Функционирование компонентов антиоксидантной системы дикорастущих видов растений при кратковременном действии стрессоров

Радюкина, Наталия Львовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Функционирование компонентов антиоксидантной системы дикорастущих видов растений при кратковременном действии стрессоров
ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Функционирование компонентов антиоксидантной системы дикорастущих видов растений при кратковременном действии стрессоров"

На привал рукописи 1

/ п 1

Радюкнна Наталия Львовна

«Функционирование компонентов антноксидантной системы дикорастущих видов растении при кратковременном действии стрессоров»

03.01.05 - физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва-2015

-1 к'сл гт

005570284

Работа выполнена в лаборатории физиологических и молекулярных механизмов адаптации Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, Москва.

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор, чл.-корр. РАН Кузнецов Владимир Васильевич

Официальные оппоненты: Иванов Борис Николаевич, доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт фундаментальных проблем биологии Российской академии наук, г. Пущино; зав. лабораторией фотосинтетического электрошюго транспорта; Таланова Вера Викторовна, доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии Карельского научного центра Российской академии наук, г. Петрозаводск, главный научный сотрудник лаборатории экологической физиологии растений; Кошкин Евгений Иванович, доктор биологических наук, профессор. Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования Российский государственный аграрный университет - Московская сельскокохозяйственной академии им. К.А. Тимирязева, Москва, профессор кафедры физиологии растений факультета агрономии и биотехнологии. Ведущая организация: Федеральное государственное автономное учреждение высшего образования Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского, г. Нижний Новгород.

Защита диссертации состоится «20» октября 2015 года в 11:00 ч на заседании Совета по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук Д 002.210.01 по специальности 03.01.05 -«Физиология и биохимия растений» (биологические науки) при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук по адресу: 127276, Москва, ул. Ботаническая, 35. Факс: (499) 977-80-18, www.ippras.ru, электронная ггатга: т-azarlcovich@ippras.ru, ifr@ippras.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук

Автореферат разослан июня 2015 г. Ученый секретарь

диссертационного совета кандидат биологических наук

Азаркович Марина Ивановна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы.

Сохранение существующих на Земле экосистем - актуальная задача человечества в ближайшие десятилетия. Поскольку растения являются основными продуцентами в биоценозах, то ключевой проблемой современной физиологии растений остается исследование механизмов, позволяющих растению выживать и заканчивать онтогенетический цикл в условиях кратковременного или постоянного действия неблагоприятных факторов окружающей среды. К таким неблагоприятным факторам относят засоление, повышение содержания в почвах тяжелых металлов, подтопление и другие аналогичные изменения экологических условий, являющихся следствием природных явлений или деятельности человека. Это важное направление физиологии растений связано с именами отечественных и зарубежных ученых, в частности, Н. А. Максимова, Б. П. Строганова, П. А. Генкеля, И. И.Туманова, Вл. В. Кузнецова, Н. И. Шевяковой, Б. П. Холодовой, Ю.В.Балнокина, Т.И.Труновой, H. Н. В. Selye, J.-K. Zhu, Р. В. К. Kishor, D. Rodes.

В растении под действием одного или нескольких стресс-факторов, происходит индукция защитного ответа, который позволяет ему выживать и адаптироваться к изменившимся внешним условиям. Выживание растений предполагает протекание двух качественно различных этапов: быстрого стрессорпого ответа (стресс-реакции) и долговременной (специализированной) адаптации. Эти два этапа выполняют разлотные биологические функции. Стадия стресс-реакции обеспечивает лишь кратковременную защиту за счет мобилизации или индукции систем быстрого ответа. Эти системы энергоемки и не специфичны. На стадии адаптации обычно формируются эффективные долговременные защитные механизмы (Кузнецов, 2009). Известен целый ряд специализированных механизмов, индуцируемых растением при действии определенного агрессора. Однако в последнее время накоплены многочисленные данные о том, что общим интегральным процессом, характеризующим негативное действие стрессоров различной природы, является усиление генерации активных форм кислорода (АФК) (Foyer and Noctor, 2000; Gechev, 2006, Полесская., 2007, Abogadallah, 2010; Poljsak, 2011; Poljsak and Milisav, 2012; Miura and Tada, 2014). Образование АФК нужно рассматривать как негативное последствие существования организмов в аэробной среде и этот процесс возник одновременно с появлением фотосинтезирующих организмов. Повышенное образование АФК происходит в

хлоропластах и митохондриях в том случае, когда актцептором электронов выступает кислород из-за истощенности пула других акцепторов электронов (например, НАДФ) (Gechev, 2006; Gill and Tu teja, 2010; Foyer and Noctor, 2011). Кроме того, источником АФК является фотодыхание, скорость которого контролируется соотношением СО2/ 02 и температурой. Взаимодействие АФК с белками, липидами, нуклеиновыми кислотами приводит к нарушению структуры и функции мембран, активности ферментов, мутагенезу и, в итоге, к остановке клеточного цикла и апоптозу (Bieza and Lois, 2001; Mittier, 2002; Hidema J., Kumagai., 2006; Hong et all., 2013). В ответ на усиление генерации АФК, как правило, наблюдается активация элементов антиоксидантной защитной системы. Появление и развитие у организмов антиоксидантной системы, позволяющей контролировать уровень АФК, происходило одновременно с появлением и развитием фотосинтезирующих организмов (Mittler, 2002; Zhu, 2002; Бараненко, 2006; Abogadallah, 2010; Foyer and Noctor, 2015). Антиоксидантная защитная система клетки, растения - множество взаимосвязанных окислительно-восстановительных реакций, в которых участвуют антиоксидантные ферменты и низкомолекулярные метаболиты. В нормальных условиях и при ОС антиоксидантные ферменты, супероксиддисмутазы (СОД), различные пероксидазы (ПО), каталаза и ферменты аскорбат-глутатионового цикла, играют важную роль в поддержании определенного безопасного уровня АФК. В последнее время активно обсуждается вопрос о способности АФК выступать в качестве сигнальных молекул и регуляторов экспрессии генов, детерминирующих защитный ответ растения (Apel К., Hirt H., 2004; Mittler et.al., 2004). Такой уровень необходим для протекания ряда метаболических реакций в клетке и не вызывает повреждения биомолекул (Kliebenstein D.J. et а!., 1998; Gechev, 2006, Abogadallah, 2010). Альтернативным защитным механизмом у растений является стресс-зависимое накопление низкомолекулярных органических антиоксидангов: аскорбиновой кислоты, а-токоферола, глутатиона, пролина, полиаминов (ПА), каротиноидов, антоцианов и других соединений. Таким образом, образование повышенного количества АФК опасно в том случае, когда происходит нарушение баланса между образованием АФК и их разрушением (Gechev et al., 2006, Полесская, 2007, Abogadallah, 2010; Poljsak, 2011; Poljsak and Milisav, 2012; Miura and Tada, 2014). Именно этот нарушение и является негативным интегральным процессом, получившим название окислительного стресса (ОС). В настоящее

время изучение механизмов адаптации растений к действию абиотических стрессоров, в частности, к засолению и действию ультрафиолетового излучения, проводят с использованием конграстлых по устойчивости модельных растений или трансгенных с измененной экспрессией генов, кодирующих антиоксидантныг ферменты или ферменты биосинтеза или катаболизма низкомолекулярных антиоксидантов. Однако проблема сохранения биоразнообразия затрагивает значительно более широкий спектр дикорастущих видов растений. Дикорастущие растения, не подвергавшиеся направленной селекции, могут существенно отличаться от модельных по конститутивному или стресс-индуцируемуму уровню известных адаптивных реакций. Именно на этот аспект указывал Н. Вавилов в своей монографии «Центры происхождения культурных растений» (Вавилов,1926). Такие исследования дикорастущих видов, позволяющие расширить наши знания об общих закономерностях защитного ответа в стрессорных условиях, важны для разработки стратегии сохранения биоценозов. Следует отметить, что одни и те же виды дикорастущих растений могут быть представителями нескольких различных биоценозов. В настоящее время в экологической англоязычной и российской литературе наравне с термином «биоценоз» применяется термин «биом». Биом - это совокупность биоценозов климатического пояса. Пределы выживаемости дикорастущих растений, представляющих биомы климатических поясов, при меняющихся природных условиях, а также природа защитного ответа изучены явно недостаточно.

Другой важной проблемой при изучении защитного ответа растения являются регуляторные или компенсаторные механизмы внутри антиоксидантной системы растений в нормальных и стрессорных условиях. Поскольку антиоксидантная система - это целая сеть биохимических реакций, необходимость существования таких механизмов очевидна. Несмотря на обширную литературу, посвященную функционированию антиоксидантных ферментов (Бараненко, 2005; Poljsak, 2011; Poljsak and Milisav, 2012; Miura and Tada, 2014) и низкомолекулярных метболитсв (Шевякова, Кузнецов, 1999; Galston et.al.,1997; Bouchereau et.al, 1999; Hong et al., 2000; Maiysik et al., 2007; Кузнецов и др., 2007; Kaul et al, 2008; Krishnan et al., 2008; Verbruggen, Hermans, 2008; Шевяксва и др., 2009), очень немного известно о таких регуляторных или компенсаторных механизмах внутри антиоксидантной системы. Более того, остается практически не изученным вопрос, как функционируют антиоксидангные ферменты при изменениях в метаболизме

низкомолекулярных веществ, например, нролина или полиаминов (ПА), и как изменяется в этих условиях окислительно-восстановительный гомеостаз клетки. Таким образом, целью предлагаемой работы являлось: выявление общих закономерностей функционирования компонентов антиоксидантной системы дикорастущих видов растений, принадлежащих к биомам двух климатических поясов, при кратковременном воздействии абиотических стрессоров различной природы и исследование характера отношений между низкомолекулярными органическими антиоксидантами и антиоксидантными ферментами. Положения, выносимые на защиту.

1. Реализация защитного эффекта антиоксидантной системы при кратковременном действии стрессоров на дикорастущие виды растений, представляющих биомы двух климатических поясов, требует активации нескольких или многих антиоксидантных реакций. При этом дикорастущие растения, относящиеся к биомам двух климатических поясов и произрастающие в различных условиях обитания, не обнаруживают принципиальных различий в функционировании компонентов антиоксидантной системы.

2. Избирательность в активации конкретных биохимических реакций, обеспечивающих защиту от окислительного стресса, определяется прежде всего конститутивными особенностями вида растения, и дополнительно природой действующего стрессора.

3.Пролин и спермин вовлекаются в регуляцию функционирования антиоксидантных ферментов и низкомолекулярных органических антиоксидантов. Цель и основные задачи исследования. Цель данного исследования - выявление общих закономерностей функционирования компонентов антиоксидантной системы дикорастущих видов растений, принадлежащих к биомам двух климатических поясов, при кратковременном воздействии абиотических стрессоров различной природы и исследование характера отношений между низкомолекулярными органическими антиоксидантами и антиоксидантными ферментами.

Основные задачи исследования. В связи с поставленной целью выполнялись следующие задачи:

1. Для выявления различий в конститутивном уровне активности антиоксидантной системы, связанных с видовой принадлежностью, провести сравнительный анализ активностей СОД, каталазы и свободной формы ПО,

содержания пролина, ПА и других низкомолекулярных соединений в контрольных услокиях у дикорастущих растений, представляющих биомы умеренного пояса (лес и степь), субтропического пояса (вечнозеленые жестколистные леса и кустарники).

2. Для выявления избирательности в функционировании компоненте« антиоксидантной системы, зависящей от вида стрессора, пролести сравнительный анализ изменений в активностях СОД, каталазы и свободной формы ПО, уровнях пролина и ПА, каротиноидов, антоцианов и флавоноидов у опытных растений при действии засоления и UV-B облучения.

3. Для выявления общих закономерностей в регуляции внутриклеточного уровня пролина при действии абиотических стрессоров (засоления, UV-B облучения, модуляторов окислительного стресса: параквата (PQ) и Н202) провести сравнительный анализ экспрессии генов метаболизма пролина в растениях Thellitngiella salmginea (теллунгиелла солонцовая) в стрессорных условиях.

4. Для выявления общих закономерностей в регуляции внутриклеточного уровня ПА при действии абиотических стрессоров (засоления, UV-B облучения) провести сравнительный анализ экспрессии генов биосинтеза ПА у растений теллунгиеллы солонцовой и подорожника большого в стрессорных условиях.

