Влияние спермина на функционирование антиоксидантной системы растений Thellungiella salsuginea

Королькова, Диана Валерьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние спермина на функционирование антиоксидантной системы растений Thellungiella salsuginea
ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Влияние спермина на функционирование антиоксидантной системы растений Thellungiella salsuginea"

На правах рукописи

Королькова Диана Валерьевна

ВЛИЯНИЕ СПЕРМИНА НА ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ АНТИОКСИДАНТНОЙ СИСТЕМЫ РАСТЕНИЙ ТНЕЬШМвШЫЛ

БАЬЗиОШЕА

03.01.05 - физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

5 ДЕК 2013

005541648

Москва—2013

005541648

Работа выполнена в лаборатории физиологических и молекулярных механизмов адаптации Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, Москва.

Научный руководитель:

кандидат биологических наук

Радюкина Наталия Львовна

Официальные оппоненты:

Тараканов Иван Германович, доктор биологических наук, профессор, Российский государственный аграрный университет - МСХА им. К.А. Тимирязева, кафедра физиологии растений, заведующий кафедрой

Живухина Елена Александровна, кандидат биологических наук, доцент, Московский педагогический государственный университет, биолого - химический факультет, доцент кафедры ботаники

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, биологический факультет

Защита диссертации состоится «26» декабря 2013 года в 13:00 ч на заседании Совета по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук Д 002.210.01 по специальности 03.01.05 - «Физиология и биохимия растений» (Биологические науки) при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук по адресу: 127276, Москва, ул. Ботаническая, 35. Факс: (499) 977-80-18, www.ippras.ra, электронная почта: m-azarkovich@ippras.ru, ifr@ippras.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук. Автореферат разослан «22» ноября 2013г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Жизнь растений — это чётко организованная, генетически запрограммированная и регулируемая система взаимосвязанных превращений органических веществ и связанной в них потенциальной энергии (Ничипорович, 1972). Вместе с тем, в природных условиях растения постоянно подвергаются действию неблагоприятных факторов окружающей среды, что приводит к нарушению равновесия между различными метаболическими реакциями, протекающими в клетке.

Общим признаком действия стрессоров является усиление генерации активных форм кислорода (АФК), приводящее к развитию окислительного стресса (ОС) (Mittler, 2002; Foyer, Noctor, 2005). В процессе эволюции в растениях развивалась сложная система строго координированных реакций, контролирующих уровень АФК. Антиоксидантная защитная система (АОС) растений включает в себя как высокомолекулярные антиоксиданты (ферменты аскорбат-глутатионового цикла, супероксиддисмутаза (СОД), каталаза (КАТ) и др.), так и низкомолекулярные метаболиты (пролин (Про), полиамины (ПА), соединения фенольной природы и прочие). До сих пор остаются практически не выясненными механизмы, лежащие в основе взаиморегуляции между компонентами АОС.

В последнее время особое внимание учёных уделяется низкомолекулярным метаболитам, в частности Про и ПА. В ряде работ показано, что ПА путресцинового ряда (путресцин (Пут), спермидин (Спд), спермин (Спм)), обладающие антиоксидантными и хелатирующими свойствами, вовлечены в регуляцию многих физиологических процессов (Аронова и др., 2005; Кузнецов и др., 2006; Hussain et al., 2011; Moschou et al., 2012).

Вопрос о том, какой эффект оказывают экзогенные ПА, в частности Спм, на окислительно-восстановительный статус растения, остается в настоящее время открытым. Практически неизвестно, как искусственное повышение ПА в клетках растений влияет на функционирование и взаиморегуляцию компонентов АОС в оптимальных условиях выращивания, а также при действии стрессоров.

Cona et al., 2006). Имеются предположения, что, образующийся при катаболизме ПА, пероксид водорода участвует в индукции АОС, что, возможно, является основой защитного действия ПА в клетках растений (Yoda et al., 2003; Wan et al., 2009; Aleasar et al., 2011). Исследования no данному вопросу единичны и до сих пор неясно вовлекается ли ПАО в индукцию защитного ответа растения на стрессы.

В связи со всем вышесказанным представляется целесообразным исследование влияния экзогенных ПА на функционирование компонентов АОС как в оптимальных условиях выращивания растений, так и при действии окислительного стресса.

Цель и задачи исследования. Цель заключалась в исследовании роли полиаминов в регуляции функционирования компонентов антиоксидантной системы и индукции защитного ответа растений Th. salsuginea при обработке спермином, пероксидом водорода, а также при их совместном действии.

Задачи исследования:

1. Изучить влияние спермина на функционирование компонентов антиоксидантной защитной системы растений Th. salsuginea в оптимальных условиях выращивания, а также при действии окислительного стресса, индуцированного пероксидом водорода.

2. Исследовать функционирование компонентов антиоксидантной защитной системы растений Th. salsuginea при совместном действии спермина и пероксида водорода.

3. Исследовать функционирование полиаминоксидазы и роль фермента в регуляции внутриклеточного пула полиаминов в растениях Th. salsuginea в условиях обработки растений спермином, пероксидом водорода и при их совместном действии.

4. Провести сравнительный анализ уровней мРНК генов, кодирующих изоформы полиаминоксидазы, в растениях Th. salsuginea в условиях обработки растений спермином, пероксидом водорода и при их совместном действии.

5. Изучить влияние спермина на изоферментный состав ключевых антиоксидантных ферментов (супероксиддисмутаза, аскорбатпероксидаза) и уровни мРНК генов, кодирующих изоформы данных ферментов, в растениях Th. salsuginea при обработке экзогенным спермином, пероксидом водорода и при их совместном воздействии.

6. Изучить влияние спермина на метаболизм пролина и уровни мРНК генов, кодирующих ключевые ферменты синтеза и катаболизма пролина, у растений Th. salsuginea при обработке экзогешшм спермином, пероксидом водорода и их совместном действии.

Научная новизна. Впервые показано, что экзогенный спермин в растениях 77г. salsuginea активирует супероксиддисмутазу и аскорбатпероксидазу как в оптимальных условиях выращивания, так и при действии окислительного стресса, индуцированного пероксидом водорода. В оптимальных условиях спермин вызывал изменения в изоферментном составе и уровнях мРНК генов, кодирующих изоферменты супероксиддисмутазы и аскорбатпероксидазы. Впервые показано существование ПАОЗ-зависимой обратной конверсии высокомолекулярных полиаминов в растениях 77г. ваЬи&пеа. Экзогенный спермин приводил к изменению уровня мРНК генов, кодирующих изоформы полиаминоксидазы как в оптимальных условиях выращивания, так и при действии окислительного стресса. Подтверждена гипотеза о взаимосвязи биосинтеза пролина и полиаминов. Спермин вовлекается в регуляцию метаболизма пролина, вызывая изменения в содержании свободного пролина в растениях, а также повышение уровней мРНК генов, кодирующих ключевые ферменты метаболизма пролина.

Практическая значимость. Полученные данные по влиянию спермина на функционирование антиоксидантной системы Тк salsuginea имеют существенное значение для понимания роли полиаминов в индукции защитного ответа растений. Результаты исследования расширяют представления о механизмах, лежащих в основе координированной взаиморегуляции компонентов защитной системы растительного организма. Полученные данные могут быть использованы в технологиях создания трансгенных растений, обладающих повышенной устойчивостью к стрессам различной природы. Возможно использование результатов настоящего исследования в практике растениеводства. Вся совокупность теоретических обобщений и экспериментальных данных этой работы может быть рекомендована для разработок курсов лекций для студентов биологических факультетов ВУЗов.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на 16-ой Путинской международной школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI» (Пущино, 2012); XIX Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2012» (Москва, 2012); Н(Х) Международной Ботанической Конференции молодых ученых (Санкт-Петербург, 2012); на семинаре молодых ученых в Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева (Москва, 2012); XX Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2013» (Москва, 2013); 17-ой Путинской международной школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI» (Пущино, 2013).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных

работ, в том числе 2 статьи в рецензируемых журналах.

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Материалы диссертации изложены на 115 страницах машинописного текста и иллюстрированы 4 таблицами и 23 рисунками. Список цитируемой литературы включает 225 наименований, в т.ч. 215 на иностранных языках.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве объекта исследований использовали 6-недельные растения Thellungiella salsuginea (Pail.) O.E. Schulz (Th. salsuginea) (экотип Shandong), выращенные на питательной среде Кнопа с микроэлементами по Хогланду (pH = 6,0). Растения культивировали в камере фитотрона при 12 - часовом световом периоде под лампами Philips (F36W/54) (интенсивность светового потока в диапазоне ФАР 250 ± 50 мкмоль фотонов/м"2с"'). Температура воздуха составляла 23 ± 5°С и 16 ± 5°С (день/ночь), относительная влажность воздуха - 55/70% (день/ночь).

Условия проведения опытов. Взрослые растения, находящиеся на стадии розетки (6 недель) переносили на питательную среду, содержавшую Спм (1 мМ или 2 мМ), ингибитор активности полиаминоксидазы НЕН (ß -hydroxyethyl hydrazine) (1 мМ или 2 мМ) или оба эти соединения. Окислительный стресс индуцировали нанесением на листья раствора пероксида водорода (500 мкМ). Контрольные растения выращивали на исходной питательной среде.

Через 12 ч культивирования растений в указанных выше условиях отбирали пробы листьев и корней; материал фиксировали жидким азотом и хранили при -70"С до проведения биохимических и молекулярно -биологических анализов.

Содержание свободных ПА определяли в виде их дансил-производных методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (МареШ et al., 2008).

Определение содержания свободного Про проводили по методу Bates с соавт. (Bates et al., 1973).

Содержание малонового диальдегида (МДА) оценивали спектрофотометрическим методом, основанном на образовании окрашенного комплекса МДА с тиобарбитуровой кислотой при нагревании (Heath, Packer, 1968).

Определение активности ПАО проводили по методу Cona et al. (2003). Активность ПАО рассчитывали по количеству образовавшегося пероксида

водорода при окислительной деградации спермидина.

Определение общей активности СОД проводили но методу, основанному на ингибировании СОД фотохимического восстановления нитросинего тетразолия до формазана (Beauchamp, Fridovich, 1971), и выражали в условных единицах активности СОД/мг белка.

Активность КАТ измеряли спектрофотометрически по скорости разрушения пероксида водорода каталазой грубого экстракта (Maehly, Chance, 1954).

Активность гваяколовых пероксидаз (ПО) измеряли спектрофотометрически по скорости окисления гваякола (Ridge, Osborne, 1971).

Активность АПО определяли спектрофотометрически по скорости разрушения аскорбиновой кислоты (Nakano, Asada, 1981).

Активность пролиндегидрогеназы (ПДГ) определяли спектрофотометрически по изменению концентрации восстановленного НАД (Mattioni et al., 1997).

Определение белка в ферментных препаратах проводили спектрофотометрически с использованием красителя Кумасси R-250 по Esen (Esen, 1978).

Нативный гель-электрофорез СОД, АПО проводили в полиакриламидном геле (12% разделяющий и 5% концентрирующий) по стандартной методике Ornstein и Davis (Ornstein, 1964; Davis, 1964) на приборе «Mini protein 3», (Bio-Rad, США). При проведении гель-электрофореза образцы выравнивали по содержанию белка. Содержание белка определяли методом, основанном на восстановлении меди при взаимодействии с белками в щелочных условиях в присутствии бицинхониновой кислоты (Smith, 1985). В качестве стандарта использовали БСА. Визуализацию отдельных изоформ СОД проводили методами, предложенными Мизальским (Miszalski, 1998). Визуализацию отдельных изоформ АПО проводили по методике, предложенной Миттлером (Mittler, Zilinskas, 1993).

Экспрессию генов изоформ ПАО, АПО, СОД, а также генов метаболизма Про исследовали методом ОТ-ПЦР с использованием специфических праймеров, сконструированных в программной среде Vector NTI и AliginX (Invitrogen, США), программы Vector NTI и базы данных www.ncbi.nlm.nih.gov. Тотальную РНК выделяли кислым фенол-хлороформом (Krapp et al., 1993). Очистку от примесей ДНК, синтез кДНК осуществляли с использованием ферментов и реактивов фирмы «Fermentas» по протоколу производителя. Результаты ПЦР оценивали методом электрофореза нуклеиновых кислот в 1%-ном агарозном геле в присутствии

бромистого этидия. Обработку полученных фореграмм проводили с помощью программы GelPro.

Представленные данные являются результатом трёх независимых экспериментов, получены не менее, чем в 3-кратной биологической и аналитической повторностях. Итоговые данные обрабатывали статистически в среде Microsoft Excel 2007 и выражали как среднюю арифметическую величину ± ошибка средней величины.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Влияние спермина на содержание МДА и активность антиоксидантных ферментов в растениях Th. salsuginea

Для выяснения роли ПА в функционировании компонентов АОС представлялось целесообразным исследовать реакцию растений на действие экзогенных ПА, в частности Спм, как в оптимальных условиях выращивания, так и при развитии окислительного стресса.

Добавление в питательную среду растений 1 мМ и 2 мМ Спм не приводило к изменениям уровня МДА и активности КАТ в корнях. При этом происходило некоторое повышение активностей СОД (с 2,03 ± 0,14 ед. акт./(мг белка мин) до 2,46 ± 0,27 и 3,06 ± 0,21 ед. акт./(мг белка мин)), АПО (с 56,15 ± 2,80 мкмоль аскорбата/(мг белка мин) до 80,03 ± 3,08 и 74,26 ± 3,10 мкмоль аскорбата/(мг белка мин)), ПО II (с 43,13 ± 2,70 нмоль гваякола/(мг белка мин) до 118,26 ± 8,47 и 102,00 ± 7,90 нмоль гваякола/(мг белка мин)) и снижение активности ПО I (с 512,47 ± 35,80 нмоль гваякола/(мг белка мин) до 261,89 ± 21,18 и 289,01 ± 24,10 нмоль гваякола/(мг белка мин)). 2 мМ Спм вызывал изменения в спектре изоформ-СОД (увеличение активности Cu/Zn-СОД и снижение Mn-СОД), что сопровождалось увеличением уровня мРНК генов, кодирующих Cu/Zn- СОД изоформу (рис. 1 и 2а).

При обработке растений 1 мМ Спм в листьях не было отмечено изменений содержания МДА, а также существенного повышения активности АПО, гваяколовых ПО и КАТ. Не было изменений и в общей активности и изоферментном составе ключевого фермента антиоксидантной системы -СОД. 2 мМ Спм оказывал действие, сходное с действием 1 мМ Спм. Не было отмечено существенных изменений в спектре изоформ СОД и уровнях мРНК генов CSD1, CSD2 и FeSDl (рис. 1 и 26).

Таким образом, Спм, добавленный в питательную среду, не вызывал развитие у растений окислительного стресса, но приводил к изменениям в активностях антиоксидантных ферментов. Предположительно, увеличение активности цитозольной изоформы СОД связано с функционированием ПО в качестве оксидазы (Liithje et al., 2011).

(а)

Ке-СОД НД си/гп-сод РЩ

Мп-СОД Я®

1 мМ

Спм

Ге-СОД Си/гп-€ОД Мп-СОД

2 мМ Спм

к 1мМ 2 иМ Спм Спм

£ 4.5

с 4

V а э 3.5

и -й е; 3

- и ^ 2.5 -

а X и О 2

£ е-О 1.5

и £ С 1

<и н 0.5

я 0

..........

1 мМ Спм 2 мМ Спм

Рисунок 1 - Изоферментный состав СОД в растениях Тк эаЬи&пеа. 1 корни, 2 - листья; а - корни, б - листья.

а л

к»

с^ш

С81)2 Лст2

2 1 О 4

<3 2 0

ей £

1 мМ Спм

-I-

Г 1 ■

2 мМ Спм

сяш

С81)2 Ге.ЧШ Асг2

Ш...............1...........Л

1 мМ Спм

2 мМ Спм

Рисунок 2 - Уровень мРНК генов, кодирующих изоферменты СОД в растениях Тк яаАш^шеа. а - корни, б - листья.

2. Влияние спермина на активность и изоферментный состав АПО

в растениях Тк. йаки&пеа В ДНК растений 77г. за1^теа нами были идентифицированы пять генов, кодирующих изоформы АПО (АРХ1, АРХ2, АРХЗ, АРХ4, АРХ5). На уровне мРНК было обнаружено присутствие двух генов, кодирующих цитозольные изоформы АПО (АРХ1, АРХ2) и гена, кодирующего микросомальную изоформу (АРХ4). В корнях и листьях Тк salsugmea при добавлении 1 мМ и 2 мМ Сим в питательную среду возрастал уровень мРНК генов АРХ1 и АРХ4 (рис. За и 36). Однако не было отмечено достоверных изменений уровня мРНК гена АРХ2 изоформы.

(а)__

АРХ1 АРХ2 ЛРХ4 ЛсГ2

И 2 ^ 1

| I

&н а, « XI

к 1мМ 2 иМ Спм Спм

(б)

АРХ1 |> Ас¿2 |ВИДЕД

х. 1 мМ 2 мМ

02 О

1 мМ Спм

2 мМ

Спм

3 2 1

0 3 2

1 О

Спм Спм

И.

Рисунок 3 - Уровень мРНК генов, кодирующих изоформы АПО в растениях Тк salsuginea. а - корни, б - листья.

В корнях и в листьях растений Тк иаки^теа было обнаружено присутствие двух высокомолекулярных изоформ АПО. В корнях при действии 1 мМ и 2 мМ Спм наблюдалось появление одной низкомолекулярной изоформы и двух дополнительных высокомолекулярных (рис. 4а). В присутствии 1 мМ и 2 мМ Спм в листьях происходило появление дополнительно одной низкомолекулярной изоформы (рис. 46).

(а)

140 кДА ¡вея ¡¡¡Я

11Ю1ИИМ1

ИИ

67 кДА 5 И 11111

к 1мМ 2мМ Спм Спм

(б)

МО К-Д А

67кДА

¡¡; 1мМ 2мМ Спм Спм

Рисунок 4 - Изоферментный состав АПО в растениях ТИ. 8аЬщ1пга. а -корни, б - листья.

3. Влияние совместной обработки спермином и пероксидом водорода на содержание МДА и активность антиоксидантных ферментов в растениях ГА. ха1$1щ'теа

В ряде работ показано, что в условиях окислительного стресса ПА проявляют антиоксидантные свойства (СЬайорас)Ьауау е1 а1., 2002; Огорра ег а!., 2003; Каккаг, Sawhney, 2003). Согласно данным, представленным в разделе 1 и 2, более яркие изменения в функционировании компонентов АОС наблюдались при воздействии Спм в концентрации 2 мМ. Поэтому, в наших опытах по проверке антиоксидантных свойств ПА мы использовали 2 мМ Спм.

(а) __ (б)

Ге-сод ВИЯВВ1

71«

Ге-ООД Са/гп-СОД Мп-СОД

Мп-СОД

К 2 мМ Спм 500 мкМ Н2О2

2 мМ Спм 500 мкМ Н2О2

, Ре-

сод

(Щ Си/7л-Ш СОД

Ш Мп" Ш сод

Рисунок 5 - Изоферментный состав СОД в растениях 77г. ха1$и£'теа. 1 -корни, 2 - листья; а - корни, б - листья.

Сим, добавленный в питательную среду растений, в условиях окислительного стресса в корнях приводил к повышению активности СОД (с 2,03 ±0,14 ед. акт./(мг белка мин) до 4,26 ± 0,46 ед. акт./(мг белка мин)) и ПОП (43,13 ± 2,70 нмоль гваякола/(мг белка мин) до 96,36 ± 4,15 нмоль гваякола/(мг белка мин)), незначительному увеличению активности АПО и снижению активности П01 (с 512,47 ± 35,80 нмоль гваякола/(мг белка мин) до 235,92 ± 25,26 нмоль гваякола/(мг белка мин)). В листьях не наблюдалось достоверных изменений содержания МДА и активности КАТ. Однако происходило увеличение активности СОД (с 1,68 ± 0,009 ед. акт./(мг белка мин) до 3,11 ± 0,31 ед. акт./(мг белка мин)) и АПО (с 7,41 ± 0,42 ед. акт./(мг белка мин) до 12,42 ± 0,64 ед. акт./(мг белка мин)).

(а)

CSD1 CSD2 FeSDl Act.2

2 мМ Спи 500 мкМ Н2О2

2 мМ Спм 500 мкМ Н2О2

Рисунок 6 - Уровень мРНК генов, кодирующих изоферменты СОД в растениях ТИ. заЬи§теа. а — корни, б — листья.

В корнях в этих условиях наблюдалось увеличение активности Cu/Zn-содержащей изоформы (в 2,5 раза) и снижение активности Мп-содержащей изоформы СОД на фоне повышения уровня мРНК генов CSD1 и CSD2 (рис. 5 и 6а). В листьях не наблюдалось достоверных изменений ни спектра изоформ фермента, ни уровня мРНК генов CSD!, CSD2, FeSDl (рис. 5 и 66).

Гч

и 2 сС

тг 1

. О

5 3 а

1 мМ Спм 500 мкМ Ш02

Ш.

з 2 1 0 3 2 1 0 3 2 1 О

К 2 мМ Спм 500 мкМ Н2О2

на

2 мМ Спм 500 мкМ Н2О2

2 мЫ Спм 500 мкМ Н2О2

Рисунок 7 - Уровень мРНК генов, кодирующих изоформы АПО в растениях ГА. salsuginea. а - корни, б - листья.

(а)

(б)

140 нДЛ | радрг;

р| V 1|| 1Ё8

67 кДА 1111 ■ -ДйЩ ШаИЗЖвйвЩра НвнЗ

140 кДА

67 к ДА

ним—II

■ ШШЙ

2 мМ Спм 500 мкМ Н202

ИМИ

к- 2 мМ Спм 500 мкМ Н202

Рисунок 8 - Изоферментный состав АПО в растениях Тк salsuginea. а -корни, б — листья.

В корнях на фоне отсутствия значимых изменений общей активности АПО не было отмечено и изменений уровня мРНК генов, кодирующих изоформы данного фермента (рис. 7а). При этом происходило ингибирование одной из высокомолекулярных изоформ АПО и появление

низкомолекулярной (рис. 8а). В листьях в данных условиях при повышении общей активности АПО наблюдалось увеличение уровня мРНК генов, кодирующих цитозольную и микросомальную нзоформы фермента (АРХ1 и АРХ4) (рис. 76). Методом гель - электрофореза в нативных условиях показано появление дополнительной низкомолекулярной изоформы АПО (рис. 86). Возможно, изменения в спектре изоформ АПО связаны с транспортом как пероксида водорода, так и Спм.

4. Влияние спермина и совместного действие спермина и пероксида водорода на метаболизм пролина в растениях Тк. хаЫи«теа

Известно, что одним из компонентов АОС растений является пролин, обладающий мультифункциональными свойствами (Шевякова и др., 2009; Сошинкова и др., 2013). Многие исследователи полагают, что в клетках растений поддерживается тесная корреляция между уровнями содержания Про и ПА.

Р5С81 Р5СВН Аса

ч "ч

« с<з

Ч о

у «Л

к 1 мМ 2 мМ Спм Спм

Р5С$1 Р5СПН Ас^2

3 2 1 0

к 1 мМ 2 мМ Спм Спм

£ к-,

Й Р? £ ^

□ К

1 мМ Спм

з -1

2 -

1 .......... 0

2 мМ Спм

1 мМ Спм

г мм

Спм

Рисунок 9 - Уровень мРНК генов метаболизма Про в растениях 77г. ха1т£теа. а - корни, б - листья.

Из полученных данных следует, что внесение 1 мМ и 2 мМ Спм в питательную среду 77г. salsuginea сопровождалось повышением в корнях содержания внутриклеточного Про в 2 раза (с 1,24 ± 0,006 мг/г сырой массы до 2,81 ± 0,032 мг/г сырой массы и 2,65 ± 0,18 мг/ г сырой массы соответственно) при отсутствии изменений активности ПДГ. В листьях не

наблюдалось достоверного увеличения уровня Про, но при этом отмечалось ингибирование активности ПДГ - ключевого фермента деградации Про (с 11,21 ±0,53 мг/г сырой массы до 3,91 ± 026 мг/г сырой массы и 3,24 ± 0,23 мг/г сырой массы соответственно). Однако экзогенный Спм повышал уровень мРНК генов ключевых ферментов метаболизма пролина Р5С5У и Р5СВН и в корнях и в листьях растений (рис. 9а и 96).

Совместная обработка Спм и пероксидом водорода не оказала существенного влияния на содержание Про и активность ПДГ как в корнях, так и в листьях растений. Вместе с тем, в корнях происходило увеличение в 2,5 раза уровня мРНК ключевого гена биосинтеза Про Р5С67 (рис. 10а и 106). В листьях повышение относительного содержания мРНК гена Р5СЯ1 в 3 раза сопровождалось снижением в 2 раза уровня мРНК гена катаболизма Про Р5СОН (рис. 106).

Данные свидетельствуют о том, что действие экзогенного Спм на метаболизм Про проявляется на транскрипционном уровне, но, не всегда сопровождается изменениями на уровне конечного продукта.

л Е

ю с

Г5СЯ1 Р5СВН А с(2

> 3 со О 2 "с.

¡4

.о

>г,

й.

К 1 мМ Спм 500 мкМ Н2О2

■

Р5СЯ1 Р5СВН А(Л2

3 2 1 0

2 мМ Спм 500 мкМ Н2О2

К 2 мМ Спм 500 мкМ Н2О2

2 мМ Спм 500 мкМ Н2О2

Рисунок 10 - Уровень мРНК генов метаболизма Про в растениях Тк ьаЬщгпеа. а - корни, б - листья.

5. Изменение содержания и спектра свободных полиаминов при действии спермина и пероксида водорода в растениях Th. salsuginea

Полученные результаты показывают, что в корнях контрольных растений содержание Пут составляло 0,139 ± 0,011 нмоль/г сухой массы, Спд - 0,022 ± 0,003 нмоль/г сухой массы и Спм - 0,039 ± 0,004 нмоль/г сухой массы. Спустя 12 ч после внесения 1 мМ Спм в питательную среду наблюдали увеличение общего пула ПА в корнях, которое было обусловлено увеличением (в 1,8 раза) содержания Пут (0,243 ± 0,014 нмоль/г сухой массы) и (в 2,2 раза) Спд (0,049 ± 0,004 нмоль/г сухой массы). Листья контрольных растений характеризовались практически таким же уровнем свободных ПА (Пут - 0,122 ± 0,009 нмоль/г сухой массы, Спм - 0,032 ± 0,003нмоль/г сухой массы, Спд - 0,035 ± 0,004 нмоль/г сухой массы), что и корни. При добавлении в питательную среду 1 мМ Спм содержание в листьях ПА незначительно снижалось.

Повышение концентрации Спм в питательной среде (2 мМ) сопровождалось дальнейшим увеличением в корнях общего пула ПА исключительно за счет накопления Спд (0,533 ± 0,027 нмоль/г сухой массы), тогда как в листьях наблюдалось снижение внутриклеточного содержания ПА в основном за счет падения уровня Пут (0,080 ± 0,007 нмоль/г- сухой массы).

Возможным объяснением отсутствия повышения содержания внутриклеточного Спм в указанных условиях может быть ингибирование Спм собственного биосинтеза. Повышение содержания Спд, а не Спм, может служить аргументом в пользу гипотезы о функционировании у Th. salsuginea в условиях экзогенного добавления Спм особой изоформы ПАО, превращающей Спм в Спд, который далее превращается в Пут. Различия в действии Спм на пул свободных ПА в корнях и листьях могут свидетельствовать о том, что экзогенный Спм, добавленный в питательную среду, не достигал листьев растений.

Обработка растений Th. salsuginea 500 мкМ пероксидом водорода вызывала в корнях лишь незначительное повышение уровня ПА за счёт увеличения содержания Пут в 1,3 раза (0,174 ± 0,019 нмоль/г сухой массы) и Спд в 1,5 раза (0,032 ± 0,002 нмоль/г сухой массы) в первые 12 часов эксперимента. В листьях в этих условиях происходило снижение в 2,2 раза уровня Спд (0,016 ± 0,001 нмоль/г сухой массы), а также некоторое уменьшение содержания Пут (в 1,3 раза; 0,091 ± 0,009 нмоль/г сухой массы) и Спм (в 1,5 раз; 0,020 ± 0,001 нмоль/г сухой массы). Подобные изменения могут указывать на участие ПА в защитном ответе на действие пероксида водорода, которое в первую очередь начинается в листьях. В корнях же биосинтез ПА мог усиливаться для пополнения пула в листьях.

Обработка растений Спм совместно с пероксидом водорода не вызывала существенных изменений содержания и спектра ПА ни в корнях, ни в листьях. Это может быть связано с прямым участием поступающего в растения Спм с детоксикацией пероксида водорода.

6. Функционирование ПАО в растениях Th. salsuginea

Рассматривая влияние ПА на окислительно-восстановительный статус клетки, представляют интерес реакции катаболизма ПА, которые контролируются ПАО или ДАО.. В процессе катаболизма ПА образуется пероксид водорода, который выступает не только в качестве сигнальной молекулы, но и является одной из АФК, повышение концентрации которой может нарушать равновесие между компонентами АОС.

Для растения Arabidopsis thaliana известно 5 генов, кодирующих ПАО: AtPAOl, AtPA02, AtPA03, AtPA04, AtPA05 (Tavladoraki et al., 2006; Alcazar at al., 2006, 2008; Kamada-Nobusada et al., 2008; Moschou et al., 2008). Ген А1РАОЗ был идентифицирован как осуществляющий ПАОЗ-зависимое обратное превращение Спм в Спд и Спд в Пут (Moschou et al., 2008). Мы обнаружили присутствие РАО4 и РА05 в геноме Th. salsuginea, однако действие пероксида водорода и Спм не индуцировали экспрессию этих генов на уровне мРНК. Возможно, данные гены являются для растения Th. salsuginea молчащими или малокопийными.

1 -i

500 мкМ Н2О2

Рисунок 11 - Активность ПАО в растениях Тк salsuginea. 1 - корни, 2 -листья.

Обработка растений 1 мМ и 2 мМ Спм сопровождалась увеличением активности ПАО в корнях (в 1,8 и 2,7 раз соответственно) (рис. 11). В этих

условиях наблюдалось увеличение уровня мРНК РАО/, РА02, РАОЗ, причём использование 2 мМ Спм приводило к более существенным изменениям (рис. 12а). При этом в листьях наблюдалось незначительное снижение активности ПАО на фоне отсутствия изменений экспрессии генов, кодирующих изоформы данного фермента (рис. 11 и 126). Полученные данные изменений активности ПАО согласуются с данными по содержанию и спектру ПА и подтверждают её участие в строгой регуляции пула ПА.

Сопоставление содержания ПА и активности ПАО при действии пероксида водорода также показало увеличение активности ПАО в корнях почти в два раза, при снижении пула ПА и снижение активности ПАО в листьях (рис. 11). Важно отметить, что уровень мРНК генов PAOl, РА02, РАОЗ в корнях был сопоставим с данными, полученными при обработке 2 мМ Спм (рис. 12а). В листьях добавление пероксида водорода приводило только к увеличению уровня мРНК гена РАОЗ, инициирующего ПАОЗ -зависимое обратное превращение высокомолекулярных ПА (рис. 126). Можно предположить, что в листьях пероксид водорода окислял ПА и восстановление пула происходило за счёт обратной конверсии из Спм.

PAOl РАО2 РАОЗ Act2

PAOl РА02 РАОЗ A et 2

4 -I

3 1 2 1

1 ! к*

о ®

1 мМ 2 мМ ЗОрмкМ Спм Спм 11-СЪ

к 1 мМ 2 мМ 500мкМ Спм Спм Н:Оз

Рисунок 12 — Уровень мРНК генов, кодирующих изоформы ПАО в

растениях 77г. ьакщ'теа. 1 - 1мМ Спм, 2 - 2мМ Спм, 3 - 500мкМ Н202; а -

корни, б - листья.

При совместной обработке пероксидом водорода и Спм в листьях активность ПАО снижалась на фоне отсутствия изменений в уровнях мРНК генов, кодирующих изоформы фермента (рис. 11 и 136). В корнях активность ПАО увеличивалась в 2 раза (рис. 11). Также происходило увеличение уровня мРНК гена РАОЗ (рис. 13а). Достоверного изменения относительного содержания мРНК генов РАО! и РА02 отмечено не было.

РЛ01 РА О 2 РАОЗ Лсг2

»4

а «м2

"I1

а2 2-1 о

РА01 РАО2 РАОЗ А&2

2 1

2 мМ Спм 500 мкМ Н202

Рисунок 13 - Уровень мРНК генов, кодирующих изоформы ПАО в растениях Тк. ¡а!хи%теа. а - корни, б - листья.

Снижение активности ПАО в листьях при совместном действии двух факторов, по-видимому, связано с отсутствием избытка ПА или их деградацией неферментативным путём. В корнях же повышение активности этого фермента можно связать с локальным повышением содержания ПА.

7. Действие ингибитора ПАО на активность ПАО и содержание свободных ПА в растениях ТА. salsuginea

Для оценки степени участия ПАО в регуляции внутриклеточного уровня ПА, мы добавили в питательную среду растений ингибитор активности ПАО - НЕН. Обработка 1 мМ и 2 мМ НЕН вызывала ингибирование общей активности ПАО в корнях и листьях примерно на 50% по сравнению с

контролем. Спм, добавленный совместно с НЕН, не вызывал увеличения активности ПАО (рис. 14).

При обработке 1 мМ НЕН наблюдалось некоторое снижение общего пула Г1А в корнях за счет уменьшения количества Пут (0,093 ± 0,007 нмоль/г сухого веса). 2 мМ НЕН не оказывая существенного влияния на количественное содержание и спектр ПА в корнях, В листьях действие 1 мМ и 2 мМ НЕН оказывало сходное с действием 2 мМ Спм влияние: общее содержание ПА снижалось в основном за счет уменьшения количества Пут (0,080 ± 0,007 нмоль/г сухого веса и 0,084 ± 0,009 нмоль/г сухого веса соответственно) и Спд (0,018 ± 0,002 нмоль/г сухого веса и 0,020 ± 0,003 нмоль/г сухого веса соответственно). Возможно, ингибирование прямого синтеза ПА из Пут играет роль альтернативного регуляториого пути для сохранения уровня пула Г1А.

Рисунок 14 - Активность ПАО в растениях 77г. salsuginea. I - корни, 2 -листья.

Спм, добавленный совместно с НЕН, практически не изменял процент ингибирования активности ПАО (рис. 14). Обработка растений 1 мМ НЕН совместно с 1 мМ Спм не вызывала значительных изменений общего содержания свободных ПА в корнях. Уровень ПА существенно не изменялся и при обработке растений 2 мМ НЕН совместно с 2 мМ Спм. Однако происходило некоторое перераспределение доли индивидуальных ПА. В листьях наблюдалось незначительное снижение содержания ПА. Таким образом, совместное действие ингибитора ПАО и Спм также демонстрирует необходимость поддержания пула ПА на определенном уровне.

Это подтверждается анализом уровня мРНК генов, кодирующих изоформы ПАО (РАО!, РА02, РАОЗ) при применении ингибитора в концентрации 1 мМ и 2 мМ, а также ингибитора совместно со Спм. В корнях

1мМ 2 мМ i мЫ 2мМ

НЕН HEII НЕН НЕН

1шМ 2 мМ

Сим Сим

при действии как ингибитора, так и ингибитора совместно со Спм отмечалось увеличение уровня мРНК гена РАОЗ в 2-2,5 раза на фоне отсутствия изменений в относительном содержании мРНК генов РА01, РА02 (рис. 15а). В листьях не происходило изменений уровней мРНК генов, кодирующих изоформы НАО, в указанных условиях (рис. 156).

(б)

РАО!

ттШВШ

Асе2

к 1

МЛ.....1.....1

К 1 2 3 4 К 12 3 4 Рисунок 15 - Уровень мРНК генов ПАО в растениях Тк хаЬщ'теа. 1 -1мМ НЕН, 2 - 2мМ НЕН, 3 - 1мМ НЕН + 1мМ Спм, 4 - 2мМ НЕН + 2мМ Спм; а — корни, б - листья.

Как следует из полученных данных, ингибитор в концентрации 1 мМ вызывал снижение пула ПА, однако одновременная обработка ИЕН и Спм не приводила к изменениям уровня ПА. Это является аргументом в пользу гипотезы о функционировании изоформы фермента, осуществляющей обратную конверсию ПА. Также на это указывает увеличение уровня мРНК гена РАОЗ в данных условиях.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Механизмы взаимной регуляции между ферментами-антиоксидантами и низкомолекулярными компонентами АОС изучаются давно, но и по сей день вопрос до конца неясен. ПА, низкомолекулярные компоненты АОС,

представляют собой органические соединения катионной природы с высокой биологической активностью. Суммарное содержание ПА и соотношение между ними зависят от вида растения, типа ткани и стадии онтогенеза (Кузнецов, 2006). Конститутивно высокий уровень в клетках растений принадлежит ПА семейства путресцина (Пут, Спд, Спм) (Tavladoraki et al., 2006; Moschou et al., 2008).

Как правило, повышение внутриклеточного уровня ПА коррелирует с устойчивостью растений ко многим типам абиотических стрессов. Однако остаётся открытым вопрос о том, какой эффект оказывают экзогенные ПА, в частности Спм, на окислительно-восстановительный статус растения. Для подтверждения участия ПА в функционировании АОС представляется целесообразным исследовать реакцию растений на действие экзогенных ПА, как в оптимальных условиях выращивания, так и при развитии окислительного стресса.

Исходя из всего вышесказанного, целью данной работы было исследование роли ПА в регуляции функционирования компонентов АОС и индукции защитного ответа растений Th. salsuginea при обработке спермином, пероксидом водорода, а также при их совместном действии.

Экзогенный Спм (1 мМ) вызывал повышение пула и изменение спектра ПА в корнях Th. salsuginea через 12 ч эксперимента. Повышение концентрации Спм (2 мМ) в питательном растворе приводило к дальнейшему увеличению содержания свободных ПА. Изменение спектра ПА можно объяснить способностью данных метаболитов к образованию конъюгированных форм. Косвенным доказательством этому может служить повышение активности некоторых форм ПО, так как существует гипотеза, что конъюгаты ПА с оксикоричными кислотами способны являться субстратом для данного фермента (Martin-Tanguy, 2001).

Изменение спектра ПА в данных условиях, а также повышение активности ПАО и увеличение уровня мРНК гена РАОЗ свидетельствует о функционирование у Th. salsuginea ПАОЗ - зависимой обратной конверсии высокомолекулярных ПА. Ранее для A. thaliana была высказана возможность существования подобной обратной конверсии Спм (Tavladoraki et al., 2006).

Обработка Спм, пероксидом водорода, а также их совместное действие вызывало увеличение активности ПАО в корнях, повышение уровня мРНК генов, кодирующих изоформы фермента. Это служит аргументом в пользу доказательства участия ПАО в индукции защитного ответа растений при действии стрессов. По-видимому, молекулы пероксида водорода, образующиеся при катаболизме ПА, играют роль сигнальных молекул в системе строго координированных защитных реакций растений.

В растениях хрустальной травки экзогенный Спм в малых

концентрациях (<1 мМ) проявлял антиоксидантные, а при высоких (>1 мМ) прооксидантные свойства, что было вызвано следствием интенсивной деградации ПА (Аронова и др., 2005). Исходя из полученных результатов, в растениях 77/. salsuginea 1 мМ и 2 мМ Спм не проявлял прооксидантных свойств.

Изменение общего пула ПА при окислительном стрессе, индуцированном пероксидом водорода, а также действие экзогенного Спм в этих условиях указывает на участие ПА в регуляции защитного ответа на действие стрессовых факторов. Можно предположить, что защитное действие Спм объясняется химическими свойствами ПА как органических катионов. Они электростатически взаимодействуют с отрицательно заряженными фосфатными группами фосфолипидов, нуклеиновых кислот и с карбоксильными группами белков, а также ковалентно связываются с полипептидными цепями на этапе посттрансляционной модификации белков (Galston et al.,1997; Waiden et al., 1997; Bouchereau et al., 1999; Kaur-Sawhney et al., 2003). Таким образом, связывание ПА с молекулами белков или нуклеиновых кислот способствует защите их от распада, кроме того, придает им наиболее эффективную в стрессовых условиях конформацию молекулы.

Спм, подобно остальным высокомолекулярным ПА, может соединяться с фосфатными группами ДНК, не затрагивая ее вторичную нативную структуру. Тем самым, по-видимому, и обеспечивается беспрепятственная транскрипция генов, кодирующих изоформы антиоксидантных ферментов, при стрессе. Геометрия расположения NH^ — групп в молекуле Спм находится в наибольшем соответствии с отрицательно заряженными группами нуклеиновых кислот (Cohen, 1990). Так, можно объяснить участие Спм в защите ДНК от воздействия эндонуклеаз.

Одним из компонентов АОС клеток растений является Про, обладающий выраженным антиоксидантным и стресс-защитным эффектом. Кроме того, Про может вступать в конкурентные отношения с ПА за единый предшественник - глутамат. Действие Спм на метаболизм Про проявляется на транскрипционном уровне, но, не всегда сопровождается изменениями на уровне конечного продукта.

Таким образом, экзогенный Спм вовлекается в регуляцию функционирования компонентов АОС, приводя к изменениям активностей, изоферментного состава и уровня мРНК генов, кодирующих изоформы антиоксидантных ферментов в растениях Th. salsuginea. Регуляторная роль Спм в функционировании компонентов АОС при стрессе может быть реализована через регуляцию общей активности ПАО и её изозимов. ПАО обеспечивает внутриклеточный баланс ПА и запускает реакции генерации молекул пероксида водорода, выполняющего сигнальные функции.

выводы

1. В оптимальных условиях выращивания растений Th. salsuginea экзогенный спермин (1-2 мМ) проявлял антиоксидантные свойства, что способствовало поддержанию редокс-баланса в клетках растений. В пользу данного положения свидетельствуют изменения общей активности и изоферментного состава супероксиддисмутазы, аскорбатпероксидазы и гваяколовых пероксидаз, увеличение в 2-3 раза уровней мРНК кодирующих их генов.

2. При окислительном стрессе, индуцированном пероксидом водорода, экзогенный спермин вовлекался в детоксикацию активных форм кислорода путем стимуляции активности и повышения уровней мРНК генов, кодирующих изозимы ключевых антиоксидантных ферментов. Также экзогенный спермин вызывал повышение содержания полиаминов и пролина - низкомолекулярных компонентов антиоксидантной системы, участвующих в индукции защитного ответа растений.

3. Подтверждена гипотеза о вовлечении спермина в регуляцию метаболизма пролина, обладающего антиоксидантными свойствами. Экзогенный спермин влиял на экспрессию генов биосинтеза и деградации пролина, что проявлялось в 2-х кратном повышении уровней мРНК генов, кодирующих ключевые ферменты его метаболизма и увеличении содержания пролина в корневой системе растений.

4. Регуляторная роль спермина в функционировании компонентов антиоксидантной системы при стрессе может быть реализована через регуляцию общей активности полиаминоксидазьг и активностей ее различных изозимов, поскольку полиаминоксидаза обеспечивает внутриклеточный баланс полиаминов и запускает реакции генерации молекул пероксида водорода, выполняющего сигнальные функции.

5. Результаты опытов с использованием ингибитора активности полиаминоксидазы ф - hydroxyethyl hydrazine) свидетельствуют о ключевой роли данного фермента в поддержании постоянного содержания полиаминов, обладающих антиоксидантным и регуляторпым действием, что проявляется в изменении спектра полиаминов при сохранении их общего содержания.

6. Подтверждена гипотеза о функционировании в растениях ПАОЗ-зависимой обратной конверсии высокомолекулярных полиаминов и продемонстрировано, что активность ПАОЗ регулируется экзогенным спермином. В пользу этой точки зрения свидетельствуют данные об изменении спектра полиаминов, повышении активности полиаминоксидазы и увеличении уровня мРНК гена РАОЗ на фоне действия экзогенного спермина.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Сошинкова Т.Н., Королькова Д.В. (2011) Влияние пролина на антиоксидантный статус суспензионной культуры Thellungiella salsuginea. В сб.: Пущинская jмеждународная школа-конференция молодых ученых, Пущино, с. 412.

2. Сошинкова Т.Н., Королькова Д.В., Радюкина Н.Л., Носов А.В., Кузнецов Вл.В. (2011) Действие низкомолекулярных антиоксидантов на защитную систему суспензионной культуры клеток Thellungiella salsuginea в условиях окислительного стресса. В сб.: VII Съезд Общества физиологов растений России «Физиология растений — фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий». Материалы докладов Часть II., Нижний Новгород, с. 659.

3. Сошинкова Т.Н., Королькова Д.В., Радюкина НЛ. (2011) Экзогенный нролин участвует в защите растений Thellungiella salsuginea от окислительного стресса. В сб.: Международная конференция молодых учёных «Леса Евразии» (тезисы докладов), Брянск, с. 269-270.

4. Королькова Д.В., Сошинкова Т.Н. (2012) Влияние полиаминов на компоненты антиоксидантной системы растений Thellungiella salsuginea. В сб.: XIX Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2012». Москва, с. 237.

5. Королькова Д.В., Сопшнкова Т.Н. (2012) Влияние экзогенных полиаминов путресцинового ряда на метаболизм пролина в растениях Thellungiella salsuginea. В сб.: Пущинская международная школа-конференция молодых ученых, Пущино, с. 469.

6. Королькова Д.В., Сошинкова Т.Н. (2012) Влияние экзогенных полиаминов на антиоксидантный статус Thellungiella salsuginea. В сб.: II (X) Международная Ботаническая Конференции молодых ученых, Санкт-Петербург, с. 64-65.

7. Сошинкова Т.Н., Королькова Д.В. (2012) Индукция защитных систем Thellungiella salsuginea при окислительном стрессе. В сб.: II (X) Международная Ботаническая Конференции молодых ученых, Санкт-Петербург, с. 71.

8. Сошинкова Т.Н., Радюкина Н.Л., Королькова Д.В., Носов А.В. (2013) Пролин и функционирование антиоксидантной системы растений и культивируемых клеток Thellungiella salsuginea при окислительном стрессе. Физиология растений, 60,47-60.

9. Королькова Д.В., Сошинкова Т.Н. (2013) The effect of exogenous spermine on the functioning of antioxidant enzymes and proline metabolism in

Thellungiella заЬгфпеа. В сб.: XX Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2013». Москва, с. 297.

10. Королькова Д.В., Сошинкова Т.Н., Радюкина Н.Л. (2013) Влияние спермина на функционирование антиоксидантной системы TheIhlng¡ella sa¡suginea. В сб.: Пущинская международная школа-конференция молодых ученых, Пущино, с.274-275.

11. Сошинкова Т.Н., Королькова Д.В., Радюкина Н.Л., Кузнецов Вл.В. (2013) Влияние пероксида водорода на функционирование антиоксидантной системы растений ТИеИи^геПа salsuginea В сб.: Годичное собрание общества физиологов растений России «Инновационные направления современной физиологии растений», с. 340.

12. Королькова Д.В., Радюкина НЛ., Сошинкова Т.Н., Мапелли С., Кузнецов Вл.В. (2014) Влияние экзогенного спермина на функционирование антиоксидантной системы растений ТЪе11ипфе11а йакщ1пеа. Физиология растений, 61, 69-76.

Подписано в печать: 21.11.2013

Заказ № 9183 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Королькова, Диана Валерьевна, Москва

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИЙ ИМ. К.А. ТИМИРЯЗЕВА

_РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК_

На правах рукописи

04201450969

Королькова Диана Валерьевна

ВЛИЯНИЕ СПЕРМИНА НА ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ АНТИОКСИДАНТНОЙ СИСТЕМЫ РАСТЕНИЙ THELL UNGIELLA

SALSUGINEA

Специальность 03.01.05 - «физиология и биохимия растений»

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Научный руководитель - кандидат биологических наук,

Радгокина Н.Л.

Москва-2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ...................................................................................................................с. 6

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.............................................................................с. 11

1.1.Окислительный стресс..........................................................................................с. 11

1.2. Антиоксидантная защитная система..................................................................с. 13

1.3.Полиамины. Структура, химические свойства, локализация...........................с. 17

1.4.Транспорт полиаминов.........................................................................................с. 20

1.5.Метаболизм полиаминов.....................................................................................с. 22

1.5.1. Биосинтез полиаминов....................................................................................с. 22

1.5.2. Молекулярные механизмы биосинтеза полиаминов....................................с. 26

1.5.3. Катаболизм полиаминов.................................................................................с. 28

1.5.4. ПАОЗ - зависимая обратная конверсия полиаминов ..................................с. 33

1.6.Полиамины при стрессе: биологическая роль...................................................с. 34

1.6.1. Применение ингибиторов для изучения роли полиаминов.........................с. 34

1.6.2. Роль полиаминов в растении...........................................................................с. 35

ГЛАВА II. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ........................................с. 40

2.1. Объект исследования...........................................................................................с. 40

2.2. Условия выращивания растений........................................................................с. 41

2.3. Условия проведения опытов ..............................................................................с. 42

2.4. Определение содержания малонового диальдегида........................................с. 42

2.5. Определение активности супероксиддисмутазы .............................................с. 43

2.6. Определение активности аскорбатпероксидазы ..............................................с. 44

2.7. Определение активности полиаминоксидазы ..................................................с. 45

2.8. Определение активности пероксидазы .............................................................с. 46

2.9. Определение активности каталазы....................................................................с. 47

2.10. Определение содержания внутриклеточного пролина..................................с. 49

2.11. Определение активности пролиндегидрогеназы............................................с. 50

2.12. Определение содержания белка в ферментных препаратах .........................с. 51

2.13. Методика нативного гель-электрофореза СОД и АПО..................................с. 52

2.14. Определение уровня транскрипции генов ......................................................с. 55

2.15. Определение содержания свободных полиаминов.........................................с. 60

2.16.Математическая обработка данных..................................................................с. 61

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ......................................................с. 62

3.1. Влияние спермина на содержание МДА и активность ферментов-антиоксидантов в растениях Тк. заки&пеа..............................................................с. 62

3.2. Влияние спермина на активность и изоферментный состав АПО в растениях Тк. за15щ1пеа..............................................................................................................с. 66

3.3. Вляние совместной обработки спермином и пероксидом водорода на содержание МДА и активность ферментов-антиоксидантов в растениях Тк. ясАви^пеа.....................................................................................................................с. 68

3.4. Влияние спермина и совместное действие спермина и пероксида водорода на метаболизм пролина в растениях Тк. заЬщтеа .....................................................с. 73

3.5. Содержание и спектр свободных полиаминов при обработке спермином и пероксидом водорода в растениях Тк. salsuginea ...................................................с. 76

3.6. Функционирование ПАО в растениях Тк. заки&пеа ......................................с. 79

3.7. Действие ингибитора ПАО на активность ПАО и содержание ПА в растениях Тк. salsuginea...............................................................................................................с. 82

ЗАКЛЮЧЕНИЕ...........................................................................................................с. 86

ВЫВОДЫ ....................................................................................................................с. 89

Список цитируемой литературы...............................................................................с. 91

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АФК активные формы кислорода

ПА полиамины

Пут путресцин

Спд спермидин

Спм спермин

Кад кадаверин

ПАО полиаминоксидаза

ДАО диаминоксидаза

НЕН fi - hydroxyethyl hydrazine, ингибитор активности ПАО

АОС антиоксидантная система

АПО аскорбатпероксидаза

ОС окислительный стресс

СОД супероксиддисмутаза

Cu/Zn - СОД изоформа СОД, содержащая медь и цинк как кофакторы

Fe - СОД изоформа СОД, содержащая железо как кофактор

Мп СОД изоформа СОД, содержащая марганец как кофактор

ПО гваяколовая пероксидаза

КАТ катал аза

МДА малоновый диальдегид

ПОЛ перекисное окисление липидов мембран

Про пролин

ПДГ пролиндегидрогеназа

АБК абсцизовая кислота

SAM 8-аденозил-Ь-метионин

SAMDK S-аденозилметиониндекарбоксилаза

СПМС сперминсинтаза

СПДС спермидинсинтаза

ОДК орнитиндекарбоксилаза

АДК аргининдекарбоксилаза

ЛДК лизиндекарбоксилаза

ПВП поливинилпирролидон

DIT дитиотриитол

NBT нитросиний тетразолий

TEMED тетраметилэтилендиамин

ВВЕДЕНИЕ

Жизнь растений — это чётко организованная, генетически запрограммированная и регулируемая система взаимосвязанных превращений органических веществ и связанной в них потенциальной энергии (Ничипорович, 1972). Вместе с тем, в природных условиях растения постоянно подвергаются действию неблагоприятных факторов окружающей среды, что приводит к нарушению равновесия между различными метаболическими реакциями, протекающими в клетке.

клетках растений влияет на функционирование и взаиморегуляцию компонентов АОС в оптимальных условиях выращивания, а также при действии стрессоров.

Внутриклеточный уровень веществ определяется соотношением скоростей синтеза и распада. Рассматривая влияние ПА на окислительно-восстановительный статус клетки, необходимо, прежде всего, обращать внимание на реакции катаболизма ПА, которые контролируются полиаминоксидазой (ПАО) или диаминоксидазой (ДАО) (Аронова и др., 2005). Существуют разрозненные данные о том, что ПАО, регулируя внутриклеточный уровень ПА, может вовлекаться в повышение устойчивости растений к неблагоприятным факторам (Sebela et al., 2001; Cona et al., 2006). Имеются предположения, что, образующийся при катаболизме ПА, пероксид водорода участвует в индукции АОС, что, возможно, является основой защитного действия ПА в клетках растений (Yoda et al., 2003; Aleasar et al., 2011). Исследования по данному вопросу единичны и до сих пор неясно вовлекается ли ПАО в индукцию защитного ответа растения на стрессы.

Задачи исследования:

1. Изучить влияние спермина на функционирование компонентов антиоксидантной защитной системы растений Th. salsuginea в оптимальных

условиях выращивания, а также при действии окислительного стресса, индуцированного пероксидом водорода.

2. Исследовать функционирование компонентов антиоксидантной защитной системы растений Тк. йакщтеа при совместном действии спермина и пероксида водорода.

3. Исследовать функционирование полиаминоксидазы и роль фермента в регуляции внутриклеточного пула полиаминов в растениях Тк. яаЬщтеа в условиях обработки растений спермином, пероксидом водорода и при их совместном действии.

4. Провести сравнительный анализ уровней мРНК генов, кодирующих изоформы полиаминоксидазы, в растениях Тк. Бакщтеа в условиях обработки растений спермином, пероксидом водорода и при их совместном действии.

5. Изучить влияние спермина на изоферментный состав ключевых антиоксидантных ферментов (супероксиддисмутаза, аскорбатпероксидаза) и уровни мРНК генов, кодирующих изоформы данных ферментов, в растениях Тк. яаЬщтеа при обработке экзогенным спермином, пероксидом водорода и при их совместном воздействии.

6. Изучить влияние спермина на метаболизм пролина и уровни мРНК генов, кодирующих ключевые ферменты синтеза и катаболизма пролина, у растений Тк. яаЬг^пеа при обработке экзогенным спермином, пероксидом водорода и их совместном действии.

Научная новизна. Впервые показано, что экзогенный спермин в растениях Тк. яаЬщтеа активирует супероксиддисмутазу и аскорбатпероксидазу как в оптимальных условиях выращивания, так и при действии окислительного стресса, индуцированного пероксидом водорода. В оптимальных условиях спермин вызывал изменения в изоферментном составе и уровнях мРНК генов, кодирующих изоферменты супероксиддисмутазы и аскорбатпероксидазы. Впервые показано существование ПАОЗ-зависимой обратной конверсии

высокомолекулярных полиаминов в растениях 77/. заЬщтеа. Экзогенный спермин приводил к изменению уровня мРНК генов, кодирующих изоформы полиаминоксидазы как в оптимальных условиях выращивания, так и при действии окислительного стресса. Подтверждена гипотеза о взаимосвязи биосинтеза пролина и полиаминов. Спермин вовлекается в регуляцию метаболизма пролина, вызывая изменения в содержании свободного пролина в растениях, а также повышение уровней мРНК генов, кодирующих ключевые ферменты метаболизма пролина.

Практическая значимость. Полученные данные по влиянию спермина на функционирование антиоксидантной ' системы 77г. заЬи^тга имеют существенное значение для понимания роли полиаминов в индукции защитного ответа растений. Результаты исследования расширяют представления о механизмах, лежащих в основе координированной взаиморегуляции компонентов защитной системы растительного организма. Полученные данные могут быть использованы в технологиях создания трансгенных растений, обладающих повышенной устойчивостью к стрессам различной природы. Возможно использование результатов настоящего исследования в практике растениеводства. Вся совокупность теоретических обобщений и экспериментальных данных этой работы может быть рекомендована для разработок курсов лекций для студентов биологических факультетов ВУЗов.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на 16-ой Пущинской международной школе-конференции молодых ученых «Биология -наука XXI века» (Пущино, 2012); XIX Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2012» (Москва, 2012); П(Х) Международной Ботанической Конференции молодых ученых (Санкт-Петербург, 2012); на семинаре молодых ученых в Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева (Москва, 2012); XX Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2013»

(Москва, 2013); 17-ой Пущинской международной школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2013).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе 2 статьи в рецензируемых журналах.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Окислительный стресс

В природных условиях растения постоянно или периодически испытывают на себе действие разнообразных неблагоприятных факторов внешней среды, в том числе и абиотических (засуха, засоление, гипотермия и гипертермия и др.). Установлено, что усиление генерации АФК является общим признаком действия стресс-факторов и приводит к развитию ОС (Mittler, 2002; Foyer, Noctor, 2005). ОС возникает и развивается в результате сверхпродукции АФК и/или снижения эффективности АОС (Dat et al., 2000; Foyer, Noctor, 2005).

АФК представляют собой высокореакционные соединения, образующиеся в результате неполного восстановления кислорода: супероксид анион радикал (Ог"), синглетный кислород ('02), пероксид водорода (Н2О2), гидроксилрадикал (НО') (Foyer, Noctor, 2000; Halliwell, 2006; Jithesh et al, 2006). В клетках растений непрерывно происходит образование АФК в результате контакта кислорода с восстановленными компонентами электрон-транспортных цепей фотосинтеза и дыхания (Apel, Hirt, 2004). Основными источниками внутриклеточных АФК являются хлоропласта, митохондрии, пероксисомы (Jithesh et al., 2006). Кроме того, образование АФК может быть связано с работой липоксигеназы, пероксидазы, НАДФН - оксидазы, ксантиноксидазы (Blokhina et al., 2003; Mittova et al., 2003).

Взаимодействие активных радикалов с белками, липидами, нуклеиновыми кислотами приводит к нарушению структуры и функции мембран, ферментов и, в итоге, к остановке клеточного цикла и даже смерти (Bieza et al., 2001). О2", !Ог, НО вступают в реакции с остатками жирных кислот фосфолипидов, вызывая перекисное окисление липидов (ПОЛ). В результате происходит нарушение гидрофобности и проницаемости липидного бислоя, что, в свою очередь, негативно сказывается на функционировании всех ферментных систем, ассоциированных с мембраной. Реагируя с окружающими молекулами и

структурами, АФК могут вызвать повреждения в ДНК, а также нарушить структурную целостность компартментов и клетки в целом (Shen et al., 1997; Blokhina et al, 2003; Шевякова и др., 2009).

Показано, что все виды АФК способны инактивировать белки-ферменты, белки-каналы и белки-транспортеры (Dat et al., 2000; Не, Hader, 2002; Heck et al., 2003; Полесская, 2007). Супероксидрадикал и пероксид водорода вступают в реакции с ионами железа, приводя к образованию гидроксилрадикала, способного к окислению многих соединений в клетке (Dat et al., 2000; Mittler, 2002). Причём, клетки растений и животных не обладают ферментными системами, которые могли бы нейтрализовать гидроксилрадикал (Rio et al., 1998; Полесская, 2007).

Следует отметить, что АФК помимо деструкции биомолекул, выполняют функцию сигнальных веществ, запускающих каскады защитных реакций, блокирования клеточного цикла или апоптоза, и регуляции уровня экспрессии специфических генов ответа путем активации или инактивации транскрипционных факторов (Mackerness, 2000; Не, Häder, 2002; Frohnmeyer, Staiger, 2003; Jenkins, 2009). Известно, что АФК совместно с фитогормоном абсцизовой кислотой (АБК) участвует в регуляции процессов открывания/закрывания устьиц. Показано, что обработка проростков кукурузы пероксидом водорода приводила к увеличению активности СОД, АПО, глутатионредуктазы и альтернативной оксидазы, что, по-видимому, связано с индукцией синтеза этих ферментов (Prasad et al., 1996). Пероксид водорода, посредством активации входных кальциевых каналов, участвует в гиперполяризации мембраны (Jithesh et al., 2006). Есть предположения, что АФК являются одними из компонентов, участвующих в трансдукции УФ сигнала (Mackerness, 2000; Jenkins, 2009). Конститутивный уровень АФК также необходим растительному организму и для процессов старения и программируемой гибели клеток.

Для ликвидации последствий действия АФК в клетке растений веками происходило формирование АОС. Функционирование этой системы для поддержания баланса А�

Информация о работе

Королькова, Диана Валерьевна
кандидата биологических наук
Москва, 2013
ВАК 03.01.05

Диссертация

Влияние спермина на функционирование антиоксидантной системы растений Thellungiella salsuginea - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы