Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сигнальная регуляция экспрессии генов защитных белков растений при холодовом стрессе

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Сигнальная регуляция экспрессии генов защитных белков растений при холодовом стрессе"

На правахткописи

г правах ру^

ГИМАЛОВ ФУАТ РАМАЗАНОВИЧ

СИГНАЛЬНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ ЗАЩИТНЫХ БЕЛКОВ РАСТЕНИЙ ПРИ ХОЛОДОВОМ СТРЕССЕ

03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

2 8 АВГ 2014

Уфа-2014 005551975

005551975

Работа выполнена в лаборатории молекулярной биологии и нанобиотехнолотии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук

Научный консультант

Вахитов Венер Абсатарович доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты

Каримова

Фатима Габдуллазяновна доктор биологических наук, профессор

Топунов Алексей Федорович доктор биологических наук

Высоцкая Лидия Борисовна доктор биологических наук

Ведущая организация

Ведущий научный сотрудник лаборатории окислительно-восстановительного метаболизма ФГБУН Казанского института биохимии и биофизики Казанского научного центра Российской академии наук

Зав. лабораторией биохимии азотфиксации и метаболизма азота ФГБУН Института биохимии им. А.Н.Баха Российской академии наук

Ведущий научный сотрудник лаборатории физиологии растений ФГБУН Института биологии Уфимского научного центра Российской академии наук

ФГБУН Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН

¿0

Защита диссертации состоится » 014 г. в «,/0у> часов на

заседании Диссертационного совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 002.133.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук по адресу: 450054, Уфа, просп. Октября, д. 71. ИБГ УНЦ РАН

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться на сайте ИБГ УНЦ РАН (ibg.anrb.ra/dissov.html) и в Научной библиотеке Уфимского научного центра РАН (г. Уфа, просп. Октября, д. 71) e-mail: molgen(Sanrb.ru

Автореферат разослан «_»

2014 г.

Ученый секретарь />

диссертационного совета С М- Бикбулатова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Аюуальность темы. Растения в естественных условиях произрастания испытывают воздействие постоянно изменяющихся повреждающих факторов внешней среды физической, химической, биологической природы. Эффективность приспособления к ним зависит от слаженности функционирования систем регуляции метаболизма и синтеза белков, задействованных в стрессовом ответе и участвующих в сохранении биопотенциала растений (Chinnusamy et al., 2004). К таковым относятся как конститутивно синтезируемые белки, так и стрессовые белки, синтез которых в растениях в оптимальных условиях произрастания обычно не наблюдается, однако, они необходимы для сохранения целостности клеточных структур и поддержания жизненного потенциала растительных организмов в стрессовых условиях (Guy et al., 2008; Jiang et al., 2010). Вместе с тем, представления о сигнальной регуляции экспрессионной активности защитных генов в связи с формированием устойчивости растений пока далеки от ясности.

Температурный режим, напрямую связанный с водным обменом, относится к числу факторов среды, лимитирующих рост, развитие и продуктивность растений, и подвержен резким перепадам. В силу своей прикрепленное™ к месту обитания, растения вынуждены приспосабливаться к этим перепадам (Janska et al., 2009). В связи с этим исследование механизмов реализации устойчивости растений к гипотермии является одной из важнейших проблем современной науки о растениях.

Многие виды растений приобретают способность переносить значительное понижение температуры окружающей среды, если они предварительно проходят период так называемого закаливания, во время которого в клетках растений наблюдаются разнообразные биохимические перестройки, вызванные, в том числе, индукцией большого числа холод-индуцируемых генов (Thomashow, 1999, 2010). Исследования, направленные на выяснение изменений в экспрессии холод-индуцируемых генов, обусловленных воздействием холодового шока, выявили среди них как специфически экспрессируемые на холоду гены, так и гены, экспрессия которых индуцируется, наряду с низкой температурой, также и другими стрессовыми воздействиями, такими, как, например, дегидратация и солевой стресс (Kurkela, Frank, 1990; Yamaguchi-Shinozaki, Shinozaki, 1994; Dunn et al, 1994; Leung et al., 1998; Thomashow, 1999; 2003; Xiong et al., 2002; Kaniuga, 2008; Popko et al., 2010). Анализ уровня экспрессии генов с использованием полногеномных панелей показал, что холодовая акклимация, в частности, у арабидопсиса, включает изменения в уровне

3

экспрессии нескольких сотен генов, вызывающие значительные колебания в содержании многих клеточных метаболитов (Kaplan et al., 2004; Vogel et al., 2005; Kaplan et al., 2007). В формирование защитных реакций у растений вовлекаются также и некоторые конститутивно экспрессирующиеся белки, синтез и количество которых увеличивается при гипотермии (Shen et al., 1993).

К настоящему времени в литературе накопилось немало данных о возможных функциях белков холодового шока, которые отличаются большим разнообразием. Некоторые из них участвуют в преобразовании физико-химических свойств плазматических мембран, а также в фосфорилировании митохондриальных белков (Лось, 2010); другие повышают стабильность мембран и цитоскелета (Pokorna et al., 2004). Большую группу составляют гидрофильные белки, выполняющие криопротекторные функции (Middleton et al., 2009; Lauersen et al., 2011).

Установлена ключевая роль абсцизовой кислоты (АБК) в индукции синтеза стрессовых белков, протекторная функция многих из которых уже доказана (Kobayashi et al., 2006; Matsui et al., 2008). К ним относятся, в частности, дегидрины, обеспечивающие защиту биополимеров от денатурации, вызванной нарушением водного режима растений в условиях засухи, засоления и гипотермии (Hanin et al., 2011). Однако механизмы регуляции экспрессии генов дегидринов растений пока изучены недостаточно.

Вместе с тем, важная роль в развитии устойчивости растений к низким температурам принадлежит белкам растений, функционирующим и при нормальных условиях роста К ним можно отнести лектины, в частности, агглютинин зародыша пшеницы (АЗП), относящийся к семейству Rab-белков (Шакирова, 2001). Несмотря на детальное исследование его физико-химических свойств, физиологическая роль АЗП в растениях пшеницы дискутируется в литературе (Rudiger, Gabius, 2001; Шакирова, Берукова, 2007). Участие АБК в контроле экспрессии гена АЗП и регуляции количественного уровня АЗП в растениях пшеницы при стрессовых воздействиях дает основание предполагать вовлечение его в АБК-индуцируемые неспецифические реакции пшеницы в ответ на неблагоприятные воздействия абиотической природы. При этом все больше данных накапливается в пользу вовлечения и других фитогормонов в регуляцию устойчивости к абиотическим стрессам, вызывающим обезвоживание (Argueso et al., 2009; Hayat et al., 2010), в частности, брассиностероидов (Kagale et al., 2007).

Приспособление растений к стрессам предполагает наличие эффективного механизма восприятия и передачи сигналов из внешней среды. Показано, что развитие холодостойкости - комплексный признак, проявляющийся при слаженном действии различных систем растительного организма (Thomashow, 1999; Heidarvand, Amin, 2010). В настоящее время интенсивно исследуются отдельные этапы развития стрессового ответа (трансдукция сигнала, активация транскрипции генов, посттранскрипционные процессы) (Thomashow, 2010). Однако последовательность прохождения холодового сигнала и молекулярные механизмы этого процесса изучены недостаточно полно.

Это относится также к генам факторов транскрипции CBF (CRT /С-repeat/ -binding /actor) играющих ключевую роль в регуляции экспрессии многих COR (соМ-rcsponsive)-renoB, содержащих в промоторных областях одну или несколько копий последовательностей, обозначенных как DRE (í/ehydration-responsive element)/CRT цис-элементы. К настоящему времени получено немало данных, указывающих на существенные изменения показателей функционирования активных генов растений, подвергнутых воздействию абиотических стрессовых факторов (Sherman, Talbert, 2002; Madlung, Cornai, 2004; Чемерис и др., 2007; Choi, Sano, 2007; González et al., 2011). Так, холодовой стресс приводит к увеличению доли гетерохроматина и уменьшению доли эухроматина (Stepinski, 2012) и общему изменению степени метилирования ДНК растений (Steward et al., 2002). Однако особый интерес в связи с развитием устойчивости к гипотермии вызывают исследования изменений уровня метилирования конкретных чувствительных к холоду генов.

Несмотря на большой массив данных в этой области, еще не вполне ясно, что лежит в основе различий в уровне холодостойкости различных видов растений и усилении их холодостойкости в ходе закаливания. Решение этих принципиальных вопросов имеет не только фундаментальное значение для современной науки о растениях, но и важный прикладной характер для понимания механизмов развития холодоустойчивости культурных растений, что, в свою очередь, необходимо для эффективного управления этим процессом.

Цель исследования: выявление молекулярных механизмов восприятия и передачи холодового сигнала растительными клетками и вклада фитогормонов в регуляцию экспрессии генов белков, задействованных в формировании устойчивости растений к гипотермии.

В связи с этим были обозначены следующие задачи:

1. Клонирование гена белка холодового шока (БХШ) капусты Brassica oleracea L. CSP5 и гена дегидрина пшеницы TADHN, определение их первичной структуры.

2. Исследование транскрипции гена CSP5 капусты и гена дегидрина пшеницы TADHN в ходе гипотермии.

3. Выявление первичных этапов передачи сигнала о холодовом стрессе.

4. Анализ влияния АБК и 24-эпибрассинолида на транскрипционную активность генов CSP5 и гена дегидрина пшеницы TADHN.

5. Анализ вовлечения агглютинина зародыша пшеницы в развитие ответных реакций растений пшеницы на низкие положительные температуры и оценка его роли в защите растений от повреждающего действия стресса.

6. Определение нуклеотидных последовательностей промоторных областей генов CBF капусты и сравнительный анализ экспрессионной активности генов CBF у закаленных и незакаленных растений в норме и при холодовом стрессе.

7. Определение характера и степени метилирования промоторных последовательностей генов CBF растений в оптимальных температурных условиях, при пониженной температуре и в пост-стрессовый период. Научная новизна. Установлено, что значительная индукция экспрессии гена

аланин-богатого белка холодового шока капусты CSP5 и других видов растений семейства капустных наблюдается не только при гипотермии, но и при засухе и действии АБК, что указывает о вовлечении белка, кодируемого этим геном, в формирование неспецифических защитных реакций растений в ответ на стрессовые факторы, вызывающие нарушение водного режима.

Показано, что передача низкотемпературного сигнала из внешней среды, вызывающего стрессовый ответ растения, происходит многоступенчато. Начальными этапами процесса трансдукции холодового сигнала являются активация кальциевых каналов и увеличение потока ионов кальция в цитоплазму, сопровождаемое активацией кальций-зависимых протеинкиназ, которые, вероятно, в свою очередь, вызывают активацию факторов транскрипции, задействованных в экспрессии гена белка холодового шока капусты CSP5. В пользу этого свидетельствуют данные, полученные на протопластах и растениях капусты с использованием ингибиторного анализа.

Получены приоритетные данные об участии 24-эпибрассинолида (ЭБ) в активации экспрессии гена CSP5, что вносит важный вклад в реализацию защитного

действия ЭБ на растения капусты при гипотермии, которое проявляется в снижении уровня повреждающего действия холода на рост ЭБ-предобработанных растений и ускорении восстановления ростовых процессов в условиях холодового стресса. Полученные данные углубляют представления о структурно-функциональной организации генов БХШ высших растений, о процессах восприятия растениями холодового сигнала окружающей среды и некоторых общих механизмах адаптации растений к неблагоприятным условиям обитания.

Обнаружен важный вклад уровня метилирования промотора гена СВР капусты, являющегося ключевым элементом в запуске механизма развития устойчивости растений к холодовому стрессу, в регуляцию уровня его транскрипции в норме, гипотермии и закаливании: у растений, прошедших этап холодового закаливания, уменьшается степень метилирования последовательности ДНК промотора. Исследовано изменение статуса метилирования промоторной области гена СВР капусты после окончания цикла закаливания и показано частичное восстановление метилирования в ранее деметилированных участках промоторной области этого гена.

С использованием ингибиторного анализа выявлена ключевая роль обратимого стресс-индуцированного накопления АБК в регуляции экспрессии ТАйНЫ гена дегидрина в растениях пшеницы при холодовом стрессе. Впервые выявлен факт вовлечения ЭБ в независимую от эндогенной АБК регуляцию активации экспрессии ТАйНЫ гена дегидрина пшеницы.

Практическая значимость. Знание молекулярных механизмов регуляции генов транскрипционных факторов, контролирующих активность генов холодового ответа растений, может служить основой для развития новых стратегий усиления холодостойкости растений и увеличения их продуктивности, а также расширения зоны возделывания тех или иных сельскохозяйственных культур.

Результаты работы позволяют подойти к решению вопроса о способности различных гормонов - индукторов устойчивости - запускать экспрессию одних и тех же генов защитных белков, обосновать их роль в развитии защитных реакций в разные временные интервалы от момента воздействия стресс-факторов и определить их вклад в формировании общей и специфической устойчивости.

Выяснение механизмов изменения уровня экспрессии чувствительных к холоду генов в растительных клетках имеет потенциально большой практический интерес для получения устойчивых к холоду сортов с помощью технологии переноса тех или иных генов.

Полученные в ходе настоящего исследования данные вносят вклад в раскрытие механизмов реализации комплексной устойчивости растений и систем их регуляции, что необходимо для грамотного управления стресс-устойчивостью в растениеводстве.

Положения, выносимые на защиту:

1. Активация экспрессии гена белка холодового шока капусты CSP5 осуществляется в результате многоступенчатой передачи низкотемпературного сигнала из внешней среды. Начальными этапами являются активация кальциевых каналов и увеличение потока ионов кальция в цитоплазму, сопровождаемое активацией кальций-зависимых протеинкиназ, участвующих в активации факторов транскрипции, задействованных в экспрессии гена белка холодового шока капусты CSPS.

2. В формирование защитных реакций растений вовлекаются также некоторые конститутивно экспрессирующиеся белки, синтез и количество которых увеличивается при гипотермии, в частности, дегидрины и агглютинин зародыша пшеницы, что подтверждается усилением экспрессии генов этих белков при гипотермии.

3. Холодовое закаливание растений приводит к частичному деметилированию цитозинов в промоторном участке гена транскрипционного фактора CBF у растений капусты. При снятии стрессовых температурных условий часть деметилированных в процессе закаливания последовательностей промоторной области исследуемого гена метилируется вновь.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на XI, XIII и XIV конгрессах FESPB (Варна, 1998; Гераклион, 2002; Краков, 2004); IV съезде общества физиологов растений России (Москва, 1999), Международной конференции «Актуальные вопросы экологической физиологии растений в XXI веке» (Сыктывкар, 2001), III съезде биохимического общества. (Санкт-Петербург, 2002), V и VII съездах Общества физиологов растений (Пенза, 2003; Нижний Новгород, 2011); Международной конференции «Физиологические и молекулярно-генетические аспекты сохранения биоразнообразия» (Вологда, 2005); III Международной научно-практической конференции «Современные проблемы биологии, экологии и химии» (Запорожье, 2012).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 36 работ, из них 16 статей в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Структура н объем диссертации. Диссертация изложена на 262 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, описания

материалов и методов исследования, результатов исследования и обсуждения, заключения, выводов, списка литературы. Диссертация иллюстрирована 38 рисунками и 4 таблицами. Список литературы включает 541 источник.

ОБЪЕКТЫ II МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследований служили растения капусты огородной Brassica oleráceo L., цветной капусты (Brassica oleráceo var. boírytis L.) и пшеницы мягкой Triticum aestivum L.

Для исследования экспрессии гена белка холодового шока использовали капусту огородную Brassica oleráceo L. сорта Амагер 611. Образцы контрольных и опытных растений брали на стадии появления 4-го листа и переносили в среду, содержащую 2% сахарозы. Часть растений выращивали при температуре 7-8°С в течение 5 дней для закаливания. Растения, прошедшие и не прошедшие процесс акклимации, подвергали холодовому стрессу в течение 1-10 дней, после чего проводили измерения прироста биомассы и уровня содержания мРНК CSP5 в пробах.

Для исследования экспрессии генов CBF использовали цветную капусту сорта Альфа (В. oleráceo var. botrytis L.). Растения выращивали в грунте из вермикулита с добавлением среды Murashige and Skoog (1962) при 24°С, 16-часовом фото периоде и освещенности 15 кяк.

Схема опытов с закаливанием проростков представлена в таблице 1.

Таблица 1 - Условия проведения экспериментов

Группа Условия П| эоизрастания

Температурный режим Фаза роста и длительность

I. Нормальные температурные условия 24°С Стадия 4-го листа

II. Нормальные температурные условия / холодовой стресс 24°С Стадия 4-го листа

1°С 0,5-3 часа

III. Нормальные температурные условия / закаливание / холодовой стресс 24°С Стадия 4-го листа

7-8 °С 7 суток

1°С 0,25-24 часа

IV. Нормальные температурные условия / закаливание / нормальные температурные условия 24°С Стадия 4-го листа

7-8°С 7 суток

24°С 14 суток

Исследование экспрессии дегидрин-подобного гена ТЛОНЫ проводили на 4-сут проростках пшеницы ТгШсит аеяйуит Ь. сорта Жница. Семена после стерилизации 96%-ным этанолом проращивали на светоплощадке в течение 3-сут в кюветах на

9

фильтровальной бумаге, смоченной водопроводной водой, при 21-23°С, 16-часовом световом дне и освещенности 15 клк. После отделения эндосперма 3-х сут проростки корнями помещали в стаканы с раствором 2%-ной сахарозы в смеси 5 мг/л флуридона на сутки. Затем 4-х сут проростки переносили на свежую смесь 2%-ной сахарозы и 5 мг/л флуридона, часть из которых помещали в термостатированную камеру на 6°С, а другую оставляли при комнатной температуре. В ходе б ч опыта проростки фиксировали в жидком азоте по 15 шт. в каждой навеске для экстракции АБК и выделения РНК. Контролем служили проростки, инкубированные на растворе 2%-ной сахарозы при комнатной температуре.

Высокомолекулярную ДНК из растений выделяли фенольно-детергентным методом по Грехему (Graham, 1978), РНК - реагентом Trizol по рекомендациям фирмы-изготовителя (Invitrogen, США). кДНК получали с помощью набора, содержащего обратную транскриптазу M-MLV (Силекс, Россия). Плазмидную ДНК получали методами мягкого лизиса (Clewell, Helinski, 1969), быстрого щелочного лизиса (Birnboim, Doly, 1979) или с помощью наборов для выделения плазмидной ДНК (Цитокин, Россия) по протоколу фирмы-изготовителя. Подготовку и трансформацию компетентных клеток проводили по методике Коэна (Cohen, 1972). Аналитический гель-электрофорез нуклеиновых кислот проводили в 1-2%-ных агарозных или в 10-15%-ных полиакриламидных гелях. Элюцию ДНК из агарозных гелей проводили с использованием набора для очистки ДНК (Цитокин, Россия). Оценку степени метилирования ДНК проводили методом бисульфитной конверсии с помощью наборов EZ DNA Methylation Kit (Zymo Research, США) и MethylCode Bisulfite Conversion Kit (Invitrogen, США) по протоколам фирм-производителей. Изменения уровня метилирования анализировали с помощью программы СуМАТЕ (Hetzl et al., 2007). Определение нуклеотидных последовательностей ДНК проводили на автоматическом секвенаторе Genome-Lab фирмы Beckman Coulter (США). Сравнение нуклеотидных последовательностей осуществляли с помощью программы Megalign из пакета программ Lasergene (DNASTAR, Inc., США). Поиск возможных сайтов связывания транскрипционных факторов проводили с помощью программы PLACE (Higo et al, 1999; Prestridge, 1991). ПЦР проводили со стандартным набором реагентов в приборах МС2 (ДНК-Технология), ПЦР-РВ с использованием TaqMan проб и с переносом энергии от праймера к праймеру - на приборе iCycler iQ5 (Bio-Rad Laboratories, США). Среднее арифметическое значение уровня экспрессии 3-х независимых

экспериментов и стандартную ошибку среднего (SEM) находили с помощью модуля описательной статистики в программе Statistica 6.1 (StatSoft, Inc.). Сравнение экспериментальных групп проводили с использованием парного t-критерия Стьюдента для зависимых выборок (п = 3, р < 0,05). Нозерн-блот и дот-блот анализы проводили согласно стандартным протоколам (Sambrook et al., 1989). Радиоактивное мечение препаратов ДНК осуществляли с помощью у-[32Р] АТФ и полинуклеотидкиназы фага Т4 (Махаш, Gilbert, 1977), а также используя Кленовский фрагмент ДНК полимеразы I и соответствующий [а-32Р] дНТФ (Sambrook et al., 1989). Электрофорез белков проводили по методу Laemmli (1970) в полиакриламидном геле (ПААГ). Количество белка определяли по методу Бредфорд (Bradford, 1976). Определение активности протеинкиназ проводили по методу Киккава с сотр. (Kikkawa et al., 1983). Протопласты получали из 4-х недельных проростков капусты. Иммуноферментный анализ проводили, как описано у Хайруллина и др. (1993). Работа выполнена частично на оборудовании ЦКП «Биомика» (Отделение биохимических методов исследований и нанобиотехнологии РЦКП «Агидель») и УНУ «КОДИНК».

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Клонирование гена белка холодового шока капусты

Во время холодовой акклимации в клетках растений наблюдаются различные биохимические изменения. Наиболее существенным из них является синтез белков холодового шока, выполняющих разнообразные функции во время холодового стресса и адаптации к нему. Среди разнообразия индуцируемых во время холодовой акклимации так называемых COR (cold-regulated)-reHoe растений нами выбрана последовательность ДНК капусты, соответствующая охарактеризованному ранее гену белка холодового шока KIN 1 арабидопсиса (Kurkela, Franck, 1990).

Выбранную последовательность амплифицировали и клонировали в плазмидном векторе pGEM-T Easy (Promega, США). Амплификацию ДНК проводили, используя праймеры, синтезированные на основе гена KIN 1 БХШ арабидопсиса. Выбор праймеров, имеющих последовательности 5-AATGTCAGAGACCAACAAGAA-3' и 5'-TTCGGGTCAAATTTGGGA-3', был осуществлен с помощью компьютерной программы Lasergene (DNASTAR Inc., США). Определение нуклеотидной последовательности показало, что клонированный фрагмент ДНК, кодирующий ген БХШ капусты и обозначенный нами как CSP5, состоит из 600 пар оснований (GenBank ID17U497).

При сравнительном анализе нуклеотидных последовательностей CSP5 и сходных генов белков холодового шока арабидопсиса (Kurkela, Franck, 1990) и рапса (Orr et al., 1992) выявлено, что кодирующая область гена БХШ капусты высокогомологична кодирующим участкам сравниваемых генов, что свидетельствует о высокой консервативности аминокислотных последовательностей соответствующих белков (Рисунок 1).

I ATG GCA GAG ACG ААС AAG GCT AGC TTC CAA GCC GGT CAA GCC GCT GGT CGT GCT GA 1

... T.......с......AA. GC...............g A.......с AAA.....2

........С.........CAG.....................T.............3

II G GAG AAG TCT AAT GTG CTG ATG GAC AAG GTC AAG GAT GCT GCT ACC TCT GCT GGA

.......AGC.....t ... С.........С............aG.TGG.......

.......GG..................................G.A.........

GCG TCT GCT CAA AC 1 . . t GGA . . a.....2

.....g..... 3

III G GCA GGA CAG AAG ATA TCG GAG ACC GCA GGG GGA GCT GTT AAT GTT GTG AAG GAG

. ..g ... A.. .GT G.......t G.G ... .C.....G......с T.С........с

с . .g............A.....G.G...........с......С.С.........

AAG ACC GAC CTG CAG GCA 1

.......G. ... A.. AAG 2

.......G. A.. A.С AAG 3

Рисунок 1. Сравнение нуклеотидных последовательностей кодирующих участков генов белков холодового шока растений семейства капустных: 1. Brassica oleracea; 2. Arabidopsis thaliana; 3. Brassica napus. I, II. III - экзоны. Строчными буквами указаны замены нуклеотидов, не вызывающие изменения в аминокислотной последовательности.

По аналогии с последовательностью гена БХШ арабидопсиса в данном фрагменте были определены первый (56 п.н.), второй (69 п.н.) и третий (72 п.н.) экзоны, разделенные двумя нитронами, состоящими из 283 п.н. и 120 п.н., соответственно (Рисунок 2, а). Анализ нуклеотидной последовательности клонированного гена капусты показал отличительные особенности кодирующей и некодирующей областей гена. Интроны являются АТ-богатыми (около 70% для второго интрона), что характерно в целом для интронов растительных генов. Экзоны, напротив, являются GC-богатыми, что в свою очередь определяет преимущественный аминокислотный состав кодируемого белка.

Анализ выведенной аминокислотной последовательности белка холодового шока капусты выявил довольно высокое содержание аланина (около 20%), лизина (около 13%) и глицина (около 11%), которые распределены неравномерно по длине

белка и сконцентрированы в трех аланин-глицин-богатых участках, при этом самым протяженным является участок, находящийся в середине полипептидной цепи.

Рисунок 2. Структура гена белка холодового шока (CSP5) (а) и белка холодового шока (б) капусты (Brassica oleráceo). А. сс-спиральные участки; Б. ß-складчатые участки; В. Гидрофильные участки, Г. а-амфипатические участки.

Как показал компьютерный анализ, данный белок является гидрофильным и имеет альфа-спиральную структуру, но на фоне общей гидрофильности были выявлены три относительно гидрофобных участка, совпадающие с аланин-глицин-богатыми фрагментами белка (Рисунок 2, б).

Проведенное нами сравнение известных аминокислотных последовательностей БХШ арабидопсиса KIN1 (Kurkela, Franck, 1990) и рапса BN28 (Orr et al., 1992) с последовательностью CSP5 капусты показало их высокую гомологию (Рис. 3), достигающую 70% в первом случае и 79% - во втором.

MAETNKASFQAGQAAGRAEEKSNVLMDKVKDAATSAGAS AQTAGQKISETAGGAVNWKEKTDLQA 1 ** ** ****** * **** *** ** **** ******* ** * * * ** ** ***

MAETNKNAFQAGQAAGKAEEKSNVLLDKAKDAAAAAGASAQQAGKSISDAAVGGVNFVKDKTGLNK 2 ** ** ****** * **** *** ** **** ******* ** * * * ** ** ***

MAD-NKQSFQAGQASGRAEEKGNVLMDKVKDAATAAGASAQTAGQKITEAAGGAVNLVKEKTGMNK 3

Рисунок 3. Сравнительный анализ выведенных аминокислотных последовательностей БХШ капусты CSP5 (1), арабидопсиса KIN1 (2) и рапса BN28 (3).

Имеющиеся замены отдельных аминокислот сводятся главным образом к нефункциональным заменам на сходные аминокислоты, как, например, аланин на глицин, треонин или наоборот, за исключением трех аминокислот в С-концевой части белка.

Kurkela и Franck (1990) на основании определенного сходства аминокислотных последовательностей KIN1 арабидопсиса и некоторых малых антифризных белков (AFP) арктических рыб (Hew et ai., 1986), составляющего 28 %, а также их малого размера, высокого содержания неполярных аминокислот и сс-спиральной вторичной структуры, предположили, что данный белок относится к семейству антифризных апанин-богатых белков, действие которых заключается в сдерживании образования внутриклеточного льда.

Экспрессия гена CSP5 капусты при холодовой акклимации.

Выяснение функциональных характеристик белков предполагает изучение регуляции активности генов, кодирующих эти белки, так как экспрессия многих генов индуцируется только при определенных условиях. В связи с этим был проведен анализ экспрессии гена CSP5 капусты в условиях воздействия на растения низкой температуры, подсушивания, экзогенной АБК и нагрева (рис. 4).

500-, I I 400-1 ■я 5 300-1

¡ s

3 ¿ 200 H а *

S 'к

100

Рисунок 4. Экспрессия мРНК CSP5 в растениях Brassica oleráceo. i. Контроль; 2. Экспозиция при -5°С, 30 мин. с последующей инкубацией при +5°С в течение 12 часов; 3. Экспозиция при -5°С, 30 мин.; 4. Экспозиция при +5°С, 1 неделя; 5. Экспозиция при +5°С, 2 недели; 6. Обработка АБК при нормальных условиях; 7. Обработка АБК с последующей инкубацией при +5°С, 24 часа; 8. Экспозиция при +5°С, 24 часа; 9. Высушивание.

Образцы РНК для анализа были выделены из растений, подвергнутых различным видам стрессового воздействия.

Из рисунка 4 видно, что С5Я5 мРНК детектируется во всех случаях холодового воздействия, но с разной интенсивностью. Наиболее сильная индукция экспрессии генов белков холодового шока наблюдается при воздействии на растения кратковременной отрицательной температурой с дальнейшей экспозицией при низкой положительной температуре (-5°С, 30 мин, +5°С, 12 ч), а также при длительном

14

(более 6 суток) воздействии низкой положительной температуры. Двухчасовое обезвоживающее воздействие приводит к увеличению синтеза мРНК данного гена. Ранее индукцию синтеза БХШ при водном стрессе отмечали у арабидопсиса (Kurkela, Frank, 1990; Nordin et al., 1991; Lang et al., 1994) и шпината (Kazuoka, Oeda, 1994). Очевидно, что такие белки уменьшают последствия дегидратации, сопровождающей внеклеточное образование льда, вызывающего переход воды из клетки в межклеточную область по градиенту водного потенциала. Можно предположить, что БХШ, кодируемый геном CSP5 капусты, также относится к семейству белков, синтезирующихся при клеточной дегидратации, вызванной внешними воздействиями.

Известно, что АБК вовлечена в формирование клеточного ответа на воздействие низкой температуры (Heidervand, Amin, 2010; Baron et al., 2012). Это подтверждается и результатами анализа экспрессии гена CSP5 в растениях капусты, обработанных АБК при нормальных температурных условиях, с последующей инкубацией при +5°С 24 часа.

Таким образом, по-видимому, этот белок сочетает как криопротекторную функцию, что вытекает из его сходства с другими антифризными белками (альфа-спиральная структура, гидрофильность, повышенное содержание аланина), так и адаптивную к обезвоживанию.

Начальные этапы низкотемпературной индукции экспрессии CSP5 в растениях капусты Механизмы передачи низкотемпературного сигнала из внешней среды, приводящего к экспрессии регулируемых холодом генов, изучены недостаточно, несмотря на значительное внимание к этой проблеме (Penfíeld, 2008; Wifield et al., 2010). Известно, что прямым и, вероятно, наиболее ранним следствием влияния колебаний температуры на клетки является изменение текучести мембран (Mikami, Murata, 2003). Понижение температуры уменьшает, а повышение температуры, наоборот, увеличивает текучесть клеточных мембран (Alonso et al., 1997). Эти наблюдения позволили предположить, что плазматическая мембрана действует как первичный сенсор температурных колебаний вследствие динамических изменений ее физических характеристик (Murata, Los, 1997).

В наших опытах использованы протопласты капусты, полученные из листьев растений 4-х недельного возраста. Для повышения текучести плазматической мембраны суспензию протопластов капусты (106 клеток на 1 мл) инкубировали в среде, содержащей бензиловый спирт (БС) в двух концентрациях - 5 и 10 мМ и, в

контрольном варианте, - без БС. Уменьшение текучести плазматической мембраны достигалось обработкой протопластов в присутствии ДМСО в концентрациях 1, 2 и 3%. Из таких протопластов выделяли РНК для дот-блот-анализа. Результаты с использованием в качестве зонда меченного 32Р фрагмента гена СБР5 капусты показали, что в протопластах, инкубированных при 5°С в присутствии бензилового спирта (БС), экспрессия этого гена снижалась по сравнению с контролем (Рисунок 5, а), а при обработке ДМСО при 23°С, напротив, усиливалась (Рисунок 5, б).

[БС] JIM [ДМСО], %

Рисунок 5. Влияние на экспрессию гена белка холодового шока CSP5 Brassica oleráceo в протопластах: а) бензилового спирта: к - без БС, 23°С; 0 - без БС, 5°С; 5 -[БС] 5 мМ, 5°С; 10 - [БС] 10 мМ, 5°С) и б) ДМСО: к - без ДМСО, 23°С; 0 - без ДМСО, 5°С; 1 - [ДМСО] 1%; 2- [ДМСО] 2%; 3 - [ДМСО] 3% при нормальной температуре.

Уменьшение текучести плазматической мембраны, по всей видимости, меняет силы натяжения в мембране и способствует открыванию активируемых холодом кальциевых каналов, относящихся к механочувствительным ионным каналам (Ding, Pickard, 1993). Следовательно, при уменьшении текучести плазматической мембраны происходит увеличение потока ионов кальция в клетки растений. Ранее на проростках рапса было показано, что модулирование интенсивности поступления ионов кальция различными агентами отражалось на уровне экспрессии генов, регулируемых холодом (Sangwan, 2001). В связи с этим, были проведены опыты по оценке влияния хелатора ионов кальция EGTA и Са-ионофора A23Í87, стимулирующего приток в цитоплазму ионов кальция, ассоциированных с клеточной стенкой, на уровень экспрессии гена CSP5 в протопластах капусты при разных температурных режимах. Так, обработка протопластов капусты хелатором ионов кальция EGTA существенно тормозила холод-индуцированную экспрессию CSP5, поддерживая

16

транскрипционную активность этого гена на уровне, близком к уровню контроля при нормальной температуре, хотя полного подавления процесса при этом не неблюдалось (Рисунок 6). Возможно, такой результат обусловлен тем, что БОТА связывает внеклеточные ионы кальция, а общее повышение концентрации ионов кальция в цитоплазме при стрессе достигается из различных депо кальций-ионов.

Рисунок 6. Экспрессия гена СЗР5 в необработанных и обработанных БОТА и Са2+-ионофором клетках при изменении потока ионов кальция в цитоплазму: протопласты инкубировались при 23°С; 0,5 ч и 2 ч при 5°С.

Кот-роль Ш ЕОТА Ш Са2*-ионофор

время, ч

В то же время, воздействие на клетки Са-ионофором А23187, стимулирующим приток в цитоплазму ионов кальция, связанных на клеточных стенках, вызывало почти двукратное повышение экспрессионной активности гена С5Р5 как в норме, так и на холоду (Рисунок 6). Эти результаты демонстрируют четкую зависимость уровня экспрессии гена СБР5 капусты от изменения концентрации ионов кальция в цитоплазме и в норме, и при воздействии низкой температуры.

Анализ влияния блокаторов кальциевых каналов - нифедипина и циннаризина на уровень экспрессии СБР5 выявил, что нифедипин, блокирующий кальциевые каналы плазматической мембраны, оказывал эффект в подавлении экспрессии СЖ5, в то время как циннаризин - блокатор каналов внутриклеточных кальциевых депо -существенного влияния на экспрессию С5Р5 не оказывал (Рисунок 7).

400

Рисунок 7. Экспрессия гена С5Р5 в необработанных и обработанных нифедипином и циннаризином клетках при изменении потока ионов кальция в цитоплазму: протопласты

инкубировались при 23°С; — 0,5 ч, 2 ч и 6 ч при 5°С.

Следовательно, изменение концентрации ионов кальция в цитоплазме прямо отражается на уровне экспрессии гена белка холодового шока капусты.

Экспрессия гена С5Р5 капусты при различной активности кальций-зависимых протеиикиназ

Важную роль в регуляции экспрессии генов у растений при воздействии на них различных биотических и абиотических факторов, в том числе, при холодовом стрессе, играет фосфорилирование белков (Мопгоу е1 а1„ 1993). Известно, что эти воздействия первоначально вызывают флуктуации в концентрации ионов кальция в цитоплазме (ТаМШаци е1 а]., 1997). Связывающим звеном между колебаниями концентрации Са2+ и изменениями в экспрессии генов и метаболизме, по всей видимости, является активность кальций-зависимых протеинкиназ.

В белковых экстрактах, выделенных из растений капусты, подвергнутых холоду, и без холодовой обработки, уровень фосфорилирования гистона Ш-Б, взятого в качестве субстрата для протеинкиназ, заметно отличался (Рисунок 8).

0,5 ч

Рисунок 8. Фосфорилирование гистона Ш-Б в экстрактах клеток растений, подвергнутых низкотемпературному стрессу

Холодовой стресс вызывал повышение фосфорилирования гистона уже через 30 мин. Значительное и быстрое повышение протеинкиназной активности после помещения проростков капусты на холод выявлено и в опытах по фосфорилированию белков в реакциях ш vivo. При этом фосфорилируются белки с молекулярной массой 24, 42 и 58 кДа (Рисунок 9). В случае предварительной инкубации проростков в питательной среде с добавлением хелаторов ионов кальция EGTA и ВАРТА уровень

18

фосфорилирования белка с молекулярной массой 24 кДа существенно снижался, а белки с молекулярной массой 42 и 58 кДа на радиоавтографе не выявлялись, что подтверждает кальций-зависимый характер фосфорилирования данных белков при холодовом стрессе.

15 30 1 ч 0 15 30 1 ч 30 1ч |_МШ—шш-1 °С I мин чин I 23 "С ШШ-1

5°С ЕвТА 5 °с ЕвТА ВАРТА 5°С ВАРТА

Рисунок 9. Фосфорилирование белков растений капусты при низкотемпературном воздействии

В вариантах с использованием соединения ВАРТА, хелатирующего ионы кальция из внутриклеточных депо, подавление фосфорилирования белков по сравнению с вариантами с ЕвТА меньше, что указывает на больший вклад ионов кальция, поступающих из окружающей среды, на активацию протеинкиназ при холодовом стрессе.

Необходимость этапа фосфорилирования определенных белков для экспрессии гена СБР5 подтверждается опытами с ингибиторами протеинкиназ (Рисунок 10).

Вортманнин

Рисунок 10. Влияние ингибиторов протеинкиназ на экспрессию гена С5Р5\ растения инкубировали при 23°С; 0,5 ч, 2 ч и 6 ч при 5°С.

Так, обработка растений ингибиторами протеинкиназ стауроспорином и вортманнином приводила к снижению активности транскрипции гена СБР5 при холодовом стрессе.

Влияние реорганизации цитоскелета на экспрессию гена белка холодового шока капусты Известно, что компоненты цитоскелета связаны с плазматической мембраной и ионными каналами (ТЫоп е1 а1., 1996). В то же время есть сведения, что воздействие низких температур вызывает распад микротрубочек (АЬскакИтапоуа е1 а1., 2003). Орвар и сотр. (Огуаг е1 а1., 2000) предположили, что уменьшение текучести плазматической мембраны при низкой температуре вызывает реорганизацию цитоскелета и активацию кальциевых каналов с последующей индукцией экспрессии регулируемых холодом генов. Мы также исследовали экспрессию гена белка холодового шока капусты СБР5 в протопластах из растений капусты при воздействии на них реагентов, влияющих на реорганизацию цитоскелета, в различных условиях температурного режима.

Для оценки воздействия веществ, приводящих к реорганизации тубулинового цитоскелета, на экспрессию гена белка холодового шока капусты С5Р5, суспензию протопластов (106 клеток на 1 мл) инкубировали в среде, содержащей таксол (1 мкМ) и колхицин (100 мкг/мл).

При обработке протопластов капусты таксолом, стабилизирующим тубулиновый цитоскелет, экспрессия гена СБР5 при 5°С заметно ингибируется, оставаясь практически на уровне экспрессии этого гена при комнатной температуре (Рисунок 11).

Рисунок 11. Оценка уровня экспрессии гена С5Р5 при воздействии реагентов, влияющих на состояние цитоскелета. ! - контроль;

2 - гипотермия;

3 - таксол+гипотермия;

4 - таксол + ДМСО;

5 - колхицин;

6 - колхицин + БС

При действии на протопласты колхицина, ингибирующего полимеризацию тубулиновых белков и разрушающего микротрубочки, наблюдается заметное

увеличение экспрессии гена CSP5 даже при комнатной температуре. Обработка протопластов одновременно колхицином и бензиловым спиртом, вызывающим повышение текучести плазматической мембраны, приводит лишь к незначительному, по сравнению с действием одного колхицина, уменьшению экспрессии гена CSP5.

Реорганизация цитоскелета, по-видимому, приводит к активации кальциевых каналов, что в свою очередь обеспечивает поток ионов кальция в цитоплазму и дальнейшее прохождение холодового сигнала, завершающееся адекватным стрессовым ответом.

Таким образом, передача низкотемпературного сигнала из внешней среды, вызывающего соответствующий стрессовый ответ растения, происходит многоступенчато. На протопластах и растениях капусты выявлено, что начальными этапами процесса трансдукции холодового сигнала являются активация кальциевых каналов, в частности, в результате изменения состояния клеточных мембран, и увеличение потока ионов кальция в цитоплазму, подтверждаемое результатами опытов с хелаторами ионов кальция. Повышение концентрации ионов кальция в цитоплазме, вероятно, приводит к активации кальций-зависимых протеинкиназ, которые, как можно полагать, участвуют в индукции транскрипционных факторов, необходимых для экспрессии регулируемых холодом генов БХШ.

Гормональная регуляция экспрессии гена белка холодового шока капусты

Важная роль в регуляции физиологических процессов, лежащих в основе роста и развития растительных организмов, отводится фитогормонам. Одним из наиболее значимых при стрессовых ответах растений является АБК.

Для изучения влияния экзогенной АБК, а также обезвоживания, на экспрессию гена CSP5 капусты был проведен дот-блот анализ РНК из растений капусты, обработанных АБК при нормальных температурных условиях, обработанных АБК с последующей инкубацией при +5°С в течение 24 часов, а также после высушивания.

Как видно из рисунка 4, мРНК CSP5 детектируется как при воздействии экзогенной АБК на растения, так и при обезвоживании в равной степени. При этом уровень индукции мРНК все же несколько меньше, чем при низкотемпературном воздействии. Известно, что при холодовом воздействии уровень эндогенного содержания АБК в растениях арабидопсиса увеличивается в 3-4 раза, а при высушивании в 40-50 раз (Lang, Palva, 1992), при этом накопление АБК при охлаждении носит транзиентный характер, в то время как при высушивании

наблюдается кумулятивное накопление фитогормона (Tomashow, 1999). Сопоставляя эти сведения с нашими данными, можно сделать вывод о том, что при высушивании индукция экспрессии мРНК гена CSPS опосредована АБК.

При одновременном воздействии на растения и АБК, и холода (+5°С) индукция мРНК гена CSPS не превышает значений, наблюдаемых при других вариантах опыта. Очевидно, в обоих путях регуляции экспрессии гена CSP5 (как при дегидратации, так и при холодовом воздействии), являющихся частью процесса адаптации Brassica oleracea к воздействию низких температур, имеются общие элементы.

Многочисленные данные свидетельствуют о снижении повреждающего действия различных неблагоприятных факторов среды, включая и холодовой стресс, на растения под влиянием еще одной группы фитогормонов - брассиностероидов (БС) (Khripach et al., 2000; Olinevich et al., 2000; Morillon et al., 2001; Sasse, 2003; Авальбаев и др., 2006; Kagale et al., 2007; Bajguz, Hayat, 2009). Брассиностероиды, обширный класс фитогормонов стероидной природы, характеризуются широким спектром физиологического действия на растения, в котором важное место отводится их антистрессовой активности, в том числе и в отношении водного стресса (Khripach et al., 2000; Sasse, 2003; Авальбаев и др., 2006). Это указывает на вероятное вовлечение БС в предадаптацию растений к возможным стрессовым ситуациям (Шакирова, Безрукова, 1998; Шакирова, 2001). К таким реакциям, например, можно отнести индукцию накопления осмопротектанта пролина в листьях ячменя (Бокебаева, 1991) или лектина в корнях проростков пшеницы (Шакирова, Безрукова, 1998), участвующих в развитии неспецифических защитных реакций растений. Дополнительной иллюстрацией антистрессового эффекта эпибрассинолида могут служить также данные об ослаблении под влиянием этого гормона неблагоприятного воздействия засоления нарост корней проростков пшеницы (Шакирова, 2001).

В связи с этим встает вопрос, способен ли 24-эпибрассинолид (ЭБ) повышать устойчивость растений капусты к низким положительным температурам и индуцировать экспрессию гена CSP5 капусты.

Постановку физиологических опытов с ЭБ проводили совместно с к.б.н. М.В.Безруковой. Растения для опытов переносили в среду, содержащую 2% сахарозы и 0,4 мкМ ЭБ на 8 час. Контрольные растения помещали в среду с сахарозой, но без ЭБ. Затем растения подвергали холодовому стрессу при 5°С в течение 10 дней и проводили измерения прироста биомассы. Видно, что обработка ЭБ оказывает явный

ростстимулирующий эффект на проростки капусты в ходе всего опыта и предотвращает вызванное холодом торможение роста растений (Рисунок 12).

Рисунок 12. Влияние предобработки ЭБ на прирост проростков капусты в норме и гипотермии (5°С).

Эти данные указывают на явный защитный эффект ЭБ на проростки капусты от холодового стресса. Можно ожидать, что важный вклад в реализацию антистрессового действия ЭБ на растения капусты вносит его эффект на экспрессию гена С5Я5.

Действительно, как видно из рисунка 13, ЭБ увеличивает уровень экспрессии гена СБР5 в проростках капусты почти вдвое уже через 30 мин экспозиции, что сопоставимо с действием холода. В ходе опыта обработка ЭБ, также как и гипотермия, вызывает дальнейшее возрастание транскрипционной активности данного гена, так что через 6 ч она увеличивалась почти втрое.

4 *

а

5 юо

ЭБ + гипотермия

щ

2

время, ч.

т

Рисунок 13. Влияние гипотермии (5°С) и 0.04 мМ ЭБ на уровень экспрессии гена С5Р5 в 14-дневных проростках капусты (в % от контроля).

Полученные результаты свидетельствуют о высокой чувствительности гена

С5Р5 к обработке ЭБ и возможном вовлечении продукта этого гена в спектр

антистрессового действия ЭБ на растения капусты. Индуцируя существенное

23

повышение экспрессии гена С5Р5 и, соответственно, усиливая синтез самого белка, ЭБ, видимо, способствует ускорению процесса адаптации растений к холодовому стрессу.

Таким образом, предобработка ЭБ оказывает защитное действие на проростки капусты при гипотермии, что проявляется в быстром восстановлении ростовых процессов в условиях холодового стресса. Важный вклад в реализацию антистрессового действия ЭБ на растения вносит ЭБ-индуцированная экспрессия гена СЗР5 капусты.

Известно, что холодовой стресс сопровождается повышением содержания АБК в клетках растений. Нами выявлено, что обработка АБК также вызывает стимуляцию экспрессии гена С!>/>5 капусты, тогда как одновременное воздействие холодового стресса и АБК на растения приводило к дополнительному усилению транскрипции, которое, однако, было ниже их суммарного значения, что свидетельствует в пользу существования общих элементов в обоих путях регуляции экспрессии гена СБР5 капусты. Для того, чтобы выяснить, не опосредован ли эффект БС на экспрессию гена С£Р5 капусты через изменение под его влиянием эндогенного уровня АБК, мы

предобработанных 24-капусты, подвергнутых

Рисунок 14. Динамика изменения концентрации АБК в предобработанных в течение 24 час 24-эпибрассинолидом и необработанных проростках капусты в ходе

низкотемпературного воздействия.

Предобработка ЭБ вызывала некоторое увеличение уровня АБК в ходе гипотермии по сравнению с контрольными растениями (20°С), однако оно было значительно ниже, чем у таковых, выращиваемых при 5°С без обработки ЭБ.

Полученные результаты свидетельствуют в пользу реализации независимой от АБК регуляции эпибрассинолидом экспрессии гена СБР5 капусты. В растениях,

провели анализ динамики содержания АБК в эпибрассинолидом и необработанных проростках низкотемпературному воздействию (Рисунок 14).

80 -- Кон-роль ■ "ипотсрмия -—-ОБ — • -ЭЕм Гипотермия

а

2 50

•й _____

ш гэ 10

0.5 1 2 д е :2 Время, сутки

предварительно обработанных ЭБ, в первые 30 минут холодового стресса наблюдается определенное повышение содержания АБК, затем концентрация АБК падает и в дальнейшем поддерживается на уровне контрольных растений. Это может указывать на снижение уровня повреждающего действия холодового стресса на растения в результате предобработки ЭБ.

Участие факторов CBF в регуляции экспрессии гена белка холодового шока капусты Многочисленные данные указывают на то, что факторы CBF являются ключевым компонентом в транскрипционной регуляции генов холодового ответа растений. Конститутивная экспрессия генов CBF в трансгенных растениях арабидопсиса индуцирует экспрессию DRE/CRT-содержащих генов и приводит к повышению холодоустойчивости этих растений без предварительного этапа холодовой акклимации (Jaglo-Ottosen et al., 1998). Поэтому исследование уровня экспрессии генов CBF в условиях низкотемпературного стресса необходимо для выяснения молекулярных механизмов передачи холодового сигнала. К тому же, потенциальная возможность использования в трансгенных растениях генов CBF для повышения устойчивости к холодовому стрессу вызывает необходимость изучения подобных генов у разных видов растений.

Определение нуклеотидной последовательности CBF гена капусты Фрагмент гена CBF капусты, включающий также участок промотора, прилегающий к гену, получали с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), используя праймеры, подобранные по соответствующим последовательностям арабидопсиса. Полученный фрагмент ДНК капусты клонировали в векторе pAL-TA (Евроген, Россия) и определили его нуклеотидную последовательность.

Сравнение нуклеотидной последовательности этого фрагмента CBF-гена цветной капусты с имеющимися в GenBank нуклеотидными последовательностями СВ^-подобных генов капусты, а так же с последовательностями генов CBF близкородственных растений, таких как Brassica napus, Brassica гара и Arabidopsis thaliana, показало, что данные последовательности имеют высокую степень гомологии (Рисунок 15).

Последовательности нуклеотидов 5'-участка клонированного фрагмента ДНК капусты и промоторных областей генов CBF арабидопсиса и некоторых растений рода капустных (Brassica)-, рапса, репы, а также теллунгиеллы солонцовой (Thellungiella salsuginea) имеют высокую гомологию, а у арабидопсиса наибольшее

сходство с данным фрагментом гена СВР капусты обладает промотор гена СВР2. При этом промотор арабидопсиса оказался протяженнее на 5 пар нуклеотидов по сравнению с промоторами капустных, а промотор теллунгиеллы солонцовой - на 17 пар нуклеотидов.

ВоСВР АТОААСТСАОТСТСТАСТТТТТСТОААСТТСТТаЗСТСТОАаААСОАСТСТССгаЗ------ТАООТСХЗТСАТ

ВпСВР АТОААСТСАОТСТСТАСТТТТТСТОААСТТСТТ<3<ЗСТСТСАСААСОАОТСТССС-КЗ------ТАССТОЗТСАТ

ВгСВР АТОАССТСАТТТТСТАССТТСТСТОАААТОТТС(3<ЗСТССОАОТАССАОТСТССТАСА---ТТААОСвЗСОАС

АЪСВР1 АТСААСТСАТТТТСА<ЗСТТТТТСТОАААТОТТТСЗ<ЗСТССОАТТАСОА(ЗССТСА---------АООСЭЗАОАТ

AtCBF2 АТСААСТСАТОТТСТССТТТТТСТСАААТОТТТООСТССОАТТАССАОТСТССООТТТССТСАСОСОаТОАТ АЪСВРЗ АТОААСТСАТТТТСТОСТТТТТСТОАААТОТТТОССТССОАТТАСОАОТСТТСООТТТССТСАСасСаТОАТ

ВоСВР ТАСТОТСССАТОТТООСОССОАаСТОТССеААСААСССвОССКЗаТАОСААОААОТТТСОСОАСАСАСОТСАС

ВпСВР ТАСТОТСССАТОТТОССООСОАОСТСТССОААОААОССООСеСОТАООАА5ААОТТТСО<ЗОАСАСАСОТСАС

ВгСВР ТАТТСТСССАСОСТОаССОСОАССТОТССОААОАААССТОСОООТСаСААОААСТТТСОССАОАСОСОТСАС

АССВР1 ТАТТСТССОАССТТ(ЗСССАСОАОТТСТССОААОАААССООССЮОССОТААОААСТТТССТОА<ЗАСТСОТСАС

АЬСВР2 ТАСАСТССаААОСТТСССАСОАССТОССССААОАААССАОС<ЗООААО<ЗААОААСТТТСОТ0АОАСТСаТСАС

АЪСВРЗ ТАТАТТССОАС<ЗСТТОСаАССАОСТ(ЗССССААОАААСССОС<ЗООТСОТААОААСТТТСОТаАОАСТСОТСАС

ВоСВР СССАТТТАССОАССАОТТСОССТТАСААААТСАСЗСТААСТОСМТОТОТОААОТОАССХЗААССАААСАААААА

ВпСВР сссатттассоасзсаоттссссттаоаааатсаоотааотсз<5СТОТОТОААОТОАС<ЗОААССАААСААААМ

ВгСВР CCAATTTACAGAGGAGTACGTCTGAGAAACTCA<3GTAAGTGG<3TGTGTGAGGTGAO<5GAGCCAAACAAAAAG

AtCBFl ССААТТТАСАОА<ЗСАОТТССТСАААОАААСТССОСТААОТОаСТТТСТСААОТОАОАОАОССАААСААОААА

АЪСВР2 ССААТТТАСА0АООАСТТСаТСАААОАААСТСС<ЗОТААСТС(ЗСТОТОТС&ОТТСАСАСАСССАААСААОААА

А1:СВРЗ ССААТАТАСАОАСИАСТТСОТСаСАСАААСТССОСТААСТОССТТТОТСАССТТАОАОААССАААСААОААА

ВоСВР ТСТ,АООАТТТОЗСТС<ЗОААСТТТСААААСАОСТСАОАТСОСАССТССТОСТСАСОАСОТСОССОССТТАОСТ ВпСВР ТСТАОСАТТТОССТССОААСТТТСААААСАОСТОАОАТСОСАССТССТОСТСАСОАСОТСОСССССТТАОСТ ВгСВР ТСТА<ЗСАТТТСССТСССТАСТТТССТААСССССОАСАТС<ЗСАССТСОТОСТСАСОАССТСССССССАТАОСС АЬСВР1 АССАСОАТТТ<ЗОСТССССАСТТТССАААССССТСАОАТСССАССТСОТ<ЗСТСАСОАССТС(ЗСТССАТТАОСС AtCBF2 АССАССАТТТСССТСССОАСТТТССАААССОСТОАСАТООСАОСТССТССТСАСОАСОТСОССОССАТАОСТ АЬСВРЗ АСААООАТТТСССТСООААСАТТТСАААССОСТСАСАТООСАССТСОАОСТСАССАСОТТОССОСТТТАССС

ВоСВР СТССОТОСААСАООССССТОССТСААСТТСССССАСТСОССТТОССОССТССОТАТСССССАОАСААССТОС ВпСВР СТССОТОСААСАСССОССТСССТСААСТТСССССАСТСООСТТСОСОССТССОТАТСССОСАОАСААССТОС ВгСВР СТССОТОССАААТССОССТОССТСААТТТСОССОАСТСОССТТОССООСТСССТАТСССОСАОАСААСАТОС АЪСВР1 СТССОТОССССАТСАОСАТОТСТСААСТТСОСТОАСТСООСТТОаСОССТАСОААТСССССАОТСААСАТОС AtCBF2 СТСССТаССАОАТСТвССТСТСТСААТТТСОСТОАСТССССТТСОССОСТАСОААТСССОСААТСААССТОТ АЬСВРЗ СТТСОТСХЗСССАТСАСССТСТСТСААТТТССХ^ТСАСТССССТТССАСАСТССОААТССССОААТСААСТТСС

ВоСВР СЗССАА«ЗАТАТССАСААССЗСТОСТ<ЗСТСАА<ЗСС(ЗСАТТС- -СТТАСА«3

ВпСВР ОССАА<ЗСАТАТССАОААССХ:Т<ЗСТ(ЗСТОАА(ЗСС<ЗСАТТСОСТТТТОА<3<3

ВгСВР СССААСЮАТАТССАОААО<ЗСО<ЮТОСТСАА<ЗСС<ЗССОТОССТТТТСА<ЗС

АЬСВР1 ОССАА<ЗСАТАТССААААА<ЗСО<ЗСТ(ЗСТОААОССОСОТТСССТТТТСААС

АЬСВР2 ОССААОаАААТССААААО<ЗСОеСС<ЗСТОАА<ЗСССЗССТТОААТТТТСААО

AtCBFЗ (ЗСТААССАСАТССААААСС!ССОССССТСАА<ЗСТ(ЗСОТТССССТТТСА(ЗС

Рисунок 15. Сравнение нуклеотидных последовательностей генов СВР различных видов растений (ВоСВР - капусты; ВпСВР - рапса; ВгСВР - репы; А(СВР1, А1СВР2, АьСВРЗ — арабидопсиса).

Таким образом, клонированный нами фрагмент ДНК включает в себя участок промоторной области СВР гена капусты длиной 145 пар нуклеотидов и 5'-участок транскрибируемой части длиной 401 пара нуклеотидов.

Экспрессия CBF гена капусты при холодовом стрессе

Определение уровня экспрессии гена транскрипционного фактора CBF капусты при различных температурных условиях проводили методом ОТ-ПЦР в реальном времени с использованием TaqMan зондов. Результаты показали, что уже через полчаса после экспозиции растений при низкой температуре экспрессия гена CBF повышается в 13-14 раз относительно контроля (Рисунок 16). Через час она достигает своего пика, превышая контроль в 50-70 раз. После этого уровень экспрессии CBF-гена постепенно снижается, но даже через 3 часа значительно выше, чем у контроля.

Рисунок 16. Изменение уровня экспрессии гена CBF капусты при низкотемпературном стрессе. Все различия статистически достоверны (п=3, р<0,05). Значения представлены в виде среднего арифметического ± стандартная ошибка среднего. Процент активации рассчитывали по отношению к контролю, который принимали за 100%.

Изменение уровня экспрессии CBF гена капусты при закаливании растений

Известно, что холодовое закаливание значительно повышает устойчивость растительного организма к низким температурам. Учитывая значение CBF генов в активации генов холодового ответа, представляло интерес выяснение вопроса о том, как влияет закаливание на экспрессию СВР генов.

Определение уровня экспрессии гена транскрипционного фактора CBF капусты у закаленных растений проводили так же, как и в случае незакаленных растений. Растения, выращиваемые в климатокамере при 22°С, помещали на низкие положительные температуры (5-7°С) и закаливали таким образом в течение недели. Затем растения, как и в предыдущем эксперименте, переносили в термостатированный бокс, охлажденный до 0°С, и выдерживали при данной температуре до суток. Были выбраны следующие временные отрезки: 15 минут, 30 минут, 1 час, 2 часа, 3 часа, 9 часов, 12 часов и 24 часа.

Уровень экспрессии закаленных растений сравнивался с двумя контрольными группами: первая - растения, прошедшие этап холодового закаливания, но не подвергавшиеся стрессу; вторая - незакаленные контрольные растения, так же не

£ 8000-

\ 6000.

= 2 4000-

\ 1.2000-а. е-

« 1 600-' г а i

I ~ 2601

гЬ

Г~1

1 2 время, ч

подвергавшиеся воздействию низкой температуры. Было установлено, что у растений из первой контрольной группы экспрессия СВР превышает таковую у растений из второй группы в 3,5 раза, что подтверждает влияние закаливания на содержание мРНК СВР гена у растений.

При сравнении с первой контрольной группой было зафиксировано ожидаемое повышение уровня экспрессии СВР гена. Так, уже через 15 минут холодового воздействия количество мРНК повысилось в 4 раза, через полчаса достигло 30-40-кратного превышения относительно контрольной группы и держалось на этой отметке вплоть до трех часов стрессового воздействия (Рисунок 17).

Рисунок 17. Изменение уровня экспрессии гена СВР закаленных растений капусты при низкотемпературном стрессе.

Все различия статистически достоверны (п=3, р<0,05). Значения представлены в виде среднего арифметического ± стандартная ошибка среднего. Процент активации рассчитывали по отношению к контролю, который принимали за 100%.

Начиная с трех часов, наблюдается постепенное понижение уровня экспрессии. Через 12 часов количество мРНК было больше, чем у контрольных растений в 10 раз, а спустя сутки всего в 3 раза. Обращает на себя внимание то, что у закаленных растений низкотемпературное воздействие приводит к повышению экспрессии генов СВР через 15 минут в 14 раз, а через полчаса в 135 раз выше контрольного. Через 1-2 часа уровень экспрессии остается примерно на той же отметке, а к трем часам начинается незначительное понижение содержания транскрипта. В дальнейшем понижение уровня экспрессии продолжается, однако изменения в количестве мРНК происходят более плавно по сравнению с незакаленными растениями (Рисунок 18).

% $000-1

время, ч

| 15000. ; £ 10000. I I 5000'

а. г

I!

: а

н

500

250'

Л

0 0,26 0,5 1

9 12 24

время, ч

Рисунок 18. Изменение уровня экспрессии гена СВР закаленных растений капусты при низкотемпературном стрессе (относительно незакаленного контроля). Все различия статистически достоверны (п=3, р<0,05). Значения представлены в виде среднего

арифметического ± стандартная ошибка среднего. Процент активации рассчитывали по отношению к контролю, который принимали за 100%.

Сопоставление уровня экспрессии генов СВР и ростовых процессов, как интегральных показателей функционирования растений и реализации генетической информации, позволяет судить, хотя и косвенно, о защитной роли накопления соответствующих белков при холодовом стрессе.

Для подтверждения этого предположения проростки в возрасте 4-х листьев были разделены на 2 группы примерно по 20 штук. Одна группа проростков прошла стадию закаливания при 7°С 16-часовом фотопериоде и освещенности 15 клк в течение 7 суток, другая группа проростков не закаливалась. Затем обе группы проростков были подвергнуты холодовому стрессу при температуре около 1°С в течение 1 суток и затем перенесены в климатокамеру с нормальной температурой выращивания. После этого через каждые сутки измеряли прирост биомассы отдельных проростков и брали по несколько растений для выделения РНК и определения количества мРНК СВР.

«закаленные 'Закаленные

Рисунок 19. Изменение массы закаленных и незакаленных растений после низкотемпературного стресса.

Дни после стресса

Как видно из рисунка 19, растения, прошедшие этап холодового закаливания, значительно лучше перенесли низкотемпературный стресс, восстанавливая через сутки положительную динамику прироста биомассы. Незакаленные проростки лишь на седьмые сутки после стресса достигли значений прироста закаленных проростков.

Выживаемость закаленных растений после стресса так же была выше. В течение двух недель после 24 часов низкотемпературного воздействия среди незакаленных растений выжило 58%, а среди закаленных - 73%. При этом содержание мРНК CBF у закаленных растений превышало данный показатель у незакаленных растений (Рис. 18). Видимо, наряду с другими приспособительными реакциями, повышающими адаптацию растений капусты к холоду, уровень экспрессии генов CBF также является фактором более успешной защиты растений от холодовых повреждений.

Изменение степени метилирования ДНК промоторной области CBF-гена капусты Brassica oleráceo L. при холодовой акклимации

Известно, у высших растений ДНК значительно метилирована по остаткам цитозина. Глобальное метилирование ДНК видо-, ткане-, органоспецифично, оно изменяется при прорастании семян, переходе растений к цветению. Метилирование ДНК может существенно модулироваться различными биотическими и абиотическими факторами, влияющими на рост и развитие растений (Ванюшин, 2009).

1 CGTGTCCACTTGGCACTCCGAGAGCCAAAAAAACACCGTGTTCTTTTCTA -210

2 CGTGTCCACTTGGCACTCCGAGAGCCAAAAAAACACCGTGTTCTTTTCTA -210

1 AAATCCAGCCCCACCCATTTCCAAATATCTCATGCCAATATAAACACCAA -160

2 AAATCCAGCCCCACCCATTTCCAAATATCTCATGCCAATATAAACACCAA -160

1 CTCTCGCTCCACTTTTCTCAAACCACAAACTTTTAACTCCACCTGAAAAG -110

2 CTCTCGCTCCACTTTTCTCAAACCACAAACTTTTAACTCCACCTGAAAAG -110

1 AAGATAAAAGAGAGAGAAATAAATATCTTATCAAACCAGACAGAACAGAG -60

2 AAGATAAAAGAGAGAGAAATAAATATCTTATCAAACCAGACAGAACAGAG -60

1 ATCTTGTTACTTACTATACTACACTCAGCCTTATCCAGTTTTCAAAAGAA -10

2 ATCTTGTTACTTACTATATTATATTTAGTTTTATTTAGTTTTTAAAAGAA -10

1 GTTTCAACTATGAACTCAGTCTCTACTTTTTCTGAACTTCTTGGCTCTGA +41

2 GTTTTAATTATGAATTTAGTTTTTATTTTTTTTGAATTTTTTGGTTTTGA +41

Рисунок 20. Сравнение нуклеотидных последовательностей фрагмента гена С5/7 в исходной ДНК из растений капусты, растущих в нормальных температурных условиях, до бисульфитной обработки (1) и после бисульфитной обработки (2). Метилированные нуклеотиды отмечены красным цветом. Курсивом выделен старт инициации транскрипции.

Выявление метилированных цитозинов в нуклеотидной последовательности CBF гена производилось методом бисульфитной конверсии с помощью специализированных наборов по протоколам фирм-производителей.

В предварительном опыте было показано, что в клонированном фрагменте гена более половины из всех цитозинов при бисульфитной обработке ДНК конвертировались в тимин, следовательно, в исходной ДНК это были неметилированные цитозины.

В исследуемой последовательности ДНК неметилированными оказались остатки цитозинов в диапозоне примерно до -262 и после -41 положений. При этом часть цитозиновых остатков как в сайтах CG, CNG, так и в сайтах CNN, при бисульфитной обработке ДНК незакаленных растений остались неизменными, что указывает на то, что в исходной ДНК они были метилированы. Наибольшее количество таких метилировнных цитозинов обнаруживались во фрагменте промотора, ограниченном положениями -261 и -40.

Анализ нуклеотидных последовательностей фрагментов ДНК, ограниченных положениями -261 и -41, содержащие участки промотора CßF-гена из растений капусты, прошедших и не прошедших холодовое закаливание, в сравнении с нуклеотидной последовательностью ДНК без бисульфитной обработки, показал, что содержание метилированных и неметилированных цитозинов в ДНК закаленных и незакаленных растений отличалось. В различных клонах часть цитозиновых остатков, от 7 до 12, метилированных в исходной ДНК, при закаливании деметилировались. При этом 5 цитозинов в положениях -200... -197 и -195, -194 были деметилированы во всех исследованных клонах.

Степень метилирования ДНК промоторной области CBF-гена Brassica

oleráceo L. при различных температурных условиях выращивания Следующим этапом работы было выяснение вопроса сохранения статуса метилирования ДНК у растений, прошедших этап холодового закаливания, но в дальнейшем выращиваемых в нормальных температурных условиях. Оказалось, что экспрессия генов CBF у этих растений была на уровне контрольных растений до холодового закаливания, а содержание метилцитозинов в промоторной последовательности гена CBF близко к первоначальному уровню, обнаруживаемому в незакаленных растениях. В приведенном фрагменте ДНК все цитозины оказались метилированнными, поэтому в исходной последовательности ДНК и последовательности ДНК после бисульфитной обработки, выявляющей

метилировнные нуклеотиды, различия не обнаружены (Рисунок 21). Из 20 CG, CNG и CNN островков, обнаруживаемых во фрагменте промотора от -261-го до -42-го нуклеотида после холодового закаливания проростков, 3 деметилировались полностью, 1 - частично. Таким образом, содержание метилицитозинов в рассматриваемом фрагменте последовательности ДНК промотора CBF-генов, снижающееся у растений, прошедших этап холодового закаливания, при снятии стрессовых условий приближается к исходному уровню. Так же стоит отметить, что большинство деметилированных в ходе холодового закаливания цитозиновых остатков при переносе растений в благоприятные условия произрастания метилируются вновь.

-234 -216 -204 -203 -200 -199 -198 -197 -195 -194 -193 -178 -158 -156 -152 -150 -136 -73 -63 -49

По'шипя нуклеотида «1 «2 ИЗ

Рисунок 21. Частота метилирования цитозинов в промоторе гена CBF капусты. 1 - растения, выращенные в нормальных температурных условиях; 2 - растения, прошедшие стадию холодового закаливания; 3 - растения, перенесенные в нормальные темпратурные условия после этапа закаливания.

По оси абсцисс отмечены положения цитозина относительно стартового кодона, по оси ординат - степень метилирования.

Клонированную нами промоторную последовательность CBF гена капусты сравнивали с промоторами арабидопсиса с целью выявления в них сайтов связывания транскрипционных факторов, возможно, влияющих на экспрессию исследуемого нами гена. Было обнаружено несколько мотивов, встречающихся в промоторах CBF генов арабидопсиса, такие как MYC, MYB, 1СЕг2 (Рисунок 22).

Мотивы MYC и 1СЕг2 узнаются транскрипционным фактором ICE (Inducer of

CBF expression) - положительно регулирующим экспрессию CBF (Chinnusamy et al., 2003; Zarka et al., 2003). Мотивы MYB связываются белком MYB15, что приводит к снижению экспрессии CBF генов (Agarwal et al., 2006).

-450 TTAATAGATAAATACAGAGTTGTCCTGCTCAACCCATACATAGCCACACAT -401 -400 TCACCCAGTACAAGTTAAAACACATAAAAGTATAACGAGTGAAGAGTCAGC -351

-350 AGCCATACCACAAAGGTCAAGATGACACGTGGCAGCATATAAGTGAATGAA -301

-300 AACAACGCATTCACACAAACCGTGGGATGATCAATTTAGCTGTGTCGTGTC -251

-250 CACTTGGCACTCCGAGAGCCAAAAAAACACCGTGTTCTTTTCTAAAATCCA -201

"200 GCCCCACCCATTTCCAAATATCTCATGCCAATATAAACACCAACTCTCGCT -151

"150 CCACTTTTCTCAAACCACAAACTTTTAACTCCACCTGAAAAGAAGATAAAA -101

"100 GAGAGAGAAATAAATATCTTATCAAACCAGACAGAACAGAGATCTTGTTAC -050

-049 TTACTATACTACACTCAGCCTTATCCAGTTTTCAAAAGAAGTTTCAACT -001

Рисунок 22. Возможные сайты связывания транскрипционных факторов в промоторной области гена CBF капусты. Желтым цветом выделены MYC мотивы (CANNTG); синим цветом - MYB мотивы (WAACCA); зеленым - мотив 1СЕг2 (ACTCCG). Метилированная область промотора подчеркнута

Таким образом, можно отметить, что кодирующая часть исследуемого гена свободна от метилированных оснований, однако его промоторная область имеет метилированный участок. Хотя большинство метилированных цитозинов остаются таковыми вне зависимости от температурных условий, в которых выращивалось растение, часть из них все же деметилируется при закаливании. Из шестидесяти метилированных нуклеотидов, в той или иной мере деметилируется двадцать. Девятнадцать из них - это цитозины, расположенные в ассиметричной последовательности CNN.

Самое заметное деметилирование при закаливании растений наблюдается в положениях от -200 до -194 во всех исследованных нами клонах, а нуклеотид в положении -193 остается метилированным лишь в 20% случаях, в то время как в остальных положения деметилирование носит частичный характер и обнаруживается в 70-90% клонов.

Результаты исследований показали, что последовательности ДНК промотора CAF-гена деметилированные при закаливании, восстанавливают степень метилирования при переносе растений в благоприятные условия роста Механизм данного процесса пока неясен и может быть предметом дальнейших исследований.

Множественные пути гормональной регуляции экспрессии генов дегидринов в растениях пшеницы в норме и при холодовом стрессе

Холод может индуцировать в растениях экспрессию широкого спектра генов, кодирующих различные стрессовые белки, в том числе дегидрины, накопление которых наблюдается в условиях засухи, засоления, вызывающих нарушение водного режима, а также при обработке АБК (Close, 1996; 1997). Дегидрины злаков представляют собой весьма неоднородное семейство, включающее несколько компактных групп. Анализ соответствующих аминокислотных последовательностей выявил, что нуклеотидные последовательности, относящиеся к отдельным группам, кодируют белки, принадлежащие к разным классам дегидринов. Результаты анализа позволили использовать эти последовательности при подборе праймеров. Праймеры с нуклеотидным составом 5'CATCGATGAGAACGGTGAGGTG35'ТТСЖЕАТСАТСТгаХГАОГАСХ;3', были подобраны к высококонсервативному участку кодирующей области (2-ой экзон) dhn8 гена дегидрина ячменя. С использованием этих праймеров был амплифицирован фрагмент ДНК пшеницы размером 390 п.н. (Рисунок 23).

--тмтагвшг^Kirarav^-urj^

10 То Л 7с ЪО 60 70 80 90 lio lid lio

Birle» dhns ;>nc

mtina от« --^гсагаолстосою^тс^^ HI

frítícuri «síivo. «сот --яоясгасваидаотхжт^

тлснк ........................................so

LSSé- -gmcroraaccoc-■

lío lío lío

Bar lev dhofi чепе GATO30CCCC—GCGTCTGT7CA3CTCAC........I*1

тймотмиим WOT« оэтаЖ-ч£5гст<эта»ссс«^ из

Ttit ™ KW< cgSg^--occtccctc>octck.........aroocазотсктготсет^тажияетол!^^ г«

Kit ™ ™ ко! сотссот.-ссоттетгаслссстс.........слтасдгажстаж>жг,мл»от^ г«

тшм "Lu* Йсисспятагойотжйос.........атаскоткстотогп

ГО 2F0 Wo ЗМ 310 :

parley di»! 9«ne ---------------------Í222£22H£2£S252£££S"S2SS£2££

Tritií-jn «COR* TOO^^^jgjjjjJj^™®^^ 3Sfl

TriticuU aestlvu* "tfCOR '......................ССЯТГСССОЯСАСССАССХТОГТОТааСС^-С^^ Л9

тлит ........................ссаххссстскхжхтсг ажскаагкапяхахесс m

ido U0 <30 430 140 4Í0 «¿0 Bjrley dhnS ocie ахххтааасстаетасссохлссазллаз^^

Trltlcuw aestivot ааж< шэдшииоташйоэахпълахсАлдаслладюэх^^ <зг

Triticun aestlvua KC0R4 Tritlcuir. aestivur, KCP

ТЛИ® СЬОССОСОЗЧХЖЗСгаМСМСТГХАПтаАЛОЙ^^ зев

Рисунок 23. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей гена dhn8 дегидрина ячменя, мРНК семейства WCOR дегидринов пшеницы и клонированного фрагмента дегидрин-подобного TADHN гена пшеницы размером 390 п.н.

Секвенирование и сравнительный анализ ПЦР-продукта, обозначенного нами

как TADHN (Triticum aestivum dehydrin) показали, что его нуклеотидная

34

последовательность на более чем 90% гомологична с таковой гена dhn8 дегидрина ячменя, а также высокогомологична последовательностям мРНК Wcor410, Wcor410b, Wcor410c дегидринов пшеницы, относящимися к разряду холод-чувствительных (Danyluk et al„ 1998) (Рисунок 23).

В выведенной полипептидной последовательности синтезированного нами ПЦР-продукта обнаружен 15-звенный участок, включающий аминокислоты EKKGFLEKIKEKLPG, полностью соответствующий К-сегменту дегидринов, являющегося отличительным признаком дегидринов (Close, 1996). Вероятно, во многом именно наличие К-сегментов, формирующих амфифильную а-спираль, обусловливает структурные особенности дегидринов, способствующие выполнению ими защитных функций, к проявлениям которых можно отнести связывание с липидными компонентами биомембран (Close, 1996; Danyluk et al., 1998; Koag et al., 2003). Таким образом, синтезированный ПЦР-продукт можно рассматривать в качестве фрагмента дегидрин-подобного гена пшеницы, названного нами как TADHN. Нуклеотидная последовательность фрагмента гена TADHN зарегистрирована в базе данных NCBI (Accession No AY574032).

в

время, ч

Рисунок 24. Влияние 3.7 мкМ АБК (А) и 0.4 мкМ 24-эпибрассинолида (Б) на уровень экспрессии ТАЭЬ^ гена дегидрина в 4-сут проростках пшеницы

Основываясь на выявленном нами эффекте вовлечения и АБК, и ЭБ в регуляцию транскрипции гена СЗ'Р5 капусты, интересно было в сравнительном плане исследовать, проявляет ли ген ТАОНМ пшеницы чувствительность к этим гормонам. Результаты, приведенные на рисунке 24, демонстрируют чувствительность исследуемого нами гена дегидрина пшеницы к обработке не только АБК, но и ЭБ.

Причем, важно подчеркнуть, что обработка ЭБ не вызывает в проростках заметных сдвигов в содержании АБК (Таблица 2).

Таблица 2 - Влияние обработки ЭБ на содержание АБК в корнях (нг/г сырой массы корней)

Вариант опыта Время обработки, ч

1,5 3 7 16

Контроль 76+3,8 77+4,0 75+3,7 78+3,1

0,4 нМ ЭБ 74±3,0 77+3,8 74+3,7 73±4,4

Можно видеть, что оба фитогормона индуцируют усиление синтеза мРНК дегидрина в проростках пшеницы с максимумом на 6 ч, хотя в случае воздействия АБК этот процесс выражен более сильно. Полученные нами данные подтверждают известную чувствительность дегидринов пшеницы к АБК (Danyluk et al., 1998), что волне ожидаемо, поскольку в промоторах генов дегидринов имеются сайты, ответственные за связывание с АБК (ABRE) (Nakashima, Yamaguchi-Shinozaki, 2006). Кроме того, полученные данные указывают на вовлечение в регуляцию активации транскрипции TADHN гена дегидрина ЭБ, которая реализуется независимо от эндогенной АБК.

Как уже упоминалось, последовательность TADHN гена имеет высокую гомологию с последовательностями мРНК, кодирующими холод-чувствительные гены Wcor410 (Danyluk et al., 1998). Можно было ожидать вовлечения этих генов в ответные реакции на холодовой стресс. Нами проведен сравнительный анализ содержания АБК и транскрипционной активности TADHN гена в проростках пшеницы в ходе гипотермии. Поскольку значение эндогенной АБК в регуляции транскрипции генов защитных белков, задействованных в ответ на холод, интенсивно обсуждается в литературе (Beck et al., 2007; Shinozaki, Yamaguchi-Shinozaki, 2007; Chung, Parish, 2008), нами были предприняты опыты с использованием эффективного ингибитора биосинтеза АБК флуридона (Cammue et al., 1989).

Из рисунка 25 видно, что экспонирование проростков при температуре 6°С уже через 1 ч привело к двукратному повышению концентрации АБК, тогда как предобработка флуридоном предотвратила вызываемое холодом новообразование АБК в растениях. Это, в свою очередь, отразилось в торможении, но не в предотвращении холод-индуцируемой транскрипции TADHN гена дегидрина

а 500 п и

й 400£ >S

£ 300 -о

■fc 200 -

Ш 100 -<

- Контроль —

Д--5-.

. 6о С . -4- - Фл+бо С

3 4 5 Время, ч

0 О * 200

.ЬI

1 8 I

5 Е g 150

I I 6

5 о

J| 1.

□ 6о С □ Фл+бо С

T ъ

Время, ч

Рисунок 25. Влияние ингибитора синтеза АБК флуридона (5 мг/л) на динамику содержания АБК в проростках пшеницы в условиях холодового стресса (6°С). Контрольные растения (1); растения, предобработанные (2) и необработанные флуридоном (3) и подвергнутые воздействию низкой температуры

Полученные нами результаты свидетельствуют в пользу важной роли индуцируемого холодом повышения уровня эндогенной АБК в транскрипции гена TADHN, особенно четко проявляющейся в начальный период стресса, тогда как в последующий период стресса все большее значение приобретает именно холодовой сигнал. Чувствительность генов дегидринов как к АБК, так и к холоду, определяется наличием в их промоторах ABRE (ABA-responsive)-ty«c-3neMeHTOB, включающих консервативную ACGT последовательность, с которыми взаимодействуют активируемые АБК транскрипционные факторы семейства bZIP (basic leucine zipper) AREB/ABFs (ABA-responsive element-binding/ABA-binding factors) (Beck et al., 2007; Shinozaki, Yamaguchi-Shinozaki, 2007), а также C-repeat/DRE мотивов, чувствительных к CBF факторам (Stockinger et al., 1997; Liu et al., 1998).

Таким образом, различные взаимодействующие друг с другом комбинации цис-регуляторных элементов в промоторах генов дегидринов и разнообразие транс-активирующих факторов обусловливает их чувствительность к холоду и АБК (Puhakainen et al., 2004; Chung, Parish, 2008; Shinozaki, Yamaguchi-Shinozaki, 2007; Narusaka et al., 2003).

Участие лектина в формировании устойчивости растений пшеницы к холодовому стрессу

Низкотемпературный стресс, как известно, вызывает существенные изменения в скорости протекания важнейших физиолого-биохимических процессов, а также модификацию физико-химической структуры мембран и экспрессию генов некоторых специфических холодовых и конститутивных белков (Sevillano et al., 2009: Winfield eta 1., 2010). Примером последних может служить ген агглютинина зародыша пшеницы (АЗП), относящийся к ra¿-(responsive to abscisic acid) генам (Scriver, Mundy, 1990). АЗП - типичный представитель лектинов злаков, синтез и накопление которого наблюдают в зародышах в период обезвоживания семян, при этом он является белком, характерным и для вегетирующих растений. Содержание АЗП в ходе онтогенеза пшеницы существенно меняется, что указывает на вероятность выполнения этим лектином важных физиологических функций (Шакирова, Безрукова, 2007). Известно также, что синтез и накопление АЗП в растениях пшеницы происходит в ответ на различные воздействия окружающей среды (Camraue et al., 1989; Шакирова и др., 2003). При этом накоплению АЗП в растениях предшествует обратимое увеличение концентрации эндогенной АБК (Scriver, Mundy, 1990; Shakirova et al., 2001).

Действительно, из рисунка 26а видно, что инкубирование проростков пшеницы при 7°С приводило к более чем двукратному увеличению уровня АБК в корнях, с максимумом, приходящимся на 2 ч.

600 -

,- 400

- Контроль - -л- - 7о С

2—5-

-Я-г

6 8 10 Время, ч

ó 10 5 „

2 4 IZ о < 2

— Контроль —d— 7о С

Iе \

8 10 Время, ч

Рисунок 26. Динамика содержания АБК (а) и АЗП (б) в корнях 4-суточных проростков пшеницы в ходе воздействия низкой положительной температуры (7°С).

Количественная оценка АЗП в корнях тех же растений выявила значительное накопление лектина с максимумом на 5 ч воздействия стресса (Рисунок 266).

Полученные результаты указывают на вовлечение АЗП в ответные реакции растений пшеницы на низкую положительную температуру, однако, как и в случае АБК, более чем трехкратное возрастание содержания АЗП в корнях в ответ на гипотермию было обратимым.

В связи с тем, что лектин пшеницы является экскретируемым белком (Саттие е! а!., 1989, Кильдибекова и др., 2004), важно было проанализировать содержание этого белка в среде инкубации проростков в ходе низкотемпературного стресса, а также в пост-стрессовый период. Из рисунка 27 видно, что за первые 7 ч воздействия стресса содержание АЗП в среде возрастало почти втрое в сравнении с контролем, при перенесении этих же проростков на свежую среду в условиях 7°С наблюдался дальнейший выход АЗП из растений, хотя его концентрация была уже значительно меньше; возвращение растений к нормальному температурному режиму на одни сутки привело к незначительной экскреции лектина в среду (Рисунок 27).

Местом преимущественного синтеза и аккумуляции АЗП являются меристематические ткани корней (Яа1кЬе1 й а1., 1984). Поэтому особый интерес представляла оценка митотического индекса (МИ) клеток кончиков корней проростков пшеницы после 24 ч воздействия гипотермии и влияние экзогенного АЗП на этот показатель в пост-стрессовый период.

Из рисунка 28 видно, что инкубирование проростков в течение 24 ч в условиях гипотермии приводило к торможению МИ клеток кончиков корней, а перенесение их на нормальную температуру (24/22°С) способствовало постепенному восстановлению митотической активности меристемы корней, однако, даже спустя двое суток после стресса МИ этих растений не достигал контрольного уровня. В то же время АЗП после воздействия низкой температуры практически в полной мере восстановил МИ

Рисунок 27. Содержание АЗП в среде инкубации 4-хсуточных проростков пшеницы при гипотермии через 7 часов (1), 24 часа (2) воздействия стресса и через 24 часа после удаления стресс-фактора (3).

2

3

клеток корней уже за одни сутки, а спустя двое суток МИ в этом варианте опыта превосходил значение контроля (Рисунок 28). Причем выявленный эффект характерен именно для АЗП. поскольку глиадин, запасной белок зерновок пшеницы, взятый в качестве белка не лектина, не оказал влияния на МИ клеток кончиков корней.

_Контэоль я Холод

6,5

~Холод+АВП ИХолод+глилдин

'Шй

5 6 7

Возросг прээоетков, сутки

Рисунок 28. Динамика митотической активности клеток апикальной меристемы корней проростков пшеницы. 4-сут. проростки подвергали 24-часовому холодовому стрессу, после чего 5-сут растения переносили на среду в нормальные условия температуры (24/22°С), содержащую или не содержащую 1 мг/л АЗП или 1 мг/л глиадина на сутки, а затем на свежую среду без белков.

Таким образом, полученные результаты указывают на вовлечение АЗП в формирование АБК-контролируемых защитных реакций растений пшеницы в ответ на гипотермию. Холод-индуцированное накопление АЗП в корнях сопровождается его активным высвобождением из меристематических тканей корней в наружную среду. АЗП, экскретируемый в область, окружающую кончик корня, вероятно, в качестве экзогенного белка может оказывать защитный эффект на деление клеток в ходе воздействии гипотермии и ускорять восстановление митотической активности клеток апикальной меристемы корней проростков пшеницы в пост-стрессовый период.

Заключение

Совокупность полученных нами результатов позволяет констатировать, что в

основе фундаментального процесса адаптации растений к гипотермии лежит

способность растительных организмов реализовывать широкий спектр защитно-

40

приспособительных реакций, необходимых для развития их устойчивости к данному стрессовому воздействию, среди которых можно выявить общие неспецифические физиолого-биохимические защитные реакции. К таковым, прежде всего, относятся сдвиги в состоянии гормональной системы растений, играющей ключевую роль в регуляции переключения генетических программ и, следовательно, функциональной активности клеток, с нормальных условий на так называемые стрессовые программы. Это многофакторный процесс, в котором задействован широкий спектр генов. Для лучшего понимания их взаимодействия необходимо знание особенностей регуляции их функционирования.

Белки холодового шока растений, предположительно относящиеся к семейству богатых аланином антифризных белков, играют важную роль в торможении образования внутриклеточного льда в условиях гипотермии. К ним относится и ген БХШ С5Р5 капусты. С использованием ингибиторного анализа нами на протопластах и растениях капусты прослежены пути передачи низкотемпературного сигнала из внешней среды. Так, выявлено, что холод-индуцируемая экспрессия гена С£Р5 обусловлена активацией кальциевых каналов и увеличением потока ионов кальция в цитоплазму в результате изменения состояния клеточных мембран. В свою очередь, повышение концентрации ионов кальция в цитоплазме может приводить к активации кальций-зависимых протеинкиназ, и, следовательно, этапа фосфорилирования, необходимого для регуляции индуцируемой холодом экспрессии гена С5Р5.

К характерным ответным реакциям растений на нарушения температурного режима относится быстрое, обычно транзиторное, накопление АБК (Агоса е1 а1., 2003), что также продемонстрировано в нашей работе на разных растительных объектах. В связи с этим не удивительно, что ген СЗР5 проявляет чувствительность к экзогенной АБК. Однако анализ транскрипционной активности С5Р5 гена в предобработанных АБК и подвергнутых холодовому воздействию растениях капусты, свидетельствует в пользу реализации как АБК-, так и холод-зависимых путей регуляции данного процесса, что, вероятно, обусловлено наличием в промоторе этого гена различных как АБК-, так и холод-чувствительных цис-мотивов. Использование ингибитора синтеза АБК флуридона позволило выявить наличие как АБК-опосредуемых, так и холод-индуцируемых путей регуляции клонированного гена ТАВНИ дегидрина в растениях пшеницы в ходе гипотермии. Это указывает на независимые пути сигнальной (АБК, холод) регуляции генов защитных белков и свидетельствует о надежности систем регуляции стрессового ответа растений.

Эффективными индукторами стресс-устойчивости растений, наряду с АБК, служат и другие фитогормоны, в спектре регуляторного действия которых достойное место занимает антистрессовая активность. К таковым, в частности, относятся брассиностероиды, участвующие в регуляции устойчивости растений к стрессовым воздействиям, в том числе и к холоду. Впервые выявлен факт участия в регуляции индукции транскрипции генов дегидрина не только АБК, признанного индуктора экспрессии генов дегидринов, но и 24-эпибрассинолида. Это указывает на существование альтернативных путей гормональной регуляции экспрессии генов дегидринов, что может быть обусловлено наличием в их промоторах сайтов узнавания различных гормонов.

Это заключение справедливо и в отношении гена CSP5 капусты. Так, ЭБ-индуцированная экспрессия гена БХШ вносит важный вклад в реализацию его защитного действия на растения (капуста, пшеница) при гипотермии, которое проявляется в снижении уровня повреждающего действия низкотемпературного стресса на рост растений и в ускорении восстановления ростовых процессов в постстрессовый период. Следовательно, вовлечение белков холодового шока и дегидринов в спектр действия ЭБ на проростки пшеницы и цветной капусты в нормальных и стрессовых условиях может служить показателем развития у растений под влиянием данного фитогормона предадаптирующего и протекторного эффектов.

Кроме CSP5 и дегидринов, вклад в формирование устойчивости растений вносит также агглютинин зародыша пшеницы, типичный представитель лектинов злаков, который, однако, является строго АБК-контролируемым.

Выявлено влияние неблагоприятных температурных условий, а именно охлаждения, на статус метилирования промоторных областей гена транскрипционного фактора CBF капусты. Полученные нами данные об уменьшении степени метилирования ДНК при холодовой обработке растений согласуются с концепцией взаимосвязи уровня экспрессии генов и степени метилирования генома (Bird, 2002). Подтверждением этому служат также данные о том, что содержание метилцитозинов в последовательности ДНК промотора гена CBF, снижающееся у растений, прошедших этап холодового закаливания, в нормальных температурных условиях частично возвращается в первоначальное состояние. Таким образом, литературные данные и результаты наших исследований показывают, что модификация хроматина, обусловленная частично метилированием / деметилированием ДНК, может приводить к изменениям в экспрессии генов CBF за

счет их ингибирования или, наоборот, индукции, в благоприятных или неблагоприятных внешнесредовых условиях. Однако, выяснение конкретных механизмов взаимосвязи между изменением степени метилирования цитозинов в промоторной области гена C5F капусты и уровнем его экспрессии, требует дальнейших исследований. Возможно, деметилирование определенных цитозинов способствует изменению скорости цис-активации экспрессии гена СВР или, возможно, имеет место изменение структуры хроматина в обнаруженном нами метилированном участке, что тоже может способствовать усилению транскрипции.

Выводы

1. Клонирован специфичный для семейства капустных ген белка холодового шока С5Р5, в структуре которого имеются 3 вС-богатых экзона (56 п.н., 68 п.н., 73 п.н., соответственно), разделенные двумя АТ-богатыми интронами размером 283 п.н. и 120 п.н.

2. Аминокислотный состав БХШ капусты, выведенный на основе нуклеотидной последовательности, характеризуется высоким содержанием аланина (около 20%), лизина (около 13%) и глицина (около 11%), распределенных неравномерно в полипептидной цепи и сконцентрированных в трех аланин-глицин-богатых участках. Компьютерный анализ аминокислотной последовательности показал общую гидрофильность белка, при наличии трех относительно гидрофобных участков, совпадающих с аланин-глицин-богатыми фрагментами белка.

3. Экспрессия гена БХШ капусты индуцируется под воздействием экзогенной абсцизовой кислоты, гипотермии, а также дегидратации.

4. Выявлена многоступенчатость передачи низкотемпературного сигнала из внешней среды, включающая активацию кальциевых каналов и увеличение потока ионов кальция в цитоплазму, сопровождаемое активацией кальций-зависимых протеинкиназ, участвующих, по-видимому, в активации факторов транскрипции, задействованных в экспрессии гена белка холодового шока капусты СБР5. Показана роль процессов реорганизации цитоскелета в активации экспрессии гена белка холодового шока капусты СБР5.

5. Получены приоритетные данные, демонстрирующие участие 24-эпибрасинолида в независимой от АБК стимуляции экспрессии гена СБР5 и защитное действие на проростки капусты при гипотермии.

6. Впервые клонирован фрагмент гена СВР капусты протяженностью 858 пар нуклеотидов, включающий промоторную область и транскрибируемую часть, и выявлена его консервативность для семейства капустных. Установлено, что экспрессия гена СВР у растений, прошедших этап холодовой акклимации, носит значительно более интенсивный и долговременный характер по сравнению с экспрессией этого гена у растений без холодового закаливания.

7. В промоторной части гена C5F капусты обнаружена метилированная область, включающая в себя 60 метилированных цитозинов, тогда как в 5'-транскрибируемом участке исследуемого гена метилцитозины отсутствуют. Обнаружено, что закаливание приводит к частичному деметилированию в выявленной в промоторе метилированной области. Сравнение степени метилирования цитозинов в промоторной области гена СВР закаленных растений и растений, помещенных в нормальные температурные условия после закаливания, выявило, что при снятии стрессовых температурных условий часть деметилированных в процессе закаливания последовательностей промоторной области исследуемого гена метилируется вновь.

8. Клонирован чувствительный к гипотермии и АБК дегидрин-подобный ген пшеницы ТАОРМ, имеющий высокую степень гомологии с генами дегидрина ячменя (Нт8 и пшеницы семейства \Vcor410 и включающий последовательность, кодирующую обязательный для дегидринов /{'-сегмент. Установлено, что при нормальных температурных условиях АБК вызывает индукцию экспрессии ТАйНЫ гена дегидрина в проростках пшеницы. С использованием ингибитора синтеза АБК флуридона выявлено, что регуляция активности экспрессии ТАОНЫ гена дегидрина пшеницы эпибрассинолидом осуществляется независимым от АБК путем.

9. Выявлен вклад в формирование устойчивости пшеницы к гипотермии АБК-контролируемого транзиторного накопления агглютинина зародыша пшеницы в кончиках корней, сопровождаемого экскрецией лектина в окружающую среду. Функциональная роль лектина при этом может заключаться в поддержании митотической активности клеток апикальной меристемы корней и ускорении восстановления их роста в пост-стрессовый период.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ РАБОТЫ Статьи в рецензируемых научных журналах

1. Баймиев, Ан.Х. Экспрессия гена аланин-богатого белка капусты при различных условиях холодовой акклимации / Ан.Х.Баймиев, Ф.Р.Гималов, А.В.Чемерис, В.А.Вахитов // Физиология растений. 1999. Т. 46. № 4. С. 605-609.

2. Shakirova, F.M. Induction of wheat germ agglutinin synthesis by abscisic and gibberellic acids in roots of wheat seedlings / F.M.Shakirova, M.V.Bezrukova,

A.M.Avalbaev, F.R.Gimalov // Plant Growth Regulation. 2001. V. 33. P. 111-115.

3. Гималов, Ф.Р. Распространенность генов низкомолекулярных аланин-богатых белков «холодового шока» в растениях умеренного климата и вариабельность их первичной структуры / Ф.Р.Гималов, Ан.Х.Баймиев, Ал.Х.Баймиев, Чемерис A.B.,

B.А.Вахитов // Генетика. 2001. Т. 37. С. 1021-1024.

4. Шакирова, Ф.М. Участие абсцизовой и гибберелловой кислот в регуляции экспрессии гена АЗП в корнях проростков / Ф.М.Шакирова, М.В.Безрукова, А.М.Авальбаев, Ф.Р. Гималов // Вестник Башкирского университета. 2001. вып. №2 (1). С. 105-107.

5. Шакирова, Ф.М. Стимуляция экспрессии гена агглютинина зародыша пшеницы в корнях проростков под влиянием 24-эпибрассинолида / Ф.М.Шакирова, М.В.Безрукова, А.М.Авальбаев, Ф.Р.Гималов // Физиология растений. 2002. Т.49. №2.

C.253-256.

6. Аллагулова, Ч.Р. Дегидрины растений: их структура и предполагаемые функции / Ч.Р.Аллагулова, Ф.Р.Гималов, Ф.М.Шакирова, В.А.Вахитов // Биохимия. 2003. Т. 68, вып. 9. С. 1157-1165.

7. Гималов, Ф.Р. О восприятии растением холодового сигнала / Ф.Р.Гималов,

A.В.Чемерис, В.А Вахитов // Успехи современной биологии. 2004. Т. 124, № 2. С. 185-196.

8. Гималов, Ф.Р. Начальные этапы индукции экспрессии гена белка холодового шока капусты / Ф.Р.Гималов, А.Х.Баймиев, Р.Т Матниязов., А.В.Чемерис,

B.А.Вахитов // Биохимия. 2004. Т. 36, № 5. С. 575-579.

9. Шакирова, Ф.М. Индукция экспрессии гена дегидрина TADHN и накопление абсцизовой кислоты в растениях пшеницы при гипотермии / Ф.М.Шакирова, Ч.Р.Аллагулова, М.В.Безрукова, Ф.Р.Гималов // Доклады РАН. 2005. Т. 400, № 4. С. 550-552.

10. Гималов, Ф.Р. Влияние 24-эпибрассинолида на рост проростков капусты при холодовом стрессе / Ф.Р.Гималов, Р.Т.Матниязов, А.В.Чемерис, В.А.Вахитов // Агрохимия. 2006. №8. С. 34-37.

11. Аллагулова, Ч.Р. Структура дегидрин-подобного гена TADHN мягкой пшеницы и участие АБК и 24-эпибрассинолида в активации его экспрессии / Ч.Р.Аллагулова, Ф.Р.Гималов, А.М.Авальбаев, А.Р.Сахабутдинова, Р.А.Юлдашев, Ф.М.Шакирова // Физиология растений. 2007. Т. 54, № 1. С. 131-136.

12. Шакирова, Ф.М. Роль эндогенной АБК в индуцируемой холодом экспрессии TADHN гена дегидрина в проростках пшеницы / Ф.М.Шакирова, Ч.Р.Аллагулова, М.В.Безрукова, А.М.Авальбаев, Ф.Р.Гималов // Физиология растений. 2009. Т.56. № 5. С. 796-800.

13. Гималов, Ф.Р. Экспрессия CBF-подобного гена цветной капусты (Brassica oleracea L.) при холодовом стрессе / Ф.Р.Гималов, Д.С.Фарафонтов, Д.А.Чемерис, Р.Т.Матниязов, А.В.Чемерис // Агрохимия. 2011. № 11. С. 88-95.

14. Гималов, Ф.Р. Изменение степени метилирования ДНК промоторной области CBF-гена капусты Brassica oleracea L. при холодовой акклимации / Ф.Р.Гималов, Д.С.Фарафонтов, Д.А.Чемерис, Р.Т Матниязов., А.В.Чемерис // Вестник Башкирского университета. 2012. Т. 17, № 1. С. 82-85.

15. Безрукова, М.В. Участие агглютинина пшеницы в формировнии устойчивости растений к гипотермии / М.В.Безрукова, А.Р.Лубянова, Ф.Р.Гималов, Ф.М.Шакирова // Агрохимия. 2012. № 4. С. 37-42.

16. Гималов, Ф.Р. Степень метилирования ДНК промоторной области CBF-гена цветной капусты Brassica oleracea L. при различных температурных условиях выращивания / Ф.Р.Гималов, Д.С.Фарафонтов, Р.Т.Матниязов, А.В.Чемерис // Вестник Башкирского университета. 2012. Т. 17, №4. С. 1749-1752.

Тезисы докладов и статьи в сборниках конференций:

17. Вахитов, В.А. Сравнительное изучение генов белков холодового шока растений семейства крестоцветных при холодовой акклимации / В.А.Вахитов, Ан.Х.Баймиев, А.В.Чемерис, Ф.Р.Гималов // Биотехнология. Теория и практика. 1997. № 3. С. 32.

18. Gimalov, F.R. Low temperature induction of genes of cold shock proteins in Brassica oleracea and some other representatives of Cruciferae family / F.R.Gimalov, A.Kh.Baimiev, A.V.Chemeris, V.A.Vakhitov // Biological Bulletin of Poznan. 1997. V. 34. Supplement. P. 72-73.

19. Shakirova, F.M. The involment of epibrassinolide in the induction of expression of WGA-gene in roots of wheat seedlings / F.M.Shakirova, M,V.Bezrukova, A.M.Avalbaev, F.R.Gimalov // Abs.l 1th Congress FESPP, Varna, Bulgaria. In: Bulg. J. Plant Physiol. 1998. V.ll (s).P. 95.

20. Шакирова, Ф.М. Индукция экспрессии гена лектина пшеницы под влиянием фитогормонов / Ф.М.Шакирова, А.М.Авальбаев, М.В.Безрукова, Ф.Р.Гималов //

Тезисы докладов IV съезда общества физиологов растений России. Москва. 1999. С. 786.

21. Баймиев, А.Х. Распространеность генов, подобных гену БХШ капусты, в геномах растений разных семейств / А.Х.Баймиев, Ф.Р.Гималов, А.В.Чемерис, В.А.Вахитов // Тезисы докладов IV съезда общества физиологов растений России. Москва. 1999. С. 317.

22. Гималов, Ф.Р. Экспрессия гена аланин-богатого белка капусты при различных условиях холодовой акклимации / Ф.Р.Гималов, А.Х.Баймиев, А.В.Чемерис, В.А.Вахитов // Тезисы докладов IV съезда общества физиологов растений России. Москва. 1999. С. 342.

23. Shakirova, F.M. Induction of the expression of WGA-gene in roots of wheat seedlings by gibberellic acid / F.M.Shakirova, A.M.Avalbaev, M.V.Bezrukova, F.R.Gimalov//Plant Physiol. Biochem. 2000. V. 38 supl. P. 87.

24. Шакирова, Ф.М. Взаимовлияние фитогормонов в регуляции экспрессии гена агглютинина зародыша пшеницы / Ф.М.Шакирова, А.М.Авальбаев, М.В.Безрукова, Ф.Р.Гималов // Иммуноанализ регуляторов роста в решении проблем физиологии растений, растениеводства и биотехнологии. Уфа. 2000. Изд-во: АН РБ. С.13-18.

25. Shakirova, F.M. Transcriptional and posttranscriptional levels of regulation by ABA of lectin content in roots of wheat seedlings / F.M.Shakirova, A.M.Avalbaev, M.V.Bezrukova, F.R.Gimalov // Int. Symposium "Stress under environmental stress". Москва. 2001. P. 208.

26. Shakirova, F.M. Regulation of WGA synthesis in roots seedlings by ABA / F.M.Shakirova, A.M.Avalbaev, M.V.Bezrukova, F.R.Gimalov // Тезисы докладов Международной конференции «Актуальные вопросы экологической физиологии растений в 21 веке». Сыктывкар. 2001. С. 369.

27. Shakirova, F.M. The influence of phytohormones on induction of the expression of WGA gene in roots of wheat seedlings / F.M.Shakirova, M.V.Bezrukova, A.M.Avalbaev, F.R.Gimalov // Int. Symposium "Signalling systems of plant cells". Москва. 2001. P. 106.

28. Аллагулова, Ч.Р. Индукция экспрессии генов дегидринов абсцизовой кислотой / Ч.Р.Аллагулова, Ф.М.Шакирова, Ф.Р.Гималов, А.В.Чемерис // Тезисы научных докладов III съезда биохимического общества. Санкт-Петербург. 2002. С. 387-388.

29. Bezrukova, M.V. WGA participates in protection of cells in wheat seedlings roots in responds to cold stress / M.V.Bezrukova, A.R.Kildibekova, F.R.Gimalov, F.M.Shakirova // Acta Physiologiae Plantarem. 2004. Sp. Issue The 14th FESPB Congress. Cracow, Poland. P. 229.

30. Гималов, Ф.Р. Влияние реорганизации цитоскелета и изменения активности протеинкиназ на экспрессию гена белка холодового шока капусты / Ф.Р.Гималов,

В.А.Вахитов, А.В.Чемерис, Р.Т.Матниязов, А.Х.Баймиев // Стрессовые белки растений. Материалы Всероссийской научной конференции. Иркутск. 2004. С. 31-34.

31. Аллагулова, Ч.Р. Низкотемпературная индукция экспрессии дегидрин-подобного гена TADHN в растениях пшеницы / Ч.Р.Аллагулова, Ф.Р.Гимапов, Ф.М.Шакирова // Материалы III междисциплинарной конференции. Петрозаводск. 2004. С. 41.

32. Гималов, Ф.Р. Влияние фитогормона эпибрассинолида на регуляцию экспрессии гена белка холодового шока капусты / Ф.Р.Гималов, Р.Т.Матниязов, А.В.Чемерис,

B.А.Вахитов // Международная конференция «Физиологические и молекулярно-генетические аспекты сохранения биоразнообразия». Вологда. 2005. С. 45.

33. Матниязов, Р.Т. Новые технологии амплификации нуклеиновых кислот в режиме реального времени для изучения транскрипционной активности отдельных генов / Р.Т.Матниязов, Ф.Р.Гималов, А.Х.Баймиев, А.В.Чемерис, В.А.Вахитов // Международная конференция «Физиологические и молекулярно-генетические аспекты сохранения биоразнообразия». Вологда 2005. С. 111.

34. Shakirova, F.M. Expression of the dehydrin-like gene TADHN in the wheat plants under water stress conditions / F.M.Shakirova, C.R.Allagulova, A.R.Sakhabutdinova, F.R.Gimalov // Abstracts of the XV Congress of the Federation of European Societies of Plant Biology (FESPB) Lyon, France. 2006. P. 162.

35. Гималов, Ф.Р. Холодовая регуляция экспрессии СЯ/^подобного гена капусты Brassica oleráceo / Ф.Р.Гималов, Д.С.Фарафонтов, Д.А.Чемерис, Р.Т.Матниязов, А.В.Чемерис // Материалы VII Съезда Общества физиологов растений России. Нижний Новгород. 2011. С. 183.

36. Фарафонтов, Д.С. Влияние низкой температуры на степень метилирования ДНК промоторной области CBF-гена капусты Brassica oleráceo L. / Д.С.Фарафонтов, Р.Т.Матниязов, Ф.Р.Гималов // Материалы III Международной научно-практической конференции «Современные проблемы биологии, экологии и химии». Запорожье. 2012.

C. 54-55.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АБК - абсцизовая кислота

АЗП - агглютинин зародыша пшеницы

АФК - активные формы кислорода

БСА - бычий сывороточный альбумин

ДДС - додецилсульфат натрия

ДТТ - дитиотреитол

ПОЛ - перекисное окисление липидов

СОД - супероксиддисмутаза

ТАЕ - трис-ацетатный буфер

TBE - трис-боратный буфер

ТЕ - трис-ЭДТА буфер

ТЕМЕД - тетраэтилметилендиамин

Су5 - цианин-5

CBF - CRT-öinding/actor

CRT -C-repeat

FAM - 6-карбоксифлуоресцеин

Отпечатано с готового оригинал - макета на собственной полиграфической базе ИСЭИ УНЦ РАН 450054, РБ, г. Уфа, пр. Октября, 71 Тел: (8-347) 235-55-33, факс: (8-347) 235-55-44 Заказ № 08. Подписано в печать 01.06.2014 г. Формат 60x84, 1/16. Бумага типа «Снегурочка» Гарнитура «Times». Усл. печ. л. 02,40 Уч.-изд. л. 03,13 Тираж 100 экз.