5. Для выявления общих закономерностей в функционировании СОД при действии стрессоров различной природы (засоления, UV-B облучения и модуляторов окислительного стресса) исследовать изменения в спектре, активностях изоформ СОД и экспрессии генов, кодирующих изоформы СОД в растениях шалфея и теллунгиеллы солонцовой.

6. Для выявления способности пролина и спермина (Спм) участвовать в регуляции функционирования антиоксцдантных ферментов исследовать изоферментный состав СОД, аскорбатпсрсксидазы (АП), а также экспрессию генов, кодирующих изоферметы, в растениях шалфея и теллунгиеллы солонцовой в нормальных условиях и при действии стрессоров в условиях экзогенного добавления прелина и Спм.

Научная новизна. Проведенные комплексные исследования с использованием растений, относящихся к биомам двух климатических поясов, впервые показали, что функционирование антиоксидантной системы являться главным общим механизмом быстрого защитного ответа растений при кратковременном действии засоления и UV-B облучения, а также при их последовательном действии. Для

эффективного защитного действия антиоксидантной системы не достаточно активации одной из реакций детоксикации активных форм кислорода, требуется функционирование как антиоксидантных ферментов, так и низкомолкулярных метаболитов. При этом установлено, что активация конкретной биохимической реакции, входящей в сеть антиоксидантной системы и обеспечивающей защитный ответ растения, определяется видом растения и интенсивностью и природой действующего фактора. Это проиллюстрировано обнаруженными реципрокными отношениями между уровнем пролина и активностью СОД, действующими в растениях, как в нормальных условиях, так и при действии абиотических стрессоров, и тем, что при засолении или UV-B облучении избирательно активировались или биосинтез полиаминов, или пролина, или антоцианов. Кроме того, показано, что высоким конститутивным уровнем пролина обладают как растения - гликофиты, например, василистник и чернушка, так и устойчивые к засолению растения, например, теллунгиелла солонцовая. Функционирование одной конкретной биохимической защитной реакции не является достаточным условием для выживания растения даже при кратковременном действии стрессора. Впервые установлено, что пролин и Спм регулируют активность, изоферментный состав ключевых антиоксидантных ферментов СОД, ПО, каталазы и АП как в нормальных, так и в стрессорных условиях у растений шалфея и теллунгиеллы солонцовой, возможно опосредовано через регуляцию собственного метаболизма. У растений шалфея и теллунгиеллы солонцовой, различающихся по конститутивному уровню пролина, последний принимает участие в регуляции функционирования антиоксидантных ферментов при действ™ UV-B облучения, 1Ь02 и PQ. Впервые показано, что участие пролина в детоксикации активных форм кислорода сопряжено с его окислением до оксипролина. В растениях теллунгиеллы солонцовой в условиях окислительного стресса, содержание оксипролина увеличивается в 2 раза.

Научно-практическое значение работы. Полученные в работе данные о функционировании антиоксидантной системы у дикорастущих растениях при действии стрессоров позволяют считать ее универсальным защитным механизмом растений. Полученные в работе экспериментальные данные по влиянию экзогенного пролина на биосинтез полиаминов и активности антиоксидантных ферментов у растений шалфея и теллунгиеллы солонцовой в нормальных условиях и при действии стрессоров вносят значительный вклад в понимание механизмов

регуляции компонентов антиокеидантной системы при адаптации растений к неблагоприятным условиям. Эти данные полезны в разработке технологии создания трансгенных растений с повышенной устойчивостью к UV -В облучению, засолению и другим стрессорам. Теоретические обобщения и совокупность экспериментальных данных работы использовуются при чтении курса лекций «Экологической биохимии» для студентов почвенного факультета Московского государственного универсотета им. М.В.Ломоносова. Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на конференциях и съездах: БИОЛОГИЯ - НАУКА XXI ВЕКА:! 1-я Международная Путинская школа-конференция молодых ученых, Пущине, 2007, Международная конференция «Современная физиология растений: от молекул до экосистем», Сыктывкар, 2007, Леса Евразии - Русский север: VII Международная конференция молодых ученых. - МГУ Л, 2007, БИОЛОГИЯ - НАУКА XXI ВЕКА: 12-я Международная Путинская школа-конференция молодых ученых, Пущипо, 2008; Международная конференция «Физико-химические основы структурно-функциональной организации растений», Екатеринбург, 200S; Межинститутский семинар ИФР РАН, Москва, 2008; Congress of the FESPB, Темпере, Финляндия, 2008; Международная научная конференция «Физико-химические механизмы адаптации растений к антропогенному загрязнению в условиях Крайнего Севера», Апатиты, 2009; XVII International conference "Plant abiotic stress" Vienna, Austria, 2009; XVIII Congress of the FESPB, Валенсия, Испания, 2010; Съезд Общества физиологов растений России, Нижний Новгород, 2011.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 25 работ, из них 24 - в рецензируемых журналах или в журналах списка ВАК, 1 - глава в книге. Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объекта и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения и выводов. Работа изложена на 206 страницах машинописного текста, включая 4 таблицы, 55 рисунков; библиография содержит 293 названия, из которых 258 на иностранном языке.

Глава 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР. Сформулированы основные представления об образовании и видах АФК в растении в нормальных и стрессорных условиях. Подробно рассмотрены вопросы функционирования низкомолекулярных и высокомолекулярных компонентов антиокеидантной защитной системы растения.

Глава 2. ОБЪЕКТЫ II МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ. В качестве объемов исследований использовали дикорастущие растения трех групп, представляющих биомы двух климатических поясов, различающиеся по требованиям к влажности, освещенности, температурному режиму и составу почв (Жизнь растений, 1974).

1. Умеренный пояс (смешанный лес): Семейство розоцветных Rosaceae, гравилат городской Geum urbanum L. (далее - «гравилат»); Семейство сложноцветных As/eraceae; мицелис стенной Micelis muralis L. (далее -«мицелис»); Семейство лютиковых Ranunculaceae, василистник водосборолистный Thalictrum aquilegifolivm L. (далее - «василистник»); Семейство подорожниковых Plantaginaceae, подорожник большой Plantago major L. Последнее растение харатеризуется также как рудеральное (далее -«подорожник);

2. Умеренный пояс (степь): Семейство крестоцветных Brasscicaceae, теллунгиелла солонцовая Thellungiella salsuginea (Pallas) O.E.Schulz (экотип Shandong) (далее - «теллунгиелла»); Семейство сложноцветные Asteraceae, полынь Jlepxa Artemisia lercheana Web. (далее - «полынь);

3. Субтропический пояс (вечнозеленые жестколистные леса и кустарники — маквес): Семейство яснотковых Lamiaceae, базилик камфорный Ocimum basilicum L. (далее - «базилик»); Семейство губоцветных Lamiaceae или Labiatae, шалфей лекарственный Salvia officinalis L. (далее - «шалфей); Семейство лютиковых Ranunculaceae, калинджи, или чернушка посевная Nigella sativa L. (далее — «чернушка).

Во всех экспериментах использовали 6-недельные растения, выращенные в водной культуре (Радюкина и др., 2007; Карташов и др., 2008).

Стрессорные факторы. Засоление и TJV-B облучение являются классическими модельными стрессорами, позволяющими изучать механизмы защитного действия. Их интенсивность и продолжительность действия можно легко воспроизводись в условиях фитотрона. Оба стрессорных фактора, хлоридное засоление (100 мМ) и UV-B облучение (12,3 Кдж/м2 в течение 10 мин), не характерны для представителей биоценозов южной тайги, но возникают в условиях лесостепей и солонцеватых степей. Интенсивность UV-B облучения в этих зонах, расположенных в широтах от 35 до 45°, составляет до 120 Мвт/м2 в летние месяцы (Кондратьев и др., 2013). Использованная интенсивность UV-B облучения и засоления вызывала у опытных растений изменения в исследуемых

параметрах, но не приводила к серьезным внешним повреждениям. Условия проведения опытов. Группы растений переносили на питательный раствор, содержащий 100 мМ NaCl, и выращивали в течение четырёх суток (Радюкина и др., 2007 а). Группу растений, подвергавшихся обработке UV-D, переносили в камеру с ультрафиолетовыми лампами и облучали в течение 10 мин, что соответствовало дозе облучения 12,3 кДж/м'. После облучения растения перемещали в камеру фитотрона для фотореактквации и через 24 ч отбирали пробы листьев и корней интактных растений.

Взрослые растения теллунгиеллы и шалфея переносили на питательную среду с 2 мМ пролина, листья обрабатывали Н202 (500 мкМ) и паракватом (PQ) (1мл раствора, содержащего 0,1 цМ параквата в 0,05% Твин-80) (Шашукова и др., 2010; Сошинкова и др., 2013).

Определение содержания свободного пролина в листьях и корнях растений

проводили по методу Baies с соавт. (Bates et al., 1973).

Оценку содержания малонового диальдегида (МДА) в листьях и корнях растений проводили спектрофотометрическим методом (Heath, Packer, 1968). Определение содержания свободного оксипролина проводили методом жидкостной хромато-масс-спектрометрии на кафедре аналитической химии Химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Определение общих растворимых фенольных соединений проводили по методу Фолина-Дениса (Загоскина, 2003). Содержание флавоноидов и антоцианов проводили по методу Mabry (Mabiy et al., 1970).

Определение общей активности супероксиддисмутазы (СОД) проводили по методу Beauchamp, Fridovich, 1971.

Активность аскорбат пероксидазы (АП) н пролнндегидрогеназы (ПДГ) определяли спектрофотометрнчески (Nakano, Asada, 1981 и Mattioni et al., 1997). Нативнын гель-электрофорез СОД, АП проводили в полиакриламидном геле по стандартной методике Ornstein и Davis (Kiiebenstein et al., 1998; Omstein, 1964; Davis, 1964) на приборе «Mir.i protean 3», (Bio-Rad, США). В качестве стандарта использовали БСА. Визуализацию отдельных изоформ СОД проводили методом, предложенным Мизальсккм (Miszalski, 1998). Визуализацию изоформ АП проводили по методу, предложенному Миттлером и Зелинскас (Mittler, Zilinskas, 1993).

Определение активности свободной формы пероксндазы (ПО) проводили по методу, модифицированному Шевяковой с соавторами [Shevyakova et al., 2002]. Определение свободных полиамииов (ПА) проводили в виде даисильных производных с помощью ВЭЖХ по прописи (Mapelli et al,2008). Определение содержания белка в ферментных препаратах проводили спектрофотометрически с использованием красителя Кумасси R-250 по Эсену (Esen, 1978).

Уровень мРНК генов изоформ АП, СОД, а также генов метаболизма пролина, биосинтеза ПА исследовали методом ОТ-ПЦР с использованием специфических праймеров, сконструированных в программной среде Vector NTI и AliginX (Invitrogen, США), программы Vector NTI и базы данных www.ncbi.nlm.nih.gov. Тотальную РНК выделяли фенол-хлороформным (Кгарр et al., 1993). Очистку от примесей ДНК, синтез кДНК осуществляли с использованием ферментов и реактивов фирмы «Fermentas» по протоколу производителя. Результаты ПЦР оценивали методом электрофореза нуклеиновых кислот в 1%-ном агарозном геле в присутствии бромистого этидия. Обработку полученых фореграмм проводили с помощью программы GelPro.

Представленные данные являются результатом трех независимых экспериментов и получены не менее чем в 3-кратной биологической и аналитической повторностях. Результаты, представляющие собою малые выборочные совокупности, обрабатывали статистически в среде Microsoft Excel 2007 и выражали как среднюю арифметическую величину ± ошибка средней величины.

Глава 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Сравнительный анализ функционирование антиоксидантной системы у растений, представляющих биомы двух климатических поясов, при засолении и UV-B облучении

Для ответа на вопрос, какие общие закономерности и какие отличия наблюдаются в функционировании антиоксидантной системы дикорастущих растений, мы использовали сравнительный анализ функционирования ангиоксидантных ферментов и низкомолекулярных метаболитов. Из множества антиоксидантных ферментов мы выбрали: уникальный и ключевой фермент -СОД, два разлагающих пероксид водорода фермента: ПО (свободная форма) и каталазу. Из низкомолекулярных метаболитов особое внимание было уделено пролину, ПА и веществам, обладающих фотозащитной функцией, антоцианам,

флавоноидам, каротиноидам, в листьях и корнях трех групп опытных растений, представляющих биомы двух климатических поясов, в контрольных и стрессорных условиях. Для доказательства развития ОС при действии выбранных стрессоров в листьях и корнях опытных растений был измерен уровень МДА -показателя перекисного окисления липидов. У всех растений через сутки и при действии засоления, и при действии UV-B облучения уровень МДА был повышен в среднем в 5-10 раз по сравнению с контролем. Это свидетельствовало о том, что для активации реакций образования АФК достаточно и кратковременного действия стрессоров.

