Гормональная регуляция уровня дегидринов в растениях пшеницы в условиях обезвоживания

Ключникова, Екатерина Олеговна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Гормональная регуляция уровня дегидринов в растениях пшеницы в условиях обезвоживания
ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Гормональная регуляция уровня дегидринов в растениях пшеницы в условиях обезвоживания"

На правах рукописи

КЛЮЧНИКОВА ЕКАТЕРИНА ОЛЕГОВНА

ГОРМОНАЛЬНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ УРОВНЯ ДЕГИДРИНОВ В РАСТЕНИЯХ ПШЕНИЦЫ В УСЛОВИЯХ ОБЕЗВОЖИВАНИЯ

03.01.05. - физиология и биохимия растений

Автореферат Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических паук

21 МОЯ 2013

005539338

Уфа 2013

005539338

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Шакпрова Фарида Мишшхановна

Официальные оппоненты: Веселое Станислав Юрьевич

доктор биологических наук, профессор кафедры биохимии и биотехнологии Башкирского государственного университета

Таланова Вера Викторовна

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории экологической физиологии растений Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт биологии КарНЦ РАН

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН

Защита состоится « 12 » декабря 2013 года в « 16.00 » на заседании диссертационного совета Д 212.013.11 в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении «Башкирский государственный университет» по адресу: 450076, г. Уфа, ул. Заки Валиди, 32, биологический факультет, ауд. 332.

Факс (347)273-67-78, e-mail: disbiobsu@mail.ru Официальный сайт БашГу: http://www.bsunet.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке БашГУ. Автореферат разослан «» ноября 2013 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, д.б.н.

М.Ю. Шарипова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальпость. К наиболее широко распространенным в мире повреждающим факторам среды, приводящим к обезвоживанию, существенному торможению ростовых процессов растений и потере урожая, относятся засуха, гипотермия, засоление, а в связи с ростом техногенного загрязнения окружающей среды также воздействие избыточных концентраций солей тяжелых металлов (ТМ). Известно, что эти стрессы часто взаимосвязаны и индуцируют общие сигнальные пути регуляции клеточных ответов, направленных на адаптацию, и вызывают в растениях сходные морфологические, физиоло-биохимические, молекулярно-генетические изменения (DalCorso et al., 2008; Potters et al., 2009; Winfield et al., 2010; Shakirova et al., 2010; 2012).

К числу универсальных реакций растений в ответ на эти стрессовые воздействия, вызывающие обезвоживание, относится усиление биосинтеза АБК и её накопление (Rock et al., 2010). В основе реализации регуляторного действия АБК в формировании стресс-устойчивости растений лежит индукция экспрессии АБК-чувствительных генов. О ключевой роли АБК в регуляции защитных реакций к неблагоприятным факторам, приводящим к нарушению водного режима, свидетельствуют данные о том, что из почти двух тысяч индуцируемых засухой генов в Arabidopsis taliana около 1300 находятся под контролем АБК (Huang et al., 2008). К таковым, в частности, относятся гены белков дегидринов, присущих всем таксономическим группам царства растений (Close, 1997; Аллагулова и др., 2003; Kosova et al., 2010; Hanin et al., 2011). Массированная аккумуляция дегидринов наблюдается в зародышах семян в период их обезвоживания, однако резкое усиление экспрессии генов дегидринов и накопление их белковых продуктов регистрируется в тканях вегетирующих растений, подвергнутых обезвоживанию, а среди индуцируемых в этих условиях стрессовых белков дегидрины наиболее многочисленны (Аллагулова и др., 2003; Нага, 2010; Hanin et al., 2011). Физико-химические свойства дегидринов, особенности строения, в том числе обязательное наличие 15-аминокислотного К-сегмента, способного к формированию вторичной амфифильной а-спирали, свидетельствуют в пользу их участия в защите биополимеров от денатурации, в сохранении целостности клеточных структур и

стабилизации мембран в условиях обезвоживания (Аллагулова и др., 2003; Kosova et al., 2010; Нага, 2010). Индукция экспрессии генов дегидринов и накопление их белковых продуктов происходит в растениях и в нормальных условиях при обработке АБК (Close, 1997; Шакирова и др., 2005; Аллагулова и др., 2007). Чувствительность генов дегидринов к АБК и стрессовым факторам определяется наличием в их промоторах различных взаимодействующих друг с другом комбинаций г/ис-регуляторных элементов, взаимодействующих с АБК-индуцируемыми транс-факторами (Shinozaki, Yamaguchi-Shinozaki, 2007; Chung, Parish, 2008; Hanin et al., 2011). Вместе с тем, сведения об активации транскрипции TADHN гена дегидрина в проростках пшеницы в ответ на обработку 24-эпибрассинолидом (ЭБ) на фоне отсутствия изменений в концентрации АБК (Аллагулова и др., 2007) свидетельствуют о реализации независимых от эндогенной АБК путях гормональной регуляции уровня дегидринов в растениях. Эти данные дают основание предполагать участие и других фитогормонов, сочетающих в себе ярко выраженные свойства стимуляторов ростовых процессов и индукторов устойчивости к стрессовым факторам, вызывающим обезвоживание, в регуляции транскрипции генов и количественного уровня дегидринов и важном вкладе этих белков в реализацию их протекторного действия на растения. Цель и задачи исследований. Цель работы заключалась в изучении механизмов гормональной регуляции уровня дегидринов в растениях пшеницы, подвергнутых воздействию стрессовых факторов, вызывающих дефицит влаги. Для решения цели были поставлены следующие задачи:

1) для оценки вовлечения дегидринов в реализацию предадаптирующего действия цитокинина 6-бензиламинопурина (БАЛ) и салициловой кислоты (СК) провести анализ влияния этих гормонов на активность транскрипции TADHN гена дегидрина пшеницы в проростках в присутствии или отсутствие ингибитора синтеза АБК флуридона;

2) исследовать динамику транскрипции гена TADHN дегидрина в растениях в ходе воздействия гипотермии и кадмиевого стресса и оценить вклад эндогенной АБК в регуляцию этого процесса;

3) с использованием антител, полученных к К-сегменту дегидринов, исследовать спектр иммунореактивных белков в корнях и побегах предобработанных и необработанных флуридоном проростков пшеницы в условиях низкотемпературного стресса;

4) с использованием вестерн-блот-анализа провести оценку количественного уровня дегидринов в предобработанных и необработанных флуридоном растениях, подвергнутых воздействию ацетата кадмия;

5) методом иммуноблотгинга провести анализ уровня дегидринов в предобработанных СК и ЭБ в присутствии или отсутствие флуридона проростках пшеницы в условиях кадмиевого стресса.

Научная новизпа. С использованием ингибитора синтеза АБК флуридона получены приоритетные данные о реализации как зависимых, так и независимых от эндогенной АБК путей регуляции активации транскрипции ТАВНТЯ гена дегидрина в растениях пшеницы, обработанных СК или БАП в разных концентрациях. Впервые на растениях пшеницы показано сочетание АБК- и холод-индуцируемых путей регуляции экспрессии гена ТЛйНМ дегидрина и накопления дегидриновых белков в растениях пшеницы при гипотермии. Выявлен важный вклад дегидринов в проявление протекторного эффекта СК и ЭБ на растения пшеницы в условиях кадмиевого стресса, при этом реализация их регуляторного действия на уровень дегидринов различается: ЭБ, в отличие от СК, проявляет независимую от эндогенной АБК способность к индукции накопления дегидринов.

Практическая значимость работы. Результаты проведенных в работе исследований расширяют знания о молекулярных механизмах защиты пшеницы к гипотермии и кадмиевому стрессу и важной роли фитогормонов, сочетающих в себе свойства стимуляторов роста и индукторов устойчивости, таких как цитокинины, ЭБ и СК, в их регуляции. Вовлечение уникальной группы стрессовых белков дегидринов в спектр действия СК и ЭБ на проростки пшеницы в нормальных и стрессовых условиях может служить важным критерием развития под их влиянием предадаптирующего и протекторного эффектов на растения. Совокупность полученных данных раскрывает пути эффективного управления

стресс-устойчивостью пшеницы с применением исследованных в работе фитогормонов, повышения урожая основной хлебной культуры России и улучшения его качества.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на международных научных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «ЛОМОНОСОВ-2010» (Москва, 2010), международных школах-конференциях молодых ученых «Биология-наука XXI века» (Пущино, 2011) и «Биомика» (Уфа, 2011, 2012), XVII и XVIII конгрессах FESPB (Valencia, Spain, 2010, Freiburg, Germany, 2012), VI Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Уфа, 2013), 38-м конгрессе FEBS (Санкт-Петербург, 2013), 25-м конгрессе SPPS (Helsingor, Denmark, 2013). Конкурсная поддержка работы. Исследования поддержаны грантами РФФИ № 08-04-01563а, № 11-04-01642-а и РФФИ-Поволжье № 11-04-97051. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 работ, в том числе 2 статьи в журналах из перечня ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы изложения методов исследований, результатов исследований и их обсуждения, заключения и выводов. Работа изложена на 134 страницах и иллюстрирована 22 рисунками и 1 таблицей. Список литературы включает 273 наименования.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования служили проростки яровой пшеницы Triticum aestivum L. сорта Башкирская-26. Семена пшеницы после стерилизации 96%-ным этанолом проращивали в кюветах на фильтровальной бумаге в течение 3-х суток (16-часовой световой день, 15 клк) при 22-24° С. После отделения эндосперма проростки корнями помещали в раствор 2%-ной сахарозы, используемой в качестве питательного раствора (Шакирова и др., 1993), затем в зависимости от целей работы использовали разные постановки опытов. 3-сут проростки отделяли от эндосперма и выдерживали 24 ч на растворе 2%-ной сахарозы для снятия раневого стресса, после чего 4-сут проростки переносили на разные промежутки времени на смесь 2%-ной сахарозы с фитогормонами 6-бензиламинопурином в концентрациях 44 нМ и 4.4 мкМ, 50 мкМ салициловой кислотой или 0.4 мкМ 24-

эпибрассинолидом. В раде опытов 3-сут проростки помещали на 24 ч на раствор 2%-ной сахарозы в присутствии или отсутствие флуридона в концентрации 5 мг/л, предотвращающей новообразование АБК (Шакирова и др., 2009), после чего 4-сут проростки переносили на свежий раствор 2%-ной сахарозы в смеси с БАП, СК или ЭБ в присутствии флуридона. Опыты с низкотемпературной обработкой. 4-сут проростки после инкубирования на 2%-ной сахарозе в течение 24 ч переносили в климатокамеру на 6° С и выдерживали их в течение 9 ч. В других опытах 3-сут проростки помещали на раствор 2%-ной сахарозы в присутствии или отсутствие флуридона и выдерживали их в климатокамере при температуре 6° С в течение 48 ч. Опыты с ацетатом кадмия. Предобработанные и необработанные флуридоном 4-сут проростки переносили на разные промежутки времени в течение 24 ч на смесь 2%-ной сахарозы и 1 мМ ацетата кадмия Сс1(СНзСОО)2 в присутствии или отсутствие флуридона. Для оценки роли гормонов в защите растений от кадмия 3-сут проростки помещали на 24 ч на раствор 2%-ной сахарозы, содержащий ЭБ или СК в присутствии или отсутствие флуридона, после чего переносили на смесь 2%-ной сахарозы, ацетата кадмия и флуридона на 24 ч. Контролем служили проростки, инкубированные на растворе 2% сахарозы. Через определенные промежутки времени контрольные и опытные проростки или отдельно корни и побеги фиксировали в жидком азоте для последующей оценки в них физиолого-биохимических показателей.

Митотический индекс у не менее 3000 клеток апикальной меристемы корней оценивали цитологически с помощью окуляр-микрометра (Паушева, 1988). Содержание АБК в тканях определяли методом непрямого твердофазного конкурентного иммуноферментного анализа (ЬЪакпота аЬ, 2003). РНК выделяли согласно (ВооЛе й а1., 1995). Для получения кДНК на основе мРНК Т/ЮНЫ гена дегидрина проводили реакцию обратной транскрипции с использованием \f-MuLV обратной транскриптазы согласно протоколу поставщика. ПЦР проводили в амплификаторе типа ТП4-ПЦР-01-"Терцик" ("ДНК-Технология", Россия), после чего фрагменты ДНК фракционировали методом электрофореза в 1-2% агарозном геле или 7% ПААГ. Разделение полипептидов проводили методами электрофореза (ЬаештИ, 1970), используя прибор для

вертикального электрофореза Mini- PROTEAN Tetra cell 165-8001 (Bio-Rad, США), источник питания Эльф-4 ("ДНК-Технология", Россия). Вестерн блоттинг проводили согласно методике (Towbin et al., 1979) в приборе Mini Trans-Blot® Module 170-3924EDU (Bio-Rad, США) в течение 1 ч при напряжении 100 V и силе тока от 18 до 22 мА, подаваемых источником питания PowerPac HC Power Supply #164-5052EDU (Bio-Rad, США). В работе использовали нитроцеллюлозные мембраны Protran Membrane (Whatman) с шириной пор 0,2 нм. Поликлональные антитела, полученные к K-сегменту дегидринов, любезно предоставлены проф. T.J. Close (США). Детекцию дегидринов проводили с помощью вторичных кроличьих антител, меченных пероксидазой (НИИ им. Гамалея, Россия).

Опыты проводили в двух-трех биологических и четырех-пяти аналитических повторностях. В иллюстрациях представлены средние арифметические значения и ошибки средних.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Гормональная регуляция транскрипции TADHN гена дегндрина в проростках пшеницы. Ранее в нашей лаборатории был клонирован и секвенирован фрагмент гена дегидрина, гомологичный dhn8 гену дегидрина ячменя и семейству мРНК дегидринов пшеницы Wcor410, Wcor410b и Wcor410c, кодирующих белки, относящиеся к SKn типу дегидринов, обозначенный как ген TADHN (Triticum aestivum dehydrin) (Allagulova et al., 2004, Accession No AY574032), включающий последовательность, кодирующую K-сегмент дегидринов. Для TADHN гена показана высокая чувствительность к АБК, признанному иидуктору стресс-устойчивости (Шакирова и др., 2005), а также к 24-эпибрассинолиду, причем ЭБ проявил способность к индукции экспрессии гена TADHN на фоне отсутствия сдвигов в концентрации АБК (Аллагулова и др., 2007). Нами было выявлено, что в регуляции транскрипции гена TADHN дегидрина в растениях пшеницы участвуют и другие фигогормоны, также как и ЭБ, сочетающие в себе рост-стимулирующий и предадаптирующий эффекты. Из рис. 1 видно, что обработка проростков 50 мкМ CK и 4.4 мкМ БАЛ, в концентрациях, при которых они оказывают ярко выраженное стимулирующее действие на рост пшеницы (Shakirova et al., 2003; Авальбаев и др., 2010), приводит к значительному усилению транскрипции гена

дегидрина, которому, однако, предшествует быстрое транзиторное накопление АБК. Эти данные свидетельствуют в пользу того, вызываемая СК и БАП активация экспрессии гена ТАЙНЫ обусловлена увеличением под их влиянием концентрации АБК.

5 200

>5 О О.

5 150 х

* 100 -

- Контроль —О- СК - -л- - Фл + СК

I I 180 ш

О 2 к & § С 160 •5 Д а.

к т

5 § Я 140 • | '

« й- ^ 120

б!

>- 100

6 к' - СК • -А- -Фл + СК

.....1

I 4 6 8

200

[Л « < §

I 175

X X

К °

& 5 150

125 100

5.1

>• а * Д

1 I I

I ^ б а

225 ; 200

; 150 125 100

□ БАП _1_

□ БАП+Фл

Рис. 1. Влияние мкМ 50 салициловой кислоты и 4.4 мкМ БАП на динамику содержания АБК (а, в) и транскрипционной активности ТАЭНЫ гена дегидрина (б, г) в 4-сут предобработаняых и необработанных 5 мг/л флуридоном ироростках шпишцы.

Действительно, результаты опытов с совместной с гормонами обработкой проростков ингибитором синтеза АБК флуридоном демонстрируют необходимость эндогенной АБК в регуляции вызываемой СК и БАП транскрипции гена дегидрина (рис. 1). Из рис. 2 видно, что инкубирование проростков на среде, содержащей 44 нМ БАП. привело к двукратному накоплению транскриптов гена дегидрина, которое наблюдалось при отсутствии значимых изменений в концентрации АБК в проростках, поэтому неудивительно, что предобработка проростков флуридоном не препятствовала вызываемой гормоном активации транскрипции гена. Полученные данные указывают на способность цитокинина осуществлять также и независимую от АБК позитивную регуляцию транскрипции ТАЙНЫ гена и вовлекать дегидрин в спектр его предадаптирующего действия.

SO - 3 6 9

Время, ч Время, ч

Рис, 2. Влияние 44 нМ БАП на динамику содержания АБК (а) и траискриптов TADHN гена дегидрина (б) в 4-сут предобработанных и необработанных 5 мг/л флуридоном проростках пшеницы.

Таким образом, в регуляции транскрипции гена TADHN дегидрина в растениях пшеницы помимо АБК задействованы и другие фитогормоны, сочетающие в себе как ростстимулирующий, так и предадаптирующий к возможным стрессовым ситуациям эффекты. При этом, если цитокинин в относительно высокой концентрации, 4.4 мкМ, и СК вызывают активацию транскрипции гена дегидрина опосредовано через индуцированное ими транзиторное накопление АБК, то БАП в концентрации 44 нМ способен к независимой от эндогенной АБК регуляции этого процесса.

Регуляции транскрипции TADHN геиа дегидрина в растениях пшеницы, подвергнутых стрессу. Низкотемпературный стресс. Гипотермия относится к числу наиболее часто встречающихся абиотических стрессовых факторов, лимитирующих рост и продуктивность растений (Tbomashow, 1999; Трунова, 2006). К характерным ответным реакциям растений на холодовой стресс относится быстрое обратимое увеличение концентрации АБК (Kovacs et al., 2011), что, в свою очередь, влечет за собой активацию экспрессии генов защитных белков, в спектре которых особое место отводится дегидринам (Chung, Parish, 2008; Kosova et al., 2010). TADHN ген гомологичен семейству чувствительных к холоду генов дегидринов WCOR 410 пшеницы, в связи с чем их можно рассматривать в качестве важных компонентов приспособительных реакций растений, направленных на снижение уровня повреждающего действия гипотермии.

Так, низкотемпературный стресс вызывает быстрое транзиторное накопление АБК, предшествующее стресс-индуцированному поступательному

накоплению транскриптов ТАБШ гена дегидрина (рис. 3). Для оценки вклада эндогенной АБК в регуляцию транскрипции гена мы провели опыты с флуридоном. Видно, что предобработка проростков флуридоном полностью предотвратила вызываемое холодом накопление АБК, что отразилось в торможении, но не предотвращении накопления ТАОНЫ транскриптов в растениях.

□ Контрсиъ и Go С а Фл + 6о С

£ <

. - - $

Время,1

8 10 Время. ч

Рис. 3. Влияние холодового стресса на динамику содержания АБК (а) и транскрипционной активности TADHN гена дегидрина (б) в 4-сут. предобработанных и необработанных флуридоном проростках пшеницы.

Полученные данные демонстрируют вовлечение АБК в регуляцию транскрипции TADHN гена дегидрина в растениях при гипотермии, особенно четко проявляющееся в начальный период стресса, и иллюстрируют реализацию как АБК-зависимых, так и не зависимых от эндогенной АБК путей регуляции активности этого гена в ответ на холод. Вероятно, выявленный эффект обусловлен наличием в его промоторе как АВКЕ-г^с-регуляторных элементов, чувствительных к АБК-индуцируемым транс-факторам (Chung, Parish, 2008), так и CRT/DRE/LTRE-z/wc-регуляторных мотивов, чувствительных к Холодовым CBFs/DREB-факторам (Thomashow, 2010). При этом важно отметить сведения о способности АБК индуцировать экспрессию также и некоторых генов CBF (Knight et al, 2004; Chung, Parish, 2008).

Воздействие токсических ионов кадмия. В литературе имеются сведения, убедительно указывающие на участие дегидринов в защите растений не только к условиям гипотермии, засухи, засоления, но и к воздействию тяжелых металлов (Нага, 2010: Hanin et al., 2011; Нага et al., 2013). К наиболее токсичным ТМ относят

кадмий, не являющийся необходимым элементом для нормальной

жизнедеятельности растений (DalCorso et al, 2008). Поскольку воздействие кадмия вызывает нарушение водного обмена, неудивительно, что в этих условиях наблюдается активация транскрипции генов, чувствительных к АБК (Fusco et al., 2005), в частности, дегидринов, синтез и накопление которых резко усиливается в ответ на ТМ. Действительно, в настоящее время широко обсуждается вклад дегидринов в уменьшение степени повреждающего действия ионов тяжелых металлов на растения, в том числе вследствие участия дегидринов в нейтрализации ТМ-индуцируемой продукции АФК (Deng et al., 2007; Fiara, 2010; Нага et al., 20)3). В связи с этим, интересно было в сравнительном аспекте исследовать влияние ацетата кадмия на динамику содержания АБК и транскриптов TADHN гена дегидрина в растениях пшеницы.

Из рис. 4 видно, что воздействие 1 мМ ацетата кадмия вызывает быстрое существенное обратимое накопление АБК, предшествующее двукратному усилению экспрессии TADHN гена с максимумом, приходящимся на 6 ч.

250 200 . 150 100 -50 -0

-Контроль — Cd

§. х к 200

>D 5

- í I

| | | 150

1 I S 5 g-*

° и 100

Время, ч

^ N

€ -5—

Время, i

Рис. 4. Влияние 1мМ ацетата кадмия на динамику содержания АБК (а) и транскрипционную активность ТАЙНЫ гена дегидрина в 4-сут проростках пшеницы в присутствии/отсутствиеи флуридона.

Обращает на себя внимание высокая чувствительность ТАЙНЫ гена к кадмию. Однако в отличие от действия гипотермии, изменение его транскрипционной активности носит транзиторный характер, что может свидетельствовать о том, что этот ген дегидрина не относится к компонентам специализированной защиты к кадмиевому стрессу, однако может вовлекаться в развитие АБК-контролируемых неспецифических, возможно, кратковременных

защитных реакций пшеницы в ответ на кадмий. В пользу этого предположения свидетельствует факт полного предотвращения флуридоном транскрипции TADHN гена (рис. 46). Таким образом, использование ингибиторного анализа позволило выявить реализацию как зависимых, так и независимых от эндогенной АБК путей регуляции накопления транскриптов TADHN дегидрина в проростках пшеницы в ответ на гипотермию и кадмий, также как и на обработку гормонами, характеризующимися ярко выраженным антистрессовым действием. Полученные результаты могут свидетельствовать в пользу важного вклада кодируемого TADHN геном дегидрина в формирование стресс-устойчивости пшеницы, однако они не являются достаточными для выявления его функциональной значимости. В связи с этим особый интерес представляло исследование количественных и качественных изменений в спектре дегидринов в ответ на стресс в необработанных и предобработанных гормонами растениях пшеницы с использованием вестерн-блот анализа.

Иммупоблоттинг дегидринов пшеницы. Анализ аминокислотной последовательности, выведенной из нуклеотидной последовательности TADHN гена, позволил отобрать аминокислотную последовательность TADHN дегидрина, включающую 10 аминокислот, примыкающих к началу К-сегмента, и 7 первых аминокислот из К-сегмента, что, на наш взгляд, могло быть достаточным для распознавания белкового продукта именно TADHN гена. В НПФ «Верта» (г. Санкт-Петрбург) по нашему заказу синтезирован пептид [TEAAPAVPEEEKKGFLE], к которому были получены кроличьи антитела. Вместе с тем, в работе мы использовали антитела к синтетическому К-сегменту дегидринов, любезно предоставленные проф. T.J. Close (США). Исходя из того, что исследуемый нами TADHN ген в высокой степени гомологичен генам дегидринов семейства WCOR и характеризуется чувствительностью к пониженным температурам, можно было предположить, что при гипотермии среди прочих белков будет аккумулироваться и TADHN дегидрин, увеличение содержания которого можно детектировать с помощью антител, синтезированных по нашему заказу, а также антител, полученных к К-сегменту. Поскольку дегидрины отличаются высокой термостабилыюстью (Close, 1997), для проверки

этого предположения в опытах анализировали термостабильную

фракцию водорастворимых белков проростков пшеницы.

М.м. кДа а

80 -,

^^ _^ тЛ

1 2 3

Рис. 5. Детекция дегидринов из термостабильтной фракшт полииетидов, полученной из побегов подвергнутых холодовому воздействию (6 С) в течение 48 ч 5-сут проростков пшеницы. Нигроцеллюлозные мембраны иллюстрируют спектр белков, детектируемых сывороткой, полученной к ТАОНИ дегидрину (а) и сывороткой к К-сегменту (б). Дорожки слева направо: 1 - маркерные белки; 2 - контроль; 3 - 6° С.

Анализ иммунореактивных к антителам к фрагменту ТАОНЫ дегидрина на нитроцеллюлозной мембране выявил полипептид с М.м. 55 кДа (рис. 5а), который детектировался также сывороткой к К-сегменту (рис. 56). причем, наиболее значимый ответ этого белка с использованием обеих сывороток проявился в варианте опыта с холодовой обработкой. Эти результаты дают основание полагать, что полипептид с М.м. 55 кДа может являться продуктом ТАВНТУ гена дегидрина. Вместе с тем, в спектре иммунореактивных к антителам к К-сегменту белков четко выявилось холод-индуцируемое накопление белка с М.м. 69 кДа, что указывает на вовлечение также и этого белка в ответные реакции на гипотермию. С целью детального сравнительного анализа участия дегидринов 55 кДа и 69 кДа в формировании устойчивости пшеницы к холодовому стрессу и оценки значения АБК в регуляции уровня этих белков далее были проведены эксперименты с использованием антител, полученных к К-сегменту.

Роль эндогенной АБК в регуляции холод-индуцируемого накопления дегидринов в проростках пшеницы. Сравнительный вестерн-блот анализ уровня холод-индуцируемых дегидринов в корнях и побегах предобработанных и необработанных флуридоном растений пшеницы и подвергнутых воздействию низкой температуры в течение 48 ч показал (рис. 6), что наиболее существенные изменения наблюдались в уровне дегидрина с М.м. 55 кДа: более чем 2.5-кратное

накопление дегидрина в корнях и пятикратное - в побегах. Предобработка флуридоном подавила индуцируемое холодом накопление этого белка в корнях, что свидетельствует о важной роли стресс-индуцированного накопления АБК в регуляции уровня 55 кДа дегидрина в них, а в побегах флуридон почти вдвое снизил, но не предотвратил вызываемое стрессом увеличение уровня белка (рис. 6). Эти данные свидетельствуют в пользу вовлечения 55 кДа дегидрина в формирование устойчивости растений к гипотермии и об участии в регуляции его уровня наряду с АБК других холод-индуцируемых сигнальных систем.

„ 350 п „ I

а. о: с;

5 О ®

С! ЬЕ О) 9

И55кДа

ВбЭкДа

5 £

Е о

а) е- 400

4 £

0) о

Ф о 300 Н

Ёгг § 200 го X

100

ез 55кДа

гбЭкДа

6'С

69 кДа 55 кДа

Корни

69 кДа 55 кДа

2 3

Побеги

Рис. 6. Влияние гипотермии (6° С, 48 ч) на уровень дегидринов в корнях (а) и побегах (б) 6-сут необработанных и предобработанных флуридоном проростков пшеницы. Дорожки слева направо: 1 - контроль. 2 - 6° С, 3 - флуридон + 6° С.

Обращает на себя внимание, что в корнях и побегах контрольного варианта четко проявляется иммуносигнал, соответствующий полипептиду с М.м. 69 кДа (рис. 6), который в ответ на холод возрос примерно в 1.5 раза как в корнях, так и побегах, что может свидетельствовать о том, что этот дегидрин не является активным участником развиваемых на холод защитных реакций пшеницы. Интересно, что предобработка проростков флуридоном по-разному отразилась в уровне дегидрина 69 кДа: в корнях он резко снизил его содержание даже относительно контроля, а в побегах - нет (рис. 6). Полученные результаты позволили высказать предположение о том, что оба исследованных нами

дегидрина характеризуются более интенсивным оборотом в корнях, чем в побегах, однако оно нуждается в экспериментальной проверке.

Таким образом, на растениях пшеницы, подвергнутых холодовому стрессу, получены данные, указывающие в пользу вовлечения дегидринов в формирование устойчивости пшеницы к гипотермии. Использование в опытах также как и при анализе транскрипционной активности ТАВНЫ гена при гипотермии флуридона позволило выявить наличие как АБК-зависимых, так и независимых от эндогенной АБК путей регуляции количественного уровня дегидринов при данном стрессе. Анализ уровня дегидринов в проростках пшеницы в условиях кадмиевого стресса. Основываясь на имеющихся в литературе сведениях о чувствительности дегидриновых генов к воздействию ТМ (Татав е1 а1., 2010; Уагщ ег а1., 2012), вовлечении дегидринов в защиту растений от вызываемого ТМ также и окислительного стресса, и обезвоживания (Нага, 2010; Нага ег а1., 2013), и полученных нами данных об АБК-опосредуемой обратимой активации транскрипции ТАПШ гена дегидрина в проростках пшеницы в ответ на ацетат кадмия (рис. 4), можно было ожидать, что дегидрины задействованы в формировании защитных реакций растений пшеницы и при кадмиевом стрессе.

55 Кда 28 к Да

Рис. 7. Иммуноблоттинг термостабильных белков проростков пшеницы, предобработанных 5 мг/л флуридоном, подвергнутых воздействию 1 мМ ацетата кадмия в течение 24 ч (а), и денситометрия дегидринов относительно контроля (б). 1 - контроль; 2 - ацетат кадмия; 3 - флуридон + кадмий.

Рис. 7 демонстрирует существенные изменения в уровне иммунореактивных к антителам к К-сегменту полипептидов пшеницы в ответ на кадмиевый стресс. Инкубирование проростков на среде с 1 мМ ацетатом кадмия вызвало 1.5-кратное накопление дегидрина с М.м. 55 кДа, при этом присутствие флуридона слабо отразилось на его и так небольшом уровне, что указывает на то, что этот высоко

§ £ О. о

□ 28 кДа 055 кДа

чувствительный к холоду белок, скорее всего, не является участником эффективной защиты пшеницы при кадмиевом стрессе. Однако в спектре белков выявился высоко иммунореактивный полипептид с М.м. 28 кДа, содержание которого возросло в 3.5 раза в ответ на кадмий, а флуридон, хотя и не предотвратил, но существенно снизил его уровень в подвергнутых кадмию растениях (рис. 7), что указывает в пользу вовлечения дегидрина 28 кДа в развитие защитных реакций на этот стресс.

Таким образом, дегидрины являются важными компонентами защитных реакций растений пшеницы в отношении разных стрессовых факторов (гипотермия и кадмий), вызывающих окислительный стресс и обезвоживание. Об этом свидетельствуют данные по активации транскрипции гена ТАОНЫ дегидрина в ответ на низкотемпературный и кадмиевый стрессы, а также результаты иммуноблоттинга дегидринов, которые позволили выявить различия в спектре иммунореактивных к антителам, полученным к К-сегменту, дегидринов, отвечающих на эти стрессоры. Наибольшую чувствительность к гипотермии проявили дегидрины с М.м. 69 кДа и, особенно, 55 кДа, предположительно, белковый продукт ТАПНМ гена дегидрина, накопление которых в значительной мере обусловлено холод-индуцированным возрастанием уровня АБК. При этом 55 кДа дегидрин, вероятно, не является активным участником защиты при кадмиевом стрессе в отличие от высоко чувствительного к ацетату кадмия и ингибитору синтеза АБК дегидрина с М.м. 28 кДа.

Влияние салициловой кислоты на содержание дегидринов в проростках пшеницы, подвергнутых кадмиевому стрессу. В литературе накопилось немало сведений, указывающих на эффективность применения СК с целью снижения токсического действия ионов кадмия на разные культурные растения (Науа! й а!., 2010), что в целом отражается в поддержании ростовых процессов обработанных СК разных видов растений при кадмиевом стрессе на уровне близком контролю.

Основываясь на полученных данных о быстром транзиторном накоплении АБК в проростках пшеницы в ответ на обработку СК и поддержании повышенного уровня АБК в СК-предобработанных растениях в условиях засоления, было высказано предположение, что реализация предадаптирующего и протекторного

эффектов СК обусловлена регуляцией под её влиянием концентрации АБК (БЬаккоуа й; а!., 2003; БЬаклгоуа, 2007). Поскольку сама обработка проростков пшеницы СК, также как и воздействие кадмия, вызывает обусловленное накоплением АБК усиление транскрипции ТАВШ гена и накопление 28 кДа дегидрина (рис. 1, 4, 7), можно было ожидать изменений в уровне накопления дегидриновых белков в предобработанных СК в присутствии или отсутствие флуридона растениях, подвергнутых ацетату кадмия.

56 Кда 28 кДа

400

3 300 ™ 250 '§.200 й 150 100

и « 50

5-,

— Контроль ■ (СК)+С<!

" ___ -5-6. .

- х - (Фл+сю+са

Рис. 8. Иммуноблотпшг термостабильных белков предобработанных и необработанных 50 мкМ салициловой кислотой в присутствии флуридона и подвергнутых 1 мМ ацетату кадмия в течение 24 ч 5-сут проростков тиеншда и данные деиситомегрии дегидринов относительно контроля (а): 1 - Контроль; 2 - 4-сут проростки инкубировали 24 ч на среде с СК; 3 - 4-сут проростки инкубировали 24 ч на среде с кадмием; 4 - 3-сут проростки инкубировали 24 ч на среде с СК, после чего 4-сут растения переносили на 24 ч на среду с кадмием; 5 -3 сут проростки инкубировали 24 ч на смеси 0.5 мг/л флуридона и СК, после чего 4-сут растения переносили на 24 ч на среду с кадмием, а также содержание АБК в предобработанных СК в присутствии или отсутствие флуридона проростках в ходе воздействия ацетата кадмия (б).

Данные, приведенные на рис. 8, подтверждают это предположение. Видно, что сама обработка СК в течение 24 ч вызывает заметное увеличение содержания 28 кДа дегидрина. при этом существенных сдвигов в уровне дегидрина 55 кДа относительно контроля не выявлено, хотя СК индуцирует АБК-опосредуемое усиление транскрипции гена ТАИНК, правда, транзиторное (рис. 4). В то же время предобработанные СК проростки характеризуются существенно меньшим уровнем вызываемого кадмием накопления дегидринов с М.м. 28 кДа и 55 кДа относительно необработанных СК, что вероятно, является следствием уменьшением уровня стресс-индуцированного накопления АБК в этих растениях

(рис. 8 а,б). В предобработанных СК совместно с флуридоном растениях наблюдается как предотвращение вызываемого кадмием накопления АБК, так и торможение повышения уровня обоих дегидринов (рис. 8), что указывает на важную роль поддержания повышенной концентрации эндогенной АБК в регуляции защитного действия СК на растения пшеницы. О проявлении протекторного эффекта СК на растения в условиях кадмиевого стресса и роли эндогенной АБК в его реализации, в частности, можно судить по данным митотической активности клеток кончиков корней (рис. 9).

Рис. 9. Митотический индекс корней предобработанных и необработанных СК в присутствии или отсутствие флуридона 4-сут проростков пшеницы,

подвергнутых 1 мМ ацетату кадмия в

контроль ск cd (CK)+Cd (Фтск) +cd течение 7 ч

Таким образом, полученные данные указывают на вовлечение дегидринов в развитие предадаптирующего действия СК к возможным стрессовым ситуациям в ходе обработки в норме, обусловленного СК-индуцированным накоплением АБК, и реализацию защитного эффекта в СК-предобработанных проростках при кадмиевом стрессе, связанного с поддержанием повышенного уровня АБК в них. Влияние 24-эпибрассинолида на уровень дегидринов в растениях пшеницы в норме и при кадмиевом стрессе. К настоящему времени хорошо известно о ярко выраженном защитном эффекте БС на растения при воздействии гипо- и гипертермии, засухи, засоления, кадмия и других ТМ (Kagale et al, 2007; Bajguz, Hayat, 2009; Hayat et al, 2010; 2012). Поэтому не удивительно, что важный вклад в реализацию протекторного действия БС на растения вносит активация под их влиянием синтеза и накопления ключевых осмопротектантов, таких как пролин и дегидрины (Deng et al., 2007; Hayat et al., 2010; Rady, 2011; Li et al., 2012), поскольку и пролин, и дегидрины вовлечены также в нейтрализацию избытка АФК (Szabados, Savoure, 2009; Нага, 2010), резкое усиление продукции которых обычно происходит при стрессе.

Ранее в нашей лаборатории была выявлена обратимая активация транскрипции ТЛВНМ гена дегидрина в проростках пшеницы в ходе обработки ЭБ, наблюдаемая на фоне отсутствия изменений в уровне эндогенной АБК, что свидетельствует в пользу реализации ЭБ альтернативных АБК путей регуляция этого процесса (Аллагулова и др., 2007). В то же время и СК, также сочетающая в себе свойства рост-стимулятора и индуктора стресс-устойчивости, в том числе к кадмию, вызывает транзиторное накопление транскриптов ТАОНН дегидрина, которое, однако, обусловлено вызываемым СК накоплением АБК, предшествующим индукции транскрипции 7Ж>#Лггена (рис. 1). Таким образом, и ЭБ, и СК включают в развитие своего предадаптирующего действия на растения пшеницы активацию транскрипции гена ТАЙНЫ депщрина, хотя цуги гормональной регуляции этого процесса различаются. Для оценки вклада дегидринов в формирование защитного действия ЭБ и значения эндогенной АБК в регуляции их уровня был проведен анализ уровня этих белков в предобработанных и необработанных ЭБ в присутствии флуридона проростках пшеницы, подвергнутых кадмиевому стрессу, результаты которого приведены на рис. 10.

600

^ о. 500

сг 5 о

X со 300 .

с; с

си 200 -

100

□ 28 «Да

3 55кДа

А,

ЭБ С<1 (Фл)+Сс) (ЭБ)+СЙ (Фл+ЭБ)+Сй

Рис. 10. (а). Иммуноблоттинг термостабильных белков предобработанных и необработанных в течение 24 ч 400 яМ 24-эпибрассинолидом в присутствии или отсутствие флуридона и подвергнутых кадмию в течение 24 ч 5-сут проростков и данные денситометрии дегидринов относительно контроля, (б). Этнический индекс корней 4-суг предобработанных и необработанных ЭБ проростков пшеницы при воздействии ацетата кадмия втетаие7ч.

Можно видеть различия в ответе исследуемых дегидринов как на саму обработку ЭБ, так и на кадмий необработанных и предобработанных ЭБ растений.

Так, наиболее реактивным в ответ на обработку ЭБ оказался дегидрин 28 кДа (также как и обработку СК), содержание которою возрастало вдвое на фоне отсутствия значимых изменений в уровне белка с Мм. 55 кДа Причем во всех вариантах опыта с кадмием, в том числе в присутствии флуридона, содержание дегидрина 55 кДа было относительно низким и в целом поддерживалось на одном уровне (рис. 10а). Кадмий индуцировал более чем 3.5-кратное накопление белка с М.м. 28 кДа. Такой ответ является характерным для дегидринов на воздействие разных ТМ, вызывающих в растениях усиление транскрипции генов дегидринов и накопление их белковых продуктов, поскольку для некоторых из них хорошо продемонстрированы металл-связывающие свойства благодаря наличию у них гистидин-богатых доменов (Нага, 2010; Напт й а1., 2011; Нага е1 а1., 2013). При этом предобработка флуридоном существенно снизила, но не предотвратила кадмий-индуцированное накопление дегидрина М.м. 28 кДа (рис. 10а), что указывает на реализацию также и независимых от эндогенной АБК путей контроля содержания этого дегидрина при данном стрессовом воздействии. Интересно отметить, что в предобработанных ЭБ растениях в условиях кадмиевого стресса, в отличие от действия СК, наблюдается дополнительное накопление 28 кДа дегидрина (рис. 10а), при этом предобработка проростков ЭБ способствует повышению устойчивости пшеницы к кадмию, о чем свидетельствуют данные о предотвращении стресс-индуцированного ингибирования митотической активности клеток корней (рис. 106). Таким образом, нами выявлена способность ЭБ вызывать двукратное увеличение содержания дегидрина 28 кДа в норме и дополнительное его накопление в ЭБ-предобработанных проростках пшеницы при кадмиевом стрессе, что указывает о вовлечении дегидринов в проявление протекторного эффекта ЭБ на растения.

Суммируя полученные результаты, можно заключить, что дегидрины, относящиеся к разряду АБК-контролируемых белков, вносят важный вклад в формирование предадаптирующего к возможным неблагоприятным воздействиям, вызывающим обезвоживание, и протекторного эффектов фитогормонов БАП, СК, ЭБ на проростки пшеницы. Использование в работе флуридона позволило впервые выявить реализацию под влиянием разных гормонов зависимых и независимых от

эндогенной АБК путей регуляции уровня дегидринов в растениях в норме и при стрессе.

ВЫВОДЫ

1. С использованием ингибитора синтеза АБК флуридона получены приоритетные данные о различии путей регуляции цитокинином БАЛ и салициловой кислотой накопления транскриптов ТАЙНЫ гена дегидрина в растениях пшеницы: БАП в зависимости от действующей концентрации способен регулировать этот процесс через вызываемое им накопление АБК, так и независимо от эндогенной АБК, тогда как СК - лишь опосредовано через АБК.

1. Обнаружена высокая чувствительность гена дегидрина ТАЙНЫ к воздействию гипотермии и токсических ионов кадмия на проростки пшеницы. В условиях холодового стресса выявлено наличие как АБК-опосредуемых, так и независимых от АБК путей регуляции транскрипции гена ТАЙНЫ дегидрина, тогда как в условиях ацетата кадмия активация транскрипции гена обусловлена кадмий-индуцированным накоплением АБК.

3. В спектре термостабильных полипептидов подвергнутых холодовому стрессу проростков пшеницы максимальную иммунореактивность к антителам, полученным к К-сегменту дегидринов, в корнях и, особенно, в побегах проявил белок с М.м. 55 кДа, что указывает в пользу участия этого дегидрина в специализированной системе защиты растений к гипотермии. Предобработка растений флуридоном заметно снизила, но не предотвратила стресс-индуцированное увеличение уровня данного дегидрина в побегах, что указывает на наличие как АБК-, так и опосредуемых холодом путей регуляции его содержания в условиях гипотермии.

4. Воздействие 1 мМ ацетата кадмия на проростки пшеницы вызвало более чем трех-кратное накопление дегидрина с М.м. 28 кДа. Флуридон существенно уменьшил, но не предотвратил накопление этого белка при стрессе.

5. Выявлены принципиальные различия в характере количественного ответа дегидрина 28 кДа у обработанных СК и 24-эпибрассинолидом проростков пшеницы, подвергнутых кадмиевому стрессу. В предобработанных СК проростках наблюдается существенное уменьшение вызываемого кадмием уровня накопления

дегидрина в сравнении с необработанными, вероятно,

обусловленное пониженным стресс-индуцированным увеличением концентрации АБК в этих растениях, тогда как в предобработанных ЭБ проростках происходит дополнительное накопление 28 кДа дегидрина, важный вклад в контроль которого вносят независимые от эндогенной АБК пути регуляции его содержания.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК МОП РФ

Ключникова Е.О., Аллагулова Ч.Р., Авальбаев A.M., Гималов Ф.Р., Шакирова Ф.М. Гормональная регуляция транскрипции TADHN гена дегидрина в растениях пшеницы // Вестник Башкирского Университета. 2012. Т. 17. №3. С. 983-988.

Масленникова Д.Р., Фатхутдинова P.A., Безрукова М.В., Аллагулова Ч.Р., Ключникова Е.О., Шакирова Ф.М. Механизмы протекторного действия салициловой кислоты на растения пшеницы в условиях кадмиевого стресса // Агрохимия. 2013. №3. С. 72-79.

Публикации в сборниках и материалах конференций

Allagulova Ch., Klyuchnikova Е., Lastochkina О., Avalbaev A., Yuldashev R., Shakirova F. Regulation of TADHN dehydrin gene expression by cytokinin 6-benzylaminopurine in wheat plants // Abstracts XVIII FESPB Congress. Valencia, Spain, 2010. P. 147.

Ключникова E.O., Худайдатова Э.Р. Участие TADHN гена дегидрина в формировании АБК-контролируемых защитных реакций проростков пшеницы в ответ на воздействие кадмия //Биомика. 2011. Т. 1. № 2. С. 54-55.

Аллагулова Ч.Р., Ключникова Е.О., Авальбаев A.M., Сомов К.А., Юлдашев P.A., Шкильдина И.Н., Шакирова Ф.М. Регуляция цитокинином 6-бензиламинопурином уровня осмопротектантов дегидрина и пролина в растениях пшеницы // В сб. «Биостимуляторы в медицине и сельском хозяйстве». РицБашГУ: Уфа. 2011.г. С. 164-168.

Ключникова Е.О., Бурханова Г.Ф., Аллагулова Ч.Р., Авальбаев A.M., Максимов И.В., Шакирова Ф.М. Участие 24-эпибрассинолида в регуляции экспрессии генов защитных белков в проростках пшеницы // В сб. "Физиология

растений - фундаментальная основа экологии и инновационной

биотехнологии». Нижний Новгород. 2011. С. 341-342.

Аллагулова Ч.Р., Ключникова Е.О., Шкильдина И.Н., Шакирова Ф.М. Роль эндогенной АБК в регуляции салициловой кислотой экспрессии TADHN гена дегидрина в растениях пшеницы // Там же. С. 44-45.

Ключникова Е.О., Аллагулова Ч.Р., Юлдашев Р.А., Авальбаев A.M., Шакирова Ф.М. Исследование роли абсцизовой кислоты в накоплении дегидрин-подобных белков в растениях пшеницы при гипотермии // Биомика. Т. 3. №1. 2012. С. 52-54.

Klyuchnikova Е., Allagulova Ch., M.V. Bezrukova, A.M. Avalbaev, F.M. Shakirova. ABA-mediated TADHN dehydrin gene expression in wheat seedlings under exposure to cadmium toxic ions // Abstracts XIX FESPB Congress. Freiburg, Germany. 2012. P. 656.

Аллагулова Ч.Р., Ключникова E.O., МасленниковаД.Р., Шакирова Ф.М. Роль эндогенной АБК в регуляции салициловой кислотой уровня 28 кДа дегидрина в растениях пшеницы в условиях кадмиевого стресса // Материалы VI Российского Симпозиума «Белки и пептиды». Уфа. 2013. С. 142.

Klyuchnikova Е., Allagulova Ch., Maslennikova D., Avalbaev A., Yuldashev R., Shakirova F. Regulation of 28 kD dehydrin content in wheat plants by 24-epibrassinolide under cadmium stress // Abstracts of 38th FEBS Congress. Saint Petersburg, Russia. 2013. P. 234.

Allagulova Ch., Klyuchnikova E., Maslennikova D., Shakirova F. Role of endogenous ABA in the regulation of 28 kD dehydrin in wheat plants under cadmium stress //Abstracts of 25th SPPS Congress. Helsingor, Denmark. 2013. P. 61.

Автор выражает глубокую благодарность своему научному руководителю проф. Ф.М. Шакировой, а также сотрудникам лаборатории молекулярных механизмов устойчивости растений к стрессам к.б.н. Ч.Р. Аллагуловой, к.б.н. A.M. Авальбаеву, к.б.н. Д.Р. Масленниковой, к.б.н. Р.А. Юлдашеву, к.б.н. М.В. Безруковой, к.б.н. Р.А. Фатхутдиновой за неоценимую поддержку, постоянное внимание к работе и помощь в ходе ее выполнения, а также обсуждения и описания результатов.

Подписано в печать 06/11/13. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать ризографическая. ТираЮО экз. Заказ 1170. Гарнитура «Ите5№\у11отап». Отпечатано в типографии «ПЕЧАТНЫЙ ДОМЪ» ИП ВЕРКО. Объем 1 пл. Уфа, Карла Маркса 12 корп. 5. т/ф: 8(347) 27-27-600, 27-29-123

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ключникова, Екатерина Олеговна, Уфа

На правах рукописи

04201453058

КЛЮЧНИКОВА ЕКАТЕРИНА ОЛЕГОВНА

ГОРМОНАЛЬНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ УРОВНЯ ДЕГИДРИНОВ В РАСТЕНИЯХ ПШЕНИЦЫ В УСЛОВИЯХ ОБЕЗВОЖИВАНИЯ

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

03.01.05 - физиология и биохимия растений

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор

Ф.М. Шакирова

УФА-2013

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 5

ВВЕДЕНИЕ 6

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10 Дегидрины как обширный класс II LEA белков и их роль в устойчивости растений к обезвоживанию

1.1. Роль LEA белков в жизни растений 11 1.1.1. Классификация LEA белков 15 LEA-белки класса I 16 LEA белки класса III 16 LEA белки класса IV 17 LEA белки класса V 18 Атипичные LEA белки 18

1.2. Дегидрины - LEA белки класса II 19 Первичная структура 19 Вторичная и третичная структура 21

1.2.1. Структурные особенности дегидринов и их функции 24 Тип YnSK2 24 Тип KnS 25 Тип SKn 26 Тип К„ 28 Тип Y2Kn 28

1.2.2. Распространение дегидринов 29 1.2.2.1. Локализация дегидринов в растениях 31 Внутриклеточная локализация дегидринов 31 Локализация дегидринов в растительных тканях в норме и при стрессе 33

1.3. Роль дегидринов в защитных реакциях растений 34

1.3.1. Сигнальная регуляция транскрипции генов дегидринов 34

1.3.2. Молекулярные механизмы защитного действия дегидринов 35

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 43

2.1 Объект исследования 43

2.2 Постановка лабораторных опытов 43

2.3 Анализ ростовых процессов 44 2.3.1 Определение митотической активности меристематических 44

клеток корней проростков пшеницы

2.4. Экстрагирование АБК 45

2.5. Определение содержания АБК методом ИФА 45

2.6. Определение концентрация пролина 46

2.7. Определение содержания кадмия в растительных тканях 47

2.8. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей 47

2.9. Полимеразная цепная реакция 47

2.10. Выделение и очистка РНК из растений 48

2.11. Реакция обратной транскрипции РНК и полуколичественный 49 анализ транскрипции генов

2.12. Электрофорез фрагментов ДНК в агарозном геле 49

2.13. Экстракция белков из растительного материала 50

2.14. Определение концентрации белков 50

2.15. Электрофорез белков в денатурирующих условиях 50

2.16. Вестерн-блоттинг 51

2.17. Определение молекулярной массы белков 53

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 54

3.1. Подбор праймеров к генам дегидринов пшеницы, имеющихся в 54 Генбанке

3.2. Регуляция транскрипционной активности гена ТА ОНИ дегидрина в 58 проростках пшеницы

3.2.1. Гормональная регуляция транскрипции ТА О ИМ гена дегидрина 5 9

АБК 59

БАП 61

ск

3.2.2. Регуляции транскрипции ТАБНЫгена дегидрина в растениях 66

пшеницы, подвергнутых стрессу Низкотемпературный стресс Воздействие токсических ионов кадмия

3.3. Иммуноблоттинг дегидринов пшеницы 3.3.1. Роль эндогенной АБК в регуляции холод-индуцируемого

накопления дегидринов в проростках пшеницы

3.3.2. Анализ уровня дегидринов в проростках пшеницы в условиях 81 кадмиевого стресса

3.3.3. Влияние салициловой кислоты на содержание дегидринов в 84 проростках пшеницы, подвергнутых кадмиевому стрессу

3.3.4. Влияние 24-эпибрассинолида на уровень дегидринов в 91 растениях пшеницы в норме и при кадмиевом стрессе

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

103

106

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АБК - абсцизовая кислота

БАП - 6-бензиламинопурин

БС - брассиностероиды

ИФА - иммуноферментный анализ

МИ - митотический индекс

ПЦР - полимеразная цепная реакция

СК - салициловая кислота

ЦК - цитокинины

ЭБ - 24-эпибрассинолид

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность. К наиболее широко распространенным в мире повреждающим факторам среды, приводящим к обезвоживанию, существенному торможению ростовых процессов растений, потере урожая и его качества, относятся засуха, гипотермия, засоление, а в связи с ростом техногенного загрязнения окружающей среды также воздействие избыточных концентраций солей тяжелых металлов (ТМ). Известно, что эти стрессы часто взаимосвязаны и индуцируют общие сигнальные пути регуляции клеточных ответов, направленных на адаптацию, и вызывают в растениях сходные морфологические, физиоло-биохимические, молекулярно-генетические изменения (DalCorso et al., 2008; Munns, Tester, 2008; Potters et al., 2009; Des Marais, Juenger, 2010; Winfield et al., 2010; Shakirova et al., 2010; 2012; 2013).

К числу универсальных реакцией растений в ответ на эти стрессовые воздействия, вызывающие обезвоживание, относится усиление биосинтеза АБК и её накопление (Rock et al., 2010). В основе реализации регуляторного действия АБК в формировании стресс-устойчивости растений лежит индукция экспрессии АБК-чувствительных генов. О ключевой роли АБК в регуляции защитных реакций к неблагоприятным факторам, приводящим к нарушению водного режима, свидетельствуют данные о том, что из почти двух тысяч индуцируемых засухой генов в Arabidopsis thaliana около 1300 находятся под контролем АБК (Huang et al., 2008). К таковым, в частности, относятся гены белков дегидринов, присущим всем таксономическим группам царства растений (Close, 1997; Аллагулова и др., 2003; Kosovâ et al., 2010; Hanin et al., 2011). Массированная аккумуляция дегидринов наблюдается в зародышах семян в период их обезвоживания, однако резкое усиление экспрессии генов дегидринов и накопление их белковых продуктов регистрируется в тканях вегетирующих растений, подвергнутых обезвоживанию, а среди индуцируемых в этих условиях стрессовых белков

дегидрины наиболее многочисленны (Аллагулова и др., 2003; Нага, 2010; Kosova et al., 2011). Физико-химические свойства дегидринов, особенности строения, в том числе обязательное наличие 15-аминокислотного К-сегмента, способного к формированию вторичной амфифильной а-спирали, свидетельствуют в пользу их участия в защите биополимеров от денатурации, в сохранении целостности клеточных структур и стабилизации мембран в условиях обезвоживания (Аллагулова и др., 2003; Kosova et al., 2010; Нага, 2010).

Индукция экспрессии генов дегидринов и накопление их белковых продуктов происходит в растениях и в нормальных условиях при обработке АБК (Close, 1997; Шакирова и др., 2005; Аллагулова и др., 2007). Чувствительность генов дегидринов к АБК и разным стрессовым факторам определяется наличием в их промоторах различных взаимодействующих друг с другом комбинаций i/wc-регуляторных элементов, взаимодействующих с разнообразными АБК-индуцируемыми трансфакторами (Shinozaki, Yamaguchi-Shinozaki, 2007; Chung, Parish, 2008; Шакирова и др., 2009; Hanin et al., 2011). Вместе с тем, сведения об активации транскрипции TADHN гена дегидрина в проростках пшеницы в ответ на обработку 24-эпибрассинолидом (ЭБ) на фоне отсутствия изменений в концентрации АБК (Аллагулова и др., 2007) свидетельствуют о реализации независимых от эндогенной АБК путях гормональной регуляции уровня дегидринов в растениях. Полученные данные дают основание предполагать участие и других фитогормонов, сочетающих в себе ярко выраженные свойства стимуляторов ростовых процессов и индукторов устойчивости к стрессовым факторам, вызывающим обезвоживание, в регуляции транскрипции генов и количественного уровня дегидринов и значении этих белков в реализации их протекторного действия на растения. Цель и задачи исследовании. Цель работы заключалась в изучении механизмов гормональной регуляции уровня дегидринов в растениях

пшеницы, подвергнутых воздействию стрессовых факторов, вызывающих дефицит влаги. Для решения цели были поставлены следующие задачи:

1) для оценки вовлечения дегидринов в реализацию предадаптирующего действия цитокинина 6-бензиламинопурина (БАП) и салициловой кислоты (СК) провести анализ влияния этих гормонов на активность транскрипции ТАБНЫ гена дегидрина пшеницы в проростках в присутствии или отсутствие ингибитора синтеза АБК флуридона;

2) исследовать динамику транскрипции гена ТАОНМ дегидрина в растениях в ходе воздействия гипотермии и кадмиевого стресса и оценить вклад эндогенной АБК в регуляцию этого процесса;

3) с использованием антител к К-сегменту дегидринов исследовать спектр иммунореактивных белков в корнях и побегах предобработанных и необработанных флуридоном проростков пшеницы в условиях низкотемпературного стресса;

4) с использованием вестерн-блот-анализа провести оценку спектра дегидринов и их количественного уровня в предобработанных и необработанных флуридоном растениях, подвергнутых кадмиевому стрессу;

5) методом иммуноблоттинга провести анализ уровня дегидринов в предобработанных СК и ЭБ в присутствии или отсутствие флуридона проростках пшеницы, подвергнутых воздействию ацетата кадмия. Научная новизна. С использованием ингибитора синтеза АБК флуридона получены приоритетные данные о реализации как зависимых, так и независимых от эндогенной АБК путей регуляции активации транскрипции ТАОНМ гена дегидрина в растениях пшеницы, обработанных СК или БАП в разных концентрациях. Впервые на растениях пшеницы показано сочетание АБК- и холод-индуцируемых путей регуляции экспрессии гена ТАЙНЫ дегидрина и накопления дегидриновых белков в растениях пшеницы при гипотермии. Выявлен важный вклад дегидринов в проявление протекторного эффекта СК и ЭБ на растения пшеницы в условиях кадмиевого стресса, при этом реализация их регуляторного действия на уровень дегидринов

различается: ЭБ, в отличие от СК, проявляет независимую от эндогенной АБК способность к индукции накопления дегидринов.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Дегидрины как обширный класс II LEA белков и их роль в устойчивости растений к обезвоживанию

В процессе эволюции в растительных организмах выработался и закрепился комплекс защитных механизмов, направленных на адаптацию к изменяющимся условиям произрастания. Устойчивость растений к стрессовым факторам, обеспечивается сложными многомерными механизмами, основе которых лежат биохимические и физиологические модификации, отражающиеся в изменении в экспрессии большого ряда генов. К таковым стресс-индуцируемым генам относят гены, кодирующие транскрипционные факторы, ферменты синтеза осмопротектантов и детоксификации, антифризные белки, шапероны, ферменты фосфолипидного метаболизма, белки позднего эмбриогенеза и многие другие белки с различными известными и пока не известными функциями (Bray, 1997; Thomashow, 1999; Svenson, 2002; Winfield et al., 2010). Важным звеном в защитных реакциях растений в условиях абиотических стрессов, многие из которых вызывают нарушение водного обмена, является синтез гидрофильных белков.

Несмотря на то, что влагообеспеченность является главным фактором, лимитирующим рост и продуктивность растений, ряд физиологических процессов, сопровождающихся снижением водного статуса клеток, характерен для нормального хода онтогенеза, как например, созревание семян, холодовая акклиматизация, формирование морозоустойчивости. Такие процессы, направленные на преодоление неблагоприятных условий среды, связаны с реализацией программированной экспрессии специфических генов, ключевая роль в регуляции которой принадлежит фитогормону абсцизовой кислоте (Rock et al., 2010; Zhu et al., 2011; Chen et al., 2013). К таковым, в частности, относятся гены, кодирующие белки позднего эмбриогенеза или LEA (late embryogenesis abundant) белки, специфически экспрессирующиеся в этот период онтогенеза. В пользу участия LEA белков в формировании

стресс-устойчивости растений указывают факты об активации транскрипции кодирующих их генов и данные о накоплении этих белков в тканях вегетирующих растений при обработке АБК, а также при воздействии абиотических стрессовых факторов, повреждающий эффект которых включает компонент обезвоживания (Dure, 1993; Shinozaki, Yamaguchi-Shinozaki, 2007; Dalai et al., 2009).

1.1. Роль LEA белков в жизни растений

Вода - важнейший компонент живого организма. Обезвоживание приводит к значительным физическим и химическим изменениям в клеточной архитектуре, структуре макромолекул, которые в конечном итоге могут повлечь гибель клетки. Однако некоторые организмы выработали приспособления, позволяющие переживать потери до 99% воды, сохраняя при этом жизнеспособность. Ткани с низким содержанием воды встречаются как у растений, так и в животном царстве, как например, семена или пыльца растений, дрожжевые клетки, споры грибов, нематод, коловраток и некоторых ракообразных (Alpert et al., 2006). Ортодоксальные семена или пыльцевые зерна высших растений в соответствующих условиях могут сохранять способность к воспроизведению годами, десятками или даже сотнями лет (Hoecstra et al., 2001). Листья и корни плауна наскального Lycopodium rupestris способны обезвоживаться до 10% и возобновлять метаболизм и жизненный цикл после регидратации (Bartels et al., 2005).

Устойчивость растений к обезвоживанию обуславливается формированием сложного комплекса адаптивных реакций (Buitink, Leprince, 2004; Alpret, 2006: Vasquez-Robinet et al., 2008; Des Marais, Juenger, 2010), включающих изменения структуры или состава клеточной стенки, органелл, органов (Zhu et al., 2007), индукцию защитных систем (Wilson, 2004; Shinozaki, Yamaguchi-Shinozaki, 2007; Nevo, Chen, 2010), нейтрализацию свободных радикалов (Miller et al., 2010), аккумуляцию компонентов со

свойствами осмопротектантов (Dure et al., 1989; Collins, Clegg, 2004; Nevo, Chen, 2010).

Ключевыми белками, вовлеченными в формирование устойчивости растений к обезвоживанию, являются LEA белки. Впервые эта группа белков была идентифицирована в зрелых зародышах пшеницы (Triticum aestivum) и хлопчатника (Gossypium hirsutum) (Galau, Dure, 1981). Для обозначения новой группы высокогидрофильных белков было предложено название "LEA", отражающее их массированное накопление в ходе естественного эмбриогенеза при обезвоживании семян, когда содержание LEA белков может достигать 4% от всех клеточных белков ( Galau, Dure 1981, Shin et al., 2008). Поскольку на этом этапе развития ортодоксальные семена приобретают способность выдерживать экстремальное обезвоживание и длительное время сохранять жизнеспособность, первоначально функции LEA белков связывали с развитием устойчивости растений к обезвоживанию. Так, в пшенице был выявлен Em-белок, стабильный в зрелых семенах, однако содержание мРНК которого существенно снижалось через несколько часов после прорастания (Galau, Dure, 1981; Galau et al, 1986; Dure, 1993). Анализ кДНК последовательности Em белка выявил его гомологию с последовательностью Dil Lea гена, выявленного в зрелых зародышах хлопчатника (Litts et al., 1987; Baker et al., 1988).

К настоящему времени идентифицированы сотни генов LEA белков в представителях высших и низших растений. Несмотря на то, что впервые LEA белки были обнаружены в связи формированием семян, большинство LEA генов чувствительны к АБК и индуцируются при воздействии стрессовых факторов, вызывающих обезвоживание. Более того, оказалось, что гидрофильные LEA-подобные белки характерны не только для растительных таксонов: они выявлены в бактериях Bacillus subtilis и Deinococcus radiodurans (Stacy, Aalen 1998; Battista et al., 2001), цианобактериях Anabaena sp. (Close, Lammers, 1993), дрожжах Saccharomyces cerevisiae (Sales et al., 2000), грибах, например, трюфеле Tuber borcbii (Abba

et al., 2006), и грибоподобных животных слизевиках (Eichinger et al., 2005). Кроме того, LEA-подобные белки характерны для различных видов беспозвоночных животных, способных в течение долгого времени сохранять жизнеспособность после практически полного обезвоживания тканей в состоянии ангидробиоза (потеря воды может достигать 90%): они были выявлены в круглых червях нематодах, первичнополостных, коловратках, ракообразных, артемииях, тихоходках и других (Alpert et al., 2006; Рупперт, 2008; Hand, et al, 2011; Hincha, Thalhamer, 2012). Предполагается, что устойчивость этих организмов к обезвоживанию может быть связана со способностью синтезировать LEA-подобные белки (Hand et al., 2011). В ряде видов растений показана корреляция между выживаемостью при водном дефиците и накоплением в их клетках LEA белков. Например, сверхэкспрессия генов, кодирующих LEA белки, в трансформантах риса коррелировала с высокой устойчивостью растений к водному дефициту (Cheng et al., 2002).

С самого начала обнаружения LEA белков было выдвинуто предположение об их важной роли в формировании устойчивости растений к обезвоживанию, на что указывают данные об их внутриклеточной локализации. Известно, что LEA белки обнаруживаются в разных компартментах клеток (хлоропласты (NDong et al., 2002), митохондрии (Borovskii et al., 2002; Grelet et al., 2005; Tolleter et al., 2007), цитоплазма (Alban et al., 2000; Heyen et al., 2002; Goyal et al., 2005b), вакуоли (Heyen et al., 2002), ядро (Goday et al., 1994; Houde et al., 1995)), в которых �

Информация о работе

Ключникова, Екатерина Олеговна
кандидата биологических наук
Уфа, 2013
ВАК 03.01.05

Диссертация

Гормональная регуляция уровня дегидринов в растениях пшеницы в условиях обезвоживания - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы