Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Прооксидантные и антиоксидантные свойства пролина у растений и культивируемых клеток Thellungiella salsuginea.

ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сошинкова, Татьяна Николаевна, Москва

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИЙ ИМ. К.А. ТИМИРЯЗЕВА

РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК _

На правах рукописи

04201358046

Сошинкова Татьяна Николаевна

ПРООКСИДАНТНЫЕ И АНТИОКСИДАНТНЫЕ СВОЙСТВА ПРОЛИНА У РАСТЕНИЙ И КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК тнЕььтвтьъА ял/лиаьЕА

Специальность 03.01.05 - «физиология и биохимия растений»

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Научный руководитель - кандидат биологических наук,

Радюкина Н.Л.

Москва-2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ..............................................................................................................с. 5

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................с. 10

1.1 Окислительный стресс......................................................................................с. 10

1.2Антиоксидантная защитная система..............................................................с. 12

1 .ЗПролин как компонент защитной системы растений...................................с. 17

1.3.1 Свойства и биосинтез пролина..................................................................с. 17

1.3.2 Ключевые ферменты метаболизма пролина............................................с. 19

1.3.3 Мультифункциональная роль пролина ....................................................с. 23

1.3.4 Функционирование «пролинового цикла»................................................с. 30

ГЛАВА II. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ...................................с. 33

2.1 Объект исследования.......................................................................................с. 33

2.2 Условия выращивания растений и культуры клеток...................................с. 34

2.3 Условия проведения опытов ..........................................................................с. 36

2.4 Определение содержания малонового диальдегида....................................с. 37

2.5 Определение активности супероксиддисмутазы .........................................с. 38

2.6 Определение активности аскорбатпероксидазы ..........................................с. 39

2.7 Определение внутриклеточного содержания пролина................................с. 39

2.8 Определение активности пролиндегидрогеназы .........................................с. 40

2.9 Определение содержания белка в ферментных препаратах.......................с. 42

2.10 Методика нативного гель-электрофореза СОД и АП................................с. 43

2.11 Определение уровня транскрипции генов ..................................................с. 45

2.12 Определение содержания свободного оксипролина .................................с. 50

2.13 Математическая обработка данных.............................................................с. 51

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ................с. 52

3.1 Развитие окислительного стресса при обработке пролином растений и культивируемых клеток Thellungiella salsuginea в нормальных условиях культивирования....................................................................................................с. 52

3.2 Развитие окислительного стресса при обработке пероксидом водорода растений и культивируемых клеток Th. salsuginea............................................с. 59

3.3 Особенности совместного действия Н2О2 и пролина на функционирование антиоксидантной системы растений и культивируемых клеток..................с. 61

3.4 Влияние пролина, Н202 и их совместного действия на изоферментный состав СОД и АП в растениях и культивируемых клетках...........................................с. 64

3.5 Влияние экзогенного пролина, Н2О2 и их совместного действия на экспрессию генов, кодирующих изоформы аскорбатпероксидазы и супероксиддисмутазы ...........................................................................................с. 67

3.6 Влияние пролина, Н202 и их совместного действия на экспрессию генов метаболизма пролина............................................................................................с. 72

ЗАКЛЮЧЕНИЕ .....................................................................................................с. 76

ВЫВОДЫ ...............................................................................................................с. 79

Список цитируемой литературы..........................................................................с. 81

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АФК активные формы кислорода

