Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Вариабельность по солеустойчивости у сегрегантов соматического гибрида картофеля

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Вариабельность по солеустойчивости у сегрегантов соматического гибрида картофеля"

-. — о

I I и

1 1

ИОЯ

На правах рукописи

БУРГУТИН Александр Борисович

ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ ПО СОЛЕУСТОЙЧИВОСТИ У СЕГРЕГАНТОВ СОМАТИЧЕСКОГО ГИБРИДА КАРТОФЕЛЯ

(03.00.12 - физиология растений)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель член-корреспондент РАН. академик РАСХН проф.--Р. Г. Бутенко

Москва - 1996

Работа выполнена в ордена Трудового Красного Знамени Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН.

Научный руководитель

Официальные оппоненты

член-корреспондент РАН. академик РАСХН, доктор биологических наук, профессор Р.Г. Бутенко

доктор биологических наук В. В. Мазин

кандидат биологических наук И.М. Яшина

Ведущая организация

- МГУ. Биологический факультет

Защита диссертации состоится ОкГ^ 1996 г.

в У часов на заседании Диссертационного совета по присуждению ученой степени кандидата биологических наук (К 002.45.01) при Институте физиологии растений РАН по адресу: 127276. Москва И-276. ул. Ботаническая. 35.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН.

Автореферат разослан

" 996

г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета. ^

кандидат биологических наук

Л

М.И.Азаркович

- 3 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Успех физиологам культивируемых клеток и управляемый морфогенез (Бутенко. 1964) открыли новые возможности получения измененных форм растений. Одна из таких во'зможностей -гибридизация соматических клеток (Carlson. 1972; Butenko. 1979; Глеба, Сытник. 1984). В "неполовых" гибридах от диких форм с культурными порой выражены характеристики дикой формы. Чтобы не потерять ценные признаки, уже сочетающиеся в соматических гибридах, можно улучшить такую форму не возвратным скрещиванием с сортом, а получением сомаклональных вариантов от гибрида в надежде на сегрегацию соответствующих признаков партнеров. Учитывая высокую изменчивость гибридного генома от сексуальных скрещиваний в культуре клеток (Терновский и др.. 1972). можно попытаться также улучшить соматические гибриды с помощью клеточной селекции и корректировать комплекс свойств гибрида: сочетать, например, устойчивость к патогенам с устойчивостью к абиотическому фактору (например, засолению). а также с детерминантами культурной формы.

При использовании подобных подходов преимущество имеют вегетативно размножаемые культуры (например, картофель), так как любой достигнутый успех закрепляется клонированием (Яшина. 1984). Картофель - важнейшая после злаков культура. Благодаря биологическим особенностям Solanum tuberosum, картофель чрезвычайно пластичен и его сорта возделываются от тропиков до Арктики. Широкий ареал требует улучшения формы применительно к регионам. Коррекция признаков соматических гибридов картофеля по-видимому возможна при сегрегации детерминант партнеров после геномных обменов у растений-реге-нерантов из каллуса гибрида и эффективной клеточной селекции гибридного материала.

Цель и задачи исследования. В работе с соматическим гибридом картофеля (Solanum tuberosum L.+ S. chacoenese Bltt.) мы преследовали две цели:

1. Изучение принципиальной возможности сегрегации детерминант партнеров у сомаклональных вариантов, полученных из каллусной ткани гибрида;

2. Использование повышенной изменчивости гибридного генома для целей клеточной селекции на устойчивость к хлористому натрию. Для достижения поставленных целей необходимо было выполнить

следующие задачи:

1. Получить сомаклональные варианты (растения-регенеранты) гиб-

- 4 -

рида от культуры каллусной ткани;

2. Проследить во времени морфофизиологические картины изменчивости полученных линий растений;

3. Проанализировать с помощью доступных нам систем сегрегацию

детерминант партнеров соматического гибрида;

4. Провести отбор на устойчивость к NaCl в системе клеточной

селекции у гибрида;

5. Оценить результаты отбора на уровне растений In vitro.

Научная' новизна работы. Впервые показано, что с помощью сомак-

лональных вариантов растений, полученных от каллусной культуры соматического гибрида выявляется сегрегация детерминант партнеров по соматической гибридизации. Показано преимущество использования короткой схемы клеточной селекции; селективный фактор при этом применялся только для тканей первого пассажа. Получены вариантные линии растений соматического гибрида картофеля, толерантные к хлористому натрию в условиях In vitro. Удалось показать вклад как со-маклональной вариабельности, так и значение фактора селективного отбора на результат формообразовательного процесса in vitro.

Практическая значимость работы. Использование сегрегации детерминант партнеров при получении сомаклональных вариантов соматических гибридов может быть полезным в селекции как метод создания дополнительного разнообразия за счет межгеномных обменов партнерских форм внутри генома гибрида. Показано, что сомаклональная вариабельность дала возможность отобрать искомые варианты - солеустой-чивые клоны - в единственном субкультивировании каллусов.

Апробация работы. Результаты исследования были представлены на: 1. Всесоюзном совещании по регуляции роста и развития картофеля. Москва, 1988; 2. Международном рабочем совещании по проблемам селекции картофеля. Киевская обл.. Немешаево. 1989 г.; 3. II Российском симпозиуме "Новые методы биотехнологии растений". Пущино, 1993; 4. III Съезде Всероссийского общества физиологов растений. С.-Петербург. 1993; 5. II Международной конференции "Биология культивируемых клеток и биотехнология". Алматы. 1993; 6. Расширенных семинарах Отдела биологии клетки и биотехнологии ИФР РАН 1988, 1993. 1994. 1995.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ.

Структура диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение, выводы, список литературы. Работа изложена

аЗО - 5 -

на 116 страниц /машинописного текста, содержит 7 таблиц. 16 рисунков. список литературы включает 288 наименования.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объекты исследования. В качестве объектов использовали:

1) межвидовой соматический гибрид (далее гибрид) Solanum tuberosum L. + S. chacoense Bitt. (получен в работе Бутенко Р.Г. и Кучко A.A.. 1979) - пробирочные растения:

2) исходные партнерские формы соматического гибрида'в" виде про-" бирочных растений, переданные нам из Украинского НИИКХ в 1981 г. : S. tuberosum L.. сорт Приекульский ранний; S. chacoense Bltt.. f. paroQll. К - 2940.

Растения поддерживали микрочеренкованием в пробирочной культуре в камерах фитотрона ИФР РАН (+22°... +23° С днем и +20° ночью: длина дня 1С часов: освещенность на уровне растений 9000 - 10000 люкс (лампы ЛБ-80). По мере необходимости растения высаживали в почву. Каллусные культуры гибрида получали от отрезков междоузлий (длина 3-5 мм. без почки) пробирочных растений. Экспланты и каллусы культивировали в чашках Петри диаметром 80 мм с 15 мл питательной среды.

Питательные среда. Для культивирования In vitro растений и клеточных культур применяли питательные среды на основе прописи солей Мурасиге и Скуга (Murashlge. Skoog, 1962) со следующими основными ингредиентами в мг/л в каждом случае: а) поддержание и размножение пробирочных растений - без применения ауксинов и цитокининов; б) инициирование и субкультивирование каллусных тканей - сс-НУК - 5.0, 6-БАП - 0.5; в) регенерацию растений из клеточных культур проводили в два этапа: Среда 1-го этапа (шг1) - 6-БАП -0.5, а-НУК - 0.1. Среда 2-го этапа (тг2) - зеатин - 0.5, - ß-ИУК - 0.1.

Методические подробности опубликованы (Бургутин и др.. 1994).

В экспериментах по селекции в питательные среды вводили NaCl как селективный агент в различных концентрациях в зависимости от задач.

Биохимические исследования. Сравнительный биохимический анализ спектра запасных белков, изоэстераз и изопероксидаз проводили на микроклубнях, корнях, стеблях и листьях пробирочных культур в возрасте 5-6 недель для вегетирующих растений и в фазе покоя для физиологически зрелых микроклубней.

Экстракцию легкорастворимых белков из тканей растений, фракцио-

нирование белков и изоферментов электрофорезом и изоэлектрофокуси-рованием. а также выявление белковых компонентов, изоэстераз и изопероксидаз в гелях проводили согласно опубликованным материалам (Мусин. 1989).

При классификации электрофоретических спектров растворимых белков микроклубней опирались на методы, использованные в европейском каталоге-определителе сортов картофеля (Stegeman, Loeschke. 1976): при анализе изоферментов использовали единую номенклатуру для Solanum, Lycoperslcon и Capsicum (Douches. Qulros, 1987).

Эксперименты повторяли не менее 3-4 раз.

Цитологические наблюдения. Для подсчета числа хромосом в клетках кончиков корешков молодые пробирочные растеньица через 8-10 суток после черенкования (при длине корней 10-15 мм) помещали на ночь на холод (+2° С); далее кончики корней фиксировали в уксусном алкоголе (этиловый спирт/уксусная кислота - 3:1). окрашивали гематоксилином, готовили давленые препараты и микроскопировали согласно общепринятым подходам (Паушева. 1974).

Морфометрические измерения. Параметры роста растений In vitro партнеров по гибридизации, соматического гибрида и его сомакло-нальных вариантов многократно оценивали на уровне пробирочных растений и растений в почвенной культуре. Для пробирочных растений учитывали параметры: высота побега и число узлов стебля на 25 день культуры, аномалии развития побега и листа, окраска стебля и листа. опушенность растения, развитие корневой системы, окраска клубня. Достоверность различий испытуемых линий растений з сравнении с гибридом по толерантности к NaCl оценивали по статистическим критериям: F (Фишера), t (Стьюдента). U (Вилкоксона - Манни - Уитни).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Характеристика соматического гибрида.

Соматический гибрид (Solanum tuberosum I. + S. chacoense Bltt.) был изучен до нашего исследования: по анализу потомства от самоопыления 4% растений от Fl имели морфологию культурного вида. 29% -дикого вида и около 60% промежуточного типа; биохимический анализ (исследование белка фракции I) подтвердил гибридность по ядерным детерминантам; анализ рестрикционных фрагментов хлоропластной и митохондриальной ДНК показал, что цитоплазма также гибридна (Butenko et al.. 1984); морфологические признаки гибрида демонстрировали промежуточное наследование (Кучко. 1982). Гибриду был

присущ гетерозис - мощное развитие куста, высокая фертильность.

1.1. Стабильность растений соматического гибрида. По нашим наблюдениям. начиная с 1981 года по настоящее время (1996 г.) пробирочные растения исходного соматического гибрида в культуре In vitro проявили стабильность по морфологическим- признакам. За 14 лет наблюдения (более 90 вегетативных субкультур при микрочеренковании) не бьшо отмечено существенных изменений в развитии пробирочных растений гибрида по следующим параметрам: габитус и высота побега, листорасположение (очередное), форма листовой пластинки, развитие корневой системы, способность к образованию микроклубней. Не было отмечено химерности по хлорофиллдефектности. Для гибрида стабильность по перечисленным показателям сравнима с партнерами по гибридизации (сорт Приекульский ранний и дикий вид картофеля), а также с другими сортами S. tuberosum и формами Solanum нашей коллекции In vitro . Наши наблюдения над растениями гибрида в почве (вегетационные и полевые культуры) показали сохранность растениями гибрида первоначального габитуса и высокой фертильности, которые были отмечены ранее в работе А.А.Кучко (Кучко, 1982).

Мы предполагаем, что применение нами питательной среды для размножения растений In vitro без ауксинов и цитокининов способствовало стабильности морфофизиологических характеристик растений гибрида in vitro на протяжении многих лет наблюдений. .

1.2. Цитологическая характеристика гибрида. По данным, полученным в 1978 году (Бутенко, Кучко. 1979), гибрид являлся миксоплои-дом с модальным числом хромосом в соматических клетках, близким к 60 (4035 клеток) при размахе варьирования от 37 до 80 хромосом. Анеуплоидия (и миксоплоидия) гибрида удивления не вызывали, так как он был получен из неорганизованной ткани после слияния протопластов партнеров. В нашем исследовании, проведенном через 10 лет после получения гибрида, было обнаружено, что модальное число хромосом в соматических клетках гибрида гипотетраплоидное (меньше 48) при размахе варьирования 35-51 (Рис. 1). По-видимому, мы столкнулись с клеточной элиминацией, когда некоторые несбалансированные клетки уходят из популяции (либо имеет место селективная элиминация хромосом). При этом гибрид остался миксоплоидом, а существенных фенотипических изменений растений гибрида за наблюдаемый период нами не обнаружено. Факты гибридной мощности и высокой фертильности при выраженной анеуплоидии и миксоплоидии у Solanum известны для ряда гибридных семей от отдаленных скрещиваний (Брокш. 1992).

К сожалению, сложность морфологических различий партнерских хромосом у изучаемых видов (Оболоник, 1986) как в исходном гибридном материале в 1978 году, так и после 10 лет размножения, не позволяет более точно охарактеризовать происшедшие изменения.

Число метафаз

35 36 39 40 41 42 43 44 45 4S 47 48 49 51

Число хромосом

Рис. 1. Распределение метафаз клеток кончиков корешков по числу хромосом у растений соматического гибрида картофеля in vitro.

1.3. Подтверждение гибридности. Несколько причин заставили нас отвечать на вопрос о сохранности гибридного статуса формы, полученной после слияния протопластов в 1978 г.: цитологические изменения. наблюдаемые нами через 10 лет культивирования растений гибрида; постоянство морфофизиологических характеристик растений: черты фенотипа гибрида, которые свойственны дикой форме. И. наконец. данные литературы о непостоянстве гибридного генома растительных клеток, культивируемых In vitro (Larkln. Scowcrbft. 1981).

Изоэлектрофоретический анализ, осуществленный в настоящей работе. показал, что гибрид по составу растворимых белков клубней близок к S. chacoense (Рис. 2). Это подтвердили и данные диск-электрофореза в системе Davis. В то же время мы отметили наличие у гибрида мажорных компонентов, соответствующих компонентам спектра Приекульского раннего в областях с р! 5.6 и р! 9.3 при изоэлектро-

Рис. 2. Спектры ИЭФ растворимых белков микроклубней сорта Приекульский ранннй (1), формы сЬасоепзе В^и. (2) и межвидового соматического гибрида картофеля (3). Белки-маркеры р1: а - ингибитор трипсина (р1 4,55), Ь - бета-лактоглобулин (р1 5,13), с -карбоангидраэа В (быка) (р1 5,85), с1 - карбоангидраза В (человека) (р1 6,57), е - ми-оглобнн (р! 7,16).

фокусировании в диапазоне pH 3,5 - 9.5. У второго партнера по гибридизации (S. chacoense) эти компоненты не были обнаружены. Детальный анализ в более узких диапазонах pH однозначно подтвердил идентичность pi этих компонентов гибрида белкам культурного сорта (Рис. 2.).

Изопероксидазная система корней пробирочных растений картофеля оказалась удобной для биохимической идентификации форм картофеля в культуре In vitro (Мусина, Кусин, 1992). Поэтому особенно вахно было обнаружение у гибрида компонентов пероксидазы корней обоих родительских форм в зоне с Rf 0.34-0,40 (Рис. 36). Напомним, что для доказательства гибридности используются белковые компоненты, представленные у исходных генотипов альтернативно и детерминантные по видоспецифичности у Solanum. Последнее предполагает, что элект-рофоретические компоненты с. Приекульского раннего и S. chacoense. обнаруженные у гибрида, тождественны генетическим детерминантам S. tuberosum и S. chacoense.

Ярким маркерным компонентом культурного сорта является эстераза с pi 6.9 (Рис. 4а. стрелка); она не найдена у диплоида. но представлена у гибрида. В этой зоне у гибрида найдены компоненты обоих партнерских форм.

i.4. Эффективность образования побегов из каллуса гибрида. Еще одна характеристика соматического гибрида делала реальными получение сомаклональных вариантов растений и проведение клеточной селекции. При сравнении образцов нашей коллекции (Бургутин, Бутенко, 1984) растений картофеля in vitro по эффективности образования побегов из первичных и пассируемых каллусов гибрид показал наибольшую способность к образованию побегов (Butenko et al., 1984).

2. Получение солеустойчивых вариантных линий растений с использованием соматического гибрида.

При выборе селекционного фактора как модельной системы мы обратили внимание на отсутсвие информации о программах традиционной селекции по толерантности к засолению у картофеля (Epstein et al.. 1980). Это побудило нас в 1983 году обратиться к методам In vitro, используя в качестве модельного объекта соматический гибрид. К этому моменту уже появились убедительные примеры таких подходов для других растений (Dix, Street, 1975; Ошмарина и др.. 1983).

2.1. Клеточная селекция. При выборе схемы клеточной селекции мы наметили всего одно субкультивирование каллусов гибрида на среде с хлористым натрием (Рис. 5).

0.12— -

(б).

"!Ьг".

| | -0.08 Ц-о.

18

и- —0.25

— 0.34

— 0.40

0.52-

г5 Iщм. Щ П.Щ&-Щ

Щ Р5

1 2 3 4 5 6 7 Я 9 ¡0 "|Ьг""с1Г Н. 4 5.3 5.1 5.2 13 15 16

. .' — 0.60

■ ¿Номера

1 2 3~'4~5~"б~ 7 '8 9' 10 1рекоп "1Ъг" "сЬ* II. 4 53 5.1 5.2 13 15 16 Лшши

спектры ? лектр сссрега :,:нонественнь::{ телекуля

Ал-.-

1 - сорт Прпекулсск::::: ранн:п':, ; - ферма 5. -.о

~ - ' Т ---'ВС'^7 ~ ■ " V— --1 ~ ' — —ТТ^-Г.ТТ— ^ — - - . — - --—- —

-:гн?.л ,-г.н:!Л 4, с - линия 5.5. 5 - 5.:, ~ - линия 5.5, £ -

:я 13. - линия 15, 10 - линия 15.

(а)

П Я"?' я • ■

-гг.

<53

(б)

«в — — ----• «»«■»«■»

|—р!

__р1 Х.5-

»

.2 3 4 5 Л 7

1 2 3 4 5 6 7 X9 К) II 12 ' фскст •ЧЬг"."и1Г И. 4 5 5.3 5.1 5.2 13 35 17 25 .Лшши

г КС. -±. 1 - С

Спектры }-ей мнокёственных код-куляркых форм алъФа-астерагы (а) п побегов (б) пробпрочннн растений. Нумерация треков: :рт Приекулгский ракнпй, 5 - ссрма 3. сЬасоепзе Б1Рг. , 3 -

*.й;ч2П5СНСй соматический гибрид. 4 - ссмаклснальная вариантная линия 4. 5 - линия Б, 5 - линия 5.3. " - линия 5.1. Б - линия 5.3 - линия 13. 10 - линия 35, 11 - линия 17, 12 - линия 25.

7

— 0.08

0.360.40-

0.52 —

Т/: \215 ''5"6 8' ^¡^^'Ш^^Д^ЩИ/Щ«-!»-^©^!^ {ЧьЖлЧЮ4 '5735.1 5Д1И115' 16Ш ' ¿'ЧЬг"'ГсЬ',Н.1<П5.3'15.1 5.2.13 ¡15 !Д6 Шн

Рис. 3. Спектры электрофореза множественных молекулярных форм пе-роксидазы стеблей (а) и корней (б) пробирочных растений. Нумерация треков: 1 - сорт Приекулъский ранний, 2 - форма Б. сЬасоепве , 3 - межвидовой соматический гибрид, 4 - сомаклональная вариантная линия 4, 5 - линия 5.3, 6 - линия 5.1, 7 - линия 5.2, 8 -линия 13, 9 - линия 15, 10 - линия 16.

Рис. 4. Спектры ИЭФ множественных молекулярных форм алъфа-эстеразы

листьез (з) и побегов (б) пробирочных растений. Нумерация треков: 1 - сорт Приекулъский ранний, 2 - форма Б. с1тасоепзе Вг^., 3 -межвидовой соматический гибрид, 4 - сомаклональная вариантная линия 4, 5 - линия 5, 6 - линия 5.3, 7 - линия 5.1, 8 - линия 5.2, 9 - линия 13, 10 - линия 35, 11 - линия 17, 12 - линия 25.

Рис. 5. Схема клеточной селекции и оценка ее результатов. (тт~1 тг? - тепы яля пегенегзздии побегов)

Рис. 6. Рост каллусов соматического гибрида на средах с хлористым натрием (26'день культуры). Концентрации соли : верхний ряд чашек (слеза направо): 0% (контроль), 0.1%, 0.5%, 1.0%; нижний ряд: 1.5,%, 2.0%, 3.0%.

гис. 7. Рост растений ir. vitro соматического гибрида на фоне различны:: концентраций хлористого натрия (20-е сутки культивирования} . Номера на пробирких соответствует следующим концентрациям соли: 1 - без соли; 2 - 0.1%; 3 - 0. 2%; 4-0.3%; 5 - 0.4%; 6 -0.5%; 7- С. П; 8 - 1%; 9 - 1. 5%.

Отрезки междоузлий пробирочных растений гибрида культивировали на питательной среде для неорганизованного роста без хлористого натрия 25 суток. Первичные каллусы, образовавшиеся на срезах стебля. . были отделены от ткани экспланта и транспланты весом около 50 мг.перенесены на поверхность идентичной питательной среды в вариантах со следующими концентрациями хлористого натрия (в %): О, 0.1. 0.5, 1.0. 1.5. 2.О и 3.0. В каждом варианте было высажено по 36-45 каллусов, по 9 каллусов на чашку. На 26 сутки культивирования (Рис. 6) варианты с 0.1 и 0.5 36 соли мало отличались от конт-. роля. Заметно меньшего размера были каллусы при 1.0% хлористого натрия и резкое ингибирование роста было отмечено в варианте с 1.5 процентами соли. При 2% соли некоторые каллусы побурели, а при 3 % соли отмечен полный некроз ткани.

Для дальнейшей работы (перевод культуры на среды для регенерации. без соли) были выбраны ткани от вариантов: контроль, с 1%. 1.5 % и 2 % соли. От каждого из 4-х перечисленных вариантов было пересажено на среду для регенерации 36-45 каллусов. Каллусы без расчленения перенесены на среду регенерации 1-го этапа (см. "Материалы и методы"). Активная пролиферация и последующая регенерация побегов на среде 2-го этапа отмечены для тканей от вариантов: контроль. 1 % и 1.5 % соли: ткани от варианта с 2 % NaCl не развивались. Образующиеся побеги отделяли от каллуса и переносили на среду для клонального размножения. От каждого каллуса отбирали не более одного побега, чтобы исключить клонирование идентичных форм. Каждый регенерант. размноженный черенкованием, дал начало сомакло-нальной вариантной линии.

2.2. Оценка результатов селекции. Первым шагом для оценки результатов селекции было определение чувствительности растений гибрида к присутствию хлористого натрия в среде размножения (Рис. 7). Не было обнаружено стимуляции по развитию побегов к 30-м суткам культуры на фоне используемых концентраций соли. Мы убедились, что 0.7% соли в спектре изученных концентраций является сублетальной для растений гибрида и оценки вариантных линий растений по толерантности к NaCl проводили именно с этой концентрацией.

В 1985 году для одновременного испытания на толерантность к NaCl всех вариантных линий они были пронумерованы от 1 (гибрид) до 39 и представлены тремя группами растений: первая группа - с N 2 по К 7 - от каллусов без селекции, вторая группа - с N 8 по N 15 - от каллусов варианта с 1 % NaCl.

третья группа - с N 16 по N 39 - от каллуса варианта с 1.5 % NaCl.

От каждой линии растений на среду размножения с 0.1 % NaCl было высажено по 7-11 черенков. При ранних сроках (на .11 и 20 сутки) по визуальной оценке не были выявлены варианты, явно превосходящие гибрид по высоте побега. Окончательная оценка была проведена на 65 день культивирования (Рис. 8). Результаты испытания представлены в виде достоверности отличий исследуемых линий растений от гибрида по двум морфологическим показателям: а) частоте образования побегов из черенков; б) высоте побегов.

Поскольку все черенки гибрида дали побеги, не было выявлено клонов, превосходящих гибрид по этому показателю. Пять линий растений (NN 17. 25. 35. 36. 37) достоверно превышали гибрид по высоте побегов; все они относились к 3-й группе растений (от каллусов, культивировавшихся на среде с 1,5 % NaCl).

Результаты скрининга 1985 года были подтверждены в многократных оценках In vitro на протяжении 10 лет работы с некоторыми из вариантных линий. В этих последующих оценках испытывали растения линий NN 17. 25. 35 из пяти указанных выше и в одном из испытаний линию N 4 из группы растений без селекции. Показателями оценки служили: высота растений, сухой вес побега, число корней. Во всех испытаниях линии NN 17, 25. 35 превышали исходную форму по всем трем показателям. Средние значения показателей за все годы испытаний для каждой из этих трех линий растений на 60-70 день культуры (Рис. 9 а) демонстрируют достоверную разницу между гибридом и отобранными вариантами.

На фоне NaCl для отобранных линий наиболее быстро выявлялось превышение над гибридом по числу корней на растение. В 1994 году это отмечено на 9 сутки культуры для линии N 35 (Рис. 9 б), что подтвердилось в дальнейших испытаниях в 1995 г. В то же время, линия N 4 (регенерант. от каллуса без селекции) не показала превышения над исходной формой, также подтвердив оценку 1985 года.

Положительный итог нашей работы свидетельствует о возможности использования короткой схемы клеточной селекции.

Причиной большей толерантности к NaCl исследуемых линий по сравнению с гибридом мог быть отбор по общей биологической продуктивности (мощность развития). Г.В. Удовенко (Удовенко. 1977) считает. что при сравнении генотипов по солеустойчивости корректно одновременно учитывать их продуктивность без засоления. Неоднок-

О 1 ■ о

N.. 2 Л 4 :

I I I—

^ее-

ч I О 1 О 1 I иши | и—| | |

7 К 9 1011 12 13 И 15 16 17 18 192021 22232423262728293031 32 33 3435 3637 38 39 I I I I I

ООООI о

I IООI ООО

*** 0.001 ** 0.01 * 0.05

■ее-

-4-1—Ь

-4—+

-I—I—I-

-4-

-4-

6

Рис. 8. Достоверность отличий изучаемых линий растений в сравнении с гибридом (НбО по частоте образования побегов из черенков и по высоте побегов (0.7% ЫаС1; 65 день культуры) .

*, *-*, *** - уровни значимости.

Кружок (о) означает отсутствие достоверных отличий от N31; сплошные вертикальные отрезки - отличие от ^ по высоте побегов (и критерий); пунктирные отрезки - отличия от ^ по частоте образования побегов (Г критерий); вверх от центральной горизонтальной линии - превышение над №1 (+ №0; вниз от линии - меньше N31 (-N31); две стрелки разделяют три группы растений, полученные от трех вариантов каллусных тканей (слева направо: без N3121, 1% ИаС1, 1.5% ИаС1).

Высота Сухой вес Число Время культивирования до

побега побега корней момента измерения, сутки

Рис. 9. Поведение линий растений in vitro в сравнении с соматическим гибридом (Nst).

(а) Параметры роста побега и корней у линий, растущих в присутствии 0.77. NaCl в питательной среде (60-70 дни культуры); средние показатели за годы наблюдений (1985-1994).

(б) Число корней у изучаемых линий растений н(а фоне 0.77. МаС1 (эксперимент 1994 года). Линии растений: (1) Nst; (2)и4; (3)л/17; (4)л/25; (5)V35. Плюсы над столбиками соответствуют уровням значимости (+++ - Р <_ 0.001; ++ - Р <_ 0.01).

ратные прямые эксперименты по сравнению ростовых параметров (высота и сухой вес побега» число узлов стебля, число корней на растении) исследуемых линий с растениями гибрида на среде без NaCl показали. что достоверных различий выявлено не было Это означает, по-видимому, что на средах с NaCl отселектированныё линии превышают гибрид по солеустойчивости не из-за мощности развития, а именно из-за свойств, приобретенных в результате селекции на толерантность к хлористому натрию (Строгонов, 1962).

Приведенные нами данные- свидетельствуют об определенных преимуществах отбора на солеустойчивость с использованием целых растений In vitro. Оценивая результат отбора культивируемых клеток по целым растениям (полученным от этих клеток), мы избегаем противоречий, когда устойчивость на уровне клеточной линии не совпадает с устой-" чивостью растения.

Следует особо подчеркнуть, что при субкультивировании без соли наши линии сохранили отселектированный признак толерантности после более 60 вегетативных поколений In vitro; это может косвенно свидетельствовать в пользу стабильных изменений, определяющих повышенную толерантность к хлористому натрию.

Все полученные в нашей работе линии растений являются сомакло-нальными вариантами и каждая из них с равным успехом могла быть изменена в ту или иную сторону. Наличие селективного давления на стадии неорганизованного роста выявило более резистентные к хлористому натрию варианты. И отсутствие таких вариантов (согласно примененным показателям) от каллусов без селекции и от каллусов, культивировавшихся при сравнительно низком уровне селективного давления (Рис. 8). также свидетельствует в пользу селекции, что согласуется с данными известного исследования на табаке (Bressan et al.. 1985). согласно которому только достаточно высокий уровень хлористого натрия приводил к стабильным изменениям, а при более низких уровнях засоления возникающие варианты теряли приобретенные свойства.

3. Изменчивость сомаклональных вариантов соматического гибрида.

3.1. Распределение вариантные форм среди регенератов соматического гибрида. В 1984-85 годах вариантные линии растений гибрида были оценены по морфологическим показателям. При визуальной оценке все 38 линий растений можно разделить на 2 группы: клоны, близкие по габитусу к гибриду (23 линии) и клоны, в той или иной мере из-

мененные (15 линий) (См. Табл. 1). Во всех трех группах клонов по происхождении (т.е.. регенеранты от каллусов, которые культивировали при разных концентрациях ИаС1) встречаются как измененные (чаще уродливые), так и неизмененные морфологически формы. Наблюдается некоторая тенденция, по которой измененные формы чаще проявлялись при меньшем селективном давлении на каллусную культуру (IX ИаС1) или в отсутствие селективного давления. Похожая тенденция (закономерность) отмечена в работе группы Л.Ы. Хромовой (Кирсанова. 1993). где использовали УФ. температуру. +35° е.. длительную культуру суспензии. Напомним, что в нашей работе более толерантные к соли клоны (5 клонов) выявлены только от каллусов варианта 1.5% КаС1; при этом все толерантные к соли клоны входят в группу неизмененных.

Табл. 1.-

Распределение вариантных форм среди полученных регенерантов (клонов) по группам (шт.) ».

ГРУППЫ растений

По габитусу По происхождению от каллусов

Без NaCl с 1 % NaCl с 1.5 % NaCl 1

Близкие к соматическому гибриду 1/0 4/0 18/5 23/5

Отличающиеся от гибрида 5/0 4/0 6/0 15/0

I 6/0 8/0 24/5 38/5

• В числителе - число клонов в группе, в знаменателе - число клонов, толерантных к ИаС1

3.2. Норфофизиюлогинеские и цитологические наблюдения. Подсчет числа хромосом в кончиках корней вариантных растений In vitro не дал новой информации - распределение клеток по плоидности соответствовало (было близким) таковому гибрида (см. Рис. 1): а слож-

ность различий хромосом родительских форм гибрида не позволила нам более точно охарактеризовать наблюдаемые картины цитологической изменчивости.

Сомаклональная вариабельность пробирочных растений помимо толерантности к NaCl выражалась в следующем: 1.. Изменена пластинка листа: она неправильной формы, несимметрична относительно главной жилки, ткань листа гофрирована, утолщена: 2. Встречаются сближенные и супротивные листья: 3. Ослаблено корнеобразование: 4. Замедлен рост побега; 5. - Отмечена химерность по хлорофиллдефектности; 6. Различна эффективность образования микроклубней; 7. Выражено различие по способности регенерации побега de novo из стеблевого экспланта.

Перечисленные различия от исходной формы мы наблюдали на протяжении более 10 лет; они сохранялись при выращивании растений In vitro в широком диапазоне условий (освещенность от 3 до 15 клк, температура от +5° до +29° С). Приобретенный габитус также сохранялся при возобновлении вегетации In vitro из микроклубней.

Наиболее подробно и длительно мы наблюдали восемь сомаклональ-ных линий гибрида (NN 4, 5. 13. 15. 16. 17. 25. 35). Эта группа была представлена как измененными формами (NN 5. 13. 15). так и формами, напоминающими гибрид. Особый интерес представляет для нас линия N 5. так как при микроразмножении черенкованием этой линии в течение ряда лет от нее выделились четыре новых измененных клона с устойчивым сохранением нового габитуса (NN линий 5.1. 5.2. 5.3, 5.4). Линия N 5.2 при выращивании в почве напоминала "культурного" родителя (S. tuberosum) по габитусу куста и форме листа. Вполне понятно, что такие морфологические картины сходства могут быть результатом случайной конвергенции в аномальности и не связаны с генетическим родством. Но мы не исключаем возможности сегрегации детерминант партнеров по гибридизации и - как результат - выщепление форм с новым сочетанием признаков партнеров. Получить семена от указанных измененных форм не удалось - из 19 растений линии N 5.2. наблюдаемых в вегетационном опыте, только у одного растения была отмечена бутонизация, не завершившаяся цветением. Так как гибридологический анализ не реален, мы провели исследование доступных нам систем экспрессии для выяснения наблюдаемых картин изменчивости.

3.3. Сегрегация биохимических детерминант партнеров по гибридизации у сомаклональных вариантов соматического гибрида. Мы попытались определить детерминанты партнеров по гибридизации изучаемых сомаклональных вариантов путем сравнения запасных белков, изоэсте-раз и изопероксидаз микроклубней и этих же изоферментов отдельно у корней, стеблей и листьев пробирочных растений картофеля. Основанием для анализа перечисленных белковых систем послужила работа по паспортизации сортов картофеля (Мусин. 1989). где продемонстрирована возможность идентификации сортов и форм на основе белковых маркеров с высокой разрешающей способностью.

Соматический гибрид, полученный после слияния протопластов из неорганизованной ткани, можно считать сомаклональным вариантом по определению. Подтверждением этого является появление в электрофо-ретических'спектрах белков микроклубней гибрида компонентов, которые не были обнаружены у исходных родительских форм. Одним из заметных проявлений сомаклональной вариабельности среди сомаклонов гибрида по изоэстеразной системе побегов было исчезновение компонента с р1 8.5 у вариантов NN 17 и 25 (Рис. 46): у остальных сомаклональных линий и у гибрида этот компонент проявлялся достаточно интенсивно, но отсутствовал у родителей гибрида. Важно отметить, что варианты NN 17 и 25 морфологически близки к соматическому гибриду и толерантны к №С1. Линия N 35. также толерантная к соли и напоминающая гибрид, сохранила отмеченный выше компонент с р1 8.5. В связи с последним следует отметить, что не удалось использовать эзозимы эстеразы побегов как маркеры солеустойчивости.

Линия N 5.2. "подозреваемая" нами как сегрегант по морфологическим картинам изменчивости, не проявляла подобной сегрегации ни по одной из анализируемых систем биохимических маркеров.

С помощью изопероксидазной системы удалось показать сегрегацию детерминант партнеров для сомаклональных вариантов.

Так. маркерная изопероксидаза стеблей с ИГ 0.36. специфичная для Б. сЬасоепэе и обнаруженная у соматического гибрида, у линий NN 5.1 и 13 не была найдена (Рис. За). У этих же линий отсутствовал компонент пероксидазы. специфичный для стеблей, с ИГ 0.40, характерный для культурного сорта, найденный у гибрида и представленный у остальных вариантных форм (Рис. За).

Наиболее ярким проявлением сегрегации детерминант партнеров (и одновременно сомаклональной вариабельности) в изопероксидазной системе корней пробирочных растений была линия N 13 (Рис. 36). У

этой линии отсутствовали маркерные компоненты S. tuberosum с Rf 0.34 и 0.40. присутствующие у всех анализируемых сомаклональных линий и гибрида. При этом напомним, что растения линии 13 по морфологическим показателям не схожи с родительскими формами и с гибридом.

Таким образом, был показан принципиальный факт сегрегации детерминант партнеров по гибридизации для сомаклональных вариантных линий растений гибрида.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Гибриды соматических клеток являются перспективной моделью для изучения изменчивости гибридного генома неорганизованно растущих культур и растений-регенерантов. полученных от них. Обнаруженный нами с помощью анализа изоферментов феномен сегрегации детерминант партнеров по гибридизации у растений-регенерантов (сомаклональных вариантов) соматического гибрида позволяет использовать подобные формы для создания измененных растений. Высокая изменчивость растений-регенерантов от гибридного каллуса позволила провести эффективную клеточную селекцию на устойчивость к хлористому натрию.

В нашем случае такой подход дал возможность корректировать комплекс свойств гибрида: форме, уже обладающей положительными селекционными характеристиками (абсолютная полевая устойчивость к Y вирусу картофеля и грибным болезням) придано свойство большей толерантности к засолению.

В нашем исследовании предложена короткая схема клеточной селекции - всего одно субкультивирование на питательной среде с хлористым натрием. Положительный итог отбора демонстрирует возможность такого подхода. Оценка результатов селекции, проведенная при испытании растений-регенерантов. а не при испытании клеточных линий, позволила устранить противоречия, возникающие при трактовке результатов клеточной селекции, так как не всегда отселектированный признак выражен и на уровне культивируемых клеток и на уровне рас-тений-регенерантов от них.

Длительное наблюдение над отобранными клонами растений In vitro (с 1984 года) показало сохранность этими клонами приобретенного свойства - толерантности к хлористому натрию.

- 23 -ВЫВОДЫ

1. Подтверждено межвидовое происхождение соматического гибрида (S. tuberosum + S. chacoense) при анализе запасных белков микроклубней. изопероксидаз и изоэстераз отдельно у корней и побегов после 15 лет клонального размножения растений In vitro.

2. Полученные из каллусов гибрида линии растений являются со-маклональными вариантами; это подтверждено как морфологическими различиями с гибридом, сохранившимися более 10 лет. так и исследованием изоферментных спектров эстераз и пероксидаз.

3. По данным изоэлектрофокусирования и диск-электрофореза отдельные белковые компоненты родительских форм гибрида по разному представлены у сомаклональных вариантов гибрида, что может свидетельствовать о сегрегации биохимических детерминант партнеров по гибридизации в геномах вариантных линий.

4. С использованием соматического гибрида картофеля в результате клеточной селекции получены вариантные линии растений, более чем исходная форма толерантные к хлористому натрию по параметрам роста побега и корней растений In vitro.

5. При субкультивировании без соли отобранные линии растений сохранили отселектированный признак после более чем 60 вегетативных поколений In vitro, что может косвенно свидетельствовать о наследственных изменениях, определяющих толерантность к хлористому натрию.

6. Предложена схема клеточной селекции, включающая всего одно субкультивирование каллусных тканей в селективных условиях: положительный итог отбора свидетельствует о применимости этого подхода.

7. Одновременное испытание всех вариантных линий растений установило появление толерантных к NaCl вариантов только при высоком уровне селективного давления: это позволило выявить обе составляющие единого процесса формообразования In vitro: сомаклональную вариабельность и селективный отбор.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Бургутин А.Б.. Бутенко Р.Г. Устойчивость клеток картофеля к этионину // Проблемы и пути повышения устойчивости растений к болезням и экстремальным условиям среды в связи с задачами селекции. Часть 2. - Устойчивость растений к экстремальным условиям среды. Ленинград. ВИР. 1981. С. 147.

2. Бургутин А.Б.. Метод диагностики эффективности регенерации растений в культуре тканей различных форм картофеля // Культура клеток растений и биотехнология. Кишинев: Штиинца.' 1983. С. 111.

3. Butenko R.G., Chromova L.M.. Sednlna G.V.. Kuchko A.A.. Burgutln A.B., Komarnltsky I.K. New forma of potato created by cell and protoplast culture methods // Tissue Culture and RES. Eds: Rohllch P.. Bacsy E. Budapest. Akad. Klado. 1984. P.515-527.

4. Бургутин А.Б.. Бутенко P.Г. Коллекция пробирочных растений картофеля // Научно-тех. бюлл. ВИР. 1984. В. 145. С.50-52.

5. Бургутин А.Б.. Ниссанка Иддагода. Мусин С.М.. Кучко A.A.. Бутенко Р.Г. Анализ сомаклональных вариантов соматического гибрида картофеля // Регуляция роста и развития картофеля. М.: Наука. 1990. С. 112-117.

6. Бургутин А. Б.. Ниссанка Иддагода. Кауров Б. А. Растения картофеля. устойчивые In vitro к хлористому натрию // 3 Съезд Всерос. Об-ва физиологов растений. С.-Петербург. 1993. С.503.

7. Бургутин А.Б. Селекция картофеля In vitro на устойчивость к хлористому натрию // 2 Мевдународ. конф. "Биология культивируемых клеток растений и биотехнология". Тезисы докл. Алматы. 1993. Т. 1. С. 87.

8. Бургутин А.Б.. Мусин С.М., Бутенко Р.Г. Сегрегация генетических детерминант у сомаклональных вариантов соматического гибрида картофеля // 2 Международ, конф. "Биология культивируемых клеток растений и биотехнология". Тезисы докл. Алматы. 1993. Т. 1. С. 88.

9. Бургутин А.Б.. Селекция картофеля In vitro на устойчивость к хлористому натрию // Новые методы биотехнологии растений. Пущино. 1993. С. 117.

10. Бургутин А.Б.. Мусин С.М., Бутенко Р.Г. Сегрегация биохимических генетических детерминант у сомаклональных вариантов межвидового соматического гибрида картофеля // Физиол. раст. 1994. Т. 41. N 6. С. 843-852.

11. Бургутин А.Б.. Бутенко Р.Г.. Кауров Б.А.. Ниссанка Иддагода. Селекция картофеля In vitro на устойчивость к хлористому натрию // Физиол. раст. 1996. Т. 43. N 4. С. 597-605.