая изменчивость противоречит эволюционному учению. Постановка разных вариантов диск-электрофореза показала, что протеиновые профили у изученных нами 8 «новообразованных» штаммов оказались практически одинаковыми и соответствовали протеинограм-мам исходного 28°С штамма чумного микроба ЕВ, но существенно отличались от протеинограмм псевдотуберкулезного микроба (I-VI сер.). Следовательно, в данном случае не может идти речь о видообразующей изменчивости, а изученные «новообразованные» штаммы следует признать атипичными чумными, но не псевдотуберкулезными.

В основном различия между чумными протеинограммами имеют место не в количестве белковых зон, а в интенсивности их окраски у разных штаммов. Чем контрастнее различия в интенсивности окраски отдельных белковых зон у разных штаммов, тем проще дифференциальная диагностика между ними.

Особое место в изучении белков чумного микроба занимает их иммунохимический анализ. Наиболее четкий анализ в РИД обычно проводится по 6-8 зонам преципитата. Для оптимального выявления различий между штаммами РИД следует ставить с 3-4 разными антисыворотками и не брать одновременно более 2-3 штаммов.

Для сравнения методом диск-электрофореза в одной пластине ПААГ четкий дифференциальный анализ можно проводить одновременно с 10-20 штаммами по 30-40 и более белковым зонам. Хотя РИД уступает диск-электрофорезу по информативности, целесообразно использовать их сочетан-но для получения наиболее полной информации, необходимой для эпидемиологической и эпизоотологической маркировки штаммов.

Из всех белковых биополимеров чумного микроба наибольший интерес для физико-химического и иммунохимиче-ского анализов представляет капсульный антиген - фракция I. Биополимеры Ф1 синтезируются в достаточно большом количестве, составляя 10-15% от всей массы водорастворимых белков, видоспецифичны, серологически активны и т.д.

Проведенные нами исследования позволяют утверждать, что для обнаружения нативного капсульного антигена (Ф1) чумного микроба с мол. массой от 500 до 3000 КД наиболее целесообразно ставить РИГА или РНСА с эритроцитар-ными или латексными поли- или моноклональными диагно-стикумами, с подтверждением специфичности результата в реакциях торможения. Двухкомпонентные иммуносуспензион-ные реакции проще в постановке, чем иммуноферментные или аналогичные трехкомпонентные, и имеют более высокую чувствительность по сравнению с последними, что обусловлено большей стабильностью антительных диагностику-мов по сравнению с иммуносуспензионными антигенными.

Через 1 ч после термической обработки в дистиллированной воде фракция I представляет собой набор из 6-8 олигомеров с молекулярной массой 18 КД и более. Ее серологическая активность снижается, примерно, в 8-16 раз в РНАт и конкурентном варианте ТИФА. В других реакциях она не выявляется.

В процессе реассоциации через 18 ч в пробе насчитывается уже более 20 олигомеров, а на 14 сутки практически отсутствуют мономеры и преобладают крупные олигоме-ры с молекулярной массой около 150-500 КД, но не происходит восстановления физико-химической структуры, характерной для нативного капсульного антигена (Ф1). Процесс реассоциации «плавленого» антигена сопровождается повышением его серологической активности в РНАт и конкурентном варианте ТИФА в 2-4 раза, а также восстановлением иммунологической активности в «сэндвич» варианте ТИФА до титра, примерно, соответствующего РНАт.

После кипячения в присутствии 1% ДСНа и 1% р-меркаптоэтанола нативный капсульный антиген диссоциирует в мономер, который обнаруживается только в РНАт и конкурентном варианте ТИФА. Этот процесс сопровождается снижением серологической активности «плавленого» антигена в 300 раз. В случае кипячения фракции I в присутствии только 1% ДСНа она диссоциирует в мономер с молекулярной массой около 18 КД и олигомер с молекулярной массой около 80 КД, что сопровождается снижением серологической активности антигена в 100-200 раз. В присутствии 1% ДСНа, а тем более дополнительно 1% Р~ меркаптоэтанола, частичного восстановления серологической активности капсульного антигена не наблюдается.

Согласно полученным данным, высокая серологическая активность в иммуносуспензионных и иммуноферментных реакциях обусловлена преимущественно свободным капсульным антигеном, а не микробными клетками. Мы это объясняем тем, что биополимеры Ф1 не прочно связаны с клеточной стенкой и после биосинтеза легко отделяются от клеток.

Замена эритроцитов на полиакролеиновые микросферы позволила приготовить и запатентовать принципиально новые иммуноглобулиновые диагностические препараты для серодиагностики чумы (пат. 2012888 Россия, 1994; пат. 2199750 Россия, 2003) . Разработана биотехнология получения диагностикумов суспензионных чумных иммуноглобу-линовых путем сенсибилизации 1 мл 5% взвеси полиакро-леиновых частиц 150 мкг поли- или моноклональных антител к фракции I чумного микроба. Для обеспечения стабильности диагностикума после ковалентной фиксации на носитель специфических иммуноглобулинов препарат обрабатывали 2,5% раствором инертного протеина. Консервирование диагностикума осуществляли 1% формалином или азидом натрия в конечной концентрации 1:500, а также путем лиофильного высушивания. Диагностикум сохранял свою специфическую активность в течение 1 года (срок наблюдения) . Чувствительность отдельных серий препаратов позволяла обнаруживать чумной микроб в концентрации 31,2 - 312 тыс. м.к./мл или 0,6-2,5 нг/мл фракции I чумного микроба.

Оптимизированы методики постановки реакций с латекс-ными диагностикумами в микро- и макрообъемах. Положительный эффект достигается благодаря использованию в качестве разводящей жидкости ФСБ рН 7,2, дополнительно содержащего неполный гидролизат белка куриного яйца 1:50-1:100 и неионный детергент твин-80 1:500001:100000. Получен патент на способ приготовления разводящей жидкости для постановки этих серологических реакций (пат. 2198407 Россия, 2003), который отмечен Дипломом от VI международного салона промышленной собственности «Архимед-2003».

Проведенные испытания показали, что латексные диаг-ностикумы в РНСА не уступают по чувствительности аналогичным эритроцитарным диагностикумам в РИГА при обнаружении капсульного антигена во взвесях микробных клеток и суспензиях внутренних органов, а также в трехкомпо-нентных реакциях не уступают РНАг при исследовании сывороток на наличие противочумных антител. В то же время, полиакролеиновые чумные иммуноглобулиновые диагно-стикумы имеют преимущества перед аналогичными эритроци-тарными, т.к. позволяют четко проводить экспресс-диагностику в объемном методе РНСА в течение 5-2 5 мин по феномену агглютината под малым увеличением микроскопа (пат. 2092852 Россия, 1997) или в течение 1-2 мин путем сканирования агглютината лучом денситометра (пат. 2101356 Россия, 1998), что важно в условиях работы СПЭБ и СНЛК. Аналогичные феномены с эритроцитарными диагностикумами проходят либо в более поздние сроки (30-40 мин) или не так.четко.

Особого внимания заслуживает возможность постановки РНСА «П» на стекле, которую осуществляют путем смешивания 1 капли 0,2-0,3%-ной взвеси частиц латексного диаг-ностикума с 1 каплей исследуемого материала, содержащего Ф1 (взвеси микробных клеток в концентрации 1'108 -1-109 м.к./мл, суспензии внутренних органов, фильтраты проб из объектов внешней среды и т.д.) . Результаты учитывают через 5-10 мин невооруженным глазом. В опытной пробе с Ф1 У. pestis наблюдается формирование четко выраженного агглютината при его отсутствии в контроле. Применение малого увеличения микроскопа позволяет более четко рассмотреть этот агглютинат и контроль.

Хотя с момента разработки первых иммуноферментных тест-систем для обнаружения фракции I прошло уже более 20 лет, ввиду трудоемкости их постановки, использования токсичных реактивов, они не получили широкого практического использования. По нашим данным, существенных различий в чувствительности между иммунофермент-ными тест-системами и иммуносуспензионными реакциями нет. Главным преимуществом иммуноферментного анализа является его высокая специфичность, превышающая таковую у иммуносуспензионных реакций. Поэтому мы рекомендуем использование разных вариантов ТИФА для подтверждения положительных результатов иммуносуспензионных реакций, что бывает особенно важно при исследовании погадок, загнивших трупов животных, сильно загрязненных вязких проб из объектов внешней среды, отдельных сывороток.

Особое место в серологической доктрине следует отвести иммуноферментным тест-системам по типу двойного антительного сэндвича на основе магноиммуносорбентов и иммуноферментных (пероксидазных) конъюгатов. Нами разработана и запатентована биотехнология получения магнитных иммуносорбентных частиц путем включения оксида железа в полиакролеиновые микросферы с последующей сенсибилизацией их чумными иммуноглобулинами к фракции I (пат. 2246968 Россия, 2005).

Приготовленный магнитоуправляемый диагностикум способен фиксировать на своей поверхности капсульный антиген и клетки возбудителя чумы, находящиеся в нестерильной почве. После удаления несвязавшихся с магноиммуносорбентами посторонних частиц и биополимеров путем сепарации микросфер с помощью магнитного поля возбудитель чумы обнаруживался в иммуноферментном анализе с чувствительностью 1"102-1'103 м.к./мл.

Благодаря размещению МИС в специальных ловушках, через которые пропускается исследуемый супернатант пробы, за счет эффекта аффинной хроматографии наблюдается дополнительная концентрация капсульного антигена на сорбенте отчасти объясняющая высокую чувствительность данной тест-системы. Очевидна необходимость использования ее для первичной детекции Ф1 чумного микроба в объектах внешней среды в условиях работы лабораторий СПЭБ •и СНЛК.

С целью оптимизации иммунофлуоресцентного анализа чумного микроба была усовершенствована биотехнология приготовления тест-системы для непрямого метода флуоресцирующих антител. Упростить технологию получения ви-доспецифической антифракционной сыворотки удалось за счет иммунизации кроликов очищенным капсульным антигеном (Ф1) .

Для выявления в мазках клеток чумного микроба, их последовательно обрабатывают кроличьей сывороткой к фракции I чумного микроба в разведении 1:100-1:200, инкубируют 20-30 мин, промывают, и прокрашивают люминес-цирующими антивидовыми (антикроличьими) бараньими иммуноглобулинами в" рабочем разведении в течение 20-30 мин. Такая диагностическая люминесцирующая тест-система позволяет специфически обнаруживать только чумной микроб в концентрации 1"106-1"107 м.к./мл.

Нами разработаны и утверждены зам. директора по научной работе СтавНИПЧИ: «Методические рекомендации по индикации возбудителей особо опасных инфекционных заболеваний (чума, туляремия, бруцеллез, сибирская язва, холера) в СПЭБ и СНЛК в условиях чрезвычайных ситуаций» (Ставрополь, 2003), в которых предложена схема наиболее целесообразного использования различных диагностикумов и тест-систем для обнаружения капсульного антигена при проведении специфической индикации на чуму. Она содержит 5 основных стадий анализа, включает постановку ПЦР и проведение бактериологического анализа (табл.25).

По нашему мнению, в основе специфической индикации чумы в настоящее время по-прежнему остаются сертифицированные чумные антительные эритроцитарные и иммунолю-минесцирующие диагностикумы. Экспериментальные серии латексных иммуноглобулиновых диагностикумов предлагаются в качестве дополнительного теста и в перспективе могут придти на замену эритроцитарным. Сертифицированные и экспериментальные серии иммуноферментных тест-систем, включая магноиммуносорбентные, в настоящее время и, по-видимому, отдаленной перспективе будут применяться в качестве дополняющих методов для подтверждения специфичности результата, или при невозможности исследования материала иммуносуспензонными методами.

Очевидно, что оптимизация серодиагностики чумы зависит и от совершенствования методик, позволяющих в короткие сроки накапливать большое количество искомого антигена. Поэтому особое место в работе отведено оптимизации условий биосинтеза фракции I.

Проведенные исследования показали, что нет необходимости в увеличении времени подращивания бактерий чумы при 37°С до трех и более суток; повышении температуры выращивания до 38,5°С; применении последовательного культивирования: сначала при 28°С, а затем при 37°С. Культивирование чумного микроба для серологического анализа достаточно вести при 37°С в течение 2 суток на агаре или бульоне Хоттингера рН 7,2 с 1% гемолизирован-ной крови.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Зайцев, Александр Алексеевич, Ставрополь

1. Акимович В.В., Доброцветова Т.Я. Количественный состав антигенов бактерий чумы и псевдотуберкулеза по результатам преципитации в агаре. Соообщение 1. Антигенный состав бактерий чумы // Тр. ин-та «Микроб». Саратов, 1960. - Вып.4. - С.210-216.

2. Алиев М.Н., Булах О. С. Опыт применения серологической диагностики чумы в природных очагах Восточного Закавказья // Современные проблемы серологических исследований при эпидемиологическом надзоре в природных очагах чумы

3. СССР: Тез. докл. на Всесоюз. конф. (март 1982) . Саратов, 1982. - С.46-48.

4. Анисимов А.П., Захарова Н.М. Серовариация капсульного антигена возбудителя чумы // Молекул, генетика, микро-биол. и вирусология. 1992. - №9-10. - С.26-29.

5. Анисимов П.И., Сердобинцев J1.H., Иванов Ю.В., Тараненко Т.М., Наумов A.B. Некоторые физико-химические особенности капсульного белка чумного микроба // Молекул, генетика, микробиология и вирусология. 1987. - №2. - С. 2427.

6. Апарин Г.П., Голубинский Е.П. Микробиология чумы: Руководство. Иркутск: Изд-во Иркут. ун-та, 1989. - 91 с.

7. Апарин Г.П., Саран М. О перспективах применения серологических методов обследования эпизоотических чумных очагов Монгольской Народной Республики // Докл. Иркутск, противочумного ин-та. 1974. - Вып.10. - С.85-87.

8. Афанасьев E.H. Научно-методические аспекты экспресс-диагностики возбудителей особо опасных зоонозных инфекций (чума, бруцеллез, сибирская язва) : Автореф. дис. . д-ра мед. наук. Ростов-на-Дону, 2000. - 46 с.

9. Ашмарин И.П., Воробьев A.A. Статистические методы в микробиологических исследованиях. -Л.: Медгиз, 1962. 180 с.

10. Басова H.H., Канатов Ю.В. Системы серологических реакций // Серологические методы диагностики при эпизоотологиче-ском обследовании природных очагов чумы: Тематич. сб. -Саратов, 1975. С.30-42.

11. Баяр Г.А., Коникова P.E., Крылов В.Н. Капельный метод постановки реакции непрямой гемагглютинации с чумными бактериями // Пробл. особо опасных инф. Саратов, 1968. - №3. - С.95-97.

12. Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп пато-генности. Санитарные правила. М., 1994. - 152 с.

13. Безсонова A.A., Ленская Г.Н., Молодцова П., Мосолова О. Сообщение о нескольких фактах спонтанного перехода В. Pestis в В. Pseudotuberculesis rodentium Pfelffer'а // Вестник микроб., эпидемиол. и паразит. 1936. - T.XV. -Вып.2. - С.151-162.

14. Бинатова В.В. Совершенствование методов лабораторной диагностики лептоспиноза: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Саратов, 1999. - 29 с.

15. Быкова О.И. Микроскопический учет РИГА в целях экспрессной серодиагностики некоторых особо опасных инфекций // Особо опасные и редко встречающиеся тропические инфекции: Тез. докл. науч. конф. (окт. 1980 г.). Волгоград, 1980. - С.8-9.

16. Введение в иммунологию. Пер. с англ. / Под ред. А.Я. Кульберга. М.: Высшая школа, 1983. - 160 с.

17. Вейнблат В.И. Антигены Yersinia pestis (Биохим. и имму-нол. аспекты) : Атореф. дис. . д-ра мед. наук. Саратов, 1974. - 36 с.

18. Вейнблат В.И. К вопросу применения микрометода в серологических исследованиях, проводимых в природных очагах чумы / / Профилактика природноочаговых инфекций: Тез. докл. Всесоюз. науч.-практич. конф. (6-8 дек. 1983 г.).- Ставрополь, 1983. С.336-337.

19. Вейнблат В.И., Павлова Ю.П. Применение реакции агломерации ализариновых суспензионных антител для количественного, определения фракции I // Пробл. особо опасных инф. Саратов, 1969. - №4. - С.51-53.

20. Венгеров Ю.Ю., Леви М.И., Волков Д.В., Свешников П.Г., Соверин B.C. Системы серологических реакций с использованием иммуноспецифических реагентов, меченых ферментом // ЖМЭИ. 1987. - №8. - С.56-61.

21. Вильяме Д.Э., Арнтцен Л., Тиндал Г.Л., Йзексон М. Применение иммуноферментных тестов для подтверждения клинического диагноза чумы в Намибии, 1982 г. // Бюлл. ВОЗ. -1986 Т.64, №5. - С.98-106.

22. Войтенко A.M., Рачинина H.A., Пак М.И. О результатах серологического исследования на чуму грызунов Гиссарского хребта // Проблемы особо опасных инфекций. Саратов, 1972. - Вып.4 (26). - С.154-155.

23. Волосивец А.И. Фагоустойчивые мутанты чумных бактерий и их свойства // Бкшл. экспер. биол. и мед. 1963. - №11. - С.107-110.

24. Воробьев С.М., Венгеров Ю.Ю., Свешников Н.Г., Нисанов

25. Гинцбург A.JI. Плазмиды и мобильные генетические элементы патогенных бактерий рода Yersinia // Генетика. 1987. -Т.23., №4. - С.581-595.

26. Голубинский Е.П., Рудник B.C., Меринов С.П., Колосов В.М., Федоров Ю.М., Рыбин С.А. Сравнительная характеристика гемагглютинационных и иммуноферментного методов в диагностике чумы // ЖМЭИ. 1983. - №12. - С.92.

27. Голубинский Е.П., Рудник B.C., Рудник М.П., Меринов С.П., Поляченко В.М. Обнаружение фракции I чумного микроба ферментноиммунологическим методом // Проблемы изучения механизма эпизоотии чумы: Тез. докл. на Всесоюз. конф. Саратов, 1980. - С.9-11.

28. Гремякова Т.Д., Стапаншина В.Н., Шулюпин O.K., Негрий В.Ф., Мицевич Е.В. Экспрессия основных антигенов и ростовые свойства клеток Y. pestis в средах различного состава при 37°С // ЖМЭИ. 1993. - №1. - С.16-20.

29. Девдариани 3.JI., Федорова В.А., Солодовников Н.С., Плотников О.П., Шульгина И.В. Иммуноферментная тест-система для идентификации типичных и атипичных штаммов чумного микроба // Медицинская паразитология и паразитарные болезни.- 1997.- №1.- С. 31-33.

30. Дробков В.И., Абдуллин Т.Г., Дармов И.В. Использование иммуноферментного анализа при лабораторной диагностике чумы // ЖМЭИ 1991. - №10. - С.40-42.

31. Дубичев А.Г., Воронцов В.Д., Сердобинцев Л.И., Некрасов

32. A.B., Наумов A.B. Некоторые особенности белок-белковых взаимодействий молекул капсульного антигена чумного микроба // Микробиол, иммунол. и биохимия особо опасных инфекций: Тр. противочумных учр. СССР. Саратов, 1987. -С.41-45.

33. Евченко Ю.М., Бейер А.П., Грижебовский Г.М., Гончаров

34. Евченко Ю.М., Зайцев A.A., Брюханов А.Ф., Щедрин В.И., Царева Н.С., Борздова И.Ю., Лемякин Г.И., Брюханова Г.Д. Способ обнаружения чумного микроба в объектах внешней среды: Пат. 2149407 Россия; Заявл. 17.11.98, Опубл. 20.05.2000, Бкот .№14.

35. Езепчук Ю.В. Биомолекулярные основы патогенности бактерий. М., 1977. - 276 с.

36. Ерохин Е.П., Малинкова Е.Б., Башнин Ю.И. Способ получения диагностикума для идентификации возбудителя чумы: A.c. СССР на изобретение №1227006 от 11.12.1284 г.

37. Ефременко В.И. Магноиммуносорбенты в микробиологических исследованиях. Ставрополь, 1996. - 131 с.

38. Ефременко В.И., Метлин В.Н., Рыбкин B.C. Молекулярная организация термолабильных токсинов возбудителя чумы // Иммунология и иммунопрофилактика чумы и холеры: Тез. докл. Всесоюз. конф. Саратов, 1980. - С.34-36.

39. Ефременко Д.В. Совершенствование экспрессных методов индикации микобактерий туберкулеза: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Ставрополь, 2005. - 24 с.

40. Жарникова И.В., Тюменцева И.С., Ефременко В.И., Афанасьев E.H., Бинатова В.В. Способ получения иммуносорбента (варианты): Пат. 2138813 Россия; Заявл. 20.11.97; Опубл. 27.09.99, Бкш. №27.

41. Жуков-Вережников H.H. Иммунология чумы.- М.: МедГИЗ, 1940. 268 с.

42. Жуков-Вережников H.H., Пехов А.П. Генетика бактерий. -М.: МедГИЗ, 1963. 458 с.

43. Завадский K.M. Вид и видообразование.- Л.,1968. 382 с.

44. Зайцев A.A. О выявлении моновалентного антигена чумного микроба иммуноферментным методом // Актуальные вопросы иммунопрофилактики особо опасных инфекций: Тез. докл. Всесоюз. науч.-практич. конф. (26-27 мая 1986 г.). -Ставрополь, 1986.- 4.1. С.98-101.

45. Зайцев A.A. Способ получения диагностикума суспензионного чумного антигенного на основе фракции I: Пат. 2199750 Россия; МПК 7 С 12 № 11/08; G01 №331543; Заявл. 20.02.01; Опубл. 27.02.03, Бюл. №6.

46. Зайцев A.A., Бинатова В.В. Способ постановки реакции ла-тексной агглютинации: Пат. 2198407 Россия; МПК 7 G01 №331531; 33/569; Заявл. 20.02.01; Опубл. 10.02.03, Бюл. №4.

47. Зайцев A.A., Евченко Ю.М., Щедрин В.И., Царева Н.С. Способ восстановления способности к биосинтезу капсульного антигена чумного микроба: Пат. 2155962 Россия; Заявл. 04.02.99, Опубл. 10.09.2000, Бюл.№25.

48. Зайцев A.A., Лопаткин О.Н. Изучение антигена общего для возбудителей чумы и псевдотуберкулеза с помощью монокло-нальных антител. Ставрополь, 1986. - 16 с. - Деп. в ВИНИТИ 23.12.86, №8771-В. // Р.Ж. Микробиол., сан. и мед. - 1987. - Б5 Ц 219 Деп.

49. Зайцев A.A., Розанова Г.Н. Сравнительная характеристика штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов, выделенных в Прикаспийском Северо-Западном природном очаге в 1980-81 гг./ Науч.-исслед. противочумный ин-т Кавказа и

50. Закавказья. Ставрополь, 1984. - 10 с. - Библиогр. : 23 назв. - Деп. в ВИНИТИ 06.04.84, №2076-84 Деп.

51. Закревский В.И., Плеханова Н.Г., Храмов В.А. некоторые свойства уреазы, инкапсулированной в липосомы // Укр. биохим. журн. 1986. - Т.58, № 4. - С. 31-35.

52. Заплатина С.И. Изучение антигенов чумных и псевдотуберкулезных микробов методом преципитации в агаре (соообще-ние 2) //Тр. Ростовского-на-Дону науч.-исслед. противочумного ин-та. Ростов н/Д, 1957. - Т.15. - С.298-306.

53. Зацепин В.И., Зайцев A.A. Способ серодиагностики кап-сульного антигена чумного микроба: Пат. 2092852 Россия; Заявл. 15.04.94; Опубл. 10.10.97, Бюл. №28.

54. Инструктивно-методические материалы по применению серологических методов диагностики при эпизоотологическом обследовании природных очагов чумы. М., 1983. - 136 с.

55. Инструкция по изготовлению и контролю диагностикума суспензионного чумного моноклонального сухого. Ставрополь, 1989. - 167 с.

56. Инструкция по изготовлению и контролю тест-системы диагностической для обнаружения возбудителей чумы, сапа, ме-миоидоза, туляремии, бруцеллеза, сибирской язвы в непрямом иммунофлюоресцентном методе. Ставрополь, 1990. -182 с.

57. Инструкция по применению тест-системы иммуноферментной моноклональной для идентификации капсульного антигена возбудителя чумы. М., 1986. - 4 с.

58. Калмыкова Л.И. Биологические свойства и белковый спектр водорастворимых фракций штаммов чумного микроба, выделенных в очагах Кавказа: Автореф. дисс. . канд. мед. наук. Саратов, 1984. - 22 с.

59. Калмыкова Л.И., Лалазарова И.Г., Сучков Ю.Г., Ефременко

60. Кальной С.М., Жарникова И.В., Зайцев A.A. Способ получения магноиммуносорбента для обнаружения бактериальных антигенов: Пат. 2246968 Россия; Заявл. 31.03.03, Опубл. 27.02.05 г., Бюл. №6.

61. Кальной С.М., Зайцев A.A. Способ индикации бактериальных антигенов: Пат. 2102761 Россия; Заявл. 05.12.94, Опубл. 20.01.98 г., Бюл. №2.

62. Кальной С.М., Зайцев A.A., Шишов И.Н., Мирошниченко А.И. Способ индикации бактериальных антигенов: Пат. 2101356 Россия; Заявл. 11.04.95, Опубл. 10.01.98 г., Бюл. №1.

63. Кальной С.М., Кучеренко И.Ф., Кузякова Л.М. Ускорение РПГА в электрическом поле // Иммунология и специфическая профилактика особо опасных инфекций: Матер. Российской науч. конф. (21-23 сент. 1993 г.). Саратов, 1993 в. -С.277-278.

64. Каминский Л.С. Статистическая обработка лабораторных и клинических данных. Л., «Медицина», 1964. - 252с.

65. Канатов Ю.В. Реакция обнаружения гаптенов с помощью эритроцитов, сенсибилизированных антителами // Материалы 8 науч. конф. противочумных учр. Средней Азии и Казахстана. Алма-Ата, 1974 а. - Вып.1. - С.11-13.

66. Канатов Ю.В. Система серологических реакций для исследования грызунов при эпизоотологическом обследовании на чуму // Материалы конф., посвящ. 50-летию ин-та «Микроб». Саратов, 1968 а. - С.61-63.

67. Канатов Ю.В. Система серологических реакций при чуме. I. Принципы конструирования систем. Диагностика заболеваний у животных // Материалы 6 науч. конф. противочумных учр. Средней Азии и Казахстана. Алма-Ата, 1969 а. - Вып.1. - С.28-31.

68. Канатов Ю.В. Система серологических реакций с сенсибилизированными эритроцитами для обнаружения антигенов и антител: Автореф. дис. . д-ра мед. наук. Саратов, 1974 б. - 36 с.

69. Канатов Ю.В., Лобачев B.C., Дмитриев П.П., Лапин И.С., Канатова Е.А., Ролдугина В.И. Применение серологических тестов для ускоренного эпизоотологического обследования в природном очаге чумы // ЖМЭИ. 1968 б. - №11. -С.127-131.

70. Канатов Ю.В., Новиков Г.С. Системы серологических реакций при чуме. V. Динамика антител у больших песчанок при подножном заражении // Материалы 7 науч. конф. противочумные учр. Средней Азии и Казахстана. Алма-Ата, 1971 а. - С.120-212.

71. Классовский Л.И., Петров B.C. Об эволюционной адаптации возбудителя чумы' к существованию в системе грызун-блоха

72. Пробл. особо опасных инф. Саратов, 1968. - Вып.4. -С.178-179.

73. Классовский Л.Н., Сучков Ю.Г. К вопросу о «видообразую-щей» изменчивости возбудителя чумы // Микробиология и биохимия возбудителей особо опасных инфекций: Тр. противочумных учр. СССР. Саратов, 1982. - С.3-7.

74. Кобьшкова Л.Е., Кийко В.Ф., Леви М.И. Обнаружение кап-сульного антигена возбудителя чумы в погадках хищных птиц и испражнениях наземных хищников на территории Туркмении // Зоол. журн. 1974. - Т.53, №5. - С.807-810.

75. Коссе Л.В., Лебедева С.А., Кузнецова Л.С., Чернявская

76. A.C., Заренков М.И. Новые данные, относящиеся к специфичности и генетическому контролю капсульного антигена (Ф1) Y. pestis // ЖМЭИ. 1997. - №2. - С.29-33.

77. Костюковский В.М. Разработка методов лабораторной диагностики Л-форм чумного микроба: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Саратов, 1989. - 20 с.

78. Котурга Л.Н., Классовский Л.Н., Осадчая Л.М., Петров

79. B.C. Сравнительная характеристика патоморфологических изменений, вызванных природным и «новообразованными» штаммами возбудителя псевдотуберкулеза // Пробл. особо опасных инф. Саратов, 1969. - Вып.З. - С.10-12.

80. Кравченко А.Г., Соколов М.И.Адсорбция специфических полисахаридов бактерий эритроцитами человека // ЖМЭИ. -1946. №12. - С.10-16.

81. Кузнецова К.А., Леви М.И. Инструктивно-методические материалы по применению серологических методов диагностикипри эпизоотологическом обследовании природных очагов чумы. М., 1983 - 136 с.

82. Кузнецова К.А., Марин С.Н., Тесленко Б.Б. Применение методов серологических исследований в природных очагах чумы СССР // Пробл. особо опасных инф. Саратов, 1979. -Вып.6 (70). - С.12-18.

83. Кузнецова К.А., Хотько Н.И., Иванов В.И. Основные направления совершенствования серологических исследований при эпидемиологическом надзоре в природных очагах чумы СССР // Иммунология и профилактика особо опасных инфекций. Саратов, 1982. - С.3-7.

84. Куклева J1.M., Проценко О.А., Кутырев В.В. Современные представления о родстве возбудителей чумы и псевдотуберкулеза // Молекул. генетика, микробиол. и ви-русол.- 2002.- №1.- С.3-7.

85. Куляш Г.Ю., Головко Е.М., Ляцин М.И. Изучение белковой экспрессии Y. pestis в динамике длительного культивирования in vivo // Молекул, ген., микробиол. и вирусол. -1991. №8. - С.16-20.

86. Лалазарова И.Г. Об изменчивости чумного микроба под действием террамицина // Специфическая профилактика особо опасных инф. М.: Медицина, 1964. - С.371-381.

87. Лашкевич В.А. Использование моноклональных антител в вирусологии // Вопросы вирусологии. 1983. - №6. - С.648-656.

88. Леви М.И. Воспроизводимость результатов определения активности антител и антигенов в микротитраторе Такачи // Лабораторное дело. 1982 а. - №7. - С.38-40.

89. Леви М.И. Дискретный характер аффинитета антител иммунных сывороток и значение этого фактора для связывания антигена // ЖМЭИ. 1983. - №4. - С.98-103.

90. Леви М.И. Значение серологических методов для эпизоото-логического обследования на чуму // Тез. докл. науч. конф. по природной очаговости и профилактике чумы и туляремии (30 окт.-2 нояб. 1962 г.). Ростов н/Д., 1962 а. - С.26-37.

91. Леви М.И. Математическое моделирование взаимодействия капсульного антигена чумного микроба с антителами разного аффинитета // Антибиотики и мед. биотехнология. -1986. №3. - С.203-209.

92. Леви М.И. Перспективы применения иммунологических методов для эпизоотологического обследования на чуму // Тр. Азербайдж. противочумной станции. 1962 б. - Т.З. -С.239-241.

93. Леви М.И., Венгеров Ю.Ю., Волков Д.В., Лифшиц М.М., Ака-новский Л.Н., Курочкин С.Н., Свешников П.Г. Использование моноклональных антител в иммуноферментном анализе для доказательства одновалентности антигена // ЖМЭИ. -1984. №11. - С.84-88.

94. Леви М.И., Момот А.Г. Выход и характеристика водорастворимых фракций различных штаммов бактерий чумы // Сб. науч. работ Элистинской противочумной станции. -1961 а. Вып.2. - С.111-121.

95. Леви М.И., Момот А.Г. Серологические исследования при чуме. Сообщ. VII. Реакция нейтрализации антител // Сб. науч. работ Элистинской противочумной станции. -1961 б. С.207-214.

96. Леви М.И., Орлова Г.М., Сучков Ю.Г. Опыт изготовления формалинизированных эритроцитов, сенсибилизированных капсульным антигенов возбудителя чумы // Вопросы биологии микроорганизмов и прикладной иммунологии. Кишинев, 1963 а. - С.134-135.

97. Леви М.И., Сагатовская Л.А., Момот А.Г. Определение фракции I у различных штаммов возбудителя чумы // Микробиология и иммунология особо опасных инфекций. Саратов, 1964 а. - С.125-127.

98. Леви М.И., Сучков Ю.Г., Орлова Г.М., Герасюк Л.Г. Значение серологического метода для эпизоотологического обследования диких грызунов на чуму // Журн. гиг., эпиде-миол., микробиол. и иммунологии (Прага). 1964 б. -Т.8, №4. - С.344-348.

99. Леви М.И., Шимко Т.А., Сазыкин А.Ю., Навашин С.М. Использование ß-лактамазы из Bacillus licheniformis 749/С для твердофазного иммуноферментного анализа // Антибиотики и мед. биотехнология. 1985. - №9. - С.662-665.

100. Леви M.И., Шимко Т.А., Темиралиева Г.А. Испытание в полевой практике иммуноферментного метода с применением беталактамазы в качестве маркера моноклональных антител к капсульному антигену чумного микроба // ЖМЭИ. 1987.- №3. С.43-49.

101. Ленская Г.Н. Изменчивость чумного микроба: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Саратов, 1946. - 28 с.

102. Лобачев B.C., Леви М.И., Лившиц М.М. Сохранение специфического антигена возбудителя чумы в погадках хищных птиц // Зоол. журн. 1971. - Т.50, вып.10. - С.1593-1595.

103. Лукин Ю.В. Синтез и исследование полимерных дисперсных систем для иммуноанализа: Автореф. дис. . канд. хим. наук. М., 1986. - 17 с.

104. Лукин Ю.В., Базарев В.Н., Зайченко A.C., Воронов С.А., Зубов В.П., Грицкова И.А., Правдеников А.И. Полиакролеи-новые латексы: синтез, введение наполнителей и механизмы формирования // ДАН СССР. 1985 а. - Т. 285, №1. -С.159-161.

105. Лукин Ю.В., Трифонов В.Д., Туркин С.И., Зубов В.П. Поли-акролеиновые латексы в качестве иммунореагентов // Труды МХТИ. М., 1985 б. - Вып.135. - С.88-92.

106. Малецкая О.В. Сравнительное изучение специфичности и чувствительности серологических реакций при диагностикечумы в природных очагах на Кавказе: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Саратов, 1987. - 20 с.

107. Манолов А.Д., Васильев В.П., Закревский В.И., Снегирев1 ос.

108. Е.А., Калеи Г.М. Получение высокоактивного меченного I капсульного антигена чумного микроба // ЖМЭИ. 1987. -№7. - С.117-118.

109. Марин С.Н. Оценка эпизоотологического состояния территорий по данным серологического исследования грызунов // Серологические методы диагностики при эпизоотологическом обследовании природных очагов чумы: Тематич. сб. Саратов, 1975 а. С.138-148.

110. Марин С.Н. Роль методов серологической диагностики при эпизоотологическом обследовании природного очага чумы // Международные и национальные аспекты эпиднадзора по чуме: Тез. к науч. конф. Иркутск, 1975 б. - 4.1. -С.106-107.

111. Марин С.Н., Пейсахис JI.A., Шмутер М.Ф., Черченко И.И. Методы серологических исследований и их место в профилактике чумы / / Профилактика чумы в природных очагах: Материалы конф. (март 1973 г.) Саратов, 1973. - С.123-129.

112. Метлин В.Н. Значение «мышиного» токсина в иммуногенности чумного микроба // Пробл. особо опасных инф. Саратов,k ■ 1968 а №3. - С.46-51.

113. Метлин В.Н. Серологический анализ токсинообразующей способности бактерий чумы // Пробл. особо опасных инф. -Саратов, 1968 б. №3. - С.28-33.

114. Метлин В.Н. Характеристика вирулентности и токсичности чумного микроба, утратившего способность к синтезу фракции I Бейкера //. Пробл.особо опасных инф. Саратов, 1968 в. - №3. - С.39-45.

115. Метлин В.Н., Земцова И.Н., Гиззатуллина С.К. Иммуноген-ная активность штамма чумного микроба 231 А, не синтезирующего «мышиный» токсин // Пробл. особо опасных инф. -Саратов, 1973. №1. - С.68-71.

116. Метлин В.Н., Попов A.A. Иммуноэлектрофоретическое изучение «мышиного» токсина чумного микроба // Пробл. особо опасных инф. Саратов, 1968. - №3. - С.34-38.

117. Милин В.М., Щербаков A.A., Айманова O.JI., Канатов Ю.В.,

118. Темиралиева Г.А., Кравченко Н.П. Изучение причин парадоксальных результатов серологических исследований при диагностике чумы // Тр. противочумных учр. СССР. Саратов, 1991. - С.45-52.

119. Михайлова P.C., Беккер M.JI. Изменение свойств штамма Y. pestis EV под воздействием антисьюороток бактерий и нук-леотидный состав его ДНК // ЖМЭИ. 1966. - №10. - С. 2529.

120. Мишанькин Б.Н., Васильева Г.И., Козловский В.Н., Мишань-кин М.Б., Ермоленко Т.Д., Веркина JT.М. «Мышиный» токсин- суперантиген чумного микроба // Иммунология.- 1997.-№б- С. 24-27.

121. Мишанькин Б.Н., Шевченко JI.A., Коробейник Н.В., Диханов Г. Г. Возможный путь реализации повышенной температуры культивирования у чумного микроба // ЖМЭИ. 1984. - №6.- С.42-47.

122. Моноклональные антитела. Гидридомы: новый уровень биологического анализа / Пер. с англ. под ред. Р.Г. Кеннета, Мак-Карна Т. Дж., Бехтол К.Б. М.: Медицина, 1983. -416 с., ил.

123. Наставление по эпиднадзору в природных очагах чумы Кавказа. Ставрополь, 1986. - 71 с.

124. Наумов A.B., Самойлова Л.В. Лабораторная диагностика чумы. Саратов, 1992. - 24 с.

125. Неронов В.М., Доброхотов Б.П., Мещерякова И.С. Серологическое исследование погадок пернатых хищников в окрестности станции Ималь-баба Туркменской ССР // ЖМЭИ. -1974. №12. - С.38-40.

126. Никитин В.М. Справочник методов иммунологии. Кишинев: «Штиинца», 1982. - 304 с.

127. Николаев Н.И., Гольдфарб Л.М., Земцова И.Н., Метлин В. Н., Пунский Е. Е. К вопросу об изучении антигенной структуры чумного микроба // Пробл. особо опасних инф. -Саратов, 1969. №5. - С.5-8.

128. Организация и проведение работы специализированными противоэпидемическими бригадами в чрезвычайных ситуациях: Методические указания. М. : Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2000. - 53 с.

129. Палагин А.Ю. Фибринолизин чумного микроба: биохимические и иммунохимические аспекты: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Саратов, 1993.- 23с.

130. Поляк Р., Кату Р., Каруш Ф. Иммуноглобулины. М. : Мир, 1981. - 435 с.

131. Попов A.A., Прокофьева В.П., Дальвадянц С.М. Об антигенном родстве бактерий псевдотуберкулеза и чумы по данным иммуноэлектрофореза // Пробл. особо опасных инф. Саратов, 1972. - №1. - С.33-36.

132. Попов В.А. Применение системы серологических реакций при исследовании полевого материала из Закавказского высокогорного очага чумы // Микробиология, эпидемиология и профилактика инфекционных заболеваний: Тез. докл. -Ставрополь, 1974. С.258-260.

133. Попов В.А., Нурмагомедов М.М., Осипова С.П. Серологическое исследование горных сусликов и блох из очага чумы Центрального Кавказа // Проблемы особо опасных инфекций. Саратов, 1978. - Вып.1 (59). - С.37-41.

134. Попов Ю.А. Структурная и функциональная организация плазмид чумного микроба и генно-инженерные разработки на этой основе: Автореф. дис. . д-ра биол. наук. Саратов, 1992. - 25 с.

135. Природные очаги чумы Кавказа, Прикаспия, Средней Азии и Сибири / Под. ред. Г.Г. Онищенко, В.В. Кутыре-ва.- ОАО Издательство «Медицина», 2004.- 192 е.: ил.

136. Пунский И.Е., Трауб JI.A. Применение реакции агломерации на стекле для экспресс-анализа чумы // Биотехнология, иммунология и биохимия особо опасных инфекций. Саратов, 1989. - С.107-109.

137. Рыцай Т. Специфическая агглютинация эритроцитов, покрытых антителами // Бюл. Польской АН Отд-ние 2. 1956. -Т.4, №9. - С.335-339.

138. Рудник М.П. Разработка и применение иммуноферментного метода для диагностики чумы: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Саратов, 1985. - 18 с.

139. Рудник М.П., Голубинский Е.П., Меринов С.П., Маевский М.П., Гриднева Л.Г. Применение энзимосвязанного иммуно-сорбентного определения (ELISA) для диагностики чумы // Иммунология. 1983. - №6. - С.74-76.

140. Рудник М.П., Дубровина В.И., Иннокентьева Т.И. Динамика образования антител и элиминация антигена при экспериментальной чуме у основных носителей очагов Сибири // Chinese J. of control of endemic diseases. 1999. -V.14. - P.217-220.

141. Руководство по противоэпидемическому обеспечению населения в чрезвычайных ситуациях. М., 1995. - 439 с.

142. Руководство по профилактике чумы / Под общей ред. проф. Наумова A.B. и проф. Самойловой Л.В. Саратов, 1992. -278 с.

143. Сакваралидзе Л.А., Нерсесов В.А., Царцвадзе Н.С., Гиор-гадзе Т.С. Эффективность серологических методов исследования в полевочном очаге чумы // Изв. АН СССР. Сер. биол. 1983. - Т.9, №6. - С.419-423.

144. Сергиев В.П., Федоров Ю.М., Леви М.И., Канатов Ю.В. Результаты испытания чумного антительного моноклонального эритроцитарного диагностикума // ЖМЭИ. 1985. - №11. -С.82-87.

145. Сердобинцев Л.И., Тараненко Т.М., Терентьев С.А., Наумов

146. A.B. К вопросу о макромолекулярной организации капсульного антигена // Диагностика особо опасных инфекций: Тр. противочумных учр. СССР. Саратов, 1983. - С.39-44.

147. Серенко А.Ф., Ермакова В.В. Социальная гигиена и организация здравоохранения.- М., «Медицина», 1977.- 672 с.

148. Смелянский В.П., Зыкин Л.Ф., Манолов А.Д., Мананков

149. B.В., Зайцев A.A. Способ получения латексного диагностикума: Пат. 2012888 Россия; Заявл. 3.06.91, Опубл. 15.05.94, Бкш. №9.

150. Смирнова Е.И., Чибрикова Е.В. К вопросу об антигенной структуре псевдотуберкулезного микроба // Тр. ин-та «Микроб». Саратов, i960. - С.220-227.

151. Соколова Н.М. К вопросу о мутации вакцинного штамма ЕВ // Пробл. особо опасных инф. Саратов, 1971. - Вып. 3(19). - С.130-135.

152. Сун Чжичжоу. Совершенствование экспрессных методов индикации чумного микроба: Автореф. дис. . канд. мед. наук.- Саратов, 2000. 26 с.

153. Сучков Ю.Г., Канатов Ю.В. Сенсибилизация формалинизиро-ванных эритроцитов иммунными гамма-глобулинами // ЖМЭИ.- 1965. №8. - С.63-67.

154. Тамбовцев Е.П., Ахметкалиев С.Г., Пятницкий H.H. Методы статистической обработки результатов серологических исследований // ЖМЭИ. № 10. - С. 26-31.

155. Тенджерди Р., Хиллам Р. Дифференциация штаммов Y. pestis по количественному содержанию в них «мышиного» токсина и фракции I // Бюл. ВОЗ. 1974. - Т.48, №3. - С.305-313.

156. Титенко М.М. Исследование антигенов, специфичных для возбудителя чумы, с целью совершенствования методов диагностики: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Саратов, 1985. - 20 с.

157. Топорков В.П. Теоретические и практические аспекты информативности методов диагностики чумы при эпидемиологическом надзоре в природных очагах: Автореф. дис. . д-ра мед. наук. Саратов, 1997. - 52 с.

158. Трауб JI.A. Усовершенствование биологического и серологического методов диагностики чумы: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Саратов, 1990. - 23 с.

159. Тынянова В.И., Демидова Г.В., Плетницкий А.Э., Кубанцева Е.П., Подладчикова О.Н., Беспалова И.А., Гончаров Е.К.,

160. Тюлембаев М.А. Влияние температуры на свойства капсуль-ного антигена // Материалы V объединенного съезда гигиенистов, эпидемиологов, анкробиологов и инфекционистов Казахстана. Алма-Ата, 1991. - T.V. - С.102-103.

161. Тюлембаев М.А. Капсульный антиген чумного микроба и его применение: Автореф. дис. . д-ра мед. наук. Алматы, 1996. - 51 с.

162. Уильяме Д.Э., Джентри М.К., Брэден К.А., Лейстар Ф., Йолкен Р.Х. Использование реакции энзиммеченных антител для количественного определения антигенемии при острой чуме // Бюл. ВОЗ. 1984. - Т.62, №3. - С.69-72.

163. Филимонова Ю.А. Динамика иммунологических реакций у экспериментальных животных, привитых против чумы: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Ставрополь, 1972. - 22 с.

164. Хажакян Г.К., Шехикян М.Т., Вартанян A.A., Хангулян Э.К. Серологические исследования по выявлению специфического чумного антигена в Закавказском высокогорном очаге // Биол. журн. Армении. 1981. - Т.34, №11. - С.1170-1175.

165. Шимко Т.А. Использование пенициллиназы и моноклональных антител к капсульному антигену чумного микроба в иммуноферментном анализе для диагностики чумы: Автореф. дисс. . канд. биол. наук. Саратов, 1988. - 18 с.

166. Шмальгаузен И.И. Проблема дарвинизма. Л.: Наука, 1969. - 298 с.

167. Щедрин В.И., Шашаев М.А., Лямкин Г.И., Царева Н.С., Майский В. Г., Зайцев A.A. Способ лабораторной диагностики чумы: Пат. 2077591 Россия; Заявл. 8.04.93, Опубл. 20.04.97, Бюл. №11.

168. Щербаков A.A. Мембранные белки чумного микроба (теоретические и прикладные аспекты) : Автореф. дис. . д-ра биол. наук. Саратов, 1991. - 36 с.

169. Яблоков A.B., Юсуфов А.Г. Эволюционное учение. М. : Высшая школа, 1976. - 256 с.

170. Ян Гуйжун. Биологические особенности штаммов чумного микроба из природных очагов России и Китая: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Саратов, 2000. - 23 с.

171. Яхьяев А.Д., Канатов Ю.В. Система серологических реакций при чуме. Сообщ.8. Динамика антител у больных песчанок, инфицированных в природе // Материалы 8 науч. конф. противочумных учр. Средней Азии и Казахстана. Алма-Ата, 1974. - С.150-153.

172. Ящук А.П. К вопросу о видообразовании у чумного микроба на искусственных питательных средах // Тр. ин-та «Микроб». Саратов, 1960. - С.141-147.

173. Abath F.G.C., Almeda A.M.Р., Ferreira L.C.S. Electropho-retic characterization of the onter membrane proteins of Y. pestis, isolated in north-east Brasil // Epidemiol.1.fect. 1989. - V.103, №3. - P.595-602.

174. Abath F.G.C., Almeda A.M.P., Ferreira L.C.S. Identification of surface-exsposed Y.pestis proteins by radio-iodination and biotinylation // J. Med. Microbiol. -1992.- №6.- P. 420-424.

175. Backer E.E., Sommer H., Foster L.E. Studies of immunization against plaque. I.The isolation and characterization of the soluble antigen of P. pestis // J.Immunol. -1952. V.68, №2. - P.131-145.

176. Bahmanyar M., Cavanaugh D.C. Plaque. Manual. Geneva, 1976.

177. Bradford M.W. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. -1976. V.72, №2. - P.248-254.

178. Brubaker R.R. The genus Yersinia; Biochemistry and genetics of virulence // Curr. Top. Microbiol. Immunal. -1972. V.57. - P.III. - 158.

179. Burrows T.W. Virulence Pasteurell pestis and immunity to plaque // Ergeb. Microbiol. Immitatsforshung. experiment. Therapie. 6. 1963. - B-d. 37. - P. 59-113.

180. Camp F. The common antigens for plaque and human blood // Milit. Med. 1967. - V.132. - P.426-429.

181. Cavanaugh D.C., Borteir M.K., Robinson D.H., Williams J.E. Application de la prueba serologice ELISA al diagnostico de la peste // Bel. Odie. Sean. Panam. 1980. -V.88, №2. - P.170-171.

182. Chen T.H., Meyer K.F. Studies on immunization against plaque X. Specific Precipitation of P. pestis Antigens and antibodies in Gels // J. Immunal. 1955. - V.74,6. P.501-507.

183. Continho A.F.G., Sousa F.L.C., De Comparative Studies of Y. pestis membrane isolation techniques and their potential use in plaque epidemiology // Rew. Inst. Med. Trop. Sao Paulo. 1990. - V.32, №2. - P.78-83.

184. Corbel M.J., Brewer R.A., Hendry D.M. Disk electrophoresis of phenol: acetic acid; Water-soluble proteins for the identification of Yersinia species // Research in Veterinary Science. 1982. - V.33. - P.43-46.

185. Davis B.J. Disc-electrophoresis. II Method and application to human serum proteins // Ann. N. Y. Acad. Sei. -1964. V.121. - P.404-427.

186. Engvall E., Perlmann P. Enzime-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin // Im-munochemistry. 1971. - V.8, №9. - P.871-879.

187. Goding J.V. The chromic chloride method of coupling antigens to erythrocytes: Definition of some important parameters // J. Immunal. Meth. 1980. - V.39. - P.285-308.

188. Hudson B.W., Coldenberg M.I. Isolation of Yersinia Pestis of unusual problem content obtained from Central Jawa // Bull. W.H.O. 1970. - V.43. - P.917-919.

189. Hudson B.W., Quan T.J. Electrophoretic Studies of the Yersiniae // Am. J. Trop. Med. Hyd. 1975. - V.24, №6. - P.968-973.

190. Hudson B.W., Quan T.J., Bailey R.E. Electrophoretic studies of geographic distribution of Yersinia pestis protein variant // Int. J. Syst. Bacteriol. 1976. -V.26, №1. - P.1-16.

191. Hudson B.W., Quan T.J., Sites V.R., Marshall J.O. Anelectrophoretic and bacteriologic study of Yersinia pes-tis isolates from Central Jawa, Asia and Western Hemisphere // Am. J. Trop. Med. Hyd. 1973. - V.22, №5. -P.642-653.

192. Kim J.T., Grecnbarm D., Davis P. Separation of antigen-specific lymphocytes. A new general method of releasing cells bound to nylon mesh // J. Immunal. 1975. -V. 114. - P.1302-1306.

193. Kohler G., Milatein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity // Nature. 1975. - V.256. - P.495-497.

194. Kumakura M., Suzuki M., Adachi S., Kaetsu I. Poli-acrolein microspheres as immunoreagents // J. Immunal. Methods. 1983. - V.63, №1. - P.115-122.

195. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. -1970. V.227. - P.680-685.

196. Lawton W.D., Fukui G.M., Surgalla M.J. Studies on the antigenic of Pasteurella pestis and Pasteurella pseudotuberculosis // J. Immunal. 1960. - V.84, №5. - P.475-479.

197. Lowry O.H., Rosebrough N.S., Parr A.L., Raudall R.S. Protein measurement with the Folea fenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. - V.193, №99. - P.265-274.

198. Margel S., Beitler U., Off arum M. A novel synthesis of poliacrolein microspheres and their application for all labeling and cell separation // Immunal. Commun.-1981 V.10, №7. P.567-575.

199. Milstein C., Calfre G., Sesher D.S., Springer T. Monoclonal antibodies and cell surface antigens // Cell

200. Biol. Int. Rep. 1979. - V.3, №1. - P.1-20.

201. Milstein C., Galfre C., Socher D.S., Springer T. Monoclonal antibodies and cell surface antigens // Cell Ciol. Int. Rep. 1979. - №1. - P.1-12.

202. Montie T.C., Montie D.B. Protein Toxins of Pasteurella pestis. Subunit Composition and Acid Binding // Biochemistry. 1971. - V.10, №11. - P.2094-2100.

203. Montie T.C., Montie D.B., Aje S.J. Action of Sulfhidril and Other Denaturing Agents on the Protein Toxins of P. pestis // Archives of Biochem. And Biophis. V.114. -P.123-137.

204. Montie T.C., Montie D.B., Aje S.J. F comparison of the characteristic of two murene-toxic proteins from P. pestis // Biochim. Biophis. Acta. 1966. - V.130. - P.406-419.

205. Montie T.C., Montie D.B., Aje S.J. The identification and isolation of two mouse-tixic protein components in extracts from P. pestis // J. Expte. Med. 1964. -V.120. - P.1021-1213.

206. Nakane P.K., Kawaoi A. Peroxidase-labelled antibody a new method of conjugation // J. Histochem. Cytochem. -1974. - V.22, №12. - P.1084-1092.

207. Ouchterlony O. Antigen-antibody reactions in gels // Arkiv, Kemi, Mineral Geol.- 1949.- V.26, N14.- P.1-9.

208. Rothstein T., Gefler M.S. In vivo protection against toxification by monoclonal antibodies to tetanus toxin produced by murene hybridoma clones // Molec. Immunal. -1983. V.20. - P.161-168.

209. Shepherd A.S., Hummitzch D.E., Leman P.A., Swanzpoel E., Searle L.A. Comparive tests for detection of plaque antigen and antibody in experimentally infected wild rodents // J. Clin. Microbiol. 1986. - V. 24, №6. -P.1075 - 1078.

210. Straley S.C. The plasmid-encoded outer membrane proteins of Y. pestis // Rew. Infeet. Dis. 1988. - V.10, №2. -P.323-326.

211. Towbin H.T., Staechelin, and Gordon S. Electrophoretic transfer of protein from polyacrylamide gels to intro-cellulose sheets: procedure and some applications // Proc. Nati. Acad. Sci. 1989. - V.76. - P.4350.

212. Werblin T., Siskind G. Proliferation of lymphoid cells: Studies with human lymphoid cell lines and immunoglobulin synthesis // Immunochemistry. 1972. - V.9.1. P.987-1011.

213. Williams J.E., Arntsen L., Robinson D.H. Comparison of passive haemagglutination and ensime-linked immunosoe-bent assay for serodiagnosis of plaque // Bull. WHO. -1982. V.60, №5. - P.777-781.

214. Williams J.E., Arntzen L., Tyndal G.L., Isaacson M. Application of enzyme immunoassays for the confirmation of clinically Suspect plaque in Namibia // Bull. W.H.O. -1986. V.64, №5. - P.745-752.1. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

215. При приготовлении диагностикума чумного полиакро-леинового антигенного рекомендуется после сенсибилизации его фракцией I дополнительно подвергать термической обработке при 70-80°С и перемешивании в течение 30-40 мин.

216. Рекомендуется проводить селективное концентрирование капсульного антигена чумного микроба на магноим-муносорбенте (используя магнитные ловушки) с последующей постановкой ИФА, КИФА, ПЦР.

217. Экспериментальные серии полиакролеиновых диагно-стикумов предлагается использовать в качестве дополнительного диагностического теста при эпизоотологическом обследовании и специфической индикации возбудителя чумы.