МикроРНК опосредованная регуляция экспрессии генов Cu/Zn-СОД в растении Thellungiella salsuginea при стрессе

Пашковский, Павел Павлович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
МикроРНК опосредованная регуляция экспрессии генов Cu/Zn-СОД в растении Thellungiella salsuginea при стрессе
ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "МикроРНК опосредованная регуляция экспрессии генов Cu/Zn-СОД в растении Thellungiella salsuginea при стрессе"

На правах рукописи

Пашковский Павел Павлович

МикроРНК опосредованная регуляция экспрессии генов Си^п-СОД в растении ТкеИип&еИа salsuginea при стрессе

03.01.05 - физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 ИЮН 2011

Москва-2011

4848772

Работа выполнена в лаборатории физиологических и молекулярных механизмов адаптации Учреждения Российской академии наук Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, Москва.

Научный руководитель:

кандидат биологических наук

Радюкина Наталия Львовна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук

Новикова Галина Викторовна

доктор биологических наук, профессор

Тараканов Иван Германович

Ведущая организация: Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет.

Защита состоится «21» июня 2011 г. в 13 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 002.210.01 при Учреждении Российской академии наук Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН по адресу: 127276, Москва, ул. Ботаническая, 35.

Факс: (499) 977 8018, электронная почта: m-azarkovich@ippras.ru; ifr@ippras.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН.

Автореферат разослан «19» мая 2011 г.

Ученый секретарь совета по защите докторских и кандидатских диссертаций,

кандидат биологических паук

М.И. Азаркович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Изучение устойчивости растений к действию неблагоприятных факторов внешней среды остается одним из центральных направлений физиологии растений. На сегодняшний день, очевидно, что существует сеть метаболических реакций, формирующих способность растений адаптироваться к изменяющимся условиям. Однако наименее изученным аспектом в проблеме устойчивости остается вопрос о регуляторных механизмах, позволяющих координировать функционирование всего комплекса реакций защитного ответа. Регуляция стрессорного ответа может осуществляться на генном, транскрипционном, посттранскрипционном, трансляционном и посттрансляционном уровнях организации. Одним из важных элементов посттранскрипционной регуляции активности генов является механизм умолкания генов, обусловленный РНК-интерференцией (РНКи). Обнаружение феномена РНКи в опытах на нематоде в 1998 году позволило выявить новый пласт регуляторных процессов, которые вовлечены в регуляцию экспрессии генов у большинства эукариот. В настоящее время механизм РНКи стал важным инструментом функциональной гено-мики, позволяющий специфически регулировать активность генов. В последнее время стало ясным, что в основе механизмов РНКи лежат процессы умолкания генов, который обусловлен экспрессией малых РНК.

В растениях Arabidopsis thaliana L. было обнаружено два основных класса малых РНК размером 21-23 нк., участвующих в подавлении экспрессии генов: siPHK (small interfering РНК) (Baulcombe, 1999) и миРНК (micro РНК) (Bartel, 2001). Роль siPHK заключается в защите клетки от вызванной РНК-вирусами инфекции, в то время как миРНК закодированы в геноме многоклеточных организмов в виде шпилечного предшественника (пре-миРНК) и регулируют активность генов в цитоплазме и ядре (Bartel, 2004).

Недавние исследования показали, что миРНК способны регулировать комплекс биологических процессов в растениях такие как гормональный контроль, иммунный ответ, полярный рост и адаптация к неблагоприятным условиям (Voinnet, 2009). Все больше появляется данных о том, что в условиях стресса изменяется как экспрессия миРНК, так и экспрессия мРНК - генов мишеней, а также активность миРНК-белковых комплексов (Leung et al., 2010).

После проведения биоинформационного анализа было выдвинуто

предположение о возможной посттранскрипционной регуляции генов Cu/Zn-СОД с помощью miR398 (Bonnet, 2004; Sunkar, 2004). Изменение уровня экспрессии miR398 было отмечено у A. thaliana под действием абиотических стресс-факторов и при бактериальном поражении растений (Sunkar, 2006).

В работах Yamasaki (2007) сообщалось, что изменение содержания меди в питательной среде растений влияет на экспрессию, как минимум, двух из трех МИР генов, кодирующих miR398 (miR398 b, с), при этом также изменялся уровень мРНК генов CSD. Несмотря на это, точный молекулярный механизм данного процесса остается пока слабо изученным. К тому же остается неизвестным факт наличия miR398 опосредованной регуляции генов CSD у более устойчивых к действию абиотических стрессов растений-галофитов.

Из всего вышесказанного становится очевидным, что изучение явления РНКи открывает большие перспективы для понимания механизмов миРНК-опосредованной регуляции экспрессии генов в растениях, а также позволяет создавать трансгенные растения нового поколения, реализующие свой адаптивный потенциал для сохранения продуктивности в условиях стресса.

Цель диссертационной работы заключалась в исследовании роли микроРНК в посттранскрипционной регуляции генов Cu/Zn-СОД и гена CCS в растении Thellun-giella salsuginea (Pallas) (Th. salsuginea) при действии стрессоров различной физической природы.

Задачи исследования:

1. Исследовать экспрессию семейства генов miR398 и изучить изменение уровня экспрессии m¡R398 при действии различных видов абиотических стрессоров (засоление, UV-B, свет высокой интенсивности, различные концентрации меди в питательной среде растений).

2. Исследовать органоспецифичность экспрессии m¡R398 при стрессе.

3. Сравнить закономерности процессинга m¡R398 с экспрессией генов Cu/Zn-

сод.

4. Исследовать экспрессию генов Cu/Zn-СОД и гена CCSy растений Th. salsuginea при различном содержании меди в питательной среде в связи с изменением уровня экспрессии m¡R398.

5. Исследовать уровень экспрессии генов Argonaute (Ago), экзонуклеазы Dicer-

likel (DCL1), транскрипционного фактора Squamosa promoter binding protein-like 7 {SPL7), РНК-зависимой РНК-полимеразы 1 (RdRPl), вовлеченных в процесс образования и функционирования miR398 в условиях стресса.

Научная новизна проведенных исследований. Впервые показано, что экспрессия miR398 наблюдается у растсний-галофитов. Установлено, что у растений Th. salsuginea мишенью консервативной miR398 могут выступать мРНК цитозолыюй Cu/Zn-СОД (CSDI). Другой из возможных мишеней miR398 может быть мРНК шапе-рона меди CCS1, доставляющего ионы меди к апобелкам Cu/Zn-СОД в различные компартменты клетки.

Впервые показано, что экспрессия miR398 осуществляется не только в надземной части растений, по и в корнях взрослых растений Th. salsuginea, что свидетельствует об отсутствии органоспецифичности. Показано, что у растений Th. salsuginea экспрессия miR398 зависит от концентрации меди в питательной среде, и в условиях сё отсутствия значительно увеличивается, вызывая умолкание гена CSD1, а также гена CCS1. Это подтверждает важную биологическую роль miR398 опосредованной регуляции экспрессии генов при стрессе у растений Th. salsuginea, а также указывает на возможность существования в растительных клетках множества мишеней для уже открытых в настоящее время микроРНК.

Практическая ценность. Полученные в результате проведенных исследований данные расширяют представления о регуляторных механизмах функционирования защитного ответа растений на повреждающие воздействия стрессоров. Исследованное в ходе работы явление миРНК опосредованной регуляции генов антиоксидантных ферментов, указывает на наличие гюсттранскрипционных превращений мРНК на пути созревания соответствующих белков у растений Th. salsuginea. Возможно также, что этот механизм принимает участие в сигнальном каскаде в растениях, находящихся в условиях стресса, или при изменении концентрации эссенциальных элементов в питательной среде. Полученные данные могут быть использованы для разработки стратегии создания трансгенных растений, реализующих свой потенциал для сохранения высокой продуктивности в условиях стресса. Все полученные материалы могут быть включены в курс лекций для студентов биологических ВУЗов. Апробация результатов работы. Данные, представленные в работе, докладывались на конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (г. Пущино, Россия,

2009, 2010,2011), XVll Congress of the Federation of European Societies of Plant Biology (г. Валенсия, Испания, 2010), а также на Годичном собрании ОФР (г. Апатиты, Мурманская область, 2009).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ, из которых 4 в журналах, рекомендуемых ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка использованной литературы и приложения. Диссертационная работа изложена на 115 страницах машинописного текста, содержит 2 таблицы, 2 схемы и 15 рисунков. Список цитируемой литературы составляет 153 наименования, из которых 142 на иностранном языке.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследования.

Объектом исследований являлись растения Thellungiella salsuginea (Pallas) (Th. salsuginea), выращенные в водной культуре на среде Джонсона, модифицированной по Винтер, в камере фитотрона при температуре 23 ± 1°С днем и 16 ± 1°С ночью. При достижении растениями возраста 6 недель (стадия розетки) их разделяли на четыре группы и подвергали обработке: NaCl (100 мМ и 300 мМ), CuS04 (0; 1 и 100 мкМ), облучению UV-B в камере с УФ лампами (280-315 нм, 3.94-4.43 эВ, "Philips", Голландия) в течение 10 и 20 минут (12,3 и 24,6 кДж/м2 соответственно) или светом высокой интенсивности (20 мин, ДНАТ ФАР 54,1 Вт/м2, 650-750 им., "Reflux 250", Россия). Питательный раствор, не содержащий ионов меди, готовили в кюветах, обработанных ЮОмМ ЭДТА с применением деионизированной воды. Корни растений перед перенесением на среду без меди промывались 10 мМ ЭДТА. Пробы листьев и корней отбирали сразу после начала эксперимента и через 24 ч, полученные образцы хранили при -70°С. Эксперименты проводили в трех биологических и трех аналитических повтор-ностях. В исследованиях для сравнительной оценки изучаемых параметров был использован контрастный по устойчивости вид - Arabidopsis thaliana L. Dijon.

Методы исследования. Выделение тотальной РНК осуществляли с реактивом TRIZOL™ (Invitrogen, США). После гомогенизации проводили экстракцию фенол-

хлороформной смссыо (рН=4,3), образцы инкубировали 10 минут на льду, центрифугировали 15 мин 8000 g (+4°С). РНК осаждали ЗМ CH3COONa (рН=5,5) и абсолютным этанолом в течение 12 ч при -70°С, с последующим центрифугированием 30 мин при 10000 g (+4°С). Осадок промывали абсолютным этанолом, центрифугировали 15 мин при 10000 g (+4°С) и подсушивали при 42"С. Осадок растворяли в 20-30 мкл RNA Loading Dye Solution (Fermentas, Канада) и определяли концентрацию РНК. Для Нозерн-блот гибридизации проводили гель-электрофорез 30 мкг тотальной РНК в 20% ПААГ (процентное отношение массы бисакриламида к общей массе обоих мономеров составляло 5%) в присутствии 7М мочевины, затем блот-псреное на мембрану Hybond-N+ (Amersham, США) с последующим ее инкубированием под UV-B в следующей последовательности: 50 сек. 360 нм, 10 сек. 240 нм. Мембрану гибридизо-вали в течение 12 ч с антиемысловым ДНК-олигонуклеотидом к miR398, меченным у-32Р по 5'-концу. Мембрану анализировали с помощью сканера Typhoon™ 9410 (GE Healthcare, США). Для контроля загрузки полученный фильтр после сканирования отмывали и вновь гибридизовали с антиемысловым радиоактивно меченым ДНК оли-гонуклеотидом, комплементарным малой ядерной РНК U6. Полученные результаты обрабатывались как отношение свечения образцов миРНК к свечению контроля загрузки U6 и выражались в процентах от контрольных значений.

Оценку содержания белка CSD1 и CCS1 проводили с помощью всстсрн-блот анализа. Белки экстрагировали буфером: 50 мМ Tris-HCl (рН=8); глицерин 10%; SDS 5%; ß-меркаптоэтапол 5%; ЭДТА 25 мМ; коктейль ингибиторов протеаз (Fermentas, Канада) 0,1%; PMSF 1мМ. Определение концентрации белков проводили по Smith (1985) с бицинхониновой кислотой (Acros, США). Концентрацию белка рассчитывали по калибровочной кривой, построенной с использованием растворов БСА с известной концентрацией.

Электрофорез белковой фракции в денатурирующих условиях проводили в 15% полиакриламидпом геле по стандартной методике Laemmli (1970) па приборе Bio-Rad «Miniprotean 3» (США). Процентное отношение массы бисакриламида к общей массе обоих мономеров составляло 0,25%.

Вестерн-блотинг проводили по методу Tobin (1979). Электро-блотинг осуществляли в течение 2 ч (1В/1см2). После стандартной процедуры подготовки (Маниатис и др., 1984) мембрану инкубировали с первичными поликлональными антителами на

Cu/Zn-СОД CSD1 и шаперона меди для СОД CCS1 в течение 12 ч при +4°С. После отмывки мембраны проводили реакцию с вторичными антителами, конъюгирован-ными с флуоресцентным соединением Dy-Light 488 (Agrisera, Швеция) в течение 1 ч, затем мембрану отмывали и сканировали на Typhoon™ 9410 (GE Healthcare, США).

Синтез кДНК осуществляли с помощью M-MLV Reverse Transcriptase Kit (Permentas, Канада) и праймером oligo(dT)2]. Далее проводили ПЦР с ген-специфичными праймерами, подобранными с использованием нуклеотидных последовательностей генов баз данных NCBI (National center of bioinformatics, США, www.ncbi.nlrn.nih.gov) в среде программы Vector NT1 Suite 9 (lnvitrogen, США). Количественную оценку ампликонов проводили на сканере Typhoon™ 9410 (GE Healthcare, США). Результаты экспериментов подвергали математической обработке, средние значения и их стандартные отклонения получены в результате проведения трех независимых повторений эксперимента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Разработка методических подходов для исследования экспрессии miR398.

Для исследования экспрессии miR398 был осуществлен биоинформационный анализ последовательностей З'-НТО мРНК генов CSD растений Thellungiella и Arabi-dopsis по выявлению сайтов связывания с известными последовательностями miR398. Для этого в программной среде Vector NT1 9.0 (lnvitrogen, США) были выровнены последовательности мРНК CSD1, найденные в базе данных NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) относительно miR398, обнаруженных в базе данных малых РНК (http://www.mirbase.org) (рис. 1).

Arabidopsis thaliana (MI0001017)miR39Sa UUCCCCACUGGACUCUUGUGU-5

SUGU-5

™CUGAG3|y|cACA- 3 ZCUGAGAACACA-3 CUGAGA0CACA- 3

miR398 b/c GUCCCCACUGGACUCLfÜ Arabidopsis thaliana (NM 100757.3) AAGGGGlTOÜ TheUimgwlIa habphüa (EF405S67.1) AAGGGGUGC

Oryza sativa (L36320.1) GgGGGGliCG

З'-НТО мРНК CSD1

Рис.1 Выравнивание последовательностей З'-НТО мРНК гена CSD1 некоторых высших растений относительно друг друга и относительно miR398 а, Ь, с Arabidopsis thaliana.

На основе полученных биоинформационных и литературных данных был разработан антисмысловой ДНК олигонуклеотид, который затем испытывали в качестве зонда методом Нозсрн-блот гибридизации в системе положительных и отрицательных контролей. В качестве положительного контроля использовали искусственный олигонуклеотид (ЛиТсх, Москва), соответствующий но своей пуклеотидпой последовательности miR398, в концентрации 10 фМ. Разработанный зопд показал высокий уровень комплементарное™ к последовательности искусственного олигонуклеотида, соответствующего miR398, а также последовательностям miR398, обнаруженных в тотальной РНК Th. salsuginea. Растительные миРНК, в отличие от животных, высоко комплементарны последовательностям мРНК своих мишеней, что обуславливает строго определенное количество целевых генов, способных регулироваться одной миРНК. Однако у растений A. thaliana в последовательностях в З'-НТО области мРНК гена CCS1, шаперона меди, доставляющего медь к апобелкам Cu/Zn-СОД, были обнаружены сайты связывания с miR398, что может указывать на возможность регуляции Cu/Zn-СОД не только прямо, но и косвенно через регуляцию экспрессии CCS1 (Beauclair et al., 2010).

При проведении биоинформационного анализа мРНК CCS1 некоторых видов высших растений в З'-НТО этих мРНК, был идентифицирован возможный сайт связывания, который согласно выравненным последовательностям также может являться областью взаимодействия с miR398 (рис. 2).

Ärabidopsis thaliana (MI0001017) miR398auuccccÄCUGGACUCDUGUGü-5

miR398 b/c guccccacuggäcucüügugü-5 Ärabidopsis thaliana (NM101123.3)

Glycine max (AF329816) ä : Lycopersicon esad&ntum (AFI 17707) & ' Oryza saüva (NM001060148) t

GGG й

GGG С

Solanum tuberosum (AY196210) &PTC

■ACCaGGGAÄCÄC G АС С ï G GGAAC АС GrGACCIGGGAACAC G G 2 GAC С T G GGAAC АС GTGACC ï G GQ^C AC

-j -3 -3 -3

-3

З'-НТО мРНК CCS1

Рис.2 Выравнивание последовательностей З'-НТО мРНК гена СС57 некоторых высших растений относительно друг друга и относительно 1т^398 а, Ь, с А. ¡ИаНапа.

2. Анализ уровня экспрессии пп1*398 у различных видов растений.

Среди примерно тысячи растительных МИР генов, представленных в базе данных миРНК (http://microrna.sanger.ac.uk/sequences), 100 семейств родственных миРНК

образуют эволюционный ряд микроРНК А. ЛаИапа. Некоторые семейства миРНК консервативны у мхов и нлауновидных, что указывает на их древнее происхождение. Другие семейства миРНК развились после разделения на высшие растения и мхи, но до появления однодольных и двудольных. Семейство гшГ1398, вероятно, является одним из примеров сравнительно недавнего эволюционного приобретения высших растений (Уюппе1, 2009). Из представленных па рисунке 3 результатов Нозерп-блот гибридизации видно, что радиоактивно меченый зонд связался с тотальной РНК, выделенной из листьев и корней ТЬ. 5аЬщтеа и А. ¡каИапа. Ровная конститутивная экспрессия иб указывает на равномерность загрузки выделенной РНК представленных растений.

Н Н

О Си О £Х

Щ 3 Ц % к+

1шЯ398 Иб I

1 2 1 -Thellungiella salsuginea P.;

2- Arabidopsis thaliana L. Dijon

Рис. 3 Результат Нозерп-блот гибридизации 30 мкг тотальной РНК из листьев и корней растений с ангиемысловым зондом к последовательностям miR398A thaliana.

Нозерн-блот гибридизация с зондом, комплементарным miR398 A. thaliana, выявила у галофита Th. salsuginea малую РНК размером 21 нуклеотид (рис. 3). При проведении Нозерн-блот гибридизации во фракции тотальной РНК Th. salsuginea также была выявлена более длинная РНК, которая, по всей видимости, является предшественником, а именно пре-миРНК miR398. Длина этого фрагмента примерно на 10 нук-леотидов больше, чем длина пре-миРНК miR398 у A. thaliana (EU549620.1) (данные не приведены).

Таким образом, на основании проведенных исследований, нами было установлено, что miR398 конститутивно экспрессируется в листьях и корнях растений галофита Th. salsuginea.

3. Исследование экспрессии miR398 и CSDI при действии NaCI, света высокой интенсивности и UV-B облучения на растения Th. salsuginea.

Важная роль miR398 в регуляции гена CSD1 была показана у растений А. ihaliana, находившихся под действием абиотических стрссс-факторов (Sunkar et al., 2006). Поскольку А. Ihaliana и Th. salsuginea контрастно различаются по степени устойчивости к действию засоления, было важно исследовать изменения уровня экспрессии miR398 у галофита Th. salsuginea в условиях действия NaCI. Анализ экспрессии гена CSDI у Th. salsuginea методом ОТ-ПЦР позволил установить, что па среде с NaCI (300 мМ) уровень мРНК CSD1 увеличивается в корнях, но снижается в листьях через 24 ч после начала обработки. Как было обнаружено ранее, растения Th. salsuginea отвечают на действие NaCI (300 мМ) повышением общей активности СОД (Радюкипа и др., 2008). Как показал анализ экспрессии miR398 (Нозерп-блот) в растениях Th. salsuginea при действии 300 мМ NaCI уровень miR398 в листьях повышался через 24 ч, в то время как в корнях он снижался, (рис. 4).

3 250

И 3 о а н о

200

я §

<и

а О X

150

100

miR398

г CSDI

К 24 ч 24 ч 24 ч К 24 ч 24 ч 24 ч

NaCI Свет UV-B

листья

корни

Рис. 4 Изменение уровней экспрессии miR398 (Нозерн-блот) и мРНК CSDI (ОТ-ПЦР) в корнях и листьях растений Th. salsuginea при действии 300 мМ NaCI, 20 минут света высокой интенсивности и 20 минут UV-B через 24 часа после начала эксперимента.

Сравнение уровней п^398 и мРНК гена С501 в корнях и, особенно, в листьях, как и у А. ЛаИапа в условиях засоления, выявило обратное соотношение уровней их

экспрессии через 24 часа после обработки NaCl (рис 4.).

Галофиты, как правило, произрастают в регионах с засушливым климатом и помимо избыточного содержания солей в почве подвергаются действию комплекса ксеротермических факторов, одним из которых является солнечная радиация. Чтобы выяснить действует ли механизм миРНК опосредованной регуляции экспрессии генов CSD только при солевом стрессе, или функционирует в ответ на действие стрессоров иной природы, мы изучили экспрессию miR398 при действии света высокой интенсивности. Для облучения использовали свет в 10 раз более интенсивный по сравнению с нормальным освещением. Исследование уровня miR398 показало, что в ответ на облучение в листьях Th. salsuginea через 24 ч наблюдалось снижение экспрессии miR398 (рис. 4), в то время как в корнях - повышение. Таким образом, при облучении светом высокой интенсивности сохранялась тенденция обратной зависимости между экспрессией miR398 в корнях и листьях так же, как и при засолении. При этом уровни экспрессии miR398 и мРНК CSD! также находились в обратной зависимости. Однако изменения в экспрессии наблюдаемых генов были менее выражены, чем при действии NaCl.

UV-B облучение, подобно действию других повреждающих абиотических факторов, вызывает окислительный стресс, следствием которого является изменение активности СОД. Основываясь на проведенных в лаборатории исследованиях, мы использовали 10 и 20 минутное UV-B облучение для изучения уровней экспрессии miR398 и гена CSD1 (Радюкина и др., 2010). Полученные данные показали, что характер экспрессии гена CSD1 и miR398 в листьях и корнях Th. salsuginea при двух дозах облучения был довольно близок (данные для 10 мил облучения приведены в диссертации). Сравнение уровней экспрессии гена CSD1 и miR398 при двух дозах облучения показало дозозависимый характер: более сильное облучение соответствовало более сильному изменению экспрессии. Данные, представленные на рисунке 4, демонстрируют уровень экспрессии miR398 и CSD1 через 24 ч после облучения UV-B (20 минут) в листьях и корнях. Важно, что после действия UV-B облучения наблюдалось обратное соотношение между изменением количества miR398 в листьях и в корнях, а также сохранялась тенденция к обратному соотношению между уровнями мРНК гена CSD1 и miR398. Изменения в экспрессии исследуемых генов при действии UV-B были сопоставимы с изменением их экспрессии при действии NaCl, несмотря на кратко-

временность воздействия UV-B на листья. Причем наблюдалось изменение экспрессии изучаемых генов не только в листьях, но и в корнях. Это может быть связано с тем, что облучение UV-B влияет на экспрессию целого ряда генов специфического ответа и, возможно на экспрессию отдельных представителей семейства генов МИР 398.

4. Изучение регуляции процсссинга CSD1 и CCS1 в листьях и корнях Tit. salsuginea в условиях различных концентраций меди в питательной срсдс.

Медь является эссенциальным микроэлементом для питания растений. Среди основных белков, имеющих в составе кофактора ионы меди, можно выделить пласто-цианин (играет важную роль в передаче электронов при фотосинтезе), Cu/Zn-СОД, цитохром С (участвует в процессах дыхания в митохондриях), лакказу (семейство ок-сидаз). На долю этих белков приходится большая часть внутриклеточной меди.

В ряде работ показано, что в условиях недостатка меди отмечалось снижение содержания белка Cu/Zn-СОД и его ферментативной активности. При этом у А. thaliana наблюдалось повышение уровня мРНК гена, кодирующего другую изоформу - Fe-СОД, и ферментативной активности этого белка (Yamasaki et al., 2007). Было также показано, что у A. thaliana и некоторых других высших растений различные концентрации меди регулируют экспрессию мРНК гена CCS1, кодирующего шаперон меди, доставляющего Си к апобелкам различных изофермептов Cu/Zn-СОД (Beauclair et al., 2010). Поскольку, предыдущими экспериментами нами было показано участие miR398 в регуляции экспрессии гена CSD! у галофита Th. salsuginea в условиях действия различных абиотических стрессоров, особый интерес представляло исследование влияния различных концентраций меди в питательной среде па регуляцию экспрессии гена CSD1 с помощью miR398.

Основываясь на литературных данных и данных наших предварительных экспериментов были выбраны следующие концентрации Си: 1 мкМ и 100 мкМ. Следует отметить, что растения A. thaliana оказались более чувствительными к действию меди, чем Th. salsuginea. Медь в концентрации 100 мкМ была летальной для растений А. thaliana и приводила к гибели 95% растений на 5 сутки эксперимента. У оставшихся 5% растений под действием 100 мкМ меди наблюдалось стимулирование стадии цветения, которая наступала раньше, чем у контрольных растений. Растения Th.

.va/.^'мg^«eí^ проявляли большую устойчивость к действию высокой концентрации меди. Концентрация 100 мкМ не вызывала у этих растений никаких внешних физиологических изменений за исключением потемнения корней.

о 600

h-С

^ 400 щ

I 300 s

I 200

nnR398 mCSDl

100 I, 0

Ii i

а о и

контроль

а. §

лист кор лист а. о и лист О. О К лист R"

miR398 ъ» 4 ' ' ?

U6 «„» -а.....Ф V»-

CSD!** - т т т

Actin2 Штт 4м» *» м* тт тт —

0,25 цМ 0 цМ 1 цМ 100 цМ контроль

Рис. 5 Влияние различных концентраций CuS04 на уровень экспрессии miR398 и CSD1 в листьях и корнях растений Th. salsuginea через 24 часа.

Как показали данные Нозерн-блот гибридизации тотальной РНК Th. salsuginea, при внесении 100 мкМ CuS04b питательную среду, происходило почти полное ипги-бирование экспрессии miR398 в листьях и, особенно, в корнях. В экспериментах с отсутствием меди в питательной среде наблюдали значительное увеличение экспрессии miR398 в листья и, особенно, в корнях (рис. 5). При исследовании экспрессии гена CSDI в листьях и корнях показано, что через 24 ч отсутствия меди в питательной среде вызывало снижение экспрессии этого гена в корнях и в листьях. При концентрации меди 100 мкМ в подземной и надземной частях растений Th. salsuginea наблюдалось существенное увеличение количества мРНК гена CSD1. Однако вестерн-блот анализ со специфичными для цитозолыюй формы Cu/Zn-СОД антителами показал, что этот белок определялся только в листьях растения при всех исследованных концентрациях меди в питательной среде (рис. 6). Это может свидетельствовать о том, что синтез самого белка может осуществляться только в листьях. При высокой концентрации меди 100 мкМ в листьях наблюдалось усиление экспрессии гена CSDI, однако, повышения

содержания белка CSD1 не происходило. С другой стороны, при исследовании экспрессии гена CCS1 шаперона меди для СОД, в листьях и корнях было показано, что количество мРНК этого гена увеличивалось в листьях при концентрации CuS04 1 и 100 мкМ, в условиях же отсутствия меди экспрессия этого гена значительно снижалась в листьях и корнях. Белок CCS1 обнаруживался только в листьях у контрольных растений (0,25 мкМ C11SO4), а также при внесении 1 мкМ CuS04 в питательную среду. Важно отметить, что в условиях различной концентрации меди в питательной среде Th. salsuginea как в листьях, так и в корнях прослеживается рсципрокный характер взаимоотношений между экспрессией miR398, с одной стороны, и экспрессией гена CSD1 и гена CCS1, с другой. В связи с этим можно предположить, что в условиях различной концентрации меди в питательной среде, наблюдается посттранскрипционная miR398 опосредованная регуляция генов CSD/ и CCS1.

При исследовании в листьях и корнях Th. salsuginea экспрессии m'iR398 показано, что через 48 ч в растениях, в питательный раствор которых, был внесен CuS04 в исследуемых концентрациях, продолжалось ингибирование экспрессии miR398 на фоне увеличения содержания предшественника npe-miR398 (данные приведены в диссертации). Этот факт может указывать на ингибирование функции экзонуклеазы Dicer, которая необходима для процессирования пре-миРНК в зрелую miR398. Также, можно сделать предположение, что высокое содержание меди в питательной среде может ингибировать процессинг белка Cu/Zn-СОД за счет нарушения структуры активного центра ионами меди.

Возможно также, что увеличение miR398 обусловленной регуляции мРНК CCS1 в условиях отсутствия меди в питательной среде сокращает количество доставляемой меди к белку CSD1 и, как следствие, снижается его содержание в листьях. Вероятно, в условиях отсутствия меди в питательной среде может происходить перераспределение поступающих иопов меди между Cu/Zn-СОД и другими важными медьсодержащими белками, например, такими, как пластоцианин, играющего важную роль в фотосинтезе.

контроль

0.25 цМ ОцМ 100

t- ь (- н

u cl о о. о а, о а.

и S I В I S g S

Coomassie листья корни

miR398

CSD1 CCS1 Actin2 CSD1 'é CCS1

250 100

Нозерн-блат 70

■■■■■■ ■■ '.........

ШЁ Я1

ОТ-ПЦР

35ÄP®"

25 pip

tt ш ■

lecTepH-o.iOT 1 ^'Г* ■ ■ 11 " 10

Рис.6 Влияние различных концентраций CuS04 в питательной среде растений 77г. suginea на экспрессию miR398 (Нозерн-блот), генов CSD1, CCS1 (ОТ-ПЦР) и содержание белка CSD1 и CCS1 (вестерн-блот) через 24 часа.

5. Исследование уровня экспрессии генов, участвующих в процессиигс miR398.

У растений, в отличие от животных, белки, участвующие в процессинге мик-роРНК, представлены множественными гомологами, которые способны активироваться в ответ на действие стрессоров различной природы (Vionnet, 2009). Однако среди множества белков можно выделить несколько важнейших групп. К ним относятся белки Argonaute, которые являются обязательными элементами RISC (RNA induced silencing complex), непосредственно выполняющего ипгибирование или рестрикцию мРНК. У растений семейство белков Argonaute представлено 10 белками (Agol-10). Из проведенных нами экспериментов следует, что значительное влияние на экспрессию miR398 у растений Th. salsugenia оказывает изменение концентрации меди в питательной среде. miR398 являются, по всей видимости, важными маркерными молекулами, позволяющими растениям быстро реагировать на изменение концентрации меди в питательной среде. Поскольку в условиях отсутствия меди в питательной среде наблюдалась наибольшая экспрессия miR398, необходимо было установить, какой из генов, кодирующих белки Argonaute при этом активируется. На рисунке 7 представлен результат ОТ-ПЦР мРНК растений перенесенных на питательный раствор без меди. В течение суток, в листьях наблюдалось увеличение экспрессии мРНК генов, кодирующих белки Agol, Ago4, Ago9 и AgolO.

Важными дцРНК (двухцепочечная РНК) связывающими белками, непосрсдст-

венно участвующими в процессинге миРНК, являются белки типа Dicer (Dicer-likel). У растений это семейство представлено 4 белками (DCL1-4), но важнейшим из них в процессинге миРНК считается DCL1. Растения, мутантные по этому гену, проявляют серьезные фенотипические отклонения, а нокаут генов Dicer может приводить к пол-пому ипгибированию процессинга зрелых миРНК. В условиях недостатка меди в питательной среде происходит увеличение экспрессии гена Dicerl, что согласуется с наблюдаемым увеличением уровня miR398.

В обычных условиях после расхождения миРНК дуплекса одна из цепочек интегрируется в RISC комплекс, а другая, как правило, деградирует. В условиях стресса или недостатка определенных элементов в питательной среде, вторая часть миРНК дуплекса может выступать в качестве затравки для беспраймерного синтеза нового миРНК дуплекса. Для этого важного в большинстве эукариотических клеток процесса существуют PIIK-зависимые РНК-полимеразы (RdRPl-4). Эти белки в условиях стресса позволяют увеличивать уровень тех или иных миРНК без активации МИР генов на уровне гетерохроматина.

В условиях отсутствия меди в питательной среде у растений Th.salsuginea происходит увеличение уровня экспрессии RDR1 гена, что может указывать на беспрай-мерный синтез новых миРНК дуплексов на «отстающей» цепи миРНК дуплекса как на матрице. Это может способствовать сокращению продолжительности процессинга и тем самым ускорить ответ растений на стресс.

К 24 ч К 24 ч К 24 ч К 24 ч К 24 ч К 24 ч

Рис. 7 Изменение уровней экспрессии мРНК Agoi, Ago9, ЛgolO, ОСИ, ЯОЯ1 в листьях растений ТА ¡аЬи^пеа в условиях отсутствия меди в питательной среде через 24 часа.

Экспрессии гтК398 и мРНК генов СЖ>/ и СС81, их регуляция могут зависеть от других важных факторов, например, транскрипционных. Согласно литературным данным, у А. вгаНапа в промоторных последовательностях генов МИР 398 обнаружен

цис-элсмепт GTAC бокса, активизирующийся в условиях недостатка меди (Yamasaki et al., 2009). Более того, GTAC промоторная область генов miR398 способна связываться с SPL доменом транскрипционного фактора SPL7 (SQUAMOSA промотор-связывающийся белок-7), который способен активировать экспрессию генов МИР 398. Методом ОТ-ПЦР нами было показано увеличение экспрессии гена SPL7 в условиях отсутствия меди в питательной среде через 24 ч после начала эксперимента (рис. 8), что согласуется с увеличением уровня miR398.

1250

I200

-чО

. 150 100 50

контроль 12 ч 24 ч

н о S

сх

н а S

SPL7

лист кор лист кор лист кор

контроль 12 ч

24 ч

е?

CL, 8

Aclml ДО 4SI A №

Рис. 8 Влияние отсутствия меди в питательной среде на уровень экспрессии 5РЬ7 (ОТ-ПЦР) в листьях и корнях 77г. salsu.gi.nea в течение 24 часов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Антиоксидантные ферменты, одним из которых является Cu/Zn-СОД, играют важную роль в детоксикации АФК, интенсивная генерация которых происходит в условиях действия стрессоров различной природы. Регуляция экспрессии кодирующих эти ферменты генов может осуществляться на геномном, транскрипционном, посттранскрипционном, трансляционном и посттрансляциопном уровнях. Функционирование механизма посттранскрипционной регуляции экспрессии генов, а именно РНК-интерференции с участием миРНК, недавно было продемонстрировано у растений гликофитов при действии повреждающих факторов (NaCl, паракват, сахароза, высокие концентрации меди, железа). В частности, у А. thaliana, наблюдалось увеличение количества мРНК CSD1 и CSD2 на фоне снижения уровня miR398. Вопрос о том, функционирует ли подобный механизм miR398 зависимой регуляции экспрессии

CSD генов в растениях галофитах, обладающих высокой конститутивной устойчивостью к засолению и другим экстремальным факторам, оставался открытым.

Проведенные биоинформационные исследования позволили установить возможные сайты связывания с З'-НТО мРНК CSD] и CCS1 у растений Th. salsuginea, а также позволили разработать антисмысловой зонд. Полученный ДНК зонд, способный связываться с семейством miR398, позволил изучить их конститутивную экспрессию у растений Th. salsuginea.

В проведенных нами исследованиях было показано, что у Th. salsuginea интенсивность экспрессии miR398 изменяется не только при засолении, но и при действии света высокой интенсивности, UV-B облучения и в условиях различных концентраций меди в питательной среде (рис. 4, 5). Это указывает на стресс-зависимость такого механизма регуляции, функционирующего как в устойчивых, так и в чувствительных растениях. Уровень экспрессии miR398 у Th. salsuginea в ответ на действие стрессора носит дозозависимый характер, что особенно четко проявляется в условиях засоления, а также действия различных концентраций меди (рис. 4, 6) и, в меньшей степени, при действии света высокой интенсивности и UV-B (рис. 4). При этом наблюдалось отсутствие органоспецифичности. Можно полагать, что в основе этого явления лежит интенсивность образования АФК, генерация которых возрастает при усилении повреждающего воздействия стрессора. Нельзя исключать, что АФК, индуцирующие синтез антиоксидантных ферментов, одновременно ингибируют экспрессию miR398, что повышает эффективность функционирования клеточной антиоксидаптпой системы.

Анализ динамики уровней miR398 у растений Th. salsuginea в ответ на UV-B облучение и свет высокой интенсивности свидетельствует о том, что облучение листьев сопровождается чрезвычайно быстрым (0.5-1 ч) изменением экспрессии miR398 в корнях, которые непосредственно не подвергались стрессорному воздействию (рис. 4). Эти данные находятся в полном соответствии с ранее установленным фактом, согласно которому не только листья, но и корни вовлекаются в формирование защитного ответа па действие UV-B облучения. Результаты экспериментов позволяют высказать предположение, согласно которому экспрессия miR398 находится под контролем сигналов межорганного действия, которые инициируются в листе и передаются в корневую систему. Изучение роли miR398 в регуляции экспрессии CSD1 показало,

что у галофита Th. salsuginea, также как и у гликофита A. thaliana, существует обратная зависимость между экспрессией генов CSD] и miR398. Наиболее четко такая зависимость проявлялась при ответе растений на засоление и на различные концентрации меди, хотя подобная тенденция сохранялась и при действии UV-B облучения (рис. 4). Это свидетельствует в пользу того, что ген CSD1 может являться одной из мишеней для miR398 как при действии засоления, так и при действии тяжелых металлов, в частности меди, на растения.

Из экспериментов по влиянию различных концентраций меди в питательной среде растений Th. salsuginea следует, что изменение экспрессии miR398 может зависеть от содержания меди в клетках растений и являться своего рода маркером ее доступности из питательной среды. При внесении 1 мкМ CuS04, то есть в 4 раза более высокой концентрации, чем в контроле (0,25 мкМ), наблюдалось снижение экспрессии miR398. Снижение экспрессии miR398 приводит к ослаблению посттранскрипционной регуляции мРНК, в З'-НТО областях которых были обнаружены сайты связывания с miR398. В результате этого наблюдалось увеличение содержания белков CCS1 и CSD1. Галофит Th. salsuginea проявляет значительную устойчивость к действию тяжелых металлов. В условиях отсутствия меди у Th. salsuginea происходило увеличение уровня экспрессии двух обнаруженных генов Fe-СОД (данные приведены в диссертации). Возможно, это было частью компенсаторного механизма при снижении содержания белка Cu/Zn-СОД и его активности. Анализ экспрессии гена шаперо-на меди CCSI и содержания белка CCS1 в условиях действия различных концентраций меди позволил предположить, что miR398 способна регулировать Cu/Zn-СОД не только прямо, но и косвенно через регуляцию шапероиа меди, доставляющего медь к апобелкам СОД. Кроме того, в условиях отсутствия меди в питательной среде у Th. salsuginea наблюдается повышение уровня экспрессии гена транскрипционного фактора SQUAMOSA proteine like-7, содержащего мотив, связывающийся с промоторной областью генов, кодирующих miR398.

Таким образом, миРНК-RlSC комплексы связываются с нстранслирусмыми областями, они позволяют разобщить в пространстве и во времени синтез белка и его регуляцию. Это ускоряет реакцию растения на изменяющиеся условия внешней среды, что позволило нам составить возможную схему, описывающую механизм miR398 опосредованной регуляции Cu/Zn-СОД в условиях действия стрессоров различной

природы, а также при различных концентрациях меди в питательной среде у растений 77г. salsuginea (рис. 9).

Рис. 9 Схема возможной гшЯ398 опосредованной регуляции генов Си/2п-СОД в растении при стрессе.

ВЫВОДЫ

1. Установлены мишени действия miR398 в растении Th. salsuginea, в качестве которых выступают мРНК цитозольной Cu/Zn-СОД (CSD J) и мРНК шаперона меди CCS1, доставляющего ионы меди к апобелкам супероксиддисмутаз, имеющим цито-зольную (CSD1), хлоропластную (CSD2) и пероксисомальную (CSD3) локализацию.

2. Продемонстрировано наличие обратной связи между интенсивностью экспрессии генов CSD и CCS, с одной стороны, и уровнем miR398 в условиях стресса, с другой, что свидетельствует о функционировании механизма посттранскрипционной регуляции экспрессии генов супероксиддисмутазы и металлошаперона меди.

3. Уровень экспрессии miR398 в растении Тк salsuginea определяется доступностью меди. Снижение концентрации меди в питательной среде сопровождается стимуляцией экспрессии miR398, снижением уровня мРНК цитоплазматической СОД, а также miR398 опосредованной регуляции CCS1 и усилением экспрессии транскрипционного фактора SPL7.

4. miR398 опосредованная регуляция экспрессии гена CSDI не является орга-

носпецифичной, а экспрессия miR398 в корнях и листьях имеет обратную зависимость.

5. Совокупность полученных данных свидетельствует о наличии механизма miR398 опосредованной регуляции экспрессии стресс-зависимых генов у ГА. salsuginea в условиях действия повреждающих абиотических факторов, а также о наличии у данной микроРНК множественных генов-мишеней, что позволяет одновременно контролировать протекание различных физиологических процессов.

СПИСОК РАБОТ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Карташов A.B., Иванов Ю.В., Пашковский П.П., Радюкина Н.Л., Кузнецов Вл.В. (2007) Исследование ранней индукции защитных систем растений подорожника большого (Plantago major L.) под действием NaCl. В сб: Тезисы VI Съезда Общества физиологоврастений. Сыктывкар, с. 176 - 177.

2. Карташов A.B., Радюкина Н.Л., Пашковский П.П., Кузнецов Вл.В. (2008) Роль систем антиоксидаитной защиты при адаптации дикорастущих видов растений к солевому стрессу. Физиология растений, 55, 516 - 522.

3. Пашковский П.П., Рязанский С.С, Кузнецов Вл.В. (2009) Экспрессия малых РНК под действием абиотических факторов у растений Thellungiella halophila. В сб: ¡3-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых "Биология - наука XXI века", Пущино, с. 131 - 132.

4. Пашковский П.П., Рязанский С.С., Радюкина ПЛ., Кузнецов Вл.В. (2009) Влияние абиотических факторов на экспрессию малых РНК miR398 у растений Thellungiella halophila. В сб: Тезисы докладов Годичного собрания ОФР «Физико-химические механизмы адаптации растеиий к антропогенному загрязнению в условиях крайнего севера», Апатиты, с. 260 - 261.

5. Иванов Ю.В., Карташов A.B., Радюкина Н.Л., Пашковский П.П., Юрспков A.A. (2009) Участие пролина в защитном ответе растений на действие абиотических стрессоров. В сб: Тезисы докладов IX Международной конференции молодых учёных «Леса Евразии - Польские леса», Курник (Польша), с. 181-184.

6. Пашковский П.П., Рязанский С.С., Кузнецов Вл.В. (2010) МикроРНК опосредованная регуляция гена цитозолыюй Cu/Zn-СОД у растений Thellungiella halophila под действием абиотических стрессов. В сб: 14-я Международная

Пущииская школа-конференция молодых ученых "Биологин — наука XXI века", Пущино, с. 321 - 322.

7. Пашковский П.П.,. Рязанский С.С., Радюкнна Н.Л., Гвоздев В.А., Кузнецов Вл.В. (2010) miR398 и регуляция экспрессии гена цигоплазматической Cu/Zn-СОД в растениях Thellungiella halophila в условиях стресса. Физиология растений, 57, 707 - 714.

8. Pashkovskiy P., Ryazansky S., Kuznctsov V. (2010) Cu/Zn superoxide dismutase mRNA levels in Thellungiella halophila opposite correlate with expression of M1R398 under abiotic stresses. In: Abstr. Am. Soc. Plant Biol. Can. Soc. Plant Physiol., № P07023, p. 98.

9. Pashkovskiy P., Ryazansky S., Radyukina N., Kuznctsov V. (2010) Expression of small microRNA M1R398 under abiotic stress in Thellungiella halophila plants. In: Abstr. FESPB-2010, p. 112.

10. Пашковский П.П., Радгокина H.JI. (2010) МикроРНК и гены антиоксидантной защитной системы у растений Thellungiella halophila при стрессе. В сб: Всероссийский симпозиум "Растение и стресс", Москва, с. 269 - 270.

11. Пашковский П.П. (2011) МикроРНК опосредованная регуляция мРНК шаперона меди CCSI и Cu/Zn СОД CSD1, 2 в растениях Thellungiella salsuginea. В сб: 15-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых "Биология -наукаXXIвека". Пущино, с. 20-21.

12. Парфенов И.А., Рсвина Т.А., Пашковский П.П., Радюкнна Н.Л., Валуева Т.А. (2011) Фрагмент гена, кодирующего белок-ингибитор химотрипсина и трипсина в картофеле. Прикладная биохимия и микробиология, 47, 1 - 5.

13. Radyukina N.L., Ivanov Yu.V., Pashkovskiy P.P., Kartashov A.V., Shcvya-kova N.I., Kuznccov VI.V. (2011) Regulation of gene expression governing proline metabolism in Thellungiella salsuginea by NaCl and paraquat. Russian Journal of Plant Physiology, 58,643 - 652 .

Подписано в печать 18.05.2011 г. Печать лазерная цифровая Тираж 130 экз.

Типография Aegis-Print 115230, Москва, Варшавское шоссе, д. 42 Тел.: 8 (495) 785-00-38, 8 (926) 850-53-16 www.autoref.ae-print.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Пашковский, Павел Павлович

Глава 1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

1.1. Актуальность проблемы.

1.2. Задачи исследования.

1.3. Научная новизна проведенных исследований.

1.4. Практическая ценность.

1.5. Апробация работы.

Глава 2.

2.1. Супероксиддисмутаза как один из ключевых компонентов системы защиты клеток и тканей от окислительного стресса.

2.2. Регуляция активности СОД на различных уровнях организации.

2.3. РНК-интерференция и косупрессия.

2.4. Малые РНК растений.

2.5. б1РНК растений.

2.5.1. Механизм продукции и функции з!РНК.

2.5.2. Биологическая роль з1РНК.

2.6. МиРНК растений.

2.7. Процессинг миРНК растений.

2.8. Эволюция растительных МИР генов.

2.9. Применение РНК-интерференции.

Глава 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Объекты исследований.

3.2. Проведение молекулярных анализов.

3.2.1. Выделение тотальной РНК из растительного материала фенол-хлороформным методом для определения уровня экспрессии микроРНК

3.2.2. Нозерн-блот анализ для детекции коротких РНК с ДНК-олигонуклеотидом.

3.2.3. Очистка тотальной РНК от примесей ДНК для проведения ОТ-ПЦР.

3.2.4. Обратная транскрипция.

3.2.5. Подбор праймеров для проведения обратной полимеразной цепной реакции (ПЦР) и зондов для Нозерн-блот гибридизации.

3.2.6. Условия проведения ПЦР-анализа.

3.2.7. Подготовка проб для секвенирования нуклеотидных последовательностей генов.

3.3. Проведение вестерн-блот анализа.

3.3.1. Экстракция белков из тканей растения.

3.3.2. Проведение электрофореза в полиакриламидном геле.

3.4. Математическая обработка данных.

Глава 4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Разработка методических подходов для исследования экспрессии miR398.

4.2. Анализ уровня экспрессии семейства miR398 у 77г. salsuginea при действии NaCl, света высокой интенсивности и UV-B облучения.

4.2.1. Экспрессия miR398 и гена CSD1 при действии NaCl.

4.2.2. Экспрессия miR398 и гена CSD1 при действии света высокой интенсивности.

4.2.3. Экспрессия miR398 и гена CSD1 при действии UV-B облучения.

4.3. Исследование экспрессии miR398 в каллусной культуре.

77г. salsuginea.

4.4. Исследование влияния различных концентраций меди в питательной среде растений Тк ваЬщтеа на экспрессию генов МИР 398, С5Х>/ и ССЭ

4.5. Исследование влияния различных концентраций меди в питательной среде растений Th. salsuginea на содержание белков CSD1 и CCS1.

4.6. Исследование экспрессии генов Argonaute, DCL1, DDR1, SPL7, связанных с процессингом miR398 в растении Th. salsuginea.

4.7. ОБСУЖДЕНИЕ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "МикроРНК опосредованная регуляция экспрессии генов Cu/Zn-СОД в растении Thellungiella salsuginea при стрессе"

Изучение устойчивости растений к действию неблагоприятных факторов внешней среды остается одним из важных направлений физиологии растений. На сегодняшний день, очевидно, что существует сеть метаболических реакций, формирующих способность растений адаптироваться к изменяющимся условиям. Однако наименее изученным аспектом в проблеме устойчивости остается вопрос о регуляторных механизмах, позволяющих координировать функционирование всего комплекса реакций защитного ответа. Регуляция стрессорного ответа может осуществляться на генном, транскрипционном, посттранскрипционном, трансляционном и посттрансляционном уровнях организации. Одним из важных элементов посттранскрипционной регуляции активности генов является механизм умолкания генов, обусловленный РНК-интерференцией (РНКи). Обнаружение феномена РНКи в опытах на нематоде в 1998 году позволило выявить новый пласт регуляторных процессов, которые вовлечены в регуляцию экспрессии генов у большинства эукариот. В настоящее время механизм РНКи стал важным инструментом функциональной геномики, позволяющий специфически регулировать активность генов. В последнее время стало ясным, что в* основе механизмов РНКи лежат процессы умолкания генов, который обусловлен экспрессией малых РНК.

В растениях Arabidopsis thaliana L. было обнаружено два основных класса малых РНК размером 21-23 нк., участвующих в подавлении экспрессии генов: siPHK (small interfering РНК) (Baulcombe, 1999), миРНК (micro РНК) (Olsen et al, 2001). Природная роль siPHK заключается в защите клетки от вызванной РНК-вирусами инфекции (Wang et al., 2008), в то время как миРНК закодированы в геноме многоклеточных организмов в виде шпилечного предшественника (пре-миРНК), и регулируют активность генов в цитоплазме и в ядре (Bartel, 2004).

Недавние исследования показали, что миРНК способны регулировать целый комплекс биологических процессов в, растениях, такие как: гормональный контроль, иммунный ответ, полярный рост органов и адаптация к различным стрессам (Jones-Rhoades et al., 2004, Sunkar et al., 2006). Все больше появляется данных о том, что в условиях стресса изменяется как экспрессия миРНК, так и экспрессия мРНК - генов мишеней, а также активность миРНК-белковых комплексов. Например, у растений А. thaliana миРНК miR393, miR397b и miR402, играют важную роль в адаптации к засолению и засухе. Предполагается, что генами - мишенями для этих миРНК могут служить гены, ответственные за общие механизмы адаптации (Martin et.al., 2010).

Биогенез siPHK и миРНК протекает практически по идентичному механизму и контролируется общими генами. siPHK, как и миРНК, в составе комплекса с белками Argonaute (Ago) способны вызывать посттранскрипционное эндонуклеазное разрезание мРНК-мишени, при обнаружении участка нуклеотидной последовательности комплементарного малым РНК. Не полная комплементарность коротких РНК и участка мРНК-мишени приводит к трансляционному подавлению экспрессии гена или к эндонуклеазной деградации мРНК.

Снижение уровня экспрессии miR398, одной из консервативных миРНК (Bonnet et al., 2004; Bartel, 2004; Sunkar et al., 2006), было отмечено y A. thaliana под действием абиотических стресс-факторов и при бактериальном поражении (Sunkar et al., 2006; Jagadeeswaran et al., 2009). После проведения биоинформационного анализа было выдвинуто предположение о возможной посттранскрипционной miR398 опосредованной регуляции генов цитозольной CSD1, хлоропластной CSD2 Cu/Zn-СОД и субъединицы митохондриальной цитохром С оксидазы COX5b-l (Bonnet et al., 2004; Jones-Rhoades et al., 2004; Sunkar, 2006). Участие miR398 в регуляции гена CSD1 было показано Sunkar et al. 2006 на трансгенных растениях A. thaliana с устойчивой к действию miR398 формы гена CSD1. Такие растения проявляли большую устойчивость к окислительному стрессу, вызываемому различными абиотическими факторами.

В работах Yamasaki (Yamasaki et al., 2007) сообщалось, что изменение содержания меди в питательной среде растений влияет на экспрессию как минимум двух из трех МИР генов, кодирующих miR398 (miR398 b, с). При этом также изменялся уровень мРНК генов CSD, что указывало на посттранскрипционные механизмы их регуляции в условиях изменения концентрации меди в питательной среде. Несмотря на это, точный молекулярный механизм данного процесса остается пока не ясным.

Из всего вышесказанного становится очевидным, что изучение явления РНКи открывает большие перспективы для понимания механизмов миРНК опосредованной посттранскрипционной регуляции экспрессии генов в растениях, а также возможность создания трансгенных растений нового поколения, позволяющих максимально использовать адаптивный потенциал растений.

Цель настоящей работы заключалась в том, чтобы исследовать роль микроРНК в посттранскрипционной регуляции генов CSD и CCS в растении Thellungiella salsuginea P. (Th. salsuginea) при действии стрессоров различной физической природы.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Пашковский, Павел Павлович

выводы

1. Установлены мишени действия miR398 в растении Th. salsuginea, в качестве которых выступают мРНК цитозольной Cu/Zn-СОД (CSD1) и мРНК шаперона меди CCS1, доставляющего ионы меди к апобелкам супероксиддисмутаз, имеющим цитозольную (CSD 1), хлоропластную (CSD2) и пероксисомальную (СБОЗУлокализацию.

3. Уровень экспрессии miR398 в растении Th. salsuginea определяется доступностью меди. Снижение концентрации меди в питательной среде сопровождается стимуляцией экспрессии miR398, снижением уровня мРНК цитоплазматической СОД, а также miR398 опосредованной регуляции CCS1 и усилением экспрессии транскрипционного фактора SPL7.

4. miR398 опосредованная регуляция экспрессии гена CSD1 не является орга-носпецифичной, а экспрессия miR398 в корнях и листьях имеет обратную зависимость.

5. Совокупность полученных данных свидетельствует о наличии механизма miR398 опосредованной регуляции экспрессии стресс-зависимых генов у Th. salsuginea в условиях действия повреждающих абиотических факторов, а также о наличии у данной микроРНК множественных генов-мишеней, что позволяет одновременно контролировать протекание различных физиологических процессов.

СПИСОК РАБОТ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Карташов A.B., Иванов Ю.В., Пашковский П.П., Радюкина H.JL, Кузнецов Вл.В. (2007) Исследование ранней индукции защитных систем растений подорожника большого (Plantago major L.) под действием NaCl. В сб: Тезисы VI Съезда Общества физиологов растений. Сыктывкар, с. 176 — 177.

2. Карташов A.B., Радюкина П.Л., Пашковский П.П., Кузнецов

Вл.В. (2008) Роль систем антиоксидантной защиты при адаптации дикорастущих видов растений к солевому стрессу. Физиология растений, 55, 516-522.

3. Пашковский ПЛ., Рязанский С.С, Кузнецов Вл.В. (2009) Экспрессия малых РНК под действием абиотических факторов у растений Thellungiella halophila. В сб: 13-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых "Биология - наука XXI века", Пущино, с. 131 — 132.

4. Пашковский П.П., Рязанский С.С., Радюкина Н.Л., Кузнецов

Вл.В. (2009) Влияние абиотических факторов на экспрессию малых РНК miR398 у растений Thellungiella halophila. В сб: Тезисы докладов Годичного собрания ОФР «Физико-химические механизмы адаптации растений к антропогенному загрязнению в условиях крайнего севера», Апатиты, с. 260 — 261.

5. Иванов Ю.В., Карташов A.B., Радюкина Н.Л., Пашковский П.П., Юренков A.A. (2009) Участие пролина в защитном ответе растений на действие абиотических стрессоров. В сб: Тезисы докладов IX Международной конференции молодых учёных «Леса Евразии - Польские леса», Курник (Польша), с. 181 - 184.

6. Пашковский П.П., Рязанский С.С., Кузнецов Вл.В. (2010) МикроРНК опосредованная регуляция гена цитозольной Cu/Zn-СОД у растений Thellungiella halophila под действием абиотических стрессов. В сб:

14-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых "Биология - наука XXI века", Пущино, с. 321 - 322.

7. Пашковский II.IL,. Рязанский С.С., Радюкина H.JL, Гвоздев В.А., Кузнецов Вл.В., (2010) miR398 и регуляция экспрессии* гена цитоплазматической Gu/Zn-СОД в растениях Thellungiella halophila в, условиях-стресса. Физиология растений, 57, 707-714.

8. Pashkovskiy P., Ryazansky S., Kuznetsov V. (2010) Cu/Zn superoxide dismutase* mRNA levels in Thellungiella halophila opposite correlate with expression of MIR398 under abiotic stresses. In: Abstr. Am. Soc. Plant Biol. Can. Soc. Plant Physiol., № P07023, p. 98.

9. Pashkovskiy P., Ryazansky S., Radyukina N., Kuznetsov V. (2010) Expression' of small microRNA MIR398 under abiotic stress in Thellungiella halophila plants. In: Abstr. FESPB-2010, p. 112.

10: Пашковский П.П., Радюкина H.JL (2010) МикроРНК и гены антиоксидантной защитной системы у растений Thellungiella halophila при стрессе. В сб: Всероссийский симпозиум "Растение и стресс", Москва, с. 269 -270.

11. Пашковский П.П., (2011) МикроРНК опосредованная? регуляция мРНК шаперона меди CCS1 и Cu/Zn СОД CSD1, 2 в растениях Thellungiella salsuginea. В сб: 15-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых "Биология -наука XXI века". Пущино, с. 20 — 21.

12. Парфенов И.А., PeBHHaiT.A., Пашковский П.П., Радюкина Н.Л., Валуева Т. А. (2011) Фрагмент гена, кодирующего белок-ингибитор химотрипсина и трипсина в картофеле. Прикладная биохимия и микробиология, 47,1-5.

13. Radyukina, N.L., Ivanov Yu.V., Pashkovskiy P.P., Kartashov A.V., Shevyakova N.I., Kuznecov VI.V. (2011) Regulation of gene expression governing proline metabolism in Thellungiella salsuginea by NaCl and paraquat. Russian Journal of Plant Physiology, 58, 643 - 652 .

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В проведенных нами исследованиях было показано, что у Th. salsuginea интенсивность экспрессии miR398 изменяется не только при засолении, но и при действии света высокой интенсивности, UV-B облучения и в условиях различных концентраций меди в питательной среде. Это указывает на стресс-зависимость такого механизма регуляции, функционирующего как в устойчивых, так и в чувствительных растениях. Уровень экспрессии miR398 у Th. salsuginea в ответ на действие стрессора носит дозозависимый характер, что1 особенно четко проявляется в условиях засоления, а также действия5 различных концентраций меди. При этом наблюдалось отсутствие органоспецифичности. Можно полагать, что в основе этого явления» лежит интенсивность образования АФК, генерация которых возрастает при. усилении повреждающего воздействия стрессора. Нельзя исключать, что АФК, индуцирующие синтез антиоксидантных ферментов, одновременно ингибируют экспрессию miR398, что повышает эффективность функционирования клеточной антиоксидантной системы.

Анализ динамики уровней miR398 у растений Th. salsuginea в ответ на UV-B облучение и свет высокой интенсивности свидетельствует о том, что облучение листьев сопровождается чрезвычайно быстрым изменением экспрессии miR398 в корнях, которые непосредственно не подвергались стрессорному воздействию. Эти данные находятся в соответствии с ранее установленным фактом, согласно которому не только > листья, но и корни' вовлекаются в формирование защитного ответа на действие UV-B облучения. Результаты экспериментов позволяют высказать предположение, согласно которому экспрессия? miR398 находится под контролем сигналов» межорганного действия, которые инициируются^ в листе и передаются в корневую систему. Изучение роли miR398 в регуляции экспрессии CSD1 показало, что у галофита Th. salsuginea существует обратная зависимость между экспрессией генов CSD1 и miR398.

Из экспериментов по влиянию различных концентраций меди в питательной среде растений Th. salsuginea следует, что изменение экспрессии miR398 может зависеть от содержания меди в клетках растений и являться своего рода маркером ее доступности из питательной среды. При внесении 1 мкМ< CuS04 наблюдалось снижение экспрессии miR398. Снижение экспрессии miR398 приводит к ослаблению посттранскрипционной регуляции мРНК, в З'-НТО областях которых были обнаружены сайты связывания с miR398. В результате этого наблюдалось увеличение содержания белков CCS1 и CSD1. Галофит Th. salsuginea проявляет значительную устойчивость к действию тяжелых металлов. В условиях отсутствия меди у Th. salsuginea происходило увеличение уровня-экспрессии двух обнаруженных генов Fe-СОД. Возможно, это было частью компенсаторного механизма при снижении содержания белка Cu/Zn-СОД и его активности. Анализ экспрессии гена шаперона меди CCS1 и содержания белка CCST в условиях действия различных, концентраций меди позволил предположить,, что miR398 способна регулировать Cu/Zn-СОД не только прямо, но и косвенно через регуляцию шаперона меди, доставляющего медь к апобелкам СОД.

Результаты данной работы внесли некоторую определенность в miR398 опосредованную регуляцию генов CSD при действии-стрессов на взрослых растениях Th. salsuginea. Суммируя все вышесказанное, можно» сделать вывод о том, чтов. растениях есть, определенная группа ферментов и белков, отвечающих на- стресс или онтогенетическое развитие, мРНК которых подвержены посттранскрипционной трансформации со1 стороны миРНК. Так как миРНК-RISC комплексы связываются с нетранслируемыми областями, они по сути позволяют разобщить в пространстве и во времени синтез белка и его регуляцию, позволяя тем самым, более быстро и адекватно реагировать на изменяющиеся условия внешней среды и заблаговременно принимать действия для экономии энергии и мобилизации защитных систем^ для выживания в новых условиях. Подводя итог проведенным исследованиям, мы предлагаем возможную схему функционирования механизма миРНК опосредованной регуляции в условиях действия на растения стрессоров различной природы, а также при различных концентрациях меди в питательной среде у растений Th. salsuginea (рис. 28).

Рис. 28 Схема возможной гш11398 опосредованной регуляции генов Сш^п-СОД в растении при стрессе.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Пашковский, Павел Павлович, Москва

1. Бараненко В.В. (2006) Супероксидцисмутаза в клетках растений. Цитология, 48, 465-474.

2. Зайцев Г.Н. (1984) Математическая статистика в эксперементальной ботанике. М.: Наука 424 с.

3. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. (1984) Молекулярное клонирование, под ред. акад. A.A. Баева. М.: Мир. 479 с.

4. Омельянчук H.A., Кузнецова Т.Н., Катохин A.B. (2005) МикроРНК растений. В сб: Информационный вестник ВОГиС, с. 440-450.

5. Остерман Л.А. (1981) Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование. М.: Наука. 288 с.

6. Пешкова Г.А., Малышев Л.И. (1994) Флора Сибири. Т. 7. Н.:Наука, 159 с.

7. Радюкина Н.Л., Шашукова A.B., Мапелли С., Шевякова Н.И., Кузнецов Вл.В. (2010) Пролин регулирует уровень полиаминов в растениях шалфея в нормальных условиях и при UV-B облучении. Физиология растений, 57, 422-429.I

8. Радюкина Н.Л., Карташов A.B., Иванов Ю.В., Шевякова Н.И., Кузнецов Вл.В. (2007) Функционирование защитных систем у галофитов и гликофитов в условиях прогрессирующего засоления. Физиология растений, 54, 806-815.

9. Радюкина Н.Л., Карташов A.B., Иванов Ю.В., Шевякова Н.И., Кузнецов Вл. В. (2007) Сравнительный анализ функционирования защитных систем у представителей галофитной и гликофитной флоры в условиях засоления. Физиология растений, 54, 902-912.

10. Рукавцова Е.Б., Алексеева В.В., Бурьянов Я.И. (2010) Применение РНК-интерференции в метаболической инженерии растений.98

11. Биоорганическая химия, 36, 146-156.

12. Рязанский С.С., Гвоздев В.А. (2008) Короткие РНК и канцерогенез. Биохимия,1Ъ, 640-655.

13. Abdel-Ghany S.E., Pilon М. (2008) MicroRNA-mediated,Systemic Down-regulation of Copper Protein Expression in »Response to,Low Copper availability in Arabidopsis.J. Biol.Chem., 283, 15932-15945:

14. Addo-Quaye C., Eshoo T.W., Bartel D.P., Axtell M.J. (2008) Endogenous siRNA and miRNA targets identified by sequencing of the Arabidopsis degradome. Curr.Biol, 18, 758-762.

15. Aleman L.M., Doench J., Sharp P.A. (2007) Comparison of siRNA induced off-target RNA and protein effects. RNA, 13, 385-395.

16. Ambros V., Lee R.C., Lavanway A., Williams P.T., Jewell D. (2003) MicroRNAs and other tiny endogenous RNAs in C. elegans . Curr. Biol., 13, 807818.

17. Anantharaman V., Koonin E., Aravind L. (2002) Comparative genomics and evolution of proteins involved in RNA metabolism. Nucleic Acids Res., 30, 1427-1464.

18. Arteaga-Vazquez M., Caballero-Perez J., Vielle-Calzada J. (2006) A Family of microRNAs present in plants and animals. The Plant Cell, 18, 33553369.

19. Axtell M.J., Jan C., Rajagopalan R., Bartel D.P. (2006) A two-hit trigger for siRNA biogenesis in plants. Cell, 127, 565-577.

20. Bartel В., Bartel D.P. (2003) MicroRNAs: At the Root of Plant Development? Plant Physiology, 132, 709-717.

21. Bartel D. (2004) MicroRNAs: Genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell, 116, 281-297.

22. Bellaire B.A., Carmody J., Braud J., Gossett D., Banks S., Lucas M.,

23. Fowler T.E. (2000) Involvement of abscisic acid-dependent' and- -independent pathways in the upregulation of antioxidant enzyme activity during NaCl stress in cotton callus tissue. Free Radic. Res., 33, 531-545.

24. Beauchamp C.O., Fridovich I. (1973) Isozymes of superoxide dismutase from wheat germ. Biochim. biophys., 317, 50-64.

25. Bieza K., Lois R. (2001) An Arabidopsis mutant tolerant to lethal ultraviolet-B levels shows constitutively elevated accumulation of flavonoids and other phenolics. Plant Physiol, 126, 1105-1115.

26. Birchler J;A., Bhadra M.P., Bhadra U. (2000) Making noise about silence: re-pression of repeated genes in animals. Curr. Opin: Genet., 10, 211-216.

27. Blokhina O.B., Virolainen E., Fagerstedt K.V. (2003) Antioxidants, oxidative damage and oxygen depravation stress. Review. Ann. Bot., 91, 179-194.

28. Bohnsack MiT., Czaplinski K., Gorlich D. (2004) Exportin 5 is a RanGTP-dependent dsRNA-binding protein that mediates nuclear export of pre-miRNAs. RNA, 10, 185-191.

29. Bonnet E., Wuyts J., Rouze P., Van de Peer Y.(2004) Evidence that microRNA precursors, unlike other non-coding RNAs, have lower folding free energies than random sequences. Bioinformatics, 17, 2911-2917.

30. Buchon N., Vaury C. (2006) RNAi: a defensive RNA-silencing against viruses and transposable elements. Heredity, 96, 195-202.

31. Burkhead J.L., Reynolds K.A., Abdel-Ghany S.E., Cohu C.M., Pilon M.2009) Copperhomeostasis. New Phytologist, 182, 799-816;

32. Carthew R.W., Sontheimer E.J. (2009) Origins and mechanisms of miRNAs and siRNAs. Cell, 136, 642-655.

33. Gasano B.Mi, Martin M;, Sabater B; (1994) Sensitivity to superoxide;dismutase transcript; levels and activities to oxidative stress is lower in mature-senescent than in young barley leaves. Plant Physiol., 106, 1033-1039:

34. Cerutti H., Casas-Mollano J. (2006) On the origin and functions of RNA-mediated silencing: from protists to man: Curr Genet, 50, 81-99.

35. Chapman E.J., Carrington J.C. (2007) Specialization and evolution of endogenous small RNA pathways; Nat. Rev. Genet., 8, 884—896.

36. Cogoni C., Macino, G. (1999) Homology-dependent; gene silencing in plants and fungi: a number of variations on the same theme. Curr. Opin. Microbiol., 2, 657-662.

37. Dunoyer P., Lecellier C.Hi,. Parizotto E.A., Himber C., Voinnet O.2004) Probing the microRNA and small interfering RNA pathways with virus-encoded suppressors of RNA silencing: Plant Cell, 16, 1235-1250.

38. Eulalio A.,,Rehwinkel J., Strieker M., Huntzinger E., Yang S.F., Doerks

39. T., Dorner S., Bork P., Boutros M., Izaurralde E. (2007) Target-specific requirements for enhancers of decapping in miRNA-mediated gene silencing. Genes Dev., 21; 2558-2570.

40. Dugas D.V., Bartel B. (2008) Sucrose Induction of Arabidopsis miR398 represses two Cu/Zn superoxide dismutases. Plant Mol. Biol., 67,403-417.

41. Fahlgren N., Howell M:D., Kasschau K.D., Chapman E.J., Sullivant

42. G.M:, Gumbie J:S., Givan S.A., Law T.F;, Grant S.R., Dangl J;L., Carrington.

43. J.C. (2007) High-throughput sequencing of Arabidopsis microRNAs: evidence for frequent birth and death of MIRNA genes. Plos one, 10,1371-1376.

44. Fang Y., Spector D.L. (2007) Identification of nuclear dicing bodies containing proteins for microRNA biogenesis in living Arabidopsis plants. Curr. Biol., 17, 818-823.

45. Forstemann K., Horwich M.D., Wee L., Tomari Y., Zamore P.D: (2007> Drosophila microRNAs are sorted into functionally distinct Argonaute protein complexes after production by Dicer-1. Cell, 130, 287-297.

46. Franco-Zorrilla J.M., Valli A., Todesco M., Mateos L, Puga M.I., Rubio-Somoza I., Leyva A., Weigel D., Garcia J.A., Paz-Ares J. (2007) Targetmimicry provides a new mechanism for regulation of microRNA activity. Nat.1. Genet., 39, 1033-1037.

47. Fujii H., Chiou T.J., Lin S.I., Aung K., Zhu J.K. (2005) A miRNA involved in phosphate-starvation response in Arabidopsis. Curr. Biol., 15, 20382043.

48. Garcia D. (2008) A miRacle in plant development: Role of microRNAs in cell differentiation and patterning. Semin. Cell Dev. Biol., 19, 586-595

49. Goeres D.G., Van Norman'J.M., Zhang W., Fauver N.A., Spencer M.L., Sieburth L.E. (2007) Components of the Arabidopsis mRNA decapping complex are required for early seedling development. Plant Cell, 19, 1549-1564'.

50. Golden D.E., Gerbasi V.R:, Sontheimer E.J. (2008) An inside job for siRNAs. Mol. Cell, 31; 309-312.

51. Goldstein S., Meyerstein D., Czapski G. (1993) The Fenton reagents: Free Radical Biology and Medicine, 15,435-445.

52. Gregory B.D:, O'Malley R:C., Lister R., Urich M.A., Tonti-Filippini J., Chen H., Millar A.H., Ecker J.R. (2008) A link between RNA metabolism and silencing affecting Arabidopsis development. Dev. Cell, 14, 854-866.

53. Hammond S.M., Boettcher S., Caudy A.A., Kobayashi.RI, Hannon G.J.2001)' Argonaute2, a link between genetic and biochemical analysis of RNAi. Science, 293, 1146-1150.

54. Hernandez JjA., Jimenes A., Mullineaux P., Sevilla F. (2000) Tolerance of pea (Pisum sativum L.) to long-term salt stress is associated with the induction of antioxidant defences. Plant Cell Environ., 23, 853-862.

55. Hidema J., Kumagai T. (2006) Sensitivity of rice to ultraviolet-B radiation Ann. Bot, 97, 933-942.

56. Horwich M.D., Li C., Matranga C., Vagin V., Farley G., Wang P., Zamore P.D. (2007) The Drosophila RNA methyltransferase, DmHenl,modifies germline piRNAs and single-stranded siRNAs in RISC. Curr. Biol, 17, 1265-1272.

57. Hutvagner G., Zamore P.D. (2002) A microRNA in a multiple-turnover RNAi enzyme complex. Science, 297, 2056-2060.

58. Huntzinger E., Izaurralde E. (2011) Gene silencing by microRNAs: contributions of translational repression and mRNA decay. Nat. Rev. Genet., 12, 99-110.

59. Jagadeesvvaran G., Saini A., Sunkar R. (2009) Biotic and abiotic stress down regulate miR398 expression. Planta, 229,1009-1014.

60. Jithesh M. N., Prashanth S.R., Sivaprakash K.R., Parida A.K. (2006)

61. Antioxidative response mechanisms in halophytes: their role in stress defense, India Journal of Genetics, 85, 237-254.

62. Jones-Rhoades M.W., Bartel D.P. (2004) Computational identification of plant microRNAs and their targets, including a stress-induced miRNA. Mol. Cell, 14, 787-799.

63. Jones L., Hamilton A.J., Voinnet O., Thomas C.L., Maule A.J., Baulcombe D.C. (1999) RNA-DNA interactions and DNA methylation in post-transcriptional gene silencing. The Plant cell, 11, 2291-2301.

64. Jover-Gil S., Candela H., Ponce M. (2005) Plant microRNAs and development Int. J. Dev. Biol., 49, 733-744.

65. Kaminaka H., Morita S., Tokumoto M., Masumura T., Tanaka K.1999) Differential gene expression of rice superoxide dismutase isoforms tooxidative and anvironmental stresses. Free Radic. Res., 31, 219-225.

66. Katiyar-Agarwal S., Morgan R., Dahlbeck D., Borsani O., Villegas A.,

67. Zhu J.K., Staskawicz B.J., Jin H. (2006) A pathogen-inducible endogenous siRNA in plant immunity. PNAS, 103, 18002-18007.

68. Kennedy S., Wang D., Ruvkun G. (2004) A conserved siRNA-degrading RNase negatively regulates RNA interference in C. elegans. Nature, 427, 645-649.

69. Khvorova A., Reynolds A., Jayasena S.D. (2003) Functional siRNAs and« miRNAs exhibit strand bias. Cell, 115, 209-216.

70. Kim V.N. (2005) MicroRNA biogenesis: coordinated cropping and dicing. Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 6, 376-385.

71. Kiriakidou M., Tan G.S., Lamprinaki S., Planell-Saguer M., Nelson P.T., Mourelatos Z. (2007) An mRNA m7G cap binding-like motif within human Ago2 represses translation. Cell, 129, 1141-1151.

72. Kliebenstein D.J., Monde R.A., Last R.L. (1998) Superoxide dismutase in Arabidopsis: an eclectic enzyme family with disparate regulation and protein localization. Plant Physiol, 118, 637-650.

73. Kurepa J., Herouart D., Montagu V.M., Inze D. (1997) Differential expression of Cu/Zn- and Fe-superoxide dismutase genes of tobacco during development, oxidative stress and hormonal treatment. Plant Cell Physiol38, 463-470.

74. Kurihara Y., Takashi Y., Watanabe Y. (2006) The interaction between DCL1 and HYL1 is important for efficient and precise processing of pri-miRNA in plant microRNA biogenesis. RNA, 12, 206-212.

75. Laemmli U.K.(1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227,680-685.

76. Lee Y., Kim M., Han J., Yeom K.H., Lee S., Baek S.H., Kim V.N. (2004) MicroRNA genes are transcribed by RNA polymerase II. EMBO J. 23,4051-4060.

77. Li J., Yang Z., Yu B., Liu J., Chen X. (2005) Methylation protects miRNAs and siRNAs from a 3"-end uridylation activity in Arabidopsis. Curr. Biol, 15, 1501-1507.

78. Liu C.G., Calin G.A., Meloon B., Gamliel N., Sevignani C., Ferracin M., Dumitru C.D., Shimizu M., Zupo S., Dono M. (2004) An oligonucleotide microchip for genome-wide microRNA profiling in human and mouse tissues. Proc. Natl Acad Sci., 101, 9740-9744.

79. Liu Q., Feng- Y., Zhu Z. (2008) Dicer-like (DCL) proteins in plants. Functional & Integrative Genomics, 9, 277-286.

80. Liu Z., Xiao H., Zheng X., Qiao X., Wang H. (2011) Silencing effect of shRNA expression vectors with stem length of 21, 27 or 29 bp. African Journal of Biotechnology, 10, 1073-1080.

81. Madamanchi N., Donahue J., Cramer C., Alscher R., Pederson K.1994) Differential response of Cu/Zn superoxide dismutase in.two pea cultivars during a short term exposure to sulfur dioxide. Plant Mol. Biol, 26, 95-103.

82. Mallory A.C., Reinhart B.J., Bartel D.P., Vance V.B., Bowman L.H.2002) A viral suppressor of RNA silencing differentially regulates the accumulation of short interfering RNAs and microRNAs in tobacco. PNAS, 99, 15228-15233.

83. Martin R.C., Liu P., Goloviznina N. A., Nonogaki H. (2010) microRNA, seeds, and Darwin?: diverse function, of miRNA in seed biology and plant responses to stress. Journal of Experimental Botany, 61, 2229-2234.

84. Martinez J. (2002) Single-stranded antisense siRNAs guide target RNA cleavage in RNAi. Cell, 110, 563-574.89i Martinez J., Tuschl T. (2004) RISC is a 5' phosphomonoester-producing RNA endonuclease. Genes Dev., 18? 975-980.*

85. Masclaux F.,.Charpenteau M.,,Takahashi T., Pont-Lezica R:, Gnlaud

86. J.P. (2004). Gene silencing using a heat-inducible RNAi system in Arabidopsis. Biochem Biophys Res Commun., 321, 364-369.

87. Matzke M., Matzke A.J., Kooter J.M. (2001) RNA: guiding gene silencing. Science, 293, 1080-1083.

88. Matranga C., Tomari Y., Shin C., Bartel D.P., Zamore P.D. (2005) Passenger-strand cleavage facilitates assembly of siRNA into Ago2-containing RNAi enzyme complexes. Cell, 123, 607-620:

89. Matts J., Jagadeeswaran G., Roe B.A., Sunkar R. (2010) Identification of microRNAs and their targets in switchgrass, a model biofuel plant species. J Plant Physiol., 167, 896-904.

90. Meaux J., Hu J.Y., Tartler U., Goebel U. (2008) Structurally different alleles,of the ath-MIR824 microRNA precursor- are maintained at high frequency in Arabidopsis thaliana. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 105, 8994-8999.

91. Meng Y., Ma X., Chen D., Wu P., Chen M. (2010) MicroRNA-mediated signaling involved in plant, root development. Biochemical and Biophysical Research Communications, 393, 345-349.

92. Miyoshi K, Okada T.N, Siomi HI, Siomi M.C. (2009) Characterization of the miRNA-RISC loading complex and miRNA-RISC formed in the DrosophilamiRNA pathway. RNA, 15; 1282-1291.

93. Molnar A., Schwach F., Studholmc D.J., Thuenemann E.C., Baulcombe

94. Obbard D., Jiggins F., Halligan D., Littler T. (2006) Naturals selection drives extremely rapid evolution in.antiviral RNAi genes. Carr Biol:, 16, 580-585:

95. Okamura K., Ishizuka A., Siomi H., Siomi M.C. (2004) Distinct roles for Argonaute proteins in small» RNA-directed RNA. cleavage pathways. Genes & Dev., 18, 1655-1666.

96. OIsen P.H., Ambros V. (1999) The lin-4 regulatory RNA controls developmental timing in Caenorhabditis elegans by blocking LIN-14 protein synthesis after the initiation^ of translation. Dev. Biol., 216, 671- 680.

97. Palatnik J.F., Wollmann H., Schommer. C., Schwab R., Boisbouvier J., Rodriguez Ri, Warthmann N., Alien E., Dezulian T., Huson D. (2007) Sequence and expression differences underlie functional specialization of

98. Arabidopsis microRNAs miR159 and miR319. Dev. . Cell, 13, 115-125.i

99. Park M.Y., Wu G., Gonzalez-Sulser A., Vaucheret H., Poethig R.S.2005) Nuclear processing and export of microRNAs in Arabidopsis . Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102, 3691-3696

100. Reinhart B.X, Slack F.J., Basson M., Pasquinelli A.E., Bettinger J.C., Rougvie A.E., Horvitz H;R., Ruvkun G. (2000) The 21-nucleotide letr7 RNA regulates developmental timing inCaenorhabditis elegans. JV«/Mre, 403, 901-906:

101. Scandalios J.G. (1997) Molecular genetics of superoxide* dismutase in p\mts.ln:.Oxidative stress and the molecular biology of antioxidant defensesy,

102. J. G. Scandalios. (ed.) New York: Cold Spring Harbor Lab. Press, pp. 527-568.

103. Schwarz D.S., Hutvagner G., Du T., Xu Z., Aronin N., Zamore P.D.2003) Asymmetry in the assembly of the RNAi enzyme complex. Cell, 115, 199208.

104. Slesak I., Karpinska B., Surowska E., Miszalski Z., Karpinski S. (2003)

105. Redox changes in the chloroplasts and hydrogen peroxide are essential forregulation of C3-CAM transition and photooxidative stress responses in theffacultative CAM plant Mesembtyanthenum crystallinum L. Plant Cell Physiol., 44, 573-581.

106. Smith N.A., Singh S.P., Wang M.B., Stoutjesdijk P.A., Green A.G., Waterhouse P.M. (2000) Total silencing by intron-spliced hairpin RNAs. Nature, 407,319-320.

107. Smith, P.K. (1985) Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical. Biochem., 150, 76-85.

108. Sunkar R., Kapoor A., Zhu J.K. (2006) Posttranscriptional induction of two Cu/Zn superoxide dismutase genes in Arabidopsis is mediated by down-regulation of miR398 and important for oxidative stress tolerance. Plant Cell, 18, 2051-2065.

109. Sunkar R., Chinnusamy V., Zhu J., Zhu J.K. (2007) Small RNAs as big players in plant abiotic stress responses and nutrient deprivation. Trends Plant1. Sci., 12, 301-309.

110. Talmor-Neiman M., Stav R., Frank W., Voss B., Arazi T. (2006) Novel micro-RNAs and intermediates of micro-RNA biogenesis from moss. Plant J., 47, 25-37.

111. Tobin, H., Staehnil T., Gordon J. (1979) Electrophoretic transfer of proteins from polyacrilamide gels to nitrocellulose sheets. Proceeding of the National Academy of Sciences USA, 16,4350-4354.

112. Tomari Y., Du T., Zamore P.D. (2007) Sorting of Drosophila small silencing RNAs. Cell, 57, 299-308.

113. Timmons L, Fire A. (1998) Specific interference by ingested. dsRNA. Nature, 29; 6705-6854.

114. Van der Krol A.R., Mur L.A., de Lange P., Mol J:N., Stuitje A.R. (1990) Inhibition of flower, pigmentation by antisense CHS genes: promoter and minimal sequence requirementsdfor the antisense effect. Plant Mol: Biol., 14,457-466:

115. Vazquez F.*, Vaucheret HI, Raj ago pa Ian R., Lepers C., Gasciolli V., Mallory A.C,. Hilbert J.L., Bartel D.P., Crete P. (2004) Endogenous transacting siRNAs regaulte the acccumulation of Arabidopsis mRNAs. MolCell, 16, 69-79.

116. Vazquez F., Blevins T., Ailhas J., Boiler T., Meins F. (2008) Evolution of Arabidopsis MIR genes generates novel microRNA classes. Nucleic Acids Res., 36, 6429-6438.

117. Vaucheret H. (2008) Plant ARGONAUTES. Trends Plant Sci., 13, 350358.

118. Vionnet O. (2009) Origin; biogenesis, and activity of plant microRNAs. Review. Cell, 136; 669-687.

119. Voinnet, O. (2008). Use, tolerance and avoidance of amplified' RNA silencing by plants. Trends Plant Sci., 13,317-328.

120. Wang P., Liang Z., Zeng J., Li W., Sun X., Miao Z., Tang K. (2008) Generation of tobacco lines with widely different reduction in nicotine levels, via RNA silencing approaches. JBiosci., 33, 177-184.

121. Wang J.F., Zhou H., Chen Y.Q., Luo Q.J., Qu L.H. (2004) Identification of 20 microRNAs from Oryza sativa. Nucleic Acids Res., 32, 1688-1695.

122. Wang J.W., Schwab R., Czech B., Mica E., Weigel D. (2008) Dual effects of miR156-targeted SPL genes and CYP78A5/KLUH on plastochron length and organ size in Arabidopsis thaliana. Plant Cell, 20,1231-1243.

123. Williamson Jf D^, Scandalios J.G. (1992) Differential response of maize catalases and superoxide dismutases to the photoactivated fungal toxin cercosporin. Plant J., 2, 351-358.

124. Xie Z., Allen E., Fahlgren N., Calamar A., Givan S.A., Carrington J.C.2005) Expression of Arabidopsis MI RNA Genes. Genetics, genomics, and molecular evohitiom Plant Physiology, 138, 2145-2154.

125. Xie Z., Kasschau K.D., Carrington J.C. (2003) Negative feedback regulation of Dicer-Likcl in Arabidopsis by microRNA-guided mRNA degradation. Curr.Biol., 13,784-789.

126. Yamamoto Y.Y., Sieburth L., Voinnet O. (2008) Widespread translational inhibition by plant miRNAs and siRNAs. Science, 320, 1185-1190.

127. Yamasaki H., Abdel-Ghany S.E., Cohu C.M., Kobayashi Y., Shikanai T., Pilon M. (2007) Regulation of copper homeostasis by micro-RNA in Arabidopsis J. Biol Chem., 282, 16369-16378.

128. Yamasakia Hi, Hayashib M., Fükazawab M., Kobayashia Y., Shikanaic

129. T. (2009) SQUAMOSA Promoter, Binding Protein-Like7 is a central regulator for Copper Homeostasis in Arabidopsis; The Plant Cell, 21, 347-361.

130. Yang Z., Ebright Y.W., Yu B., Chen X. (2006) HEN1 recognizes 21-24 nt small RNA duplexes and deposits a methyl group onto the X OH of the 3'. terminal nucleotide. Nucleic Acids Res., 34, 667-675.

131. Yi R., Qin Y., Macara I.G., Cullen B.R. (2003) Exportin-5 mediates thenuclear export of pre-microRNAs and short hairpin RNAs. Genes Dev., 17, 30113016.

132. Zamore P.D., Haley B. (2005) Ribo-gnome: the big world of small RNAs. Science, 309, 1519-1524.

133. Zhang B., Pan X., Cannon C.H., Cobb G.P., Anderson T.A. (2006) Conservation and divergence of plant microRNA genes. Plant J., 46, 243-259.

134. Zhang B., Pan X., Stellwag E.J. (2008a) Identification of soybean microRNAs and their targets. Planta, 229,161-182.

135. Zhang Z., Wei L., Zou X., TaoY., Liu Z., Zheng Y. (2008b) Submergence-responsive, microRNAs are potentially involved in the regulation of morphological and metabolic adaptations in maize root cells. Ann. Bot., 102, 509519.

136. Zeng Y., Yi R., Cullen B.R. (2005) Recognition and cleavage of primary microRNA precursors by the nuclear processing enzyme Drosha. The EMBO Journal, 24, 138-148.

137. Zhu D., Scandalios J.G. (1994) Differential accumulation of manganese-superoxide dismutase transcripts in maze in response to abscisic acid and high osmoticum. Plant Physiol., 106, 173-178.

138. Zhou X., Wang G., Zhang W. (2007) UV-B Responsive microRNA genes in Arabidopsis thaliana. Mol. Syst. Biol., 3,1-16.

139. Zhu C., Ding Y., Liu H. (2011) miR398 and plant stress responses. Physiol Plantarum, 142, 63-71.

Информация о работе

Пашковский, Павел Павлович
кандидата биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.01.05

Диссертация

МикроРНК опосредованная регуляция экспрессии генов Cu/Zn-СОД в растении Thellungiella salsuginea при стрессе - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы