Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Белки с доменом холодового шока растения-экстремофита Thellungiella salsuginea в процессе адаптации растений к низким температурам

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Белки с доменом холодового шока растения-экстремофита Thellungiella salsuginea в процессе адаптации растений к низким температурам"

На правах рукописи

Таранов Василий Васильевич

Белки с доменом холодового шока растения-экстремофита Thellungiella salsuginea (Pall.) в процессе адаптации растений к низким температурам

03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнология)

21 НОЯ 2013

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

005539960

Москва 2013

005539960

Работа выполнена в лаборатории стрессоустойчивости растений Государственного научного учреждения Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии Россельхозакадемии (г. Москва).

Научный руководитель:

Бабаков Алексей Владимирович, доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты:

Хрусталева Людмила Ивановна, доктор биологических наук, профессор, преподаватель кафедры генетики и биотехнологии РГАУ-МСХА

Новикова Галина Викторовна, доктор биологических наук, в.н.с. лаборатории молекулярных основ внутриклеточной регуляции ИФР РАН

Ведущая организация:

Центр «Биоинженерия» РАН (г. Москва)

Защита состоится «f'f» QtJ(/*l3fUL 2013 г. в // часов на заседании диссертационного совета Д.0сГб.027.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной биотехнологии по адресу: 127550, Москва, Тимирязевская, 42. Тел.: (499) 976-65-44, факс: (499) 977-09-47 e-mail: iab@iab.ac.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной биотехнологии.

Автореферат разослан 2013 г., размещен на Интернет-сайте

www.vniisb.ru «С8 » fffXS^P 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, Кандидат биологических наук /}fl

ВобликоваВ.Д.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Молекулярные механизмы устойчивости растений к абиотическому стрессу являются одной из наиболее изучаемых проблем современной биологии растений. Повышенный интерес к исследованиям в этой области объясняется тем, что научные вопросы соприкасаются с экономическими проблемами. Низкотемпературный стресс негативно влияет на рост сельскохозяйственных растений, ограничивая их географическое распространение и снижая их продуктивность. В этой связи большое значение имеет изучение механизмов устойчивости сельскохозяйственных культур к низким температурам, результатом которого может быть создание новых холодостойких сортов, а также расширение посевных площадей. В настоящее время благодаря достижениям современной науки появилась возможность создания устойчивых сортов сельскохозяйственных культур с помощью методов генетической инженерии путем целенаправленного изменения экспрессии собственных генов или путем введения в геном культурных растений генов из других видов и семейств.

Несмотря на большие усилия мирового научного сообщества в решении проблемы повышения устойчивости растений к неблагоприятным факторам внешней среды, успехи в создании устойчивых сортов сельскохозяйственных растений генно-инженерными методами весьма скромны. И связано это прежде всего с недостатком фундаментальных знаний о молекулярных механизмах, лежащих в основе устойчивости растений к холодовому стрессу. Известно, что при выдерживании растений в течение нескольких дней при низких положительных температурах они приобретают повышенную устойчивость к отрицательным температурам. Этот процесс называется закаливанием (cold acclimation). При этом процессе в растениях индуцируются изменения в метаболизме, что в конечном итоге приводит к

повышению их холодоустойчивости (Zhu et al. 2007). Эти изменения включают в себя модификации мембран растений, накопление Са2+ в цитозоле, увеличение уровня ROS, активацию систем утилизации ROS, изменения в синтезе белков и Сахаров, накопление пролина и биохимические изменения, влияющие на фотосинтез.

Большая часть информации, касающейся молекулярных механизмов устойчивости, получена в работах с Arabidopsis thaliana, растения с небольшим геномом, нуклеотидная последовательность которого определена полностью. Холодоустойчивость принято связывать с функционированием факторов транскрипции CBF/DREB (Gilmour et al. 2009; Liu et al. 2009), факторов, так или иначе модулирующих структуру мембран (Uemura et al. 2006), гена неизвестной функции Eskimol (Xin et al. 2007) и белков с древним, высококонсервативным доменом холодового шока (CSD) (Скабкин с соавт. 2004).

В последнее время в качестве модельного объекта для изучения устойчивости растений к различным стрессам используется растение Thellungiella salsuginea (halophila). Это близкородственное A. Thaliana растение отличается гораздо большей холодо- и солеустойчивостью (Amtman, 2009). Молекулярные механизмы, лежащие в основе повышенной устойчивости Т. Salsuginea к абиотическим стрессам, пока остаются малоизученными. Особенно это касается холодового стресса.

Исходя из данных об участии CSDP в адаптации A. Thaliana к холодовому стрессу и большого сходства геномов двух растений, мы попытались ответить на вопрос, может ли повышенная морозоустойчивость Т. salsuginea объясняться особенностями первичной структуры CSDP и/шш их синтезом в ответ на охлаждение, а также оценить перспективность использования генов CSDP Т. salsuginea в биотехнологии культурных растений с целью повышения их устойчивости к абиотическому стрессу.

В соответствии с изложенными целями были поставлены следующие

задачи:

- идентифицировать гены белков с доменом холодового шока в растении Т. Salsuginea;

- исследовать экспрессию идентифицированных генов в ответ на холодовой стресс;

-исследовать РНК шаперонную активность идентифицированных TsCSDP и их CSD и С-концевых доменов;

- получить трансгенные растения Arabidopsis thaliana, экспрессирующие идентифицированные гены TsCSDP, и провести молекулярно-биологический анализ полученных трансгенных растений.

Научная новизна. В данной работе впервые идентифицированы четыре гена, кодирующие CSD белки в растении Thellungiella salsuginea (TsCSDPl-4). Обнаружено, что экспрессия всех идентифицированных генов регулируется холодовым стрессом, а динамика ее изменения уникальна для каждого гена. Установлена нуклеотидная последовательность промоторной области гена TsCSDP 1, в ней обнаружены цис-элементы, типичные для генов, активируемых холодовым стрессом. В тесте по комплементации роста мутантных бактерий E.coli ВХ04 (ДcspA, AcspB, kcspE, AcspG) показано, что активными в этом тесте являются домены холодового шока белков TsCSDP, а добавление к ним мотивов Zn-F приводит к потере активности. Получены траснгенные растения Arabidopsis thaliana, экспрессирующие ген TsCSDP2 или ген TsCSDP3. Молекулярно-биологический анализ трансгенных растений показал, что только гетерологичная экспрессия TsCSDP3 привела к повышению морозоустойчивости трансгенных растений. Анализ экспрессии COR генов в закаленных и незакаленных растениях с TsCSDP3 показал, что участие этого белка в процессах закаливания не зависит от известных молекулярных механизмов, вовлекающих факторы транскрипции CBF/DREB, Eskimol, Zat6, Zatl2.

Апробация работы. Результаты исследований представ длены на VIII и XIII молодежных научных конференциях «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии (2008, 2013), IV Всероссийском симпозиуме «ТРАНСГЕННЫЕ РАСТЕНИЯ: технологии создания, биологические свойства, применение, биобезопасность» (2012), IX международном семинаре «international Plant Cold Hardiness» 2011, XVII Конгрессе федерации Европейских обществ биологов растений (FESPB) (2010)

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания методов и объектов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 164 источника. Материалы диссертации изложены на 135 страницах машинописного текста, включая 8 таблиц и 22 рисунка.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследований. Семена Thellungiella salsuginea (Pall.) О.Е Schulz были собраны вблизи города Якутска (61° с.ш., 130° в.д.; республика Саха). Материалом для исследования служили розеточные листья четырехнедельных растений, выращенных при температуре 24/15°С (день/ночь) и 16 часовом фотопериоде в климатической камере Fitotron 600Н ("Gallenkamp", Великобритания). В качестве второго объекта исследований служила суспензионная культура клеток Т. Salsuginea, полученная в лаборатории физиологии культивируемых клеток ИФР РАН ведущим научным сотрудником, доктором биологических наук A.B. Носовым.

