Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Мембранные белки чумного микроба (теоретические и прикладные аспекты)

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Мембранные белки чумного микроба (теоретические и прикладные аспекты)"

• ГОССАНЭПИДНАДЗОР РСФСР Всесоюзный ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт "Микроб"

На правах рукописи

ЩЕРБАКОВ Анатолия Анисимович

УД{ 616.981.452:575

МЕМБРАННЫЕ БЕЛКИ ЧУМНОГО МИКРОБА (ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ И ПРИКЛАДНЫЕ АСПЕКТУ)

03.00.07 - микробиология

Диссертация на соискание учёной степени доктора биологических наук

Научные консультанты: доктор медицинских наук, профессор АНШМОВ Й.И., доктор медицин^ чих наук, профессор НАУМОВ A.B.

Саратов - 1991

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. На обследованной в СССР территории природные очаги чумы занимают около 10 % площади. Интенсивная хозяйственная деятельность и освоение многих очаговых территорий определяют актуальность изучения биологии возбудителя чумы. Поскольку возможно заражение человека и животных, важна своевременная и надёжная оценка потенциальной эпидемической опасности природных очагов. Для решения этой задачи необходимо достоверное обнаружение возбудителя или биологических меток его присутствия в природе, что невозможно без надёжных методов диагностики (Ладный с соавт., 1977; Ротшильд, 1978; Кузнецова с соавт., 1980; Анисимов с соавт., 1986; Голубинский, 1987; Дятлов, 1987; Козлов, 1990).

Создание иммунопрофилактических и иммунодиагностических препаратов на основе известных антигенов чумного миг.рсгч ллется традиционным направлением в области разработк; „.юсо-бов эффективной защиты от чумной инфекции. Современные методы биохимии и молекулярной биологии позволяют проводить «деление и очистку ряда биологически активных компонентов возбудителя чумы, такьх ;<г.к пестицин 1, "мышиный" токсин, фракция I, и ряда ферузптсв: фосфолипазы, нейраминидазы, фибринолизина. На основе некоторых из низ созданы коммерческие и экспериментальные диагностические и профилактические препараты, успешно при-кзнлемые в медицинской практике.

Однако в природе встречаются штаммы, не диагносцнруеыые традиционными серологическими методами в связи с утратой или репрессией синтеза фракции I, токсина, элиминации плазмид.Поэтому злободневным остается поиск новых видоспецифических анти-гзнов.

Важная роль в этоа отводится исследованию поверхностных компонентов бактериальной клетки - ее мембранных структур представленных липополисахарид - белковыми комплексами.-

Актуальность исследования мембранных структур определяется их высокой функциональной значимостью в процессах взаимодействия с окружающей средой, г в случае патогенных бактерий - с клетками и тканями макроорганизма. Определяя процессы деления клеток, переноса генетического материала, рецепции бактерио-

фагов и бактериоцинов, наличие заряда клеточной поверхности и адгезивных свойств, мембранные структуры детерминирует широкий спектр иммунобиологических свойств, взаимодействуя с иммунной системой и вызывая значительные изменения в иммунном статусе животного.

Устойчивый интерес к мембранным белкам и липополисахариду со стороны исследователей разных специальностей обусловлен как многообразием функций этих структур, так и тем, что выяснение молекулярных основ их биологического действия связано с решением фундаментальных вопросов иммуногенеза и клеточной рецепции (Соловьева, 1990).

Важным для теории и практической медицины является изучение мембранных белков в связи с возможностью разработки на их основе новых перспективных профилактических и диагностических чумных препаратов. Решение этих задач обеспечиьчится изучением структуры внешней мембраны, белков и полисахарида, входящих в её состав. Эти исследования возможны гтри наличии эффективных методов выделения как внешних мембран, так и способов разделения их на компоненты без значительного нардщ ;ния присущих им функций.

Современная биохимия чумного микроба достигла значительных успехов .в исследовании ряда важнейших компонентов клетки - ли-пополисахарида (ЛПС), основного соматического антигена (ОСА) и фракции I ($1). Изучены их иммунохимические и биологические свойства (Дальвадянц, 1968; Боровикова, 1972; Бахрак, 1972, 1973; Вейнблат, 1974; Тараненко, 1988). Эти успехи.стали возможными благодаря разработкам достаточно эффективных методов выделения и очистки гидрофильных белков и липополисахарида с помощью аналитической и препаративной хроматографии.

Исследование другого важного компо1 ;нта внешней мембраны -её поверхностных белков - потребовало применение новых подходов. Гидрофобность элементов внешней мембраны не позволяет проводить выделение значительного количества её структурных белков классическими методами и является ограничением использования их в целях создания профилактических и диагностических препаратов. Применение буферных растворов и органических растворителей приводит к освобожпению только слабо связанных белков. Успехи в исследовании гидрофобных структур клетки связаны

с применением детергентов - группы веществ, производящих разрывы гидрофобных связей. Известно, что условия обработки детергентами в значительной степени модифицируют белковые молекулы, их биологические и иимунохимические активности. Нарушение гидрофобных свг'зй часто приводит к потере энзиматической и субстратной специфичности. Вторым важным моментом, который необходимо учитывать, являются ограничения, связанные с анализом таких структур, так как в гелях для электрофоретического разделения присутствует детергент, а макромолекулы исследуются после их значительной модификация и деструкции. Методические трудности в изучении мембранных белков значительно снижают темпы развития наших знаний о структуре и функции этих полимеров. Тем не менее возрастает понимание конкретного важного значения макромолекулярного соединения мембранных белков и липополиса-харида при их взаимодейотвии с распознающими структурами И гуморальными факторами макроорганизма в процессе реализации их биологической активности.

Кэ вышесказанного следует, что изучение поверхностно..: структур клетки чумного микроба - её мембранных белков - представляется актуальной проблемой и их исследование позволит познать многие биологичоские и иммунохимические закономерности взаимодействия макро- и микроорганизма, расширить представления о механизме патогенности чумного микроба, использовать их для" диагностики и иммунопрофилактики.

Цель работы - комплексное исследование физико-химической природы и биологической активности внешних мембран чумного микроба, гидрофобных белков и периплазмы, изучение их иммунохимических свойств и иммунобиологической активности. Теоретические и экспериментальное обоснование использования новых антигенов при конструировании препаратов для диагностики и профилактики чумы. '

Задачи исследования. I/ Разработать оптимальную технологию выделения внешних и цитоплазматических мембран из разных штаммов .чумного микроба и провести сравнительный анализ их полипептидного состава. 2/ Исследовать биологическую и энзиматическую активность фракций периплазмы, цитоплазмы и мембранных структур. 3/ Провести анализ полипептидного состава клеточных оболочек культур штаммов ахромогенннх вариантов

чумного микроба, отличающихся по имыунохимическим свойствам. 4/ Исследовать иммунохимическую активность препаратов внешних мембран чумного микроба. 5/ Разработать на основе препарата мембранных белков и гомологичных антител новые диагностические препараты: диагностикума антигенного, эритроцитарного; диагностикума иммуноглобулинового, эритроцитарного; иммуноглобулинов люминесцирующих; коньпгата пероксидазного, иммуноглобулинового, испытывая их в соответствующих реакциях. 6/ Исследовать протективные свойства препарата мембранных белков. 7/ Провести иммунохимический анализ взаимодействия чумных и псевдотуберкулёзных сывороток с полипептидами препарата мембранных белков с целью совершенствования новых диагностических препаратов. 8/ Установить закономерности антителогенеза к мембранным белкам у экспериментально зараженных возбудителем чумы лабораторных животных и диких грызунов для объективности оценки результатов полевых испытаний новых диагностических препаратов.

Научная новизна. Впервые получены и охарактеризованы по физико-химическим показателям фракции внешних и цитоплазматических мембран чумного микроба. Показана их антигенная неоднородность. Выявлены пестицшюгенная, нейрамини-дазная, фибринолитическая, плазмокоагулазная активности во фракциях периплазмы и цитоплазмы. В периплазме чумного микроба обнаружены "мышиный" токсин и фосфолипаза.

