Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Некоторые биохимические особенности устойчивых к NaCl растений картофеля in vitro и in vivo

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Некоторые биохимические особенности устойчивых к NaCl растений картофеля in vitro и in vivo"

На правах рукописи

АЗИМОВ МУРОДАЛИ ЛАКАЙЕВИЧ

НЕКОТОРЫЕ БИОХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ УСТОЙЧИВЫХ К NACL РАСТЕНИЙ КАРТОФЕЛЯ IN VITRO И IN VIVO

03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

3 О МАЙ 2013

005060742

Душаибе-2013

005060742

Работа выполнена в Институте ботаники, физиологии и генетики растений Академии наук Республики Таджикистан

кандидат биологических наук Давлятназарова Зульфня Буриевна член-корреспондент АН Республики Таджикистан, доктор биологических наук, профессор

Алиев Курбон Алневнч

Доктор биологических наук, профессор кафедры физиологии растений, Таджикского национального университета Бабаджанова Мухаббат Абдурахмановна кандидат биологических наук, доцент кафедры биохимии Таджикского

государственного медицинского университета им. Абуали ибн Сино Гулов Махмали Кадырович

Ведущая организация: Таджикский аграрный университет

им. Ш. Шотемура

Защита диссертации состоится « » ДЬг^т^Е-т!^ 20 /3 г. в_Д^^часов на заседании Диссертационного совета Д 737.004.05 при Таджикском национальном университете по адресу: 734025, Республика Таджикистан, г. Душанбе, пр. Рудаки, 17.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Таджикского национального университета.

Автореферат разослан «

Научный руководитель: Научный консультант:

Официальные оппонен ты:

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук,

доцент ^ Хамрабаева З.М.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Картофель - важнейшай' сельскохозяйственная культура, которая подвержена воздействию различных стрессовых факторов, таких как засуха, высокие температуры и засоление.' При этом засоление оказывает наиболее повреждающее действие. Вредное действие засоления имеет комплексный характер и обусловлено как нарушением осмотического баланса клетки, что негативно сказывается на водном режиме растений, так и прямым токсическим влиянием ионов (Na+, SO4"2, CI", СО3'2) на физиологические и биохимические процессы в клетке, таким как увеличение концентрации вредных метаболитов, следствием чего является дезорганизация мембран, подавление синтеза белков, нуклеиновых кислот, накопление токсогенных ионов и, инициация окислительного стресса (Строганов, 1973; Zhu, 2001; Кузнецов, Дмитриева, 2006).

Для изучения токсического влияния соли и клеточных механизмов толерантности было предложено использовать клеточные культуры (Бап-конин и др., 1989; Кулаева и др., 1997). При изучении механизмов устойчивости у выделенных in vitro солеустойчивых клеточных линий было показано, что у ряда клонов не нарушена способность к проникновению ионов соли и, вместе с тем, поддерживается осмотический градиент, необходимый для функционирования клетки. Эти линии аккумулировали значительно более высокие концентрации ионов, чем чувствительные линии и, более того, для нормального роста нуждались в повышенном содержании соли в среде. Механизмы выносливости, благодаря которым растения адаптируются к условиям засоления, могут быть разными и до конца не изучены. Получение растений с целью придания им устойчивости к стрес-сорным факторам основано на манипулировании экспрессии и активности основных ферментов антиоксидантной системы растений, которые напрямую связаны с зашитой клетки от супероксид-радикалов (Мерзляк, 2005).

В связи с этим в последние годы были предприняты попытки, направленные на повышение солеустойчивости важнейших сельскохозяйственных культур с использованием подходов культуры клеток и традиционной селекции (Лян и др., 2009).

Несмотря на актуальность проблемы, к началу наших исследований отсутствовали их сведения об использовании гибридов картофеля на солё-устойчивость в условиях in vitro. Это побудило нас обратиться к методам in vitro, как реальному подходу отбора генотипов картофеля на солеустой-чивость, так как картофель по признаку устойчивости к засолению почвы варьирует в широких диапазонах в зависимости от сорта (Bilski 'et'aj.y 1988; Sabbah, Tal., 1990; Бургутин и др. 1996). ' ' ;

В настоящей работе представлены экспериментальные данные, свидетельствующие о возможности отбора на устойчивость к засолению разнообразных гибридов картофеля in vitro и некоторые физиолого-биохимические показатели разнотолерантных генотипов, что'актуально и является перспективным в решении научно-практических задач.

3

Цель работы. Отбор солеустойчивых гибридов картофеля в условиях in vitro и изучение некоторых физиолого-биохимических показателей устойчивых и неустойчивых к солевому стрессу генотипов и их испытание в полевых условиях.

Задачи работы. В соответствии с этим были поставлены следующие задачи: -

1. Микроклональное размножение гибридов картофеля в культуре in vitro;

2. Скрининг гибридов на устойчивость к хлористому натрию in vitro; '

3. Изучение водообмена, как элемента адаптации к солевому стрессу in vivo;

4. Изучение активности СОД (супероксиддисмутаза) и образование МДА (малоновый диапьдегид) при солевом стрессе;

5. Изучение активности каталазы;

6. Изучение нёкоторых биохимических показателей и продуктивности устойчивых гибридов картофеля.

Научная Новизна. Впервые в системе in vitro выявлен клон-гибрид, обладающий устойчивостью к высокой концентрации хлористого натрия. Показано, что при многократном культивировании устойчивые гибриды сохраняли повышенную толерантность к солевому стрессу.

Полученные путем скрининга гибриды картофеля отличались по активности СОД и содержанию МДА, содержанию воды, водоудерживаю-щеи способности и продуктивности, что дает возможность использования селективной системы с хлористым натрием для отбора толерантных к солевому стресбу генотипов картофеля.

Показано, что биохимическая устойчивость растений связана, прежде всего, с активацией фермента супероксиддисмутазы, обезвреживающей супероксидрадикал кислорода. Выявлено, что активация супероксиддис-MyT¿3bi при солевом стрессе и засухе выше в 2-3 раза у устойчивого генотипа, чем у неустойчивого.

Показано, что нарушение водообмена связано с гормональным дисбалансом, возникающим при скрещивании отдаленных генотипов картофеля. Проведение фитогормональной коррекции на уровне целого растения восстанавливает нормальный ход биохимических процессов и, следо-вітельно, усиливает адаптационные возможности растений картофеля при стрессе.

Практическая значимость. Оценка большого набора гибридов картофеля 6 условиях повышенной концентрации соли (NaCI) в условиях in vitro позволила выделить отдельные генотипы ¿'высокой устойчивостью и продуктивностью. На основе физиологических и биохимических показателей в сочетании с методами биотехнологии удалось выделить новый оригийальный, высокопродуктивный гибрид картофеля, обладающий высокой устойчивостью к условиям солевого стресса. Гибрид №11 переДан как новый сорт Фанзабад в Государственную комиссию по сортоиспыта-

4

нию сельскохозяйственных культур и охране сорта при Министерстве сельского хозяйства Республики Таджикистан.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены (или представлены) на: .

• международном семинаре «Улучшение продовольствия и безопасности доходов в Юго-Западной и Центральной Азии через сорта картофеля с улучшенной устойчивостью к абиотическим стрессам», Шимла (Индия), 2008; ; ,

• научной конференции «Достижения современной физиологии растений: теоретические и прикладные аспекты», Душанбе, 2008;

« республиканском семинаре «Гузориши сектори тухмпарварии Точи-кистон ба муносибатхои бозоргонн», Душанбе, 2008;

• конференции-молодых ученых Таджикского национального Университета, Душанбе 2006-2009 гг.; •

• международном семинаре «Улучшение продовольствия и безопасности доходов в Юго-Западной и Центральной Азии через сорта картофеля с улучшенной устойчивостью к абиотическим стрессам», Ташкент (Узбекистан), 2009

• научной конференции, посвященной 80-летию со дня рождения академика АН Республики Таджикистан Ю.С.Насырова «Фотосинтез и проблемы повышения продуктивности растений» (г.Душанбе, 12 октября 2012г).

Публикации. По теме диссертации было опубликовано 14 работ, из них 3 статьи и 11 тезисов докладов.

Структура и объем диссертации. Диссертация написана на русском языке, на 112 страницах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы, 5 глав, собственных исследований, выводов, списка литературы, иллюстрирована 18 таблицами и 17 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал н методы исследований В качестве объектов исследования использовались гибриды картофеля (Solanum tuberosum L.), полученные из международного центра картофеля (CIP, Перу) в 2005 году. Всего было получено 27 гибридов. Происхождение этих гибридов представлено в таблице 1. Из представленных гибридов нами были выбраны наиболее устойчивые (№1, 9, 24) и наиболее неустойчивые(№20, 22) кNaCl гибриды. ::■■■■!.■■:■;,■.■>■.

