Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ангидробиоз дрожжей

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Ангидробиоз дрожжей"

СТ

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ

На правах рукописи

Рапопорт Александр Иосифович

УДК 582.282.23+58.032.3 АНГИДРОБИОЗ ДРОЖЖЕЙ

/03.00.07 — микробиология/

/03/ /в

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва — 1988

Работа выполнена в Институте микробиологии им. А. Кирхенштейна АН Латв. ССР

Официальные оппоненты:

1. Член-корреспондент АН СССР Л. В.Калакуцкий

2. Доктор биологических наук В. И. Дуда

3. Доктор биологических наук, профессор Д. Н. Островский

Ведущая организация: Институт проблем криобиологии и криомедищшы АН УССР

Защита состоится «_»_ 198_г. в _ час.

на заседании специализированного совета Д. 002.64.01 при Институте микробиологии АН СССР по адресу 117811 г. Москва, Проспект 60-летия Октября, д. 7, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии АН СССР

Автореферат разослан «__>>____198_г.

И. О. ученого секретаря специализированного совета канд. бнол. наук Л. Е. Никитин.

СБГЦАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОШ

'^ .АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ В "Основных напраатениях экономического ' ' я социального развития СССР", принятых

на ХХУЦ съезде КПСС, указывается на необходимость ускорения научно-технического прогресса и развития науки и в т.ч. физико-химической биологии и научных основ биотехнологии, поставлена задача увеличения выпуска продукции микробиологической промышленности. В связи с этим крайне актуальна.: Ст£ .овится углубленна наших представлений о наиболее существенных закономерностях различных сторон жизнедеятельности микроорганизмов. При этом серьезное внимание должно быть уделено планомерному и всестороннему развитию фундаментальных исследований для решения тех задач, которые впоследствии могут быть использованы в практических целях.

К '.с.'лсим проблемам, гребущим детально го изучения, относится и явление анабиоза. Проблема анабиоза и.эет большое мировоззренческое и общебиологическое значение. Ее решение приблкжг зт к пониманию сущности жизни, Ешвллег рол. воды и структурной организации клетки для жизнеспособности биологических систем. Прогресс в изучении анабиоза имеет ваяное значение для развития учения о происхождении и распространении жизни на Ьемле и планетах солнечной системы, способствует выяснению вопроса о возможности миграции низ ни меиду планетами.

Наряду с этим, проблема анабиоза имеет ис .лючительно большое практическое значение. Возможность консервирования органов, тканей и клеток открывает новые горизонты в медицине. Высушивание или заморшшвание сперт позволяет создать $овд генетического материала высокопродуктивных сельскохозяйственных животных, что крайне необходимо при использовании метода искусственного осеменения. Б последние годы проблема консервации генетических ресурсов стала крайне актуальной и в связи с необходимостью сохранения в природе существующей, по крайней мере, в наши дни фло^ы и фауны из-за постоянного и достаточно быстрого полного исчезновения многих■редких видов животных.

В микробиологической, медицинской, пгсдевой и мясомолочной промышленности произЕоД.. .'ся ряд препаратов, представляющих собой жизнеспособные клетки микроорганизмов. Их качестзо, потребительские свойства, длительность хранения намного улучшаются

их производстве в сухом виде. Дальнейшее же улучшение качества выпускаемых сухизс биопрепаратов, повышение экономической рентабельности их производства, разработка новых технологий неразрывно связаны с необходимостью детального изучения анабиотического состояния живых организмов. I

К 1970 г. - времени начала проведения настоящей работы - бч-ди шясненн основ, ле физиологические изменения, характеризующие процессы обезвоживания и последующей регвдратации микроорганизмов. На первый план выдвинулась задача углубленного исследования основных внутриклеточных структурно-функциональных, биохимических, биофизических и ыодекулярно-биологических механизмов, о которыми связан переход дрожжевых клеток в состояние анабиоза и одновременного выяснения возможных причиг гибели части клеток в подобных условиях.

Ц ПЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ Целью настоящей работы являлось выяснение основных закономерностей . структурной и функциональной перестройки клетки при ее переходе в состояние анабиоза, достигаемого в результате обезвоживания организмов /ангидробиоза/, а также в процессе ее реактивации и выхода из этого состояния.

Чтобы достичь поставленной цели планировалось решать следующие основные задачи;

I/ разработать или модифицировать руд методических подходов, необходимых для всестороннего исследования дрожжевых, клеток, находящихся в состоянии анабиоза или реактивации и выхода из этого состояния;

2/ охарактеризовать структурные и функциональные перестройки основных органшгя дрокжешх клеток при их переходе в состояние ■ ангидробиоза и при последующем восстановлении активной жизнедеятельности организмов;

3/ изучить некоторые изменения структурно-функциоьального состояния мембран при' обезвоживашш-регидратацяи дроажей;

4/ исследовать защитные реакции, реализующиеся в дрозжевых ялетках при их переходе в состояние ангидробиоза;

5/ исследовать возможность повышения устойчивости яроикевых организмов к процессам обезвоаиЕания, ре вдратации и реактивации путем воздействия на них факторами внешней срр^ы;

б/ обобщить данные о роли основных факторов, определяющих сохранение жизнеспособности, дрожжей в экстремальных условиях обез-вокивакия-регэдратацин.

НАУЧНАЯ Н0Е13НА И ЗНАЧИМОСТЬ В проведенной работе сформировано

и развито новое научное направление - цитология ангидрсбиоза, понимаемое как раскрытие важнейших закономерностей биологии клетки, связанных с обратдаш торможением ее метаболизма, последующей реактивацией и выходом иа этого состояния.

Показано, что ангидробиоз представляет собой эволюционно сформировавшийся процесс адаптации к условиям экстремально низких уровней влажностей, осуществляющийся путем комплексной. структурно-функциональной перестройки клетки и проявлявшейся на всех уровнях организации - клеточном, субклеточном /ооганоедном/ г ио; кулярнсм.

Выяснены основные закономерности перехода клетки в состояние ангвдробиоза и ее последующей реактивации. Первый этап характеризуется перестройкой ядерного аппах на: конденсацией хроматина, переходом его структура в трансярипционно неактивную форму о наднуклеосомной организацией, стабилизацией генома. Происходит тагосе снижение количества рибосом и стабилизация пула РНК на уровне 6(К от исходного содержания. Существенные изменения характерны для струтаурно-функциональных свойств мембран /в т.ч. изменяется их проницаемость/, что связано с перестройкой их молекулярной организации, при которой на отдельных участках мембран ыояет осуществляться переход липиднбго бислоя из ламелляр-ной фазы в гексагональную фазу П. Показано, что на этапе торможения метаболизма в дргаиах активируется ряд внутриклеточных процессов, среда которых возрастание активности вакуолярной системы и осуществление специальных защитных реакций - отграничение участков необратимо поврежденной цитоплазмы, Отделение нуклеолеммой хроыатинсодерващей й резорбция остальной части ядра, синтез и накопление протекторных соединений /трегалоза, полно лов/.

Установлено, что существенной характеристикой этапа реактивации является возможность значительного снижения поврелдений в мембранах и увеличение в результате этого количества клеток,

восстанавливающих активную жизнедеятельность, путем создания условий, способствующих нормализации молекулярной организации мембран. Обнаружена повышенная физиологическая активность дрожжевых организмов, выводимых из состояния ангйдробиоза /увеличение накопления биомассы и синтеза гидролитические ферментов/.

Установлены основные факторы, определяющие максимальное сохранение жизнесп. аобности дрожжей в условиях перехода в состояние акгццробиоза, среди которых степень стабильности нуклеиновых кислот, определенная стадия клеточного цикла, способность к конденсации хроматина, степень сохранности структуры мембран, накопление клетками трегалозы или полиолов.

Показана возможность значительного повышения устойчивости дрожжей к обезвоживании,, пере водящему их в состояние анп.. ^ро-биоза, путем создания условий, имитирующих начальные аташ» дегидратации организмов в природные условиях.

Значительная часть выявленных в работе структурно-функциональных изменений монет рассматриваться как защитные реакции клетки, направленные на сохранение жизнеспособности организмов в условиях обезвоживания. Полученные данные изменяют представления о потенциальных возможностях эукариотической клетки и о поведении микроорганизмов в природе при воздействии такого фактора как экстремально низкие уровни влажности.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ На осноге полученных результатов

возникла возможность разработка в дальнейших исследованиях анабиоза нового направления, имеющего наряду с теоретическим и непосредственное практическое значение - направленного поиска условий, обеспечивающих значительное повышение устойчивости дрождевых организмов к процес-. сам обезвоживания, регидратацш и реактиваций, и резкого повышения на этой основе качества сухих биопрепаратов микробного происхождения и экономической эффективности их промышленного производства.

Цитологические данные о строении микроорганизмов и реактивности их мембран и различных внутриклеточных органелл ыогут быть использованы при изучении механизмов действия различных экстремальных факторов в качества модельных систем.

Данные о строении ш.гактных дрожжевых клеток и об их струн- -

турно-функциональных переотройках при переходе в состояние анабиоза и о необратимых патологических повреждениях, возникающих при гибели клеток, могут быть использованы при оценкэ физиологического состояния культур и при ин,цикации различных воздействий на клетку, при работах по оптимизации новых технологий культивирования микроорганизмов и по получешпо сухих биопрепаратов микробного происхождения, а таето г/ри определении биологической активности микроорганизмов, что весьма существенно для микробиологической промышленности и биотехнологии.

. Разработаны и описаны методы быстрого количественного определения степени жчзнеспособн сти дрожжевых организмов, подвергнутых экстремальным воздействиям и разработана градации различных состояний живых клеток.

Показана возможность использования нового сравнительного критерия оценки устойчивости дроижей к дегидратации, исходя из степени стабильности их нуклеиновых кислот.

Данные, изложенные в диссертационной работе, использоваг! при чтении курсов лекций по микробиологии на кафедре физиологии ра ектений и микробиологии Латвийского Государственного университета им. П.Стучки, по цитологии микроорганизмов на кафедре микробиологии Московского Государственного университета им. М.В.Ломоносова, по технической микробиологии на кафедре технологии консервирования Кишиневского политехнического института им. С.Лазо и по биотехнологии на кафедре органического синтеза и биотехнологии Рижского политехнического института им. А.Я.Пельше.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ Материалы диссертации доложены.и обсудцены на шести конференциях молодых ученых /Рига, 1У72, 1975, 1У76,1977, 1979; Ереван, 1977/, на симпозиуме "Анабиоз и предакабиоз микроорганизмов" /Рига, 1571/, П Всесоюзной конференции по теоретическим и прикладном вопросам криобиологии /ларьков, 1584/ и на Международной конференции по криобиологии /Харьков, 1988/, на Всесоюзном симпозиуме "Ре-гу.лция биохимических процессов у микроорганизмов" /Пущине, 1972/, на Всесоюзном симпозиуме "Общие механ"змы клеточных реакций на повреждающие воздействия" /Ленинград, 1976/, на Втором Всесоюзном сшпоз1Г-|в "Структура и функции нуклеиновых кислот и биосинтез белка в раствгаях" /Таякент, 1977/, на ампс-зиуие по биотехнологии /Рига, 1978/, на Всесоюзном сишозкуме

ПО онтогенезу микроорганизмов /Пущино, 1977/, на Втором Всесоюзном симпозиуме "Структура и функции лизосом" /Новосибирск, 1980/, на I Всесоюзной конференции "Автоматизированные система обработки изображений" /Москва, 1981/, на 1У Всесоюзном симпозиуме "Электронная микроскопия в ботанических исследованиях" /Рига, '978/, ка У Всесоюзном симпозиуме по ультраструктуре рг i-тений /Кишинев, 19«о/, на Ш симпозиуме "Электронная микроскопия и вопросы диагностики" /Кишинев, 1У86/, на 9, II, 12 Всесоюзных конференциях по электронной микроскопии /Тбилиси, 1973; Таллия, 1979; Сумы 1У82/, на 5, 6 и 7 съездах Всесоюзного микробиологического общества /Ереван, 1975; Рига, 1980; Алма-Ата, 1985/, на 15 Чехословацкой конференции по электронной микроскопии /Прага, 1977', на 4, 7, 8 и 9 Международных дрожжевых симпозиумах /Вена, 1974; Валенсия, 1981; Бомбей, 1983;. Смоленице, 1983/» ни 8 объединенном симпозиуме биохимических обществ СССР-ГДР /Рига, 1985/, на 13 Международном микробиологическом съезде /Т11А, 1у82/, на Международном симпозиуме по регуляции микробного метаболизма /Пущино, 1983/, на всесоюзных рабочих совещаниях по консервации генома, по кинетике и по цитологии микроорганизмов /Пущино, 1982; Киев, 1983; Цущино, 1У84/, на 3 Рияской школе "Поверхность клеток и биомембраны" /Рига, 1986/.

ПУБЛИКАЦИИ Основные материалы диссертации опубликованы в

78 печатных работах и в а'.ч. монографии "Анабиоз микроорганизмов" /соавтор Ы.ЕЛЗегсар, Б.Э.Дамберг/ .к. научно-популярной книге "Анабиоз, приостановленная жизнь...".

ОСНОВНЫЕ ЗАЕВДАМгБ ПОЛоМИЯ ДИССЕРТАЦИИ При пореходедрозже-

шх клеток в состояние ангидробиоза их органелли претерпеваю ряд сб; тьшх струн-турно-<£ункциональншс перестроен, большинство 'из которых косит адаптивный характер.

При переходе дроажевых клеток в состояние ангвдребкозй в них может осуществляться ряд спецкальшк s&pthhx реакций, направленных на сохранение иизнеспособносга организмов. Среда них накопление клетками трегадозы и поляояов, коаденсация хроматина в ядрах, отделение хроматяноодеркащей частя ядра, отграничение необратимо погрежденных участков цитоплазмы и некоторые другие. _

При переходе дрожжей в состояние ангвдробиоза, по крайне t

мере, на отдельных участках их цитоплазматических и вакуолярных мембран может осуществляться переход липидного бислоя из ламел-лярной фазы в гексагональную фазу II.

Одной из основных причин гибели части клеток при обезвоживании дрожжей являются серьезные повреждения их мембран. Значительное снижение повреждений мембран может быть достигнуто путем создания условий, способствующих восстановлению их функционально нормальной молекулярной организации.

При экспериментальном переводе дрожжевых организмов в состояние ангидробиоза необходимо учитывать основные факторы, определяющие сохранение жизнеспособности организмов в экстремальных условиях обезвоживания и последумцеЯ регидратации /степень стабильности нуклеиновых кислот, способность клетки к конденсации хроматина, стадии клеточного цикла, степень сохранения молекулярной организации мембран, способность к осуществлению других защитных реакций/.

Путем направленной искусственной инициации защитных внутриклеточных реакций можно значительно повысить устойчивость дроя-гей к обезвоживанию.

СГОШУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИЙ Диссертация состоит из 15 разделов, которые включают: введение; 4 раздела, в которых обобщаются современные литературные данные ао анабиозу микроорганизмов; 8 разделов, в которых излагаются результаты экспериментальных исследований автора по ан-гидробиозу дрояжей; выводы и список цитированной литературы. Диссертация излагается на 299 страницах ,учетного машинописного текста, содержит 2У таблиц и 122 рисунка. Список литературы включает 272 названий работ отечественных и 497 названий работ зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ОБЪЕКТЫ И МЕТОД В ИССВД0ВШ1ЯХ АНГИДРОБИОЗА ДРШКЕЙ

В заьисшости от задач исследований в проводившихся экспериментах использовались различные ввды и штаммы дрожжей. Среди них: 9 штаммов ВассЬагогаусея сегет1в1вв, 4 шташа 8ассЬв-гоаусе<1еэ • Z шга^а Огур^ососеия а1МЗия, а так-

59 Сгур-Ьососеия Ьипеаг1сия, Епйотуевя [пветшИ. ЕпЙойуеорв!*

tibuXigera, Lipomyces kononenkohe, Candida utilis, Candida vini. .

Дрсети1 исследовашиеся в данной работа, выращивали как в условиях периодического, так и непрерывного /хемостатного/ куль- ; тквирования. Температура культивирования - 28-30 °С, длитель-¡л о схь процесса зависела от задач данного эксперимента. В качестве питательных с; зд использовали как полноценные естественные среды, так и синтетические среды с различными добавками.

Состояние анабиоза в проводившихся .-экспериментах достигалось в результате обезвоживания клеток высушиванием или лиофи-лизацией. При этом дрожжи осаждали на мембранных фильтрах КЙ или ü3 и затш высушивали в термостате при 30 °С в течение 48 часов. В ряде экспериментов дрожжи высушивали на покровн-х стеклах, покрытых тонким слоем подсушенной сусло-агаровой среды. Сушку таких препаратов вели при 30 °С 24-48 часов. Использовали также сушку дрожжей в фильтрующем слое на лабораторной сушилке при температуре 37 °С. Лиофилизацию микроорганизмов осуществляли с применением элитной среды Файбича на установке фирмы Edwarde модель 30Р2.

Реактивацию обезвоженных дрожжевых организмов проводили в жидких питательных средах различного состава, а также на поверхности сусло-агаровой питательной среды. В экспериментах, в которых проводилось непосредственное микроскопическое наблюдение за процессом реактивации, покровные стекла с высушенными на них клетками прикрепляли парафином к чистому предметному стеклу. Затш менду стеклами пропускали сусловую питательную среду. Уто давало возы^.шооть проследить за всем процессом реактивации клеток от г : обводнения до начала размножения.

Регвдратацию дроасаей, находившихся в состсянт. анабиоза, проводили в различных по составу рагидратационных жидкостях. При осуществлении медленной постепенной регидратацик обезвоженных дрожжевых клеток использовали влажную камеру с температурой 3? °С.

В экспериментах по изучению фазоопецифичности повреждений клеток при дегвдратации-регидратации фракционирование дрожжевой суспензии и синхронизацию культур осуществляли с помощью флотации /Ива<'ов и др., 1984/. Возрастную структуру популяции оценивали по содержанию клеток двух фаз почковани.» /Иванов,

Седина, 1985/.

При исследованиях возможности направленно?, активации зацит-ных реакций в клетках перед их обезвоживанием высушиванием дрожжи суспендировали и затем инкубировали з растьорах с раз ими концентрациями /0,¡¿5-1,0 ■!/ сахарозы и лактозы.

Для обнаружения возможных изменений митохоэдриальной ДНК оценивали наличие в популяции обезвоженных клеток организмов с мутациями дыхательной недостаточности. При этом использовали модифицированный метод Сгура /llallis, Whittaker, 1974/ или метод отпечатков на селективной этанол-содержащей ореде.

При цитологических исследованиях анабиотического состояния дрожжевых организмов использовали методы световой микроскопии в белом свете, фаэово-контрастной, аноптральнои и лшинесцент-ной микроскопии, а такне различные методы электронной микроскопии. Прижизненные микроскопические исследования клеток проводили как на неокрашенных препаратах, так ч после окрашивания клеток сильно разведенным раствором нейтрального красного. В проведенных экспериментах использовали "елый ряд флуорохромов -акридиновый оранжевый, аурофосфин, эфир антрагчловой кислоты, липидный флуорохром, приму лин.

При этом использовали фазово-контрастные и люминесцентные микроскопы, а также спектроцитофлуоршетр, собранный по стандартной схеме /Агроскин и др., 1964; Зелзнин, 1967/.

Оптико-структурный машинный анализ препаратов дрожжей проводили на системе "Протва" /Богданов и др., 1984/.

Спектроцитофлуориметричесхоэ исследование состояния нуклеиновых кислот проводили по методу Риглера /Rigler, 1966/.

В электронно-микроскопических исследованиях применяли метода ультратонких срезов, крисфрактографии, сканирующей электронной микроскопии, оттенания препаратов металлом. При использовании' метода ультратонхих срезов клетки фиксировали по Мюллеру /см* Кейсель в др., 1962/. При подготовке образцов дрожжевых клеток длг сканирующей электроннсЛ микроскопии использовался несколько модифицированный нами метод Хейдаанека Heytmanek, 1975; 50/. При использований в электронно-микроскопических исследованиях метода криофрактографиц дрожжи суспендировали в глицерине, замораживали в жидком фреоне а получали реплику со скола в приборе фирмыBaizers /Лихтенштейн/. При использовании метода от-

тенетая клеток металлом применяли окись вольфрама. Электронно-микроскопические исследования хроматина проводили на препаратах, приготовленных по методу Миллера / Miller et el., 1у70/.

Электронно-микроскопические п^зпарагы изучали в просвечивающих электронных микроскопах jaä-7A, JM-iOOB, JEM-I00C и JEM-I200EX фирьгы JEOL /Япония/, а также в сканирующем электронном микроскопе JSM-T200 фирмы JEOL /Япония/ и при использовании сканирующей приставки ASID-4D к микроскопу JEM-I00C.

Изменения состава пула свободных аминокислот изучали на аминокислотном анализаторе 6Q2QA /ЧССР/. Спектрофотоиетрически определяли содержание нуклеиновых кислот /Спирин, 1У58; Кулаев и др., 1973/ в различных фракциях фосфорных соединений /Кулаев -и др., 1у60/, а также об^ее содержание FHK / Waldron, Lao-route, 1975/. Изучение интенсивности синтеза РНК и белка при реактивации осуществляли с помощью Н^-уредина и С^-лейцина.

Определяли активности рибонукдеазы / bindblom, 1977/, кислой фосфатазы / Schurr, Tagil, 1971/, алкогольдегадрогеназы /Тарасова и др., 1972/, «¿-амилазы /Рухлядева, Полыгалина, 1981/, глюкоамилазы /Dahlquiefc, 1961/, инвертазы /Юркевич, Наумов, 1969/..

Содержание в образцах спирта определяли методой газовой хроматографии на хроматографе " Chrom -4" /ЧССР/. Для количественного и качественного определения многоатомных спиртов использовали метод бумажной хроиатографии /Хайс, Ыацек, 1962/. Количество трегалозы определяли антроновым методом / Trevelyen, Harrison, 1952/. Содержание электролитов в регидратационной среде определяли по изменению электрического сопротивления раствора, а содержание нуклеотидов - спектрофотоиетрически. При изучении содершшя ионов К* и Mg2+ использовали пламенный фотометр PF-5 / Carl Zeies, Jena, ГДР/ И атомно-адсорбционный спектрофотометр ААВ 403 / Perkin Elmer США/. Цитахрсмы выявляли по дифференциальным спектрам, регистрируемым на спектрофотометре о-260 /Shimedzu, Япония/. Интенсивность эндогенного и субстратного дыхания регистрировали амперометрически в кислородной ячейке /Шольц, Островский, 1975/.

Для характеристики степени стабильности клеточной стенки дрожжей проводили сравнение образования протопластов у интакт-

. ных и обезвоженных дрожжей при стандартной обработке клеток уА-меркаптоэтанолом и улиточным ферментом. При этом регистрировалось время,-необходимое для снижения исходной оптической плотности на 5Ш.

Для изучения изменений поверхностного заряда дрожжевых клеток использовали краситель альциановый синий. Определения активности системы транспорта проводили исходя из кинетики его поглощения клетками с помощью ион-селективного электрода модели 95-12 / Orion, США/.

Количество и релаксационные характеристики воды, оставшейся в дрожжевых клетках после высушивания, определяли с помощью метода ядерного магнитного резонанса /ШР-спиновое эхо/ /Фаррар, Беккер, 1973/ на модернизированном релаксометре ffiP-I /Аксенов и др., 1971/. Структурные перестройки цитоплазматической мембраны исследовали и с помощью метода ЭПР-спектроскопии при использовании спиновых зондов, встраивающихся в лнщцную область мембраны. Спектры ИПР зондов регистрировали на спектрометре Е-4 /Вариан, США/.

Результаты проводившихся в работе экспериментов обрабатывали при использовании дШ Hewlett Packard /ОНА/, модель' 98¿5A.

Определения жизнеспособности обезвоженных дрожжей

В исследованиях, посвяще1шнх проблеме анабиоза микроорганизмов, очень большое значение имеет правильное определение выживаемости культуры при обезвоживании.

В последние десятилетия в этих целях'широко используется ли-минесцентно-микроскопический метод с использованием фяуорохро-ма приыулина /Мейсель, 1951; Ыейсель и др., 1961/.

Однако, в святая с существенным возрастанием проницаемости цитоплаомагаческой мембраны при обезвоживании-регидратации клеток возникла необходимость проверки возможности применения этого метода з работах, посвященных дегидратации дрожжей. При этом проводилось сравнение результатов, получаемых при использовании разных методов - лшинесцентно-микроскопичеокого, стандартного метода рассевов и метода кратковременного подравнивания суспензии регидратированных микроорганизмов в камере Пешкова /Пешков, 1949/, сопровождавшемся непосредственным микроскопическим

контролем за образующимися микроколониями.

Получению в проведегчых исследованиях результаты показали пригодность приыуланового метода и его точность при работах, ' связанных с аигидробиозсм дрожжей. Быстрота же определения выживаемости этим способом по сравнению с большой трудоемкостью и длительностью ожидания результатов при методе рассевов свидетельствует о целе^ ¿образности использования лшинесцентно-мик-роскопического метода для определения жизнеспособности организмов при относительно медленном конвективном обезвоживании дрожжей /60/.

При исследованиях возможности определения выживаемости после более "жесткого" способа обезвоживания - лиофюшзацви была выявлена различная степень повреждения отдельны: клеток у чувствительных к этому воздействию штаммов.

В связи с этим для более полной характеристики степени жизнеспособности клеток после достаточно жестких экстремальных воздействий, на наш взгляд целесообразно ввести следующую классификацию состояния живых орган»-змов:

I/ кивая клетка, способная к нормальному размножению;

'¿! кивая клетка, способная к ограниченному размножению /образование небольших микроколоний/;

3/ живая клетка, не способная к дальнейшему размножению.

Полученные результаты указывают на то, что при определении ахжите-'ости микроорганизмов необходимо учитывать, что при .использовании разных методов могут быть выявлены клетки,, находящиеся в различных физиологических состояниях. Так, традиционно используемый метод рассова на твердую питательную среду дает лишь ответ о ноличесп 1 клеток, развивающихся и размножающихся . 5еэ каких-либо нарушений. Микросяогшрование подраниваемых микроколоний выявляет количество нормально развивающихся и размножающихся клеток, и клеток, размножающихся с нарушение ш. Применение ке примулинового метода дает общее количество живых меток. В евяаие&тш при изучении влияния на дрогши сильно повреждающих факторов определение выживаемости клеток с помощью примулинового метода следует дополнять прямым микроскопированием процесса развития реактивирующихся организмов с подсчетом числа образующихся при подращившг-и никрокогоний /60/.

Нами был проведен также и анализ возможности использован.л

1а -

для определения выживаемости дро?зкеЙ магиленового синего, который также достаточно широко применяется в связи с отсутствие.« во многих лабораториях люминесцентных микроскопов. При этом оказалось, что при относительно мягких воздействиях /к которым может быть отнесено конвективное обезвоживание, приводящее к сохранению большого колйчэства жизнеспособных клеток/ результаты, полученные при использовании пркмулинового метода и окраски ме~ тиленовым синим достаточно хорошо совпадают. Г то же время при таком воздействии как замораливание-оттаивание они несколько различаются. Анализ этих различий дал возможность сделать заключение о том, что с помощью метиленового синего нэ учитываются частично поврежденные клетки, которые могут быть реактивированы после определенного периода репарации повреидений. Следовательно при исследовании экстремальных воздействий на дрог-евые кдеткг совместное использование этих двух методов также монет оказаться полезным для более полной характеристики состояния популяции /74/.

УСТОЙЧИВХТЬ ДРОКНЕЙ К АНГИДРОВЙШ/

На протяжении многих лет в литературе делались попытки наделения различных групп микроорганизмов по их устойчивости к обезвоживанию. В то же время имеются сведения о том, что такие данные носят достаточно относительный характер, В первую очередь, это связано с тем, что по устойчивости к дегидратации могут существенно отличаться нэ только различие виды, но и резные штаммы одного и того же 'вида. Это было продемонстрировано и в настоящей работе при определении вгадиваемости четырех штаммов дротсей ЗассИагсипусея сегеГ1з1а<г поспз их лиофялиза-ции з одинаковых условиях. Ес.те выживаемость наиболее устойчивого из исследованных птаымов з. свгеу1еЗ.*е 14 после лнофилн-зеции составляла 605», то у наименее устойчивого штамма 8. о*-геу1в1ае БКИ 7-398 - Определение лаг-фазы лиофилиэиро-ванных клеток при их реакгчвации покяьало, что она удлиняется после воздействия, причем длительность о хорошо коррелирует с, устойчивостью данного штакка. Время генерации Тт_2 /промежуток между перскм и вторым почкованиями/ для лиофнлкзированных етзи-мов также удлиняется по сравнению с исходит культура:-!!«. Установлено, что в результате суточного вычеркивания лиофилизиго-

ванных клеток в стерильной водопроводной воде перед началом их подращивания происходит укорочение лаг-фазы клеток, что свидетельствует о возможности протекания в таких условиях процессов репарации определенных внутриклеточных повреждений.

При цитологических наблюдениях было выявлено, что после лио-филизации у наиболее чувствительных штаммов отмечается довольно значительное число клеток, форма которых изменяется /вытянутые клетки палочковидной фор.ш, удлиненно изогнутые и овально удлиненные клетки/. Среди наиболее устойчизых штампов морфологически измененные клетки встречаются редко. Оказалось также, что в большинстве случаев способными к дальнейшему нормальному развитию и размножению являлись лишь те клетки, форма которых внешне была не изменена или изменена очень незначительно.

Установлено, что наиболее устойчивые к лиофшшзации шташы дрожжей после их регидратации и реактивации нормально развиваются, почкуются и происходит нормальное отделение дочерних клеток от материнских. При наблюдении за размножением менее устойчивых к лиофилизации дрожжей после их высушивания и последующей реактивации были отмечены различного рода нарушения. Так, может не происходить отделения молодой образовавшейся клетки от материнской, может наблюдаться образование ыикроколоний, состоящих из 2-4 клеток, табель клеток после деления, потеря живши клетками способности к размножению. Для неспособных к размножению клеток обычно характерно наличие в цитоплазме одной или двух крупных жировых капель.

. Нередко среди дрожжевой биомассы, подвергающейся лиофильному высушиванию, попадаются клетки, находящиеся в состоянии почкования. Как показали исследования, дальнейшая судьба таких клеток при подращивании после регидратации и реактивации зависит от устойчивости данного штамма к воздействию факторов лиофили-аации /12/.

Обобщение имеющихся сведений позволяет сделать заключение об относительности данных, характеризующих устойчивость какой-либо Еонкретной культуры к обезвоживанию. В связи с этим целесообразно отмечать достигнутую максимальную устойчивость данной культуры в определенных экспериментальных условиях при обязательном соблюдении условия оптимальности всех остальных факторов,

способных оказывать влияние на стабильность мигроорганизмов при подобных роздейстЕиях. При этом всегда необходимо допускать возможность того,'что при дальнейших более подробных исследованиях устойчивость этого же организма к воздействию может быть повышена.

ПРИ2ИЗНЕННЫЕ ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ КССДВДОМШЯ СОСТОЯНИЯ СБЕЗБ0-ЖЕЮЖ И РШТШШШЩАСЯ ДРСа&ЕШХ КЛЕТОК

При исследованиях с использованием фазово-контрастнсй и люминесцентной микроскопии было обнаружено, что обезвоженные клетки заметно уменьшаются в размерах, но ядра и митохондрии в них не разрушаются. Сразу после обводнения таких препаратов удавалось отметить некоторое изменение форлы ядер, которые становятся "угловатыми" и удлиняются, что указывает на ослабление ригидности ядерной мембраны. Нарушаются и сорбцнонные свойства ядер.

В процессе реактивации обезвоженных дрожжевых клеток происходит их быстрое обводнение и постепенное восстановление нормальных характеристик ядер и вакуолярного аппарата. Было отмечено, что быстрее реактивируются и восстанавливаются клетки, имеющие овальную фО]му, и медленнее - удлиненные клетки.

Для выяснения состояния клетки в начале процесса реактивации проводилось окрашивание клеток сильно разведенным раствором нейтрального красного. При этом было отмечено, что в процессе обезвоживания так изменяются фюико-химические свойства цитоплазмы, что происходит сорбирование красителя из вакуолей. Диффузная окраска цитоплазмы, наблюдающаяся, и в начале процесса выхода дрожжей из состояния анабиоза указывает на то, что клетки в этот период находятся в состоянии паранекроза, концепция которого была разработана Д.Н.Насоновым и его школой /Насонов, 1959/.

При изучении процесса реактивации обезвоженных дрожжевых клеток были использованы липидный флуорохром из группы бензими-дазола, г. также эфир антраниловой кислоты. При использовании первого из них наблкщалась продолжительная задержка в его проникновении в клетку и связывании с жировыми включениями на начальных стадиях процесса реактивации. Однако, аналогичной задержки не выявлено при использовании эс£ира антраипловой ккслотн, сильно действующего и легко проникающего в клетки вещества. Сделано

заключение об обратимости физико-химических изменений дипиднщ- . компонентов цитоплазмы высушенных дрожжевых клеток. ,

Результаты, полученные при использовании другого флуорохрома - акридинового оранжевого, свидетельствуют о "лизоссмадьной • реакции" клеток. Она заключается в увеличении при дегидратации дрозасе» и при последующей реактивации /на ранних ее этапах/ ак- : ".'■ тивности и/или ко^лчестза фагодизосом в клетках, что может быть связано с необходимостью в этот период удаления из цитоплазмы и "переваривания" различных продуктов распада, образугарася в клетках.

В ходе процесса реактивации постепенно восстанавливались еорбционные свойства нуклеоплазмы и форма ядер. При исследованиях процесса восстановления митохондриальног^ аппарата с помощью флуорохрома аурофосфина было сделано заключение об обратн-у-ч и вследствие этого преходящем нарушении при сушке физико-химических свойств отдельных компонентов митохоццрай и в т.ч. нуклеиновых кислот /14/.

Таким образом, прижизненны« цитологические исследования процессов обезвоживания и регццратации дрожжевых клеток позволили установить, что в етих условиях не происходит разрушения внутриклеточных органелл, по крайней мере тех, которые могут быть выявлены на свегооптическсм уровне. Было сделано заключение о. несомненных изменениях ряда фзпико-химических характеристик ци-трплаз! л, митоховдрий и ядер, возникающих при дегидратацяи-ре-гвдратации дрожжей. Все эти данные, полученные в начале изучения ангидробиоза дрожжей, позволили наметить основные направления дальнейших детальных комплексных исследований этой проблемы.

ОСНОВНЫЕ СТРШУШ ДРСЕЖЕВСЙ КЛЕТКИ IIИХ КЗМЕРНИЯ ПРИ ПВ- ' РЭДДЕ ОРГШШОВ В СОСТОШЙЕ АНАБИОЗА й ПР.! ПССЛВДЩШ ВОССТАНОВЛЕНИИ АКТИВНОЙ ЖЙЗНЕДЕЙТЕЯШОС'Ш

Клеточная стенка •

Для количественной оценки изменений формы и размеров дрожжевых клеток гри обезвоживании и последующей регидратации был применен метод оптико-отруктурного машинного анализа /Богданов и др., 1984/. Результаты проведенных исследований показали, что обезвоживание дрожжей поводит к уменьшению размеров клеток и изменению их формы, которые носят достаточно сток^ий характер.

Эта данные свидетельствую? о достаточно серьезных изменениях клеточной стенки дрожжей, определяющей форму и размер клеток, й в частности об определенных перестройках, связанных со структурной организацией глюканового компонента клеточной стенки, оЧ~ ветственного за ее ригидность /72/.

При использовании.метода сканирующей электронной микроскопии таете было показано уменьшение размеров клеток и их "сплющиваний"» В то же время в некоторых случа х после обезвоживания клеток /при их росте в синтетической среде до стационарной фазы роста/ сильные изменения формы клеток обнаруживались сравнительно редко, хотя сами клетки при эт^м могли выглядеть сжавшимися, о чем моано было судить и по отдельным участкам контактов мегду клетками. Эти контакты возникают на первых этапах процесса обезвоживания. Однако затем клетки уменьшаются в размерах и контакты между отдельными клетками могут разрываться, и в этой области выявляется фибриллярный материал наружного слоя клеточной стенки, имеющий маннано-прстеидную природу /50/.

Ути же изменения были обнаружен*' и при оттенении юыток металлом. В этих экспериментах на поверхности рлегск, регвдрати-рованных после высушивания, было отмечено наличие разветвленных фибрилл, отсутствующих у интактных организмов. Размер этих фибрилл ьонот достигать 1,2 - 1,4 мил. Области клеточной стенки, в которых обнаруживаются такие разветвленные фибриллы, покрыты ши достаточно густо. Расстояние между фибриллами на поверхности клеточной стенш составляет около 0,08-0,12 мкы. Обнаруженные фибриллы радиально ориентированы /41/. Сделано заключение, что выявленные фибриллы имеют маннано-протевдкую природу. Их появление указывает на нарушение или повреждение упорццочзнной стружтуртой. организации поверхностных ааннано-протеиднах Слоев, клеточной стенка дрожжей в результате их обезвоживания., ■./

Одной кз характеристик поверхностных изменений клеточной стенкя дроиней является еэ поверхностный зарад. При изучений с .■•о возможных изменений ¿то исследовано связывание дрсетемя красителя альцяанового синего, в молекуле которого содерзится 4 ; положительно заряженные изотиуронкевые группы. Проведекнаэ эксперимента показали,.что обезвоживание дрожжей приводит к значительному увеличению связывания альцианового синего клетками. Однако, выживаемость обезвоженных организмов не коррелировала

со степенью связывания альцианового синего с клетками. Было установлено, что количество связываемого красителя достигает своего максимума в диапазоне остаточных влажностей 20-3(К, и не изменяется при последующем снижении этой величины до &А, соответствующей состоянию анабиоза. Сделано заключение о значительном возрастании отрицательного заряда поверхности дрожжевых клеток при их обезвоживании /64/. Представляет интерес и то, что этот параметр клеточной стенки становится неизменным в том диапазоне остаточных влажностей, в котором по данным дифференциальной микрокалориметрии, клетки теряют свободную воду и начинается удаление части связанной воды /49/. Следует полагать, что основной причиной изменения отрицательного заряда клеточной стенки дроаней при их обезвоживании является возрастание числа свободных анионных групп маннано-протеидного компонента клеточной стенки /и главным образом, карбоксильных и фосфатных групп/, о которыми, как било показано / Stewart et ai., 1976/, связываются положительно заряженные участки альцианового синего. Таким образом, наличие свободной воды оказывает, очевидно, определенный стабилизиру1аций эффект на структуру поверхностных компонентов клеточной стенки /64/.

При исследованиях изменений клеточной стенки в процессе реактивации методом сканирующей электронной микроскопии были обнаружены некоторые изменения поверхности - складчатость или ее неоднородность. На поверхности некоторых клеток были выявлены углубления, а в ряде случаев - небольшие выпячивания,'образования в вида пузырьков, капель, частиц различных размеров и формы и их скоплений. Последние связаны с выделением из обезвоженных клеток при их регидратации различных внутриклеточных веществ /50/.

Таким образом, проведенные исследования выявили изменения формы и поверхности клеток Дрожжей в результате их обезвоживания, Сделан вывод-об определенных изменениях в структурной организации глюканового элемента клеточной стенки, поскольку с ним связана ригидность клеточной стенки и форма самой клетки. В то же время нельзя недооценивать и обусловленность формы клеток физиологическим их состоянием и свойствами клеточной поверхности пря обезвоживании. В частности, при сопоставлении данных просвечивающей и сканирующей электронной микроскопии било сделано

заключение, что факторами, определяющими сохранение или изменение формы клетки /например, ее сплющивание/, являются степень стабильности вакуолярной системы и/или толцина клеточной стенки. Естественно, что после,цний параметр связан с молекулярной организацией клеточной стенки.

Был исследован вопрос о том, влияет ли изменение структуры клеточной стенки при дегидратации дрожжей на ее способность к "удержанию" ферментов. При этом оказалось, что в изученных условиях только очень небольшое в процентном отношении количество инвертазы, связанной с клеточной стенкой - всего около 1,55», /что составляет примерно 4,5% инвертазы, локализованной в иан-нанО-протеидном слое/, выделялось при регидратации в сроду.. На этом основании сделан вывод о том, что изменения, возникающие в процессе обезвоживания в ыаннано-протеидном компоненте клеточной стенки и приводящие к выделению из него в среду части инвертазы, носят достаточно ограниченный характер.

Было изучено образование протопластов у интактных и обезвоженных дрожжей. Укспершенты показали, что в случае дегидратированных клеток процесс образования протопластов заметно облегчался и ускорялся /в 2-3 раза для клеток, взятых соответственно из стационарной и логарифмической фаз роста культуры/. Зто позволило предположить, что дегидратация оказывает на маннано-протеидный компонент клеточной стенки действие, аналогичное эффекту тиолошх реагентов, разрушая или восстанавливая днсуль-фидныо-связи. Скорее всего это и приводит к появлению на поверхности клеток дрожжей после обез воживания-регидратации ман-нано-протеидных фибрилл.

Цитоплазматическая мембрана

При изучении состояния цитоплаэматической мембраны было установлено, что в результате процесса обезвоживания дрожжей очень сильно увеличивается ее складчатость, что объясняется • сжатием клеток при дегидратации. Данные ой этом были получены как при использовании метода ультратонких срезов, так и метода криофрактографии /6,8,17,23/. Сделано заключение об определенной защитной роли эффекта складчатости цитоплазматичеекой мембраны, обеспечивающей в экстремальных для клетки условиях дегидратации сохранение целостности этой структуры путем усиле-

ния ее складчатости, а при последующем обводнении - за счет • расправления возникших инвагинаций.

В части гслаток в результате обезвоживания на некоторое участках цитоплазматической мембраны могут быть выявлены определенные нарушения ее целостности. Представляется несомненным, что подобные изменения ее структуры находятся уже на грани обратимости и необратим ,сти. Так, при цитологических исследованиях популяций дрожжевых клеток» погибших в процессе обезвоживания в значительном числе, если не в подавляющем большинстве клеток, удалось выявить множественные достаточно обширные по размерам разрывы цитоплазматической мембраны. Это свидетельствует и о возможности существования определенной корреляции между целостностью мембраны в обезвоженных или регидратируем^х после сук-и организмах и их жизнеспособностью.

Структурные перестройки цитоплазматической мембраны сопровождаются и изменениями ее функциональных характеристик. Так, при регидратации обезвоженных дрожжей сильно возрастает ее проницаемость и в среду выделяюа .л различные внутриклеточные соединения - ионы, аминокислоты, нукдеотиды, углеводы, липады, пептиды. В частности, нами было показано значительное повышение проницаемости мембраны обезвоженных организмов для свободных аминокислот. Результаты, свидетельствующие о значительном увеличении пула с_юбодных аминокислот клетки во время реактивации дрожжеР указывают и на то, что изменение проницаемости мембраны не является однонаправленным /из клетки в среду/,' а имеет место и противоположный процесс - поступление веществ в клетку из питательной средн. ЧepeJ 1,5 часа реактивации дрожжей было отмечено восстановление в значительной мера свойств проницаемости цитоплазматической мембраны /3, 46/.

Исследования изменения проницаемости цитоплазматической мембраны для некоторых внутриклеточных ионов показали, что при регидратации обезвоженных клеток из них может выделяться до внутриклеточного содержания ионов калия и до 72% содержания ионов магния /37/. В этих же условиях за счет утечки из клеток электролитов отмечено сильное снижение электрического сопротивления регвдратационной среды.

Было также обнаружено значительное возрастание проницаемости цитоплазматической мембраны для нуклеотидов к прог ,/ков распада

нуклеиновых кислот.

Б экспериментах, проведенных в нашей лаборатории было установлено, что выделение различных внутриклеточных соединений При регидратации клеток, находившихся в состоянии анабиоза, в природных условиях мотет оказывать положительное влияние на другие организмы и в частности'растения, такие подвергавшиеся воздействии неблагоприятных условий внешней среды ЛОшнцаре,. Марауска, 1978/. Представляется вполне естественным и т , что выделяющиеся из погибших при обезвоживания микроорганизмов различные внутриклеточные соединения могут оказывать благоприятный эффект и на другие клетки той же по^ляции, сохранившие в данных условиях жизнеспособность, снабжая их необходимыми питательнши веществами.

С цитоплазматической мембраной связана активность ряда тран-порт:шх систем. Проведенные эксперименты показали, что в первые 10 минут регидратации обезвоженных дрожжей в воде происходит активация системы транспорта ионов нН4+ . Подобное явление скорее всего может объясняться перестройками, возникающими в молекулярной организации мембраны. . , , .

Результаты, полученные при использовании метода ЭПР-спектро-скошш, свидетельствуют о том, что по мере удаления из клеток воды как в глубине мембраны, так и вблизи ее поверхности движение эоцдов становится более заторможенным и анизотропным. Сделан вывод, о том, что при удалении влаги уменьшается подвижность и изменяется степень ориентированности углеводородных цепей мембранных липидов /78/. V ■

Таким образом, результаты проведенных нами физиологических, цитологических и биофизических исследований указывают на то, что обезвоживание дрожжевых клеток, в результате которого большая или меньшая часть популяции микроорганизмов переходит в состояние анабиоза, может приводить к достаточно существенным структурно-функциональным перестройкам цитоплазматической мембрана, . связанным о изменениями ее молекулярной, организации.

Вакуолярная система

При изучении влияния обезвоживания на вакуолярную систему дрожжей была выявлена ее дифференциальная реакция. Особенно чувствительными оказались крупные вакуоли. Были шявлены такие эф-

факт, как сокращение, разрушение и фрагментация некоторых из них. В результате этого в клетках при обезвоживании заметно возрастало количество мелких вакуолей и везикул. . .

Изначально присутствовавшие более мелкие вакуоли и вакуоли, наполненные гранулярным или электронно-плотным материалом и выполняющие функцию лизосом, оказались значительно более стабильными в условиях дегидратации /42/,

С различиями в степени стабильности вакуолей при обезвоживании дрожжевых клеток могут быть связаны и неодинаковые изменения формы клеток, находящихся в состоянии анабиоза. Сильное уменьшение их в размерах или разрушение /в сочетании с изменениями в структурной организации глюканового компонента клеточной стенки/, очевидно, и приводит к "впячивали»" отдельных участков поверхности клетки /50/.

Во время реактивации жизнеспособных клеток постепенно происходит восстановление структурной организации вакуолярного аппарата.

Следует отметить, что в сублетально поврежденных при сушке клетках выявляется "лиз остальная реакция" - увеличение количества лизосом и фагосом. Были проведены исследования изменений активности кислой фосфатазы, являющейся маркерным ферментом лизосом в эукариотических клетках, локализованной у дрожжей как в клеточной стенке, так и Енутри клетки в различных вакуолях и везикулах, структурно аналогичных дрожжешм лизосомда /Günther et el., 1966; Bauer, Sigerlakie, 1973; Reies, 1973; van Eidn et al., 1975 и др./.

Результаты экспериментов показали, что в процессе обезвоживания внутриклеточная активность кислой фосфатазы возрастает более чем в 2 раза. При I¿5-часовой реактивации анабиотических клеток происходит дальнейшее увеличение внутриклеточной активности фермента, Полученные результаты следует рассматривать как свидетельство увеличения числа- лизосом /или их активности/ в дрожжах в процессе их обезвоживания и на первых этапах выхода клеток из анабиотического состояния /22/.

Усиление этих процессов может быть объяснено необходимостью отграничения и удаления из функционирующей цитоплазмы распадающихся при дегидратации и на первых этапах реактивация структур и макромолекул.

Однако, учитывая полученные в работе данные о повреждениях мембран при дегидратации, можно допустить, что значительная активность лизосом монет являться и одной из причин гибели части клеток при обезвоживании и реактивации. Это может быть связано с пов реждениями структурной целостности или ссильнкм пот-тетин проницаемости лизосомалышх мембран, в результате чего выход в цитоплазму гидролитических (ферментов лизосом может оказаться причиной "самопереваривания" клетки.

Было исследовано влияние процесса обезвоживания на изменение свойств проницаемости вакуолярных мембран для ионов калия и магнии, которые локализованы'в дрожжевых клетках в вакуолях /Окороков и др., 1978; Окогокоу ей а1., 1975, 1980/. В наших экспериментах показано, что из обезвоженных клеток при регвдратации может выделяться до 88$ ионов калияи72?5 ионов магния. При этом оказалось, что в количественном отношении "утечка" ионов из клеток не коррели-рует с жизнеспособностью обезвоженных организмов. Установлено, что на первых этапах процесса сушки дрожжей происходит постепенное возрастание вццеления ионов из клеток. Однако, рте при реги-дратации дрожжей, обезвоженных до остаточных влажностей порядка 206, из клеток выделялось практически максимальное для данного эксперимента количество ионов /рис. I/. Как уже отмечалось, этот

уровень остаточной апажности соответствует такому состоянию клеток, когда из них уда ляется вся свободная вода и начинается удаление связанной водн. Таким образом, уже в начале процесса удаления яр клеток связанной воды происходят существенные изменении проницаемости как цигоплрз-матическоН, так и вагусляр-ной мембран для ионов, даже несмотря на эометнне различия в физиио-х^'пчесЕих характеристиках етихкембрэн /37/.

Рис.1. Выделение ионов калия и иагнкя при регидратацш дрожжевых клеток в зависимости от остаточной влажности обезвоженных организмов /мкг/мг веса сухой биомассы/.

1 - выделение ионов калия,

2 - выделение ионов нагнил.

Важным представляется выяснение возможных изменений проницаемости вакуолярных мембран и для других более крупных соединений. В атом отношении интерес представляют данные по изучению выделения из клеток при регидратации двух свободных аминокислот - лизина и аргинина, локализованных преимущественно в вакуолях. Полученные результаты свидетельствуют о том, что из клеток выделяется лишь .лзина и I® аргинина /46/. ато показывает, что проницаемость вакуолярной мембраны для этих соединений возрастает в значительно меньшей степени. Таким образш, вакуоляр-ные мембраны в условиях дегццратации клеток более стабильны чем цитоплазматические.

Таким образш, исследования вакуолярной системы позволили сделать следунцие выводы:

I/ реакция вакуолей на процесс обезвоживания неодинакова и зависит от их (функционального состояния;

2/ состояние вакуолярной системы является одним из факторов, от которых зависит сохранение формы клеток в процессе дегидратации;

3/ в результате обезвоживания дрожжей возможна активация в клетках лизосом;

4/ происходит заметное возрастание проницаемости вакуолярных мембран для ионов при сушке дрожжей и значительно в меньшей степени - для аминокислот.

Митохондрии

При электронно-микроскопических исследованиях было установлено, что при обезвоживании дрожжевых клеток практически не происходит изменений структуры и формы митохондрий. Не обнаруживается какого-либо разрушения мембранных элементов, повреждения • крист или изменения состояния матрикса митохондрий. В то же время процесс дегидратации приводит к лучшей "визуализации" нук-леоида митохондрий, содержащего митохоедриальную ДНК. По-види-мшу, визуализация нуклеоида улучшается благодаря компактизации митохондриальной ДНК - процессу, имеющему несомненно защитный характер. Она, по-видимому, объясняет отмеченное выше явление снижения сродства митохондрий к красителям акридинового ряда.

Установлено, что в процессе реактивацли раньше других орга-нелл клетки происходит ьосстановление функциональ"ой активности1"

митохондрий. При этом митоходдрии неоднократно размножаются путем деления. Такое раннее восстановление функциональной актив-* ности этих органелл несомненно обусловлено достаточно полной сохранностью их структуры. А весьма значительное увеличение их числа в клетке указывает на интенсификацию протекающих в клетках процессов реактивации, требующих усиления энергетического обмена. -

При реактивации дрожжей митохиццрии очень «чсто располагаются вблизи поврежденных мембранных элементов и в т.ч. около "раскрытых" ядерных пор, что свидетельствует об активном участии этих органелл в репарации во^.шкших при дегидратации-регидрата-ции повреждений мембран.

Было исследовано влияние процесса сушки дрожжей на возможные изменения свойств митохондриальной ДНК. При этом было предпринято выявление возможного возникновения в этих условиях мутаций в митохондриальной ДНК и в частности мутаций, обусловливающих дыхательную недостаточность, сравнительно легко возникающую у дрожжей /Гаузе, 1977; Захаров и др., 1985 и др./. Однако, увеличения частоты возникновения мутаций дыхательнс! недостаточности з. сегеу1в1ав в результате дегидратации в наших экспериментах обнаружить не удалось. В то же Еремя при изучении влияния процесса обезвоживания на мутантные штаммы п. сегеу1я1ае, обладающие дыхательной недостаточностью, было показано, что наличие в митохондриальном геноме мутации не приводит к гибели клеТок в процессе сушки. Сопоставление этих данных позволило сделать заключение о том, что в условиях дегидратации дротяей не происходит возникновения мутаций, обусловливающих дыхательную недостаточность в. митохондриальной ДНК.

В то жо время в работа;:, проведенных в напей лаборатории, было отмечено некоторое варьирование в ходь процессов обезвоживания и последующей регидратации активностей рада митохсндриаль-пых меыбранно-связакних ферментов, одной из причин которого могу'. являться перестройки ь молекулярной организации мнтохон-дриальных мембран /Краллиш, 1937/. В сзлзи с чтим, нами было предпринято исследование степени таких мембранных изменений, результаты которого приве~енк веке.

Белок - синтезирующая система

Киеточное

Электронно-микроскопические исследования обезволенных клеток показали, что на ультратонких срезах всех изученных культур дрожжей ысшю обнаружить весьма значительное расширение отдельных пор б ядерной оболочке. При этом вблизи таких "открытых" участков ядра обычно локализуются митохондрии или липидные гранулы. Однако, при использовании метода криофрактографии подобного расширения ядерных пор выявлено не было /6,7,23/. Сопоставление этих данных позволило сделать заключение о снижении ригидности ядерной оболочки в ходе процесса обезвоживания дрожжей, и результате которого уже при частичном обводнении дегидратированных клеток происходит значительное раскрытие ядерной оболочки.

В репарации повреждений ядерной оболочки в процессе реактивации клеток участвуют липидные гранулы. Через некоторое время наряду с восстановлением нормальной /по морфологическому критерию/ структуры мембран, в ядрах могут быть выявлены "остаточные тела" сферосом, определенная часть липидного материала которых была использована в процессе репарации мембранных повреждений /67/. Необходимостью энергетического обеспечения процесса репарации повреждений в молекулярной организации ядерных мембран объясняется локализация в этих областях митохондрий.

В проведенных исследованиях было обнаружено и еще одно важнейшее, с нашей точки'зрения, явление /6,7/. При относительно медленном обезвоживании клеток дрожжей в их ядрах происходит конденсация хроматина. При сравнении влияния различных способов сушки на ультраструктуру клеточных ядер выявлено, что при медленном обезвоживании дрожжей конденсация хроматина происходит в абсолютном большинстве клеток. В то же время при возрастании скорости сушки заметно увеличивается количество клеток, в ядрах которых не обнаруживается ковденоированного хроматина. При этом в условиях продолжительной и постепенной дегидратации сохранялась и более высокая жизнеспособность обезвоженных клеток. Различная степень конденсации хроматина, хорошо коррелирующая с выживаемостью культуры, была выявлена и при обезвоживании разных по устойчивости к дегидратации штаммов дрожжей.

Сделан вывод о том, что изменения в структуре ядра, связанные с конденсацией хроматина, являются естественной приспособительной реакцией организма к неблагоприятным условиям. Более того, мы считаем, что ее осуществление в клетках является одним из основных факторов, обеспечивающих сохранение жизнеспособности клеток d различных экстремальных условиях. Наы удалось выявить аналогичную реакцию на первых этапах действия на дрожки Oendida vtni препарата иода /70/, и при обработке клеток в.ов-revieiae толуолом.

Было выполнено исследование чувствительности дрожжевых клеток к обезвоживанию в зависимости от стадий клеточного цикла. Результаты показали, что наиболее устойчивыми к процессам дегидратации являются клетки, находящиеся ва^- и о2- стадиях клеточного цикла /74/.

Данные о том, что одним из факторов, ответственных за гибель клеток при обезвоживании, является чувствительность ДНК к дегидратации и ее необратимые повреждения в подобных условиях, были получены и при исследовании устойчивости при сушке серии штаммов S. cerevisiae /от гаплоидов до тетраплоидов/ /13/.

Структурная организах^ия хроматина

При электронно-микроскопических исследованиях /проведены сошестно с А.С.Тихоненко с соавт./ было установлено, что структура хроматина дрожжей, взятье; на логарифмической фазе роста культуры, ¡.стерогенна. В этих препаратах выявляются как фибриллы хроматина с регулярной нуклеосомной организацией, так и нити с различными расстояниями между соседними нуклеосомаыи, В некоторых случаях были выявлены гладкие нити хроматина, почти полностью лишенные нуклеосом или же с их очень редкой "посадкой" -участки транскрипционной активности. В клетках, взятых во время стационарной фазы роста наблюдается более упорядоченная структура хроматина. В большинстве случаев он представлен регулярный! нуклеосомными и иаднуклеосомными нитями. Иногда выявляются хроматиновые глыбки как по периферии ядерного содержимого, тпн и в центре ядра. Все это указывает на то, что снижение активности ростовых процессов отражается и на структурной организации хроматина.

Установлено, что после дегидратации дрожжей, взятых из логарифмической фазы роста культуры, хроматин предстаачон строго

упорядоченными нуклеосомными нитями. При этом при стандартной подготовке образцов ядерное содеркимое диспергируется на пленке в незначительном количестве, что может свидетельствовать о плотной упаковке хроматг а в ядре. При исследованиях, проведенных с клетками, взятыми для сушки из стационарной фазы роста ку,:ьтуры, выявлялись в основном плотные фибриллы хроматина наднуклеосомной организации, выходящие из ядра в небольшое количестве. Толща ядра заполнена плотными глыбками хроматина.

Так™ образом, проведенные исследования свидетельствуют о том, что процесс дегидратации дрожжевых организмов приводит к стабилизации структуры хроматина. При этом отмечена и тенденция к возникновению транскрипционно неактивных структур с наднуклеосомной организащ й хроматина.

¡¿гклещовыр кислоты и £стойодвость^щоете1ш_клеток к обезвоживанию

При биохимических исследованиях была выявлена неодинаковая устойчивость при обезвоживании различных фор! нуклеиновых кислот клетки. Нуклеиновые кислоты, попадающие в щелочерастворимую фракцию, условно названную нами "лабильной фракцией", оказываются менее устойчивыми при дегидратации. На это указывает и , появление значительного количества нуклеотидов в кислотораство-I римой фракции. В то же время содержание нуклеиновых кислот в горячем хлорнокислом экстракте, также условно названном "стабильной фракцией", в процессе дегидратации клеток практически не изменяется, что свидетельствует об отсутствии их деградации в условиях обезрткивания. Поскольку полученные результаты характерны для клеток, сохраняющих жизнеспособность, то следует пола; гать, что в ату "стабильную" фракцию должна попадать вся ДНК и, по крайней перо, определенное количество РЖ /31/.

С целью выясг.мгля возможных к информационных изменений нук-лвпновш: кислот было проведено цитоспектро^луориметрическое исследование клеток после их окраски акридиновым оранжевым. Ре- ' зультаты проведенных измерений интенсивности красной и зеленой люминесценции клеток могут свидетельствовать об изменениях ри-бг-туклеэпротеидних комплексов и в частности - о денатурации рибосом.

Выдвинуто предположение о той, что устойчивость микрорганиз-

нов к дегидратации может быть связана со степенью стабил ьности их нуклеиновых кислот. Для проверни этой гипотезы были взяты •. штамма дрожжей ЗассЬагопусоаее 1и<1и1Е11, резко различающиеся по устойчивости к обезвоживанию. Показано, -.то с увеличением в клетках количества "лабильных" нуклеиновых кислот и соответственно уменьшением содержания "стабильных" нуклеиновых кислот происходит снижение устойчивости дрожжей к дегидратации. Сделан вывод о тем, что свойства нуклеиновых кислот дрожжевых организмов являются одним из факторов, определяющих чувствительность клеток к обезвоживанию. На этом основании предложен новый дополнительный критерий устойчивости дрожжей к дегедратрц-ш по соотношению "лабильных" и "стабильных" нуклеиновых кислот в клетках /31/.

Изменения рибонуклеиновых кисл от_п]эи об ез в оживании дрояяевых клеток_

В проведенных исследованиях было установлено, что при обезвоживании дрожжей в них происходит разрушение 26-43% внутриклеточных РНК. Выживаемость обезвоженных организмов при этом не оа-висит от степени разрушения РНК.

Основное снижение содержания РНК в клетках пр*исходит напер-

; в 1 ■ | 1

' 1 80 Г

;]• \ / \ I \ /

1 20 /\ 7 ^ / ----- '.,. 1,1 1 1 -

Сделан вывод о том, что в изученных условиях разрушается в основном часть, рибосомных РНК /71/.

При изучении активности ри~ бонуклеазы выявлено, что в результате обезвоживания дрожжей происходит незначительное снижение, либо незначительное увеличение активности этого фер-мент^.. При этом б^о установлено, что на первом этапе сушки наблюдается увеличение активности рибонуклеазы по сравнению с интактнши клеткам,.. Затем эта активность начинает снижаться иде .тигйет своего окончательного уровня. Сделано заключетэ о ферментативном характере разрушения ШК вначале процсзса дегидратацк дрожжевых орга-

Рис.2. Разрушение шбонук-Ж.ЛОЕЫХ кислот /17 и сни-жени- остаточной влажности клеток /2/ в процессе сутки дрожжей

иизмов.

Исследована скорость синтезов РНК и белка в процессе реактивации дроэдёй. Оказалось, что уке в перше 5_ и 15 минут реактивации происходит весьма залетное включение Н,;!-урццина и С^-лейцина в клетки, т.е. с самого начала процессов реактивации в клетках параллельно с синтезом РНК происходит синтез белка. Ыто свидетельствует о том, что в анабиотических клетках сохрашется в неповре-тденном состоянии достаточное количество всех ведов РНК для инициации белкового синтеза.

ПЕРЕСТРОЙКИ В ИШКДОПКЙ ОРГАНИЗАЦИИ ВНУТИЖЛЕТОТШХ ИИ,ЖРАН ПРИ ШЕЗВСЖШМШ-РЕГИДРАТАЦИЙ ДРШЕЕ

Исходя из современных представлена"' о структуре мембран и ее зависимости от наличия вода, в нашей лаборатории было высказано предположение о том, что при обезвоживании дрожжей на отдельных участках их внутриклеточных мембран макет осуществляться переход липидов из ламеллярной фазы в гексагональную фазу П /Бекер, 1977; 18/. Вследствие такой перестройки можно скидать резкого снижения гидрофобных взашодействий, в результате чего отдельные интегральные белки могут быть "вытолкнуты" из мембраны, или же они переместятся з ней в несвойственные для них участки, возможно, теряя при этом свою активность и разрушая /или нарушая/ другие ферментные комплексы. Все это должно обусловливать как изменения их ферментативной активности, так и резкое возрастание проницаемости мембраны. При этом восстановление свойств проницаемости будет происходить только при обратном переходе - "гексагональная фаза П—ламедлярная фаза".

Возможность возникновения подобных перестроек была оценена в настоящей работе о помощью косвенных методов, учитывающих следствия, вытекающее из предложенной модели. Первый подход бкл связан о тем, что проницаемость цитоплазкатичесьой мембраны должна сильно зависеть от влажности клеток, резко возрастая в определенный момент сушки в случае возникновения перехода "ламе лкярная фаза-— гексагональная фаз а П" и в значительной мере сягааясь при восстановлении в клетке, в процессе постепенной медленной регкдраташш того количества водк, которое необходимо, По крайне!» мэре, доя восстоноелсшш ламеллярной фазы ллпидов.

1,'чг оказалось, первнй этап сушки приводит к незначительному

постепенному возрастанию свойств проницаемости цитоплазматичес-кой мембраны, проявляющемуся при последующем обводнении. Однако, вдиапазоне остаточных влажностой, порядка 20-3 <УА, происходит резкое возрастание ее проницаемости, достигающее затем максимальных для данного эксперимента величин /рис. 3/. В связи о

этим сделано заключение, что. существенные нарушения барьера проницаемости возникают в процессе удаления части связанной вода, наступающего посла потери клетками всей свободной воды. Была изучена и возможность репарации перестроек в мембранах, определяющих их барьерные свойства. Для этого регидрата-ции подвергались уже частично увлажненные /в парах воды/ клетки. Как оказалось, "высокая" проницаемость цитоплазматической мембраны дрожжей обнаруживается лишь до достижения увлажнявшимися в парах воды клетками остаточной влажности порядка 20-25°4. При увлажнении клеток выше таких величин, наблюдалось резкое снижение проницаемости цито-плазматической мембраны.

Таким образом, обнаруженное вданной работе резкое возрастание проницаемости цитоплазматической мембраны, возникающее в ходе удаления из клеток определенной паоти связанной воды, является репари-руемым изменением мембраны и при постепенном обводнении клеток в ходе процессов реактивации до нормального уровня содержания связанной воды для данных организмов оно устраняется /69/. Обратимость такого рода изменений проницаемости и структуры мембран хорошо согласуется о гипотетической модель» перестроек мембраны.

Второе следствие возможных перестроек мембран при обезвоживании, которое нами было изучено, связано с воямсет-шм изменением количества внутркмембранных чаоткц /ШЧ/ на поверхностях мембран. Иселедованиэ состояния вануоллрных мембран, проведенное

в»>

Рио.З. Зависимость проницаемости цитоплазматической мембраны от остаточной влажности дрожжевых клеток /постепенная сушка/.

1 - электропроводность

регидратационной среды,

2 - общие потери сухих

веществ,

3 - потери нуклеотидов.

методом криофрактографии, выявило, что в результате процесса обезвоживания происходит снижение плотности ШЧ, по крайней мере, на РР-поверхностях вакуолярных мембран. В то же время имеет место перераспределение ЕМЧ и, по-видимому, снижение их плотности /с учетом уменьшения общего размера вакуолей и, соответственно, поверхностей их мембрчн/ на ЕР-поверхности. Таким образом, и э~и результаты также сввдетельртвуют в пользу представлений о возможных перестройках в молекулярной организации мембран при обезвоживании клеток, при которых может происходить "выброс" НИ из мембран.

Изучено также состояние митоховдриальных мембран в обезвоженных дрожжевых клетках. При этом не удалось выявить ни возможных потерь внутренней митохондриальной мембраной при реги-дратации цитохр^мов, ни пространственного разобщения отдельных элементов дыхательной цепи, о которой судили по дыхательной активности регидратированных после обезвоживания дражяевых клеток. В связи с этим есть все основания считать, что внутренняя митохондриальная мембрана не претерпевает при обезвоживании тех локальных изменения в структуре, которые^ как уже отмечено, были обнаружены для столь различных по своему химическому составу и свойствам мембран как цитоплазматическая и вакуодярная. ■ Одной из возможных причин' стабильности внутренней митохондриальной мембраны может являться предполагающаяся локализация в ней изолированной подвижной воды /Аксенов и др., 1973, 1975, 1978, 1987/.

ишюйшм следствием из полученных результатов, на наш в£ 'ляд, дольна быть разработка способов максимального предотвращений или значительного снижения степени перестроек в мо-

1 лекудлиной организации внутриклеточных мембран.

1 ^ АЮТСВАЦИЯ К^РИКДЕТСЧШХ ПРОЦЕССОВ В РЕЗУЛЬТАТЕ СБЕЗВОШ- . ВШЯ ДРОЯКЕй ' .! ' . -

"• '3 связи с необходимостью детальных исследований дрожжей, использующих ярахмалоодеркащив субстрат11, бчло осуществлено . сравнительное изучение дрожжей Вп<1ойусор81в Г1ЫЛ1ввга и Иъовуоев копоавпкоав. Эксперименты показали, что в зависимости от условий культивирования как Ь. копопепкоае так И Г1ьи11ввга могут давать высокие выходы биомассы и обеспе-

чивать накопление в. среде высоких активностей аыилолитических ферментов. При изучении способности этих дрожжей я ангидр^оиозу оказалось, что если Е. Г1Ьи113ега сохраняли жизнеспособность после обезвоживания, то клетки ъ» Ьипопвпкоае погибали при всех использованных режимах дегидратации /34, 38/,

Проведены цитологические исследования интактнык и обезвоженных дрожжей е, гшплвега. При этом как в мицелии, так и в клетках были выявлены все основные органеллы, характэрные для дрожжей. Причем пероксисомы были обнаружены не только при росте дрожжей в крахмалсодержащих питательных средах, но и при использовании в качество источника углерода з^алола. Охарактеризована ультраструктурная организация этих дрожжей при их росте в различных питательных средах. Установлено, что изменение в тонком строении обезвоженных клеток и сегментов мицелия е. г1ьи11еега является полностью аналогичным изменениям в ультраструктурной организации дегидратированных клеток других видов дрожжей. В , клетках этих организмов также шявлены инвагинации цитоплазма-тической мембраны, коеденсация хроматина з здрах, расширение отдельных пор ядерной оболочки и локализация в этих районах митохондрий, структура которых практически не изменяется, и липид-ных гранул.

В связи с тем, что определения жизнеспособности мицелиальной формы этих дрожжей люминесцентно-микроскопическгал методом сопряжены о определенными трудностями, был использован фунпциональ-10-физиологический подход. При этом интактные или обезвшсенные дрожжи использовались в ка'.зствэ посевного материала как для аэробного, так и анаэробного культивирования микроорганизмов. Проведенные эксперименты показали, что обезвоженные дротаи, находящиеся как в одноклеточной, так и в мицелка-ьной фор/е обеспечивали не меньшее, а даже несколько большее накопление биомассы по сравнению с вариантами, в которых использовались интактные организмы, В этих же условиях при использовании обезвоженных дрожжей з качестве инокулуыа были получены и более высокие активности амнлолитических ферментов /глюкоамилази и оС-амилазы/ в среде. При определен™ интенсивности сбраживания дрожпзаи глюкозы было установлено, что к~к обезвоженные клетки, так и обезвоягшиЯ мицэлий ж. ПЪиИдвга образуют спирт о бола о

шсокой скоростью и в большем количестве, чем соответствующие варианта интактных клеток и мицелия /рис. 4/.

Таким образом в проведенных исследованиях установлено, что обезвоживание е. ,?1Ьи11§ега приводит к своего рода их физиологической "активации", проявляющейся в большем накоплении биомассы и большем вццелении в среду амилоли-тических ферментов при их последующем культивировании в аэробных условиях и более шсокой интен- \ сивности сбраживания глюкозы до спирта в анаэробных условиях /68/.

С целью выяснения механизмов подобного явления "активации" бы- • ли исследованы изменения активности одного из ключевых ферментов, связанных с процессами брожения, - алкогольдегвдрогеназы. Оказалось, что обезвоживание дрожжей приводит к.падению активности фермента. Однако, при внесении обезвоженных дроотей /клеток/ в качестве инокулуыа в среду,. содержащую глюкозу, активность алкогольдегвдрогеназы начинает возрастать, и причем быстрее, чем в соответствующем варианте с использованием интактных дрожжей. Установлено, что в данных, условиях происходит'синтез фер.!ента' как в случае интактных, так и обезвоженных дрсжжей

/61/. ' -.''.Л/Анализ причин явления."активации" даёт возможность сделать заключение, что оно. связано о более интенсивным ростом реактивированных цосла анабиоза организмов /по сравнению о дрожжами, не подвергавшимися воздействию/. Подобный феномен может, определяться ввдвлением в среду из .погибших клеток определенных внутриклеточных соединений, оказывающих стимулирующее воздействие ня рост аультуры, сохранившей жизнеспособность, Наряду о этим, на основе анализа результатов работы высказывается и гипотеза о том, что мембранные перестройки при переходе дрожжевых кле-

2 3 15

ПгоОмхигымош» и^уооицы V"—"и; Ь (ТХЙС. СВОсрхлимО ПМ*«^, фЫси

Рис. 4. Образование спирта дрожжами Е. ПЪиНеега к-574 при инкубации в среде, содержащей глюкозу.

1 - интактный мицелий, .

2 - обезвоженный мицелий,

3 интактныв клетки,

4 обезвоженные клетки .

ток в состояние анабиоза способствуют, о одной стороны, проявлению важнейшей защитной реакции - конденсации.хроматина в , клеточных ядрах, а с другой - "активации" культуры в ходе восстановления активной жизнедеятельности организмов.

Во всех случаях выявленный феномен "активации" развития культуры при использовании в качестве инокулума обезвоженных дрожтей может представлять определенный интерес при разработке Новых биотехнологических процессов.

ЗМДОТШЕ РЕАКЦИИ В КЛЕШАХ'

При изучении анабиоза был обнаружен ряд разнообразных реакций клетки на обезвоживание, многиз из которых могут быть отнесены к категории защитных. В первую очередь среди них сле-' дует упомянуть описанное выше явление конденсации хроматина в ядрах и компактизации ДНК в митохондриальном нуклеоиде. Как было отмечено, только в случае нормального протекания процесса конденсации хроматина дрожжевые организмы могут сохранить жизнеспособность в высушенном состоянии.

Существенное значение в этом же плане имеет возрастание в ходе дегидратации дрохжей степени ненасыщенности жирных кислот липвдов и в т.ч. фосфолипедов /7,13ааап1в вь а1., .1982/. Показана и взаимосвязь между сохранением выживаемости обезвоженных клеток и накоплением нми в процессе сушки повышенных количеств трагалозы /Дамберг, 1982/.

Наряду с этими эффектами, нами была обнаружена возможность отграничения цитоплазматической мембраной в процессе обезвоживания дрожжевых организмов необратимо поврежденных, достаточно крупных по размерам участков цитоплазмы от жизнеспособных ее областей, В результате этого в процессе реактивации жизнеспособный участок развивается как нормальная клетка, увеличивается в размерах и делится, тогда как необратимо поврежденные структуры постепенно подвергаются плазмолизу /4/.

Выла обнаружена возможность отграничения ядерной мембраной и постепенная элиминация бесхромосомиых участков ядра. При этом конденсированный хроматин, как правило, остается в сохраняющейся части ядерной структуры, занимающей обычно значительно меньший объем, чем ядро контрольных клеток. Уто явление, вероятно, направлено на уменьшение объема сохраняющейся нуклео-

- Зб -

плазмы и поверхности ядерных мембран, в результате чего снижается потребность клетки в содержании связанной воды /7/. 1 Несомненно, что ети уже обнаруженные защитные реакции являются лишь частью тег процессов, которые могут осуществляться в клетках на первых этапах их обезвоживания, и что в дальне 'лпем могут быть обнаружены новые явления. Однако и полученные нами , результаты псзволягот высказать предположение о возможности искусственного повышения устойчивости клеток к процессу дегидратации путем имитации условий, возникающих на первых этапах процесса сушки, и инициации тем самым ряда защитных реакций в , клетках.

Эксперименты показали, что даже непродолжительная инкубация дрожжевых клеток в растворах с различной концентрацией /0,5 -1,0 Ы/ сахарозы или лактозы приводит к значительному увеличению устойчивости организмов к обезвоживаний. Выявленный эффект усиливался при увеличении продолжительности инкубации клеток, ив отдельных'случаях было достигнуто увеличение жизнеспособности клеток на 50-6036 /45/. При исследованиях цитологических реакций клетки, осуществляющихся в этих условиях, были выявлены такие феномены как усиление складчатости цитоплазматической мембраны и начало конденсации хроматина в ядрах. В исследованиях, проведенных совместно с С1И.Аксеновым и его коллегами, методам . спинового эха ШР было установлено, что дрожжевые клетки, инкубировавшиеся в Сахарозе, после высушивания содержали в 2-4 ра- • за больше изолированной подвижной води по сравнению с контрольными образцами. Накопление этой формы воды указывает на то, что п(.;обная "осмотическая обработка" оказывает определенное влияние на структурные характеристики внутриклеточных мембран. : 1 Было выогазано предположение о том, что в условиях, иммти-1 руагцих началЫ чС стадии процесса'дегидратации клеток, в них может происходить'сингеэ шш накопление соединений, обеспечиваю- \ -•¡и* повышение устойчивости бисмембрая «макромолекул. Проведен«, нне эксперименты полазали, что инкубация дрожжей в растворах утилиз ирушой ими сахарозы или не утилизируемой лактозы приводит й накопленйю макните или инозита Соответственно /77/. Была оценена проницаемость цитоплазматической мембраны клеток, инкубировавшихся перед сулкой в растворе лактозы. Оказалось, что клетки, высуженные после инкубации, при любой влажности имеют болер низ-

проницаемость цитоплазматической мембраны и процессе рзги-дратации, чем соответствующие "контрольные" клетки или ко галетки, инкубировавшиеся в течение того же промежутка времени ¿в вода. Сделано заключение, что в рез; льтате инкубирования дрожжевых клеток в растворе о повышенным осмотическим давлением увеличивается устойчивость цитоплазматической мембршш и снижаются ее повреждения в ходе процессов обезвоиивания-регк-дратации. Вполне возможно, что подобное явление связано о частичной "заменой" в обезвоженных клетках сачзанной с мембранами воды на синтезирующийся в этих условиях многоатомный спирт. В то же время, исходя из характера кривых зечисимости проницаемости мембраны от остаточной влажности клеток, пока нет оснований считать, что осмотическая обработка клеток перед сушкой полностыз предохраняет их цитоплазматичесную мембрану от возможного в ней обратимого перехода липидов из ламеллярной фазы в гексагональнув фазу П. Однако, в этом случае такие переходы возникают, по-видимому, в меньшем числе участков мембраны.

Таким образш, приведенные результаты свидетельствуют о том, что существует принципиальная возможность повышения устойчивости клеток к процессу дегидратации путем создания условий, благоприятствующих инициации защитных внутриклеточных реакций, В то ае время при создании подобных условий возникает возможность обнаружения и изучения начальных реакций клетки на процесс обезвоживания и среди них - реакций, направленных на сожаление жизнеспособности организмов^ ато напраачение в исследованиях основных механизме^ перехода эукариотичэской клетки в оостояние анабиоза представляется в настоящее время одним из наиболее перспективных.

ри^ош

[/'^Выявлены основные структурно-функцт-оналышо перестройки ор-ранелл дрожжевой клетки, возникающие при переходе дрожжей в иостояниэ ангвдробиоза н последующей реактивации из этого зостояния.

I/ Показаны изменения мангаио-протеидного и глюканового

элементов клеточной стенки, приводящие к появлению на по-■ верхнос-ч хяеток разветвленных маннано-ппотеидных фибрилл, к стойкому кзыг гетто формы и размеров клеток и к

повышенной электронегативности поверхности. 2/ Выявлено функциональное значение состояния вакуолярной системы для сохранения в экстремальных условиях нормальной формы дрожжевых организмов. Установлена различная ■ реакция разных элементов вакуолярной системы на процессы .обезвоживания. Отмечена "л1. осомалькал реакция", проявляющаяся как при обезвоживании клеток, так и на ранних этапах их реактивации из состояния ангидробиоза. Показано, что сильное возрастание проницаемости вакуолярных мембран для ионов происходит уже в результате удаления из клеток свободной воды. В то же время их проницаемость для более крупных соединений /' апример, аминокислот/ Возрастает в значительно меньшей степени. 3/ Обнаружено, ч^о обезвоживание дрожжей приводит к резкому усилению фестончатой складчатости цитоплазматической мембраны. Сделано заключещкз, что функциональное значение' ее Инвагинаций связано с "самозащитой" мембраны в условиях растяжения или сжатия при.различных осмотических . стрессах. Показано возрастание проницаемости■цитоплазматической мембрана! клеток дрожжей, регидратируемнх после обезвоживания. 4 4/ Сделано заключение-о-том, что наименее выраженным струк-: турно-ф/нкциональным перестройкам при обезвоживании-ре-гидратоции подвергаются митохондрии. 5/ Обнаружены изменения формы ядра при обезвоживании дрож-' • жевых клеток, и нарушение в этих уоловиях свойств 'ригидности ядерной оболочки. В.восстановлении поврежденной ядерной оболочки в процессе реактивации клеток принимают участие митохондрии и липидные гранулы. 6/ Остановлено, что наиболее устойчивыми к процессу обезво-. живания дренжедае клепги являются на стадиях оц и в2 , клеточного, цикла..' ■7/ Выявлено, что в процессе обезвоживания дрожжей в них ыо-... жат происходить раз решение части нуклеиновых кислот и э т.ч.; до 40";» общего. йодерйлания НШ-/за счет деградации • определенного количества рибосом/.' .При этом при переходе в состояние ангидробиоза в клетках сохраняется в неповрежденном состолти достаточное количество всех видов

РНК для инициации белкового синтеза.

8/ Показано, что структурные перестройки органедл сопровождаются обратимыми изменениями физико-химических свойств ядер, митохондрий и цитоплазмы,,в т.ч. потеплением сорб-ционных свойств нуклеоплазмы, понижением сродства нуклеиновых кислот митохондрий к флуорохромам акридинового рада, изменением сорбционных характеристик клетки. П, Обнаружен ряд специальных защитных реакций, осуществляющихся в дрожжевых клотках при их переходе в соотояние ангидробио-за и направленных ка сохранение кизнеспособности организмов в обезвоженном состоянии. Эти реакции представляют значительный интерес в плане раскрытия ранее не известных потенциальных - возможностей эукариотической клетки, проявляющихся в экстремальных условиях. К ним относятся:

I/ конденсация хроматина ядер вне митотического цикла, в результате чего для него становится характерной "неактивная" паднуклеосомная структура;

2/ уплотнение ДНК митохондрий;

3/ отделение с помощью цитоплазматической мембраны, поврежденных участков цитоплазмы;

4/ отделение участка ядра с хромосомами ядерной мембраной от остальной части ядра;

5/ эндогенный синтез многоатомных спиртов, предположительно стабилизирующих макромолекулы и биомембраны. Ш. Получены данные, свидетельствующие о возможности перестройки при обезвоживании дрожжей молекулярной организации цитоплаз-матических и вакуолярных мембран, по крайней мере, на отдельных их участках, при которой осуществляется переход липидного би-слоя из ламеллярной фазы в гексагональную фазу П. Не обнаружено данных, указывающих на аналогичные изменения митохон-дриальных мембран.

IV. Выявлена возможность создания условий, способствующих постепенному восстановлению нормальной молекулярной организации внутриклеточных мембран, в результате чего в процессе реактивации могут быть значительно снижены их повреждения.

V. Уотановле!Ш основные факторы, определяющие сохранение жизнеспособности организмов в экстремальных условиях обеэвояива-

-

ния-регидратоции. К ним относятся: I/ степень стабильности внутриклеточных нуклеиновых кислот* 2/ способность клетки к конденсации хроматина на ратшх

этапах доги,- ратации дрожжей; 3/ максимально возможное сохранение молекулярной ор. дни-

зации различных внутриклеточных мембран; 4/ накопление клотками достаточных крлкчеств трегалозы или

многоатомных спиртов; б/ степень насыцешости жирных кислот липидоз, с которыми связана "жидкостность" мембран и их способность к адаптации при снижении в клетках содержания свободной и связанной воды; б/ способность клетки к осуществлению на ранних этапах дегидратации ряда защитных реакций. У1. Показала возможность направленной искусственной инициации защитных внутриклеточных реакций, в результате чего может быть значительно повышена устойчивость дрожжей к обезвоживанию. УП. Установлена возможности активации в результате процессов обезвоживания-регидратедии функциональной активности дрожжевых организмов, которая может быть использована в ряде биотехноло-гичесутс процессов.

У1И. Разработан ряд новых методических приемов для исследования состояния ангидробиоза. Разработаны и улучшены методы . учета.живых и мертвых клеток, установлены различные градации степени их повреждений.

1Л. Показано, что попользовано специального нового параметра .. • соотношения в клетке количеств "лабильных" и "стабильных" нуклеиновых кислот может оказаться полезном при подборе устойчивых к обезвоживаний штаммов дртжешх организмов. . ' X. Показана делеоообраднисть разработки в дальнейших лсоледог-а-; тиос ангцдробиоза нового направления, имеющего, наряду с теоретическим, и непосредственное практическое значение - направленного поиска условий, обеспечивающих значительное повкшеш^е устойчивости дрожжевых организмов к процессам обезвоживания, дегидратации н реактивации, для повышения на этой основе качества сухих биопрепаратоэ микробного происхождения и экономической г^итдаюсти их промышленного производства.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТШК ДИССЕРТАЦИИ

1. Рапопорт А.И., Медведева Г.А., Бирюзова В.И. Некоторые данные патофизиологического исследове шя анабиоза дрожжевых op-: ганизмов. - В сб.: Анабиоз и преданабиоз микроорганизмов. Тезисы симпозиума. Рига, "жнатне", I97I, с. 18-19.

2. Рапопорт А.И. Цитологическое исследование развития лиофи-лизировагашх культур Saccharoaycee cerevisiae. - в сб.: Тезисы докладов конф. молодых ученых, посвященной 100-летию со дня рождения академика АН Латвийской ССР А.К.Кирхенштейна. Рига, "Зинатне", 1972, с. 37.

3. Новичкова А.Т., Рапопорт А.И. Изучение азотистого обмена у дрожжевых организмов при переходе их в состояние анабиоза. -В сб.: Регуляция биохимических процессов у микроорганизмов. Тезисы докладов. Цущмно-на-Оке, IS72, с. I30-I3I.

4. Рапопорт А.И. Об отторжении участков поврежденной цитоплазмы у микроорганизмов, находившихся в состоянии анабиоза. -Микробиология, 1973, т. 42, № 2, с. 357-359.

. 5. Рапопорт А.И. Ультрастр; стурные изменения дрожжевых клеток при их реактивации из состояния анабиоза. - 3 сб.: Материалы У Всесоюзной конференции по электронной микроскопии, М., "Наука", 1973, с. 336-367.

6. Рапопорт А.И., Кострикина H.A. Цитологическое исследование анабиотического состояния дрожжевых организмов. - Известия АН СССР, серия биологическая, 1973, Р S, с. 770-773.

7 Рапопорт А.И., Бирюзова В.И., Мейсель К.Н. Структура здра дрожжевых клеток в анабиотическом состоянии. - Доклады Щ СССР, 1973, г. 213, р 3, с. 703-710.

8. Biryusova V.l., Kozlova ¡n.M., Meissel И.ff., Eapoporfc A, J. lerabrana evruotureo of yeast celia, their origin and rearrange»-le't under vario-ua physiological conditions.- Proceedings of ;ha Jourth International Sympóaiwm on Yeaata. Vienna,

'art 1, p. 191-192.

9. Рапопорт А.И. Об устойчивости микроорганизмов к поьреж-;ающим воздействиям. - В сб.: Проблемы микрооиологии и виру^о-.огии. 6-я конференция молодых ученых. Трчисы докладов. Рига, Зинатне", IS75, е. 25-26.

10. Рапопорт А.И., Бирюзов В.И., Медведева Г.А., Мейсель

K.H. Анабиотическое состояние дрожжевых организмов. - В сб.: 5 съезд Всесоюзного Микробиологического Общества. Секция: Рост и развитие микроорганизмов /физиология, биохимия и цитология/. Тезисы докладов. Ереван, 1975, с. 42-43.

11. Богданова Н.Е., Рапопорт А Ч. Нуклеиновые кислоты и устойчивость. дрожжевых клеток к экстремальным воздействиям. - В сб.: Синтез и исследование биологически активных соединений. Тезисы докладов 5 конф. молодых ученых. Рига, 'Ъинатне", 1975, с. 108.

12. .Рапопорт А.И.Медведева Г.А... Цитологическое исследование устойчивости к лиофшшзации дрожжей Saccharomyces се-rovisiae. - В сб.: Микробиологически' препараты. Рига, "Зинат-нв", 1976, о. ХСй-109.

13. Богданова Н.Е., FanonopT А.И. Об устойчивости полиплоидных дрозйзй Saccharomyces cerevisiae к обезвоживанию. - В сб.: Микробиологический биосинтез аминокислот. Рига, "Зинатне", 1977, с. '54-56.

14. Рапопорт А.Й. Некоторые результаты лшинесцеитно-микрос-ропического исследования обезвоженных дрожжевых клеток. - В сб.; Микробиологически биосинтез аминокислот. Рига, "зинатне" 1977, о. 57-60. ;

16. Рапопорт A. IÍ. Структурные перестройки в дрожжевых клетках при обезЬоживании и последгнцей реактивации. - В сб.: Проблемы микробиологии и вирусологии. 7-я конф. молодых ученых. . Тезисы докладов. Рига, "Уинатне", IS77, с. 38-39.

16. Рапопорт А.И., Богданова Н.Е. Влияние степени пл'оиднос-ти дрохлевш; клеток на их устойчивость к обезвоживанию. - В сб.: Проблемы микробиологии и вирусологии. 7-я конф. молодых ученых. Теэ'йсы докладов. Рига, "Зинатне", 1977, с. 33-40.

17. Rapoport А. I., PtrJu30Va V.l., Ventina E.J., Baker U.E. Oitrastrucfcural organisation ;oí sells Ли ánabiotic átate. - Inj Processings of toe XT th CznchoelovaJr conference on electron microscopy.' Praga, 1977» vol. A, p. 257«

It). Бокер M.E., Рапопорт А.И.,Вентыня Э.Ю. Конвективное ot'eáвсхпвание как поврекдакций фактор для клеточных структур. -В сб..: Общие механизмы клеточных реакций на повреждающие воздействия» Ленинград, 1977, с, 21-23., '

19. Рапопорт А.И. Влияние обезвоживания на нуклеиновые кис-.'Юты дрожжевых организмов. - В сб.: Структура и функции нуклеиновых кислот и биосинтез белка в растениях. Тезисы докладов Зторого всесоюзного симпозиума. Ташкент, "Фан", 1977, с. 40-41.

20. Рапопорт А.И. Реакция мембранных структур дрожжевых организмов на обезвоживание.- - В сб. : Конф. молодых ученых, по-рвященная 60-летию Великой Октябрьской Социалистической революции. Тезисы. Ереван, изд. АН Армянской ССР, 1977, с. 11-12.

' 21. Рапопорт А.И. Ультраструктурные перестройки в дрожжевых рлетках при их переходе в анабиотическое состояние. - В сб.: биотехнология и биоинженерия. Т. 2. Среды и продукты микробного синтеза. Тезисы докладов симпозиума. Рига, "Зинатне", 1978, р. 138-140.

22. Рапопорт А.И., Бекер М.Е. Увеличение внутриклеточной активности кислой фосфатазы при обезвоживании дрожжей Saccharo-nyces cerevisia®. - Микробиология, 1978, т. 47, 1|Э I, с. 170 -172.

23. Бирюзова В.И., Рапопорт А.И. Криофрактографическое исследование структуры дрохиевых клеток, находящихся в анабиотическом состоянии. - Микробиология, 1978, т. 47, 2, о. 300 -ЗСб.

24. Рапопорт А.И., Вентыня Э.Ю., Бирюзова В.И., Бекер М.Е. Ультраструктурные исследования анабиотического состояния дрожжевых организмов. - В сб.: Электронная микроскопия в ботанических исследованиях. Тезисы докладов 1У Всесоюзного симпозиума. Rira,•"Зинатне", 1978, с. 221-223.

25.Вёятыня Э.Ю., Рапопорт А.И. Цитологические реакции дрожжевых организмов при переходе в анабиотическое состояние и последующей реактивации. -В сб.: Экспериментальное изучение развития микроорганизмов. Цущино-на Окэ, 1978, о. II5-II7.

26. Рапопорт А.И., Вентыня Э.Ю. Основные цитологические закономерности, сопровождающие переход дрожжевых организмов в анабиотическое состояние. - В сб.: XI Всесоюзная конференция по электронной микроскопии. Тезиса докладов. Том 2. Биология, М., "Наука", 1979, с. 73.

27. Титовский В.И., Рапопорт А,И. Исследование влияния процесса обезвоживания на рибонуклеиновые кислоты дрожжей

Saccharoayces cerevir,iaar В сб.: Знергетика и углеводный обмен у микроорганизмов. Тезисы докладов симпозиума молодых ученых. . Рига, "Зинатне", 1979, с. 73.

28. Рапопорт А.И., Вентыня а.Ю.,' Саулите Л.А., Марковский A.B., Векер М.Е. Факторы, определяющие устойчивость дрог .ей к обезвоживанию. - В сб.: У1 Съезд Всесоюзного микробиологического общестра "На главных путях научно-технического прогресса-Тезисы докладов, стендовых сообщлюй и представленных к обсуж- . дению материалов. Т.4. Микробиологический синтез, биотехнолсга и биоинженерия. Рига, 1980, о. 65.

¿У. Рапопорт А.И., Марковский A.B. Роль лизосом при переходе дрожжевых организмов в анабиотическое состояние. - В сб.: Структура и функции лизосом. Тезисы докладов Второго Всессюз-' ного симпозиума. Новосибирск, 1980, с. 153-154.

30. Векер ^.Е., Дамберг Б.З., Рапопорт А.И. Анабиоз микроорганизмов. Рига, "аинатне", 1У8Г, 252 с. .

31. Рапопорт А.И., Помощникова H.A., Фатеева М.В., Никитина Т.Н., Мейсель М.Н. Нуклэк ;овые кислоты и устойчивость дрожжевых клеток к обезвоживанию. - Микробиология, 1981, т. 50,

15 2, о. 234-237.

32. Рапопорт А.К., Яновский К.А., Козлов Ю.Г., Берестенншсо ' ва К.Д., Куролаткина О.В. Использование метода оптико-структур ного машинного анализа при изучении анабиотического состояния дрожжевых организмов. - В сб.: Автоматизированные системы обработки изобретений /АСШЗ-81/. Тезисы докладов I Всесоюзной конкуренции. М., "Науаа", 1у81, о. 261-262.

33. Веке: n.J., «apoport Ail., Laiveaieka M.Q., Zikmanie

,P.В», Váhtina E.J. Structure ani function of the yeast Saccha-romyces öerevlsias cellular envelope at dehydrafcion-rebydrati-«a. - Ir.i VII International Specialize* Symposium on Teaet. .Vbatraote.'.Yeletteia, 1931, p..60,

naher M.J., Rapoport А..Т., Dreimane M.A., Blunberga J.K. Growth and Äuhydration oí JMocycopeis rtbuligera. - Int Abstráete oí the XII International Oongress of Microbiology. In-

fceirimcional Onion of Microbiological Societies. 1992, p. 151. '•". 35. Рапопорт 7i.¿.., Вентыня Э.Ю., СаулЕте Л.А. Использование

рлактронио-микроскопических методов исследования для изучения изменений поверхности клеток дрожжей при обезвоживании и регидра-

тации. - В сб.: XII Всесоюзная конференция по электронной микроскопии. Тезисы докладов. 11., "Наука", IS82, с. 250-251.

36. Рапопорт А.К., Вентыня Э.Ю., Саулкте Л.А., Бенер f.i.E. Электронно-микроскопические исследовезия дрожжей iindomycopeie fibuligera. - В сб.: XII Всесоюзная конференция но электронной микроскопии. Тезисы докладов. М., "Наука", 1982. с. ЗС2. : 37. Рапопорт А.И., Марковский А.Б., Бекер M.js. О повышении проницаемости внутриклеточных мемблан при обезвопивании-реги-

^ратации дрожжей Saccharomyces eerevisiae. - Микробиология, 932, т. 51, № б, с. 901-904.

38. Beker m.j., Rapoport: A.I.« Dreiraon^ М.A., Ventina b.j. prowth add dehydration of yeasts which use starch-cpntaining Substrates.-In:'4reast Technology: in Focus for the Future".viii International Specialized Symposium onTeasts. Abstracts of ?apera Accepted. Bombay. 1933, A 126.

39. Rapoport A.I., Ventina E.J., Saulite L.A, Beker h.J. Anabiotic state of yeast organisms. - Int "Yeasts in human environment." DC International Specialized Symposium on Yeasts. Д* etracts. Smolenice. 1983, p. ' '•>

40. Рапопорт А.И. Загадочный анабиоз. Наука и техника, 1983, В 5, с. 8-10.

41. Рапопорт А.Н., Бирюзова В.И., Бекер М.Е. Влияние процас-;а обезвоживания на структуру поверхности клеточной стенки *рожжей. - Микробиология, 1У83, т. 52, К? 2, с. 259-262.

42. Вентыня Э.Ю., Саулите Л.А., Рапопорт А.И. Некоторые уль- -грасчруктурные особенности Развития дрожжей и их реакции на гроцессы обезвоживания и последующей реактивации. - В сб.г Уль-•раструктурная организация растений, У Всесоюзный симпозиум по •льтр.аструнтуре растений. Тезисы докладов. Кишинев. 1983,

'. '16-47*.

""Ч-З. Beker M.J., Hapoport A.I., Zikm nis P.В., Dt berga B.E. 'ehyaration ais a regulating factor of yeazt metabolism. - Im EMS International Symposium. Environmental regulation of mio-•obial metabolism. Abstracts. Pushchino. 1993, p. ?0-21.

'W-. Beker H.J., Viesturs U.K., Bhvinks J.B., Zikjnonie P.-,., apoport A.i. Practical aspects of taetabCic regulation at ultivation and dehydration of microorganisms. • Ins TTHfi In-

tarnational Symposium. Environmental reflation of microbial ' metabolism. Abstracts. Puechino. 198?, p. 95-96.

45. FanonopT А.И,, Бекер М.Е. Влияние сахарсзы и лактозы на устойчивость дрожжей Sancharomyces cerevieiae к обезвоживанию* - Микробиология, 1983, т. 52, № 5, с. 719-722.

45. Новичкова А.Т., Рапопорт А.И. Исследование состояния внутриклеточного пула свободных аминокислот при обезвоживании дрожжевых организмов. - Микробиология, 1Ш4, т. 53, Р I, с. 5-9.

4-7. Rapoport A.I.Anabioze, apturSta dzlvlba... /Анабиоз, приостановленная жизнь.../. Riga, "ZinStno" /Рига, "Зинатне"/. 1984, 116 о.

48. Бекер М.Е., Швыгаа Ю.Э., Лукг. В.Т., Лаукевид Я.Я., У пит А.А., Вальдман А.Р., Ланкова Л.М., Рапопорт А.И., Апсите А.Ф,, Бекер В.Ф., Дреймане М.А., Лейте М.П., Селга С.Э., Ма-раускаМ.К., Латвиетис Я.Я., Клинцаре А.А., Виестур У.Е., Ра-ыаы Й.А.. Трансформация продуктов фотосинтеза. Рига, "Зинатне", 1984, 252 о.

^9. Beker M.J., Bluinbergs J.S., Ventiaa E.J., Rapoport А.I» Characteristics of cellular meabranea at rehydration of dehydrated yeast Saccharoivces cerevieiae. - Applied Microbiology and Biotechnology, 19S4-V v. 19, н 5, p. 3*-7-352.

50. Вентыня Э.Ю., Саулите Л.А., Рапопорт А.И., Бекер М.Е. Электронно-микроскопическое изучение дрожжей, находящихся в состоянии анабиоза и реактивирующихся из этого состояния. -Микробиология, 1У84, т. 53, К? 4, с. 653-664.

51. Рапопорт А.И., Дамберг Б.З.,'Бекер М.Е. Ультрас'труктур-ные и бисхимичоские перестройки в дрожжевых клетках при ангид-робиозе и последующей реактивации из отого состояния. - В сб.: Вторая Всеооюзпея конференция по теоретическим и прикладным вопросам криобиологии. Тезисы докладов. Харьков, 1984, т. I, с, 197. ; •• .

52. Рапопорт А.И., Вентыня Э.Ю. Ангидробиоз дрожжей: внутриклеточные перестройки. - В сб.: экспериментальный анабиоз. Тезисы докладов П Всесоюзной конференции по анабиозу. Рига, 1584, 0. 26-29. :,.•".-.

53. Вентыня З.Ю., Саулите Л.А., Рапопорт А.И. Цитологическо< исследование изменений дрожжевых клеток пря обезвоживании, ре-

гидратации и реактивации. I. Изменения формы и поверхности клеток. - В сб.; Экспериментальный анабиоз. Тезисы докладов II Всесоюзной конференции по анабиозу. Рига, 1984, с. 49-50,

54. Вентши Э.Ю., Саулите Л.А., Рапопорт А.И. Цитологическое исследование изменений дрожжевых клеток при обезвоживании, регидратации и реактивации. II. Изменения мембранных структур клетка, - В сб.: Экспериментальный анабиоз. Тезисы докладов II Всесоюзной конференции по анабиозу. Рига, 1984, с. 50-51.

55. Блумберг Я.Э., Бекере И.К., Бурлаков С.Б., Рапопорт А.И. Изменения дрожжевых клеток в процессе удаления свободной и связанной воды. - В сб.: Укспаркментал^ный анабиоз. Тезисы докладов IX Всесоюзной конференции по анабиозу. Рига, 1984,

с. 8. '

56. Загреба Е.Д., Гиновска М.К., Бурлаков С.Б., Румянцева Т.В., Рапопорт А.И., Якобсон D.O. Исследование процесс в обезвоживания и регидратации дрожжей методом ИК-спектроскопии. •

В сб.: Зксперименталышй анабиоз. Тезисы докладов II Всесоюзной конференции по анабиозу. Рига, 1984, с. <55.

57. Вентыня Э.Ю., Саулите Л.А., Рапопорт А.И. Липиднне гра-дулы э дрошвтх клетках: биогенез, структур® и возможная функциональная роль при репарации мембранных повреждений. - В сб.: Цитология микроорганизмов. Гезнсы докладов Всесоюзного совещания. Цущино, 1984, о. 56-57. .

58. Рапопорт А.И., Веятдая Э.В., Саулите Л.А. Специфические -й чзспецифическиэ реакции дрожжевых клеток на обезвоживание и последуиую регвдратацив. - В сб. : Цитология микроорганизмов. Тезисы докладов Всесоюзного совещания. Цущино, 1984, с* IC8-104.

59. Rupoporb A.I., Ventina E.I., Saulite L.A., Beker H.J. '''east anabiosis J иеяЬгаяэ transforaatioas in eelJs. - In» Slsctroa taicroaeopy 198^» Proaeedings of the 8 th European congress on electron aierosoopy. Budapest,'Hungary, 19S4,

vol. 3, P. 2373.

60. Рапопорт А.И., Мейсель M.H. О ишш >сцентно-микроскопи-ческсм определении Енкздваемости дрожжевых организмов после обезвоживания. - Микробиология, 1985, т. 54, Р I, с. 66-6S.

'61. Кралл^л И.Л., Островская Г.М., Дамберг Б.Э., Рапопорт А.И, Измен лкя активностей алкогольдегидрогеназы в дрожже-

шх клетках при их обезвоживании-регидратации и последующей реактивации. -В сб.: Проблемы современной биохимии и биотехнологии. Тезисы докладов 8-го объединенного симпозиума биохимических обществ СССР-ГДР. Рига, 1985, с. 237.

62. Rapoport A.I., Ventina E.J., Saulite L.A., Beker М.Е. Eleotron microscopy studies of the anabiotic state of yeasts. • Iut Veroffentlichungen zur 11. Таgung Electronenmikroskopie. II. Dresden, 1984-, s; 357.

63. Рапопорт А.И. Активация ряда внутриклеточных процессов при переходе дроакей в состо.^ше анабиоза и последующем вес-становлении их активной жизнедеятельности. - В сб.: Достижения микробиологии - практике. Тезисы УГ» съезда Всесоюзного микробиологического общества. Том 2. Физиология, биохимия и организация микроорганизмов. Алма-Ата, "Наука", 1985, с. 123.

64. Рапопорт А.И., Бекер М.Е. Изменения поверхностного заряда дрожжевых клеток при их обезвоживании у. регидратации. -Микробиология, 1985, т. 54, Р 3, с. 450-453.

65. Beker M.J., Eapoport A.I., Zikmanis Р.В., Daraberga B.E. Dehydration as a yeast metabolisir regulating factor. - In: Environmental Regulation of Microbial Metabolism /Ed. by I.S.Ku-laev, E.A.Daves, D.W.Tangest/. Acad. Press, London - San Diego, 1985, p. 105-111.

66. Рапопорт А.И. Анабиоз: исследования продолжаются. Наука и техника, 1986, Р 3, с. 15-17.

67. Вентыня Э.Г., Саулите Л.А., Рапопорт А.И,, Бекер М.Е. Лип.даав включения в клетках .. их изменения при обезвоживании и реактивац,ш дрожжевых организмов. - Микробиология, 1986,

т. 55, Р I, о. II6-II9.

68. Рапспорт А.И., Дреймане М'.А., Бекер М.Е. Етияние процесса обезво* вания на дрожки Endcmyccpsis fibuligera. Микробиология, IS36, т. 55, iP 4, с. 637-690.

69. Рапопорт А.И., Вентння Э.Ю., Чананис Г.Я., Блумберг Я. 3., Бекер М.Е. Ультраструктурше перестройки внутриклеточных меыбран к возможные изменения их молекулярной организации при переходе дрожжей в состоять анабиоза. - В сб.: Электронная микроскопия и вопросы диагностики. Тезисы И Республиканской каучно-xexHi.ческой' конференции по электрошой микроскопии. Ки-щ;шев. 1956, с. 122.

70. Саулите Л.А., Рубцова С.Л., Вентаня Э.Ю., Тагаров П.Б., Рапопорт А.И. Влияние модифицированного иодкрахмала на дрожжи Candida vini. - В сб.: Электронная микроскопия и вопросы диагностики. Тезисы Ш Республиканской научно-технической конференции по электронной микроскопии. Кишинев, 1986, с. 123.

71. Рапопорт А.И., Бекер М.Е. О разрушении р'бонуклеинов)ос кислот в дрожжевых клетках при их обезвоживании. - Микробиология, 1985, т. 55, Н? 5, с. 855-857.

72. Рапопорт А.И., Берестенникова Н.Д., Яновский К.А., Бекер М.Е. Об изменениях формы и размеров дрожжевых клеток при их обезвоживании и последующей реактивации. - Микробиология, 1У86, т. 55, К? 5, с. 881-882.

73. Рапопорт А.И., Бирюзоза В.И., Светличная Т.П. Криофрак-тографическое исследование изменений вакуолей при обезвожйва-НИИ клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae. - Микроби^чогия, 1986, т. 55, IP 6, с. 1030-1035.

74. Иванов В.Н., Рапопорт А.И., Пиндрус A.A., Саулите Л.А., Шифрук Т. А. Фаэоспецифичность повреядениГ, и репарации поврездв-ний клеток дрожжей при обезвоживании-регидратэ!^ш и замораживании-оттаивании. - Микробиология, 1987, т. 56, IP 2, с. 341346.

75. Рапопорт А.И., Вентыня У.Ю Структурно-Функциональные перестройки в клетках при обезвожившгаи-регидратации. - В кн.: Торможение жизнедеятельности клеток. Рига, "Зинатне", 1987,

з. 85-100.

76. Beker M.J., Rapoport A.I. Conservation of yessta by dehydration. - Ins Advances in Bioeheoical Engineering/Bio~ technology. Vol. 35. Berlin-Hsidelberg-New York-London-Paris-Tokyo, Sp: inger-Verlag. 1937, P. 127-171.

r 77. Рапопорт А.И., Пузыревская O.M., Саубенова М.Г. Полиолы и устойчивость дрожжей к обезвоживание. - Микробиология, т. 57 /в печати/.

78. Тимошин A.A., Зшшаяяс П.Б., Рапопорт А.И., Бекер U.S. Изменение структуры цитоплазматичоской ыембпаны в процесса высушивания дрожзей Sacoharon; ;es carovi sise.' - Биофизика, 1988 /в печати/.