Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биохимические особенности антиоксидантных систем разнотолерантных к соли генотипов картофеля in vitro

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Биохимические особенности антиоксидантных систем разнотолерантных к соли генотипов картофеля in vitro"

На правах рукописи

КИЁМОВА Злрафо Суфижоновна

БИОХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ АНТИОКСИДАНТНЫХ СИСТЕМ РАЗНОТОЛЕРАНТНЫХ К СОЛИ ГЕНОТИПОВ КАРТОФЕЛЯ IN VITRO

(03.01.04 - биохимия)

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

005544729

ДУШАНБЕ-2013

005544729

Работа выполнена в Институте ботаники, физиологии и генетики растений Академии наук Республики Таджикистан

Научный руководитель: ведущий научный сотрудник института ботаники,

физиологии и генетики растений АН РТ., ku6.ii. Давлятназарова 3. Б.

Научный консультант:

Заслуженный деятель науки и техники Таджикистан, член-корреспондент АН Республики Таджикистан, доктор биологических наук, профессор Алиев Курбон

Официальные оппоненты: Доктор биологических наук, профессор, зав. кафедры

биохимии Таджикского государственного медицинского университета им. Абуали ибни Сино Сабурова Анна Мухаммадневна

кандидат биологических наук, доцент кафедры ботаники Таджикского педагогического университета им. Садриддина Айни Гайратов Мехровар Ховаровнч

Ведущая оргапшация: Таджикский аграрный университет им. Ш. Шотемура

i « g » 20/3 г. в /¿^часов i

i Д 737. ГШ,05 при Таджике ком национальном ун

Защита диссертации состоится < _ заседании Диссертационного совета Д 737.Cjrfj.05 при Уаджикском национальном университете по адресу: 734025, Республика Таджикистан, г. Душанбе, пр. Рудаки, 17.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Таджикского национального университета.

Автореферат разослан «

Ученый секретарь

,. и a i

диссертационного совета, \'Т кандидат биологических наук, Д()це1гг *

ЗЛрабаева З.М.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Картофель является важнейшей сельскохозяйственной культурой в Таджикистане. Для получения новых сортов используются как традиционные методы селекции, так и биотехнологические подходы, роль которых значительно возросла в последние годы. Биотехнологические методы способствуют получению новых сортов, обеспечивающих не только повышение урожайности, но и устойчивость к различным факторам окружающей среды, таким как засуха, засоление и повышение температуры. Влияние этих факторов особенно усилилось в последние годы в связи с глобальным изменением климата (Алиев, 2012).

Одним из факторов, лимитирующих продуктивность культурных растений является засоление почвы. Подсчитано, что количество засоленных почв с каждым годом возрастает и через 25-30 лет достигнет угрожающего уровня. Примерно 40% пахотных земель будут непригодными для сельскохозяйственного возделывания растений (ФАО, 2010).

Для изучения токсического влияния соли и механизмов толерантности используются клеточные культуры (Бабаева и др., 1968; Кулаева и др., 1997). При изучении механизмов устойчивости у выделенных in vitro со-леустойчивых клеточных линий показано, что у ряда клонов не нарушалась способность к проникновению ионов соли и вместе с тем поддерживался осмотический градиент, необходимый для функционирования клетки. Клеточные механизмы выносливости к засолению являются сходными для культивируемых in vitro клеток и целых растений, поэтому селекция на клеточном уровне представляет реальную перспективу получения устойчивых к засолению форм растений. Механизмы адаптации к условиям засоления могут быть разными и до конца не изучены.

Получение растений с целью придания им устойчивости к стрессор-ным факторам основано на манипулировании экспрессии и активности основных ферментов антиоксидантной системы растений, которые напрямую связаны с защитой клетки от супероксид - радикалов (Мерзляк, 1989).

Поэтому, возможности регулирования молекулярного и биохимического адаптационного потенциала, заложенного в генотипе растения, можно использовать для повышения толерантности растений к стрессовым факторам среды, что имеет фундаментальное и прикладное значение. Цель и задачи работы. Целью работы являлось изучение молекулярно-биохимических особенностей разноустойчивых к засолению генотипов картофеля, а также их прооксидантной и антиоксидантной системы в условиях in vitro.

В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:

1. Определить активность прооксидантов (Н2О2, 0~2) у разночувстви-тельных к соли генотипов картофеля;

2. Определить активность супероксиддисмутазы (СОД, КФ 1.15.1.1) у разночувствительных к соли генотипов картофеля;

3. Определить содержание малонового диальдегида (МДА) при воздействии засоления;

4. Изучить роль антиоксидантных систем в повышении солеустойчи-вости генотипов картофеля;

5. Изучить прооксидантные и антиоксидантные системы в различных компартментах клетки у разночувствительных гибридов картофеля.

Научная новизна работы. Изучена и проанализирована продукция активных форм кислорода (АФК), малонового диальдегида (МДА) и активность антиоксидантного фермента супероксиддисмутазы (СОД) у расте-ний-регенерантов картофеля, различающихся по устойчивости к солевому стрессу. Показано, что растения, устойчивые к засолению имеют более эффективно работающие антиоксидантные системы, и способны переносить длительный окислительный стресс.

Изучены антиоксидантные системы в различных компартментах клетки у разночувствительных гибридов картофеля. Впервые показана роль хлоро-пластных антиоксидантных систем, имеющих прямую зависимость от активации СОД и окисленности НАДФ у растений картофеля, способствующих сверх продукции АФК.

Использование антибиотика циклогексимида, специфически блокирующего трансляционный процесс на уровне цитоплазматической рибосомы показало существование предсинтезированного пула СОД и интенсификацию синтеза этого фермента De novo за счет экспрессии существующий мРНК у устойчивого к соли генотипа растений картофеля, что не было выявлено у чувствительных растений.

Практическая значимость. Полученные экспериментальные результаты расширяют представления о молекулярных механизмах устойчивости растений к экстремальным природным стрессорам и их адаптации.

Активность СОД, а также других антиоксидантов можно использовать как тест признак для селекции сельскохозяйственных растений, обладающих высоким адаптационным потенциалом.

Отобраны клон-гибриды картофеля, обладающие высоким уровнем устойчивости и урожайности в условиях засоления.

Апробация результатов исследования.

Диссертация подготовлена и обсуждена в Институте ботаники, физиологии и генетики растений Академии наук Республики Таджикистан и на биологическом факультете Таджикского национального университета. Ее основные положения, выводы и рекомендации были доложены на конференциях и семинарах: на международном семинаре «Обеспечение улучшения продовольствия и увеличение доходов в Юго-Западной и Центральной Азии (SWCA) через сорта картофеля с улучшенной устойчивостью к абиотическому стрессу» Индия (Гуджарат), 29-30 ноября 2010 г.; на VI Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» Москва (Россия), 21-25 марта 2011 г.; на республиканской научной

конференции посвященной 60-летию образования Академии наук Республики Таджикистан «Физиология растений и проблемы развития растениеводства в Таджикистане» Душанбе, 2011 г.; на международной научной конференции памяти академика Ю.С. Насырова «Фотосинтез и проблемы повышения продуктивности растений». Душанбе, 2012 г.; на республиканской научной конференции «Экологические проблемы и рациональное использование природных ресурсов» Душанбе, 2012 г.; на V международной конференции «Экологические особенности биологического разнообразия» Худжанд, 2013 г.; на международном семинаре «Улучшение сортов картофеля и технологий управления водными ресурсами для улучшения эффективности водопользования, устойчивости к внешним воздействиям, рентабельность и производительность мелких земельных хозяйств, предрасположенных к стрессовым условиям Центральной Азии». Ташкент (Узбекистан) 3-5 сентября 2013 г.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 11 работ,

Структура и объем работы

Диссертационная работа изложена на 101 страницах машинописного текста включающего в себя введение, 4 главы, заключение, списка использованной литературы и приложений. Работа также содержит 7 рисунков и 13 таблиц. Список цитируемой литературы включает 150 наименований, из которых 90 на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы н методы исследований В качестве объектов исследования использовались гибриды картофеля (Solamim tuberosum L.), полученные из Международного центра картофеля (СIP, Перу). Было изучено 27 гибридов картофеля из которых были отобраны наиболее устойчивые и неустойчивые к солевому стрессу и засухе. Гибриды картофеля размножали микрочеренкованием в стерильных условиях с дальнейшей посадкой в среду Мурасиге-Скуга (Murashige, Skoog, 1962), содержащей сахарозу - 20г/л; агар - 6.0 г/л; витамины С, В,, В6, ; а-нафтилуксусную кислоту (а- НУК) - 2 мг/л, индолил-3-масляная кислота (ИМК) -I мг/л (pH 5.7-5.8) согласно рекомендации Института сельскохозяйственной биотехнологии Российской Академии Сельскохозяйственных Наук (Россия). Пробирочные растения выращивали при температуре 22-23°С, в течении 4-5 недель, при освещенности 3000-3500 люкс и фотопериоде 16/8 ч. свет/темнота.

Скрининг in vitro в условиях солевого стресса Для скрининга на солевой стресс использовали in vitro растения, которые пересаживали на питательную среду Мурасиге-Скуга с добавлением хлористого натрия, как селективного агента, в концентрациях: 0.5%, 1%, 1.5%. Количество пробирочных растений для каждого варианта составляла 10 штук, повтор-

ность 3-х кратная. Контролем служили растения, выращенные в среде без добавления хлористого натрия. После 5-6 недель выращивания определяли процент выживаемости, высоту растений, длину корней, количество корней на одно растение.

Определение количественного содержания малонового диальдегида Содержание МДА определяли по методу, описанному в работе (Hodges et al., 1999).

Определение активности супероксидднсмутазы

Активность СОД определяли с использованием нитросинего тетразоля методом, описанным в работе (Giannopulitis, Ries, 1977). Расчет производили по количеству препарата, способного подавить реакцию восстановления нитросинего тетразоля. За единицу активности принимали 50%-ное инги-бирование образования формазана. Активность СОД выражали в единицах активности на 1г сырого веса в час. Контролем служили: а) полная реакционная среда без фермента, в которой наблюдалась максимальная окраска; б) полная реакционная среда, инкубированная в темноте, служила тем-новым контролем.

Определение содержания активных форм кислорода

Определение АФК проводили с использованием нитросинего тетразоля (HCT) по методике (Doke N.. 1983).

Определение относительного содержания воды

Для измерения относительного содержания воды (ОСВ) проводили по методике (Barrs, et al., 1962).

ОСВ рассчитывали по формуле: ОСВ = (сыр. В.- сух. В)/(НВ - сухВ).

Определение содержания пролина

Пролин определяли по методу (Bates, et al., 1973) при длине волны 520 нм на спектрофотометре Ultraspec-II (Швеция). Соответствующие стандарты пролина использовали для определения содержания пролина в пробах.

Выделение и очистку хлоропластов и митохондрии

проводили по методу (Алиев, 1985).

Определение содержания перекиси водорода

Определение содержания Н202 проводили по методу (Capaldi, Taylor., 1983).

Определение содержания НАДФ

Измерение содержание НАДФ и НАДФ-Н определяли по (Kato, et al 1973).

Определение содержание хлорофилла

проводили с использованием 80% ацетона по методу (Wettstein, 1957).

Окислительный стресс

Окислительный стресс вызывали, помещая растения в пробирки, в среду без агара, закрытыми ватно-марлевыми пробками, в 1,5% растворе NaCI на различные промежутки времени (30, 60 и 120 мин). Часть растений возвращали в нормальные для роста условия (без NaCI), для определения ре-паративных эффектов и степени повреждения. Измерения проводили через сутки после засоления.

Статистическая обработка данных Полученные результаты обработаны статистически (Урбах, 1964) по формулам, представленным в сборнике методов биохимического анализа растений под редакцией В.В Полевого и Г.Б.Максимова (1978), а также по Г.Ф.Лакина (1973).

Представленные данные достоверны при доверительной вероятности 97-99%.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Накопление активных форм кислорода н перекиси водорода у разнотолерантиых растений картофеля

В ходе эволюции высшие растения развили различные ферментативные и неферментативные антиоксидантные системы для снижения негативного действия активных форм кислорода (АФК). Интенсивное образование АФК происходит на мембранах хлоропластов и митохондрий, а также в пероксисомах, ядре, клеточной стенке и т д. (Asada, 1999; Парамонова, и др., 2007).

Так как по накоплению АФК и перекиси водорода можно судить о механизмах устойчивости растений к неблагоприятным факторам среды, целью наших исследований было изучение кинетики образования О; и Н202 в течение 24 ч воздействия NaCI у разночувствительных генотипов картофеля (рис. 1, 2).

Солевой стресс повышал образование О; у растений-регенерантов как толерантных, так и чувствительных к солевому стрессу. Однако, если в толерантных растений образование О: возростало незначительно на первых этапах солевого стресса, то на последнем этапе эксперимента (24ч), оно возросло, примерно, в два раза.

Длштельлюсгь воздействия стресса, ч

Рис.1. Образование О; у толерантных (1) и чувствительных (2) к соли растений-регенерантои картофеля в условиях солевого стресса

Образование О; у чувствительного генотипа картофеля в первые часы воздействия солевого стресса отличалось от толерантных растений в два раза, а после 24-часового воздействия образование О; возрастало больше, чем в пять раз от начального уровня. Что касается содержания Н202, то оно менялось также, как'и содержание О; (рис. 2).

Эти результаты свидетельствуют о том, что генерация О; и накопление перекиси водорода (Н202) в условиях солевого стресса (КаС1) у чувствительных растений была гораздо выше, чем у толерантных растений картофеля.

Так как образование, АФК идет в различных компартментах клетки нами было изучено накопление АФК и Н202 в хлоропластах у разночув-ствительных генотипов картофеля при солевом стрессе (табл. 1). ЫаС! повышал скорость образования 02" в хлоропластах как у чувствительных, так и у толерантных растений. Так, если скорость образования 02" у чувствительных резко повышалось, то в толерантных растениях возрастало незначительно (табл. 1).

Таблица 1.

Накопление АФК и Н:.02 в хлоропластах при солевом стрессе

Генотип Образование АФК (мкмоль/r сырой массы) Образование Н2О2 (нмоль/г сырой массы)

Солеустойчивый клон-гибрид № 1, контроль 1,21+0.07 150,4+5.5

Солеустойчивый клон-гибрид № 1, опыт (1% 2.42+0.4 214.2+5.9

Солечувствителъный клон-гибрид Л®25, контроль 1.11+0.08 ¡63.4+5.6

Солсчувствнтельный клон-гибрнд Л«25, опыт (1 °/о N301) 3.89+0.6 290.4+6.3

Содержание перекиси водорода также менялось как скорость генерации С)2 (табл.1). Таким образом, полученные данные позволили высказать мнение, что в хлоропластах при засолении чувствительный генотип -клон-гибрид № 25 накапливал больше АФК, чем толерантный к соли генотип - клон-гибрид №1.

но

а 60

10

4 6 3

Дютеъ лнв» ТЬ »«Действил <тр.(

-18—2 1

Рис. 2. Содержание Н2С2 у толерантных (1) и чувствительных (2) к соли растений — регенерантов картофеля в условиях солевого стресса (1% №С1).

Так как, гидроксильные радикалы приводят к перекисному окислению липидов, степень повреждения которых может быть оценена по накоплению малонового диальдегида (МДА), в наших опытах мы изучали содержание МДА у разнотолерантых генотипов к солевому стрессу (рис.

3).

Длительность воздействие стресса, ч

Рис. 3. Содержание МДА у толерантных (1) и чувствительных (2) к соли растенип-регенерантов картофеля в условиях солевого стресса (1% !\аС1).

9

Как видно из приведенных данн&гх, в условиях стресса содержание МДА у толерантных растений было заметно ниже, чем у чувствительных к соли генотипов. Но характер накопления МДА, существенно отличается от содержания Н202 и 02~. Можно полагать, что по мере адаптации растений к стрессу различия по повреждению мембран между этими генотипами постепенно уменьшались.

Это наводит на мысль о существовании особых механизмов адаптации растений в условиях стресса очевидно, связанных со скоростью восстановления НАДФ и НАДФ Н в разных компартментах клетки (митохондрии, хлоропласты).

Анализ активности Фд-НАДФ-ОР (ферредоксин-НАДФ-оксидоредуктазы) у исследованных гибридов показал, что в период стресса активность фермента сильно варьировала (табл. 2). Так, у чувствительного к соли клон-гибрида № 25 активность фермента первые часы стресса не изменялась, затем немного усиливалась от первоначальной активности, а при продолжительном стрессе произошло снижение активности. У устойчивого генотипа (гибрид №1) наблюдалось некоторое повышение активности фермента в период воздействия от 4 до 8 часов стресса, и резкое уменьшение к 24 часам, т.е. при продолжительном стрессе наблюдалось падение активности фермента. Активность этого же фермента у чувствительного генотипа (№ 25) была выше во всех периодах воздействия соли.

Таблица 2

Активность Фд-НАДФ-ОР при солевом стрессе у разночувстви-тельных генотипов картофеля (1% N30) в разные периоды воздействия

Генотип Активность, мкмоль НАДФ-Н/мг сырой массы

Оч 4ч 6ч 8ч 24 ч

Клок-гибрид X» 1 12.5+1.2 16.1 + 1.9 17.8+1.8 10.2+0.9 2.4+0.2

Клон-гибрид № 25 14.9+1.4 17.7+1.8 18.9+1.7 24.5+2.1 6.80+0.4

Таким образом, имело место колебание активности фермента в ходе стресса у толерантного генотипа, а у чувствительного генотипа падение активности фермента было гораздо меньше, чем у толерантного генотипа. Такой ход активности Фд-НАДФ-ОР указывает на то, что адаптационный механизм у этих генотипов протекает не однотипно, что и было подтверждено данными по накоплению МДА.

Возможно, это связано с накоплением НАДФ в митохондриях и хло-ропластах, дефицит которого приводит к накоплению АФК в клетках растений, а у толерантных растекий не возникает дефицита НАДФ в окислительно-восстановительных реакциях этих органелл растений.

Данные табл. 3 показывают, что при высокой величине отношения НАДФ Н/НАДФ, наблюдается дефицит НАДФ и электроны направляются другим путем, который провоцирует накопление большого количества АФК,-являющегося одной из причин интоксикации растений в целом.

При солевом стрессе, как у устойчивого, так и у чувствительного к соли генотипа наблюдается разный уровень восстановленности НАДФ.

Наибольший уровень восстановленности имеет место у чувствительного генотипа (клон-гибрид №25), и в норме и при солевом стрессе: Очевидно, при солевом стрессе происходит образование ограниченного количества НАДФ.

Это зависит от степени устойчивости растений к стрессовому воздействию. Таким образом, можно предполагать, что у солеустойчивого генотипа в хлоропластах имеется достаточное количество НАДФ, который участвует в обезвреживании электронов, исходящих из ФС I, а у солечув-ствительного генотипа в хлоропластах и митохондриях существует Дефицит НАДФ, способствующий накоплению большого количества АФК, особенно это происходит при стрессовых условиях.

■ Таблица 3

Величина отношения НАДФ-Н/НАДФ в условиях солевого стресса у разночувствительных генотипов растений-регенерантов картофеля

Генотипы Условия эксперимента Отношение 11АДФНЛ1АДФ % восстановленности НАДФ-Н

СолеустоНчивый клон-гибрид №1 контроль 037+0.03 100

1% N301 0.48+0.02 123

Солечувствнтельнып клон-гибрид №25 контроль 0.43+0.02 100

1% 0.69+0.04 160

Исходя из этого, мы предполагаем, что восстановленность НАДФ у солечувствительных генотипов может быть связана с интенсивностью накопления АФК. Поэтому содержание НАДФ и НАДФ.Н может отражать состояние метаболизма АФК в зависимости от времени действия стрессора на растения-регенеранты картофеля.

Активность антиоксидантов в разных оргаиеллах у разното-лерантных генотипов картофеля в условиях солевого стресса

Уровень АФК в клетках регулируется системой антиоксидантных ферментов, таких как супероксиддисмутаза (СОД), каталаза, пероксидаза, а также низкомолекулярными соединениями, одним из которых является

свободный пролин. Механизм действия пролина до настоящего времени остается малоизученным.

Увеличение концентрации пролина в растительных клетках при действии стрессовых факторов - известный факт, однако пролин выполняет не только осморегуляторную роль, но и способствует торможению окислительных процессов и снятию окислительного стресса (Шевякова, и др., 2009).

Пролин, способный образовывать устойчивый радикал, содержащий третичный углеродный атом, и в этом состоянии он принимает участие в прямом «гашении» свободно-радикальных реакций.

Как показали наши исследования (табл.4), содержание пролина у обоих генотипов достоверно различалось. Клон-гибрид №1 содержал больше пролина, чем клон-гибрид №25. При добавлении NaCl в водный раствор, различия в содержании пролина у генотипа, устойчивого к соли (клон-гибрид №1) увеличивалось в большей степени, чем у генотипа, неустойчивого к солевому стрессу (клон-гибрида №25). Следует также отметить, что на начальных этапах стресса (от 4 до 8 ч) у обоих генотипов картофеля солевой стресс вызывал плавное увеличение содержания пролина. Резкое повышение его содержания происходило при длительном воздействии стресса (24 ч). Особенно заметно увеличивалось его содержание у устойчивого к соли клон-гибрида №1- и значительно понижалось у чувствительного генотипа - клон-гибрида № 25.

Полученные данные свидетельствуют о том, что стресс, создаваемый в течение первых 8ч не достигал своей критической величины, т.е. растения не перестроили механизм адаптации к условиям стресса.

Таким образом, в условиях солевого стресса устойчивый генотип картофеля подвергался повреждению в меньшей степени, чем генотип, не обладающий устойчивостью к соли, что может быть следствием запуска механизмов адаптационных перестроек, связанных с накоплением пролина и других стресс-активных соединений, которые у разных по толерантности растений происходят по-разному и зависят от генотипа. В наших экспериментах таковым является клон-гибрид №1.

Полученные нами результаты несколько отличаются от данных других авторов (Raymond M.J., et al 1976), которые установили, что накопление МДА и пролина в условиях водного стресса было незначительным в эпикотилях гороха и не играло существенной роли в адаптационных процессах. Возможно, это связано с тем, что у растений гороха в проявлении устойчивости к стрессорам, важную роль играют другие низкомолекулярные соединения, такие как сахара и полиамины.

Действие экстремальных стрессовых факторов на растение заключается в развитии стресс-реакций.

Таблица 4

Содержание пролина у разнотолерантных генотипов картофеля в условиях стресса

Генотип Длительность воз- Пролнн, нмоль/г сырой массы

действия, ч Контроль 1.0 % ЫаС1

1 4 26.75 + 1.00 37.45+2.80

25 16.42+1.08 18.71+1.90

1 29.61 + 1.90 41.25+4.90

25 8 18.11 + 1.10 17.94+1.10

1 24 30.95+1.40 57.74+3.50

25 17.93+1.30 26.45+2.50

Один из механизмов стресса связан с нарушением динамического равновесия в системе прооксидантов и антиоксидантов, запускающих активацию процессов перекисного окисления липидов, и их активность может служить одним из косвенных показателей уровня устойчивости растения к стрессовым воздействиям.

Пластиды, как составная часть единой окислительной системы клетки, во многом могут определять активность окислительных ферментов.

Косвенным подтверждением может служить низкий уровень содержание хлорофиллов, особенно хлорофилла "Ь", у устойчивого к солевому стрессу генотипа картофеля. В следующих экспериментах мы изучали содержание фотосинтетических пигментов у разнотолерантных генотипов при солевом стрессе.

Таблица 5

Содержание хлорофилла у разнотолерантных генотипов картофеля в условиях солевого стресса (мг/г сырой массы)

Генотип Варианты Хлорофилл а Хлорофилл Ь Сумма хл.(а+Ь) Отношение хл. а/Ь Каротн-поды

N2 1

Контроль 2.42*0.12 1.22*0 02 3 6410.17 2.10*0.04 2.03*0.04

№С1 2.00*0.11 0.70*0.04 2.70*0.16 2.86*0.15 1.44±0.03

№25 Контроль 2.67*0.05 2.03±0.!4 4.70*0 19 2.58*0.16 2.00*0.04

№С1 2.35*0.12 0.55*0.01 2.90*0.06 1 52*0.03 0.57*0.02

Как показали наши исследования, генотипы отличались по содержанию хлорофилла (табл.5). Причем содержание хлорофилла у растений-регенерантов клон-гибрида №25 было значительно выше, чем у клон-гибрида №1. Следует отметить, что содержание хлорбфилл'а снижалось в условиях солевого стресса, независимо от степени устойчивости гибридов к№С1.

В условиях солевого стресса как у устойчивого, так и неустойчивого генотипов содержание хлорофилла а снижалось в меньшей степени, чем хлорофилла Ь. Содержание каротиноидов в условиях стресса у толерантного к засолению генотипа картофеля (клон-гибрид 1) было выше, чем у клон-гибрида №25, что согласуется с результатами других авторов (Dajic, 2006) об участии каротиноидов в «гашение» АФК.

Супероксиддисмутаза (СОД) является одним из ключевых компонентов системы защиты клеток и тканей от окислительной деструкции. (Бараненко, 2006), участвует в первой линии защиты клеток от образования 02" и катализирует реакцию дисмутации супероксид-радикала в хло-ропластах, митохондриях, перексисомах, и цитоплазме (Mittler, 2002; Вей Чи, 2006). В этой связи, нами была определена активность СОД в разных органеллах клетки у разиотолерантных генотипов картофеля.

Как видно из представленных в табл.6 данных активность СОД в хлоропласта* опытного и контрольного варианта в два раза выше, чем активность фермента в митохондриях. Активность СОД цитоплазмы очень низкая, по сравнению с хлоропластным и митохондриальным ферментом. В условиях солевого стресса активность СОД в хлоропластах резко усиливалась у чувствительных растений (клон-гибрид №25) по сравнению с устойчивыми (клон-гибрид №1). Активность митохондриальной и хлоро-пластной СОД у Чувствительного генотипа растений картофеля, как в контрольном варианте, так и в опытном (в условиях солевого стресса) существенно ниже, чем активность у толерантных к соли растений.

Таблица 6.

Активность СОД в разных органеллах клетки растений у разных по устойчивости к солевому стрессу генотипов картофеля

(ед. активности /г сырой массы)

Генотип Вариант В хлоропластах В митохондриях В иито-лла1ме

Клон-гнбрид №1 Контроль 89.1+3.3 43.6+1.8 18.0+1.9

Опыт (1% NaCI) 177.7+8.2 179.4+7.2 55.0+2.1

Клон-гибрид №25 Контроль 53.5+2.5 31.2+1.9 16.9+1.1

Опыт (1% NaCI) 144.8+6.2 127.6+4.4 54.6+1.9

Если у клон-гибрида №1 в нормальных условиях активность СОД составляет 89 ед. активности, то у чувствительного к соли клон-гибрида №25, она примерно в 1.5 раза меньше и составляет 53.5 ед. активности. При стрессе у этого генотипа активность СОД увеличилась в три раза, а у толерантного только в два раза.

Активность цитоплазматического фермента в контрольном варианте составляет 18.0 и 16.9 ед. активности, а в опытном варианте - 55.0 и 54.6 ед. активности у клон-гибридов №1 и № 25 соответственно.

Это говорит о том, что хлоропласты толерантных растений характеризовались меньшей степенью окисленности, чем хлоропласты чувствительных растений.

Одним из важных объяснений высокой активности СОД у толерантных к солевому стрессу генотипов по сравнению с чувствительными генотипами, может быть связанно с наличием пула фермента в клетке или с экспрессией генов в условиях стресса.

Использование антибиотиков, специфически блокирующих трансляционный процесс на уровне цитоплазматической рибосомы (80S), показало, что гены экспрессируюшие СОД находятся в ядерном гене и транслируются в цитоплазме с участием 80S рибосом (Алиев, 1985).

Таблица 7

Действие цнклогекснмида (5мг/л) на активность СОД (ед. активности/г.сырой массы) в хлоропластах

Генотип Вариант Длительность воздействия, ч

2 4 12 24 48

Клон-гнбрнд №1 Контроль 28.8*1.5 27.9*1.8 28.9*1.8 27.7*1.9 28.1*1.3

Опыт 28.6*1.6 28.8±1.6 28.6*1.2 18.8*1.1 3.1*0.6

Клон- гибрид №25 Контроль 22.2*1.1 23.3*1.3 20.4*0.9 23.1*1.4 23.3*1.2

Опыт 23.1*1.3 22.9*1.1 16.6*1.1 05.55*0.4 2.2*0.3

Как показали наши исследования, длительное выдерживание растений в среде, содержащей циклогексимид (5мг/л) приводит к снижению активности СОД у толерантного генотипа (клон-гнбрид №1) на позднем периоде блокады трансляции (после 12 ч), а у чувствительного генотипа (клон-гибрид №25) - сразу после 4 ч (табл. 7).

Таким образом, полученные результаты указывают на то, что у устойчивого к засолению генотипа имеется предсинтезированный пул СОД, способный обезвреживать АФК, образующиеся в результате стрес-сорного воздействия в первые часы воздействия.

Равновесие системы проокснданты-антноксиданты

Одним из возможных нарушений равновесия прооксиданты-антиоксиданты в сторону оксидантов при воздействии стрессорных факторов является усиление свободнорадикапьных процессов и активность перекисного окисления лнпидов (ПОЛ). Очевидно, равновесие системы прооксиданты<-»антиоксиданты в клетках растений зависит от степени устойчивости, которое запрограммировано в генотипе. В связи с этим, анализ системы проокс1щанты*-»антиоксиданты у разночувствительных

генотипов картофеля является важным шагом в изучении механизма устойчивости растений к стрессорным воздействиям. В этой связи нами проведено изучение процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) и активности антиоксидантного фермента СОД в хлоропластах картофеля как возможного ответа на действие различной степени засоления и засухи.

Данные табл. 8. показывают, что солевой стресс способствовал повышению содержания ПОЛ в хлоропластах у изученных генотипов. Наблюдалась прямая зависимость активации ПОЛ от концентрации хлористого натрия в среде выращивания растений. Селективная среда, вызывающая затруднение поступления воды, полиэтиленгликоль (ПЭГ), способствовала повышению активации ПОЛ в хлоропластах.

Следует отметить, что уровень активации ПОЛ связан с устойчивостью генотипа к солевому стрессу.

Таблица 8

Содержание МДА в хлоропластах разночувствительных генотипов растений картофеля (через сутки солевого стресса)

Варианты МДА мкмоль/г сырой массы Процент астивации, %

Солеустойчивый генотип клон-гибрид №1

Контроль 26.4+2.1 100

Опыт: +0.5% ЫаС1 22.7+2.7 86

+1.0%1МаС1 30.8+1.8 116

+2.0% ЫаС1 36.2+2.3 127

+ 12% ПЭГ 32.6+1.8 123

Солечувствительный генотип (сорт Жуковский ранний)

Контроль 32.3+2.2 100

Опыт: +0.5% N301 31.6+2.6 98

+1.0% ЫаС1 46.5+3.6 143

+2.0% ЫаС1 59.4+4.4 184

+12% ПЭГ 45.1+2.8 140

Так, активация ПОЛ у солеустойчивого генотипа (клон-гибрид №1), примерно, в 1.5-2 раза ниже, чем у чувствительного к соли генотипа (сорт Жуковский ранний). Такие же результаты получены в присутствии в среде выращивания растений-регенерантов ПЭГ, т.е. в условиях имитирующих засуху, но активация ПОЛ при засухе несколько ниже, чем при солевом стрессе.

Возможно, что активация ПОЛ в хлоропластах при стрессе связана, прежде всего, с нарушением функционирования фотосистемы I при фотосинтезе, поскольку, именно в этой фотосистеме наиболее интенсивно идет образование активного кислорода (0"2). По-видимому, нарушения, проис-

ходящие в хлоропластах в результате накопления при стрессе ПОЛ являются одними из пусковых механизмов окислительной системы клетки.

Данные, представленные в табл. 9. показывают, что повышение активности супероксиддисмутазы (СОД) в условиях стресса (соль, засуха) также является генотипическим признаком. Так, активность СОД у соле-устойчивого генотипа повышалась примерно в два раза при увеличении концентрации NaCl от 0,5 к 2% и на 318% от контрольного уровня при максимальном уровне засоления. Активность СОД у чувствительного к соли генотипа (сорт Жуковский ранний) была ниже, чем у клон-гибрида №1 в контрольном и опытном вариантах. Процент активации СОД у этого генотипа составлял 161% от контроля при 2% концентрации NaCl. Процент активации СОД при действии ПЭГ на разночуствительные гибриды картофеля также отличался и был выше почти в два раза у солеустойчиво-го клон-гибрида №1, чем у сорта Жуковский ранний.

Исследования показали, что активность СОД, участвующей в «гашении» 02\ препятствует активации ПОЛ в условиях стресса у солечувстви-тельного генотипа в меньшей степени, чем у солеустойчивого. Солеустой-чивый генотип, как было указано выше, имеет в клетках достаточное количество предсинтезированной формы СОД или происходит усиленный синтез этого фермента de novo (Samato, et al., 1995; Алиев, 2012.).

Таблица 9

Активность СОД у разночувствительных генотипов растений картофеля (через сутки солевого стресса)

Варианты Ел. активности/ г сырой массы Процент активации, %

Солеустойчнвый генотип (клон-гибрид Л"»1)

Контроль 3.8±0.3 100

Опыт: +0.5% NaCl 6.2±0.2 163

+ 1.0% NaCl 7.9±0.6 207

+2.0% NaCl 12.1±0.9 318

+ 12% ПЭГ 8.6±0.6 226

Солсчувствительный генотип (сорт Жуковский ранннй)

Контроль 3.6±0.3 100

Опыт: +0.5% NaCl 4.1±0.2 113

+ 1.0% NaCl 4.3±0.5 119

+2.0% NaCl 5.8±0.8 161

+ 12% ПЭГ 4.4±0.5 122

Наблюдаемое смешение прооксидантно-антиоксидантного равновесия является фактом, указывающим на возможную роль продуктов пере-кисного окисления липидов в качестве первичных медиаторов при солевом стрессе и засухе, очевидно, переключающих геном на экспрессию но-

17

вых транскриптомов, обеспечивающих активацию СОД и других антиок-сидантных ферментов (пероксидазы, катапазы и др.), защищающих клетку от стрессорных воздействий.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что стрессорные воздействия существенно влияют на равновесие ПОЛ и СОД в хлоропластах, вызывая активацию ПОЛ и СОД в противоположном направлении, и, этот процесс имеет генетически закрепленный признак. У солеустойчивого генотипа равновесие прооксиданты-антиоксиданты в хлоропластах картофеля смещается в сторону антиоксидантов, а у соле-чувствительного генотипа в сторону прооксидантов.

Итак, на основании полученных данных можно предположить возможность существования на молекулярном уровне феномена, связанного с разноуровневой регуляторной системой в условиях стрессорного воздействия. У устойчивых генотипов стрессорное равновесие смещается в сторону активации антиоксидантной системы регуляции, а у чувствительных в сторону прооксидантов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Как известно засоление является одним из неблагоприятных факторов окружающей среды, которое приводит к снижению продуктивности культурных растений, особенно в регионах с засушливым и частично засушливым климатом. Таджикистан является интраконтинентальной страной с характерным засушливым климатом и частично, высоким содержанием солей в почве. Высокие концентрации солей приводят к ингибированию ростовых процессов, подавлению физиологических и биохимических функций клетки и даже к гибели растений.

Торможение ряда физиологических и биохимических процессов в условиях засоления сопровождается генерацией активных форм кислорода (АФК) и развитием окислительного стресса.

Постоянное присутствие АФК в клетках делает необходимым непрерывное функционирование систем антиоксидантной зашиты растений.

В наших экспериментах солевой стресс по-разному оказывал влияние на активность антиоксидантных ферментов в разных органеллах клетки (хлоропласта, митохондрий и цитоплазмами). Особенно наблюдалось усиление активации СОД при высоких концентрациях ЫаС1 в среде культивирования растений. Но, у солеустойчивого генотипа при низких концентрациях ЫаС1 активация СОД несколько замедляется при одновременном уменьшении продуктов ПОЛ, а у чувствительного генотипа, наоборот, усиливается активация прооксидантов (О 2, Н202). Это, видимо, связанно с ограниченным пулом НАДФ в клетках чувствительных к стрес-сорным факторам генотипов картофеля. В наших опытах сверхэкспрессия НАДФ-оксидоредуктазы приводила к дефициту НАДФ у солечувстви-тельного генотипа картофеля, о чем указывает соотношение НАДФ/НАДФ-Н. Это дает основание высказывать мысль о том, что элек-

троны направляются по другим путям, способствующим образованию АФК.

Такое явление происходит тогда, когда акцепторная сторона ФС1 полностью восстановлена при накоплении НАДФ-Н, что может вызывать переход Р700 в триплетное состояние, в таком состоянии хлорофилл может взаимодействовать с кислородом (02) с образованием токсичного синглет-ного кислорода, вызывающего повреждение мембран хлоропластов при стрессовых воздействиях (засоление, засухе и др), что особенно усиливается у чувствительных к стрессу растений, по сравнению с устойчивыми генотипами картофеля.

Судьба электронов, исходящих из ФС I при стрессе может быть следующей: электроны из ФС I акцептируются ферредоксином с помощью фермента Фд-НАДФ-оксндоредуктазы. При ограничении НАДФ освобожденные электроны, образуют АФК, а накопление НАДФ Н может вызвать переход Р700 в триплетное состояние, который взаимодействуя с кислородом (02) образовывает токсичный синглетный кислород, вызывающий повреждение клеточных мембран.

В «гашении» АФК особую роль играет пролин и другие низкомолекулярные соединения. Пролин обладает «антистрессорными» свойствами и активно синтезируется в клетках растений в ответ на действие различных стрессоров (засуха, засоление, тепло, холод и др.). Пролин обладает уникальными свойствами в растворенном виде, даже в высоких концентрациях не нарушать структуру белков и других макромолекул в клетках, поэтому пролин является уникальным природным осмопротектором. Количество пролина в растениях определяется багтансом его синтеза и распада, поэтому увеличение его содержания в растениях или усиление его синтеза повышает стрессустойчивость растений. Возможно, у чувствительных генотипов преобладает распад пролина в результате активации пролиндегидрогеназы, а у стрессустойчивых генотипов, наоборот синтез преобладает над его распадом, что указывает на повышенную адаптационную устойчивость растений к стрессорным природным факторам без потери продуктивности.

Пластиды, как составные части окислительной системы клетки могут определять активность антиоксидантных ферментов. Нами было показано, что при воздействии солевого стресса содержание фотосинтетических пигментов у разнотолерантных генотипов достоверно отличалось.

Содержание хлорофилла снижалось в условиях солевого стресса у обоих генотипов, независимо от степени устойчивости к ЫаС1, но степень повреждения у устойчивого генотипа была меньше, чем у генотипа, не обладающего устойчивостью к солевому стрессу. При воздействии солевого стресса содержание хлорофилла а снижалось в меньшей степени, чем хлорофилла Ь. Что касаегся содержания каротиновдов, то у устойчивого генотипа в условиях стресса оно было выше, чем у неустойчивого. Таким об-

разом нами были подтверждены многочисленные данные об участии каро-тиноидов в «гашении» АФК.

Изучение активности СОД в разных органеллах клетки у разнотоле-рантных генотипов картофеля показало, что активность СОД в хлоропла-стах резко усиливалась у чувствительных растений по сравнению с устойчивыми. Активность СОД цитоплазмы была значительно ниже, по сравнению с активностью СОД в хлоропластах и митохондриях. Это говорит о том, что хлоропласты толерантных растений характеризовались меньшей степенью окисленности, чем хлоропласты чувствительных растений.

Одним из важных объяснений высокой активности СОД у толерантных к солевому стрессу генотипов по сравнению с чувствительными генотипами, может быть связанно с наличием пула фермента в клетке или с моментальной экспрессией генов в условиях стресса.

Действие циклогексимида -ингибитора трансляции на уровне 80S рибосом не одинаково оказывает влияние на активность СОД в хлоропластах и митохондриях. Наши исследование показали, что при длительном выдерживании растений с циклогексимидом у толерантного генотипа падение активности СОД наблюдается на позднем периоде блокады трансляции, а у чувствительного генотипа на начальном этапе. Это указывает на существование предсинтезированных форм СОД у устойчивых генотипов.

Эти результаты наводят на мысль о том, что у толерантных растений существует определенное депо СОД, способствующее обезвреживанию АФК на срок воздействия стресса, а далее подключается активация генов этого фермента, локализованных в ядре. По-видимому, чувствительные растения имеют незначительный пул предсинтезрованных СОД, которые не в полной мере обеспечивают обезвреживание АФК, даже на первом этапе воздействия стресса, что является причиной преждевременного запуска цепи реакции перекисного окисления липидов.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что при солевом стрессе происходит накопление активных форм кислорода, приводящее к увеличению содержания малонового диальдегида в зависимости от генотипа. Стрессорные воздействия существенно влияют на равновесие ПОЛ и СОД в хлоропластах, вызывая активацию ПОЛ и СОД в противоположном направлении.

2. Показано что, у солеустойчивого генотипа равновесие прооксиданты-антиоксиданты в хлоропластах картофеля смещается в сторону анти-оксидантов, а у солечувствительного генотипа в сторону прооксидан-тов.

3. Установлено, что уровень активации ПОЛ связан с устойчивостью генотипа к солевому стрессу и засухе. Так как, наблюдалась прямая зависимость активации ПОЛ от концентрации хлористого натрия и по-лиэтиленгликоля (ПЭГ) in vitro. Активность СОД, участвующего в «гашении» АФК, препятствует активации ПОЛ в условиях стресса у

солечувствительного генотипа в меньшей степени, чем у солеустойчи-вого.

4. Установлено, что при длительном выдерживании растений в среде, содержащей циклогексимид снижение активности СОД у устойчивого генотипа наблюдается на позднем периоде блокады трансляции синтеза белков на цитоплазматических рибосомах, а у чувствительного генотипа уже в первые часы воздействия, так как, солеустойчивый генотип имеет достаточное количество предсинтезированной формы СОД и происходит усиленный синтез этого фермента de novo.

5. Показано, что в условиях солевого стресса, содержание хлорофилла а снижалось в меньшей степени, чем хлорофилла Ь, независимо от генотипа. Содержание каротиноидов у устойчивого клон-гибрида было выше, чем у неустойчивого, что свидетельствует об участии каротиноидов в «гашение» АФК.

6. Показано, что адаптация к солевому стрессу на уровне целого растения осуществляется путём значительного накопления пролина и НАДФ, регулирующих активацию АФК и перекисного окисления липидов (ПОЛ) в результате чего, образуется Н202 которые очевидно провоцируют активацию альтернативных путей «гашения» окислительного стресса.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Шукурова М.Х., Киёмова 3., Гадоев С., Назарова Н., Алиев К. 3 «Гормональная регуляция клубнеобразования у картофеля при различной длительности культивирования растений in vitro» Изв. АН РТ. Отд. биол. и мед. наук. 2011, №2 (175), стр. 42-50.

2. Киёмова З.С., Ватаншоева Н. А., Гадоев С., Азимов М. «Выживаемость гибридов картофеля в среде содержащей различные концентрации NaCl in vitro» Материалы научной конференции, посвященной 60-летю образования Академии наук Республики Таджикистан, Душанбе, 2011, стр. 51-52.

3. Киёмова З.С, Норкулов Н., Давлятназарова З.Б., Шукурова М.Х., Алиев К.А. «Накопление активных форм кислорода и перекиси водорода в разнотолерантных растениях картофеля». Известия АН РТ. Отд. биол. и мед. наук. 2012, №2, стр. 52-58.

4. Давлятназарова З.Б., Киёмова 3., Норкулов Н., Шукурова М., Алиев К. «Накопление активных форм кислорода и перекиси водорода в толерантных к NaCl растениях картофеля» Материалы научной конференции, посвященной 80-летию со дня рождения академика АН РТ Ю.С.Насырова «Фотосинтез и проблемы повышения продуктивности растений», Душанбе, 2012, стр. 27-28.

5. Алиев К., Назарова H.H., Норкулов Н.Х., Киёмова 3., Сабоиев И.А., Сапимов А.Ф. «Новый способ оздоровления посадочного материала картофеля от вирусов» Матералы научной конференции, посвященной

80-летию со дня рождения академика АН РТ Ю.С.Насырова «Фотосинтез и проблемы повышения продуктивности растений», Душанбе, 2012, стр. 9-14.

6. Давлятназарова З.Б., Норкулов Н., Киёмова 3., Гадоев С., Сабоиев И.А., Алиев У.К. «О физиологическом механизме устойчивости генотипов картофеля к солевому стрессу». Материалы научной конференции, посвященной 80-летию со дня рождения академика АН РТ Ю.С.Насырова «Фотосинтез и проблемы повышения продуктивности растений», Душанбе, 2012, стр. 28-29.

7. Азимов M.JL, Ватаншоева H.A., Киёмова З.С., Авгонова X. «Действие фитогормонов в регуляции водоудерживаюшей способности растений картофеля». Материалы республиканской научной конференции «Экологические проблемы и рациональное использование природных ресурсов». Душанбе, 2012, стр. 264-267

8. Азимов М.Л., Авгонова X., Киёмова 3., Ватаншоева Н. А., «Водо-удержывающая способность солеустойчивых гибридов». Материалы республиканской научной конференции «Экологические проблемы и рациональное использование природных ресурсов». Душанбе, 2012, стр. 267-268.

9. Давлятназарова З.Б., Киёмова 3., У.К., Шукурова М., Каспарова И.С., Алиев К. «Биохимические аспекты устойчивости разночувствительных генотипов картофеля к солевому стрессу». Известия АН РТ. Отд. биол. и мед. наук. 2012, №3, стр. 43-49.

10. Киёмова З.С., Ашуров С.Х., Гафурова М., Алиев У.К. «Особенности водообмена и продуктивности толерантных к стрессу генотипов картофеля». Материалы пятой Международной конференции «Экологические особенности биологического разнообразия». Хуханд, 2013.

11. З.С. Киёмова, З.Б. Давлятназарова, С.Х. Ашуров, К.А. Алиев «Активность супероксиддисмутазы у разнотолерантных растений-регенерантов картофеля в условиях солевого стресса». Известия АН РТ. Отд. биол. и мед. наук. 2013, №1, стр. 40-45.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Киёмова, Зарафо Суфижоновна, Душанбе

Институт ботаники, физиологии и генетики растений Академии наук республики Таджикистан На правах рукописи

УДК 581.132:1.141

04201 45317 7 КИЕМОВА ЗАРАФО СУФИЖОНОВНА

«БИОХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ АНТИОКСИДАНТНЫХ СИСТЕМ РАЗНОТОЛЕРАНТНЫХ К СОЛИ ГЕНОТИПОВ

КАРТОФЕЛЯ IN VITRO»

(03.01.04 - биохимия)

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: ведущий научный сотрудник института ботаники, физиологии и генетики растений АН РТ., к.б.н. Давлятназарова 3. Б.

Научный консультант: Заслуженный деятель науки и техники Таджикистан, член-корреспондент АН Республики Таджикистан, доктор биологических наук, профессор Алиев Курбон

ДУШАНБЕ - 2013

J

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ..............................4

ВВЕДЕНИЕ..................................................................................5

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.................................................9

1.1. Стресс и его воздействие на растения.....................................9

1.2. Активные формы кислорода и пути их образования...................13

1.3. Антиоксидантная система защиты растений............................15

1.4. Ферменты антиоксидантной системы защиты растений............20

1.5. Влияние стрессорных факторов на фермент супероксиддисмутазу (СОД, КФ 1.15.1.1).................................25

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.....................29

2.1. Краткая характеристика объекта исследований....................29

2.2. Оптимальные условия для произрастания картофеля...........30

2.3. Материалы и методы исследований...................................32

2.3.1. Скрининг in vitro в условиях солевого стресса....................33

2.3.2. Окислительный стресс.....................................................33

2.3.3. Определение содержания аскорбиновой кислоты..................33

2.3.4. Определение количественного содержания

малонового диальдегида...................................................................34

2.3.5. Определение активности супероксиддисмутазы.........................34

2.3.6. Определение содержания активной формы кислорода..........35

2.3.7. Определение относительного содержания воды....................35

2.3.8. Определение водного дефицита..........................................36

2.3.9. Определение содержания пролина.........................................36

2.3.10. Выделение и очистка хлоропластов и митохондрий..............37

2.3.11. Определение содержания перекиси водорода.......................37

2.3.12. Определение содержания НАДФ........................................38

2.3.13. Определение содержание хлорофилла................................38

2.3.14. Полевые опыты..............................................................38

2.3.15. Статистическая обработка данных.....................................39

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Отбор гибридов картофеля на устойчивость к №С1...................40

3.2. Накопление активных форм кислорода и перекиси

водорода в разнотолерантных растениях картофеля..................44

3.3. Содержание малонового диальдегида (МДА) у разнотолерантных к соли генотипов картофеля.........................51

3.4. Активность ферредоксин-НАДФ-оксидоредуктазы (Фд-НАДФ-ОР, КФ: 1.6)........................................................52

3.5. Роль пролина в проявлении устойчивости у растений картофеля............................................................................55

3.6. Содержание хлорофилла и каротиноидов у различных генотипов картофеля в условиях стресса..................................58

3.7. Активность СОД в органеллах клетки разнотолерантых

к соли генотипов картофеля..................................................59

3.8. Равновесие системы прооксиданты-антиоксиданты.................62

ГЛАВА 4. ИЗУЧЕНИЕ ВОДНОГО ДЕФИЦИТА РАЗНОЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ К СТРЕСС У ГЕНОТИПОВ

КАРТОФЕЛЯ...............................................................................69

ЗАКЛЮЧЕНИЯ...........................................................................78

ВЫВОДЫ...................................................................................76

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ..............................80

ПРИЛОЖЕНИЯ...........................................................................96

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ:

а- НУК - а-нафтилуксусную. кислоту; а-ТОФ - а токоферол; АОА - антиоксидантная активность; АОЗ - антиоксидантная защита; АФК - активные формы кислорода; ГП - глутатионпероксидаза; ИМК - индолил-3-масляная кислота КАТ- катал аза

МДА- малоновый диальдегид; МС - Мурасиге - Скуга;

НАДФ - никотинамидадениндинуклеотидфосфат; ПА - полиамин; ПО - пероксидаза;

ПОЛ - перекисное окисление липидов; СОД - супероксиддисмутаза;

Фд-НАДФ-ОР - ферредоксин-НАДФ-оксидоредуктаза

ЭТЦ - электрон-транспортная цепь

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Картофель является важнейшей сельскохозяйственной культурой в Таджикистане. Для получения новых сортов используются как традиционные методы селекции, так и биотехнологические подходы, роль которых значительно возросла в последние годы. Биотехнологические методы способствуют получению новых сортов, обеспечивающих не только повышение урожайности, но и устойчивость к различным факторам окружающей среды, таким как засуха, засоление и повышение температуры. Влияние этих факторов особенно усилилось в последние годы в связи с глобальным изменением климата (Алиев, 2012).

Одним из факторов, лимитирующих продуктивность культурных растений, является засоление почвы. Подсчитано, что количество засоленных почв с каждым годом возрастает и через 25-30 лет достигнет угрожающего уровня. Примерно 40% пахотных земель будут непригодными для сельскохозяйственного возделывания растений (ФАО, 2010).

Для изучения токсического влияния соли и механизмов толерантности используются клеточные культуры (Бабаева и др., 1968; Кулаева и др., 1997). При изучении механизмов устойчивости у выделенных in vitro солеустойчивых клеточных линий показано, что у ряда клонов не нарушалась способность к проникновению ионов соли и вместе с тем поддерживался осмотический градиент, необходимый для функционирования клетки. Клеточные механизмы выносливости к засолению являются сходными для культивируемых in vitro клеток и целых растений, поэтому селекция на клеточном уровне представляет реальную перспективу получения устойчивых к засолению форм растений. Механизмы адаптации к условиям засоления могут быть разными и до конца не изучены.

Получение растений с целью придания им устойчивости к стрессорным факторам основано на манипулировании экспрессии и активности основных

ферментов антиоксидантной системы растений, которые напрямую связаны с защитой клетки от супероксид - радикалов (Мерзляк, 1989).

Поэтому, возможности регулирования молекулярного и биохимического адаптационного потенциала, заложенного в генотипе растения, можно использовать для повышения толерантности растений к стрессовым факторам среды, что имеет фундаментальное и прикладное значение. Цель и задачи работы. Целью работы являлось изучение молекулярно-биохимических особенностей разноустойчивых к засолению генотипов картофеля, а такж^ их прооксидантные и антиоксидантные системы в условиях in vitro.

В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:

1. Определить активность прооксидантов (Н2О2, 02) у

разночувствительных к соли генотипов картофеля;

2. Определить активность супероксиддисмутазы (СОД, КФ 1.15.1.1) у разночувствительных к соли генотипов картофеля;

3. Определить содержание малонового диальдегида (МДА) при воздействии засоления;

4. Изучить роль антиоксидантных систем в повышении солеустойчивости генотипов картофеля;

5. Изучить прооксидантные и антиоксидантные системы в различных компартментах клетки у разночувствительных гибридов картофеля.

Научная новизна работы. Изучена и проанализирована продукция активных форм кислорода (АФК), малонового диальдегида (МДА) и активность антиоксидантного фермента супероксиддисмутазы (СОД) у растений-регенерантов картофеля, различающихся по устойчивости к солевому стрессу. Показано, что растения, устойчивые к засолению имеют

более эффективно работающие антиоксидантные системы, и способны переносить длительный окислительный стресс.

Изучены антиоксидантные системы в различных компартментах клетки у разночувствительных гибридов картофеля. Впервые показана роль хлоропластных антиоксидантных систем, имеющих прямую зависимость от активации СОД и окисленности НАДФ у растений картофеля, способствующих сверх продукции АФК.

Использование антибиотика циклогексимида, специфически блокирующего трансляционный процесс на уровне цитоплазматической рибосомы показало существование предсинтезированного пула СОД и интенсификацию синтеза этого фермента De novo за счет экспрессии существующий мРНК у устойчивого к соли генотипа растений картофеля, что не было выявлено у чувствительных растений.

Практическая значимость. Полученные экспериментальные результаты расширяют представления о молекулярных механизмах устойчивости растений к экстремальным природным стрессорам и их адаптации.

Активность СОД, а также других антиоксидантов можно использовать как тест признак для селекции сельскохозяйственных растений, обладающих высоким адаптационным потенциалом.

Отобраны клон-гибриды картофеля, обладающие высоким уровнем устойчивости и урожайности в условиях засоления.

Апробация результатов исследования.

Диссертация подготовлена и обсуждена в Институте ботаники, физиологии и генетики растений Академии наук Республики Таджикистан и на биологическом факультете Таджикского национального университета. Ее основные положения, выводы и рекомендации были доложены на конференциях и семинарах: на международном семинаре «Обеспечение улучшения продовольствия и

увеличение доходов в Юго-Западной и Центральной Азии (SWCA) через сорта картофеля с улучшенной устойчивостью к абиотическому стрессу» Индия (Гуджарат), 29-30 ноября 2010 г.; на VI Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» Москва (Россия), 21-25 марта 2011 г.; на республиканской научной конференции посвященной 60-летию образования Академии наук Республики Таджикистан «Физиология растений и проблемы развития растениеводства в Таджикистане» Душанбе, 2011 г.; на международной научной конференции памяти академика Ю.С. Насырова «Фотосинтез и проблемы повышения продуктивности растений». Душанбе, 2012 г.; на республиканской научной конференции «Экологические проблемы и рациональное использование природных ресурсов» Душанбе, 2012 г.; на V международной конференции «Экологические особенности биологического разнообразия» Худжанд, 2013 г.; на международном семинаре «Улучшение сортов картофеля и технологий управления водными ресурсами для улучшения эффективности водопользования, устойчивости к внешним воздействиям, рентабельность и производительность мелких земельных хозяйств, предрасположенных к стрессовым условиям Центральной Азии». Ташкент (Узбекистан) 3-5 сентября 2013 г.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 11 работ.

Структура и объем работы

Диссертационная работа изложена на 100 страницах машинописного текста включающего в себя введение, 4 главы, заключение, списка использованной литературы и приложений. Работа также содержит 7 рисунков и 13 таблиц. Список цитируемой литературы включает 150 наименований, из которых 92 на иностранных языках.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Стресс и его воздействие на растения

Растительные клетки и организм в целом способны реагировать на воздействия факторов внешней среды соответствующим образом, что является необходимым для приспособления к условиям окружающей среды. Обмен веществ растений — это сложная система физиолого-биохимических процессов, связанных между собой и зависящих от внешних факторов окружающей среды (Пахомова, Чернов, 1996; Шакирова, 2001; Титов, Акимова, и др., 2006; Таланова, 2009). Очевидно, что негативные факторы способны воздействовать на четко организованную систему, подавляя метаболизм и даже разрушить нормальный (оптимальный) физиолого-биохимический процесс. Способность приспосабливаться к разнообразным стрессовым факторам внешней среды и сохранять свой жизненный потенциал является одним из условий существования растений и это зависит о защитных механизмов и возможности их реализации (Чиркова, 2002; Ипатова, 2005; Мелехов, 1985; Тарчевский, 2000; Dixon, Palva, 1996). Способность растения переносить экстремальные воздействия факторов окружающих среды и давать потомство называется устойчивостью или стресс-толерантностью. Способность растений адаптироваться в соответствии с изменяющимися условиями зависит от многих факторов. Однако длительность времени ответа определенного организма на неблагоприятные факторы, играет ключевую роль. Чем больше времени для ответа, тем более разнообразна способность адаптации к стрессорам (Веселовский и др., 2005). При неожиданном действии экстремальных факторов, ответ должен быть немедленным, и в соответствии с этим различают три способа адаптации: филогенетические адаптации - возникшие в ходе эволюционного процесса на основе генетических мутации и

передающиеся по наследству; фенотипические адаптации (акклимация) -происходят в течение жизни организма и не является наследственной, но осуществляется на основе тех возможностей, которые заложены в генотипе; срочная адаптация - это образование и функционирование шоковых защитных систем, обеспечивающих кратковременное выживание при неблагоприятных воздействиях окружающей среды. Срочная адаптация создает условия для формирования более надежных долговременных механизмов адаптации (Кузнецов Вл., Дмитриева, 2006; Бабаджанова, Эсаналиева, Алиев, 2011; Ермакова, 2005).

Несмотря на множество путей адаптации растений их можно условно разделить на два различных типа: активная адаптация - индукция синтеза ферментов с новыми свойствами или новых белков, обеспечивающих защиту клетки и протекание метаболизма в ранее непригодных для жизни условиях, то есть формирование защитных механизмов, которые приводят к такой адаптации, что расширяет границы жизни растений.

Пассивная адаптация - в отличие от животных, растения не умеют прятаться от повреждающего действия стрессора, поэтому они должны сосуществовать или уметь уклоняться от воздействия экстремальных условий среды. К пассивным адаптациям относятся: способность растений изолировать тяжелые металлы в стареющих органах, тканях, или в вакуолях, переход в состояние покоя, то есть сосуществовать с ними. Сформировать семена до наступления неблагоприятных условий является настоящим «уходом» от действующего стрессора. Однако растения одновременно используют как активные, так и пассивные пути адаптации. Например, в ответ на повышение температуры воздуха растение понижая температуру тканей за счет транспирации «уходит» от действующего фактора, и одновременно синтезирует белки теплового шока, активно защищает клеточный метаболизм от высокой температуры, (Кузнецов Вл., 2005). Толерантность и избегание создают устойчивость к стрессу.

Для объяснений состояния организма возникшего в ответ на экстремальные воздействия окружающей среды использовали слово «Стресс», которое было предложено Гансом Селье в 1936 г. (от англ. stress — напряжение). Понятие стресс перенесено в физиологию растений из медицины и существует направление - стресс-физиология растений и комплекс метаболитических перестроек у растений во время стресса называют фитострессом (Генкель, 1982).

Внешние факторы, воздействующие на биологические системы и вызывающие стресс, называют стрессорами. Факторы, вызывающие стресс у растений делят на три группы (Полевой, 1989):

1. Физические

2. Химические

3. Биологические

К физическим стрессорам относят: механические воздействия, избыточная или недостаточная влажность, освещенность, температура, радиоактивные излучения. Химическими считаются соли, ксенобиотики, газы. К биологическим неблагоприятным факторам относят: цветение, созревание плодов, негативное влияние животных, голодание и возбудителей болезней.

Согласно концепции о стрессе, сформированной Г Селье, воздействие неблагоприятных факторов в организме индуцирует неспецифические реакции, сопровождающиеся перестройкой защитных систем во времени -генерализованный адаптационный синдром, в котором выделяются три стадии: стадия тревоги — первоначальная реакция, сопровождающаяся процессами катаболизма различных соединений (снижение активности синтетических процессов, деградация белоксинтезирующего аппарата, катаболизм биополимеров), которую называют по разному - стадией повреждения (Удовенко, 1977), реакцией защитного торможения метаболизма, первичной стрессовой реакцией, фазой физиологической депрессии (Пахомова, 1995), стадией активного состояния (Гордон, 1992),

индуктивной фазой (Пахомова, Чернов, 1996). В стадии адаптации происходит синтез стрессовых белков, повышение синтеза и активация гидролитических ферментов и так далее. В стадии истощения, в результате действия различных агентов разрушаются клеточные структуры. Наблюдается деструкция ядра, в хлоропластах происходит распад гран, в митохондриях уменьшается количество крист. Появляются дополнительные вакуо