Впервые доказана иммунохимическая активность белков внешней мембраны и солюбилизированных в детергентах мембранных белков. Антитела к мембранным белкам выявлены как в антисыворотках к препаратам мембранных белков, так и в чумных коммерческих сыворотках, полученных от лошадей, иммунизированных живой культурой чумного микроба ЕВ. В -..¡спериментах на белых мышах и морских свинках установлена протективная активность препаратов гидрофобных мембранных белков. На основе препарата мембранных белков создан новый эритроцитарный антигеннцй дие^ностикум с высокой активностью (титр в РИГА с антисывороткой превышает 1:250 тыс.), что позволяет использопть его в серологическом анализе при полевых и лабораторных исследованиях материала, подозрительного на чуму. На основе антисывороток к препарату мембранных белков впервые сконструирован

иммуноглобулиновый эритроцитарнкЛ диагностикум, способный выявлять штаммы чумного микроба, лишенные фракции I, и штаммы, выращенные при 28 °С. Новыми является данные о создании и изучении препаратов люминесцирующпс иммуноглобулинов к мембранным белкам: ort обнаруживали в люмииесцентно-серологическоы анализе культуры чумного микроба вне зависимости от температуры выращивания,.а также при наличии или отсутствии в них собственных плазмид.

Требованиям научной новизны отвечают данные о получении коньюгата"иммуноглобулинов с пероксидазой к мембранным белкам чумного микроба, используемых в иммуноферментном анализе, с помощью которого по схеме двойного антительного сэндвича удаётся определять до 50 нг/мл препарата мембранных белков, что в 50-100 раз ниже концентраций, выявляемой экспериментальным иммуноглобулиновым эритроцитарным- диагностикумом. Методом им-муноблота установлено, что препарат мембранных белков седеп-жит группы полипептидов, один из которых обладает высок;,:, аффинитетом к иммуноглобулинам чумных сывороток, а другие :*кев? групповую специфичность к иммуноглобулинам из псевдотуберкулёзных сывороток II и У сероваров.

Впервые г.ри эпизоотологическом обследовании с помощью разработанных на основе мембранных белков новых диагностических 'препаратов в сыворотках диких грызунов выявлены положительно реагирующие антитела, не обнаруживаемые коммерческими диагностическими препаратами, диапазон действия которых обусловлен присутствием фракции I чумного микроба.

Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты, полученные в исследованиях позволяют глубже понять.структурную Организацию и функцию элементов внешней мембраны клеток чумного микроба. Изучение иммунохимических свойств мембранных белков имеет важное значение для разработки вопросов иммунодиагностики и профилактики чумной инфекции.

Результаты иммунохимических исследований явились методической основой для разработки диагностических препаратов и гыхода части исследований в практику обнаружения возбудителя или его маркеров в природе. Установленный факт протективной активности гидрофобных белков открывает новые перспективы для исследований,

направленных на конструирование химических пакцин.

Разработанные нами методы: получение "мышиного" токсина способом аффинной хроматографии, получение периплазматической фракции возбудителя чумы, выделение фосфолипазы и фибринолизи-на из периплазматической фракции вошли в "Методическое пособие по биохимии, генетике и молекулярной биологии возбудителя ЧУмы и псевдотуберкулёза", утверждённое ПУКИ Минздрава СССР 12 декабря 1985 г., и "Методические рекомендации по получению из клеток чумного микроба периплазматической фракции и использованию её для выделения фосфолипазы и фибринолизина", одобренные решением Ученого совета ВНИПЧИ "Микроб" 12 января 1981 г. Получено авторское свидетельство на "Способ получения "мышиного" токсина чумного микроба", зарегистрированное в Государственном реестре изобретений СССР за 1152114 от 22 декабря 1984 г. Данные, дополняющие антигенную характеристику возбудителя чумы включены в программу лекций по биохимии и генетике чумного микроба на курсах специализации по особо опасным инфекциям при ВНИПЧИ "Микроб". На экспериментально разработанные препараты составлены временная фармакопейная статья (ВЮ, экспериментально-производственный регламент (ЭПР), инструкция по применению препарата, пояснительная записка, техническое задание на диагностику;.) эритроцитарный чумной внтительный на основе мембранных белков, одобренные Ученым советом ВНИПЧИ "Микроб" 20 марта 1990 г. Техническое задание на научно-техническую разработку препарата утверждено Главным эпидемиологическим управлением Минздрава СССР 22 ноября 1990 г., ЭПР - директором ВНИПЧИ "Микроб". Комитетом МИБП разрешены государственные испытания препарата.

Диагностикум чумной антигенный на основе мембранных белков изготовляется в малых сериях по экспери. ентально-производст-венному регламенту и используется в экспериментальной работе. Он внедрен как' дополнительный метод при серологическом анализе материала, подозрительного на чуму. Его применение позволяет обнаруживать в крови лабораторных животных, зараженных микробом ч.умы, антитела, отличные от антител к фракции т, выявляемых с помсцыо коммерческих препаратов в системе серологических реакций. Экспериментальный диагностикум эффективен при анализе сыворотик животнкх, инфицироватшх типичными и бескапсульными

штаммами чумного микроба, а также возбудителями чумк, лишенными собственных плазмид.

Использование нового диагностикума, сконструированного на основе мембранных белков, позволяет повышать эффективность эпизоотологсгеского обследования и тем самым будет способствовать своевременному проведении профилактических мероприятий в природных очагих чумы.

Методы выделения периплазматической"фракции используются в работе лабораторий ВНИПЧИ "Микроб" для получения исходного материала при очистке ряда биологически активных препаратов и ферментов.

На за щи ту выносятся следующие положения: '

1. Новые данные по биохимическому, электронно-микроскопическому и эдектрофоретическому йсследованию препарата внешних мембран различных штаммов чумного микроба.

2. Роль белков внешних мембран в иммунном ответе маиг организма. Изучение антителогенеэа при иммунизации животных культурами чумного микроба и препаратами мембранных белков.

3. Научная аргументация и принципы совершенствования серологического анализа при использовании, новых диагностических препаратов.

4. Диагностическая значимость антителогенеэа к мембранным белкам у диких грызунов и лабораторных животн : при их контакте с возбудителем чумы. /

5. Рекомендации по внедрению в лабораторную практику новых диагностических препаратов, созданных на основе мембранных белков и гомологичных антител:

- антигенного эритроцитарного диагностикума;

- иммуноглобулинового эритроцитарного диагностикума;-

- иммуноглобулинов люминесцирущих;

- коньюгата пероксидазного иммуноглоб.улинового.

Апробация. Материалы диссертации были представлены

н доложены на Всесоюзном симпозиуме "Регуляция биохимических процессов у микроорганизмов" (Пущино, 1978), 4-м Всесопном биохимическом съезде (Ленинград, 1979), Всесоюзной конференции "Иммунология и иммунопрофилактика чумы и холеры" (Саратов, 1980), рабочем совещании "Биохимия клеточной поверхности

грамотрицательных микроорганизмов"(Саратов, 1984), Всесоюзной научно-практической конференции "Актуальные вопросы иммунодиагностики особо опасных инфекций" (Ставрополь, 1986),Всесоюзной конференции "Биология возбудителей инфекционных болезней и их экспрессдиагностика" (Горький, 1987), Всесоюзной конференция по химии и биохимии углеводов (Тбилиси, 1987), П-й Всесоюзной конференции "Актуальные попроси теоретической и прикладной инфекционной иммунологии. Механизмы противоинфекционного иммунитета" (Саратов, 1987), 1-м Всесоюзном симпозиуме по препаративной хроматографии физиологически активных веществ (Ленинград, 1988), XII Всесоюзной конференции по. природной очаговости болезней (Новосибирск, 1989), Всесоюзной конференции "Регуляция микробного мек.гюлтм.ч" (Пущино, 1989), Всесоюзной ьп»-чно-практичеснеи! конференции (Владивосток, 1989), научно-производственном совете работников противочумных учреждений (Ташкент, 1909), Всесоюзной конференции "Разработка и производство препаратов медицинской биотехнологии" (Махачкала, 1990), Всесоюзном симпозиуме по химии белков (Тбилиси, 1990), традиционных ежегодных научных конференциях ВНИПЧИ "Микрсб".

Материалы диссертации оформлены на основе 5 научных отчетов (1975-1990 гг.) по законченным НИР, выполняпшимся в соответствии с планами Министерства здравоохранения СРОР.

Публикация. Основное содержание предложенного материала опубликовано в 30 научных статьях и авторском свидетельстве 'на изобретение.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения,главы обзора литературы, 5 глав, отражающих результаты собственных исследований по теме, заключения и выводов, иллюстрирована 30 таблицами и 30 рисунками. Указатель литературы содержит отечестве.¡ных и иностранных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Штаммы. Основная часть экспериментов выполнена на Модели вакцинного штамма ЕВ линии НИИЭГ; использопны также и его мутанты ЕВ-ахр, ЕВ-271. В работе изучено 56 культур возбудителя чумы, с разными фено- и генотипическими свойствами. Коллекция штаммов псевдотуберкулёзного микроба различных серо-

»аров (15), салмонелл (10), шигзлл (10), кишечной палочки (10), получена из музея живых культур ВНИПЧИ "Микроб".

Микробиологические методы. Бактериальную массу возбудителя чумы, необходимую для выделения клеточных стрнок и мембранных белков, получали при выращивании культур на агаре Хоттингера при 28 °С в течение двух суток в матрацах или аппаратах АКМ-Ш (Филиппов с соав., IS85). Использовали также культуры чумного микроба, выращенные в УСлобиях хемостата на установках непрерывного культивирования.

Препаративные методы. Описанн модифицированные автором методы выделения и очистки внешних мембран, цитоплазмы и периплазмы применительно к культуре «{умного микроба (ОзЪогп et el., 1972; Sato ot ai., 1977). фракцию мембранных белков получали по модифицированному методу ( Hurhy et al.,1983). - ;

Химические' и физико-химические методы. Белок определяли по Лоури, нуклеиновые ки?.' "ты -по Спирину (1958), полисахариды - антроновым методом п-> ;hlMs • Barnott (1960), 3-дезоксиоктулозоновую кислоту (КДО) по Drogo et el.» (1970), методы электрофореза по Dnvis (IS64) Laeranli (1970) и LuEtenberg et al (1982). Для разделения и ошстки препаратов использовали гельхроыатографкю по Детерману (1970).

И ы м у н о х и м и ч е с к и е методы. Для установления :..',*мулохимического сродстга между отдельными антителами использовали методы двойной иммунодиффузии по Оухтерлони (1958). Методы иммунодота и иммуноблотинга использовали согласно rowbin et al. . (J979). Наряду с иммуноблотом при исследовании препаратов периплазмы и мембранных белков использовали лектинодот и лектиноблотинг. В работе использовали лэктины, меченные пероксидазой. • '.

Виологичес к.и.е. м оды исследован и я. Токсигенность и протективную активность препаратов внешних мембран, периплазмы и мембранных белков изучали на белых мшах (нелинейных). Изучение антителогенеза к мембранным белкам и фракции I у лаборгторных животных и двккх грызунов проводили после заражения вируленгиыми и «вирулентными штаммами шумного микроба. Анализ сывороток серологическими методами

выполняли с Я-х по СО-е сутки. Иммунные сыворотки к препаратам мембранных белков и внешним мембранам получали путём 3-кратной иммунизации кроликов массой 2,5-3,0 кг. Экспериментальные эрит-роцитарные днагностикумы на основе мембранных белков конструировали по схемам, принятым при изготовлении коммерческих диагностических препаратов. Препараты люминесцирующих иммуноглобулинов получали по методу Маршалла { тгпЬслИ et а1.» 1358), принятому в производстве коммерческих чумных люминесцирующих иммуноглобулинов. Для конструирования коньюгатов иммуноглобулинов с пероксидаэой хрена использовали метод периодатного окисления Чпклпе и Каиао (1974).

Статистическуп обработку проводили общепринятыми методами, рассчитывая среднеарифметические величины, их средние ошибки, доверительный интервал и достоверность различий по ъ-критерию Стьюдента (Сызранцев, 1938; Ашмп-рин, Воробьеь, 1962).

■ 3. МЕМБРАННЫЕ БЕЛКИ ЧУМНОГО МИКРОБА И ИХ АНТИГЕННАЯ АКТИВНОСТЬ

Клеточная оболочка бактерий - сложное комплексное образованием рядом специфических слоев, различающихся функциональной значимостью и химическим составом. Она в значительной мере ответственна за способность патогенных бактерий противостоять защитным силам макроорганизма от гуморального и клеточного воздействия. В процессе исследования впервые были разработаны научно-методические основы препаративного разделения внешних и цитоплаэматических мембран чумного микроба, а такке выделения периплазматической фракции.

В основу процедуры выделения был положен метод ОаЬогп st п1. (1972), заключающийся в обработке интак^ных клеток этилендиа-минотетрауксусной кислотой и лиэоцимом с последующим дифференциальным центрифугированием для выделения общей мембранной фракции. Ультрацентрифугирование в градиенте плотности сахароз - общей мембранной фракции приводило к разделению материала на две полосы с плавучими плотностями 1,16-1,17 и 1,21-1,24 г/см^, что соответствовало известным величинам этого показателя у цитоплаэматических и внешних мем^тан знтеробактерий.

Достоверность фракции внешних гембран была подтверждена морфологически. Элактронно-микроскопичеекое исследование срезов препарата внешних мембран показало, что они представляют 3-кон-турные' замкнутые образования,' характерные для фракции внешних ыембран грам^трицательных бактерий. Величина электронно-плотного слоя внешних мембран приблизительно равнялась 3 нм. Сравнительный электронно-микроскопический анализ наружных слоев стенки интактных клеток и срезов везикулярных структур выделенного препарата показал полное совпадение слоев и их толщины.

В препарате внешних мембран методом тонкослойной хроматографии идентифицированы глюкоза, нанноза, рибоза, глякозамин и кзтодсзоксисктоновая кислота - компонент ^ипополисахарида. Содержанке белка составляло от 12 до 15 %. Сравнительное исследование внешних мембран 4 штаммов чумного микроба, в:гращенных при 28 °С, выявляет при электрофоретическом разделение сличил как в белках, относящиеся к мажорной группе, так и ч большей мере в минорных белках. Выращивание вакцинного штамма Щ чумного микроба при 37 °С вызывало изменения в полипептидном составе «х мзмбран. Отмечалось появление дополнительных полипептидов в 75 и 50 кД.

Было предпринято исследование клеточных оболочек чумного микроба гат-амиов Г.рсзЪха ЭТ и Т.рсг.ип т\и и их ахро-могенньпе мутантов, полученных с помощью многократных пересевов в процессе хранения. Методом электрофореза в 21;л -ПДАГе был^ показано, что ахремогенные культуры в составе клеточных оболочек не имеют полипептида в 22 кД. Иммунохимическими методами выявлена поверхностная локализация этого полипептида. -Доказано, что иммуногенность и иротективность культур изученных штаммов для лабораторных животных коррелировали с наличием пали-пептида в 22 кД в их клеточных оболочках.

Белые мыши, иммунизированные хроцагенными культурами чумного микроба, выдерживали заражаюцу» дозу вирулентного штамма независимо от сроков инфицирования в 10-100 раз большую, чем мили, иммунизированные ахрокогониой культурой.

Представлялось вашим выяснить роль белков внешней мембраны как антигенов, Еыди хрдучзпы кроличьи антчсыворотки к препаратам внешних мембран. Реакции имнунодиффузии проводили с полученными сыворотками поело солвбклнзации антигенного препа-

para путём обработки его в детергенте. Зарегистрированы титры антител в значениях 1:32-1:64. Иммуноглобулинов^» фракцию анти-¿ывороток к препарату внесших мембран использовали для полутения иммунокомплексов антиген-антитело, .которые исследовали методом -¡¡г, -электрофореза. Анализ электрофореграмм иммунокомплексов (антисыворотка - мембранные белки и антисыворотка'-препарат внешних мембран), указывает на включение гидрофобных белков в состав иммунокомплексов.

Таким образом, было показано, что иммунизация препаратами внешних мембран чумного микроба с входящими в их состав белкамч, лйп'ополисахаридом и фосфолипидами вызывает образование специфических антител к гидрофобным белкам. Выделенные из препарата внешних мембран мембранные бел«и, очищенные от липополисахарида и фосфолипидов, также образовывали специфический иммунокомплекс с антиснвороткой, т.е. гидрофобные белки внешних мембран являются важными иммунохимически'активными компонентами клеточной стенки чумного микроба.

Методом двойной иммунодиффузии проведено сопоставление мембранных белков с известными антигенами чумного микроба. Было отмёчено, что мембранные белки при взаимодействим с антимембранными сыворотками формируют особую линию преципитации, отличную от линий, образованных с известными антигенами 4j много микроба: Ф1, ОСА, ЛПС. Коммерческие противочумные сыворотки также образовывали линию преципитации с солюбилизированными белками внешних мембран. »

Таким образом, впервые было показано, что вакцинация кивот--ных культурой чумного микроба приводит к образованию антител к белкам внешней мембраны, однако их титр в таких сыворотках ниже по сравнению с антителами к фракции I. В свою очередь, антисыворотки к мембранным белкам не содержат в споем состава антител к.$1 и ОСА, но включают небольшое количество антител к липополисахариду.

Анализ отдельных полипептидоп препарата внешних мембран как 'антигенов, естественно выдвигает идею осуществить их выделение и очистку с целью создания новых профилактич( оких и диагностических препаратов.

Реализация этой задачи была выполнена после разработки ряда диагностических препаратов на основе мембранных белков и анти-

тел к ним: экспериментальных антигенных и иммувоглобуляновых эритроцитарчых диагиостикумов, пероксидазных иммуноглобулиновых препаратов и препаратов люминесцирующих иммуноглобулинов.

Наряду с исследованием структуры и иммунохимическ^х свойств препаратов мембранных белков несомненный интерес представляют . и другие компоненты клеточной оболочки.

Периплазматичес кап зона клеточной оболочки бактерий, располагающаяся между внешней и цитоплазматической мембранами, б настоящее время подвергается пристальному изучению. В ней обнаружены ферменты, транспортные белки, бактериоцины, кароти-ноиды, некоторые антигены, что несомненно свидетельствует о. важной роли периплазмы в жизнедеятельности кл тки («озгет-Ьоп ot п1., 1972; .Наумов с соавт., 1986, 1988). В наших исследованиях были изучена фракции периплазмы после их вздело;" - --я культур вакцинного штамма чумного микроба по биохимически.; к иммунобиологическим свойствам. Было показано, что препараты периплазмы содержат до 23 % белка, 0,52 % нуклеиновых кислот, 12,25 % редуцирующих веществ, В ней также идентифицированы галактоза, глюкоза, ь-лнноза, рибоза, глюкозами^ Обнаружены фибри-нолнтичес1&к, фосфолипазная, гемолитическая, иейрамииидазная активности, выявлены пестицин I и "мышиный" токсин. Таким образом, был) определено, что периплазматическая фракция является местом локализации многих водорастворимых антигенов и белков с высокой биологической активностью, выделенная фракция может быть использована для очистки многих важных антигенов чумного микррба методами современной препаративной биохимии.

Резюмируя данный 'раздел работы, можно сделать следующее заключение. _ ■

Раэработа ы методические основы вццеления, очистки и анализа внешних мембран, периплазмы и мембранных белков из культур чумного микроба. Установлена роль".гидрофобных белков внеш- • ней мембраны как новых антигенов чумного микроба. В периплаз-матической фракции обнаружен пестицин I и "мышиный" токсин. Периплазматическая фракция чумного микроба может быть использована для, выделения фибрйнолизина, нейраминидазы и фосфолипазы. ■ Установлена корреляция яммуногенности и протективной активности культур чумного микроба для лабораторных животных с наличием полипептида 22 кД в их клеточных оболочках. Методом ионообмен-

ной хроматографии из препарата мембранных белков были выделены два иммунохимически активных полипептида с молекулярной массой и б? и 90 кД.

Выявление видовых антигенных субстан: в микроорганизмах и дифференцирование их на этой основе является традиционным и важным для серологической диагностики. При обнаружении чумы это направление исследований представляет особый интерес б связи с существованием в природе микроорганизмов, близкородственных возбудителю чумной инфекции. Предпосылкой создания диагностических препаратов на основе мембранных'белков явилось обнаружение антител к белкам внешней мембраны в коммерчески?: сыворотках.

Образование специфических антител в сыворотках животных в значительной степени зависит от иммунояимических свойств вводимых бактериальных антигенов. Иммуногенность микробной клетки в целом определяется не только входящими в её состая специфическими антигенами: белками, полисахаридами, нуклесгро-теидами, но и степенью их доступности для распознающих систем макроорганизма (Ляшенко, Воробьев, 1982). Поверхностное расположение некоторых макромолекул в значительной мере определяет как силу иммунного ответа, так и спектр вырабатываемых антител в организме животного. Ярким подтверждением этого является образование антител к Ф1 в организме восприимчивого теплокровного животного при его контакте с чумным микробом. В процессе взаимодействия возбудителя чумы с восприимчивым животным иммунная си тема последнего накапливает антитела не только к капсуль-ной субстанции, но и ряду белков клеточ..ой стенки.

Диагностикум чумной эритроцитарный 'антигенный на основе мембранных белков конструировали по схемам и методам, предложенным профессором М.Ф.Шмутером* и используемым при приготов-

"Выражаем глубокую признательность профессору М.Ф.'Чмутеру, под руководством которого приготовлены первые экспериментальные эритроцитарные диагностические препараты.

4. КОНСТРУИРОВАНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ

ленип коммерческих препаратов /Шмутер с соапт., 1976, Караль-ник с соаьт., 1982). Они включали ряд этапов: обработку танином бараньих формалипкзнрованных эритроцитов, сенсибилизацию . их оптпмально.1 дозой антигена,' отделение носвязавзе.ося сен-ситина и кокгерзздшо диагностического препарата. Экспериментальные серии диагностикума испытывал:! на чувствительность и специфичность с сыворотками, полученными к препарату мембранных белков, а такие чумными агглютинирующими, псевдотуберкулёлными, туляреыийными, поливалентными к кишечной палочке и другими.

Было установлено, что диагностикум может бить использован для поиска антител в сыворотках животных, зараженных бесплаэ-ыидними штаммами чумного микроба (р!'га~. _>Ря1;-,рОк1" ).

Анализ коммерческих чумных сывороток показал, что титры антител к И в ШГА составляли от 1:6,4 до 1:250 тыс., в то жо время антитела к мембранным белкам б этих сыворот . определяемые с помощью экспериментального диагностикума., ¡>ь . ревы-шг.ли 1:6 тыс. Однако следует подчеркнуть, что и;,шуниза;шг животных препартами мембранных белков вызывает сильный иммунный ответ и позволяет регистрировать уровень специфических антител в РИГА в г.лр-/ от 1:16 тыс. до 1:128 тыс. при практически полном отсутствии антител к $1 (табл. I).

Таблица I

Специфическая активность днагностикумов: зритрсцитарного антигенного на основе мембранных белков (I) и чумного эритроцитарного антигенного (II)

Название агпютниоузнкх значения титра антител в

__._: I : II _

К мембранным белкам,кроличьи■ 16000-128000 2-4 (экспериментальные) .'

К чумному микробу.лошадиные 1600-4000 2500-250000 (коммерческие)

К чумному микробу .лошадиные 400-3200 6400-128000 (полуфабрикат)

Диагностику!* мояет быг-ь использован при эпкзоотологичеглсом • обследовании в природных с тагах чуем 3 качестве дополнительного препарата с целью псршонил результямьцости серологического анализа. Ему дана оценка рядом эпидотрядов противочумных станций, и лабораторий. В условиях j-абораторного эксперимента диагностику»! выявляет антитела в некоторых псевдотуберкулёзкых сыворотках. В таких случаях ставили дополнительные РКГЛ с коммерческим гсепдотуберкулёзным диагностикумом.

Значительный уровень антител к мембранным белкам в антисыворотках и практическое отсутствие в них антител к фракции I позволили использовать их для создания новых диагкости- . ческих препаратов: диагностику::а иммуноглобулинового зритро-цитарного, яоминесцйрующих иммуноглобулинов к мембранным балкам и коньвгатз иммуноглобулинов для применения в имм.укофер--ментном анализе.

Диагностькум экспериментальный чумной эритроцитарный им./у-ноглобулиновый конструировали по схемам,.описанным ранее. В качестве сенситина л нем была использована иммуноглобулинояая фракция экспериментальных кроличьих чумных сыпороток, полу--ченных после иммунизации животных препаратами мембранных бел-коп. Испытание такого диагностикума показало возможность его применен..я для выявления как бесфракционных, так типичных штаммов чумного микроба. При этом культуры, выращенные при 28 °С, выявлялись и концентрациях более низких (на порядок), чем теже культуры, если их выращивание проводили при 37 °С -1,2'Ю® м.к./мл (табл. 2). Разная степень чувствительности выявления культур р РИГА в зависимости от температурных условий выращивания, на наш взгляд, может быть связана со сте-' пенью . шдукцин чумным микробом антигена Ф1 (температурно-зависимь>й синтез). Экранирование кап'сульной субстанцией (Ф1) клеточной стенки в определенной степени вскрывает механизм взаимодействия компонентов серологической реакции - мембранных белков и антител к ним и определяет результаты серологи-чес ого анализа культур чумного микроба, выращенных при 37 °С (табл. 2).

Серологический анализ культур различных штаммов чумного микроба, выраженных при 20 °С, не обнаруживал какой-либо корреляции ни с одним ил признаков видовой специфичности таких

как продукция пестицина и чувствительность к нему, наличие фибринолизина и плазмокоагулазы, калсульною антигена и "мышиного" токсина, степени вирулентности для лабораторных животных. Испытание на серологическую активность культур \'.еп^госо11-^ая,5а1топе119,£сМ.ео1Ъ.,Е;8с11ег1с11:!.19 не выявило Ш-гаммов, имеющих положительную реакцию с экспериментальным иммуноглобу-линовым даагностикумом. Анализ культур псевдотуберкулёзного микроба показал, что часть из них-положительно реагировала в реакции непрямой гемагглютинации.

Создание люминесцирующих иммуноглобулином^ препаратов является актуальной, проблемой экспресс-диагностики особо опасных инфекций.

Таблица 2

Рззультаты серологического исследования культур семейства Ег^егоЬас4еН.всече „. в рнГА с диагностикумом чумным эритроцитарньш иммуноглобулиновым

Микроорганизмы : Температура: выращивания, С * Число взятых: в опыт штзм-: мое : Из них с положительным результатом в №ГА

Уегв1п1а ргт1:1в 37 19 10

28 36 . 36

рзо.ис1оЪиЪег~ си1ог1з 37 28 19 19 3 2

¥сгя1п1а е-г^егосо- 37 26 15 ■ 15 оо

Йи1тэпо11а 37 15 ... 0

С^сеИ.а 37 11 0

¿г.сЪегз^гЫа соИ •. 37 .. • 14 0

Б микробиологической практике люминесцентно-микроскопического анализа чумного микроба используют коммерческие иммуноглобулины чумные люминесцирующие. Однако эти препараты выявляют клетки чумного микроба, несущие на своей поверхности продукты синтеза, детерминируемые плазмидаки ^Рас (фибринолизин) ир?га(капоуль-ное вещзство). Штаммы, лишенные этих плазмйд, утрачивали способность специфического свечения после обработки их коммерчес-

кики иммуноглобулинами чумными лвминесцирующими (Титенко с соавт., 1984).

Гипериммун--ые сыворотки получали после четырёхкр-тной иммунизации кроликов препаратами мембранных белков. Они характеризовались высокими значениями титр;! антител к гомологичному .антигену, достигающими в РИГА 1:128000-1:256000 в реакции с диагностикумом эритроцитарным антигенным на основе мембранных белков в 1:128 в реакции двойной иммуюдиффуэии по Сухтерлони. Сыворотки ье содержали антител к капсульному антигену в анализе Н1ГА с коммерческим диагностикумом. чумным эритроцитарным антигенным. Выделенную высаливанием "сульфатом аммония иммуно-глобулиповую фракцию к мембранным белкам метили флпорохромом и использовали как диагностическ; .1 препарат. Было установлено, что штаммы ¡^умного микроба тестировались экспериментальными иммуноглобулинами люминесцирующими вне зависимости ст температуры выращивания и наличия в них собственных плазмид ( эбл.З). Экспериментальные иммуноглобулины люминесцирующие не выявляли взятые в опыт птаммы салмонелл, шигелл, холерных вибрионов, кшьчной палочки и других представителей семейства энтеробяк-терий, кроме штаммов 2-го и 5-го сероварпв псевдотуберкулёэ-ного микроба. Можно полагптйТйЧтс эта неспецифичность реакции связана с наличием на поверхности близкородственных видов "ер-синий общих рецепторов для иммуноглобулинов, а также значительным совпадением по молекулярным массам главных и минорных белков внешних мембран чумного и '•севдотуберкулёзного микробов.

Известно, что для исследования культур чумного м.-проба в имыуноферментном анализе используются меченые пероксидаэой имууноглобуликпвке фракции сывороток к капсульному антигену (Голубинскяй с соавт., 1983; Рудник с соавт. ,1383; Яковлев с соавт., 1983). В связи с этим самостоятельным методическим разделом исследований считаем разработку ноеого препарата для иммунофермеитного анализа. Осноеньтуи преимуществами разрабатываемой диагностической системы было увеличение порога чувствительности и сгектра выявляемых поверхностных антигенов чумного микроба. КонЪюгаты иммуноглобулинов с пероксидаэой готовили по методу периодатного оки*яения. Счищенный гель-фильтрацией препарат использовали для постановки иммунофер-

ментных роакци'5 в схеме "двойного антительного сэндвича".

Таблица 3

Флуоресцентно -микроскопический анализ культур ч.умного микроба препаратами люминссцирущих иммуноглобулинов к фракция I U) и мембранным белкам (II)

Штамм чумного микроба

Плаэмидный состав

I

II

:температури вуращива-;ния культур, С_

: 28 : 37 ': 28 : 37

'.'.r-os-ic EY Y.Piscis ?í>1 Y.nestis Л

^.Pfi.'-tis №95 v.p 'StÍ3 J4VT1

Y.pe.itio VK¡Í-1V. v.pe3tic Herbin "'.postín Í5P/12

pPr;t+ pCnd+ pI'ro+

pl'ct pOid p.'i-n

pPst" pflfid" pl?raf

pFot- pCad* pi¡Va +

рР.-.Г p'íaíl" p"ra~

V 'st" ..Оп'Г ],/r- Г'

pi'üt" pP.Hd- p

pl'Hb1" prInd+ p?ri"

Обозначения: "+" - наличие специфической флуоресценции; "-' - отсутствие флуоресценции.

Чувстьлтельность разработаньоЯ нлми иммуноферментной систомы при выявлении мембранных белков указывает на значительное превосходство зтого метода, поскольку минимальнее концентра-ц:-:.;, определяемые с помощью экспериментального иммуноглобу-линового эритроцитарного диагностикума, были р 50-100 раз большими. Созданную систему использовали для анализа различных штаммон культур чумного микроба. Еыло отмечено значительное увеличение чувствительности примерно на один порядок м.к./мл) по сравнению с определением культур в РЯГА с экспериментальным иммуноглобулинопым диагностикумом. Кратко характеризуя материал этого раздела, можно сделать следующее заключение.

Иммунохимическими методами в чумных сыворотках впервые

выявлены антитела к солюбилизированным белкам клеточных стенок.

Созданы новью диагностические препараты, позволяющие выявлять антитела •• мембранным белкам " сыгоротках, конт~чтирорап-вих с чумным микробом-животных, и диагнеспировать возбудителя по наличию антигенов в клеточной стенке. Предполагается, что основные элементы созданной тест-системы могут быть адаптированы для использования в анализе других инфекционных заболеваний человека и жипотных, вызванных ■рпмнегативными микроорганизмами .

5. ПУТИ СОВЕРШЕНСТВОВАНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ МЕМБРАННЫХ БЕЛКОВ " АНТИТЕЛ К Ш

Поскбльку мембранные белки приставляют смесь сол'^илизи-ропзнных полипептидоз, различающихся как по молекулярной массе, так и пчуунохимическим свойствам, то можно полагать, что введение такого антигенного комплекса в организм теплокровного животного приведёт к образованию антител, специфичность и концентрация которых будут определяться компо: знта-'И этого антигенного препарата;. Анализ спектра антител таких сывороток методе» иммуноблотинга позволил бы выяснить роль отдельных полипептидов, входящих в состав препарата, а также в состав интактной клет: я чумного микроба при формировании индивидуального иммунного ответа и некоторые закономерности генеза ан-.-ител.

Были приготовлены три серии коньюгатов иммуноглобулинов чумных сывороток й две серии коиыогатов с иммуноглобулинами псевдотуберкулёзных сывороток. Коньюгаты, приготовленные на основе иммуноглобулинов из кроличьих ацтиенвороток к мембранным белкам, выявляли серию полипептидоь в препарате мембранных белков с молекулярными массами 65-90, 69, 41, 29 и 16-12 кД. Коныогаты иммуноглобулинов антисыворотск, полученных при иммунизации тавотных культурой, выращенной при.28 °С выявляли полипептиды 87, 52, 45, 41, ¿1 и 22 кД. Иммуноглобулины из сывороток, полученных на 37 °С культуру в препарате мембранных белков определяли полипептидь. с молекулярными массами 89, 52, 45 и 41 кД. Ка- ..ас представляется, тявленный спектр полипептидоЕ_ позволит проводить отбор тех иммуноу.и-мически важных полипептидов, специфичность которых наиболее ' г -сока.

Но обнаружены большие различии имунохимической активности мембранных белков в препаратах, полученных из культур штаммов Y.P6a;tis -:v (с полным набором собственных плазмид) и

v.poatin г:: ¡-ii2; (штамм, не содержащий плазмид), т.е. в основном синтез полипептидов детерминирован хромосомными генами. Об э*ом свидетельствуют и данные, полученные при испольс. .звании экспериментальных диагностических препаратов. Они выявляли клетки чумного микроба независимо от наличия плазмид pi''m,pCnd и pPtit , при этом наблюдалось снижение чувствительности при наличии капсульного антигена, "экранирующего", бактериальную поверхность.

Как уже сообщалось, иммуноглобулиновый экспериментальный эритроцитарный диагностикум наряду с выявлением культур чумного микроба определял и культуры псевдотуберкулёзного микроба 2-го и 5-го сероваров. Это было показано также и при применении экспериментальных грепарьгов для люминесцентно-серологичес-кого и иммуноферментного анализов. Важно было определить полипептиды препарата"мембранных белков, проявляющих свойство гомологии к антителам из чумных и псевдотуберкулёзных сывороток. Анализ псевдотуберкулёзной сыворотки, полученной на штамм пятого серовара в имм.упоблотинге, показал её родство к полипептидам препарата мембранных белков с молекулярной массой ¿9, 69, 52, 41 и 31 кД. Сыворотки ко второму серовару содержали антитела, специфически выявляющие полипептиды в 31 и 41 кД. Не обнаружено иммунного отве.а на полипептид с молекулярной массой в 22 кД. Полипелтиды препарата, проявляющие свойство гомологии для -сывороток 2-го и 2 5-го сероваров псевдотуберкулёзного микробов и чумм,- .< сыворотокбыли следующие: 89-87, 41, 31 и IG-I2 кД. Нсличие таких перекрестнореагирующих групп антител, хотя и значительно усложняет анализ антигенной структуры рода Yersinio, может быть полезным для получения полипептидо» в очищенном виде методами иммуноадсОрбции и создает условия конструирования на их основе моноспецифических сывороток.

Методом препаративного электрофореза проводили разделение грегарата &.емб{шнных белков, материал, содержащий полипептиды в 69-87 у. 22 кД экстрагировали и испытывали в дот-кммуноанализе. Выло установлено, что степень аффинитета.для полипептида 22 кД, выделенного из .bc.nzin ::v H".pcntir v.'j , на 2-3 порядка

выше к чумным сывороткам по сравнению с таковой в псевдотуберкулёзных сыворотках. Полипептиды 89-87 кД выявлялись оди-неново как чумными так И псевдотуберкулёзными сыворотками. Таким образом, важность 22 кД полипептида определяется, с одной стороны, его высокой специфичностью к чумным сывороткам, а с другой - прямой зависимостью с иммуногенностью и г.ротек-тивностью культур чумного микроба для лабораторных животных. Модно полагать, что белок, включающий в свой состав этот полипептид, играет значительную роль в иммуногенезе чумного микроба. Представляется важным в дальнейших исследованиях изучить имму-' нохимические свойства полипептида, возможность использования его для диагностики'чумного микроба". .

Исследовали протективные Свойства препарата мембранных белков. Белых мызей и морских свинок иммунизировали препаратом в дозе 50-100 мкг на зверька и заражали на 21-е сутки культурой вирулентного'штамма "/.рев^э 231 (I Ис1 = 10 м. ..). Уровень защиты составлял от 100 до 200 Эс1 возбудителя чумы.

При изучении структурной и функциональной организации . бактериальной клетки большая роль отводится системам, распознающим отдельные макромолекулы или их специфические последовательности. В качестве таких препаратов широко используются лектины.

Б задачу нашего исследования входило выяснение наличия рецепторов для-ряда лектинов в препаратах мембранных белков и периплазмы вакцинного штамма чумного микроба. Лектины с из-• вестной углеводной специфичностью: завязи пшеницы, клещевины (рицин), арахиса и конканзралина А, меченные пероксидазой использовались для выявления методами лектинодота и лектиноблотинга гликопротеинов в препаратах периплазмы и мембранных белков. Было обнаружено, что рицин выявлял полипептиды препарата перил- . лазмы с молекулярными массами в 67, 60, 40, 32, 30 и 24 кД. В препарате .мембранных белков выявлялись полипептидь; с молекулярными, массами в 45, 32, 28, 20, 18 и 13 кД. Лектин завязи пшеницы специфически взаимодействовал с углеводсодертащими компонентами препарата мембранных белков с молекулярными мае-, сами в 13, 12 и 10 кД, а также 15 у, 10 кД периплазмы. Методом лектинодота было показано, что меченный пероксидазой 'рицин специфически выявлял до 0,03 мкг препарата мембранных белко?

к 0,02 мкг периплазмы в то время, как конканавалин А и лектнн завязи пшеницы взаимодействовали с теми ае препаратами в концентрациях, на порядок выше.

Использование лектинов открывает перспективы их применения при изучении структурной и функциональной организации отдельных компонентов клеточной оболочки, ее периплазм! и мембранных белков. Важным мс.хет оказаться их использование в качестве лектиносорбентов для разделения препаратов на компоненту.

Кратко характеризуя материал этого раздела, можно сделать следующее заключение.

Выявлен спектр полипептидов препарата мембранных белков, взаимодействующих с антителами чумных и псевдотуберкулёзных агглютинирующих сывороток, что предполагает отбор специфических полипептидов с целью создания моно- и поливалентных диагностических препаратов.

Показано, что степень аффинитета полипептида в 22 кД к антителам чумных сывороток превышает на 2-3 порядка таковую для иолишптидов 90-87- кД.

Препараты периплазмы и мембранных белков взаимодействовали "с лектинами завязи пшеницы, клещевины, арахиса и конканавалина А. Методом лектиноблотинга в препаратах периплазм:.] и мембранных белков выяглены гликопротеины, специфически взаимодействующие с лектином завязи пшеницы и лектином клещевины.

6. ПРИМЕНЕНИЕ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ В ЛАБОРАТОРНОЙ ПРАКТИКЕ И ЭПИЗООТОЛОГИЧЕСКОМ ОБСЛЕДОВАНИИ

Методы серологической диагностики, применяемые в настоящее время при эпизос :ологическом обследовании, регламентированы соответструющими инструкциями и позволяют рыяплять типичные атаммы возбудителя чумы. Современная серодиагностика чумного микроба основана на выявлении фракции I или антител к этому антигену в оыроротках, контактировавших с возбудителем чумы животных. Однако при анализе подозрительного на чуму материала возникают определенные сложности: это плазмидная детерминированность • синтеза данного антигена, низкий уровень его на отдельных очаговых территориях 1Кудинога, К'<>8; Гольдфарб с соаьт.-,

1971 ; Ч.урбакопа с соавт., 1971; Ларионов, Пейсахис, 1971; Кузнецова с соавт,, 1982). Наблюдались изменения содержания фракции I у штамме, и в ходе эпизоотического процесса (1Е<-к, I97.I; Пупский, Адаменко, 1981 ; Топорков с соавт., 1987). Приходится учитывать и такой ¿[акт, что - синтез Ф1 клеткой чумного микроба значительно зависит от питательной среды, температуры, штаммо-вых особенностей и других факторов (Шпилевая с соавт., 1986). Кроме того, селекцией и генетическими методами получены итаммн, не имеющие плазмиды рП'т ((Панина, 1967; Проценко с соавт. ,1986: Самойлова с соавт., 1989). Вполне понятно, что использование выпускаемых в настоящее время коммерческих диагностикумов для поиска таких штаммов или антител к 51 окапывается неэффективным. Это и определяет создание альтернативных методов диагностики чумной инфекции.

Предложенные в качестве диагностических маркеров гидрофобные белковые компоненты клеточной оболочки - мембраннь,= б-злки расширяют возможности выявления возбудителя. Мембранные белки являются обязательными структурными компонентами микробной, клетки, детерминируемые хромосомной ДНК, их синтез не зависит от плазмидного состава, а поверхностная локализация способствует быстром» протеканию икмунохимических реакций.

Сравнительное исследование гнтителогенеза к мембранным белкам и капсульному антигену при экспериментальном заражении открывает, на наш взгляд, возможности выяснения роли оелков клеточной стенки чумного микроба в иммуногенезе и патогенезе.

Белых мыяей вакцинировали культурой штамма ".pestis У.ч. Выло отмечено, что титры антител к мембрагнкм белкам с 4-9-х суток постепенно возрастали втрое к 37-м суткам (срок наблюдения), в то врем? как антитела к фракции I оставались на уровне показателей 4-9-х суток или несколько снижались. Анализ результатов (табл. 4) показывает, что число иммунных зверьков с антителами к мембранным белкам превышало число таковых к фракции I во pce сроки наблюдения.

Нами проведено исследование "нтителогенсза к кздбпанныя белкам у лабораторнта ливотных после заражения их ятекмэми возбудителя чумы с различным плазмг'ным профилем. Установлено, что антител'; к мембранным белкам выявлялись у 35,5 £ белых

мышей, если заражение проводилось штаммами с типичными свойствами, и значительно больше - при заражении бескапсульными вариантами.

Высокие титры (1:5120) антител к мембранным белкам обнаруживали у морских свинок после алиментарного заражения.

Теким образом, показана возможность выявления антьгел к мембранным белкам с помощью экспериментального днагноетикума у лабораторных животных при заражении их как типичными, так и бескапсульнши штаммами возбудителя чумы.

Таблица 4

Титры антител у белых мышей после вакцинации

культурой ?.рез1:18 ^

п

(подкожно. 10 кое)

Срок после Тип серологической Кол-вр исследованных животных

вакцинации (сут) реакции • всегогчисло : :серопо~: :зитив- : :ных % : титры ; средние ;(обратные)

' РИГА коммер. 32 3 9,3 40

4-9 " РНАг коммер. 32 5 15,6 • 39

РИГА эксп. 32 2 21,8 49

РИГА коммер. 45 34 75,5 33

II-20 РНАг коммер. • 45 37 82,2 54

РИГА эксп. 45 29 64,4 52

21-29 РИГА коммер. 40 ' 25 62,5 32

РНАг коммер. .40 30 75,0 40

РИГА ЭКСП ( 40 32 80,0 96

РИГА коммер. 18 7 34,0 36

31-34 ' РНАг коммер. 18 10 55,5 40

. РНГА эксп. 18 15 83,3 145

Исследование антителогенеза у диких грызунов проводили используя вь'сокорезистентных больших песчанок (около 400 зверьков). отловленных на природносчягорой территории Туркмении. Било отмечено возрастание- величины среднегеометрического титра

к 30-м суткам после заражения и последующим снижением его к 60-м суткам (срок наблюдения). Максимальная величина титра у экспериментальных животных достигала значения 1:60-1:70. Эта закономерность отмечалась при определении титра антител как к капсульному антигену, так и к мембранным белнам. Анализ сыво-. роток на 3-4-е и последующие сутки после заражения больших песчанок культурой вирулентного штамма чумного микроба показал, что антитела определялись вначале к мембранным белкам (3-й сутки) и только в период с 5-х по 10-е сутки - и к фракции I (табл. 5). Антитела класса при регистрации их коммерчес-

ким диагностикумом к капсульному антигену составляли к 10-м суткам 28 %, в то время как их количество к мембранным белкам достигало 50 %.

Изучение уровня антител к мембранным белкам и фракции I поале заражения больших песчанок культурой бесфракционного штамма У.рея^п 358/12 показало эффективное обнаружение антител только к мембранным белкам (табл. 6).

Таким образом, приведенные факты свидетельствуют о возт можпости серологического контроля экспериментального заражения, животных бесфракционными птамнами чумного микроба, контролю за эпизоотиями, среди диких грызуноЕ, вызванными чумным микробом с измененными признаками и практической пригодности ди-г-ностических систем, на основе мембранных белков, для анализа полевого материала.

Испытание нового диагностигума проводили при эпизоотоло-гическом обследовании прнродноочагорых территорий Туркмении, где. основным носителем возбудителя являете большая песчанка. Исследовался материал, поступивший в зимне-весенний период 1983 года как с эпизоотической , так и неэпизоотической территории Сундуклинских песков Кызылкумского автономного очага чумы. 497 больших песчанок исследовали нэ нчличие антител к мембранным белкам и фракции I чумного микроба.

Приведенные в табл- 7 данные показывают, что информативность серологического анализа при использовании двух диагнсстикумор воэрасла до 55,7 %. Использование только коммерческого диагностикума позволяло выявлять у 37,8 % исследованных зверьков антитела к фракции I.

Таблица 5

Динамика выявления антител к мембранным белкам и фракции I у больших песчанок после заражения "■'огяЗ.п!.«/ ¡'ч-лЬ; М-701

- Сутки : Й1ГА с экспериментальным : РИГА с коммерческим

после заражения: диагностикумом : диагностикумом

3-е 5-е 10-е

3/12 9/14 24/29

0/12 0/14 2.1/29

Примечание. В числителе - количество серопоэитивных сывороток, в знаменателе -•количество исследованных сывороток.

Таблица б • ■

Динамика выявления антител к мембранным белкам у больших песчанок после экспериментального заражения мтаммом Уегз1п1а -рея^в 358/1?

Сутки после заражения

5-е 10-е 21-е 28-е

Кол-во исследованных сывороток

Значения титра (среднегеометрические обратные)_

20 20 20 24

38+1,82 56^2,04 43Л.90 60 Л, 73

Таблица 7

Результаты серологического анализа сывороток больших песчанок, добытых в Сундуклинских песках (1983 г.)

Счворотки I Кол-во сывороток-

: ябс. ' : %

Исследованные серологическими 497 100

методами

Положительно реагирующие в РИГА 188 37,8

с коммерческим диагностикумом

Положительно реагирующие в РИГА 179 36,0

с диагностикумом на осноре мембранных белков

Положительно реагирующие в РИГА с диагностикумом на основе мембранных белков и не выявляемые 89 17,9 коммерческим диагностикумом

Специфичность контакта грызунов с чумным микробом была определена при анализе полепого материала, добытого на территории с угасающей эпизоотией Каракумского автономного очага чумы. Исследование 3675 больших песчанок показало, что у двух i очанок были выявлены антитела к мембранным .белкам (0,05 %) и у одной - антитела к фракции I (0,025 %). Последняя находка совпала территориально с местом отлова зверька серопозитивного по мембранным белкам. Этот результат свидетельствует о высокой специфичк сти диагностикума но основе мембранных белкор и позволяет доверительно оценивать результаты, полученные на эпизоотической территории в Сундуклинских песках.

Резюмируя материал по сравнительному серологическому анализу сывороток лаборяторнь*х животных и диких грызунов после экспериментального заражения из различными по вирулентности и фенотипическому выражению штаммами чумного i/икроба, приходим к следующему заключению.

Современная система серологических методов, базирующаяся на поиске антител к фракции I или антигена в' исследуемом материале, неспособна всегда адекватно отражать урогень изменения,

вызываемых микробом чумы в иммунной системе животных. Использование диагностической системы на основе мембранных белков значительно дополняет и расииряе ■ возможности серологического контроля за течением эпизоотических процессов, вызванных нетипичными штаммами чумного микроба среди грызунов на очаговых территориях, и исследования динамики развития инфекционного процесса при экспериментальных заражениях подопытных животных.

ВЫВОДЫ

1. В результате комплексного исследования впервые определены структурная организация и функция компонентов клеточной оболочки чумного микроба: внешних мембран, периплазмы и цито-плазматических мембран. На базе полученных данных открылась возможность разработки трех новых научных направлений:

а/ исследование нового класса антигенных препаратов -мембранных белков клеточных оболочек: ■

б/ конструирование диагностических препаратов на основе открытых антигенов и гомологичных антител к ним;

в/ поиски нсвых протективных компонентов на основе мембранных белков. .

2. Установлено, -что периплаяматическая фракция клеток возбудителя чумы является комплексом биологичесг:ч активных компонентов, она обладает фосфолипазной, нейраминидазной, гемолитической, фибринолитической и плазмокоагулазной активностями, в ней ыявлены пестицин I и "мьишный" токсин. Показано специфическое взаимодействие гликопротеинов периплазматической . фракции с лектином клещевины и агглютинином завязи пшеницы.

3. Впервые показана антигенная активность компонентов внешней мембраны клеток чумного микроба. Антисыворотки к препаратам внешних мембран специфически взаимодействуют с солю-билизированными мембранными белками. Установлено наличие специфических антител к мембранным белкам в коммерческих чумных сыворотках, при изготовлении которых иммунизирующим антигеном для животных служили живые культуры чумного микроба штамма ЕВ.

4. Из клеточных оболочек вакцинного штамма ЕВ чумного микроба солюбмизацией и детергентах изглечены мембранные белки, которые в результате их высокой антигенной активности ярились основой для создания новых препаратор для диагностики чумы.

В препарате мембранных белков выявлены гликопротеины, имеющие высокое сродство к агглютинину завязи пшеницы, лектину клещевины и конканавалину А. •

5. Разработан новый эритроцитарный антигенный диагностикум, который обладает высокой специфичностью и позволяет выявлять антитела к мембранным белкам в сыворотках лабораторных животных и диких грызунов, инфицированных как типичными штаммами чумного микроба, так и штаммами, лишенными способности синтеза фракции I.

6. Разработаны новые диагностические препараты на основе иммуноглобулинов к мембранным белкам: диагностикум эритроцитарный, иммуноглобулины люминесцирующие и коньюгат пероксидазный, позволяющие выявлять культуры чумного микроба, выращенные при 28 °С вне зависимости от продукции антигена фракции I, 'мышиного" токсина, продуктов синтеза плаэмиды и степени вирулентности для лабораторных животных.

7. Установлено, что у диких грызунов после экспериментального заражения культурой вирулентного штамма чумного микроба продукция специфических антител к мембранным белкам наблюдается в более ранние сроки (3-5-е сутки), чем к фракции I.

• 8. Выявлен' спектр гомологичных антител в чумных и псевдотуберкулёзных сыворотках, специфически взаимодействующих с полипептидами препарата мембранных белков (молекулярные массы 45,41 и 31 кД). Установлен высокий аффинитет полипептида в 22 кД к иммуноглобулинам.чумных агглютинирующих сывороток.

9. Показано, что иммуногенность и протективность для белых мыаей и морских свинок культур чумного микроба штаммов ЕВ и

тта хромогенных вариантов коррелирует с наличием в их клеточных оболочках 22 кД полипептида.

10. Показано, что мембранные белки, являясь нетоксичными антигенами с еысокой иммуногенностью, "огут быть рекомендованы в качестве компонентов при конструировании чумных вакцин нового поколения.

список

научных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Кондрашин Ю.И., Коннов Н.П., Щербаков A.A.. Биологическая и морфологическая характеристика внешних мембран клеточной стенки чумного микроба // 1У Всес. биохим.' съезд.- М.: Наука,

1979.- Т.2.- С.102.

2. Кондрашин Ю.И., Щербаков A.A., Видяева H.A. Влияние температуры выращивания на состав внешних и внутренних мембран Pastereiln Pestis . // Регуляция биохим. процессов у микроорганизмов. Матер, симпоз.- Пущино, 1979.- C.II0-II2.

3. Щербаков A.A., Кузьмиченко И.А., Боровикова Т.П., Видяева H.A., Кондрашин Ю.И. Иммунохимическая и биохимическая характеристика периплазмы Yersinia rentio // ИммунОЛ. И ИММуНО-профилакт. чумы и холеры. / Тез.докл.на Всес. конф.- Саратов,

1980.- С.21-23.

4. Еидяева H.A., Щербаков A.A. Сравнительная характеристика белков внешней мембраны Yersinia pentis и Yersini« pseudotu-berculisis //'Мол. биол. и генет. возбудит, особо опасных инф.- Саратов. Изд-во СГУ, 1982.- №1,- С.9-12.

5. Сердобинцев Л.Н., Тараненко Т.М., Наумов A.B., Андреева И.П., Щербаков A.A., Мохин K.M. Выделение капсульного антигена .чумного микроба о применением ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе // Иммунол. и профилакт. особо опасных инф.-Саратов, 1982.- С.33-43.

о. Щербаков A.A., Кондрашин Ю.И., Анисимов П.И. Антигенная активность белков внешней мембраны у Yersinia restis hv // ЖМЭИ, 1983.- if3.- С.21-24.

7. Кузьмиченко И.А., Щербаков A.A., Кондрашин Ю.И., Бранд-зишевский Ю.В. Активность некоторых "ферментов патогенности"

и компонентов пестицин-фибринолизин-плазмокоагулазной системы г субклеточных фракциях чумного микроба // МЭИ, 1983,- №10.-С.101-102.

8. Аг-торское свидетельство If II52II4 (СССР) "Способ получения "мышиного" токсина чумного микроба".-Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений СССР 16.II.1983.

9. Кузьмиченко И.А., Щербаков A.A., Брандзишевский Ю.В. Субклеточная локализация некоторых "ферментов патогенности"

и компонентов пестицин-фибринолизин-плазмокоагулазной системы в чумном микробе // Актуальн.вопр.лаб.диаг. и биохим. возбудит, чумы и холеры.- Саратов, 1984,- C.I9-23.

10. Щербаков A.A., Анисимов П.И., Кондрашин Ю.И., Солодов-никова Т.Н. Диагностикум эритроцитарный антигенный на основе мембранных белков чумного микроба // Генет. и микробиол. при-родноочагов. инф.- Саратов, 1984.- С.22-27.

11. Бейнблат В.И., Титенко Ü.M., Веренков М.С., Щербаков A.A., Киреев М.Н. Видоспецифический поверхностно-соматический антиген возбудителя чумы // Мол.биол.и иммунол. возбудит.особо опасных инф. / Тез.докл.Есес. конф. Ростов-н/Д, 1984.- С.94-96.

12.Анисимов П.И., Щербаков A.A., Веренков М.С., Кокушкин A.M., Коннов Н.П., Девдариани З.Л. Люминесцирующие иммуноглобулины к мембранным белкам чумного микроба // Вопр.генет.мол. биол.и микробиол. чумы и холеры.- Саратов, 191:5.- С.49-53.

13. Анисимов П.И., Топорков В.П., Щербаков A.A., Бурлаченко Т.А., Афанасьева М.А., Вологина И.И. Возможности повышения информативности исследования при изучении энзоотии чумы // Вопр. природн.очагов.и эпидемиол. особо опасных инф.- Саратов, 1985.-С.3-9.

14. Вейнблат В.И., Титенко М.М., Веренков М.С., Меньшов П.И., Кормилицин A.B., Можаров О.Т., Щербаков A.A., Васенин A.C., Задумина С.Ю. Характеристика препаратов капсульного антигена, выделенных из бульонной культуры штамма ЕВ Yersinin t>ostis // ЖМЭИ, 1985.- M.- С. 19-24.

15. Анисимов П.И., Щербаков A.A., ВенГеров Ю.Н., Попова

А.Б., Северин Е.С. Иммуноферментный подход выявления мембранных белков Yersinia pestis //Достижения микробиологии - практике /Тез. УП съезда Всес. микробиол.об-ва,- Алма-Ата, 1985.- Т.4. (Биотехнол. основы микробиологич. синтеза).— С.5.

16. Щербаков A.A., Анисимов П.И., Солодовников Н.С., Топорков В.П., Заднова С.П. О возможности использования иммуноглобулинов к мембранным белкам для обнаружения чумного микроба // Вопр. природн.очагов, и эпидемиол. особо опасных инф.- Саратов,

1985.- С.9-16.

17. Заднова С.П., Щербаков A.A. Изучение спектра антител к мембранным белкам чумного микроба в псевдотуберкулёзных сыворотках./ Тр.раб.совещ.мол.учен.и специалист."Эпидемиол.мол. биел.,генет. и иммунол. возбудителя чумы. Саратов 18-21 окт.

1986, ч.2.Всес.н.-и. ин-т "Микроб", Саратов.-Деп.в ВИК.ГГИ 12. 04.88, V 2777-В88. ■

18. Щербаков A.A., Заднова С.П., Коннов Н.П. Анализ препарата мембранных белков иммунохим. методами //Мол.биол.и мик-робиол. природно-очаговых инф.-Саратов, 1986.- C.93-IOO.

19. Щербаков A.A., Топорков В.П., Анисимов П.И. Применение мембранных белков в диагностике чумы'// Акт.вопр.иммуно-диагн. особо опасных инф./ Тез.докл. Всес.научно-практич. конф. (26-27 мая 1986 г.).- Ставрополь, 1986.- Ч.И.- С. 187-189.

20. Щербаков A.A., Коннов Н.П., Веренков М.С., Девдариани З.Л., Анисимов П.И. Иммунохимический анализ мембранных полипептидов чумного микроба // Всес. конф. АктуалШвопр.теорет. и прикл.инф. иммунологии: Механизмы противоинф. иммунитета.-Саратов, М,,1987.- С. 123-124.

21. Щербаков A.A., Анисимов П.И., Кондрашин Ю.И., Коннов Н.П. Использование мембранных белков Yersinia Destis в иммунологических реакциях // Биохим. и биофиз. микроорганизмов.-Горький, 1987.- C.II4-II7.

22. Щербаков A.A., Луцик М.Д., Коннов Н.П., Анисимов П.И. Гликопротеины клеточной оболочки чумного микроба // УШ Всес. конф."Химия и биохим.углеводов",- Тбилиси 17-19 ноября 1987 г. /Тез.докл.- Пущино, 1987,- С.132-133.

23. Ежова Н.М., Щербаков A.A., Чернова И.А., Коннов Н.П;, Шатаева Л.К., Анисимов П.И, Хроматография препаратов мембранных белков на полимерных сорбентах // Препаративная хроматография фиол. активных веществ на полимеры., сорбентах./ Тез. докл. 1-го Всес.симп..-Л., Наука, 1988.- С.7-8.

24. Коннов Н.П., Демченко Т.А., Венгеров D.D., Семенов Т.Е., Культа Л.Ю., Щербаков A.A., Веренков М.С. Иммуноэлектронно-мик-роскопическое исследование антигенов чумного микроба* // Микро-