Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Uersinia pestis EV как индуктор синтеза цитокинов, регулирующих кооперативное взаимодействие поли- и мононуклеарных фагоцитов в процессе формирования противочумного иммунитета

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Иванова, Инна Александровна, Ростов-на-Дону

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт

YERSINIA PESTIS EV КАК ЩДУКГОР СИНТЕЗА ЦИТОКИНОВ, РЕГУЛИРУЮЩИХ КООПЕРАТИВНОЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ПОЛИ- И МОНОНУКЛЕАРНЫХ ФАГОЦИТОВ В ПРОЦЕССЕ ФОРМИРОВАНИЯ ПРОТИВОЧУМНОГО ИММУНИТЕТА

03.00.07 - микробиология 14.00.36-аллергология и иммунология

На правах рукописи

ИВАНОВА ИННА АЛЕКСАНДРОВНА

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители:

доктор медицинских наук,

профессор

Васильева Г.И.

доктор медицинских наук,

старший научный сотрудник

Рыжко И.В.

Ростов-на-Дону

1998

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ. ......................................... 6

ВВЕДЕНИЕ.................. . . . . ...... ...... ........ ....... . 8

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. ................................ 16

1.1. Цитокины: биологические эффекты и их значение...... 16

I.E. Цитокинопосредованная регуляция кооперативного

взаимодействия макрофагов и нейтрофилов.......,,.,, 26

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ............................... 40

2.1. Бактериальные штаммы............................... 40

2.2. Экспериментальные животные......................... 40

2.3. Клеточные линии.................................... 40

2.4. Получение цитокинсодеожащих оуперкатантов.......... 40

2.4.1. Получение оуперкатантов, содержащих комплекс монокиков, синтезируемых суммарным пулом мшфофагов перитонеального экссудата морских свинок........... 40

2.4.2. Получение супернатантов, содержащих комплекс моко-ккнов, синтезированных оубпопуляциями макрофагов морских свинок..................................... 42

2.4.3. Выявление монокмнов в супернатантах продуцирующих

их клеток иммуноферментным методом................. 43

2.5. Изучение изменений Функциональной активности нейтрофилов при воздействии комплекса монокинов........ 43

2.5.1. Получение нейтрофилов.............................. 43

2.5.2. Определение фагоцитарной активности нейтрофилов.... 44

2,5,3, Оценка экспрессии Fe-рецепторов на поверхности

нейтрофилов.........44

Характеристика активности лизосом нейтрофилов45

<3,5,5, Определение хемотактичеокой активности нейтрофилов 46

2.6, Получение супернатантов, содержащих комплекс нейт-рофшгакиков........................................ 46

2.7, Изучение изменений функциональной активности макрофагов при воздействии кейтрофилокиноодержащих супернатантов47

2,7Л. Определение фагоцитарной активности макрофагов,,,,, 47

2.7.2, Оценка экспрессии Fe-рецепторов на поверхности макрофагов..................................................48

2.7.3, Определение миграции макрофагов,................... 48

2.7.4, Характеристика активности лизисом макрофагов,,,,,,, 48

2.7.5, Определение индекса исчезновения макрофагов,,,,,,,, 48

2.7.6, Определение показателя макрофагальной трансформации моноцитов......................................49

Определение индекса перераспределения субпопуляций перитонеальных макрофагов,......................... 50

Статистическая обработка результатов исследования., 50

ГЛАВА 3. ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ КОМПЛЕКСА МОНОКННОВ НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ НЕЙТРОФИЛОВ ИНТАКТНЫХ И ИММУННЫХ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ.,,,,,.......... 52

3.1. Исследование влияния монокиноодермшдах супернатантов на фагоцитарную активность нейтрофилов......... 52

3.1.1, Исследование влияния монокинсодержащих супернатантов, полученных в разные сроки от начала стимуля-

ции макрофагов, на фагоцитарную активность нейтро-

шилов,................................53

3.1.3. Сравнительная характеристика регулирующего действия монокинов ка фагоцитов чумного микроба при первичном и вторичном иммунном ответе.............. 58

3.3. Изучение влияния монокинсодержащих оупернатантов

на хемотактичеокую активность нейтрофилов.......... 67

3.3. Исследование действия монокинов на экспрессию Рс-рецепторов на поверхности нейтрофилов........... 73

3.4. Оценка влияния монокинов на лабилизацию лизосомных мембран нейтрофилов................................ 79

ГЛАВА 4. ИЗУЧЕНИЕ ГЕТЕРОГЕННОСТИ ПЕРИТОНЕАЛЬНЫК МАКРОФАГОВ Пи ИК СПОСОБНОСТИ ОСУЩЕСТВЛЯТЬ ДИСТАНТНУЮ РЕГУЛЯЦИЮ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ НЕЙТРОФИЛОВ.. 86

4.1. Характеристика гетерогенности субпопуляций перито-неалъных макрофагов по их способности синтезировать монокины, модулирующие фагоцитарную актив--нооть нейтрофилов.................................. 88

4.2. Исследование гетерогенности субпопуляций перитоне-альных макрофагов по их способности осуществлять дистантную регуляцию хемотаксиса нейтрофилов....... 93

4.3. Характеристика гетерогенности субпопуляций перито-неалышх макрофагов по их способности продуцировать монокины, регулирующие экспрессию Рс-рецепторов на поверхности нейтрофилов..................... 94

ГЛАВА 5, ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ КОМПЛЕКСА НЕЙТРОФИЛОКИНОВ

цд фун?<П'ИПНД |ТЬН"уН) ДКТИрНПП'Гь МДкРПФДТ'ПН МНТЛкТ-"

6.1. Изучение влияния комплекса нейтрофилокинов на фа-

о

гоцитарную активность макрофагов, IOS

5.2. Исследование влияния комплекса нейтрофшюкинов на миграцию макрофагов................................108

5.3. Изучение влияния комплекса нейтрофилокинов на экспрессию Fe-рецепторов макрофагов,................. Л12

5.4. Исследование влияния комплекса нейтрофилокинов на лизосомный аппарат макрофагов...................... 114

5.5. Характеристика влияния комплекса нейтрофилокинов на дифференцйровку клеток системы мононуклеаюных фагоцитов..........................................119

5.6. Изучение способности нейтрофилокинов влиять на перераспределение оубпопуляций перитонеальных макрофагов. .. ...........................................123

ЗАКЛЮЧЕНИЕ................................................1£8

ВЫВОДЫ....................................................142

УКАЗАТЕЛЬ ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.......................144

БСА ИАК ИАН

ИЗФ НИМ икк

ИЛ-1,2. , .

ИПи

итмм жю

ЛФЦ

МИФ МКА м. к» Мы МФ

Нф

ПАМ ПАФ ШЖ ПМТМ

РИМ РТММ

иш

СН УЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

бычий сывороточный альбумин

индекс активации кшшшга

индекс активации нейтрофилов

индекс завершенности Фагоцитоза

индекс исчезновения макрофагов

иммунокомпетентные клетки

интерлейкин 1,2 и т.д.

индекс перераспределения макрофагов

индекс торможения миграции макрофагов

липополнсахарид

лимфоциты

фактор, ингибирующий миграцию

моноклинальные антитела

микробные клетки

моноциты

макрофаги

нейтрофилы

процент активных макрофагов процент активных фагоцитов процент поврежденных клеток

показатель макрофагадъной трансформации моноцитов

периферической крови

реакция исчезновения макрофагов

реакция торможения миграции макрофагов

система мононуклеарных фагоцитов

супернатант

условные единицы

ФАН - фактор активации нейтрофилов

ФИ - Фагоцитарный индекс

ФНО-а - фактор некрова опухолей-альфа

Рок - ко-рецептор

Актуальность проблемы. Совершенствование специфической профилактики и лечения чумы продолжает оставаться актуальной проблемой, успешное решение которой неразрывно связано с изучением тонких механизмов формирования противочумного иммунитета. В настоящее время большинством исследователей признается доминирующая роль клеточного иммунитета в формировании резистентности к чуме

(Исупов И.В. и др., 1982, 1997; Горькова А.В. и др., 1987; Тихо-

Á ___ ___ _ ,/

мирова А.А., 1У8У; Васильева Г.и., lyyu; Назарова A.Ü. и др., '

1990; Ледванов М.Ю. и др., 1993; Стукова И.Ю. и др., 1997). Изу- " чены отдельные механизмы участия клеток СШ) и .ЛФЦ в противочумном иммунитете (Васильева Г.И. и др., 1983-1998; Задумина С.Ю. и др., 1985; Герасимова К.Й., 1990; Ледванов М.Ю. и др., 1991, 1995; Са- и япина Л.В. и др., 1991). Однако взаимодействие этих и других клеток, принимающих участие в развитии резистентности к чуме, мало изучено. Имеются отдельные сообщения о способности вакцинного штамма чумного микроба и некоторых его антигенов индуцировать синтез моно- и лимфокинов, обеспечивающих кооперацию клеток СМФ и ЛФЦ (Исин Ж.М. и др., 1989; Васильева Г.И., 1990; Прокопьева Е.Д. и др., 1990; Емельянова Н.В. и др., 1991; Киселев Ю.А. и др., 1991; Ледванов М.Ю. и др., 1991, 1993, 1997; Беспалова И.А., 1996; Шмелев В.А. и др., 1997). Вместе с тем, учитывая, что основными зффекторными клетками, осуществляющими реализацию противочумного иммунитета, являются клетки фагоцитарной системы, представляет интерес изучение возможности цитокинопосредованной регуляции кооперативного взаимодействия между моно- и полинукле-арными фагоцитами в процессе формирования резистентности к чуме.

Предпосылкой проведения исследований в этом направлении

— ц —

явился нарастающий поток сообщений, свидетельствующий о том, что низкомолекулярные регуляторные пептиды (цитокины) синтезируются клетками многих типов и представляют собой единую систему гомеоо-татичеокой регуляции Функциональной активности клеток различной тканевой принадлежности5 являясь частью сложнейшей цепи взаимоо-вязанных сигналов, обеспечивающих работу различных систем в живом организме, в том числе фагоцитарной (Суслов А.П., 1990; Кулинский В.И., Колесниченко Л.С., 199?; Зимина И.В. и др., 1994; Ковальчук Л.В. и др., 1995; Ярилин А.А., 199?; Smith R.S., 1991, 1992; Dan-tzer R., 1992; Agaoe W. et al, 1993; Henderson B. et al, 1996),

Исследования последних лет показали, что регуляция взаимодействия клеток внутри системы фагоцитоза может осуществляться цитокинами не только макрофагального, но и нейтрофильного происхождения (Адаменко Г.П., 1992-1995), опровергнув традиционный взгляд на нейтрофилы как сугубо эффекторные клетки (Долгушин И.И., 1986-199?), Однако этот вопрос только начинает изучаться и до настоящего времени нет сообщений о проведении исследований комплекса монокинов и комплекса нейтрошилокинов, продуцируемых МФ и Нф под влиянием антигенов инфекционной природы, в том числе чумного микроба, и их действия на отдельные функции фагоцитов. Отсутствуют какие-либо сведения о синтезе нейтрофилокинов и их действии на мф при формировании противочумного иммунитета. Нет также сообщений о влиянии монокинов, индуцированных вакцинным штаммом чумного микроба и его антигенами, на функции Нф.

Проведение исследований в этом направлении представляется актуальным, так как позволит расшифровать неизвестные до настоящего времени механизмы Формирования резистентности к чуме и откроет принципиально новые подходы к совершенствованию вакцинопро-Филактики этой инфекции и иммунокоррекции сопровождающих ее имму-

нопатологических реакций.

Цель и задачи мшу «едавшим. Цель настоящей работы - выяснить возможность цитокинопооредовалной регуляции кооперативного взаимодействия моно- и полинуклеарных Фагоцитов в процессе формирования первичного и вторичного иммунного ответа на антигены Yersinia Pestis EV-76 и определить монокин- и нейтроФилокининдуцирующую способность вакцинного штамма чумного микроба и его антигенов.

В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие основные задачи исследования:

1. Получить супернатантьц содержащие комплекс монокинов, синтезируемых in vitro перитонеальными макрофагами интактных и V иммунных экспериментальных животных} стимулированными вакцинным штаммом чумного микроба и его антигенами (FIA, JïïIC).

g. Охарактеризовать влияние полученного комплекса монокинов на функциональную активность нейтрофилов интактных и иммунных животных.

3. Определить способность человеческих моноцитоподобных клеток линии Ü937 продуцировать комплекс монокинов, регулирующих функциональную активность нейтрофилов.

4. Определить гетерогенность субпопуляций макрофагов по их способности синтезировать монокины, модулирующие Функции нейтрофилов .

5. Получить супернатантьц содержащие комплекс нейтрофилоки-нов5 синтезируемых in vitro перитонеальными нейтсофилами интактных и иммунных экспериментальных животных5 стимулированными микробными клетками вакцинного штамма чумного микроба и его антигенами (FIAj ЛЕЮ).

6. Определить регулнторное влияние полученных нейтрошилоки-нов на функциональную активность макрофагов.

7» Провести сравнительный анализ монокин- и нейтрофилокинин-дуцирующей активности микробных клеток вакцинного штамма чумного микроба, его антигенов (FIA, Ж1С) и классического индуктора цито-кинов - ЛПС Escherichia ooli.

Научная новизна:

- впервые выявлена кооперация моно- и полинуклеарных фагоцитов, опосредуемая моно- и нейтрофилокинами, в процессе формирования противочумного иммунитета

- установлена способность моноцитоподобных клеток человеческой линии U937 продуцировать комплекс монокинов, регулирующих функции нейтрофилов

- впервые выявлены и выделены субпопуляции макрофагов, отличающиеся по их способности синтезировать монокины, модулирующие определенные функции нейтрофилов

- показано влияние комплекса монокинов, индуцированных микробными клетками вакцинного штамма чумного микроба и его антигенами (FIA, ЛПС)5 на фагоцитарную и хемотактическую активности нейтрофилов, содержание в них лизосом и экспрессию на их поверхности Fo~рецепторов

- впервые получены супернатанты, содержащие комплекс нейтро-филокинов, индуцированных микробными клетками вакцинного штамма чумного микроба и его антигенами (FIA, ЛПС)

- установлено влияние нейтрофилокинов на дифференцировку моноцитов периферической крови в макрофаги, содержание в них лизосом, миграцию и киллерную активность мононуклеарных фагоцитов и их распределение в суммарном пуле

- подобраны условия стимуляции фагоцитирующих клеток для получения монокин- и нейтрофилокинсодержащих супернатантов с определенной биологической активностью

- установлено, что вакцинный штамм чумного микроба является

мощным индуктором цитокинов, опосредующих кооперацию моно..... и по-

линуклеарных Фагоцитов

- предложены клеточные модели для биологической характеристики антигенов чумного микроба по их способности индуцировать синтез цитокинов, влияющих на определенные звенья иммуногенеза в процессе формирования противочумного иммунитета

Теоретическая ценность м практическая значимость, В результате проведенного комплексного исследования цитокиновой регуляции кооперации клеток в системе фагоцитоза в процессе формирования поствакцинального противочумного иммунитета получена отсутствовавшая до настоящего времени базисная информация о вдеточно-меди-аторных взаимоотношениях поли- и мононуклеарных фагоцитов, опосредованных моно- и нейтрофилокинами, Впервые получены и охарактеризованы оупернатанты фагоцитов, содержащи ~ • кинов, индуцированных микробными клетками : ного микроба и его антигенами, модулирующих

и 7

раны условия стимуляции фагоцитирующих клеток для получения моно-кин- и нейтрофилокиноодержащих супернатантов с определенной биологической активностью.

Впервые выявлена гетерогенность макрофагов по способности продуцировать монокины при воздействии микробных клеток вакцинного штамма чумного микроба и его антигенов, при этом идентифицированы субпопуляции макрофагов} отличающиеся по влиянию комплекса продуцируемых ими цитокинов на определенные функции нейтрофилов.

Установлена высокая монокин- и нейтрофилокининдуцирующая способность микробных клеток вакцинного штамма чумного микроба.

v

существенно превосходящая таковую классического индуктора цитоки-нов - ЛЕЮ Е.ооН,

Результаты исследований представляют существенный интерес для понимания механизмов формирования резистентности к чуме, комплексное изучение которых позволит в обозримом будущем выявить наиболее уязвимые звенья иммуногенеза и откроет новые перспективы для иммунокорригирущих воздействий.

Практическая значимость работы заключается в разработке и внедрении в практику научных исследований новых клеточных моделей для:

- биологической характеристики антигенов чумного микроба по их влиянию на цитокинопосредованную кооперацию клеток фагоцитарной системы

- скрининга иммунокпрректорОБ, целенаправленно стимулирующих или ингибйрующих субпопуляции макрофагов, продуцирующих комплекс монокинов, определяющих различную биологическую активность кде-ток-мишеней

- оценки торможения миграции макрофагов с помощью реакции исчезновения макрофагов.

Предложенные модели внедрены в практику научной работы Ростовского НИПЧИ и применяются при выполнении плановых научно-исследовательских тем.

Результаты исследований, представленные в диссертации, использованы при составлении "Методических рекомендаций по оценке нейтрофилокининдуцирующей активности антигенов чумного микроба55, утвержденных Ученым Советом РЕЧИ, протокол N5 от 7 мая 1998 года.

Основные тшмнении, швкхэшне- на защиту:

1. В процессе формирования первичного и вторичного иммунного ответа на антигены вакцинного штамма чумного микроба наблюдается

взаимодействие поли- и мононуклеарных фагоцитов, опосредуемое моно- и нейтрофилокинами.

2. Микробные клетки Yersinia pestis EV-78 являются мощным индуктором синтеза моно- и нейтрофилокинов, регулирующих кооперацию моно- и полинуклеарных фагоцитов, превосходящим по своей активности классический индуктор цитокинов - ЛПС E.coli.

3. Клетки системы мононуклеарных фагоцитов гетерогенны по своей способности продуцировать монокины при воздействии микробных клеток вакцинного штамма чумного микроба и его антигенов, при этом различные субпопуляции макрофагов отличаются по влиянию комплекса продуцируемых ими цитокинов на определен