АП аскорбатпероксидаза

ОС окислительный стресс

СОД супероксиддисмутаза

Cu/Zn - СОД изоформа СОД, содержащая медь и цинк как кофакторы

Fe - СОД изоформа СОД, содержащая железо как кофактор

Мп СОД изоформа СОД, содержащая марганец как кофактор

ПО гваяколовая пероксидаза

КАТ кагал аза

МДА малоновый диальдегид

ПОЛ перекисное окисление липидов мембран

ЦТК цикл трикарбоновых кислот

Р5С А1- пирролин-2-карбоксилат

P5CDH А1- пирролин-5-карбоксилатдегидрогеназа

P5CS А1- пирролин-5-карбоксилатсинтетаза

P5CR А1- пирролин-5-карбоксилатредуктаза

PDH пролиндегидрогеназа

ОАТ орнитин-5-аминотрансфераза

PMSF фенилметилсульфонилфторид

DMSO диметилсульфооксид

ПВП поливинилпирролидон

DTT дитиотриитол

NBT нитросиний тетразолий

TEMED тетраметилэтилендиамин

ВВЕДЕНИЕ

Около 3 млрд лет назад кислород стал необходимым компонентом окружающей среды и одним из условий существования аэробных организмов. При этом образование активных форм кислорода (АФК) явилось негативным следствием жизни организма в аэробной среде. В процессе эволюции у растений происходило формирование и развитие сложных многоступенчатых защитных реакций, контролирующих уровень АФК. Действие на растительный организм любого стрессорного фактора, как абиотического, так и биотического, провоцирует сверхпродукцию АФК и нарушает равновесие между их уровнем и активностью антиоксидантной защитной системы (Mittler, 2002; Foyer, Noctor, 2005; Gechev et al., 2006). Достижение нового равновесного состояния в изменившихся условиях представляет собой интегральный процесс, включающий множество метаболических путей, регуляция которых может осуществляться на транскрипционном, посттранскрипционном, трансляционном и посттрансляционном уровнях. Однако механизмы взаиморегуляции между компонентами антиоксидантной системы на сегодняшний день практически не известны. Одними из ключевых компонентов антиоксидантной системы являются ферменты аскорбат-глутатионового цикла, супероксиддисмутаза (СОД), каталаза (КАТ) и др. Роль низкомолекулярного многофункционального метаболита - пролина в ответе на окислительный стресс исследована далеко не достаточно.

С момента первого сообщения об аккумуляции пролина у стареющих

растений райграса (Lolium perenne) (Kemble, MacPherson, 1954) число

исследований об увеличении внутриклеточного содержания пролина у высших

растений при действии разнообразных стрессорных факторов, достигло

впечатляющих значений. В настоящее время хорошо известны данные,

5

демонстрирующие осмопротекторные свойства пролина (Schat et al., 1997; Choudhary et al., 2005; Yancey, 2005; Verslues et al., 2006), его способность стабилизировать структуру белков и регулировать pH цитоплазмы, снижать содержание АФК (Yang et al., 2009), а также регулировать соотношение НАД/НАД-Н (Krishnan et al., 2008; Szabados, Savoure, 2009; Lehmann et al., 2010; Verslues, Sharma, 2010). Однако молекулярные механизмы пролин-опосредованной защиты клеток растений остаются не выясненными; антиоксидантное действие пролина также требует серьезных дополнительных исследований. Кроме того, практически не изученным остается вопрос о том, что происходит с ферментами антиоксидантной защиты и низкомолекулярными компонентами при повышении содержания пролина в растениях. В последние годы появляются сведения о том, что стресс-зависимое изменение внутриклеточного содержания пролина может участвовать в регуляции активностей антиоксидантных ферментов в растениях (Ozturk, Demir, 2002; Радюкина и др., 2008; 2009). Но эти данные немногочисленны и конкретные механизмы взаимодействия пролина с антиоксидантными ферментами до сих пор не ясны. В связи с этим важно исследовать участие пролина в регуляции функционирования ряда антиоксидантных ферментов в растениях при развитии окислительного стресса, вызванного действием абиотических стрессоров.

В последнее время в качестве модельного объекта для изучения

устойчивости растений к различным стрессорам стали использовать

Thelhmgiella salsuginea. Это близко родственное с Arabidopsis thaliana растение

проявляет повышенную устойчивость к холодовому и солевому стрессам

(Amtmann, 2009). Молекулярные механизмы устойчивости Th. salsuginea к

абиотическим воздействиям пока остаются мало изученными. Представляет

также интерес вопрос о том, реализуется ли способность Th. salsuginea

аккумулировать высокие уровни пролина лишь на клеточном уровне, или она

проявляется также и на уровне целого организма. В связи с этим, нам представлялось актуальным провести сравнительные исследования влияния пролина на функционирование антиоксидантной системы у растений и культивируемых in vitro клеток Th. salsuginea.

Цель исследования: Цель работы заключалась в изучении участия пролина в регуляции функционирования ферментов антиоксидантной системы растений и культивируемых клеток Th. salsuginea в условиях окислительного стресса.

Задачи:

1. Изучить действие экзогенного пролина на активность ферментов антиоксидантной системы, изоферментный состав СОД, аскорбатпероксидазы (АП) у растений и культивируемых клеток Th. salsuginea.

2. Исследовать развитие окислительного стресса и функционирование ряда компонентов антиоксидантной системы при действии экзогенного пероксида водорода на растения и культивируемые клетки Th. salsuginea.

3. Изучить совместное действие пролина и пероксида водорода на функционирование ряда компонентов антиоксидантной системы растений и культивируемых клеток Th. salsuginea.

4. Провести сравнительное исследование действия пролина, пероксида водорода и их совместного действия на экспрессию генов метаболизма пролина и генов, кодирующих изоформы СОД и АП в растениях и культивируемых клетках Th. salsuginea.

Научная новизна. Впервые показано, что экзогенный пролин вызывает окислительный стресс в листьях растений и культивируемых клетках Th.

йакгфпеа, то есть проявляет прооксидантные свойства. Этот эффект был сходен с действием экзогенного пероксида водорода на объекты исследования. Защитное действие пролина проявлялось в условиях окислительного стресса, вызываемого действием пероксида водорода. Впервые показано, что в условиях окислительного стресса, вызываемого пролином и пероксидом водорода, повышается содержание свободного оксипролина. Пролин при совместном действии с пероксидом водорода снимает ингибирующее действие последнего на экспрессию генов СОД и АП в листьях растений и культивируемых клетках Тк заЫ^теа. Впервые показана работа «пролинового цикла» при совместном действии пролина с пероксидом водорода у растений и культивируемых клеток Тк БаЬг^теа, существование которого ранее было известно для клеток животных.

Практическая значимость. Полученные в результате исследований данные по влиянию пролина на функционирование антиоксидантной защитной системы растений и культивируемых клеток Тк хаЫ^пеа в нормальных условиях и при действии окислительного стресса имеют существенное значение для понимания механизмов координированной регуляции компонентов защитного ответа растительного организма в процессе реализации адаптивных программ. Эти фундаментальные знания могут использоваться в разработке технологии создания трансгенных растений с повышенной устойчивостью к абиотическим факторам среды. Вся совокупность теоретических обобщений и полученных экспериментальных данных работы может быть использована в курсах лекций для студентов биологических факультетов ВУЗов.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на 14-ой Пущинской международной школе-конференции молодых ученых «Биология -наука XXI» (Пущино, 2010); Всероссийском симпозиуме «Растение и стресс

(Plants under Environmental Stress)» (Москва, 2010); 15-ой Пущинской международной школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI» (Пущино, 2011); VII Съезде ОФР «Физиология растений - фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий» (Нижний Новгород, 2011); XIX Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2012» (Москва, 2012); Н(Х) Международной Ботанической Конференции молодых ученых (Санкт-Петербург, 2012); на семинаре молодых ученых в Институте физиологии растений им. К.А.Тимирязева (Москва, 2013)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, из которых 2 статьи в рецензируемом журнале «Физиология растений».

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объекта и методов исследований, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Материалы диссертации изложены на 113 страницах машинописного текста и содержат 5 таблиц и 12 рисунков. Список цитируемой литературы включает 250 наименований, в т.ч. 238 на иностранных языках.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Окислительный стресс

Растения, ведущие прикрепленный образ жизни, часто оказываются в неблагоприятных и даже стрессовых условиях. К ним относятся абиотические стрессы, такие как засуха, засоление, экстремальные температуры, действие тяжелых металлов, а также биотические стрессы, связанные с болезнями растений или воздействием насекомых-вредителей. Интересно, что стрессы разной природы провоцируют сверхпродукцию АФК и развитие окислительного стресса (Mittler, 2002; Foyer, Noctor, 2005). В нормальных условиях содержание АФК поддерживается на низком уровне, так как в клетках функционирует антиоксидантная защитная система (АОС), постоянно занятая их ликвидацией. Однако в стрессовых условиях часто возникает ситуация, когда антиоксидантная система не в силах сбалансировать уровень АФК, а системы репарации не успевают устранять повреждения клеточных структур. В результате развивается окислительный стресс, который может быть вызван сверхпродукцией АФК и/или падением эффективности антиоксидантиой защиты (Dal et al., 2000; Foyer, Noctor, 2005).