3.1.1.Функционпрованне антиоксидантных ферментов у растений, представляющих биомы двух климатических поясов, в условиях засоления и облучения.

Участие СОД в защитном ответе растениий на дгйствие засоления и UV-B облучения. СОД является уникальным ключевым антиокевдаптным ферментов. Именно в связи с этим мы начали свое исследование с изучения функционирования СОД у опытных растений при действии засоления и UV-B облучения, а также при моделировании ОС (PQ и Н202). На рисунке 1а, б представлены дашгые но конститутивному и стресс-индуцированному уровню общей активности СОД. Уровень общей активности СОД у опытных растении различался как в контроле, так и при действии стрессоров (Картапюн и др., 2007). Изменения в обшей активности СОД, наряду с изменениями в уровне МДА, также являлись индикатором нарушения окисл1ггельно-восстановительного баланса растения. Самая высокая активность СОД в контроле и при засолении была обнаружена в корнях василистника и в листьях гравилата. Оба эти растения входят в одну группу и представляют биомы смешанных лесов умеренного пояса, в природе не испытывают дефицита влаги и не встречаются с засолением. Самой низкой активность СОД была у теллунгиеллы и чернушки, представляющих биомы разных климатических поясов. У других исследованных растений активность СОД в корнях и листьях имела близкие значения.

Из данных видно, что при засолении у части растений ни в корнях, ни в листьях значимой активации СОД не происходило (рис. 1а, б). Однако в листьях гравилата, полыни и шалфея, корнях василистника и полыни отмечено стресс-индуцируемое повышение активности фермента. Возможно, при действии засоления инактивировались отдельные изоформы СОД, что могло приводил, к снижению

общей активности. При действии UV-B облучения тенденция к активации СОД отмечалась в листьях и корнях у большего числа растений. Можно предположить, что при облучении происходило лишь незначительное ингибирование одних изоформ фермента и заметная активация других изоформ, что в результате могло приводить к повышению общей активности. Полученные данные показали, что только функционирование СОД не могло являться достаточным для защитного ответа на действие двух стрессоров. Кроме того, значимых различий у растений, принадлежащих к биомам двух климатических поясов, не отмечалось. Уровень активности фермента главным образом зависел от видовой принадлежности растения и природы действующего стрессора, (а) х

üfe

7000 6000 ™ SOOO

4000

3000

го

и 2000 1000 о

7000

6000

ГО 5000

с;

си

4P 4000

ё 3000

го

ш 2000

1000

(б)

ЬУ

С3'4'

й ¡¡11 V. - . - •

т'Ш Шйт i-Sr-ЙЙ Ш$Ш -ж .-.»И

JiT

¿г

А«*

О" V Ла-

рису нок 1. Сравнительный анализ общей активности СОД в корнях (а) и листьях (б) трех групп опытных растений при действии засоления и UV-B облучения. 1 -смешанный лес умеренного пояса, 2 - степи умеренного пояса, 3 - вечнозелные жестколистые леса и кустарники субтропического пояса (Получено совместно с Ивановым Ю. В., Карташовым A.B., Шашуковой A.B.).

Анализ содержания мГНК генов, кодирующих изоформы СОД, на примере растений подорожника ч теллунгиеллы. В литературе присутствуют данные о регуляции активности фермента на разных уровнях, в том числе, на уровне транскрипции (Gupta et all., 1993; Blokhina et all., 2003; Бараненко, 2006; Gill and Tuteja, 2010). При анализе уровня транскриптоз мРПК генов изоформ СОД при засолении и облучении мы сфокусировались на двух растениях - подорожнике и теллунгиелле. Подорожник, согласно данным, представленным на рис. 1, продемонстрировал картину изменений активности СОД, сопоставимую с таковой для большей части исследованных растений, а теллунгиелла, как мы упоминали выше, является модельным растением. Мы преследовали две цели: с одной стороны, показать изменения в уровне транскриптов мРНК генов изоформ СОД при двух видах стрессоров, с другой стороны, увидеть различия между уровнем мРНК генов изоформ СОД в сгрессорных условиях у модельного и дикорастущего растения. Методом гель-электрофореза в нативных условиях у теллунгиеллы и подорожника были обнаружены три главные изоформы СОД. При исследовании уровня мРНК генов, кодирующих изоформы СОД, показано, что у теллунгиеллы уровень мРНК гена CSD 1, кодирующего Cu/Zn-изоформу, увеличивался через 24 ч и при засолении и при UV-B облучении. Уровень мРНК генов MSD (Мп-изоформа) и FcSDl (Fe-изоформа) у этого растения не изменялся ни при кратковременном засолении, ни при кратковременном облучении. Значительной активации СОД не наблюдалось (рис 1). Для подорожника стресс-ишуцируемой экспрессии гена, кодирующего цитозольную изоформу СОД - Cu/Zn СОД, не обнаружено при кратковременном засолении, но отмечено при кратковременном действии UV-B облучения, на фоне повышения общей активности фермента.

3.1.2. Участие гваяколовых ПО и каталазы в защитном ответе растений на засоление и UV-B облучение

Очевидно, что рассмотрение антиокекдантной системы не возможно без хотя бы общего взгляда на функционирование ферментов детоксикацин образовавшейся Н202: каталазы и гваяколовой ПО (свободной формы). Мы исследовали функционирование этих ферментов при засолении и действии UV-B облучения у тех же представителей биомов двух климатических поясов. Высокая конститутивная активность ПО в корнях отмечена у гравилата, теллунгиеллы, василистника (от 0.6 до 1,2 мкмоля гваякола/мг белка), в листьях - у мицелиса,

теллунгиеллы (1,01 и 0,5 мкмоль гваякола/ мг белка). В корнях засоление активировало ПО только у теллунгиеллы - также на 50%. Листья большинства исследованных растений обладали активностью этой формы ПО в контроле от 0,3 до 1,0 ммоль гваякола/мг белка. При кратковременном действии засоления листья почти всех опытных растений отвечали повышением активности ПО примерно на 50%. При действии UV-B облучения в листьях опытных растений активность свободной фермы ПО повышалась примерно на 30%. В корнях значимое повышение активности фермента отмечалось у теллунгиеллы и гравилата. Причем корреляции между изменением общей активности СОД и свободной формы ПО, как участников последовательных антиоксидантных реакций, ни при засолении, ни при облучении не наблюдалось. Этот факт можно объяснить многообразием путей утилизации образующейся Н202 в растениях, а также множественностью изоформ семейства ПО (Herbette et al., 2003). Анализ изменений в акгивности каталазы при действии двух видов стрессоров было проведено лишь у гравилата, подорожника, теллунгиеллы и шалфея. Показано, что засоление снижало активность фермента у растений примерно на 10% и в корнях, и в листьях. Исключение составили растения гравилата, в листьях которых происходило увеличение активности фермента в два раза, что положительно коррелировало с высокой активностью СОД у этого растения. В листьях и корнях подорожника и гравилата UV-B облучение вызывало повышение активности каталазы на 10-15%. У теллунгиеллы при облучении наблюдалось ингибирование активности фермента и в корнях, и в листьях примерно на 20%. Для шалфея при действии стрессоров повышение активности фермента было незначительным и в корнях, и в листьях. Анализ активности ферментов детоксикации Н202 продемонстрировал, что все исследованные растения обладали активной ПО (свободной формой). Очевидно, что функционирование ПО увеличивало эффективность защитного ответа при кратковременном действии стрессора на дикорастущие растения. Однако различий у растений разных групп, принадлежащих биомам двух климатических поясов, не наблюдалось. Также как и для СОД различия в функционировании ферментов детоксикации Н202 в первую очередь зависели от видовой принадлежности растений. Отсутствие четких различий в активации ПО у опытных растений в стрессорных условиях связано с множественностью изоформ фермента, локализующихся в различных клеточных компартментах, кодируемых различными генами (Лебедева и др., 2003).

3.1.3. ПА и их роль г. антиоксидантной защите у опытных растений при засолении и UV-B облучении

Кроме высокомолекулярных компонентов антиоксиланп-юи системы необходимо было проанализировать вклад низкомолекулярных метаболитов в защитный ответ растений. Кроме того, важно было понять, может ли биосинтез низкомолекулярных метаболитов активироваться при кратковременном действии стрессоров. В последнее время накоплено большое количество данных о зависимости между изменениями во внутриклеточном содержании и спектре ПА и устойчивостью растений к действию стрессоров (Alcázar et а!., 2010; Kuznetsov, Shevyakova, 2011). Но также как и для других низкомолекулярных метаболитов, данные, позволяющие сопоставить изменения в уровне ПА при кратковременном действии различных стрессоров, а также влияние увеличения эндогенного уровня свободных ПА на функционирование других компонентов антиоксидантной системы, очень малочисленны. Для выявления вклада ПА в функционирование антиоксидантной защиты было выбрано четыре растения, представляющих три группы растений.

Изменения в содержании свободных ПА у опытных растений в условиях засоления и UV-B. Выбранные растения мало различались но суммарному конститутивному содержанию свободных ПА как в корнях, так и в листьях (рис.2 а, б). В корнях растений наблюдалась следующая тенденция: незначительное увеличение содержания свободных ПА при засолении и некоторое снижение при облучении (рис. 2 а). В листьях растений засоление снижало суммарное содержание свободных ПА (рис. 2 б), a UV-B облучение, наоборот, увеличивало. Исключением были листья подорожника. Также как и в активации СОД и ПО, стресс-зависимые изменения в суммарном содержании свободных ПА и в корнях, и в листьях опытных растений определялись, прежде всего, видом растения и природой действующего стрессора. Разнонаправленность изменений в содержании и спектре ПА в корнях и листьях растений мы связываем с их транспортом по растению (Kuznetsov, Shevyakova, 2011). Влияние видоспецифичности и стресс-специфичности более заметно проявилось при анализе спектра индивидуальных ПА. В норме в корнях 1равилата и шалфея обнаруживались сопоставимые количества свободного путресцина (Пут) и спермидина (Спд), у подорожника и теллунгиеллы преобладал свободный Спд. В листьях гравилата и шалфея основным ПА был Пут, у подорожника - Спд, у теллунгиеллы - Спд и Спм.

Вызванное засолением снижение суммы свободных ITA в листьях опытных растений определялось снижением содержания Пут и Сим (рис. 2 а, б). Увеличение количества свободного Спд при засолении было обнаружено только в листьях теллунгиеллы. В литературе указывается, что именно содержание свободного Спд может быть связано с устойчивостью растения к действию засоления (Kakkar, Sawney, 2003; Kuznetsov, Shevyakova, 2011; Minocha et al., 2014). В корнях опытных растений на фоне незначительных изменений суммы свободных ПА, их спектр изменялся: для гравилата изменения затрагивали все индивидуальные ПА, у подорожника - Спд и Спм, у теллунгиеллы - Спд, у шалфея — Пут (рис. 2 а). При анализе изменений в содержании и спектре свободных ПА в листьях шалфея, теллунгиелы и подорожника при действии UV-B облучения привлекает внимание увеличение содержания свободного Пут (рис. 2 б). У гравилата Пут накапливается при засолении. Это свидетельствует о неравнозначном вкладе индивидуальных ПА в антиоксидантную защиту и о различиях в регуляции скорости биосинтеза индивидуальных ПА.

Таким образом, проведенные исследования показали, что биосинтез низкомолекулярных метаболитов может активироваться даже при кратковременном действии стрессоров. В листьях растений стресс-ицдуцируемое повышение содержания свободных ПА, особенно Пут, наблюдалось при кратковременном действии UV-B облучения, но не изменялось при засолении. В корнях имела место обратная тенденция: увеличение при засолении и снижение при UV-B облучении. Этот факт может служить дополнительным доказательством связи свободных ПА с повышением уровня АФК. Это также подтверждается отсутствием существенных различий в изменении общего содержания свободных ПА у растений, принадлежащих к разным группам, т.е. все растения испытывали негативное действие стрессора и активация биосинтеза ПА былавкладом в защитный ответ. Важно заметить, что различия в спектре ПА зависели от вида растений и природы действующего стрессора. Кроме того, наблюдалась и органоспецифичность в содержании и спектре ПА. Наиболее ярко органоспецифичность проявилась в повышении содержания кадаверина в растениях теллунгиеллы и подорожника при действии UV-B облучения: у подорожника его содержание повышалось в корнях, у теллунгиеллы в листьях (Иванов, 2008). Эта органоспецифичность также определялась природой

действующего стрессора, а именно: засоление вызывало повышение уровня ПА прежде всего в корнях, облучение - в листьях

Анализ уровня мРНК генов биосинтеза ПА на примере растениий теллунгиеллы и подорожника при действии засоления и UV-B облучения. Анализируя различия в действии засоления и VJV-B облучения на содержание и спектр свободных ПА у опытных растений, можно было предположить, что причиной этого явления служат серьезные различия в интенсивности экспрессии генов, кодирующих ферменты биосинтеза ПА. Среди генов, кодирующих ферменты биосинтез ПА, выделяется ряд ключевых: SAMS -ген S-аденозилметионинсинтазы, осуществляющей синтез S-аденозилметиогеша из метиошгаа, SAMDC — ген S-аденозилметиониндекарбоксилазы, являющейся скорость-лимитирующим фактором в синтезе ПА, SPDS - ген спермидинсинтазы, SP MS - ген сперминсинтазы. Анализ уровня мРПК указанных генов у двух растений подорожника и теллунгиеллы показал, что действие засоления повышало уровень мРНК генов SAMC, SPDSl, SPMS1 в листьях теллунгиеллы, что согласовалось с изменением содержания свободных Спд и Спм (рис. 2 а, б). UV-B облучение вызывало, кроме изменений в уровне мРНК генов SAMC, SPDSl, SPMS1, еще и повышение уровня мРНК SPMS2 у теллунгиеллы, что сопровождалось снижением содержания свободных Спм и Спд. Следует отметить, что при облучении повышение уровня мРНК генов коррелировало с увеличением дозы облучения. Аналогичная дифференциация в экспрессии генов биосинтеза ПА отмечалась и для подорожника при действии засоления и облучения.

Таким образом, полученные данные о стресс-зависимых изменениях в содержании свободных ПА и уровне экспрессии генов, кодирующих ключевые ферменты их биосинтеза позволяют сделать вывод, что хотя только UV-B облучение вызывало повышение содержания свободного Пут, усиление экспрессии ключевых генов наблюдалось и при засолении, и при UV-B облучении. Повышение уровня мРНК ключевых генов у теллунгиеллы, хотя и связано с изменениями в спектре свободных ПА, но не является достаточным для регуляции их эндогенного содержания (Cona et al. 2006; Alcázar et al., 2010). Возможно, основную роль в регуляшш спектра индивидуальных эндогенных ПА у теллунгиеллы играет полиаминоксидаза, которая может осуществлять обратное превращение одних ПА в другие (Королькова и др., 2014). Кроме того, данные, полученные для теллунгиеллы, аналогичны, таковым, полученным для

подорожника. Это позволяет предположить, что при действии засоления или UV-B облучения такие изменения в содержании и спектре свободных ПА и в уровне мРНК ключевых генов биосинтеза ПА являются сходными для двух растений.

(а)

доодсо

3 8

| SOQjOO

VS О

€00,00

и л

5 ДОО.ОО ас

200,00 | !

И Спм II Спд ■ Пут

К UV-B МзСй

Гравилат

UV-B NaCi

Подорожник

К =UV-B NiaCl

UV-B UaCL

Шалфей

12GO

юоо

I aoo г» >x

soo

r; 400 о

200

(б)

I Спл« Спд I Пут

ЩР

К UV-B Г£аС1

Гравилат

К UV B MaCt.

Подорожник

К UV-& MaCt

Т&ллу-нгиеллз

К UV-S NaCL

Шалфей

Рисунок 2. Сравнительный анализ содержания индивидуальных ПА у некоторых опытных растений при засолении и UV-B облучении: а - корни; б -листья. (Получено совместно с Ивановым Ю. В., Шашуковой A.B., Мапелли С.).

Изменения в содержании конъюгатов ПА у подорожника, гравилата, шалфея и теллунгиеллы при действии UV-B облучения. Наряду со свободными ПА в растениях присутствуют растворимые и нерастворимые конъюгаты ПА (Lutz et al., 2005; Шевякова и др., 2009). Однако при действии стрессоров редко проводят анализ пула всех форм ПА, хотя это представляется чрезвычайно важным.

Определение содержания конъюгатов было проведено з листьях и корнях подорожника, шалфея и теллунгиеллы при действии UV-B облучения. Анализ данных позволил сделать вывод, что при действии UV-B облучения предпочтительной формой индивидуальных IIA у исследованных растений и в листьях, и в корнях является свободная. Однако в корнях наблюдалось некоторое увеличение доли конъюгатов у всех исследованных растений. Наиболее наглядная разница у опытных растений наблюдалась в содержании свободной и конъюгированной форм кадаверина. В листьях свободный и связанный кадаверин обнаружен у подорожника, причем облучение уменьшало содержание обеих форм. У гравилата в листьях облучение вызывало образование его конъюгатов, а у теллунгиеллы - увеличение свободного кадаверина. В корнях у гравилата наблюдалось увеличение свободной формы, у теллунгиеллы в контроле обнаруживалась только конъюгированная форма, которая практически исчезала при облучении. У шалфея кадаверин не обнаруживался.

Полученные данные подтверждают таковые, полученные Прудниковой (Прудникова, 2006), которая выявила схожие закономерности при облучении растений Arabidopsis thaliana. Можно только предполагать, что переход одной формы и другую зависит от многих причин, в том числе, от уровня кофейной и феруловой кислот, которые участвуют в образовании конъюгатов (Son and Lewis, 2002). Однако, следует отметить, что общим выводом из проведе1шых исследований может служить отмеченный факт, что при UV-B облучении имела место тенденция к снижению образования конъюгированных форм в листьях исследованных растений и увеличению количества свободных ПА (Шашукова и др., 2011). Из приведенных выше данных следует вывод, что эффективность конкретных форм ПА опытных растений з защитном ответе определяется как видовой специфичностью, так и видом действующего стрессора. Кроме того, полученные данные гго содержании свободных ПА у гравилата, подорожника, теллунгиеллы и шалфея показали, что аккумуляция свободных ПА у исследованных растений являлась органоспецифичной.

3.1.4. Изменения в содержанки внутриклеточного пролина у растений при действии засоления к UV-B облучения

Наиболее дискуссионной в физиологии растений остается роль универсального метаболита и протогетюй аминокислоты - пролина. Факты, доказывающие участие этого соединения в защитном ответе растений и животных на действие

стрессоров представлены в многочисленных публикациях (Шевякова, Кузнецов, 1999; Ка\ч К^Ьог е1 а1., 2005; КпвЬпап е1 а1., 2008). Однако и в настоящее время изучение его роли в защитном ответе организмов остается актуальным. Конститутинвый уровень продина. Проведенное нами сравнительное изучение содержания пролина (Радюкина и др., 2007 а, б; Карташов и др., 2008) показало, что среди растений, принадлежащих к биома двух климатических поясов присутствовали виды с его высоким конститутивным содержанием в корнях и листьях (рис. 3 а, б). Таким образом, конститутивный уровень этого метаболита оказался также видоспецифичным, как и все обсуждаемые выше компоненты антиоксидантной системы. И также как исследованные выше параметры (СОД, ПО и ПА) не зависили от принадлежности к климатическому поясу. Следует также отметить, что конститутивное содержание пролина у исследованных растений не было однопорядковым в листьях и корнях, что свидетельствует об органоспецифичности аккумуляции метаболита (рис. За, б). Такая органоспецифичностъ также определялась вцдовой принадлежностью. Так у теллунгиеллы и чернушки в листьях содержание пролина в контрольных условиях было выше, чем в корнях практически на порядок. У остальных исследованных видов растений конститутивное содержание пролина былосопоставимо в листьях и корнях (рис. За, б).

Действие засоления. В условиях засоления, как следует из рисунка 3, стресс-индуцированное повышение уровня пролина в корнях (а) и листьях (б) наблюдалось у всех растений, представляющих биомы двух климатических поясов за исключением чернушки, имевшей самый высокий конститутивный уровень пролина. В условиях засоления его содержание в листьях незначительно снижалось, а в корнях оставалось таким же низким как в контроле (рис. За, б). Растения шалфея, хотя и отличались низким конститутивым уровнем пролина в листьях и корнях (0,2 мкмоль/св.массы), но в условиях засоления его содержание возрастало в 3-4 раза. То же самое можно сказать и о повышении содержания пролина при засолении у гравилата - с 0,04 мкмоль/г св.массы до 2 мкмоль, что больше в 500 раз. Из этого можно сделать вывод, что степень активации конкретной биохимической реакции, приводящей к синтезу необходимого защитного метаболита, зависит от вида растения и не всегда означает более высокую степень устойчивости. Кроме того, можно утверждать, что повышение содержания пролина при кратковременном действии засоления не создает

концентрацию этого метаболита достаточную для осмопротекции, поэтому мы считаем, что в этих условиях пролин может выполнять только антиоксидантную функцию.

Рисунок 3. Сравнительный анализ содержания пролина в корнях (а) и листьях (б) трех групп опытных растений через сутки после действия засоления и UV-B облучения 1 - смешанный лес умеренного пояса, 2 - степи умеренного пояса, 3 -вечнозелные жестколистые леса и кустарники субтропического пояса (Получено совместно с Ивановым Ю.В., Карташовым A.B., Шашуковой A.B., Тоайма В.).

Дейгтвие UV-B облучения. Участие пролина в защитном ответе на повышенное образование АФК при кратковременном действии UV-B облучения иллюстрируется изменениями в его содержании у опытных растений. Данные, полученные для двух видов, лидеров по конститутивному уровню пролина, теллунгиеллы и чернушки, показали (рис.За, б), что оба эти вида сохраняли такую же тенденцию в изменении содержания пролина в листьях в ответ на действие как

засоления, так и UV-B облучения. Так у теллунгиеллы при кратковременном действии этого фактора содержание пролина возрастало в листьях в обоих случаях, а у чернушки содержание пролина незначительно снижалось и в условиях засоления и при облучении (рис. 36). Корни теллунгиеллы реагировали прямо противоположным образом на действие засоления и UV-B облучения, увеличивая содержание пролина при засолении, но достоверно снижали его уровень при действии облучения. Такая же картина наблюдалась и в корнях полыни. В корнях чернушки облучение вызывало достоверное повышение содержания этой иминокислоты (рис. За). В листьях остальных изучаемых растений, за исключением обсуждаемых выше, содержание пролина снижалось или имело тенденцию к снижению при облучении (рис. 36). Поскольку изменения содержания пролина при засолении и UV-B облучении наблюдались у представителей биомов двух климатических поясов, то его можно рассматривать как обязательного участника защитного ответа. Такая картина иллюстрирует функционирование пролина не только как в осмопротектора, но и антиоксиданта.

3.1.5. Изменения в содержании пролина у растений в условиях ОС, вызванного Н202 и PQ

Для потверждения антиоксидантных свойств пролина, проявляющихся при действии облучения, мы провели серию экспериментов по действию параквата и Н202 на шалфей и теллунгиеллу, контрастных по конститутивному уровню пролина. При действии PQ, индуктора супероксидного анион-радикала, в пластидах и митохондриях, на теллунгиеллу и шалфей содержание пролина увеличивалось в темновой период до 20 и до 0,8 мкмоль/г св. массы соответственно, но снижалось при перенесении исследуемых растений на свет до 10 и до 0,6 мкмоль / г св. массы соответственно. При действии Н202 содержание пролина у теллунгиеллы и шалфея повышалось до 23 мкмолей и 0,9 мкмолей через 24 ч (Шашукова и др. 2009; Сошинкова и др., 2013). Кроме этого, при действии Н202 на теллунгиеллу было обнаружено повышение содержания свободного оксипролина, которой является продуктом окисления пролина. Полученные данные указывают на то, что изменения в содержании пролина у обоих исследованных видов, действительно, вызываются повышенным образованием АФК в клетке.