Мнкроразмноженпе н поддержание клонов in vitro: Гибриды картофеля размножали микрочеренкованием в стерильных условиях с дальнейшей посадкой в среду MC (Mürashige, Skobg, 1962), содержащей сахарозу - 20г/л; агар - 6.0 г/л; витамины; а-нафтйлуксусную кислоту (а-НУК) - 2 мг/'л, индолил-3-масляная кислота (ИМК) - 1 МГ/л (pH 5.7-5.8) согласно рекомендации Института сельскохозяистйенной биотехнологии РАСХН (Россия). Пробирочные растения выращивали при тем-

пературе 22-23°С, в течении 4-5 недель, при освещенности 3000-3500 люкс и фотопериоде 16/8 ч.

Скрининг in vitro в условиях солевого стресса

Для скрининга на солевой стресс использовали in vitro растения, которые пересаживали на питательную среду МС с добавлением хлористого натрия (NaCI), как селективного агента, в концентрациях: 0.5%, 1%, 1.5%. Количество пробирочных растений для каждого варианта составляло 10 штук, повторность 3-х кратная. Контролем служили растения, выращенные в среде без добавления хлористого натрия. После 5-6 недель выращивания определяли процент выживаемости, высоту растений, длину корней, количество корней на одно растение.

Микроклубнеобразование в условиях солевого стресса in vitro

Для микроклубнеобразования in vitro растения картофеля после очередного микрочеренкования помещали в среду МС следующего состава: сахароза - 80 г/л; агар -7.0г/л; витамины; кинетин - 1 мг/л (рН среды 5.75.8) с добавлением NaCI в концентрациях 0.5%, 1% и 1.5%. Количество пробирочных растений для каждого варианта составляло 10 штук, повторность 3-х кратная. Контролем служили растения, выращенные в среде без добавления NaCI. После 5-6 недель выращивания определяли процент выживаемости, а также выход микроклубней на одно растение.

В первые две недели растения выращивали при температуре 2023 С, а в последующие недели при температуре 12-15°С, освещенность 3000-3500 люкс, фотопериод 10/14 ч свет/темнота.

Биохимический анализ

Определение аскорбиновой кислоты. 3-5 г пробирочных растений растирали в ступке в присутствии 2% НС1 и доводили объем до 100 мл дистиллированной водой. Добавляли 4 мл 2%-ного раствора соляной кислоты и титровали раствором 2.6 дихлорфенолиндофенола до появления розового окрашивания, не исчезающего до ЗОсек.

Расчет количества аскорбиновой кислоты в пробе производили по формуле:

.. т-А-в-т

А =-

Б-Г

где X - содержание аскорбиновой кислоты в миллиграмм-процентах;

Т - титр раствора 2.6-дихлорфенола по аскорбиновой кислоте;

А - количество раствора 2.6-дихлорфенола (мл), израсходованное на титрование;

Б - количество мл вытяжки, взятое для титрования;

В - общее количество вытяжки (мл);

Г - количество вещества в граммах, взятое для анализа;

100 - количество граммов исследуемого материала, взятое для вы-!числёкйя'процентного содержания.

Определение содержания крахмала в клубнях картофеля. Для определения крахмала использовали 20% раствор хлорида натрия, перели-

6

того в большой стакан, в который опускали 3-5 клубней картофеля и осторожно приливали воду, до тех пор, пока клубни не начинали плавать, т.е. когда плотность клубней была равна плотности раствора. Ареометром измеряли плотность раствора и по таблице находили крахмальное число по их плотности (рекомендации ЕС (Европейского Союза)).

Определение водного дефицита. Производили по методу (Гонча-рик, 1962).

Фотосинтетическую активность листьев и дыхание определяли методом половинок по Саксу в полевых условиях (Иванова, 1946).

Содержание малонового диальдегида (МДА) определяли по методу, описанному в работе Heath, Pusker (1968), с применением тиобарбиту-ровой кислоты. Содержание МДА рассчитывали с использованием коэффициента экстинкции е=156 1-мМ--1см после вычисления неспецифического поглощения при 600 нм.

Активность супероксиддисмутазы (СОД) определяли с использованием нитросинего тетразоля (НСТ) методом, описанным в работе (Giannopulitis, Ries, 1977). Контролем служили: а) полная реакционная среда без фермента, в которой наблюдалась максимальная окраска; б) полная реакционная среда, инкубированная в темноте, служила темновым контролем. За единицу активности СОД принимали содержание фермента, подавляющего восстановление НСТ на 50%.

Определение хлорофилла. Пигменты выделяли экстрагированием из навески растений 80%-ым ацетоном и определяли содержание хлорофилла и каротиноидов по методу Шлык (1971).

Активность каталазы измеряли по скорости деградации Н2Ог согласно Kumar и Knowles (1993) и выражали в мкмоль разложившейся Н2О2/Г сырой массы в мин.

Полевые опыты: проводились в Вахдатском районе, поселок Зар-гар, по схеме, предложенной CIP (Перу, Лима). Растения выращивали по схеме 70x20 см. Внесение удобрений проводили согласно рекомендации < Международного центра картофеля (CIP). л !

Эти же составы удобрений использовались для выращивания пробирочных растений и микроклубней в условиях марлевого изолятора.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Отбор гибридов картофеля на устойчивость к NaClin vitro

Для отбора на солевой стресс использовали in vitro растения, которые пересаживали на питательную среду МС с добавлением хлористого натрия (NaCl), как селективного агента, в концентрациях 0.5%, 1%, 1.5%.;

, Результаты исследований показали, что при: концентрации 0.5% NaÇI в культуральной среде выживаемость гибридов была'100%. Листья имели окраску от светло-зеленого до темно-зеленого цвета, почти все растения образовывали вторичные побеги и корни. Высота растений варьировала от 1.6 до 3.14 см. При концентрации 1% NaCl, процент выживаемости варьировал в пределах от 40 до 100%, наблюдалась задержка роста и

7

корнеобразования (табл. 1). Высокую степень выживаемости при 1% NaCl показали гибриды 1, 9, 24. Листья у этих гибридов имели окраску от светло-зеленого до темно-зеленого цвета, наблюдалось образование вторичных побегов и корней.

Таким образом, показано, что при увеличении концентрации NaCl в среде культивирования усиливается его ингибирующее действие на выживаемость пробирочных растений картофеля in vitro.

Рис.1. Появление вторичного побега у гибридов № 1, № 24 после 60 суток культивирования in vitro

Наиболее быстрое ингибирование роста побега наблюдалось также у сорта Пикассо, который мы использовали в качестве контроля. Уже при концентрации 1% NaCl в среде культивирования происходило резкое ингибирование ростовых процессов у сорта Пикассо, а при 1.5% практически полностью они подавлялись. Что же касается гибрида №1, то он проявляет способность расти даже в среде культивирования, содержащей 2% NaCl, но при этом происходит резкое ингибирование ростовых процессов. В процентном отношении у сорта Пикассо при 1% концентрации NaCl в среде культивирования наблюдается ингибирование ростовых признаков на 87%, при 1.5% - 100%. У гибрида №1 при 1% концентрации NaCl ростовые признаки ингибируются ка 60%, при 1.5% на 76% и при более высокой концентрации NaCl (2.0%) - на 86%.

Таким образом, анализ полученных результатов свидетельствует о том, что зависимость ингибирования ростовых процессов от возрастающей дозы хлористого натрия при культивирований зависит от генотипа, т.е. имеет генетический характер. Гибрид №1 оказался бблбе устойчивым к солевому стрессу, чем сорт Пикассо. ■ ■ : г!

■ Как видно из результатов этой таблицы, ингибйрующее действие хлористого натрия на ростовые процессы строго; зависит от гено+ипов

картофеля. Наиболее устойчивые генотипы даже при 1.5 % концентрации №С1 в среде культивирования способны были формировать побеги и корни. Более того, устойчивые гибриды при длительном культивировании (более 60 дней) формировали вторичные побеги (рис.1).