Выделение РНК. Из опытных образцов растений и суспензионной культуры выделяли суммарную РНК с использованием реагента Trizol («Invitrogen», США) в соответствии с рекомендациям фирмы-изготовителя.

Выделение геномной ДНК из растений проводили в соответствии с методом (Kang and Yang, 2004).

Синтез кДНК, постановку ПЦР, клонирование генно-инженерных конструкций осуществляли согласно протоколам «Molecular cloning» (Sambrook and Russell, 2001).

Идентификация генов TsCSDP. Центральные фрагменты четырех генов TsCSDPl—4 амплифицировали с помощью праймеров, подобранных, исходя из вероятной гомологии генов Т. salsuginea и A. thaliana. Для секвенирования недостающих 5'- и 3'- участков кДНК использовали метод RACE ПЦР. После прочтения 5'- и З'-фрагментов полные нуклеотидные последовательности кДНК TsCSDPl-3 реконструировали, объединяя 5'-концевые, З'-концевые и центральные фрагменты кДНК.

Измерение экспрессии генов TsCSDPl-4 в растениях и клетках суспензионной культуры Т. salsuginea проводили, используя ген специфичные праймеры, подобранные к 3'- нетранслируемым участкам кДНК генов TsCSDP 1—4. В качестве референсного гена использовали ген актина. ПЦР в реальном времени проводили с использованием интеркалирующего красителя SYBR Green на приборе АНК32 (Россия). Определение нуклеотидной последовательности промоторной области гена TsCSDPl. Промоторную область TsCSDPl амплифицировали с геномной ДНК с помощью специфичного праймера к гену TsCSDPl и праймера к З'-кодирующей области гена At4g36030.1. Полученный в результате ПЦР фрагмент ДНК размером 1516 п.н. клонировали и секвенировали. Он включал З'-концевую часть гомолога гена At4g36030.1 длиной 187 п.н., межгенную область (473 п.н.) и 5'-концевую часть гена TsCSDPl длиной 856 п.н. Поиск и анализ возможных регуляторных цис-элементов в указанном межгенном районе проводили с помощью инструментов ресурса www.dna.affrc.go.jp/PLACE.

Комплементация роста бактерий мутантного штамма E.coli ВХ04(А«рД, AcspB, &.cspE, AcspG) при пониженной температуре. Нуклеотидные последовательности, кодирующие полные белки TsCSDPl-3, CSD1-3, С-концевые фрагменты TsCSDPl-3 с ZnF или CspA (E.coli) были

7

амплифицированы и клонированы в вектор рПМШ. Мутантные бактерии ВХ04 трансформировали созданными генетическими конструкциями, а также пустым вектором (рПЧШ). Клоны клеток, несущие рекомбинантную плазмиду, наносили по 7 мкл в разных разведениях на поверхность 1,5% агаризованной среды ЬВ с ампициллином, канамицином и 1РТО (0,2мМ) и выращивали при 17°С в течение 5 дней.

Трансформация растений АгаЬМоряЬя ОшИапа. Для агробактериальной трансформации использовали генетические конструкции на основе вектора рВ1121 с генами Т.чСБОР2 и ТъСЯОРЗ. Для биологических испытаний были отобраны по две линии гомозиготных трансгенных растений, показавшие максимальный уровень экспрессии целевого гена. Оценку способности генов ТлСЗОР2 и ТзСБйРЗ повышать устойчивость к низкотемпературному стрессу проводили двумя методами - по выживаемости растений, подвергнутых низкотемпературному стрессу, и путем измерения утечки электролита из листьев. Эксперименты по проверке морозоустойчивости проводили как на закаленных, так и на незакаленных растениях.

Измерение экспрессии генов, индуцируемых ХОЛОДОВЫМ стрессом, в трансгенных растениях Агаб/Луш'у МшИапа со сверхэкспрессией ТьСБйРЗ. Для измерения были выбраны гены СВР1, СВР2, СОЯб.б, СОИ 15А, СОР47, СОЯ78 Со/57, Со153, 7АТ6, 2АТ12, экспрессия которых в растениях А. гкаИапа существенно возрастает при закаливании (2иЛсг с1 а1. 2012). Для измерения брали шестинедельные растения А. ЛаНапа дикого типа и трансгенные растения с экспрессией Закаливание растений

проводили в течение 5 суток в климатической камере при 2°С. Растения контрольных групп были собраны в начале эксперимента. Экспрессию вышеперечисленных генов измеряли методом ПЦР в реальном времени в присутствии интеркалирующего красителя БуЬегСгееп.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Идентификация генов TsCSDPl-4. Идентификация генов была выполнена с использованием метода RACE-PCR. Центральные фрагменты четырех генов TsCSDPl^f амплифицировали с помощью праймеров, подобранных на основании вероятной гомологии генов Т. salsuginea и A. thaliana. Для секвенирования недостаю щих 5'- и 3'-участков к ДНК использовали праймеры фирмы Clontech для RACE PCR и специфичные праймеры, сконструированные на основе установленных нуклеотидных последовательностей центральных частей генов. Результирующие последовательности кДНК TsCSDPl-3 были получены после анализа перекрывающихся областей секвенированных фрагментов кДНК и объединения 5'-концевых, З'-концевых и центральных фрагментов кДНК. Идентифицированные гены зарегистрированы в базе данных GenBank: TsCSDP 1-GQ227854, TsCSDP2- GQ227855, TsCSDP3 - GQ227856.

MS------G-KMTGIVKWFNADKGFGFITPDDGSKDVFVHFSAIQNDGYKSLDEGQKVSFTIESGAKGPA-AGNVTSL

RNP1 RNP2

\\WWWWWWWWWV .******* **+*.*♦ ****•+++*****. ..++++*++*»» + »++» + ,

TsCSDPl (1) MALEDQFAG-RSTGKVNWFHD3KGYGPITPDDDGE®WH®SAILSEGFRSLTVGDSVEFAVTQGTDGKTKAVNVTAPGG TSCSDP2 (1) MSGE™NGGaRRRGTVKWFDT(J|jSpEtTPDDAGDl|^HtssIR5DGFRSLAADESVEFEVEMDHHGRPKAIEVSGPDG

TSCSDP3 (1) maqedqsaa-rstgkvnwfsdc^Hmtpddggdelfvh^ssivsdgfrsltvgesveyaitlgsdgktkavevtapgg

TSCSDP4 (1) ---------------------QKGFGFITPDDAGDDÜftö&SSIRSDGFRSLAADESVEFEVEMDNNGRPKAIEVSGPDG

+ + +...+ +*.*+.+ * .......*+. + ... .++ .++++....*++++..**.**+.** + ****•.* .++*, *

TsCSDPl (80) APLHRKEISSRGNGArrgG£^Pfe:^E^;{|f^|^^SSS--------DRGDRSSGl|^TCGDT^H|A^:VQKSSGN---GG

TSCSDP2 (81) APVQGTSGGSSGGRG---G-----FGGGRGGGRGSGG-GFGGGRGGGGGRGGHifbYKCGEPGHMARBpSEGGGGY---GG

TSCSDP3 (80) GSLKNKEISSRGNGG---G-;Ci^dGE£ig^S^EitvGGkSFGGGGRRSGGEGS-4cYMCGHVGHFARI^RQNAGGMsvqGG

TSCSDP4 ( 60 ) APVQGTSGGSSGGRG---G-----FGGGRGGGRGSGG-GFGGGRGGGGGRGGNqCYJCCGEEGHMARDCSQGGGGY---GG

TsCSDPl (149) SGGE-----------------RGG--------A-GGE-CYNCGNTGHFARftVQKSVGlWGDrGSGGGGTCYHCGGAGHM

TsCSDP2 [14 9) GGGG-YGGGGYGGDRGGGSYGGGG-RYGGGGGG-GGS-CYSCGESGHFARDCTSGGR-----------------------

TSCSDP3 (154) GGGAgji^äEV^aj^RGGSGGnRYGGGGRGsGGEGCYMCGDVGHFARlftRQHVGGDVGG-GGGGGNfg^ycgsSgiai

TSCSDP4 (12 8 ) GGGG—YGGGG-----------GGG-RFGRWRRW---R3CYSCGESGHFARDCTSGGR-----------------------

TsCSDPl (202) SRBgPTKRQP------G^^OlSsTIgii^MDRRSSGGGRGNAggggggl^igCGQaGB'^ft-SVA

TsCSDP2 (202)---------------------------------------------------------------------

T3CSDP3 (233) iBi!7gTSKRPSgggggvGiPg^iÖ^^i}DRIiGSGGGSGSS------I^B^^S^M^sSbA

TSCSDP4(16 9) ---------------------------------------------------------------------

Рис.1. Выравнивание аминокислотных последовательностей белков с доменом холодового шока Т. salsuginea (TsCSDP 1^1). В верхней строке представлен прокариотический прототип CSD (Е. coli). Верхние символы над выравниванием обозначают: (*) - полная идентичность для 4-х белков; (+) -для 3-х из 4-х или для двух пар; (.) - для 2х из 4х. Символ (\) внутри выравнивания - нет данных. Затемнением помечены консенсус-мотивы RNP1, RNP2 и мотивы цинковых пальцев ССНС-типа. (ClustalW 2.0 www.ebi.ac.uk/clustalw/')

Выравнивание аминокислотных последовательностей белков представлено на рис. 1. В верхней строке рисунка показан основной белок холодового шока Е. coli CspA в качестве прототипа домена CSD и с целью условной маркировки его границ. Два более длинных белка, TsCSDP 1 и TsCSDP3, состоят из 263 и 296 аминокислотных остатков соответственно. Два более коротких, TsCSDP2 и TsCSDP4, состоят из 202 и, вероятно, -180 аминокислотных остатков (последняя оценка приблизительна, так как нам ещё не удалось надежно установить N-концевую часть аминокислотной последовательности). Все четыре CSDP Т. salsuginea содержат в CSD обязательные элементы RNP1 и RNP2 на одинаковом расстоянии друг от друга. Остальная часть каждого TsCSDP содержит мотивы ZnF из 14 аминокислотных остатков, равномерно разделенные богатыми глицином участками. TsCSDP 1 и TsCSDP3 имеют шесть и семь ZnF соответственно, а TsCSDP2 и TsCSDP4 — по два ZnF. Выравнивание аминокислотных последовательностей TsCSDP 1—4 с гомологичными белками AtCSPl^ выявило 71-, 95-, 91- и 86%-ную гомологию между соответствующими парами.

Анализ экспрессии генов TsCSDPl-4 в растениях Thellungiella salsuginea. Анализ экспрессии генов TsCSDPl-4 проводили с помощью ПЦР в реальном времени с использованием праймеров, специфичных к отдельным генам TsCSDP. Сравнение количества мРНК генов TsCSDPl-4 в листьях растений Т. salsuginea, растущих в нормальных условиях, показано на рис. 2А. Транскршггы коротких белков (Р2, Р4) представлены в ббльшем количестве, чем длинных (PI, РЗ). Матричные РНК белков Р1-Р4 соотносятся как 10 : 27 : 1 : 31. В другой серии экспериментов мы проследили динамику экспрессии генов TsCSDPl-4 в процессе 4-х дневного охлаждения растений при + 4°С (рис. 2Б). Холодовая экспозиция оказывает сильное влияние на относительный уровень транскриптов всех четырех генов, а динамика экспрессии уникальна для каждого из генов TsCSDPl-4. Так, экспрессия

ТіСЖР7 менялась транзиентно, достигая максимума через 10 часов охлаждения и опускаясь до уровня экспрессии в контроле через четверо суток. Экспрессия Г-уСТО/^ быстро возрастала, достигая максимума уже через 3 часа после начала эксперимента, после чего постепенно снижалась, опускаясь ниже контрольного уровня через двое суток после начала охлаждения. Экспрессия ТзСБЭРЗ плавно возрастала в течение первых суток экспозиции на холоде и сохранялась на повышенном уровне в течение всего эксперимента. Экспрессия 7£С5Х>,Р4 росла все время проведения эксперимента, при этом на четвертые сутки экспрессия возрастала более чем в пять раз относительно уровня экспрессии в растениях, не подвергавшихся стрессу.

їжа тчс.ьпрі

1 1 тісяпр1

ІВ

г*

те

М

в б 2 :

—

ТзСвОРІ

ж

Зч 6ч 10ч 1с

Ш

ТзСЭОРЗ

ш

г§ї

Зч 6ч 10ч 1с

тэСБОРг

Ж

Зч

гЗп

бч 10ч 1с

Г*1 н

ТэСЗОР4

гН

пЬ

гЗп—

ІІ

Зч 6ч 10ч 1с 2с

Рис. 2. Содержание мРНК белков Т8С8БР1—4 в листьях 4-недельных растений: а - относительное содержание четырех видов матриц при нормальной температуре (количество мРНК ТбСБОРЗ принято за единицу) в листьях,— динамика экспрессии мРНК при + 4°С (уровень транскриптов при нормальной температуре (К) принят за единицу) (N=3).

Сравнение наших результатов с данными, полученными для арабидопсиса в сходных условиях выращивания (Каг1яоп еС а1. 2003), не выявило какого-либо сходства в динамике уровня мРНК для любой из пар гомологов.

Идентификация промоторной области 7яС57Ж/. Принимая во внимание столь значительные различия в динамике экспрессии гомологичных генов АгаЫ<1ор$1$ и 771 еИитеНа, мы попытались проанализировать их регуляторные элементы, расположенные в промоторной области. Зная, что АгаЬгс/е>/ш'.у и ТЪеПитеПа - близкородственные растения, мы предположили, что последовательность расположения генов на их хромосомах может частично совпадать. Исходя из этого предположения, мы проанализировали расстояние между кодирующими областями генов А(СЯР и соседними с ними генами в хромосомах, находящимися в 5' области относительно стартовых кодонов А1СБР. Это расстояние составило 741 н.п. для АгС8Р1, 1891 н.п. для ЛгС5Р2, 1994 н.п. для А&БРЗ и 3351 для н.п.А1СБР4. Учитывая, что наименьшее расстояние до соседнего гена оказалось у ЛгС50Р7, мы подобрали праймер к 3' кодирующей области соседнего с А&БР! гена, и второй праймер, специфичный для кодирующей области ТяСББР!. В результате нам удалось амплифицировать и секвенировать промоторную и выше расположенную регуляторную область гена

Анализ нуклеотидной последовательности показал, что ген ТвСЗОРЗ имеет кор-промотор, содержащий ТАТА-бокс и регуляторные цис-элементы, связанные с ответом растений на абиотические стрессы. Сравнение нуклеотидных последовательностей промоторных областей генов ТвСЗБРЗ и А1С8РЗ показало, что они идентичны на 45%, что существенно меньше идентичности кодирующих областей этих генов (71%). Как и ожидалось, многие из идентифицированных элементов были общими для этих близкородственных видов растений, некоторые специфичны для А. гкаНапа,

и большинство i/ис-элементов оказалось специфичным для Т. Salsuginea. Важно, что в группе общих и специфичных только для A. thaliana регуляторных элементов нет напрямую вовлеченных в процесс холодовой адаптации. Однако, ген Т. salsuginea оснащен элементами CRT/DRE и LTRE, типичными для генов, активируемых холодовым стрессом и регулируемых CBF/DREB факторами транскрипции (Ruelland et al. 2009, Fowler et al. 2003, Gilmour et al. 1998, Liu et al. 1998). Нельзя исключить, что именно эти элементы связаны с быстрой активацией TsCSDPl при низкой температуре.

Обобщая полученные результаты, можно заключить, что если большая, чем у Arabidopsis, холодоустойчивость Thellungiella связана с функционированием CSDP, то она обусловлена не структурными различиями в CSDP, а, скорее всего, межвидовыми различиями в регуляции экспрессии их генов при низкой температуре. Однако при этом нельзя исключить и роль белка TsCSDPl в холодоустойчивости Thellungiella salsuginea благодаря особенностям его первичной структуры.

Анализ экспрессии генов TsCSDPl-4 в клетках суспензионной культуры Thellungiella salsuginea. Для изучения физиологии растительных клеток помимо целых растений часто используются культивируемые клеточные культуры. В нашем исследовании мы использовали культуру клеток, полученную из листьев Thellungiella salsuginea экотипа «Якутск» в ИФР РАН в.н.с. А.В. Носовым. Сравнительные исследование суспензионных культур Т. Salsuginea и A. thaliana показало, что культура Т. Salsuginea значительно более устойчива к солевому и холодовому стрессу по сравнению с суспензионной культурой A. thaliana. Видимо, механизмы, обеспечивающие повышенную устойчивость к абиотическому стрессу Thellungiella по сравнению с Arabidopsis, функционируют не только на организменном, но и на клеточном уровне. Поэтому представлялось интересным сопоставить изменения в экспрессии генов TsCSDP на целых растениях и в клетках суспензионной культуры в ответ на холодовой стресс. Для этого клетки

суспензионной культуры была подвергнута холодовому стрессу в течение 8 суток. Анализ экспрессии генов проводили с помощью ПЦР в реальном времени. Образцы клеток суспензионной культуры брали при нормальных условиях роста (+26°С), а также через 3, 6, 12, 24 часа, 2, 4, и 8 суток после охлаждения (+4°С).

Оказалось, что соотношение транскриптов коротких белков Р2, Р4 и длинных PI, РЗ (4:28:1:58) принципиально не отличается от подобного соотношения для целых растений. Однако динамика изменения экспрессии TsCSDPl-4 под воздействием холодового шока была существенно иная, чем в целых растениях. Отмеченное различие указывает на то, что следует соблюдать большую осторожность при использовании данных, полученных на суспензионной культуре, для интерпретации поведения целых растений.

Комплементация роста бактерий мутантного штамма E.coli ВХ04 при пониженной температуре. Для оценки РНК-шаперонной активности полных CSD белков Т. Salsuginea, а также отдельно их фрагментов был проведен тест на способность указанных выше белков замещать бактериальные CSP в мутантных бактериях E.coli.. Для постановки эксперимента было создано десять генетических конструкций на основе вектора рШШ. Три из них содержали нуклеотидные последовательности, кодирующие полные TsCSDPl-З, три- домены холодового шока этих белков и три оставшиеся- С-концевые фрагменты с ZnF. Последняя десятая конструкция содержала ген белка CspA E.coli. Она была использована в качестве положительного контроля. На рисунке 3 показаны полученные результаты.

10"1 10"г 10"310-' 10'5 10"«

' Рис. 3. Плазмидная

TsCSDI full экспрессия TsCSD восстанавливает

TsCSDI CSD Г способность к росту при низкой

TsCSDI Zn F I температуре четверного мутанта Е.

coli ВХ04 (AcspA, AcspB, AcspE,

TsCSD2 full AcspG). Мутантные бактерии

TsCSD2CSD r 1ПНННН трансформировали: пустым

TsCSD2 Zn-F ШШШ BeKT0P0M (PINI1P' 3'

экспрессирующим белки TsCSDP и

TsCSD3 full их N- и С- концевые фрагменты Т.

!ЯР=95 salsuginea, либо собственный

TsCSD3CSD J[ / ' : белок (CspA) Е. coli.

TsCSD3 Zn-F pIN III

Из рисунка видно, что способностью восстанавливать рост мутантных бактерий обладают только домены холодового шока. Ни целые белки TsCSDP 1-3, ни их С-концевые фрагменты оказались не способны комплементировать мутации А cspA, AcspB, AcspE, AcspG в E. coli. При этом способность доменов холодового шока белков TsCSDP 1-3 восстанавливать рост мутантных бактерий существенно различалась.

Тщательное исследование собственно бактериальных белков с доменом холодового шока показало, что они, обладая РНК- шаперонной активностью, не проявляют в то же время высокой специфичности по отношению к различным РНК (Скабкин и др. 2004). Поэтому, можно думать на примере CSDP Thellungiella salsuginea, что добавление к домену холодового шока С-концевого фрагмента с ZnF приводит к повышению специфичности взаимодействия с РНК, что отрицательно сказывается в тесте по восстановлению роста клеток ВХ04 полными белками. Полученный результат указывает на существование в Т. Salsuginea, по-видимому, специфичных РНК -мишеней для TsCSDP, взаимодействие с которыми определяет механизм действия этих белков.

Трансформация А. thaliana генами TsCSDP2 и TsCSDP3 и молекулярно-биологический анализ трансгенных растений. Для дальнейшего анализа биологических функций генов CSD белков нами был применен один из методов прямой генетики - гетерологичная экспрессия генов, кодирующих целевые белки в модельном растении А. Thaliana. Для трансформации А. thaliana было выбрано два гена: TsCSDP2 и TsCSDP3. С этими генами были получены гомозиготные линии трансгенных растений А. thaliana поколения ТЗ. Растения этих линий были подвергнуты молекулярно-биологическому анализу. Используя метод ПНР в реальном времени для измерения экспрессии целевых генов, было отобрано по две линии с наибольшим уровнем экспрессии генов TsCSDP2 и TsCSDP3. Растения отобранных линий использовали для оценки морозоустойчивости в сравнении с растениями дикого типа. Оценку проводили двумя методами -путем измерения утечки электролитов из листьев растений, подвергнутых холодовому стрессу, и по выживаемости целых растений, оцененному через неделю после их промораживания. Эксперименты проводили как на незакаленных, так и на закаленных растениях. Утечку электролитов измеряли в листьях растений, которые вначале на 24 часа помещали в морозильную камеру в отсутствии света при температуре -3, -4 или -5°С, а затем в течение суток выдерживали при +4°С. Выживаемость растений оценивали визуально через две недели после промораживания.

Как незакаленные, так и закаленные трансгенные растения, экспрессирующие ген TsCSDP2, не отличались от растений дикого типа ни по утечке электролитов из листьев растений, подвергнутых морозу, ни по их выживаемости после промораживания. Трансгенные растения двух линий с геном TsCSDP3 по сравнению с растениями дикого типа показали существенно меньший выход электролитов после промораживания при температуре -4°С, но уже при температуре -5°С не наблюдалось разницы между трансгенными растениями и растениями дикого типа по этому

показателю. Выживаемость растений, экспрессирующих ТьСЪОРЗ, также была немного выше только после промораживания при -4°С: количество выживших растений линии ТвСБОРЗ-! составило 40%, Т8СЗОРЗ-2 - 60%, растений дикого типа - 20%.

А Б

Г-6С »"-8С 1'-10С

Рис. 4. Морозоустойчивость закаленных трансгенных растений АгаЫс1ор51$ по сравнению с растениями дикого типа(А1\\^): А- утечка электролитов из листьев в %, Б -выживаемость растений спустя две недели после экспозиции при -6°С в течении 24 часов.

Морозоустойчивость закаленных растений (+4°С в течение трех недель) проверяли, подвергая растения действию температур -6 (1С, -8 °С, -10 °С в течение 24 часов. Как видно из рис. 4, обе линии трансгенных растений с геном ТяС^ОР.? показали существенно меньший выход электролитов, чем растения дикого типа, причем, в отличие от незакаленных растений разница в утечке электролитов между трасгенными и растениями дикого типа наблюдается в гораздо более широком диапазоне: от -6 °С до -10°С. По выживаемости растения с геном 71уС50Р.? также в лучшую сторону отличались от растений дикого типа: после промораживания при -6 °С выжили все трансгенные растения, в то время как все растения дикого типа погибли.

Сравнивая вышеприведенные результаты, полученные двумя методами, можно видеть, что перенос гена ТяСБОРЗ в растения Л. ГИаИапа привел к существенному повышению морозоустойчивости закаленных растений и мало сказался на устойчивости незакаленных растений. Отсюда следует, что ТвСЗБРЭ, по-видимому, принимает участие в процессах закаливания растений, способствуя повышению их морозоустойчивости. Наблюдаемое же небольшое повышение морозоустойчивости незакаленных трансгенных растений тех же двух линий с геном ТбСЗОРЗ свидетельствует о том, что наблюдаемый небольшой эффект не является артефактом.

Определение содержания Сахаров в трансгенных растениях со сверхэкспрессией ТяСЗОРЗ. Одним из ключевых процессов, обеспечивающих повышение морозоустойчивости растений, является накопление в них Сахаров (гшЬег е1 а1. 2012). С целью проверки, может ли увеличение устойчивости трансгенных растений АлИаИапа, экспрессирующих ген ТзСЗЭРЗ, быть связано с увеличением концентрации Сахаров, мы измерили ее концентрацию в растениях до и после закаливания. Закаливание растений проведено в климатической камере с температурой + 2°С в течение 5 суток. Оказалось, что в листьях трансгенных растений и растений дикого типа концентрации Сахаров возрастают после закаливания в несколько раз, тем не менее, в растениях линии Т-3-1 накапливалось на 28%, а в растениях линии Т-3-2 - на 35% больше Сахаров по сравнению с растениями дикого типа. Полученный результат совпадает с данными указанной выше работы, в которой обнаружена корреляция между накоплением в процессе закаливания Сахаров и морозоустойчивостью закаленных растений 54-х экотипов А. ЖаИапа. Поэтому можно предполагать, что наблюдаемое в процессе закаливания возрастание содержания Сахаров в трансгенных растениях с геном ТзС8БРЗ по сравнению с растениями дикого типа, по крайней мере, частично может быть связано с повышением морозоустойчивости трансгенных растений.

Измерение экспрессии индуцируемых холодом генов в трансгенных растениях с геном TsCSDP3. В процессе закаливания растений происходит изменение экспрессии многих генов. С целью проверки, связана ли повышенная устойчивость трансгенных растений с регуляцией какого-либо из индуцируемых холодом генов, нами было проведено сравнительное исследование транскрипции генов, вовлеченных в процессы закаливания. Они включали гены хорошо изученных факторов транскрипции CBF (CBF1, CBF2) и регулируемых ими генов COR6.6, COR15A, COR47 и COR78. (Thomashow 1999). Кроме того, мы включили два индуцируемых холодом гена (GolSl and GolS3), кодирующих фермент галактинолсинтазу (Maruyama et al. 2009), важный для биосинтеза раффинозы (Keller and Pharr 1996), накопление которой в процессе закаливания коррелирует с морозоустойчивостью экотипов A. thaliana (Zuther et al. 2012),. Также мы исследовали экспрессию двух индуцируемых Холодовым стрессом генов, кодирующих белки с цинковыми пальцами (ZAT6 и ZAT12), не связанными непосредственно с регуляцией экспрессии генов с участием факторов транскрипции CBF (Bieniawska et al. 2008). Экспрессию всех перечисленных генов измеряли методом ПЦР в реальном времени. Материалом для выделения РЖ служили розеточные листья четырехнедельных трансгенных растений. Для адаптации к холоду растения на пять дней переносили в климатическую камеру с температурой + 2°С.

Экспозиция растений при пониженной температуре привела к индукции экспрессии всех проанализированных генов. В то же время для большинства генов мы не наблюдали отличий в уровнях экспрессии между трансгенными растениями и растениями дикого типа. Экспрессия генов ZAT6 и ZAT12 после закаливания в количественном выражении хотя и была незначительно выше в трансгенных растениях, чем в растениях дикого типа, однако величина ее возрастания была в пределах ошибки метода ПЦР в реальном времени.

Таким образом, суммируя полученные результаты, можно заключить, что участие белка TsCSDP3 в закаливании растений осуществляется по пути, независимому от функционирования факторов транскрипции CBF, ZAT6 и ZAT12.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В нашем исследовании мы идентифицировали и охарактеризовали четыре гена, кодирующих белки с доменом холодового шока из растения-

экстремофита Thellungiella salsuginea. Эти белки помимо домена холодового шока в N-концевой части аминокислотной последовательности в своей С-концевой части содержат глицин богатый участок, разделенный мотивами ZnF типа ССНС. В тесте по комплементации роста мутантных бактерий Е. Coli штамма ВХ04 (AcspA, AcspB, AcspE, AcspG) при пониженной температуре нами показано, что в этом тесте активны только домены холодового шока идентифицированных белков. В то же время ни полные белки, ни их отдельные С-концевые домены такой активностью не обладают. Сопоставление полученного результата с литературными данными по комплементации роста бактерий Е. Coli штамма ВХ04 (Скабкин и др. 2004) указывает на то, что добавление мотивов «цинковый палец» ZnF к домену холодового шока, вероятно, приводит к повышению специфичности взаимодействия TsCSDP с РНК, что и является причиной отрицательного результата с полными белками TsCSDP.

Способность мотивов ZnF типа ССНС специфично связывать РНК показана на примере взаимодействия с пре-микроРНК Let7 для белка животных Lin28, имеющего сходную доменную структуру с CSDP растений. Именно наличие двух ZnF в С-конце аминокислотной последовательности Lin28 определяет специфичность его взаимодействия с Let7 (Nam et al. 2011). Если такой вывод справедлив и для CSDP растений, тогда можно полагать, что CSDP с разным количеством ZnF, от 1 до 7, имеют в растениях и

различные РНК-мишени, что в конечном итоге может и сказаться на различиях в механизмах действия CSDP в растениях разных видов.

Парное выравнивание аминокислотных последовательностей TsCSDPl—4 с AtCSPl—4 показало гомологию 71, 95, 91 и 86% соответственно. Заметное различие в первой паре обусловлено делецией 30 аминокислотных остатков в белке TsCSDPl, приведший к потере одного ZnF. Потеря мотива ZnF с высокой вероятностью может приводить к изменению специфичности TsCSDPl по сравнению с AtCSPl и, как следствие, к изменению по сравнению с Arabidopsis круга мишеней РНК для TsCSDPl, что не может не сказаться на различии функций этих белков.

Аминокислотная последовательность TsCSDP2 на 95% идентична таковой AtCSP2. Гетерологичная экспрессия TsCSDP2 в Arabidopsis не привела, по нашим данным, к повышению морозоустойчивости трансгенных растений. Аналогичный результат был получен в работе Парка с соавт.( Park et al. 2009). Исследование биологических функций AtCSP2 с применением метода РНК интерференции продемонстрировало, что AtCSP2 негативно регулирует время перехода к цветению, ускоряет развитие семян и эмбриональное развитие (Fusaro et al., 2007). AtCSP4, ближайший паралог AtCSP2, также играет важную роль в развитии A. thaliana. Сверхэкспрессия гена AtCSP4 привела к уменьшению длины стручков и повышенной смертности зародышей (Yang and Karlson, 2011). Таким образом, с высокой долей уверенности можно полагать, что функции белка TsCSDP2 и других подобных белков семейства Brasicacia со сходной доменной структурой с двумя ZnF в большей мере связаны с процессами развития семян и переходом растений к цветению, чем с адаптацией к низким температурам.

В отличие от TsCSDP2 и TsCSDP4 белок TsCSDP3 принимает, видимо, самое непосредственное участие в механизмах закаливании растений. Об этом свидетельствуют полученные как собственные результаты, так и литературные данные по повышению морозоустойчивости растений А.

thaliana при сверхэкспрессии гена AtCSDP3 (Kim et al. 2009). При этом, как следует из полученных нами данных, повышение морозоустойчивости закаленных трансгенных растений с участием TsCSDP3 не связано непосредственно с функционированием факторов транскрипции CBF. Также из механизма действия TsCSDP3 можно исключить участие и факторов транскрипции ESKIMO, ZAT6 и ZAT12, так как в отличие от TsCSDP3 все они влияют на морозоустойчивость как закаленных, так и незакаленных растений. Таким образом, на примере белка TsCSDP3 можно заключить, что с белками CSDP связан молекулярный механизм закаливания растений, не пересекающийся непосредственно с другими известными механизмами, наиболее изученными на сегодняшний день.

Белки с доменом холодового шока относятся к РНК-связывающим белкам, поэтому, вероятнее всего, именно специфическое связывание с собственными РНК-мишенями в клетках растений предопределяет их механизм действия. Следует особо подчеркнуть, что, исходя из вероятной специфичности взаимодействия с РНК, участие CSDP в процессе закаливания растений может осуществляться как на стадии рецепции холодового стресса, так и на стадиях передачи стрессорного сигнала.

Полученный нами результат по повышению морозоустойчивости А. thaliana при переносе в него гена TsCSDP3 указывает на перспективность использования этого гена в биотехнологии культурных растений. Одной из наиболее перспективных сельскохозяйственных культур для переноса в нее гена TsCSDP3 является озимый рапс (Brassica napus), урожайность которого в среднем в 1.5 раза выше урожайности ярового рапса. В России основные посевные площади под рапс приходятся на яровые сорта и связано это с отсутствием морозоустойчивых сортах озимого рапса. Рапс относится к семейству Brassicaceae, с которым нами получен положительный результат по повышению морозоустойчивости, поэтому есть основания для предположения, что к такому же эффекту приведет и гетерологичная экспрессия гена TsCSDP3 в растениях озимого рапса. И тогда 22

использование трансгенных линий растений рапса с геном Т^С^ОРЗ, в конечном итоге, может положительным образом сказаться на выведении новых сортов озимого рапса с повышенной устойчивостью к отрицательным температурам.

ВЫВОДЫ

1. В растении-экстремофите ПеИищьеИа заЬщтеа идентифицировано четыре гена ТзСБОР1-4, кодирующих белки с доменом холодового шока. Полученные при изучении этих генов результаты указывают на перспективность использования гена ТбСБОРЗ в биотехнологии культурных растений с целью повышения их морозоустойчивости.

2. Показано, что экспрессия Т$С5БР1-4 регулируется Холодовым стрессом и динамика изменения экспрессии уникальна для каждого из генов. Определена нуклеотидная последовательность промоторной области гена 7!уС5£>Р7, она идентична промоторной области А1С8Р1 на 45%, что, по-видимому, объясняет различные динамики изменения экспрессии этих генов в ответ на холодовой стресс.

3. Исследование морозоустойчивости полученных нами трансгенных растений А. ¡¡гаПапа показало, что из двух генов и Т.^СБОРЗ только перенос ТбСБИРЗ в А. ¡ИаИапа приводит к существенному повышению морозоустойчивости в процессе закаливания.

4. Показано, что в растениях А. гИаИапа, экспрессирующих ТъСБОРЗ, количество Сахаров возрастает в процессе закаливания в среднем на 30% больше по сравнению с растениями дикого типа, что, по крайней мере, частично может объяснить повышенную морозоустойчивость трансгенных растений.

5. Гетерологичная экспрессия ТзСББРЗ в АгаЫс1ор.ч1х ЛаНапа не повлияла на экспрессию факторов транскрипции СББ/ОИЕВ и регулируемых ими генов, что свидетельствует о наличии независимого

от CBF/DREB молекулярного механизма закаливания растений, обусловленного белком TsCSDP3.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Таранов В. В., Бердникова М. В., Носов А. В., Галкин А. В., Бабаков А.

В., Белки с доменом холодового шока в растении экстремофите Thellungiella salsuginea: структура генов и их дифференцированная экспрессия при холодовой адаптации, Молекулярная биология, 44, 889—897 (2010)

2. Рыжова Н. Н., Филюшин М. А., Артемьева А. М., Бердникова М. В., Таранов В. В., Бабаков А. В., Кочиева Е. 3. Идентификация и анализ нуклеотидного полиморфизма генов Brassica гара (репа), кодирующих белки с доменом холодового шока (CSDP), Молекулярная биология, 47, 107-115 (2013)

3. Таранов В.В., Бердникова М.В., Злобин Н.Е., Бабаков А.В.

Использование белков с доменом холодового шока в биотехнологии растений для повышения их морозоустойчивости, Доклады российской академии сельскохозяйственных наук, 3, 22-24 (2013)

4. Taranov V., Berdnikova М., Nosov A., Galkin A., Babakov A. Cold shock domain protein genes in the extremophyte Thellungiella salsuginea: identification and differential expression. Congress of the Federation of European Societies of Plant Biology (FESPB 2010 - XVII). Valencia (Spain). 2010. S07-001.

5. Taranov V., Berdnikova M., Babakov A. Cold shock domain proteins in extremophyto thellungiella salsuginea (salt cress) gene structure and RNA-chaperone. Activity 9th international Plant Cold Hardiness Seminar (9lh IPCHS). Luxembourg. 2011. P32.

6. Таранов В. В., Бердникова М. В., Бабаков А. В. Белки с доменом холодового шока растения экстремофита Thellungiella salsuginea. ІП международный симпозиум. Клеточная сигнализация у растений. Казань.

2011. сі82.

24

7. Леонова Т.Г., Бабаков A.B., Таранов В.В. Холодовая обработка растений

Thelliingiella salsuginea и Thellungiella botschatzevii повышает их солеустойчивость. VII Съезд общества физиологов растений. Нижний Новгород. 2012. с420.

8. Бердникова М.В., Рыжова H.H., Таранов В.В., Артемьева А.М., Кочиева Е.З., Бабаков A.B. Идентификация и нуклеотидный полиморфизм в генах, кодирующих белки с доменом холодового шока (CSDP) у Brassica rapa. Материалы международной научной конференции "Генетика и биотехнология XXI века: проблемы, достижения, перспективы" Минск. 8-11 октября 2012, с. 43.

9. Таранов В.В., Селиванов A.A., Бердникова М.В., Мошков И.Е., Бабаков A.B. О функциях белков с доменом холодового шока в растения. Материалы IV Всероссийского симпозиума "ТРАНСГЕННЫЕ РАСТЕНИЯ: технологии создания, биологические свойства, применение, биобезопасность". Москва. 19-23 ноября 2012. с. 90.

10. M.V. Berdnikova, V.V. Taranov, A.A. Selivanov, I.E. Moshkov, A.V. Babakov High expression of an isolated RNA-binding cold-shock domain modulates floral timing in Arabidopsis. Sitges, Spain. 2-4 December 2012. Cell symposia "Functional RNAs". p. 1.26.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Таранов, Василий Васильевич, Москва

На правах рукописи

Российская академия сельскохозяйственных наук ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии 04201365341 Таранов Василий Васильевич

Белки с доменом холодового шока растения-экстремофита Тке11и^1еИа БаЬщтеа в процессе адаптации растений к низким температурам

03.01.06. — Биотехнология (в т.ч. бионанотехнология)

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель д.б.н., профессор А.В. БАБАКОВ

Москва 2013

Оглавление

Список сокращений 5

ВВЕДЕНИЕ 6

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9

1.1 Повреждение растений при низкотемпературном стрессе 9

1.2 Механизмы закаливания 10

1.3 Восприятие низких температур 13

1.4 Регуляция экспрессии генов низкими температурами 18

1.4.1 Регуляция транскрипции 18

1.4.2 Посттранскрипционная регуляция экспрессии генов 22 1.4.2.1. Процессинг мРНК и экспорт из ядра 22

1.4.2.3 Малые некодирующие РНК в ответе растений на низкотемпературный стресс 25

1.4.2.4 Посттрансляционная регуляция экспрессии белков в ответ на низкотемпературный стресс 27

1.5 Белки с доменом холодового шока 29

1.5.1 Структура домена холодового шока 3 О

1.5.2 Белки с доменом холодового шока бактерий 32

1.5.3 Белки с доменом холодового шока животных 36

1.5.3.1 Y-box семейство 36

1.5.3.2 Lin28 37

1.5.3.3 UNR 41

)

1.5.4 Белки с доменом холодового шока растений 42

Цели работы 48

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 50

2.1. Объект исследований 50

2.2. Выделение РНК и синтез первой цепи кДНК 50

2.3. Выделение геномной ДНК из тканей растений 51

2.4. Полимеразная цепная реакция и электрофорез ДНК 52

2.6. Приготовление компетентных клеток 53

2.7. Клонирование ПЦР-продуктов методом TA-cloning 53

2.8. Идентификация генов TsCSDP в растениях Thellungiella salsuginea 54

2.9 Оценка морозоустойчивости и способности к закаливанию клеток

суспензионной культуры Thellungiella salsuginea 49

2.10. Измерение экспрессии генов в растениях и клетках суспензионной культуры Thellungiella salsuginea 56

2.10.1. Получение растительного материала 5 6

2.10.2 ОТ-ПЦР в режиме реального времени 57

2.11. Комплементация мутантных бактерий штамма ВХ04 59

2.12. Создание векторов для трансформации растений 62

2.13. Трансформация растений Arabidopsis thaliana методом "Floral dip" созданными генетическими конструкциями 63

2.14 Биологический анализ трансгенных растений 67

2.14.2 Определение содержания Сахаров в трансгенных растениях

арабидопсиса со сверхэкспрессией TsCSDP3 69

2.14.3. Измерение экспрессии генов, индуцируемых Холодовым стрессом, в трансгенных растениях А. thaliana со сверхэкспрессией TsCSDP3 70

2.15.1. Установление и анализ нуклеотидной последовательности промотора гена TsCSDP 1 72

2.16 Статистика 72

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 73

3.1. Идентификация генов С SDP 73

3.2 Анализ экспрессии генов TsCSDP 1-4 в растениях

Thellungiella salsuginea 77

3.3 Идентификация промоторной области TsCSDP 1 80

3.4 Анализ экспрессии генов TsCSDP 1-4 в клетках суспензионной культуры Thellungiella salsuginea 85

3.5 Комплементация роста бактерий мутантного штамма Е.coli ВХ04 при пониженной температуре 80

3.6 Трансформация А thaliana генами TsCSDP2 и TsCSDP3 и молекулярно-биологический анализ трансгенных растений 95

Определение содержания Сахаров в трансгенных растениях

арабидопсиса со сверхэкспрессией TsCSDP3 103

Измерение экспрессии индуцируемых холодом генов в трансгенных растениях А. thaliana

с экспрессией TsCSDP3 104

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 109

ВЫВОДЫ 113

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 115

Список сокращений

CBF/DREB C-repeat binding factor(cj)aKTop связывающий C-

noBTop)/dehydration responsive element binding (элемент реакции на обезвоживание)

CSD Домен холодового шока

CaMV 35S Промотор вируса мозаики цветной капусты

CSP Белок холодового шока

ZnF Мотив цинковых пальцев

CSDP Белок с доменом холодового шока

АФК Активные формы кислорода

IPTG Изопропил-р-Э-тиогалактозид

LB Питательная среда Лурия-Бертани

SOB Питательная среда Super Optimal Broth

МАРК Митоген-активируемая протеинкиназа

nptll Неомицинфосфотрансфераза

PBD Protein Data Base (база данных по белкам)

Pfu ДНК полимераза Термостабильная ДНК полимераза из

Pyrococcus furiosus

RACE Rapid amplification of cDNA ends

ROS Реактивные формы кислорода

X-Gal 5 -бромо-4-хлоро-З -индоил-бета-D-

галактопиранозид

a.o. Аминокислотных остатков

н.п. Нуклеотидных пар

NCBI Национальный центр биотехнологической

информации

IRES Участок внутренней посадки рибосомы

ВВЕДЕНИЕ

Молекулярные механизмы устойчивости растений к абиотическому стрессу являются одной из наиболее изучаемых проблем современной биологии растений. Повышенный интерес к исследованиям в этой области объясняются тем, что научные вопросы соприкасаются с экономическими проблемами. Низкотемпературный стресс негативно влияет на рост сельскохозяйственных растений, ограничивая их географическое распространение и снижая их продуктивность. В этой связи большое значение имеет изучение механизмов устойчивости сельскохозяйственных культур к низким температурам, результатом которого может быть создание новых холодостойких сортов, а также расширение посевных площадей. К примеру, увеличение морозостойкости озимой пшеницы всего лишь на 2°С может распространить ее производство на обширные площади, используемые сейчас под яровую пшеницу, урожайность которой на 25 - 40% ниже (Колесниченко и Войников, 2003). Методы классической селекции, направленные на повышение морозоустойчивости пшеницы, длительны и трудоемки и не всегда позволяют достигнуть желаемого результата. В настоящее время благодаря достижениям современной науки появилась возможность создания устойчивых сортов сельскохозяйственных культур при помощи методов генетической инженерии путем целенаправленного изменения экспрессии собственных генов или путем введения в геном культурных растений генов из других видов и семейств. Несмотря на большие усилия мирового научного сообщества в решении проблемы повышения устойчивости растений к неблагоприятным факторам внешней среды, успехи в создании устойчивых сортов сельскохозяйственных растений генно-инженерными методами весьма скромны. И связано это,

прежде всего, с недостатком фундаментальных знаний о молекулярных механизмах, лежащих в основе устойчивости растений к холоду и морозу. Известно, что при выдерживании растений в течение нескольких дней при низких положительных температурах они приобретают повышенную устойчивость к отрицательным температурам. Этот процесс называется закаливанием. При этом процессе в растениях индуцируются изменения в метаболизме, что в конечном итоге приводит к повышению их морозоустойчивости (Трунова, 2007). Эти изменения включают в себя

л i

модификации мембран растений, накопление Са в цитозоле, увеличение уровня ROS, активацию систем утилизации ROS, изменения в синтезе белков и Сахаров, накопление пролина и биохимические изменения, влияющие на фотосинтез.

Большая часть информации, касающейся молекулярных механизмов устойчивости, получена в работах с Arabidopsis thaliana, растением с небольшим геномом, нуклеотидная последовательность которого определена полностью. Холодоустойчивость принято связывать с функционированием факторов транскрипции CBF/DREB (Gilmour et al., 1998; Liu et al., 1998), факторов, так или иначе модулирующих структуру мембран (Uemura et al., 1999), гена неизвестной функции Eskimo 1 (Xin et al., 1998) и белков с древним, высококонсервативным доменом холодового шока (CSD) (Скабкин и др., 2004).

В последнее время в качестве модельного объекта для изучения устойчивости растений к различным стрессам стали использовать растение Thellungiella salsuginea (halophila). Это близкородственное A. thaliana растение отличается гораздо большей холодо- и солеустойчивостью (Amtman 2005). Молекулярные механизмы, лежащие в основе повышенной устойчивости Т. salsuginea к абиотическим стрессам, пока остаются

малоизученными. Особенно это касается холодового стресса. Исходя из литературных данных о возможном участиии белков с доменом холодового шока (CSDP) в адаптации растений к холодовому стрессу (Kim et al., 2009) мы попытались выяснить, может ли повышенная холодоустойчивость Т. Salsuginea объясняться особенностями первичной структуры CSDP и/или их синтезом в этом растении в ответ на охлаждение, а также оценить перспективность использования генов CSDP растения Т. salsuginea для модификации культурных растений с целью повышения их устойчивости к абиотическому стрессу.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Повреиадение растений при низкотемпературном стрессе

Понятие низкотемпературного стресса включает в себя всю совокупность ответных реакций растений на действие холода и мороза. Эти реакции проявляются на разных уровнях организации растительного организма, от молекулярного до организменного (Трунова, 2007).

Для понимания влияния низких температур на растения надо разделять низкие, но положительные и отрицательные температуры. Понижение температуры термодинамически снижает кинетику метаболических реакций. Экспозиция растений при низких температурах сдвигает термодинамическое равновесие, нарушая регуляцию метаболизма. (Zhu et al., 2007). Низкие температуры увеличивают жесткость мембран, что ведет к нарушению всех мембранных процессов (например: открытие ионных каналов, связанные с мембранами реакции переноса электронов, и т.д.). Кроме того, низкие положительные температуры ассоциированы с аккумуляцией активных форм кислорода (АФК), что объясняется снижением активности ферментов, утилизирующих АФК под воздействием низких температур. Накопление АФК оказывает губительное действие на биологические мембраны. Низкие температуры способствуют образованию вторичных структур в РНК, тем самым влияя на экспрессию генов и белков. (Smallwood and Bowles 2002; Zhu et al., 2007) Способность растений выдерживать низкие положительные температуры названа холодостойкостью.

Воздействие низких отрицательных температур более губительно для растений. В естественных условиях растения охлаждаются медленно, что приводит к внеклеточному образованию льда. Различие в химическом

потенциале, создающееся за счет роста кристаллов льда, приводит к оттоку клеточной воды во внеклеточную среду, вызывая дегидратацию клеток и плазмолиз (Dowgert and Steponkus, 1984). Степень обезвоживания клеток зависит от степени и скорости снижения температуры. В итоге лед может проникать через симпласт (Gusta et al., 2004), вызывая повреждения внутриклеточных структур и отмирание тканей. Способность растений переносить снижение температуры ниже 0°С, сопровождающееся образованием межклеточного льда, с последующим наименьшим ущербом для своей жизнедеятельности, роста и развития названа морозостойкостью.

Экспозиция растений при низких положительных может запускать каскад реакций, которые вызывают изменения в экспрессии генов и тем самым приводят к биохимическим и физиологическим изменениям, повышающим их морозоустойчивость (Новикова и др., 2007; Ruelland et al., 2009). Этот феномен известен как закаливание (cold acclimation). Большинство растений умеренного климата способны к закаливанию и приобретают устойчивость к образованию внеклеточного льда в своих тканях. Многие важнейшие сельскохозяйственные культуры, такие как рис, кукуруза, соя и хлопок чувствительны к холоду и не способны к закаливанию. Тем не менее, температурный порог для повреждений холодом холодочувствительных растений снижается после их предварительной экспозиции при субоптимальных пониженных температурах.

1.2 Механизмы закаливания

Механизмы закаливания включают в себя физиологические изменения, происходящие в мембранах растительных клеток, накопление цитозольного Са2+, повышение уровня АФК и активацию системы антиоксидантной

защиты, изменения в экспрессии генов, изменения в синтезе белков и Сахаров, накоплении пролина и биохимические изменения, влияющие на фотосинтез. В первую очередь от низкотемпературного стресса повреждаются мембраны растительных клеток. В ряде исследований показано, что под воздействием низкотемпературного стресса увеличивается жесткость мембран, что сопровождается перестройкой цитоскелета, притоком кальция и активацией МАРК-каскада, запускающего механизм ответа на низкие температуры (Orvar et al., 2000; Xin and Browse, 2000; Sangwan et al, 2002). Состав липидов плазматических мембран в закаленных растениях изменяется таким образом, что температура, при которой появляются повреждения, становится существенно ниже по сравнению с мембранами незакаленных растений (Uemura and Steponkus, 1999). Это достигается за счет увеличения текучести мембран закаленных растений благодаря росту содержания ненасыщенных жирных кислот (Vogg et al., 1998).

На физиологическом уровне холод сильно воздействует на фотосинтез. Прекращение роста в результате действия низких температур сильно снижает потенциал для использования энергии, из-за чего происходит ингибирование фотосинтеза (Ruelland and Zachowski, 2010). В закаленных однолетних зимующих растениях фотосинтетическая активность сохраняется благодаря увеличению количества и активности нескольких ферментов цикла Кальвина (Goulas et al., 2006). Это связано с повышеным уровнем тилакоидного пластохинона, защищающего реакционные центры фотосистемы 2 от чрезмерного возбуждения (Krol et al., 1999), и сопутствующим значительным ростом пула межсистемных доноров электронов фотосистемы 1 (Ваепа-Gonzalez et al., 2001). Руланд и Заховски (Ruelland and Zachowski, 2010)

сообщили, что диссипация энергии и транспорт электронов не только усиливались после закаливания, но и способствовали защите от повреждений, вызванных окислительным стрессом.

I

Значительная роль при закаливании принадлежит Са . Кальций действует как посредник в процессах регулирования роста растений, развития и реакций на изменения условий внешней среды (Sanders et al., 2002; Du and Poovaiah, 2005). Под действием низких температур плазматические мембраны увеличивают свою жесткость. Это сопровождается активацией пока не известных каналов Са2+ и увеличением

■у I

уровня цитозольного Са (Sangwan et al., 2001; Catala et al., 2003). Высвобождение внутриклеточных резервов Ca2+ опосредовано инозит-1,4,5-трифосфатом и происходит до активации факторов транскрипции CBF и COR генов в путях передачи сигнала низкотемпературного стресса (Chinnusamy et al., 2007, 2010). Доэрти с соавторами представили дополнительные доказательства связи между кальцием и индукцией пути CBF, показав, что кальмодулин, связывающийся с транскрипционным фактором САМТА, взаимодействует с регуляторным элементом в промоторе гена CBF2 (Doherty et al., 2009).

■у i

Помимо Са в устойчивости растений к пониженным температурам большое значение имеют активные формы кислорода (АФК). Роль АФК в абиотических стрессах стала предметом серьезных научных обсуждений и особенно в участии в процессах, приводящих к закаливанию (Suzuki et al., 2011). Это связано с тем, что АФК являются не просто токсичными побочными продуктами, а действуют как сигнальные молекулы, модулирующие экспрессию различных генов, в том числе тех, которые кодируют антиоксидантные ферменты и модуляторы продукции АФК (Neill

et al., 2002; Gechev et al., 2003; Suzuki et al., 2011). Кроме того, низкотемпературный стресс индуцирует значительное увеличение уровня растворимых неферментативных антиоксидантов, таких как аскорбиновая кислота и глутатион, а также при нем повышается активность основных дегидрогиназ, генерирующих NADPH (Airaki et al., 2011).

1.3 Восприятие низких температур

Практически все живые организмы от бактерий до растений и животных живут в постоянно изменяющихся температурных условиях и, следовательно, вынуждены адаптироваться к ним. Поэтому в поисках рецепторов холода у высших растений представляется возможным обратить внимание на ортологичные системы других эукариотических организмов.

У млекопитающих рецепторами холода являются TRP каналы (катионные каналы транзиторного рецепторного потенциала), локализующиеся на плазмалемме и переносящие ионы Са в клетку. К сожалению, эта информация мало способствует пониманию рецепции холода растениями, поскольку биоинформатический анализ геномов растений показал отсутствие у них TRP каналов. Первой работой, указывавшей на роль Са в рецепции холода у растений, была работа Минорского и Спансвика, опубликованная в 1989 году (Minorsky and Spanswick, 1989). С тех пор накопилось большое количество данных, доказывающих роль чувствительных к холоду Са каналов растений (Ding and Pickard, 1993; Carpaneto et al., 2007). Предполагается, что они являются первичными сенсорами холода (Plieth, 1999; White, 2009), но на молекулярном уровне не

"У А-

идентифицирован ни один чувствительный к холоду Са канал (Knight and Knight, 2012).

Помимо кальциевых каналов за восприятие низких температур могут отвечать плазматические мембраны, что продемонстрировано на примере цианобактерий. (Murata and Los, 1997; Los and Murata, 2000). Низкая температура путем прямого физического воздействия приводит к снижению текучести мембран. Это может восприниматься как сигнал снижения температуры и приводить к активации индуцируемых холодом генов. Таким образом, в цианобактериях мембраны выступают в качестве клеточных термометров. Эти данные позволили предположить, что текучесть мембран может выступать в качестве сенсора низких температур и в высших растениях. В цианобактериях за восприятие �