Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

МУТАЦИИ И ДИПЛОИДИЗАЦИЯ У ФИТОПАТОГЕННОГО ГРИБА PHYTOPHTORA INFESTANS (MONT.) DE BARY

ВАК РФ 03.00.05, Ботаника

Автореферат диссертации по теме "МУТАЦИИ И ДИПЛОИДИЗАЦИЯ У ФИТОПАТОГЕННОГО ГРИБА PHYTOPHTORA INFESTANS (MONT.) DE BARY"

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

КУЛЩ ВИТА Б0РИ30ВНА

МУТАЦИИ И ШШОИДИЗАЦИЯ У ФЙТОПАТОГЕИНОГО ГРИВА РЯГТОРНТНОЯА Ii№E3lÄiiS (MÖNS.) DE BAÜY

(03.00.05 - ботаника}

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ИЗДАТЕЛЬСТВО МОСКОВСКОЮ УНИВЕРСИТЕТА • Т979

^¿ао пьоСр ЫЛ ~ а

Работа выполнена на кафедре низших растений Биологического ^

факультета Московского Государственного Университета имени М.В.Ломоносова. ~ - .

Научны! руководитель: доктор биологических наук, . __

доцент Дьяков Ю.Т,

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

С.В.Каменева, ----- .

кандидат биологических наук . Ю.Н.Стройюов.

Ведущая организация - Всесоюзна! научно-ис следовательский

институт селекции и семеноводства овощных культур МСХ СССР. Задета диссертации состоится "2,0 -ОЛЛ^ик/А 1979г.

. час. на заседании Специализированного Совета Ш5 (К.053,05.14) ШУ по адресу:

Москва, 117234, Ленинские Горы, Биологический факультет ЩУ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического фе^жьтета.

Автореферат разослан " " ЛОСЦрУЛЙ 1979 г.

Учени* секретарь Г.Г.Щумская

Актуальность тема. Фгтофтороз картофеля - одно не опас-веШшх заболеваний этой культуры. В нашей стране потерж урохая -картофеля от фитофтороза составляют 20-50%, а в гада эпифито-тнй достигаю® 60-70Í (Дорожкив х др., 1976).

Лучший способ защиты от болезни - создание устойчивых сортов картофеля. Однако, таете сорта вскоре после введения XX в производство, поражаются вследствие возникновения в популяции паразита вирулентных к кимрас. Поэтому изучение механизмов изменчивости P.inieatane имеет большое значение.

ШловоЗ процесс у P.iníeatana обнаружен тольро в Мексике, а в остальных местах обитания гриб размножается бесполый путем. Поэтому основную роль в изменчивости этого патогена должны играть мутации, как источник вариабельности,а гетерокариоз я па-рас ексуальный процесс, как источники возникновения новых комбинаций генов*

Нутации н гетеро кариоз у P.ini««-Une начали исследоваться лишь в последнее время. Относительно протекания У этого гриба парасексуального процесса ничего не било известно.

Наша работа посвящена изучению мутаций и парасексуального ПИКХа у Р. infestañe*

Задачи и панд исследования. I) Получение шрокого спектра мутаций устойчивости к лекарственным веществам у Р. Inf estaña к исследование свойств полученных мутантов. 2) Выделение гетеро-кариоаов ж гетерозиготных дидяоидов из штаммов, растущих на искусственны* средах и в естественных условиях* 3) Определение патогенностк гетерозиготных■дшиодвов в сравнении с исходными с мутантами. 4) Установление возможности митоткческой рекомбинации у Р.luíestaña*.

Место проведена» parinr«. работа выполнена на кафедре низших растений Биологического факультета ШТ ■ им. Ц. В.Ломоносова в течение-1975-1978 гг. --- ■ ■■ < , ■ —

//bj j; v;-гг.и^лI irr; Г; ~ -

Научная новизна в практическая ценность работа. Получен широкий спектр мутаций устойчивости к антибиотикам у Р.юсев--Ьапз. Впервые для этого гриба выделены мутанты, устойчивые к акрифлавину^ оксатетршппшгну и бластнвддину з . Установлено изменение в фосфолипидах у мутантов, устойчивых к стрептомицину г влияние стрептомицина на состав фосфодшшдов, Впервые среди оошщетов получены соматические диллоады. Показана возможность митотической рекомбинации в ядрах P.ini ва-Ьшаз, Изучены патогенные свойства даплоидов и мутантов. Выяснено, что днплои-даэация ядер макет происходить в естественных условиях* Эта возможность должна учитываться фитопатологии, изучающими изменчивость и расовый состав Р.1в£«дгааэ в связи с селекцией картофеля. Созданы основы для генетического изучения представителей оомицетов, не имелцих полового процесса. "

работе. Материалы диссертации докладывались на УЖ Конференции молодых ученых Биологического факультета МГУ, □освященной 60-летию Октября (Москва, 1976); Х1У Международной генетическом конгрессе (Москва, 1978); советник "Современные проблемы микологии" (Москва, 1978); заседании кафедры низших растений Биологического факультета МГУ (Москва, 1978).

Сти.ултура и объем работы. Диссертация состоит из "введения? "обзора литературы" (I глава), "экспериментальной части" (3 главы), "заключения* и "выводов". Материалы диссертации изложены на цэ страницах машинописного текста, включая 18 рисунков и ££ таблиц

сошаднив РАБОТЫ .

I. Материалы я методы. В работе использовала изодята физиологических рас 1: 1.2.3, 4 Р. полученные из НИИ картофельного хозяйства МСХ РСФСР.'

Гриб культивировали на агаризованной овсяной н жидкой кар-

тофелыюй средах.

Дня индуцирования мутация синхронно индистированнца зооспоры подвергали действию 0,007} раствора N -нитро- в' -нит-розометидыочевюш (ШМ) в течение 20-34 час. Отмытые от НИ! зооспора сеяли на.чашки Петри с овсяной средой, содержащей добавки соответствушкх антибиотиков в детальннх для Р-1п£еаг<ша концентрациях. Выросшие на селективной среде колонна отсаживали в пробирки с овсяный старом и исследовали.

Определение индукции рнштша мутантами и исходной расой в клубнях картофеля проводили методом двффузатов (Озерекковская и др., 1975).

Для определения фосфолидидов отмытый от среды я подсушенный мицелий гриба растирали в фарфоровой ступке с квадоевыы нес— кои. Экстракции фосфолипидов проводили по методу Фолча (у<>1оЬ, 1975) смесь» хлороформ:ыетаноя (3:1). Экстракт исследовали с помощьо тонкослойной хроматографии на пластинках с закрешгешпш. слоем силикагеля в системе хлороформ:иетанол:вода (65:25:4). Хроматограммы проявляли фосфорномодибденовой кислотой н парами йода.

Доя получения гетерокариотических изолятов смесь зооспор 2-х рас высевали на чашки Петри с агариэоваивой овсяной средой. Шросший мицелий переносили частями на чашки о двойной селективной средой. Устойчивый к 2-й антибиотикам мицелий отсеивали в пробирки и исследовали*

Патогенность определяли на листьях и клубнях картофеля с определенными а -генами устойчивости. Мицелий Р.1и*еа*ааз, отмытый от спорангиев водой» помещали ва внхнхв поверхность ли--стьев и на ломтики клубней. Оценку заражения проводили по 4-х бальной шкале (0 - отсутствие споронотешш, 3 - высший балл). Средний бадл подсчитывали примерного 30 повторностей, полученных в 5-6 независимых опытах с несколькими сортами картофеля.

Цонозооспоровие культуры получат путем рассева редкоЗ суспензии зооспор на чашки Петри о "голодным" агаром (2 г промытого агара в 100 од воды). Через 15-16 час одиночные проросшие зооспора отсаживали s цройирки с овсяной средой, ДыросшгЯ ивдр-диЯ проверяли на устойчивость к селективным агентам.

Облучение УФ-лучаии проводила с помощью спаренных ламп БУВ-15 о дозой облучения на уровне объекта 2000 эрг/мм2 в шш. Суспензию зооспор (конц. 10^ спор/ил) наносили на предаетные стекла а облучали развое время. Через 12 час подсчитывали количество проросших зооспор. Средний % вшиваемости, доверительное интервалы и достоверность ряарят^ц определяли из 5 независимых опытов.

Для определения количества ДНК в ядрах мицалия P.i-nfeot&na гриб выращивали на мазке из картофельной агариэованной среды на предметном стекле в течение 3-х суток. Фиксации препарата проводили в растворе спирт : хзороформ : уксусная кислота = 6:3:1 в течение 20 юга. Гвдрсишз проводили 5н Ш1 при комнатной температуре в течение 70 мин.

Ядра красили реактивом Шжффа по методу, ранее использованному по отношению к осмицету Saprolegnla terrea trie (Bryaat, EowtPd, t9¿9)»

Количество ДНК на I ядро определяли на сканирующем и интегрирующем михроспектрофотоыетре дри длине водны 546 вм на кафедре цитологии я пгстояопш ЛГУ.

Джя определения размеров ядер трехсуточннВ ммцеяий помещала на предметное стекло в капаю 2% уксуснокислого орсеина я накрывали покровным стеклом, края которого покрывали парафином. Раэмеры ядер определялис полотью окуляр-микрометра через 710 час, выбирая для измерения ядра в кончиках гиф.

Математическую обработку, результатов проводили но Птохяно-кому (1970).

П. Мутанты Т'?'гоа,а№ые к антибиотикам..

I. При определении летального действия м* на вегета^жв-ннй мицелий Р.шг*аг*пв было выявлено, что в зоне низких концентраций мутаген стимулировал рост гроба (табл. I).

Таблття I

Действие ШШ ва рост вегетативного мицадия Р.1пГ«»гапв

Еонцент— рацю^НШ 0 0,001 0,01 » 0.03 Î0.05 * 0,07 0,1

колоний (мм) 39 + 0,75 49 + 0,41 35 + 0,52 23+ • 17 + о.ео! о,37 9 + 0,48 0

С наиболее высокое частотой получали стерптомицинустойчи-вне мутанта. Всего их выделено 9. причем 2 оказалась зависимыми от стрептомицина. Полученные мутанты мохно разделить на 4 грушш: I груша - M, Mj, Еа среде без стрептомицина рост мутантов приблизительно такой же, как у исходного штамма* П группа - М4, М^ н Ug. Их рост ва искусственной среде примерно в 2 раза слабее, чем у контроля* Ш группа - Itj в Рост на среде подавлен сальнее, чем у мутантов П грушш, но он заметно ста-мулнровался при добавлении в среду стрептомицина в концентрации 50-100 ед/мл. 1У группа - Рост на среде без стрептомицина

не отличался от исходного штамма. Ыутапт обладал перекрестной устойчивостью к"ряду антибиотиков (табл. 2).

Для зооспор устойчивых мутантов стрептомицин также оказался менее токсичным, чем дня зооспор исходного штамма* У стреп-томицинзависимого мутанта Mg зависимость от антибиотика сохранялась и при действии его ва зооспоры: наблхщ&лся более низкий процент (73?) их прорастания в воде по сравнению с дивим штаммом (IOOÏ) и с прорастанием в присутствии 12.5 ад/ид стрептомицина (88Î).

Кроив стрвдтомицинустойчквых мутантов, нами вцдалено 4 чу— ЦЬ J

ТяЛтттр 9

Устойчивость мутанта ае5 - к различным антибиотикам

Антибиотики : Летальная доза антибиотиков для штаммов:

: а®5 : исходный

Стрептомицин >300 ед/мл 50 ед/мл

Циклогексиыид >10 мкг/мл 3 мкг/мл

Акрифладив >50 мкг/мл 10 мкг/мл

Океитетрацнклин >40 мкг/мл 20 мкг/мл

танта, устойчивых к окситетраднклину; 8 мутантов, устойчивых к акрифлавзну; 2 мутанта, устойчивых к хлорамфениколу; 2 бласти-цидин- и 2 трихотецкнустойчивых мутанта. Сведения об их устойчивости к антибиотикам приведены в таблице 3.

Как видно из данных, представленных в таблице 3, чувствительность мицелия полученных мутантов к соответствупцим антибиотикам снизилась по сравнение с исходными штаммами в 4-10 раз.

Получение 4-х различающихся по фенотипу груш стрептомицин— устойчивых кутантов, а такие значительные различия в устойчивости к акрифлавину у акрифкавивустойчивых мутантов дает возможность предположить, что мутации, по крайней мере, 7 некоторых мутантов, затронули разные локусы.

Таким образом, нами получен широкий спектр мутаций устойчивости к антибиотикам. Выделенные мутанты, за исключением стрептомнцинустойчивнх М, и «5 , не обладали перекрестной устойчивости» и сохраняли свои свойства при культивировании их на искусственных средах. Все полученные мутанты сохранили исходную расовую специфичность к агрессивность, следовательно, устойчивость к лекарственным препаратам ве влияет на патогенные свойства гриба.

2. Стрептомицинустойчивые мутанты интересны в алане кзучеивг механизма действия стрептомицина на оомгдетн, отличавшиеся новы—

Таблица 3

Величины СКд0 для мутантов и исходных культур

Штамм : Устойчи- . вость к: ♦ - : СКдо. : • * 4 * Штамм- : Устойчи- . вость к: * СК90

Исходный изолят р.1.2,3 Стрептошг-цану 40 Исходный изолят р.4 вину 8

М >600 Ь1 52

»1 >600 ч 42

«2 >600 ■ ч 41

«з *600 Ь4 70

м4 - 250 ч 35

«5 >600 Ч 41

«6 >600 Ч 24

Исходный Окентетра- 600 >600 10 ч Исходный изолят р.4 Тркхоте-щду «Й 31 16

из оля т р.4

®2 % ; V*

ИсходныК1 изолят

рл вь

циклину

Еластщи-дину

62 во

51 40 17

43 £0

Исходный . Хлорамфе-ИЭОЛЯТ р.4: николу '

К1 Кг

60 270

700 >700

шенной, по сравнение с другими грибами, чувствительностью к атому антибиотику. Вию обнаружено, что стрептомицин усиливал выход из зооспор Р.шг«в*ш1а во внешни) среду индуктора фитоалекенна картофеля рипштина (Мустафа, Дьяков, 1978). Поэтому мы исследовали

способность к индукции ршгитша в клубнях картофеля стрептоми-цинустойчивых мутантов и изодята расы 1.2.3. Дня этого суспензии зооспор мутантов и дикого штамма выдерживали 16 чао в растворах стрептомицина разных концентраций, и центрифугировали. Методом даффузатов определяли способность супернатантных гидкостей индуцировать ршштин (табл. 4).

. Тайпша'4

Влияние стрептомицина на индукцию ришитша в клубнях -картофеля мутантами и изолятоы р.1.2.3 Р.1пГев1<ша

Ш

«2 Исходный штамм

5 О

15 5

20 5

10 15

15 II

Из таблицы видно, что в отсутствие стрептомицина во всех опытах мутанты индуцировали образование большего количества ришитива, чем первоначальный штамм, что может косвенно сввдетедьствовать о нарушениях в их мембранах и потерях ори прорастании внутриклеточных веществ. Добавление стрептомицина в небольших количествах усиливало потери индуктора диким штаммом в мутантом М^ и ослабляло мутантом Последовательно, мутанты % и «2 возникли не только в результате разных мутаций, но и механизм их устойчивости к стрептомицину различен. "..''„

Шло показано, что стрептомицин в низках концентрациях, не подавляшщх синтез белка, вызывает изменение композиции мембранных фосфолшщцов (вепаАДбЬад &1», 1970).

Поэтому сравнение фосфолипидного состава исходного штамма и стрептомншнустойчивых мутантов представляло несомненный интерес. Мы установили, что фракционный состав фосфолипидов мутанта {¿2 не отличался от исходного штамма при выращивании их на среде без антибиотика. Мутант ав^ отличался от и исходного изоля-та наличием пятна на хроматограмме с = 0,50 (табл. 5). При добавлении в среду 10 ед/мл стрептомицина состав фосфолипидов у ае^ и Н^ не изменился, в то время как у исходного сггамма па-Лщцались значительные изменения.

Таблица 5

Величины к^ фосфолипидов, выделенных из некоторых штаммов

Штамм : а£ Середа без стрептомицина)

0,23 0,40 0,48 0,50 0,53 0,82 0,70

«2 0,23 0,40 0,48 0,53 0,62- 0,70

Исх* изолят 0,23 0,40 0,48 0,53 0,62 0,70

Штамм : ЕГ (среда -г- 10 ед/мл стрептомицина)

ав5 0,23 0,40 0,48 0,50 0,53 0,62 0,70 *

«2 0,23 0,40 0,48 0,53 0,62 0,70

Исх. изолят 0,23 0,33 0,38 0,53 0,62 0,70

Таким образом, механизм устойчивости к стрептомицину у аас а }&2 различен. Возможно, что у а>5 устойчивость к антибиотику связана с композицией.мембранных фосфолшщдов, так'как, кроме всего прочего, эют мутант обладал перекрестной устойчивость» к антибиотикам, а это может быть связано с проницаемости» мембран. В таком , случае у или происходит инактивация стрептомицина в

клеточных структурах P.lníeotana или эти структуры нечувствительны я антибиотику. Махно предположить в данном случае и изменение состава мембран мутанта Mg. но не фосфодипидного, а иного. Наш предварительные данные показали, что у этого мутанта изменено содержание стеринов в мицелии во сравнения с исходным штаммом.

Ш. Внпяляяиа соматических дидяовдов p.iafeataaa» В качестве маркеров мы использовала мутанты, устойчивые к стрептомицину Ср.1.2.3), акрвфлавину н окснтетрацнклину (р.4).

Дри попарном выращивании мутантов разных физиологических pao P.ta£«etuu било выделено 6 изолятов, способных расти на среде, содержащей 2 антибиотика. Изолягы обозначены: х^ая^,

EjH^, E^j, Е]-И3, £jM. Частота возникновения изолятов 2-3$. Все выделенные иэоляты отличались от исходных мутантов и дикого типа более мощным и высоким мицелием.

Дет определения соотношения ядер исходных мутантов в мицелии изолятов из них были выделены монозооспоровые культуры (всего ИЗ культур). Расщепления по признаку устойчивости к антибиотикам они не дали.

Таким образом, мицелий выделенных изолятов объединял геномы 2-х исходных мутантов, во не являлся гетерокариотическкм. Необычное его поведение могло быть вызвано нехромосомным наследованием устойчивости к антибиотикам или слиянием ядер в геадрокариоти-чесжих гифах, т.е. образованием соматических диплоадов. Обычно соматические диплоиды идентифицируют сравнением их фенотипов с ыутантными гаплоидными родителями. Однако только этого недостаточно. Кейтен и Дай (catea, Daj, 1977) описали II критериев для ' идентификации диплоадов у, грибов. Особенности биологии Р.infestaría позволили использовать 6 из них.

I. Размерн eoocnojo. Измерение диаметров инцистированных зооспор исходных мутантов и выделенных изолятов не показало досто-

верной разницы между ними (измерят по 100 зооспор каждого штамма). Объем конидий — хороший критерий дня выделения диплоидов A.niduiann и некоторых других грибов. Однако этот критерий не может быть использован в отношении тех видов грибов, у которых размер спор сально варьирует, например, у А.огу»« (íritcbara, 1963)

2.,Размеры ядер^ Результаты измерения диаметров ядер и вычисления их объемов (табл. 6) свидетельствуют о достоверно больших размерах ядер полученных изодятов по сравнению с ядрами исходных мутантов (разница достоверна на 93ít).

Таблица 6 ,

Размеры ядер мутантов и выделенных изолятов

Штаммы. : Ср. диаметр ядер : : (мхм) : Объем ядер (moá3)

3,8 + 0,06 28,72

V 3,4 ± 0,08 20,57

3,5 + 0,04 22,44

ч 3,7 ± 0,12 26,50

«I 3.2 ¿ 0,07 17,14

4,4 + 0,18* 44,58

V.6 4,8 ¿0,11 . 57,88

4,6 + 0,09 50,94

Отношение усредненных объемов ядер изолятов к объемам ядер мутантов близко х 2. Диаметры дцер изолятов я мутантов различались

- f " -

примерно в 1,3 раза. Подобные различия в размерах ядер наблюдались между гадгощршмн в диплоидными штаммами A.aJ.dulan» (ciu.tterbuok,

Rop«, 1966)» i

3.. Количество_,ВДк_в_ядр§х_:_ Количество. ДНК; в ядрах в & б* определяли с помощью микроснектрофотсыетрнческого анализа, которой впервые дли P. ¿of ее teas применен нами. Гидролизную кривую построили для одного из штаммов P. inieetaca. Изучали по

100 ядер каждого штамма. Результаты измерений показали* что каждое ядро изолята ь^а^б" содержало примерно в 2 раза больше ДНК, чем ядра исходных мутантов (табл. 7, рис. I).

Таблица 7

Характеристика ядер выделенного изолята и исходных мутантов : Количество ДНК/яд: : Коэффициент

Ииив ; l^SS®"*-; ; —<

8,72 + 0,21 134,59 24,08

ав6" 8,00 + 0,23 133,86 28,75

£4авб" 17,68 ¿ 0,30 198,66 17,08

Площадь сечения ядра у изолятов оказалась большей в средввм в 1,5 раза. Подобные различия по содержанию ДНК в гаплоидных и диплоидных ядрах показаны для других грибов (Williaoa, aeadgea, 19t5l Pathak, EXand«, 1971» Mortimw, SHaw, 1975 И Др.).

Таким образом, полученные результаты указывают на то, что выделенные нами изолята, дашие рост на смеси 2-х антибиотиков, являются гетерозиготными даплоидами (в данном случае под термином "диплоидность" мы подразумеваем не истинное число геномов в ядре, а лишь их удвоение) •

4. Ха£а2тернстика_вид£ле1щых гете^о^шюддах^илло^д^в^.

1) Фенотип. Диплоиды обладали большей устойчивостью к каждому из антибиотиков, чем исходные мутанты (табл. 8, 9, 10). Это говорит о той, что устойчивость к стрептомицину, анрифпавину и оксигетрацшшшу доминантна. -

2) Морфологая колоний g скорость роста. Полученные диплоиды резко отличались от дикого типа и мутантов характером роста на овсяной среде (таблица II).

Скорость роста дидлоидов на овсяной среде достоверно превышала скорость роста исходных мутантов (таблица 12).

го 19

го а

г

г "Т-г

2t tí

3

■ "I—i

-ri

Рис. I. Распределение количества ДНК в ядрах диплоидных

и гаплоидных штаммов Р.infestan* I - сегреганг №16 4 - а g»

2-L4ae6» 3 - сегрегант »38

5-ь;

Таблица В

Диаметры колоний (мм) дишгоидов и мутантов на различных концентрациях стрептомицина

jOjgyyy ; Концентрация стрептомицина (ед/мл)

» 0 - * 150. V 300, 1 600

70 ± 0,87 34 ¿ 0,93 33 + 1,05 27 ± 0,56

W 75 ± 0,41 39 + 0,37 38 ± 0.75 26 ± 0,47

Ej-Mj 72 ± 0,73 37 + 0,18 35 "± 0,28 18 + 0,19

70 ¿0,39 35 ± 0,52 " 28 ± 0,40 23 ¿ 0,45

EjMg 76 + 0,53 41 + 1,30- 35 +.0,71 31 £ 0,82

EjM 74 + 0,27 40 ¿ 0.70 40 ± 0,35 Зв ¿ 0,90

M 65 ±1,01 28 + 0,83 21 + 0,63 12 ¿ 0,82

«I 48 + 0,82 15 +1,13 14 + 0,39 8 ¿ 0,39

% IS + 0,4S 25 ± 0,48 20 + 0,48 II i 0,37

Таблица 9

Диаметры колоний (мм) диплоидов и мутантов на разных концентрациях'акряфлавина

Штаммы

Концентрация акрифлавина (мкт/мл)

10 * SO *40

w 55 + I.II 39 + 0.92 31 ¿ 0.35 29 ¿ 0,60

w 55 ¿ 0,77 40 ¿ 0,85 32 ¿ 0,77 20 + 0,90

H 55 ± 0,49 39 ± 0,47 29 ± 0,59 12 + 0,63

bt 50 + 0,82 38 + 0,78 26 + 0,75" 12 ¿ 1,0

Таблица 10

Диаметры колоний (им) диплоидов и мутантов на разных концентрациях оксите трациклина -

: Концентрация окситетрациклина (мкг/мл)

Штаммы .-;-

О : 10 : 20 : 40 : 60

в^м 51 £ 2,77 22 + 1,19 16 + 0,69 14 + 1,66 12 £ 0,83

52 + 1,66 30 4 0,52 20 + 0,52 13 + 0,66 II + 1,29

. 59 + 0,84 31 ± 0.84 21 + 0,94 18 + 0,26 17 + 1,05

62 1,19 31 + 0,95 23 + 0,95 17 + 0,95 13 + 1,77

41 + 2,38 16 + 0,36 12 + 0,58 9 + 1.63 7 + 0,73

45 + 0,51 17 ± 2,06 II + 1.05 9 + 0,86 7 + 0,51

Таблица II

Характеристика колоний исходных мутантов и диплоидов

- . Морфология

Мутанты : Морфология колоний мутантов : диплоидов

Колонии с нечеткими краями. Мицелий, стелющийся но субстрату, паутинистообразный. ^ Внсота воздушного мицелия приблизительно 2-3 мм.

_„ Сходен с диким типом: высота воздушного мицелия 4-6 мм.

_

М, Мз -«- "\ * ' ' - _ :---1--;-------.------'---- _ .

М^ Колонии четко отграничены, в центре колонии - высокий (5-6 мм) густой мицелий, у края колонии высота мицелия « 2 мм.

Края коло-'' ний резко отграничены. Высота воздушного мицелия 20 мы (рост в высоту ограничивался чашкой или пробиркой) .

Таблица 12

Скорость роста диплоидов и исходных мутантов на овсяной среде

Штаммы 1_Диаметры колоний (км)

- 4-е сутки : 6-е сутки : 10-е сутки

32 + 0,33 42 + 1,3 73 ± 1,10

27 ¿ 0,96 36 + 1,36 63 ± 1,10

%ы 24 + 1,21 50 + 0,60 76 ± 1,02

%М1 22 + 0,63 38 + 1,72 73 £ 1,14

% 26 +0,38 40 + 0,2 80 + 2,16

%% 23 ± 0,76 44 + 1,25 77 ¿1,67

Ь1 6 + 0,41 26 + 0,84 46 ¿ 1,02

Ь4 10 + 0,41 30 + 1,82 45 + 1,67

Е1 18 + 1,63 23 ± 0,58 46 + 1,02

ч 15 + 0,73 24 + 0,26 50 ± 0,53

м 18 + 1,0 29 + 0,44 48 ¿ 0,73

мх 17 + 0,18 19 + 0,47 47 ± 0,94

«3 10 + 0,39 18 ± 0,26 25 + 0.45 :

-а6" 12 + 0,93 28 + 1,14 56 + 0,12

3} Чувствительность к УФ-облучению. Результаты облучения зооспор полученных мутантов я исходных диплоидов получены из 5 независимых опытов. Наши данные показала (рас. 2, 3), что устойчивость к УФ-облучению зооспор диплоидов достоверно выше устойчивости зоосопр мутантов, что мохет косвенно свидетельствовать об увеличении влоидности ядер. Известно, что устойчивость к УФ-ой-лученню даштоидов в 2-2,5 раза выше устойчивости гаплоидов (яох-вал# 1961)» Все кривые, описывающие зависимость выживаемости зооспор от дозы УФ-обхучениг,имели снгаондный характер, что жжет тазхе свидетельствовать о-наличии нескольких геномов в каждом

Рис. 2. Зависимость выживаемости Рис. 3. Зависимость выжквае-

аоосгшр дщплоида я мутан— мости зооспор дюиои—

тов от дозы УФ-облучеяия: да и мутантов от дозы

• - l.a fi-| О - аа6"» УФ-облученжя: • - EjMji

ядре зооспор, в том числе и зооспор исходных мутантов» Это - косвенное подтверждение данных о диплоидности мицеянн диких штаммов P'lnieataaa (Senseae, 1977| Sanaom«, Braaier, 1973)• В таком случае полученные нами изолятн являются тетрапловдныын.

4) Патогенноеть. В таблицах 13 и 14 приведены усредненные результаты определения патогенных свойств выделенных вами диплои-дов к мутантов.

Полученные результаты можно суммировать следувдим образом:

1. Клубни и листья сортов картофеля без генов устойчивости заражались дипяовдами слабее, чей мутантами и изодятами исходных рас. Это выразилось в снижении среднего балда поражения и появлении слабого некроза под воздушным мицелием.

2. Клубни и листья сортов картофеля, имеющих ген В, , поражались дишговдами слабее, чем мутантом ааб" и взолятом росы 1.2.3, что проявилось в снижении среднего балла в сильном некрозе под мицелием гриба.

Таблица 13

Заражение листьев различных сортов картофеля дишюцдами и мутантами РллГввгапв

: Средние балл заражения на сортах:

Штаммы :ирие- : • _ * • г * 97 г- : ие-.верная •Роза : г :дщои-. мец : Темп : • * ♦ * : I 40534 *+ : л ат— „чине— •кий : а4 :Нир- .ГИНЕЯ >1*4

1.2 0,9 0,5 1.1 0,7 0 0 0

Ь4ввб" 0.6 0.3 0,3 0,8 0,5 0 0 0

Ь1 1.9 1.7 1.6 0 0 2,2 1.8 0

Ь4 1.8 1.2 1,9 0 0 1.9 1.з: 0

2.2 2,8 2.7 2,7 3,0 0 0 0

Р.4 2.5 2.6 1,8 0 0 2,3 2,0 0

р.1*2.3 1 2.4 2,7 2,5 2,8 3,0 0 0 0

Таблица 14

Заражение клубней различных сортов картофеля диолоидами и мутантами

Средний балл заражения на сортах

Штаммы ирие-кульс- КИЙ' г : лаоар-.дашский Г 'Северная : Роза г ПЕР— .бимец. дружный : 405; 34 Г*4 : Вир: гиния ;к1в4

ь1ав6* 1,2 1.3 0,7 1.4 1.0 0 0

Ь4%б* • 1.0 0,3. 0,4 1,2 0,8 0 0

Ь1 2,0 3,0 1,6 0 0 2.0 . 0

V 1.2 2,3 2,3 0 0 2,4 0

а. 6" в Р.4 2,2 2,0 3.0 3,0 2.2 0 0

2,3 2,8 2,0. 0 0 2,7 0

р.1.2.3 2,7 2,3 3,0 3.0 2.8 0 0.

3. Сорта картофеля, имепцие гены в^ и Е^В^» не поражались диплоидами, хотя мутанта £f в ь^ и изолят р.4 заражали генотип Можно полагать, что ген вирулентности Р^ доми-

нантный или полудоминантный, а ген Р4 - рецессивный. Кроме этого, мы наблюдаем также общее снижение паразитических свойств у выделенных диплоидов по сравнении с мутантами и изолятами исходных рас, и усиление их сапрофитных свойств (большая скорость роста на искусственных средах). Есть мнение, что объединение двух ядер дикариона внутри одной ядерной мембраны усиливает сапротрофную потенцию грибов, в то время как их паразитические возможности редуцируются (Yixiisae, Bartlay, 1971)» По этому поводу можно высказать следующее предположение. Агрессивность у грибов находится под полигенным контролем с высоким вкладом аддитивной вариансы в фенотипическую изменчивость (Caten, 1970| Валта., 1972)* Так как общий уровень агрессивности зависит от числа соответствуидах генов, то штаммы с низким уровнем агрессивности имеют или делецжи по этим генам, или альтернативные аллели. Бели аллели к генам агрессивности доминантны, то кумулятивное их действие в гифах о гетерохариотпческими гаплоидными или гетерозиготными диплоидными ядрами вызовет снижение агрессивности по сравнению с гомокариотичными гаплоидными штаммами.

5) Выделение сегрегантов. Для получения сегрегантов мы облучали зооспор« штамма УФ-лучами в дозе, дающей 20-30} выживаемости. Из облученных зооспор было выделено 50 монозооспо-ровых культур. 5 из них отличалась по устойчивости к стрептомицину и акрифлавину от остальных (табл. 15). Все оегреганты, кроме №38, имели пониженные паразитические свойства, что выражалось в неспособности или пониженной способности к заражению сорта без к —генов. Сегрегант *38, чувствительный к обоим антибиотикам, был патогенен для сортов с генами а^ и . Однако мы не можем утверждать, что получена раса с новыми вирулентными

Таблица

Фенотипы мутантов, диплоида и выделенных из него сегрегалтов л их патогенность

: рост с: : Ср. балл заражения

*А

о о о о о о о о

свойствами, так как попытки вызвать заражение этим сегрегантом сорта с генами R^E^ не увенчались успехом. Измерение количества ДНК в ядрах сегрегантов * 38 а * 16 показало/ что они, как и 1>4«.0б* диплоидны.

Таким образом, и прямые, и косвенные методы подтверждают, что вам удалось выделать гетерозиготные диплоида. В данном случае, по-видимому, произошло слияние ядер в гетерокариотических гифах, причем гетерокариотжческое состояние было очень кратковременным. Подобное явление наблюдали Еертольди и Катен у Ruai-oola. (Bavtoldl, o&tm, 1975)* Причины этого явления неясны. При получении диплоидов во всех комбинатах в качестве одного аз маркеров использовалась с трептомицхнустойчиво сть. Поэтому -можно предположить, что она оказала какое-то влияние на ядра, возможно, на ах мембраны, что а привело к массовой дишгоидиза-ции. Для того, чтобы определить действительно ли стрептомицин-

Культура . i^^jm . мет/мл : » : ^

: сто. : аво. : : :

ь+ — + ■ 1,2 0 2,0

S«' + - 2,2 3,0 0

W + + 1.0 1,2 0

Л 9 0 0 1.0

JU2 + - 0 0 0

»16 + - 0 0 0

«33 - • 1.2 2,0 1.0

Л43 ■ - + 0 0 0,6

устойчивость имеет отношение к увеличению частоты слияния ядер, нами был выделен штаым Bl^Btf содержащий ядра мутантов, устойчивых к бластицвдину и окситетрациклину (Ej). Из Sl^Ej било получено 23 монозооспоровые культуры, которые расщеплялись по устойчивости к антибиотикам на родительские формы. То есть, массового слияния ядер в данном случае ве произошло. Таким образом, наши данные, & также литературные, косвенно подтверждает высказанное предцоложенве(табл. 16).

Таблица 16

Расщепление монозооспоровых иэолятов, выделенных из диплоидов и гетерокарионов*)

^чество ; 1lHClJt0 монозооспоровнх иэолятов :монозоо:устоа- ;чувст- ¡устоячи: устой— А н т и б к о тих и.споро- .чившс .вктель-.вых толь чивых

*ВЫХ ИЗО1- К *НЫГ К *КО К 'ТОЛЬКО :лятов :1) +2); I)+2) : I) :ко 2)

I) стрептомицин 41 41 0 0 0

1) стрептомицин + 2) окситетрациклин 72 72 0 0 0

1) стрептомицин 2) хлорамфенихол (abattooJc, Shaw,197«) 32 32 0 0 0

1) Л^ЯЛПГТ^ТТИК 2) окситетрациклин. 23 3 3 10 7

1) трихотецин 2) кофеин (Дьяков, Кузовникова, 23 5 0 Э 8

В таблице приведены литературные данные и результаты наших исследований.

Для того, чтобы:определить, возмаино-яи образование соната-

ческих диплпидов P.iaíeetana в естественных условиях, мы заражали смесью зооспор мутантов 2-х pao Р.luíeatañe клубни восприимчивых сортов картофеля. Зараженные клубни оставляли на зимнее хранение ори t° = 4°С. Весной из зараженных клубней удалось выделить с высокой частотой (до 3$£) диалоидные изоляты. IIx да-плоидиость выла доказана описанными выше методами. Другим свидетельством в пользу допиоидизации в природе является обнаружение в британских популяциях P.infeetane тетрапловдных штаммов (San-вааа, 1971)*

Описанные механизмы {дшшоидизация, образование миготических сегрегантов) могут играть важную роль в изменчивости P.lníeo-tase. Бели гены вирулентности исходных рас доминантны (аналогично гену Pj в наших опытах), то гетерозиготный дашлоид будет сочетать вирулентность родителей, т.е. появится стабильная новая вирулентная раса. Б случае рецессивности генов вирулентности или отсутствия селективной среды в вида устойчивого к исходным расам сорта картофеля гетерозиготные дишюиды вследствие их пониженной агрессивности накапливаться не будут. Однако и в этом случае их значение в природе может быть очень велико, ибо диплоидизация обеспечивает хранение вариабельности и .ее реализацию вследствие митотического кроссннговера и, возможно, обратной гадлоидизации. В последнем случае наряду с новыми сочетаниями генов вирулентности будет восстановлена высокая агрессивность.

ВЫВОДЫ

1, Получены мутанты разных рас P.in£«atan.e, устойчивые к стрептомицину, окситетрадиклину, акрнфпавину, хлерамфениколу, трихотецкну и бластицидияу. Индуцированные мутации устойчивости к аярифлавину, окситэтрацикяину и бластиоддину у Р. inf«at&aa получены впервые.

2. Устойчивость различных мутантов к стрептомицину контро-

лируется разными генами. Об этом свидетельствуют: достоверные различия в скорости роста мутантов на средах со стрептомицином и без него; различия в композиции мембранных.фосфолипидов; различия в индукции рипштина диффузатами проростков зооспор мутантов.

3. Впервые для представителя оомицетов получены гетерозиготные диплоида.. Диплоидность их ядер подтверждена измерением объема ядер и содержания ДОК в ядрах, а такие косвенными методами.

4. Установлено, что гетерозиготные диплоидм в отличие от мутантов имеют более выраженные сапрофитные свойства и пониженную паразитическую активность.

* 5. После облучения зооспор диплоидного штамма Уф-лучами выделены сегреганты, различающиеся по двум маркерам. Таким образом, впервые показана возможность митотическоЯ рекомбинации у Р. ±п±вр-

6. Показана возможность образования гетерозиготных дипло-идов Р.ш£ев-ипя в естественных условиях*

Материалы диссертации опубликованы в следупцнх работах:

1. В.Е.Кулаш, Н.Л.Дудина, Б.Т.Дьяков. Мутанты ïhjtoph.thora ln-

feetan* (Mont*) d* Багу, устойчивые^ к различным антибиотикам. В сб. "Химический метагенез и гибридизация", и., "Наука*, 1978, 174-177.

2. В.Б. Кулиш, Ю.Т.Дьяков. Отсутствие расщепления в гетерохарио-

тическюс штаммах Phjtophthoxa iniaatvia (itont.) d* Веху. Материала 71 конференции ПО споровым растениям Средней Аэии и Казахстана, 1978, 189-190.

3. Ю.Т.Дьяков, В.Б.Кулкп. Слияние ядер в гетерокаржотическиг ги-

фах fbytopbtbora Infestons (Xant*)*&e Веху* Материалы Х1У Международного генетического конгресса, 1978, 71. 4» В.Б.Кулиш, Ю.Т.Дьяков, С.А.Еропша. Гетерокариоз у Phytophtho-

га Infeetana (itont.) d» Баху* Ш. Фи— топатологические исследования. "Микология и фитопатология", 1978, 12, *5, 406-409.

5. Ю.Т.Дьяков, В.Б.Кулиш. Генетические исследования штаммов ihy-

tgjpbthora lnieot&ne, подученных в результате попарного выращивания мутант-ных культур. "Генетика", 1979, JH..

6. В.Б.Кулиш, И.Т.Дьяков. Диплоидные штаммы Pbtftophtiiora iniee-

tana, подученные при совместном выращивании кутанткых культур. Доклады АН СССР, 1979,.«5..

Буи. тип. № Фнз.п.л^ /г ¿Г Уч.-изд.

3|ш № Тир»* /$*£}

Иэд-юМоскомжогоувнмрсхтет*. Моск*»,К-9. ул. Гервеиа, 5/7." Типография Им и МГУ. ,Мооп>1, Левгоры