Таблица 1

Реакция гибридов картофеля в среде содержащей различные

концентрации №С1 (ш уИго) (среднее из 3 повторностей)

Л"» гибридов П Л» гибридов, С1Р Вариант 1.1 N.101, % Высота растений, см Длина корня, см Выживаемость растении

№ 1 397077.16 0.5% 3.7 2.9 100%

1.5% 2.7 1.9

К 10.6 3.0

№2 392781. Г 0.5% 2.2 0.3 60%

1.5% 0.3 0.3

К 11.7 5.9

№3 390478.9 0.5% 2.0 0.9 60%

1.5% 0.5 0.2

К 13.6 4.5

№4 397030.31 0.5% 1.7 0.7 0

1.5% 0 0

К 9.0 3.5

№6 720149 0.5% 2.3 1.7 60%

1.5% 1.1 0.2

К 13 4.5

№ 7 397029.21 0.5% J 1.8 1.5 0

1.5% 1.6 0

К 6.8 3.7

№8 392780.1 0.5% 2.4 0.7 60%

1.5% 0.8 0.2

К 10.0 4.5

№9 397035.26 0.5% 3.5 2.1 100%

1.5% 1.8 1.4

К 13.5 4.3

№ 11 388972.22 0.5% 3.8 0 40%

1.5% 1.8 0

К 13.2 4.8

№ 13 388611.22 0.5% 2.5 1.6 80%

1.5% 2.0 0.6

К 13,0 4,5

№ 14 720148 0.5% 2.1 1.2 60%

1.5% 0.7 0.2

К 12.3 3.5

№ 15 388615.22 0.5% 2.1 1.7 60%

1.5% 1.3 0.5

К 10.5 2.5

№ 18 720090 0.5% 1.6 1.1 60%

1.5% 1.4 0.8

К 0 0 •

0.5% . 1.4 0.5

№ 20 720188 . , . 1.5% .1.4 0 0

К 13.2 .2.5

0.5% 1.5 0.8

№21 397069.11 1.5% 0.9 0 0

К 11.5 4.2

0.5% Г.6 0.8

№ 22 720189 1.5% 1,2 0.3 60%

К 11.3 3.8

0.5% 1.8 0.2

№23 392797.22 1.5% 0.6 0 0

К 0 0

0.5% 3.3 1.7

№24 390663.8 1.5% 2.2 1.2 100%

К 9.7 4.8

0.5% 1.8 1.5

№ 25 397073.16 1.5% 1.6 0 40%

К 12.8 3.5

0.5% 2.0 1.4

№ 26 391180.6 1.5% 1.5 0 40%

К 11.6 3.8

0.5% 2.4 1.4

№27 397054.3 1.5% 1.6 0.3 60%

К 10.6 3.6

0.5% 1.4 0.4

Пикассо 1.5% 1.2 0 10%

К 9.2 2.8

Наибольшую устойчивость к NaCl показали культивируемые in vitro растения-регенеранты гибридов №1, 9 и 24. Эти гибриды дополнительно тестировали при 1.5% NaCl, с дальнейшей регенерацией из них вторичных побегов.

Из данных таблицы 2 видно, что устойчивые к NaCl гибриды различаются друг от друга по степени образования вторичных побегов, по росту и по длине корневых волосков. Гибрид №1 существенно отличался по образованию вторичных побегов от гибридов №9 и №24 в условиях засоления. Гибрид №1 также имел существенное преимущество в образовании корней в присутствии в культуральной среде 1.5% NaCl от гибрида №9 и №24. Длина корней у гибрида №1 в два раза превышает длину корней гибридов №9 и №24.:;

Образование вторичных побегов у гибрида №1 составляло 38%, у гибрида № 9 - 20%, а у гибрида №24 - 25%. Эти наблюдения показали, что степень устойчивости проявляется по-различному у растений-регенерантов, подвергшихся солевому стрессу (1.5% NaCl).

Таблица 2

Рост, длина корней и образование вторичных побегов устойчивых ги-■ _бридоо картофеля in vitro (1.5% NaCI)_

№ CIP № Рост растений % от контроля Образование вторичных побегов, % от контроля Длина корней % от контроля

1 397077.16 24 38 63

9 397035.26 13 20 32

24 390663.8 ■ 24 25 25

Таким образом, полученные результаты дают основание говорить о разных уровнях экспрессии стрессустойчивых генов у растений-регенерантов in vitro. Среди множества расТений-регенерантов можно отобрать единичные клоны, которые обладают высокой экспрессией стрессустойчивости. Использование гибридов Картофеля в системе in vitro оказалось эффективным для получения стресс-устойчивых клонов. ' ■n-■■•'>"• Устойчивые к 1.5% концентрации NaCI гибриды №1, №9, №24 куль* тивировались далее. От каждого клона было высажено по 10-15 черенков. На 20-е сутки не было выявлено явного превосходства клонов от исходных гибридов по высоте побегов, корневой системе и размеру междоузлий. При сравнении полученных клон-гибридов с исходными гибридами CIP и их повторном культивировании в среде с 1:5% NaCI, было выявлено" явное превосходство клон-гибридов №1, №9, №24. Эти клон-гибриды превышали исходные гибриды по высоте побегов, сырой массе и числу корней. Таким образом, нами отобраны клоны по степени устойчивости к соли, отличающиеся от исходных гибридов.

Мы убедились что концентрация 1.5% NaCI является летальной для большинства растений гибридов in vitro и, в дальнейшем, скрининг устойчивых к соли растений можно производить используя именно эту концентрацию. Такие же результаты были получены и другими авторами (Бургу-тин и др., 1996; Nabos et al., 1975; Sabbah, Tal., 1990).

Таким образом, полученные результаты дают основание надеяться на использование этих гибрид-клонов, толерантных к соли, в качестве модельных растений в биотехнологии и молекулярно-генетических исследованиях и возможности адаптировать производство картофеля в условиях засолености почвы, что, конечно же, требует в дальнейшем еще более глубокого и детального исследования. Поэтому их использование в качестве модельного объекта для разработки метода микроклубнеобразования in vitro и для физиолого-биохимических исследований, имеет принципиальное значение для производства первичного семенного материала и выявления механизмов адаптации растений к стрессовым условиям.

Водный режим как элемент адаптации к стрессу Регенеранты, подвергшиеся стрессу, тестировали в условиях повышенной засухи. Для имитации засухи растения-регенеранты высаживали в

поле (марлевый изолятор) и переводили на ограниченный полив на стадии бутонизации-цветения. В течение недели влажность почвы поддерживалась на уровне 40-45% от ПВП. Содержание воды, водоудерживающую способность определяли перед ограничением полива и после недельной засухи. Во время измерений, температура в марлевом изоляторе не превышала 25...28°С.

Содержание воды в растениях (листьях) является одним из основных показателей, характеризующих водный статус в условиях водного дефицита. Содержание воды отражает баланс между поступлением и транспирацией и показывает насколько растение испытывает водный дефицит при засухе по сравнению с «нормальным» состоянием.

Под влиянием засухи содержание воды в растениях резко уменьшается. Чем интенсивнее и продолжительнее засуха, тем сильнее теряется вода. Некоторыми учеными показана положительная корреляция между засухоустойчивостью и содержанием воды (Кузнецов, Дмитриева, 2006). Более того, между солеустойчивостью и засухоустойчивостью нет особых различий, поскольку показано, что усиление солеустойчивости связано с лучшей способностью клетки удерживать воду.

Как видно из данных рис 2. при нормальном поливе общее содержание воды в листьях у всех изученных гибридов почти не отличается. Кратковременная засуха вызвала у растений уменьшение общего содержания воды от 84 до 72% у гибрида №1, от 83 до 67% у гибрида №9, от 83 до 66% у гибрида №24 и от 83 до 44%, у не солеустойчивого гибрида №20 (контрольный вариант). Эти результаты свидетельствуют о существовании стресса. Среди устойчивых к засолению растений-гибридов под действием водного дефицита (засухи) имелись небольшие различия по содержанию воды. У гибрида №1 снижение содержания воды под действием засухи было минимальным. После засухи у контрольного варианта (гибрид №20 -не устойчивый к засолению) содержание воды снизилось до 44%. Судя по реакции растений на обезвоживание, селекция растений-регенерантов в системе in vitro на солеустойчивость оказалась наиболее эффективным методом отбора для картофеля.

Водоудерживаюшая способность солеустойчивых гибридов

Один из важнейших звеньев продуктивности растений является эффективное управление водным режимом и познание механизмов его регуляции в разных экологических условиях у разных генотипов на уровне целого организма. В то же время накапливаются факты, свидетельствующие, что даже слабый водный дефицит существенно оказывает влияние на метаболизм и продуктивность растений больше, чем действие неблагоприятных экологических факторов (Кузнецов, Дмитриева, 2006).

Более того, ответная реакция на адекватное стрессовое воздействие должна быть связанна с различной функциональной надежностью, т.е. с устойчивостью и/или неустойчивостью генотипа к водному дефициту.

1 9 24 20

Гибриды

Рис. 2. Содержание воды (%) в листьях картофеля до (1) и после кратковременной засухи (2)

Можно полагать, что большую роль в формировании устойчивости играют структурные и физико-химические механизмы удержания воды на клеточном и организменном уровне. Регулирующее значение устьиц, корней, рельефа листовой поверхности также имеет значение в регуляции устойчивости растений. Повышение его с помощью фитогормонов может восполнить, в неблагоприятных условиях, недостаточность естественной эндогенной защиты, вместе с тем следует отметить ее слабую разработанность в использовании параметров водообмена в селекции растений, особенно картофеля.

Изучение этих вопросов представляет и теоретический, и практический интерес, т.к. растение в определенных пределах регулирует собственный водообмен, сохраняя оводненность на уровне, обеспечивающем нормальный физиолого-биохимический процесс. Возникает вопрос, каков уровень параметров водообмена у разных по устойчивости растений и насколько он стабилен? Эксперименты в данном направлении мы начали с изучения водоудерживающей способности листа у разных гибридов картофеля, полагая, что приспособительные возможности могут быть следствием влияния эндогенных фитогормонов в повышении уровня устойчивости растений.

Водоудерживающую способность срезанных листьев определяли по величине водоотдачи через 40, 60 и 90 минут.

Водоотдачу выражали в % от исходной сырой массы за 90 мин.

Водоудерживающая способность листьев солеустойчивых гибридов №1, 9, 24 оказалась выше по сравнению с соленеустойчивым гибридами (№20,22). ..... , -.г Г,,; •

Данные таблицы 3 показывают, что водоудерживающая'способность гибридов зависит от фазы развития растения. При переходе растения в генеративную фазу развития наблюдается увеличение водоудерживающей способности листьев растений картофеля. Изменение водоудерживающей способности колебалось от 12 до 15%. Из полученных данных можно предположить, что гибриды №1, 9, 24 могут перенести значительный вод-

ный дефицит, т.е. являются более засухоустойчивыми гибридами по сравнению с гибридами №20, 22.

Сравнительный анализ этих гибридов показал, что растения с высокой водоудерживаюшей способностью имеют более повышенную урожайность, чем гибриды, характеризующиеся низкой водоудерживаюшей способностью (табл.4).

Таблица 3

Водоудерживаюшая способность листьев в разных фазах развития

растения, (% потери воды за 90 мин.)

№ гибрида Фаза развития

Бутонизация Цветение

1 19.2 ±2.1 15.9+ 1.3

9 25.8± 1.7 19.2±2.2

20 29.2 + 2.1 25.6± 1.8

22 34.7±2.5 29.6+2.6

24 15.4± 1.2 12.5 ± 1.3

Различная реакция растений на водный дефицит связана с устойчивостью растений к неблагоприятным факторам внешней среды и потеря урожая у них происходит в меньшей степени, чем у неустойчивых гибридов.

Таблица 4

Продуктивность солеустончивых п несолеустойчивых

гибридов в условиях водного дефицита (клубни)

№ гибрида Продуктивность кг/растение % снижения

80% ПВП 40% ПВП

1 0.420±0.027 0.334±0.017 30.5

9 0.280±0.041 0.185±0.014 37.2

24 0.166±0.012 0.096±0.09 39.7

20 0.333±0.031 0.122±0.011 63.4

22 0.266±0.011 0.133±0.08 50.0

Как видно из результатов полевого испытания в условиях водного дефицита, все исследованные гибриды отличались по устойчивости в «нормальных» условиях выращивания и при водном дефиците (табл.4). Наивысшей урожайностью обладал гибрид №1, как в условиях нормального влагообеспечения, так и при кратковременном водном дефиците, т.е. при засухе (40% ПВП). Снижение урожайности у солеустойчивых гибридов при засухе было следующим: гибрид №1 - 30%, гибрид №9 - 37%, гибрид №24 - 39%. Максимальное снижение урожайности имели солене-устойчивые гибриды №20, 22, у которых снижение урожайности при засухе составляло 63 и 50% соответственно.

Таким образом, анализ полученных результатов свидетельствует о существовании определенной связи между водообменом листа, степенью

устойчивости к засухе и продуктивностью, которая отчетливо проявляется особенно при воздействии стрессовых факторов среды, т.е. водном дефиците. • ;

Продуктивность при нормальных условиях выращивания является ге, нетически закрепленным признаком растений картофеля, а в условия:, стресса она имеет выраженную связь со степенью устойчивости генотип»: который также имеет генотипическую природу.

Вероятно, большое содержание воды в растениях достигается не пу тем уменьшения транспирации, а другим путем, таким как улучшение раз; вития корневой системы, и, следовательно, увеличением всасывающей способности корней. Нельзя не отметить, участие фитогормонов, особенно цитокининов и антиоксиданткых систем в усилении устойчивости расте ний к стрессорным факторам.

Несколько меньше оказалось действие ИУК (1.2 раза) и НУК (1.3 раза). Вместе с тем, следует отметить, что уменьшение водоудерживающей способности зависит также от фазы развития растения. В фазе 25-дневного возраста гормоны в меньшей степени влияют на процесс водного обмена. На этой фазе развития растений ИУК и НУК одинаково снизили водо-удерживающую способность листьев (примерно в 1.35 раза), а б-БАП не изменил данный показательзодного обмена.

Совершенно другая картина наблюдалась при переходе растений I регенеративную фазу развития. Во всех вариантах уменьшилась потеря воды листьями (т.е. увеличилась водоудерживающая способность) по сравнению с контролем. Наибольшее возрастание этого показателя водо обмена пришлось на варианты с 6-БАП. По-видимому, повышение водоудерживающей способности в варианте с 6-БАП, связано с повышением активности белков, что приводит к изменению коллоидности цитоплазмы непосредственно влияющей на водообмен растений, что согласуется • данными Пустовой с соавторами (2006). Они также показали, что цитоки нины способствуют повышению водоудерживающей способности лисп ев злаковых растений.

Далее измеряли интенсивность фотосинтеза, дыхания и продуктов ность в условиях гормонального воздействия у изученных генотипов кар тофеля (табл. 5). В полевых условиях при определении фотосинтеза и дыхания использовали метод половинок листа, благодаря которому учитывается привес или убыль (дыхание) сухого вещества за определенный пери од. ;;

Возможно, повышение интенсивности биохимических процессов рас тений картофеля ауксинами связано с изменением, т.е. снижением концентрации АБК в листьях, поскольку известно, что ауксины и АБК оказывают противоположное воздействие. Следует отметить положительное воздействие гормонов на физиологические процессы и продуктивность растений картофеля. По всей вероятности, это связано с поддержанием коллоидности цитоплазмы, синтеза белков и тем самым способствует интенсификации оттока ассимилятов из листа (Пустовой и др., 2006).

15

Таблица 5

Влияние гормонов на фотосинтез и дыхание_

№ гибрида Варианты Интенсивность фотосинтеза мгсухой массы/дм2ч Интенсивность дыхания мг С02/г сух. массы

1 Контроль 13.5±0.8 1.08±0.05

22 14.1 ±0.7 1.5 ±0.07

1 НУК 24.8±0.9 1.93±0.15

22 27.5±1.1 2.45±0.16

1 ИУК. - ■ 25.4±1.4 1.88±0.15

22 29.5±1.7 2.79±0.14

1 6-БАП 22.1 ±1.3 1.33±0.09

22. 32.4± 1.7 3.06±0.11

Как видно из данных таблицы 9, гормоны существенно влияют на интенсивность фотосинтеза и дыхания. ИУК и НУК в два раза повышают интенсивность фотосинтеза и дыхания растений, как у неустойчивого, так и у устойчивого гибрида. Но действие фитогормонов более резко выражено у неустойчивого гибрида (№22). Наибольшее влияние на эти процессы оказывает 6-БАП,.чем НУК и ИУК.

Несколько ниже оказалось действие 6-БАП на интенсивность фотосинтеза и, дыхания растений. Изменение интенсивности физиологических процессов.существенно увеличило продуктивность растений.

Таким образом, анализ полученных данных показывает, что ауксины и цитокинины оказывают положительное воздействие на водообмен растений и продукционный процесс. Особо необходимо отметить, что 6-БАП усиливает фотосинтез ц, дыхание в большей степени у неустойчивого гибрида №22, чем у устойчивого.гибрида №1.

Вместе с тем, у стресс-устойчивых растений на примере гибрида №1 и неустойчивого к стрессу гибрида №22 вероятно существует различный баланс цитокининов и ауксинов, регулирующих ответную реакцию растений на воздействие стресса. Очевидно, устойчивость растений к стрессам связана с повышенным уровнем цитокининогенеза в листьях и корнях растений, обеспечивающих регуляцию стрессовых белков и низкомолекулярных метаболитов (Кулаева, Кузнецов, 2002; Романов, 2009)

Возможно,,что у неустойчивых к стрессу гибридов, таких как гибрид №22, содержание ауксина и цитокинина находится на низком уровне, что полностью не обеспечивает сопротивляемость растений к стрессу из-за низкого уровня индукции стрессовых метаболитов и белков.

Активность супероксиддисмутазы (СОД) и образование „ I , малонового днальдегида (МДА)

Среди многих факторов, высокая температура, засуха и засоление являются основными абиотическими факторами, ограничивающими продуктивность растений (Кузнецов, Дмитриева, 2005). Поэтому получение растений р, целью придания им устойчивости к стрессорным факторам основана на манипулировании экспрессии и активности основных ферментов

антиоксидантной системы растений, которые напрямую связаны с защитой клетки от супероксидрадикалов (Мерзляк, 1989).

При стрессовых условиях одноэлектронного восстановления кислорода при фотосинтезе в хлоропластах и митохондриях, прежде всего, накапливается 0'2, затем продукт его дисмутации Н202 и, самый токсичный гидроксильный радикал кислорода (ОН"), для гашения которого отсутствуют в растительной клетке защитные ферменты. В этом случае большую роль играет основной фермент антиоксидантной зашиты - супе-роксиддисмутаза (СОД). Поэтому исследование активности СОД, катала-зы и других ферментов представляет огромный интерес для выяснения биохимии стрессустойчивости растений картофеля. Биохимические исследования устойчивости и адаптивности картофеля к стрессорному воздействию недостаточны, а имеющиеся в литературе данные очень противоречивы.

Как показывают данные табл. 6. в присутствии 1% NaCI и маннита (0.6М) в среде вырашивания in vitro резко увеличивается образование продукта перекисного окисления липидов-малонового диальдегида (МДА) как у устойчивого клон-гибрида №1, так и у чувствительного клон-гибрида №20. Однако увеличение МДА в присутствии NaCI у устойчивого клон-гибрида на 62%, а у чувствительного на 175% больше чем в контроле, то есть NaCI и маннит существенно усиливают образование МДА у чувствительного к соли клон-гибрида - до 275%, а при засухе (маннит) -253% т.е. примерно в 3 раза по отношению к контрольному варианту. Эти эксперименты показывают, что при засухе также наблюдается повышенный уровень перекисного окисления липидов (ПОЛ) у чувствительных гибридов картофеля. Устойчивый к солевому стрессу генотип картофеля является устойчивым и к засухе и существенно отличается от неустойчивых генотипов.

Таблица 6

Содержание МДА у разночувствнтельных к соли генотнпов

в условиях стресса

Генотипы Условия эксперимента Содержание МДА, мкмоль/г сырой иас- СЫ'МИН % увеличения МДА

Клон-гибрид №1 (устойчивый к солевому стрессу) Контроль 8.97 100

NaCI (1 %) 14.57 162

Маннит (0.6% маннит) 14.11 157

Клон-гибрид №20 (чувствительный к солевому стрессу) Контроль 10.67 100

NaCI (1%) 29.35 275

Маннит(0.6%) 27.05 .. 253

При стрессе (солевой или засуха) индуцируется образование активной формы кислорода (АФК) в виде активных форм супероксиданион радика-

ла (0"2), гидроксильного радикала (ОН"), которые влияют на многие биохимические процессы.

. Одним из первоочередных этапов обезвреживания АФК является наличие активного фермента супероксиддисмутазы (СОД), который участвует в дисмутации супероксидного анион радикала с образованием ¡{202 и Ог. Как видно из данных табл.7, активность СОД при солевом стрессе и засухе у устойчивого генотипа усиливает гораздо больше, чем у чувствительного генотипа.

Таблица 7

Активность СОД у разночувствительных генотипов ___ в условиях стресса _ ..___

Генотипы Условия эксперимента Отн. ед. активности СОД/г сырой мас-сы-мнн % увеличения сод

і Клон-гибрид №1 | (устойчивый к ' соли) Контроль 67.4 100

ЫаС1 (1%) 151.2 237

Маннит (0.6% маннит) 142.7 212

| Клон-гибрид 1 №20 (чувстви-| тельный к солевому стрессу) Контроль 58.8 100

ЫаС1 (1%) 107.7 183

Маннит (0.6% маннит) 102.4 174

Следует отметить, что в нормальных условиях (контрольный вариант) у обоих генотипов активность фермента примерно одинакова, но при стрессе активация СОД у чувствительного и устойчивого генотипов резко различается как в присутствии №С1, так и при засухе (маннит). Устойчивый генотип обладает более высокой активностью СОД, чем чувствительный генотип.

Увеличение активности СОД у устойчивого генотипа при солевом стрессе наблюдается более, чем в 2:4. раза, а при засухе чуть меньше - в 2.2 раза.

Таким образом, полученные данные позволяют заключить, что устойчивость растений связана, прежде всего, с функцией супероксиддисмутазы (СОД), обезвреживающей образование при стрессе МДА с образованием перекиси водорода (Н202).

Определение активности каталазы показало различие уровня активности этого фермента у разночувствительных генотипов картофеля. Как видно из данных табл.8, активность каталазы резко различается у этих генотипов как в присутствии ЫаС1, так и маннита. Уровень активности каталазы в контрольном варианте у устойчивого генотипа в 2-3 раза выше, чем V неустойчивого. Этот показатель также отличался у чувствительных и устойчивых генотипов при стрессорных воздействиях (№С1 и маннит). Но общая активность в 3-4 раза ниже, чем у устойчивого к соли генотипа.

Таблица 8

Активность каталазы у разночувствительных к соли генотипов ■"■••••■" _ в условиях стресса _

Генотипы Условия эксперимента Активность каталазы, МКМОЛЬ Н2О2/Г сырой мас-сьгмин : % увеличения активности каталазы

Клон-гибрид №1 (устойчивый к соли) Контроль 13.37 100

NaC) (1%) 41.28 309 .

Маннит (0.6% маннит) 33.4 250

Клон-гибрид №20 (чувствительный к солевому стрессу) Контроль 6.68 100

NaCI (1%) 11.26 168

Маннит (0.6% маннит) 13.9 208

Таким образом, полученные данные показывают, что как в нормальных условиях, так и в условиях стресса (солевого и засуха) активность каталазы является одним из главных критериев, определяющих биохимическую устойчивость растений. Высокий уровень активности как в нормальных условиях, так и при стрессе является главным звеном в цепи адаптации растений.

Биохимическая характеристика солеустойчивого клон-гибрида №1

В результате изучения гибридов картофеля, полученных нами из Международного Центра Картофеля (Перу), удалось выделить оригинальный гибрид № 397077.16 (гибрид №1).

Иммуноферментный анализ гибрида показал, что гибрид полностью освобожден от вирусов.

В результате скрининга к солевому стрессу гибрид №1 показал высокую устойчивость. В дальнейшем, в течение 2007-2008 гг. гибрид №1 испытывался в ряде регионов Таджикистана (Файзабад, Муминабад, Вахдат и Джиргиталь) и показал свое превосходство перед другими сортами, выращиваемыми в этих регионах. Таким образом, путем сочетания скрининга и биотехнологии был получен перспективный сорт картофеля, названный нами «Файзабад»,

Клон-гибрид №1 in vitro хорошо формирует микроклубни при концентрациях сахарозы (7%).

Клубни имеют продолговато-овальную форму, окраска мякоти клубней бледно-желтая, расположение глазков поверхностное. Клон сред-неранний, вегетационный период составляет 100-110 дней.

Растения формируют до 10 шт. клубней. Урожайность, высокая, она достигает 40-45 т с гектара. Кожура клубней нежная, лежкость клубней

при хранении хорошая. Клон устойчив к вирусу Ь, раку, фузариозу, мак-роспориозу.

Как видно из табл.9, клон-гибрид №1 по таким хозяйственно-полезным признакам, как количество клубней, продуктивность одного растения и урожайность с одного гектара значительно превосходит стандартные сорта картофеля Кардинал, Жуковский ранний и Пикассо.

Таблица 9

Продуктивность клон-гибрида №1 (397077.16), 2008 г.

Сорт картофеля Кол-во клубней, шт./кус т Масса одного клубня, г Продуктивность, г/растение Урожайность, т/га Отклонения от стандарта

т/га %

Кардинал (стандарт) 6.3 87.8 553.2 33.1 0 0

Жуковский ранний 5.9 92.0 542.8 34.9 + 1.8 5.4

Пикассо 6.3 109.0 686.7 35.8 + 2.7 10. 8

Файзабад (гибрид № 1) 10.2 92.0 770.5 42.4 + 9.3 25. з

Клон-гибрид №1 по содержанию в клубнях сухого вещества, белков, витамина С несколько превышает сорта картофеля Кардинал, Пикассо и Жуковский ранний (табл. 10).

Таблица 10

Сорт картофеля Содержание сухого вещества, % Содержание крахмала, % Белок, % Витамин С, мг %

Файзабад(гибрид № 1) 23.0 16.2 2.2 31%

Кардинал (стандарт) 20.0 13.5 1.3 17%

Жуковский ранний 20.0 15.8 1.4 24%

Пикассо 21.2 14.8 1.3 25%

Клон-гибрид №1 в 2008 г. передан в Государственную комиссию по сортоиспытанию сельскохозяйственных культур и охране сорта при МСХА РТ как перспективный сорт для испытания в разных условиях.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее время биохимические показатели рассматриваются как одни из ключевых маркеров, характеризующих адаптацию растительной клетки к экстремальным факторам среды. С этой позиции выявление гено-

20

Типов, обладающих устойчивостью к стрессам приобретает особую значимость. Поэтому нами предложен метод, основанный на оценке активности антиоксидантных ферментов, усиливающих адаптацию клетки к стрессу in vitro, который позволяет выявить генотипы, устойчивые к засолению и засухе. '

Полученные нами экспериментальные результаты показали надежность системы in vitro для скрининга с использованием селективных химических агентов: хлористый натрий (NaCl) и полиэтиленгликоль (ПЭГ), поскольку засоление является одним из главных стрессовых факторов, снижающих продуктивность растений, особенно в сочетании с засухой. Засоление и засуха приводят к ингибированию биохимических процессов и даже к гибели растений. В основе этих процессов лежит усиление осмотического стресса, которое является следствием нарушения водного го-меостаза (Dajic, 2006; Кузнецов, Дмитриева, 2006). Наши исследования подтверждают мнение, что нарушение тургорного состояния клетки является главной причиной падения фотосинтеза и дьгхания растений. Существенным моментом является то, что генотипы, обладающие разной толерантностью к соли по-разному реагируют на солевой стресс, что возможно связано с гормональным дисбалансом клетки и ролью антиоксидантных систем.

Торможение биохимических процессов в условиях засоления сопровождается усилением перекисного окисления липидов, что проявляется в накоплении малонового диальдегида (МДА). При стрессе, уровень накопления МДА у разных по толерантности генотипов разный. Наивысшее содержание МДА при засолении наблюдается у чувствительного генотипа (клон-гибрид № 20) и, в меньшей степени, у толерантного (клон-гибрид № 1). Такие же результаты нами были получены в условиях засухи с использованием ПЭГ. Более того, наши эксперименты показали, что нарушение окислительной системы, наблюдаемое при стрессе, можно рассматривать как явление дисбаланса между прооксидантной и антиоксидантной системами клетки. Необходимо отметить, что при стрессе (засоление, засуха) наблюдается усиление системы защиты клетки растений в разной степени у разных по толерантности генотипов картофеля. При засолении заметно усиливается активность супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы у толерантных генотипов, по сравнению с чувствительными, т.е. наблюдается генотипическое проявление антиоксидантной защиты при стрессовых условиях.

Эти положения работы согласуются с повышенной стресс-зависимой активностью СОД и повышенной активностью фермента каталазы, функционирующей в межклеточном пространстве у толерантного клон-гибрида jV»1 . , . , ■ .

Полученные результаты, основанные .на изучении активации>проок-сиданта ¡и антирксиданта: в сторону антиоксидантной защиты и результаты скрининга в условиях засоления и засухи-с использованием селективных химических агентов позволили выявить генотип, обладающий повышен-

21

ной устойчивостью к этим двум стрессовым факторам. Клон-гибрид № 1 (сорт Файзабад) существенно отличается от стандартных сортов по урожайности и по биохимическому составу клубней (содержанию аскорбиновой кислоты, сухого вещества, содержанию крахмала и белка). Таким образом, нам впервые удалось выявить генотип картофеля, одновременно обладающего устойчивостью к двум стрессорным факторам (засоление и засуха).

Полученные результаты позволяют заключить, что скрининг генотипов в условиях стресса in vitro и активность антиоксидантных ферментов могут служить важнейшим критерием тестирования растений на отбор по устойчивости к стрессовым факторам и главное - требуют очень малого времени и малых материальных затрат.

ВЫВОДЫ

1. С целью отбора растений, толерантных к абиотическим стрессам, изучены 27 гибридов картофеля in vitro. Показано, что селективная система с использованием NaCl и ПЭГ является эффективной, так как обеспечивает полную элиминацию чувствительных растений и сохранение жизнеспособности устойчивых регенерантов.

2. Выявленные путем скрининга in vitro толерантные к NaCI гибриды

• ■ картофеля имели устойчивость и к засухе по таким показателям, как

содержание воды, водоудерживающая способность и продуктивность, что свидетельствует о возможности использования селективной системы с NaCI для отбора на засухоустойчивость.

3. Показано, что физиологические нарушения водообмена связаны с гормональным дисбалансом^ Проведение гормональной коррекции на уровне целого растения восстанавливает нормальный ход водообмена у неустойчивых генотипов и, следовательно, усиливает адаптационные возможности растения.

4. Показано, что активация супероксиддисмутазы при солевом стрессе . и засухе выше в 2-3 раза у устойчивого генотипа, чем у неустойчивого, а содержание малонового диальдегида (МДА) у устойчивого генотипа в 1.5-2 раза ниже, чем у солечувствительного. Наблюдается обратная связь между активностью супероксиддисмутазы и образованием МДА у устойчивых генотипов картофеля.

5. Выявлен генотип (клон-гибрид №1), обладающий повышенной устойчивостью к засолению и засухе. Биохимический анализ клубней показал, что по содержанию крахмала, белков и витамина С этот гибрид превосходит стандартные сорта Кардинал, Пикассо и Жуковский ранний.

6. Клон-гибрид №1 передан в 2008 г. в Государственную комиссию по сортоиспытанию сельскохозяйственных культур и охране сорта при МСХ РТ, как новый сорт «Файзабад», который проходит испытание в разных регионах Республики Таджикистан.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

« Разработан ускоренный способ отбора устойчивых к стрессу клон-гибридов in vitro с использованием селективных агентов.

• Активность оксидантных ферментов можно использовать как биохимический тест для оценки устойчивости генотипов картофеля и других культурных растений в условиях стресса in vitro и in vivo.

• Клон-гибрид №1 передан в Государственную комиссию по сортоиспытанию сельскохозяйственных культур и охране сорта при Министерстве сельского хозяйства Республики Таджикистан как новый сорт под названием Файзабад, обладающий высокой урожайностью и устойчивостью к солевому стрессу и засухе.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Авганова Х.Х., Азимов М.Л. Влияние экофакторов на физиологию модифицированных растений: Мат-лы кОнф. «Экологические особенности биологического1 разнообразия флОры и растительности Таджикистана». Душанбе: «Сино»-2001, с. 41-46

2. Авганова Х.Х., Азимов М.Л. Водный режим растении картофеля, полученных методом культуры тканей. Чавонон ва илми муосир. Мачмуаи маколахои илми-назариявйи конференсияи чумхуриявии олимони чавон, бахшида ба 10-солагии р^зи Вахдати миллй. Душанбе: «Дониш»-2007, с. 67.

3. Алиев К.А., Карло Карли, Азимов М.Л., Неъматуллоев З.С., Давлатназарова З.Б., Салимов А.Ф., Назарова H.H. Испытание гибридов картофеля на устойчивость к NaC! и регенерация солеустой-чивых гибридов in vitro. Доклады АН РТ, 2007, №8, с. 716-721

4. Неъматуллоев З.С., Бобохонов Р., Салимов А., Азимов М.Л., Ватан-шоева H.A., Гафурова Д.Ш.; Назарова H.H. Рост и микроклубнеоб-разование у гибридов картофеля в условиях in vitro. Мат-лы научной конференции «Достижения современной физиологии растений: теоретические и прикладные аспекты», посвященной памяти академика Академии наук Республики Таджикистан Ю.С.Насырова. Душанбе: «Дониш»-2008, с. 84-86

5. Неъматуллоев З.С., Азимов М:Л., Давлатназарова З.Б., Ашуров С., Шукурова М., Назарова H.H., Карло Карли, Алиев А.К. Некоторые особенности роста й'микроклубнеобразования у гибридов картофеля в условиях in vitro. Известия АН РТ; Отделение биол. и мед. наук. 2008, №2, с. 56-62

6. Азимов М.Л., Неъматуллоев З.С. Особенности транспираиии в онтогенезе растений картофеля. Мат-лы Международной конференции «Состояние и перспективы развития биохимии в Таджикистане». Душанбе - 2009 г, с. 26

7. Бобохонов P.C., Салимов А.Ф., Азимов М.Л. Особенности клубне-образования гибридов картофеля в зависимости от углеводного пи-

тания. Мат-лы научно-практ.конферениии молодежи ТАУ Душанбе: ТАУ-2010, с. 32-36.

8. Бобохонов P.C., Салимов А.Ф., Азимов M.JL, Давлатназарова З.Б., К.А.Алиев. Отбор генотипов картофеля устойчивых к засухе в условиях invitro. Кишоварз. Душанбе: ТАУ, 2010, №3, с. 19-21.

9. Бобохонов P.C., Салимов А.Ф., Азимов М.Л. Генотипическая особенность урожайности картофеля в полевых условиях. Матер, меж-дун. конф.: посвященной 20-летию независимости РТ и 80-летии образовании ТАУ: Душанбе: «Сабрина-К»-2012, с. 628-631.

Ю.Азимов М.Л.," Ватаншоева H.A., Киёмова З.С., Авганова X. Действие фитогормонов в регуляций водоудерживающей способности растений картофеля. Мат-лы конф. «Экологические проблемы и рациональное использование природных ресурсов». Душанбе-2012, с. 264267.

11.Азимов М.Д., Авганова X., Киёмова 3., Ватаншоева H.A. Водоудер-живаюшая способность солеустойчивых гибридов. Мат-лы конф. «Экологические проблемы и рациональное использование природных ресурсов». Душанбе-2012, с. 267-271.

12.Авганова Х.Х., Азимов М.Л., Ватаншоева H.A., Наймов A.C., Алиев М.К. Влияние экологических факторов на паратипическую изменчивость количественных показателей оздоровленного картофеля. Мат-лы конф. «Экологические проблемы и рациональное использование природных ресурсов». Душанбе-2012, с. 271-272.

13.Бобохонов P.C., Салимов А.Ф., Неъматуллоев 3.С., Азимов М.Л. Особенности урожайности различных гибридов картофеля в полевых условиях центрального Таджикистана. Сборник научных статей. Мат-лы международной научно-практической конференции «Эффективное использование биоклиматических факторов, при выращивании сельскохозяйственных культур на пахотных землях», посвященной 20-летию XVI сессии Шурой Оли Республики Таджикистана и 15-летия Национального примирения. Душанбе-2012, с. 152155.

14. Davlyatnazarova Z., Kasparova I., Saboiev I., Azimov M.L., Vatanshoeva N., Aliev K. Field screening of CIP clones regarding to heat stress. Мат-лы научной конференции, посвященной 80-летию со дня рождения академика АН Республики Таджикистан Ю.С.Насырова «Фотосинтез и проблемы повышения продуктивности растений» Душанбе: «Дониш»-2012, с. 89-93.

Сдано а набор 26.02.2013 г. Подписано в печать 28.02.2013 г. Формат 60x84 '/,6. Заказ № 35. Тираж ЮОэкз. Отпечатано в типографии ТНУ, ул. Лахути 2.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Азимов, Муродали Лакайевич, Душанбе

Институт ботаники, физиологии и генетики растений Академии наук Республики Таджикистан

04201358180

АЗИМОВ М.Л. «НЕКОТОРЫЕ БИОХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ УСТОЙЧИВЫХ К NACL РАСТЕНИЙ КАРТОФЕЛЯ IN VITRO И IN VIVO»

03.01.04 - биохимия

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: ведущий научный сотрудник

института ботаники, физиологии и генетики растений АН РТ, к.б.н. Давлятназарова З.Б.

Научный консультант: член-корреспондент

АН РТ д.б.н., профессор Алиев К.А.

Душанбе - 2013

Содержание

Введение........................................................................................3

Глава 1. Литературный обзор............................................................7

1.1. Механизмы устойчивости растений к стрессовым факторам среды.........7

1.2. Влияние солевого стресса на растения.............................................11

1.3. Типы засоления почв.................................................................. 13

1.4. Причины и последствия влияния засоления на растения...........................15

1.5. Механизмы адаптации к засолению...................................................20

1.6. Методы борьбы с засолением почв и повышение солеустойчивости растений..........................................................................................23

1.7. Основные принципы биотехнологии и методы оздоровления

картофеля.......................................................................................24

Глава 2. Экспериментальная часть. Условия, объекты и методы исследования................................................................................31

2.1. Краткая характеристика картофеля.................................................31

2.2. Оптимальные условия для произрастания картофеля...........................32

2.3. Материалы и методы исследования................................................35

2.4. Микроразмножение и поддержание клонов картофеля in vitro...............36

2.5. Скрининг in vitro в условиях солевого стресса....................................37

2.6. Микроклубнеобразование в условиях солевого стресса in vitro.............37

2.7. Определение содержания аскорбиновой кислоты..............................37

2.8. Определение содержания крахмала в клубнях картофеля.....................38

2.9. Определение водного дефицита в листьях картофеля..........................38

2.10. Определение фотосинтеза и дыхания............................................39

2.11. Определение количественного содержания

малонового диальдегида....................................................................39

2.12. Определение активности супероксиддимутазы.................................40

2.13. Определение активности каталазы.................................................40

2.14. Определение наличия вирусов в листьях картофеля...........................40

2.15. Полевые опыты.........................................................................41

2.16. Статистическая обработка данных.................................................41

Глава 3. Результаты исследований....................................................42

3.1. Отбор гибридов картофеля на устойчивость к NaCl in vitro..................42

3.2. Накопление биомассы и формирование микроклубней у различных

генотипов картофеля in vitro..............................................................49

Глава 4. Водный режим как элемент адаптации к стрессу.....................56

4.1. Общее содержание воды в листьях различных гибридов.......................56

4.2.Транспирационная активность различных генотипов........................... 57

4.3.Водоудерживающая способность листьев солеустойчивых

гибридов.......................................................................................59

4.4.Регуляция фитогормонами водоудерживающей способности

листьев картофеля............................................................................62

4.5. Активность супероксиддисмутазы и образование малонового диальдегида в листьях, разных по солеустойчивости

генотипов картофеля..........................................................................67

4.6. Продуктивность различных генотипов картофеля in vivo......................70

Глава 5. Биохимическая характеристика солеустойчивого клон-гибрида №1............................................................................74

5.1. Биохимические особенности клон-гибрида № 1 ................................74

5.2. Рост, развитие и продуктивность клон-гибрида № 1 .........................83

Заключение.....................................................................................86

Выводы.........................................................................................88

Практические рекомендации..............................................................89

Литература....................................................................................90

<

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ:

АБК - абсцизовая кислота;

АФК - активные формы кислорода;

БЗСК - банк здоровых сортов картофеля;

6-БАП - 6-бензиламинопурин;

ИУК - 3-индолилуксусная кислота;

ИМК - индолилмасляная кислота;

ИФА - иммуноферментный анализ;

МДА - малоновый диальдегид;

МС - Мурасиге - Скуга;

НУ К - а-нафтилуксусная кислота;

ПВП - поливинилпироллидон;

ПОЛ - перекисное окисление липидов;

ПЦР - полимеразная цепная реакция

СОД - супероксиддисмутаза;

ФС - фенольные соединения;

ФЭП - фосфоэнолпируват;

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота;

Р[_КУ - вирус скручивания листьев картофеля;

РУМ - вирус мозаичности картофеля;

ВВКК - вироид веретеновидности клубней картофеля;

РУА, РУЭ, РУХ, РУУ - семейство потивирусов картофеля

Введение

Картофель - важнейшая сельскохозяйственная культура, которая подвержена воздействию различных стрессовых факторов, таких как засуха, высокие температуры и засоление. При этом засоление оказывает наиболее повреждающее действие. Вредное действие засоления имеет комплексный характер и обусловлено, как нарушением осмотического баланса клетки, что негативно сказывается на водном режиме растений, так и прямым токсическим

"Ь 2 2

влиянием ионов (Na , SOr, СГ, C03"z) на физиолого-биохимические процессы в клетке, в результате чего увеличиваются концентрации вредных метаболитов, следствием этого является дезорганизация мембран, подавление синтеза белков, нуклеиновых кислот, накопление токсогенных ионов и инициация окислительного стресса (Строганов, 1973; Кузнецов, Дмитриева, 2006).

Для изучения токсического влияния соли и клеточных механизмов толерантности было предложено использовать клеточные культуры (Кулаева и др., 1997). При изучении механизмов устойчивости у выделенных in vitro солеустойчивых клеточных линий показано, что у ряда клонов не нарушена способность к проникновению ионов соли и, вместе с тем, поддерживается осмотический градиент, необходимый для функционирования клетки. Эти линии аккумулировали значительно более высокие концентрации ионов, чем чувствительные линии и, более того, для нормального роста нуждались в повышенном содержании соли в среде. Механизмы выносливости, благодаря которым растения адаптируются к условиям засоления, могут быть разными и до конца не изучены. Получение растений с целью придания им устойчивости к стрессорным факторам основано на манипулировании экспрессии и активности основных ферментов антиоксидантной системы растений, которые напрямую связаны с защитой клетки от супероксид-радикалов (Мерзляк, 1989).

Исследования в этом направлении малочисленны и до сих пор отсутствуют обнадеживающие результаты.

Несмотря на актуальность проблемы, к началу наших исследований отсутствовали сведения об использовании гибридов картофеля на солеустойчивость в условиях in vitro. Это побудило нас обратиться к методам in vitro, как реальному подходу отбора генотипов картофеля на солеустойчивость, так как картофель по признаку устойчивости к засолению почвы варьирует в широких диапазонах в зависимости от сорта (Sabbah, Tal., 1990; Бургутин и др. 1996)

В настоящей работе представлены экспериментальные данные, свидетельствующие о возможности отбора на устойчивость к засолению разнообразных гибридов картофеля in vitro и некоторые физиолого-биохимические показатели разнотолерантных генотипов, что актуально и является перспективным в решении научно-практических задач.

Цель и задачи исследований:

Отбор солеустойчивых гибридов картофеля в условиях in vitro и сравнительное изучение некоторых физиолого-биохимических показателей устойчивых и неустойчивых к солевому стрессу генотипов и их испытание в полевых условиях.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- Размножить гибриды картофеля микроклональным черенкованиием in vitro,

- Скрининг гибридов на устойчивость к хлористому натрию in vitro;

- Изучить водообмен, как элемент адаптации к солевому стрессу in vivo;

- Определить активность супероксиддисмутазы (СОД, КФ 1.15.1.1) и содержание малонового диальдегида (МДА) при солевом стрессе;

- Определить активность каталазы (КФ, 1.11.1.6);

- Изучить некоторые биохимические показатели и продуктивность устойчивых гибридов картофеля.

Научная новизна: Впервые в системе in vitro выявлен клон-гибрид, обладающий устойчивостью к высокой концентрации хлористого натрия.

Установлено, что при многократном культивировании устойчивые гибриды сохраняли повышенную толерантность к солевому стрессу.

Полученные путем скрининга гибриды картофеля отличались от неустойчивых по активности супероксиддисмутазы и содержанию малонового диальдегида, содержанию воды, водоудерживающей способности и продуктивности, что дает возможность использования селективной системы с хлористым натрием для отбора толерантных к солевому стрессу генотипов картофеля.

Показано, что биохимическая устойчивость растений связана, прежде всего. с возрастанием активности фермента супероксиддисмутазы, обезвреживающей супероксидрадикал кислорода. Выявлено, что активность супероксиддисмутазы при солевом стрессе и засухе выше в 2-3 раза у устойчивого генотипа, чем у неустойчивого.

Обнаружено, что нарушение водообмена связано с гормональным дисбалансом, возникающим при скрещивании отдаленных генотипов картофеля. Проведение фитогормональной коррекции на уровне целого растения восстановило нормальный ход биохимических процессов вследствие чего возросли адаптационные возможности растений картофеля при стрессе.

Практическая значимость: Оценка большого набора гибридов картофеля при повышенной концентрации NaCl в условиях in vitro позволила выделить отдельные генотипы с высокой устойчивостью и продуктивностью. На основе определения некоторых физиолого-биохимических показателей в сочетании с методами биотехнологии удалось выделить новый оригинальный, высокопродуктивный гибрид картофеля, обладающий высокой устойчивостью к условиям солевого стресса. Гибрид №1 передан как новый сорт Файзабад в Государственную комиссию по сортоиспытанию сельскохозяйственных культур и охране сорта при Министерстве сельского хозяйства Республики Таджикистан.

Апробация работы: Материалы диссертации были доложены (или представлены) на:

международном семинаре «Улучшение продовольствия и безопасности доходов в Юго-Западной и Центральной Азии через сорта картофеля с улучшенной устойчивостью к абиотическим стрессам», Шимла (Индия), 2008;

научной конференции «Достижения современной физиологии растений: теоретические и прикладные аспекты», Душанбе, 2008; республиканском семинаре «Гузориши сектори тухмпарварии Точикистон ба муносибатхри бозоргонй», Душанбе, 2008; конференции молодых ученых Таджикского национального университета, Душанбе 2006-2009 гг.;

международном семинаре «Улучшение продовольствия и безопасности доходов в Юго-Западной и Центральной Азии через сорта картофеля с улучшенной устойчивостью к абиотическим стрессам», Ташкент (Узбекистан), 2009

научной конференции, посвященной 80-летию со дня рождения академика АН Республики Таджикистан Ю.С.Насырова «Фотосинтез и проблемы повышения продуктивности растений», Душанбе, 2012г.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 1.1. Механизмы устойчивости растений к стрессовым факторам среды

В природных условиях произрастания или возделывания растения, в процессе своего роста и развития, часто испытывают воздействие неблагоприятных факторов внешней среды, к которым относят температурные колебания, засуху, избыточное увлажнение, засоленность почвы и т. д. Каждое растение обладает способностью к адаптации в меняющихся условиях внешней среды в пределах, обусловленных его генотипом. Чем выше способность растения изменять метаболизм в соответствии с окружающей средой, тем шире норма реакции данного растения и лучше способность к адаптации. Это свойство отличает устойчивые сорта сельскохозяйственных культур. Как правило, несильные и кратковременные изменения факторов внешней среды не приводят к существенным нарушениям физиологических функций растений, что обусловлено их способностью сохранять, относительно стабильное состояние при изменяющихся условиях внешней среды, т. е. поддерживать гомеостаз. Однако резкие и длительные воздействия приводят к нарушению многих функций растения, а часто и к его гибели. При действии неблагоприятных условий снижение физиолого-биохимических процессов и функций может достигать критических уровней, не обеспечивающих реализацию генетической программы онтогенеза, нарушаются энергетический обмен, системы регуляции, белковый обмен и другие, жизненно важные функции растительного организма (Жибоедов, 1991; Кузнецов Вл., Дмитриева, 2006). При воздействии на растение неблагоприятных факторов (стрессоров) в нем возникает напряженное состояние. Стресс - общая неспецифическая адаптационная реакция организма на действие любых неблагоприятных факторов. Выделяют три основные группы факторов, вызывающих стресс у растений: физические - недостаточная или избыточная влажность, освещенность, температура, радиоактивное излучение, механические

воздействия; химические - соли, газы, ксенобиотики (гербициды, инсектициды, фунгициды, промышленные отходы и др.); биологические - поражение возбудителями болезней или вредителями, конкуренция с другими растениями, влияние животных, цветение, созревание плодов. Сила стресса зависит от скорости развития неблагоприятной для растения ситуации и уровня стрессирующего фактора (Веселовский и др., 1993).

На клеточном уровне метаболизм растений изменяется таким образом, чтобы предотвратить негативные последствия повреждающего действия стресс-факторов Это достигается за счет реализации двух существующих одновременно (или последовательно) путей адаптации живых организмов к экстремальным факторам среды: 1) индукции синтеза отсутствующих ранее макромолекул с новыми свойствами, обеспечивающих "нормальное" протекание клеточного метаболизма при стрессе и 2) оптимизации внутриклеточной среды функционирования ферментных систем за счет аккумуляции низкомолекулярных органических соединений, обладающих протекторными свойствами (Narayanan et al., 1989; Freytag et al., 1990; Belowaly, Bouharmont, 1992; Долгих, 1994; Ларина, 1995; Bajji, Kinet, 1995)

Оба пути адаптации направлены на решение одних и тех же задач: на обеспечение организма энергией, восстановителями, предшественниками нуклеиновых кислот и белков, а также на поддержание функционирования клеточных регуляторных систем в условиях стресса (Кузнецов, Шевякова, 1999, Кузнецов Вл., Дмитриева, 2006).

Эти задачи решаютсяУ ходе "реализ!ции адаптационного процесса,-который условно может быть разбит на две основные стадии: стресс-реакцию й специализированную адаптацию. В первой стадии имеет место мобилизация или формирование ^защитных ¿систем, обеспечивающих кратковременное выживание организма в условиях повреждающего действия стрессора! На второй стадии происходит формирование специализированных адаптационных механизмов, ответственных за протекание онтогенеза_;в условйях^цлйтельного

действия стрессорного фактора (Кузнецов Вл., Кимпел, Гокджиян, 1987; Кузнецов, Шевякова, 1999; Якубова, 2011).

Генная и гормональная регуляции, будучи важнейшими эндогенными составляющими саморегуляции в живом организме, являются центральной частью регуляторных механизмов клетки как целостной системы (Шевелуха, 1992). По-видимому, запуск стрессовой реакции различными факторами связан с их воздействием на активность генов, ответственных за общую неспецифическую устойчивость растительного организма. В частности, были получены аргументы в пользу существования неспецифических элементов в первичной реакции генома растений на воздействие как пониженных, так и повышенных температур (Кузнецов, Пустовойтова, 1992). В работах Шакировой (2000, 2001) рассмотрены в сравнительном плане неспецифические защитные механизмы природных и синтетических регуляторов роста. В работах Титова с соавторами (2006), Талановой (2009) и Веселова (2001) отражена роль фитогормонов в первичной реакции растений на стресс. К числу таких реакций относятся сдвиги в гормонально-ингибиторном балансе в сторону образования стрессовых гормонов, а также изменения в соотношении антиоксиданты/оксиданты, ингибирование процессов роста и фотосинтеза (генерация АФК, накопление абсцизовой кислоты, изменение спектра индуцируемых защитных белков). В работах Колупаева и Карпеца (2007, 2009, 2010) анализируются общие сигнальные интермедиаты, участвующие в формировании адаптивных реакций растений при действии ряда стрессоров. К таким интермедиатам относятся Н202, Са и ряд других.

Учеными было показано, что стрессоры не однозначны по механизму ингибирующего и повреждающего действия, и при выборе достаточно эффекти