Уровень мРНК генов метаболизма пролина при действии различных абиотических стрессоров на примере теллунгиеллы. Участие пролина в защитном ответе на

действие засоления, облучения и модуляторов окислительного стресса поставило вопрос об изменениях в уровнях транскриптов генов его метаболизма. Влияние абиотических факторов на транскрипционном уровне мы изучали на примере теллунгнеллы. Измененения в уровне экспрессии генов метаболизма пролина в условиях действия стрессоров, проведенное на примере теллунгиеллы, показало, что повышение уровня мРНК генов биосинтеза пролина согласуется с повышением его внутриклеточного содержания. Повышение интенсивности экспрессии генов биосинтеза пролина наблюдалось также при действии модуляторов ОС (Radukina et al., 2011; Сошиккова и др., 2013). Это согласуется с показанной нами, наряду с другими авторами, способностью пролина участвовать в нейтрализации АФК, замещая СОД или действуя наряду с ней. С другой стороны, усиление экспрессии генов катаболизма пролина при действии исследованных стрессоров, возможно, связано с необходимостью функционирования «пролинового цикла». Этот цикл важен для поддержания de novo образования глутамата в митохондриях, для повторного его использования в биосинтезе других важных для жизнедеятельности растений метаболитов (ПА, аминолевулиновой кислоты и др.) и в качестве энергетического ресурса, как это показано для животных организмов (Szabados and Savoure, 2008; Miller et al., 2009).

3.1.6. Влияние UV-B облучения и засоления на содержание низкомолекулярных метаболитов, выполняющих фотозащитную и антноксидантную функции

В отличие or пролина, который является одним из основных метаболитов при засолении, защитную роль антоцианов, каротиноидов, флавоноидов связывают в большей степени с действием па растения UV-B облучения (Costa et al., 2002). В связи с этим было важно ответить на вопрос, какие различия могут наблюдаться во влиянии двух различных стрессоров на внутриклеточный уровень таких антиоксидантов. С этой целью были выбраны три растения, являющиеся представителями двух климатических зон: средиземноморской - чернушка и базилик и умеренной - полынь (Радюкина и др., 2012). Представленные на рисунке 4 данные показали, что у трех растений конститутивный уровень антоцианов, каротиноидов, флаваноидов различался, так же, как и уровень пролина. При UV-B облучении у всех растений увеличивалось содержание антоцианов и флавоноидов. При засоле!гли содержание антоцианов изменялось в меньшей степе™ или

оставалось на уровне контроля, но возрастало содержание каротиноидов. Следует отметить, что вклад каждого индивидуального метаболита в сумму низкомолекулярных антиоксидантов как в контроле, так и при стрессе существенно отличался и определялся видовой принадлежностью опытных растений. Полученные результаты являются дополнительным доказательством существования избирательности при активации той или иной реакции антиоксидантной системы, определяемой видом растения и природой стрессорного фактора. Известно, что биосинтез ПА сопряжен с биосинтезом вторичных метаболитов фенольной природы. Усиление биосинтеза ПА также как и биосинтеза низкомолекулярных веществ фенольной природы характерно для действия UV-B облучения на растения [Frohnmeyer, Staiger, 2003; Kuznetsov, Shevyakova, 2011; Кондратьев и др., 2013]. Возможно, увеличение суммы свободных ПА и антоцианов и флавоноидов при действии UV-B облучения является комплексным защитным ответом.

(а) _ »ж», (6)

о J голо ••;

ZV&XXS !

>х

о о. ш&з \

«о.йа : щ

20,ОО . ¡1

Nad UV-B UV-B NaCI + +

NaCI UV-B

NaCI UV-I

UY-8 Nad + +■

NaCI UV-B

г флзеомэмды

U fC

>з: 200LC-0

и.

tiJO.iJO

ij.

se.o© ft

аро ■ щ

(В)

NaCI UV-B UV-B NaCI + +

NaCI UV-B

Рисунок 4. Сравнительный анализ содержания низкомолекулярных метаболитов пролина, каротиноидов, флаваноидов и антоцианов в листьях базилика (а), полыни (б), чернушки (в) при засолении, UV-B облучении и их последовательном действии. (Получено совместно с Тоайма В.).

3.1.7. Избирательность в активации антиоксндантных реакций у растений, представителей биомов двух климатических поясов, при действии UV-B облучения и засоления

При сравнении изменений в общей активности СОД с содержанием пролина в растениях в контроле, при засолении и UV-B облучении (рис. 1 и 3) можно было наблюдать обратную зависимость между этими величинами. Другими словами, в контроле у растений с высокой общей активностью СОД эндогенное содержание пролина было низким, и наоборот. При действии засоления этот характер взаимоотношений между двумя величинами сохранялся, что иллюстрируется схемой, представленной на рисунке 5 а. Самыми контрастными видами в этом отношении были гравилат и теллунгиелла. При сравнении общей активности СОД и содержания пролина при действии UV-B облучения также отмечен такой характер взаимоотношений (рис. 5 б).

Таким образом, при сравнении общей активности СОД и содержания пролина у исследованных растений в контроле, при действии засоления и UV -В облучения был выявлен реципрокный характер взаимоотношений этих двух факторов. Влияние последовательного действия UV-B облучения и засоления на содержание пролина и общую активность СОД у трех опытных растений. Для подтверждения избирательности в активации СОД или биосинтеза пролина была проведена серия экспериментов с последовательным действием облучения и засоления на растениях двух биомов: базилика, чернушки и полыни. При последовательном действии двух факторов в любом порядке на базилик, чернушку и полынь облучение оказывало ингибирующее действие на содержание пролина в листьях, но стимулировало активность СОД. Засоление тормозило активность СОД в листьях, но повышало содержание пролина. В корнях обе тенденции сохранялись. Кроме того полученные данные продемонстрировали, что растения, у которых конститутивно заложена способность интенсивного биосинтеза пролина, используют это защитное соединение при кратковременном действии обоих стрессоров и их последовательном применении. Однако при последовательном действии двух факторов не наблюдалось синергизма в активации антиоксидантпых реакций, а сохранялась зависящая от вида стрессора дифференциация. При рассмотрении изменений в содержании других низкомолекулярных антиоксидантов при последовательном действии двух стрессоров также подтвердилась избирательность в накоплении антоцианов и

флавоноидов при UV-B облучении и каротиноидов и пролина при засолении Но общей тенденции, отражающей синергизм или антогонизм ирк действии двух факторов, у трех растений не наблюдалось.

(а)

Чернушка Шалфей Базилик Теллунгиелла Полынь Василистник Мицелис Подорожник Гравилат

м км оль/г сырой массы 15 10 5

С<1:

Акти вмость СОД

2000 3000 4000

ед.акт/мг бел ка

Щ Содержание пролина

Чернушка

Шалфей

Базилик

Теллунгиелла

Полынь

Василистник

Мицелис

Подорожник | Гравилат 5000

(б)

Чернушка Шалфей Базилик Теллунгиелла Полынь Василистнйк Мицелис Подорожник Гравилат

мкгл оль/г сырой массы 20 15 10

т ■

Щ Чернушка

<> Шалфей

\ Базилик

Щ Теллунгиелла

I Полынь

i василистник

| Мицелис

| Подорожник

if Гравилат

О 300 1000 1300 2000 2500 3000 3500 4000 4500 ед.акт/мг белка Щ Активность СОД Содержание пролина

Рисунок 5. Схема соотношений между уровнем пролина (левая шкала) и активностью СОД (правая шкала) у растений трех групп при действии засоления (а) и UV-B облучения (С5).

3.2. Особенности функционирования антиоксидантной защитной системы при искусственном повышение внутриклеточного содержания низкомолекулярных метаболитов в нормальных условиях и при действии стрессоров на примере шалфея и теллунгнеллы

Представленные выше данные о функционировании антиоксидантных реакций показали, что в растительной клетке существует избирательность в активации тех или иных метаболических путей при кратковременном действии стрессоров. Аккумуляция пролина и активация ключевого фермента антиоксидантной защиты СОД у растений находились в рещшрокных отношениях (рис. 5), увеличение содержания Г1А, антоцианов характерно для облучения. Такая избирательность ранее была показана только для антиоксидантных ферментов (Каг^ е1 а1., 1999; ШгЬэку е! а1., 2002; Ыоигцап е1 а1., 2012). Для ответа на вопрос о возможных причинах реципрокности накопления пролина и активности СОД а также на вопрос об уникальности такого влияния для пролина, мы использовали метод создания искусственного избытка двух метаболитов - пролина и Спм, добавлением их в питательную среду растений. В качестве модельных растений были использованы шалфей и теллунгиелла, контрастные по конститутивному уровню пролина.

Действие экзогенного пролина и спермина на контрольные растения. Добавление экзогенного пролина в питательную среду контрольных растений шалфея приводило к изменению его эндогенного уровня в листьях и корнях в 30 раз (с 0.20.3 до 9 мкмолей/г св. массы). Кроме того, наблюдалось повышение уровня МДА, снижение активности СОД и ПО, при этом активировались ПДГ и каталаза. Экзогенный пролин не вызывал изменений в содержании ПА в листьях, но повышал содержание Пут в корнях. Изоферментный состав СОД в листьях шалфея при действии экзогенного пролина не изменялся. Увеличение содержания МДА (в два раза), активация ПДГ, СОД и АП (примерно на 10-20%) наблюдались также при добавлении пролина в питательный раствор контрольных растений теллунгиеллы. При этом содержания внутриклеточного пролина в листьях вырастало в 2-5 раз (с 8,21 до 19,28 мкмоль/ г св. массы). Однако повышения содержания свободных ПА в листьях этого растения не происходило, отмечалось повышение содержания свободного оксипролина (с 1500 до 2700 нг/г сыр. массы), что указывало на окисление пролина. Анализ изоферментного состава СОД у данного растения показал, что экзогенный пролин активировал Си/7.п- и Ре-СОД

изоформы (рис. 6), а также вызывал появление новых низкомолею/ллрных изоформ АГТ (с молекулярной массой около 67 кДа и ниже) (рис. 7).

«Ре-СОД IСи/2п-С0Д «Мп-СОД * Ре-сод ®си/г»-сод в мп-сод

г г I

Я Щш 2 р 2 ,

' г *

— | 1КИ1 мш тт

¡■л !

|г

1 о

I 1В 1И

-я Я *

Про

Про+НгСк

Скм Н/О.'

Рисунок 6. Спектр изоформ СОД в контроле и при действии экзогенного пролина или Спм, Н202 и совместном действии Н202 и/или Спм и пролина в корнях (1) и листьях (2) теллунгиеллы.

Добавление в питательную среду растений шалфея и теллунгиеллы 1 мМ Спм не приводило к изменениям уровня МДА, активности кагалазы, но вызывало незначительное повышение содержания пролина и корнях и листьях. В корнях и листьях теллунгиеллы при обработке Спм отмечено некоторое повышение активностей СОД и АП (примерно на 10-15%). Следует отметить, что при обработке Спм растений шалфея наблюдалась гаже тенденция. В растениях теллунгиеллы Сим в контрольных условиях повышал активность всех трех изоформ СОД в корнях и снижал активность Ре-СОД в листьях, не затрагивая другие изоформы (рис. 6). Спм в контрольных условиях изменял также и изоферментный спектр АП в корнях и листьях теллунгиеллы: появлялись новые

изоформы фермента, в листьях высокомолекулярная (рис, 8).

низкомолекулярная в корнях

140 кДА

67 пДА

(б)

140 кДА ДМИЯ

1§§У -

67 кДА

Рисунок 7. Спектр изоформ АГ1 в корнях (а) и листьях (б) теллунгиеллы: 1 -контроль, 2 - действие экзогенного пролина, 3 - действие Н202, 4 - совместное действие пролина и Н2Од.

й? чД|

Рисунок 8. Изоформы АП в корнях (а) и листьях (б) теллунгиеллы в контроле (К), а также при действии экзогенного Спм (1), Н->02 (2) и их совместном действии

(3).

Таким образом, искусственное изменение содержания низкомолекулярных метаболитов пролина и Спм в растениях теллунгиеллы и шалфея в контрольных условиях приводило к изменениям в функционировании антиоксидантной системы. При этом прооксидантные свойства пролина были выражены более сильно.

Действие экзогенного пролина и Спм совместно со стрессорами. Исследование

действия пролина и Спм на растения теллунгиеллы и шалфея в контрольных

условиях показало, что пролин и Спм оказывали прооксидантный эффект на

растения. Совсем другая картина наблюдалась нами при действии этих

метаболитов на растения шалфея и теллунгиеллы совместно со стрессорами.

Использование совместной обработки растений теллунгиеллы пролином или Спм

и Н202, а также растений шалфея UV-B совместно с пролином показало, что в

обоих случаях пролин снижал повреждающее действие указанных стрессоров

(снижение уровня МДА). В растениях шалфея экзогенный пролин на фоне UV-B

облучения стабилизировал активность СОД на более высоком уровне по

сравнению с действием только облучения. Экзогенный пролин снимал

ингибирующее действие облучения на каталазу, ингибировал активность

свободной формы ПО, а также повышал аккумуляцию свободных IIA и их

растворимых конъюгатов в корнях и листьях по сравнению с действием только

облучения. Следует отметить, что при обработке Спм совместно с Н202 или PQ

растений шалфея наблюдалось небольшое повышение активности СОД в листьях

и корнях, незначительное увеличение содержания пролина, но уровень МДА не

изменялся. Присутствие экзогенного пролина в питательной среде теллунгиеллы

снижало ингибирующий эффект Н202 на общую активность СОД и АП. Использование обработки Спм и Н202 растений теллунгиеллы приводило к повышению активности СОД (примерно в два раза), незначительному увеличению активности АП в корнях и листьях. Ни в листьях, ни в корнях не наблюдалось достоверных изменений содержания МДА и активности каталазы.

Обобщая полученные данные можно заключить, что пролин и Спм проявляли ангиоксидантные свойства при добавлении в питательную среду растеши! теллунгиеллы и шалфея, находящихся в стрессорных условиях. Хотя в контрольных условиях обработка Спм растений теллунгиеллы не приводила к повышению уровня МДА, он оказывал влияние на активность изоформ СОД и в корнях и в листьях. Это также подтвервдало предположение, что при кратковременном действии стрессоров существует дифференциация в активации антиокендантных реакций.

3.3. Влияние экзогенного пролина и Спм на спектр изоформ СОД и АП, а также уровень мРНК генов изоформ у растений шалфея и теллунгиеллы в условиях действия стрессора

Представленные выше данные свидетельствуют о том, что пролин и Спм при стрессе вовлекаются в регуляцию функционирования СОД и АП. Однако в настоящее время остается неизвестным, влияют ли низкомолекулярные метаболиты только на функционирование белков, или опосредовано изменяют уровень мРНК генов, кодирующих изоформы СОД и АП. Для ответа на этот вопрос мы также использовали растения шалфея и теллунгиеллы. Изоферментный спектр СОД в листьях растений шалфея при совместном действии UV-B облучения и пролина. Изучение активностей идентифицированных нами изоформ показало, что в листьях шалфея, облученных UV-B, наибольший вклад в повышение общей активности СОД вносили Fe- и Cu/Zn-СОД, тогда как вклад Мп-СОД был незначительным. Внесение экзогенного пролина в питательную среду растений шалфея, подвергнутых кратковременному облучению UV-B, не повлияло на активности Мп-СОД и Cu/Zn-СОД. В то же время в присутствии пролина через 24 ч увеличивалась активность Fe-СОД изоформы, а через 36 ч появлялись две новые, отсутствовавшие ранее формы изозима (рис.9).

(а) (б)

Рисунок 9. Изоферментный спектр СОД в листьях шалфея: а - при UV-B облучении, б - при совместном действии UV-B облучения и пролина (Получено совместно с Шашуковой A.B., Макаровой С.Н.).

Сравнительное исследование совместного действия экзогенного пролина или Спм и Н2О2 на изоферментный спектр СОД и АЛ в растениях теллунгиеллы. Исследование совместного действия пролина и Н202 на растения теллунгиеллы показало, в корнях пролин или Н202 повышали активность Cu/Zn-СОД и Fe-СОД изоформ, но не влияли на Mn-изоформу (рис.6). В листьях и корнях оба фактора совместно также повышали активности Cu/Zn-СОД и Fe-СОД изоформ (рис.ба). Поскольку пролин возможно снижал содержание Н202, то при совместном действии этих веществ степень увеличения активностей двух изоформ была ниже, чем при действии факторов отдельно (рис.ба). Как показано выше, обработка Спм растений теллунгиеллы в контрольных условиях вызывала изменения в спектре изоформ СОД: в корнях увеличение активностей всех трех изоформ, в листьях снижение активностей Cu/Zn-СОД и Mn-СОД (рис. 66). Следует отметить, что при использовании Спм в более высокой концентрации эти изменения были выражены сильнее. Это свидетельствовало о том, что повышение эндогенного содержания данного метаболита активировало процессы его метаболизации и, возможно, способствовало образованию АФК (в реакциях с участием полиаминоксидазы). Действие Спм совместно с Н202 также изменяло активность изоформ СОД: в корнях повышалась активность Fe-СОД и Cu/Zn-СОД, но снижалась активность Mn-СОД; в листьях - повышалась активность Cu/Zn-СОД, незначительно снижались активности двух других изоформ (рис. 66). Совместная обработка пролином и Н202, как показали наши исследования, вызывала в корнях и листьях появление трех дополнительных изоформ АП с молекулярной массой около 67

кДа (рис. 7а, б). В корнях в этом варианте исчезала одна из высокомолекулярных полос. Обработка Спм растений теллунгиеллы в контрольных условиях вызывала изменения б спектре изоформ АП и в корнях, и в листьях (ркс. 8). При совместном действии Спм с Н2О2 на растения теллунгиеллы в корнях исчезала высокомолекулярная изоформа, и появлялась низкомолекулярная, в листьях картина была схожа с действием только Н202 (рис.8).

Таким образом, и Спм и пролин изменяли изоферментный состав АП и СОД у теллунгиеллы в контрольных условиях и при совместном действии с Н202. Влияние пролина на изоферментный состав СОД отмечен и у растений шалфея при совместном действии с UV-B облучением.

Оценка уровня мРНК генов изоформ СОД в листьях растений шалфея при совместном действии UV-B облучения и пролина. В связи с обнаруженным влиянием экзогенного пролина на активность изоформ СОД у растений шалфея (рис. 9) важно было установить, имеет ли место подобного рода регуляция на уровне мРНК генов, кодирующих изоформы СОД. Анализ уровня мРНК генов изоформ СОД у этого растения показал, что в листьях облученных UV-B растений, содержание мРНК гена MSD возрастало в 2,5 раза. Уровень мРНК CSD увеличивался в 3,5 раза. В отличие от уровня мРНК генов MSD и CSD, уровень мРНК гена FSD не изменялся. Анализ уровня мРНК генов трех изоформ СОД при совместном действии UV-B и пролина показал, что экзогенный пролин снимал стимулирующее действие UV-B на экспрессию гена USD и уровень мРНК генов MSD в листьях шалфея не изменялся. Уровень мРНК гена CSD в листьях также как и при действии только UV-B облучения возрастал в 2,5 раза. Активность цитозолыгай изоформы Cu/Zn - СОД транзиторно увеличивалась в ответ на действие UV-B, что совпадало с интенсивным увеличением (з 3,0 - 3,5 раза) уровня мРНК CSD гена. Добавление пролина в питательную среду к растениям, подвергнутым UV-B облучению, сопровождалось некоторым снижением содержания мРНК гена CSD и полным ингибированием стимулирующего эффекта ультрафиолета на активность Cu/Zn - СОД. Уровень мРНК гена FSD не изменялся ки при облучении, ни при совместном с пролином действии. Несмотря на это, растения отвечали на UV-B кратковременным ингибированием активности Fe-СОД. Пролин снимал вызванное UV-B ингибирование активности Fe-СОД в листьях растений и индуцировал появление двух новых изозимов (рис. 9), что могло быть связано с активацией их латентных форм.

Оценка уровня мРНК изоформ СОД и АП в корнях и листьях теллунгиеллы при совместном действии и пролина или спермина. Для выявления возможного влияния пролина и Сим на транскрипционном уровне мы использовали известные для теллунгиеллы последовательности генов, кодирующих изоформы СОД: CSD1 и CSD2 для Cu/Zn СОД, FeSDl - для Fe-СОД, а также MSD - для МпСОД. Во всех вариантах опытов уровни мРНК генов FeSDI и MSD не изменялись ни в корнях, ни в листьях (рис. 10). Уровни мРНК генов CSD1 и CSD2 изменялись как при действии пролина, так и при действии пролина совместно с И2О2. При действии Спм в корнях уровни экспрессии генов, кодирующих Cu/Zn - СОД изоформу (CSD1 и CSD2), не изменялись. Однако в листьях происходило их увеличение (рис. 10). При действии Спм совместно с Н202 также повышался уровень экспрессии обоих исследованных генов CSD! и CSD2, но только в листьях. Исходя из сравнительного анализа уровня мРНК генов и активностей изоформ СОД при действии пролина и Спм совместно со стрессором (рис. 8-10), можно предположить, что активность Fe-СОД регулируется на метаболическом уровне, что согласуется с данными полученными для шалфея.

4 ■

нгог нгОг

Рисунок 10. Уровень мРНК генов, кодирующих изоферменты СОД в растениях теллунгиеллы, при действии пролина и спермина, Н202, их совместном действии. 1- корни, 2 - листья. (Получено совместно с Корольковой Д.В.).

Незначительная активация Си/гпСОД при индукции экспрессии генов CSD! и CSD2 может быть связана с различным вкладом активности каждого из изоферментов в общую активность данной изоформы, обнаруживаемую методом гель-электрофореза в нативных условиях.

HZ02 МгОг

Рисунок 11. Сравнительный анализ экспрессии генов, кодирующих изоформы АП у растений теллунгиеллы при обработке пролином, Спм, Н202, при их совместном действии. (Получено совместно с Сошинковой Т.Н., Корольковой Д.В.).

В ДНК растении теллунгиеллы нами были идентифицированы пять генов, кодирующих изоформы АП (АРХ1, АРХ2, АРХЗ, АРХ4, АРХ5'). Однако после проведения обратной транскрипции Ш(Р была обнаружена экспрессия на уровне мРНК только двух генов, кодирующих цитозольные изоформы АП (АРХ1, ЛРХ2) и гена, кодирующего микросомальную изоформу (АРХ4'). Совместное действие Н202 и пролина вызывало увеличение уровня мРНК гена АРХ4, кодирующего микросомальную изоформу. и гена АРХ1, кодирующего цитозольную изоформу (рис. 11). Таким образом, яри действии пролина и Н202, пролин оказывал более заметное влияние как на активность изоформ СОД и АП, гак и на уровень мРНК соответствующих генов. Пролин вызывал повышение уровней мРНК генов АРХ1 и АРХ4 в листьях, не влияя на таковой в корнях. Н202 оказывал влияние на уровень мРНК этих генов в корнях и, в меньшей степени, в листьях. Совместное действие

двух исследуемых факторов на уровень мРНК генов АРХ1 и АРХ4 повторяло картину, характерную для пролина. Таким образом, пролин оказывал более сильное влияние на уровень мРНК, чем П2СЬ У теллунгиеллы при добавлении Спм в питательную среду и в листьях, и в корнях возрастал уровень мРНК генов АРХ1 и АРХ4 (рис.11). Однако не было отмечено достоверных изменений уровня мРНК гена АРХ2 изоформы. При совместном действии Спм и Н202 в корнях сохранялся повышенный уровень мРНК генов АРХ1 и АРХ4, но не наблюдалось изменений для мРНК гена АРХ2. В листьях достоверные изменения наблюдались только для мРНК гена АРХ4. Таким образом, также как и на уровне белка, Спм совместно с Н202 снижал стимулирующее действие данного стрессора на экспрессию генов, кодирующих изоформы АП.

Таким образом, и пролин, и Спм могут изменять функционирование антиоксидантных ферментов и при стрессе и в контрольных условиях. Это подверждает обнаруженную дифференциацию в функционировании компонентов антиоксидантной системы у растений.

Глава 4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Образование АФК в растительной или животной клетке - это последствие существования организма в аэробной среде. В процессе эволюции растения сформировали весьма эффективную систему антиоксидантной защиты от избытка АФК. Уже беглого взгляда на разветвленную сеть и/или каскад антиоксидантных реакций достаточно, чтобы увидеть всю сложность координации такой системы. Несмотря на сложную организацию, система работает очень согласованно и защищает от повреждения белки, липиды мембран и нуклеиновые кислоты. АФК, кроме повреждения макромолекул, выполняют сигнальную роль в активации защиты от патогенной атаки, росте и развитии растений, клеточного цикла, программируемой клеточной смерти. Образование избытка АФК изменяет интенсивность экспрессии множества генов ответственных за биосинтез, как белков, так и низкомолекулярных метаболитов, выполняющих, в том числе, и защитные функции. В данной работе мы попытались ответить на вопрос, может ли антиоксидантная система играть роль общего неспецифнческого механизма, позволяющего растению противостоять кратковременному действию абиотических стрессоров. Использование растений, представляющих биомы двух климатических поясов, продемонстрировало сходство в функционировании

антиоксидашной защитной системы у всех исследованных растений. Использованные растения относятся к дшсому типу, т.е. они не прошли направленной селекции (Вавилов, 1926). Выявленные при исследовании этих растений закономерности функционирования антиоксндантной системы при действии абиотических стрессоров, позволили нам сделать вывод, что ее активация, действительно, может быть общим неспецифическим защитным механизмом. С учетом опубликованных в литературе данных, можно считать, что этот механизм позволяет любому растению выживать при кратковременном действии абиотических стрессоров. Однако следует отметить, что активация одной конкретной антиоксндантной реакции не может эффективно защищать растение даже от кратковременного действия стрессоров. Поскольку образование АФК происходит в клетках растений и в нормальных условиях, был изучен конститутивный уровень как низкомолекулярных антиоксидантов, так и активностей антиоксздантных ферментов у опытных растений в контрольных условиях. Важным результатом оказалось обнаружение различий в конститутивном уровне компонентов антиоксндантной системы у этих растений. Так, растения на порядок различались по содержашно эндогенных пролина и индивидуальных ПА и других низкомолекуляркых антиоксидантов и уровню общей активности СОД. Это указывает на то, что и в нормальных условиях вклад компонентов в антиоксидантную защигу не равнозначен и зависит от вида растения. Не равнозначность вклада компонентов антиоксндантной системы у растений еще больше усиливается в стрессорных условиях. Так при кратковременном действии засоления в растениях повышалось содержание пролина, каротиноидов, активировались свободная форма гваяколовых ПО, что указывает на большую эффективность этих реакций для преодоления негативных последствий в данных условиях. Кроме того, возможно эти реакции устойчивы к ингибированию при высоких эндогенных уровнях ионов натрия и хлора. Именно ингибированием отдельных изоформ можно объяснить незначительное повышение общей активности СОД у некоторых растений в условиях засоления, хотя этот фермент является уникальным в антиоксндантной защите и его функционирование необходимое условие ее эффективности. Возможно, ингибирующим эффектом засоления на уровне нативной структуры белков объясняется низкая активность каталази. Можно также предположить, что отсутствие активации биосинтеза ПА путресцинового ряда а условиях засоления

связано с преимущественным использованием глутамата на биосинтез пролина, эффективность последнего в этих условиях хорошо показана для различных растений. При действии UV-B облучения на те же растения ведущую роль, наоборот, играли ПА (в частности, Пут) и их конъюгаты, а также антоцианы, флавоноиды, активировалась СОД и ПО, в меньшей степени, каталаза. При этом аккумуляции пролина не происходило. Следует отметить, что активация свободной формы гваяколовых ПО наблюдалось при действии двух исследованных стрессоров, что возможно связано с многообразием изоформ фермента. Полученные данные указывали на конкуренцию между усилением биосинтеза пролина и ПА: засоление стимулировало биосинтез пролина, но снижало образование ПА, облучение - наоборот, симулировало повышение содержания ПА, но не активировало биосинтез пролина. Кроме того, особенно четко избирательность в функционировании компонентов антиоксидантной защиты проявлялась между аккумуляцией пролина и активацией СОД. При последовательном действии двух стрессоров на растения базилика, полыни и чернушки такая дифференциация была выражена еще более заметно. Все полученные данные по функционированию СОД и аккумуляции пролина у опытных растений при действии засоления и UV-B облучения позволили выявить реципрокный характер между двумя этими метаболическими путями детоксикации АФК. Исследования влияния изучаемых стрессоров на экспрессию генов, кодирующих биосинтез ПА и изоформы СОД, были проведены на примере двух растений - подорожника и теллунгиеллы. Несмотря на дифференциацию в функционировании антиоксидаптных реакций, и засоление и UV В облучение вызывали повышение уровня мРНК генов биосинтеза ПА в листьях теллунгиеллы и подорожника. Но при облучении это приводило к аккумуляции ПА за счет повышения содержания Пут, при засолении сопровождалось снижением уровня свободных ПА также за счет снижения содержания Пут. Возможным объяснением мы считаем участие полиамииоксидазы в регуляции уровня свободных индивидуальных ПА, как это было показано в нашей работе (Королькова и др., 2014). Кроме того, следует отметить, что при действии UV-B облучения на растения подорожника и теллунгиеллы происходило повышение содержания кадаверина, причем у подорожника в корнях и в листьях, а у теллунгиеллы только в листьях. Это еще раз доказывает, что ПА более эффективны при действии UV-B облучения, чем при засолении. Кроме того, следует отметить, что при UV-B

облучении активировался биосинтез фенольных соединений — антоцианов и флавоноидов. Поскольку биосинтез ПА и фенольных соединений связан, можно предположить, что повышение содержания ПА важно для активации биосинтеза фенольных соединений. Повышение уровня мРНК гена CSD1 цитозольной изоформы СОД у растений теллунгиеллы и подорожника при засолении и облучении согласуется с литературными данными о стимуляции экспрессии этого гена АФК (Gechev, 2006; Miura and Tada, 2014). Но возможно регуляция активности изоформ СОД происходила как на уровне изменений в нативной структуре белка, так и на уровне активации латентных форм. Более того, ранее было показано, участие микроРНК - mir398 в регуляции экспрессии гена CSD1 в растениях теллунгиеллы при засолении и облучении (Пашковский и др., 2010). Все это вместе демонстрирует сложную картину регуляции функционирования СОД у растений в стрессорных условиях. Тем не менее, данные об изменении уровня экспрессии генов биосинтеза ПА и цитозольной изоформы СОД свидетельствуют о существовании общих закономерностей в активации антиоксидантной системы при кратковременном действии изучаемых стрессоров.

Измененения в уровне экспрессии генов метаболизма пролина в условиях действия стрессоров, проведенное на примере теллунгиеллы, показало, что повышение уровня мРНК генов биосинтеза пролина согласуется с повышением его внутриклеточного содержания. Повышение интенсивности экспрессии генов биосинтеза пролина наблюдалось также при действии модуляторов ОС. Это согласуется с показанной нами, наряду с другими авторами, способностью пролина участвовать в нейтрализации АФК, замещая СОД или действуя наряду с ней (Сошинкова и др., 2013). Обнаруженная дифференциация в функционировании некоторых антиоксидантных реакций в условиях действия различных стрессоров вызвала необходимость исследовать влияние искусственного избытка низкомолекулярных антиоксидантов - пролина и Спм - на функционирование антиоксидантной системы растения. Данные, полученные на растениях шалфея и теллунгиеллы, контрастных по конститутивному уровню пролина, показали, что повышение содержания внутриклеточного пролина и спермина оказывает заметное влияние на активность СОД, АП, ПО, изоферментный состав этих ферментов, уровень мРНК генов, кодирующих эти изоформы. Для пролина это влияние различалось в зависимости от того, в нормальных и стрессорных условиях находилось растение. В стрессорных

условиях пролин проявлял антиоксидантные свойства, как в растениях шалфея, так и в растениях теллунгиеллы. Это проявлялось в снижении ОС, общих активностях СОД, ДПО и ПО, появлении дополнительных изоформ СОД и АП, у шалфея наблюдалось повышение содержания Пут в листьях. В контрольных условиях выращивания растений теллунгиеллы экзогенный Спм, аналогично пролину, проявлял прооксидантные свойства. Об этом свидетельствовали изменения общей активности и изоферментного состава СОД, АП и гваяколовых ПО, увеличение в 2-3 раза уровней мРНК генов CSD1 и CSD2, генов АРХ1 и АРХ4. При ОС, индуцированном Н202, экзогенный спермин вовлекался в детоксикацию АФК также путем стимуляции активности изоформ СОД и АП и повышениям интенсивности экспрессии указанных выше генов. Также экзогенный спермин вызывал повышение содержания Спд и пролина.

Антиоксидантные свойства пролина и ПА были подтверждены на растениях теллунгиеллы и шалфея при использовании другого модулятора ОС -PQ. С одной стороны, роль пролина и спермина как аптиокевдантов можно объяснить их функционированием по типу шаперонов, стабилизирующих нативную структуру некоторых белков. С другой стороны, мехашим антиоксидантного действия пролина и Спм можно связать с прямым «тушением» АФК, образовавшихся при стрессе. Это предположение вполне согласуется с химической структурой молекул как пролина, так и Спм. Молекула пролина содержит гидрированное пирролыюе кольцо, для которого характерно участие в реакциях, связанных с передачей электронов. Кроме того, пролин способен образовывать устойчивый радикал, поскольку содержит третичный углеродный атом. Образование такого устойчивого радикала приводит к «тушению» или обрыву каскада свободно-радикальных реакций (Verslues and Shakma, 2010; Minosha et al., 2014). Кроме того, пролин способен и к окислению с разрывом пиррольного цикла и образованием лактонов, а также к окислению Н202 с образованием оксипролина, который был обнаружен нами при действии Н202, экзогенного пролина и их совместном действии на растения теллунгиеллы. Окисление пролина до оксипролина демонстрирует прямое участие в детоксикации АФК, поскольку ферментативного окисления свободного пролина до оксипролина в растениях и животных не известно. Кроме того, в отличие от низкомолекулярных антиоксидаптов (аскорбата, токоферола, фенолов) пролин, как известно (Verslues and Shakma, 2010), легко транспортируется по растению, что, возможно, делает его

более конкурентноспособным по отношению к антиоксидантным ферментам, а также к другим низкомолекулярным антиоксидантам. Защитное действие Спм также объясняется химическими свойствами ПА как органических катионов. Они электростатически взаимодействуют с отрицательно заряженными фосфатными группами фосфолипидов, нуклеиновых кислот и с карбоксильными группами белков, а также ковалентно связываются с полипептидными цепями на этапе посттрансляционной модификации белков (Galston et al.,1997; Waiden et al., 1997; Bouchereau et al., 1999: Kaur-Sawhney et al., 2003; Minosha et al., 2014). Таким образом, связывание индивидуальных ПА (и, в частности, Спм) с молекулами белков или нуклеиновых кислот способствует их защите от деградации, что объяснияет участие Спм в защите ДНК от воздействия эндонуклеаз (Cohen, 1990; Nayyar, Chander, 2004; Minosha et al., 2014).

Однако пролин и, в меньшей степени, Спм могут вызывать увеличение содержания АФК в растениях в нормальных условиях. Прооксидантные свойства пролина можно связать с тем, что его расходование и восстановление необходимого внутриклеточного уровня сопряженно с функционированием «пролинового цикла», показанного ранее для животных клеток. (Кузнецов, Шевякова, 1999; Mittler, 2004; Полесская, 2007; Shao et al., 2008; Jimenez-Del-Rio et al., 2012; Miura and Tada, 2014). Это объясняет изменения в уровне мРНК генов метаболизма пролина у растений, как в нормальных, так и в стрессорных условиях выращивания, а также при совместном действии стрессоров и экзогенного пролина. Прооксидантные свойства Спм связаны со строгой регуляцией его содержания, а также уровня других индивидуальных ПА путресциновего ряда, полиаминоксидазой. Одним из продуктов этой реакции является Н202, который может активировать целый каскад окислительно-восстановительных реакций. Вне зависимости от механизмов, регулирующих внутриклеточный уровень пролина и Спм, эти метаболиты при экзогенном добавлении изменяют сбалансированный метаболизм клетки и нарушают протекание последовательных биохимических реакций. Это приводит к активации механизмов поддержания равновесия. Кроме того, нролин и ПА связаны общим предщественником глутаматом, расходование которого при активации того или другого биосинтеза, вызывает конкуренцию между этими метаболитами.

выводы

1. Исследованные виды растений, принадлежащие к биомач двух климатических поясов, отвечают на кратковременное действие стрессоров (хлоридного засоления и UV-B облучения) стимуляцией функционирования антиоксидантной системы. Защитный эффект антиоксидантной системы определяется как активацией антиоксидантных ферментов, так и накоплением различных низкомолскулярных органических антиоксидантов, снижающих повреждающее действие стресс-факторов.