К АФК относят продукты неполного восстановления кислорода: супероксид анион радикал (далее - супероксидрадикал, Ог"), перекись водорода (Н2Ог), гидроксилрадикал (НО ), а также синглетный кислород ('02) (Foyer, Noctor, 2000; Halliwell, 2006; Jithesh et al., 2006; Vellosillo et al., 2010). Образование АФК постоянно происходит в растительных клетках в результате контакта кислорода с восстановленными компонентами электрон-транспортных цепей фотосинтеза и дыхания (Apel, Hirt, 2004). Существует также энзиматический путь образования АФК, связанный с работой ферментов - липоксигеназы, пероксидазы, НАДФН -оксидазы, ксантиноксидазы (Blokhina et al., 2003; Mittova et al, 2003). Все АФК реагируют и окисляют различные химические соединения и функциональные

группы. Это сопровождается модификацией или деградацией белков, разрушением липидов мембран и хлорофилла, может происходить повреждение ДНК и цитоскелета клетки. Синглетный кислород, супероксидрадикал и гидроксилрадикал вступают в реакции с остатками жирных кислот фосфолипидов. В результате возникает каскад свободно-радикальных реакций, который получил название перекисного окисления липидов мембран (ПОЛ). Вследствие этого окисления нарушаются гидрофобность и проницаемость липидного бислоя и, следовательно, работа всех ферментных систем, ассоциированных с мембраной. Все АФК способны инактивировать белки-ферменты, белки-каналы и белки-транспортеры (Dat et al, 2000; Sweetlove et al., 2002; He, Hader, 2002; Heck et al., 2003; Полесская, 2007). Наиболее подвержены действию АФК ферменты или ферментные комплексы, содержащие железосерные кластеры. Супероксидрадикал и перекись водорода прямо взаимодействуют с ионами железа, высвобождая их из состава белков и провоцируя тем самым реакции Фентона. В ходе этой реакции образуется опасный гидроксилрадикал, который наиболее реакционно-способен и окисляет практически любые соединения в клетке (Dat et al., 2000; Mittler, 2002). HO не только инициирует разрушение мембран и деградацию белков, взаимодействуя с остатками многих аминокислот, но и разрушает углеводные мостики между нуклеотидами, разрывая цепи ДНК и РНК. Высокая токсичность НО связана еще и с тем, что в клетках растений и животных нет ферментных систем, способных к его нейтрализации (Rio et al., 1998; Полесская, 2007).

Известно также, что АФК в условиях стресса могут выступать в качестве

сигнальных молекул. Так, при обработке слабыми растворами пероксида водорода

у растений можно вызвать экспрессию генов и синтез белков, содержание которых

обычно возрастает в стрессовых условиях, таких как, ферментов-антиоксидантов.

Например, в суспензионной культуре риса обработка клеток 2 мМ Н202

индуцировала синтез цитозольной аскорбатпероксидазы (Karpinski et al., 1997;

Morita et al., 1999). Обработка проростков кукурузы экзогенной Н202

11

сопровождалась повышением активности СОД, аскорбатпероксидазы, глутатионредуктазы и альтернативной оксидазы, что, вероятно, было связано с индукцией синтеза этих ферментов (Prasad et al., 1996). Накоплено много фактического материала об участии гормонов в сигнальном каскаде, вовлекающем АФК. Показано участие АФК совместно с фитогормоном АБК в регуляции открывания/закрывания устьиц. Н2О2, посредством активации входных кальциевых каналов, участвует в гиперполяризации мембраны (Jithesh et al., 2006).

Таким образом, АФК как высоко реакционно-способные окислители могут принести серьезный ущерб клетке вплоть до клеточной смерти. Однако в большинстве случаев этого не происходит, так как в клетке функциониру