2. У растений, принадлежащих к биомам двух климатических поясов, наблюдается сходство в функционировании антиоксидантной системы. Различия, обусловленные условиями произрастания, отсутствуют.

3. Среди исследованных растений различных климатических группах присутствуют растения, характеризующиеся, например, высоким содержанием пролина, активности супероксиддисмутазы и высоким конститутивным уровнем индивидуальных полиаминов т.е. специфика функционирования антиоксидантной системы определяется видовой принадлежностью растения и природой действующего стрессорного фактора.

4. Избирательность функционирования того или иного компонента антиоксидантной системы в значительной степени зависит от природы действующего на растение стрессорного фактора. Так, у исследованных растений UV-B облучение индуцирует накопление полиаминов и антоцианов и активирует супероксиддисмутазу, но слабо влияет на содержание пролина. Напротив, хлоридное засоление индуцирует аккумуляцию пролина и каротиноидов, частично ингибирует активность супероксиддисмутазы и снижает содержание полиаминов и антоцианов. Наиболее ярко указанная специфика ответа растений на повреждающие факторы различной природы проявляется при последовательном действии указанных факторов па растения базилика, чернушки и полыни.

5. Между некоторыми антиоксидантными реакциями существуют выраженные реципрокные отношения, которые наиболее четко заметны между конститутивным уровнем пролина и активностью супероксиддисмутазы при действии засоления, UV—В облучения, а также при их последовательном действии.

6. Избирательное повышение содержания пролина или полиаминов у растений шалфея и теллунгиеллы при стрессе, вероятно, связано с конкуренцией реакций биосинтеза этих метаболитов за общий предшественник, в качестве которого

выступает глутамат. В пользу этого свидетельствует тот факт, что обработка экзогенным пролином растений шалфея в контрольных и стрессорных условиях увеличивает содержание путресцина, а обработка индивидуальными полиаминам тех же растений стабилизирует уровень пролина.

7. Низкомолекулярные метаболиты, пролин и спермин, вовлекаются в регуляцию функционирования антиоксидаптных ферментов (супероксиддисмутазы и аскорбатпероксвдазы) в растениях теллунгиеллы и шалфея, что проявляется в активации пролином латентных изоформ супероксиддисмутазы и аскорбатпероксидазы, а также в изменении уровней мРНК, кодирующих эти изоформы генов. Все это может лежать в основе реципрокных отношений между содержанием пролина и активностью супероксиддисмутазы.

8. При искусственном повышении внутриклеточного содержания пролина и спермина у шалфея и теллунгиеллы, находящихся в контрольных условиях, спермин проявляет менее выраженные прооксидантные свойства по сравнению с пролином. Это может быть связано с существованием альтернативного механизма регуляции внутриклеточного уровня спермина за счет перехода свободной формы в конъюгированную и наоборот.

9. Повышение интенсивности экспрессии ключевых генов биосинтеза ПА у растений теллунгиеллы и подорожника наблюдалось как при действии хлоридного засоления, так и при UV-B облучении, тогда как увеличение содержания ПА имело место лишь при облучении. Это может быть связано с тем, что при засолении аккумуляция полиаминов лимитируется не уровнем мРНК ключевых ферментов биосинтеза, а определяется на посттранскрипционном, трансляционном или постгрансляционном уровнях.

10. Поскольку стресс-зависимая активация конкретных метаболических реакций клеточной антиоксидантной системы является множественной и ввдоспецифичной, важно учитывать: (1) - что результаты, полученные при использовании модельных растений, могут не в полной мере отражать механизмы функционирования антиоксидантной системы у других видов растений; (2) - что для создания трансгенных растений с эффективно функционирующей ашиоксидантной системой целесообразно использовать два или несколько трансгенов, кодирующих компоненты антиоксидантной системы.

Список публикаций но теме диссертации

1. Ежова Т. А., Солдатова О. Г1., Мамонова Л. Б., Радюкина Н. Л., Софьин А. В., Кудрявцева II. 11., Романов В.И., Шестаков С. В. Толеранные к норфлуразону мутанты Arabidopsis thaliana как объект изучения резистентности к окислительному стрессу// Физиология растений. -1997. - Т. 44. - С. 665-670

2. Ежова Т. А., Солдатова О. П., Мамонова Л. Б., Радюкина Н. Л., Софьин А. В., Кудрявцева Н. Н., Романов В.И., Шестаков С. В. Изучение активностей ферментов антиоксидантной системы в онтогенезе мутантов устойчивых к норфлуразону // Онтогенез. - 2000. - Т.31. - Р.40-46.

3. Лебедева О.В., Ежова Т.А., Мусин С.М., Радюкина Н.Л., Шестаков С.В. Ген PXD контролирует образование трех анионных пероксидаз Arabidopsis thaliana // Известия АН, серия биологическая. — 2003. - С. 178-187.

4. Soldatova О., Apchelimov A., Radukina N., Ezhova T.,Shestakov S., Zicmann V., Hedtke В., Grimm B. An Arabidopsis mutant that is resistant to the protoporphyrinogen oxidase inhibitor acifluorfen shows regulatory changes in tetrapyrrole biosynthesis // Mol.Gen.Genomics. -2005.-Vol. 273. - P. 311-318.

5. Карташов A.B., Иванов Ю.В., Радюкина Н.Л., Шевякова Н.И., Кузнецов Вл.В. Активация некоторых защитных систем в растениях Thellungiella halophila при действии NaCl // Известия ПГПУ. -2006. - Т. 5, №1. - С.57-61.

6. Радюкина Н.Л., Карташов А.В., Иванов Ю.В., Шевякова Н.И., Кузнецов Вл. В. Сравнительный анализ функционирования защитных систем у представителей галофитной и гликофитной флоры в условиях засоления // Физиология растений. -2007. - Т. 54. - С. 902-912.

7. Kuznctsov VI. V., Radukina Nataliya L., Shevyakova Nina I. "Metabolism of polyamines and prospects for producing stress-tolerant plants": An overview. In: Plant Stress and Biotechnology (Ch. 6) Ed. Devarajan Thangadurai, Bioscience Publications, 2007. - P. 213-256.

8. Карташов А. В., Радюкина И. Л., Иванов Ю. В., Пашковский П. П., Шевякова Н. И., Кузнецов Вл. В. Роль антиоксидантных систем при адаптации дикорастущих видов растений к солевому шоку П Физиология растений. - 2008. - Т. 55, N 4. - С. 516522.

9. Рздюкина H. Л., Шашукова А. В., Шевякова Н. И., Кузнецов Вл. В. Участие пролина в антиоксидантной защитной системе шалфея при действии NAC1 и параквата II Физиология растений. - 2008. - Т.55, N 5. - С. 721-730.

Ю.МареШ S., Brambilla I. M., Radyukina N. L., Ivanov Yu. V., Kartashov A. V., Reggiani R., Kuznetsov VI. V. Free and bound polyamines changes in différent plants as a conséquence of uv-b light irradiation II Gen. Appl. Plant. Physiol. (Spécial Issue). - 2008. -Vol. 34. - P. 55-56.

1 i.Рздюкина H.JI., Мапелли С., Иванов Ю.В., Картащов А.В., Брамбнлла И.. Кузнецов Вл.В. Гомеостаз полиаминов и антиоксидантные системы корней и листьев Plantago major при солевом стрессе // Физиология растений. - 2009. - Т. 56. - С. 359368.

12.Радюкина Н.Л., Шашукова А.В., Мапелли С., Шевякова Н.И., Кузнецов Вл.В. Пролин регулирует уровень полиаминов в растениях шалфея в нормальных условиях и при UV-B облучении // Физиология растений. - 2010. - Т. 57. - С. 422-429.

13.Тоайма В.И.М., Радюкина Н.Л. Дмитриева Г.А. Кузнецов Вл.В. Участие антиаксидантной защитной системы базилика в кросс-адаптации при комплексном действии UV-B и засоления // Вестник РУДИ. - 2010. - Т. 14. - С 123-127.

Н.Пашковский П.П., Рязанский С.С., Радюкина Н.Л., Гвоздев В.А., Кузнецов Вл.В. МИР398 и регуляция экспрессии гена цитоплазматической Cu/Zn SOD в растениях ThellungieUa halophilc. в условиях стресса // Физиология растений. - 2010. -Т. 57. - С. 756-767.

15. Радюкина Н. Л., Шашукова А. В., Макарова С. С., Кузнецов Вл. В. Экзогенный пролин модифицирует дифференциальную экспрессию генов супероксиддиемутазы в растениях шалфея при UV-B облуче!ши Н Физиология растений. - 2011. - Т. 58. - С.49-57.

16.Парфенов НА., Ревина Т.А., Пашковский П.П., Радюкина Н.Л., Валуева Т.А. Фрагмент гена, кодирующего белок-ингибитор химотрипсина и трипсина в картофеле // Прикладная биохимия к микробиология. - 2011. - Т. 47, - С.402-407.

17.Radyukina N.L., Ivanov Yu.V., Kartashov A.V.. Pashkovskiy P.P., Shevyakova N.I., Kuznetsov Vl.V. Regulation of gene expression governing proline metabolism in Theliungiella salsuginea by NaCl and paraquat // Физиология растений. - 2011. - T. 58. -С. 558-567.

18.Радюкина H. Л., Шашукова А. В., Мапелли С, Сошинкова Т. Н. Влияние экзогенных полиаминов на содержание пролииа и эндогенных свободных и конъюгированных полиаминоврастений шалфея в условиях окислительного стресса // Физиология растений. - 2011. - Т. 58. - С. 673-680.

19.Пашковский П.И., Радюкина Н.Л. МикроРНК и регуляция экспрессии генов Cu/Zn-СОД в растении Theliungiella salsuginea при действии различных концентраций меди// Вестник Томского государственного университета. - 2011. - Т. 15. - С. 147-151.

20.Радюкина Н.Л., Тоайма В., Зарипова Н.Р., Кузнецов Вл.В. Участие низкомолекулярных антиоксидантов в кросс адаптации лекарственных растений к последовательному действию UV_B облучения и засоления // Физиология растений. -2012.-Т. 59.-С.1-9.

21.Радюкина Н.Л., Тоайма В., Зарипова Н.Р., Кузнецов Вл.В. Влияние последовательного действия UV-B облучения и засоления на динамику содержания фенольных соединений в растениях различных экофизнологических групп. Сборник материалов докладов VIII Между народного симпозиума. - М, 2012. - С. 434-439.

22.Сошинкова Т. Н., Радюкина Н. Л., Королькова Д. В., Носов А. В. Пролин и функционирование антиоксидантной системы растений и культивируемых клеток Theliungiella salsuginea при окислительном стрессе // Физиология растений. - 2013. -Т.60. - С. 47- 60.

23.Iori V., Pietrini F., Cheremisina A., Shevyakova Nina I., Radyukina N., Kuznetsov Vladimir V., Zacchini M. Growth Responses, Metal Accumulation and Phytoremoval Capability in Amaranthus Plants Exposed to Nickel Under Hydroponics // Water Air Soil Pollution. - 2013. - DOI 10.1007/sl 1270-013-1450-3.

24.Королькова Д.В., Радюкина H.JL, Сошипкова Т.Н., Мапелли С., Кузнецова

Вл.В. Влияние экзогенного спермина на функционирование антиоксидантной

системы растений Thellungislla salsvginea // Физиология растений. - 2014. - Т.61. - С. 69- 76.

25.Pietrini F., Iori V., Cheremisina A., Shevyakova N. I., Kadyukina N., Kuznstsov VI. V., Zacchini M. Evaluation of nickel tolerance in arnaranthus paniculatus l.plants by measuring photosynthesis, oxidative status,antioxidative response and metal-binding molecule content // Environ Sci Pollut Res. - 2015. - Vol. 22. - P. 482 - 494

Подписано в печать:

10.06.2015

Заказ № 10797 Тираж - 150 экз. Печать трафарегная. Объем: 3 усл.п.л. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 vvvvw.autoreferat.ra

Информация о работе

Радюкина, Наталия Львовна
доктора биологических наук
Москва, 2015
ВАК 03.01.05

Автореферат

Функционирование компонентов антиоксидантной системы дикорастущих видов растений при кратковременном действии стрессоров - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы