Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Видовой состав и структура популяций возбудителей фитофтороза и альтернариоза картофеля и томата

ВАК РФ 03.02.12, Микология

Автореферат диссертации по теме "Видовой состав и структура популяций возбудителей фитофтороза и альтернариоза картофеля и томата"

Московский Государственный Университет имени М.В.Ломоносова

Биологический факультет

ВИДОВОЙ СОСТАВ И СТРУКТУРА ПОПУЛЯЦИЙ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ФИТОФТОРОЗА И АЛЬТЕРНАРИОЗА КАРТОФЕЛЯ И ТОМАТА

Специальность 03.02.12 - «Микология»

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

На правах рукописи

005052847

ЕЛАНСКИИ

Сергей Николаевич

1 1 ОКТ 2012

Москва 2012

005052847

Работа выполнена на кафедре микологии и альгологии Биологического факультета Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова

Научный консультант:

доктор биологических наук Дьяков Юрий Таричанович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, академик Россельхозакадемии Левитин Марк Михайлович

Ведущая организация:

доктор биологических наук Джалилов Февзи Сеид-Умерович

доктор биологических наук Ткаченко Олег Борисович

ГНУ Татарский научно-исследовательский институт сельского хозяйства Россельхозакадемии

Защита диссертации состоится 09 ноября 2012 года в 15 часов 30 минут на заседании Диссертационного совета Д. 501.001.46 Биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, МГУ, д. 1, стр. 12. Факс (495) 939-39-70.

С диссертацией можно ознакомиться в Фундаментальной библиотеке МГУ имени М.В. Ломоносова.

« «5"" >:

Автореферат разослан «_ » октября 2012 года.

Ученый секретарь

диссертационного совета, к.б.н. ^ШШЛМ^елл-у М.А.Гусаковская

Актуальность темы. Оомицет Phytophthora infestons (Mont.) de Baiy и несовершенные грибы из рода Altemaria - возбудители фитофтороза и альтернариоза, опасных заболеваний картофеля и томата. Потери урожая картофеля от этих заболеваний за счет преждевременного отмирания ботвы, поражения плодов и клубней во время вегетации и при хранении в среднем составляют около 10%, но в эпифитотийные годы могут возрастать до 30% и более. Потери томата в случае эпифитотийного развития и массового поражения созревающих плодов могут достигать 100%. Борьба с фитофторозом и альтернариозом осложняется очень высокой изменчивостью возбудителей этих болезней, позволяющей им быстро приспосабливаться к новым устойчивым сортам растений и к новым фунгицидам. Полностью устойчивых к этим заболеваниям сортов картофеля и томата не существует.

Основой защиты всех возделываемых сортов картофеля и томата является использование химических фунгицидов. Однако мероприятия химической защиты могут быть эффективны только в том случае, если в популяциях возбудителей нет (или очень небольшая доля) высокоустойчивых к используемым фунгицидам штаммов. Для оптимального выбора фунгицидных препаратов и расчета сроков и кратности их применения необходимо знать не только долю резистентных штаммов, но и устойчивость выращиваемых сортов к распространенным на данной территории штаммам возбудителей. Сведения о клональной структуре популяций позволяют изучить вероятность полового процесса и гибридизации и, в практическом плане, полезны для оценки риска инвазии особо опасных штаммов и клональных линий патогенов (например, их завоз из-за рубежа или из других регионов с партиями семенного картофеля). В результате полового процесса у P. infestons образуются половые споры (ооспоры), способные длительное время сохраняться в почве и инициировать начало эпифитотий. Поэтому для того, чтобы защитные мероприятия были эффективны, необходим постоянный мониторинг структуры популяций возбудителей фитофтороза и альтернариоза.

В последнее время вопросы защиты картофеля от болезней стали особенно актуальными в связи с тем, что эта культура рассматривается как одна из самых перспективных технических культур. Кроме переработки на картофелепродукты (чипсы, замороженный картофель, крахмал, картофельная мука) картофель может быть использован для получения этилового спирта, глюкозы, сахарных сиропов, красителей, антиоксидантов и других веществ. Развитие грибных заболеваний вызывает изменение химического состава клубней, что делает их непригодными для переработки.

Целью работы было изучение видового состава и структуры популяций возбудителей фитофтороза и альтернариоза картофеля и томата в России.

В качестве основных задач были определены следующие:

— изучение генотипического состава популяций P. infestons на основе независимых маркерных признаков: тип спаривания, спектр изоферментов пептидазы, гаплотипы митохондриальной ДНК, структура отдельных участков генома;

— оценка хозяйственно-важных биологических показателей штаммов Р. infestons: устойчивость к фунгицидам и вирулентность к сортам картофеля и томата;

— исследование закономерностей образования ооспор P. infestons в агроценозах на разных растениях-хозяевах;

— определение видового состава возбудителей альтернариоза картофеля и томата, разработка метода экспресс-идентификации наиболее распространенных видов, изучение устойчивости изолятов Alternaría sp. к фунгицидам.

Научная новизна. В настоящей работе обобщены результаты проведенных автором исследований штаммов P. infestons, выделенных на территории России и Беларуси в период с 1991 по 2011 годы. Впервые проведен анализ структуры российских популяций P. infestons с помощью признанного в мировой практике набора независимых маркерных признаков. Выявлены различия в клоналыюй структуре популяций Европейской и Азиатско-Дальневосточной частей России. Исследовано распределение типов спаривания, определены некоторые закономерности образования ооспор в пораженных органах картофеля и томата. Для изучения структуры популяций впервые использованы такие новые маркерные признаки, как локус пептидазы Рер-2 и полиморфизм участков генома, расположенных между ретропозонами SINE. Исследовано поражение диких видов томата фитофторозом в Московской области, изучены изменения агрессивности при реципрокных заражениях картофеля и томата.

Исследован видовой состав возбудителей альтернариоза картофеля и томата из разных регионов России по морфологическим и молекулярно-генетическим (последовательность нуклеотидов участков ядерных и митохондриальных рибосомных генов) характеристикам. На основе полученных последовательностей нуклеотидов созданы праймеры для ПЦР и отработаны методы идентификации видового состава возбудителей альтернариоза в пораженном листе без выделения изолята в чистую культуру.

Исследована устойчивость возбудителей фитофтороза и альтернариоза из разных регионов к некоторым широко используемым фунгицидам.

Теоретическое значение работы. В работе изучены разные в таксономическом и эколого-трофическом планах группы организмов:

4

биотрофный паразит оомицег и некротрофные паразиты - аскомицетные грибы, паразитирующие на одних и тех же растениях - картофеле и томате.

Исследования Р. ¡nfestans показали, что процессы внутривидовой эволюции при паразитировании на разных растениях, первоначально показывавшие тенденции дивергенции популяций, впоследствии привели к возникновению единой популяции с высокой агрессивностью к обоим видам. Возможной причиной появления подобной популяции является половой процесс, о протекании которого в ряде популяций Европейской части России свидетельствуют выявленные в работе высокое генотипическое разнообразие, присутствие штаммов обоих типов спаривания и ооспор в пораженных фитофторозом образцах.

Исследования возбудителей альтернариоза выявили практически повсеместное в европейской части России преобладание мелкоспоровых Alternaría как на картофеле, так и на томате. Возможно, это связано с частым применением содержащих манкоцеб фунгицидов, более эффективных по отношению к крупноспоровым видам.

Практическое значение работы. В результате исследований собрана коллекция чистых культур возбудителей фитофтороза и альтернариоза картофеля и томата из разных регионов России, которая может быть использована при оценке сортов и селекционного материала на устойчивость к фитофторозу и альтернариозу. Изучена устойчивость возбудителей из разных регионов к некоторым зарегистрированным в России фунгицидам, что используется при планировании мероприятий по защите картофеля. Разработан метод ПЦР-идентификации видового состава возбудителей альтернариоза в пораженных образцах, не требующий выделения изолятов в чистую культуру. Метод имеет практическую ценность, т.к. виды Alternaría отличаются по устойчивости к некоторым применяемым фунгицидам и по агрессивности к сортам растений-хозяев. Материалы диссертации используются в лекциях по фитопатологии и спецкурсах кафедры микологии и альгологии биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. На территории России присутствуют популяции Р. ¡nfestans разной клональной структуры. В Европейской части и на картофеле, и на томате встречаются как моно- и поликлональные, так и панмиксные популяции. В Сибири и на Дальнем Востоке преобладают моноклональные, иногда встречаются поликлональные популяции.

2. Отмечаемое практически повсеместно в популяциях Европейской части России высокое генотипическое разнообразие Р. ¡nfestans может объясняться гибридизацией при половом процессе. В пользу прохождения

5

полового процесса свидетельствует одновременное присутствие в популяциях штаммов с разными типами спаривания и ооспор в пораженных фитофторозом растительных образцах.

3. Исследованные изоляты Р. ¡nfestans с картофеля и томата из разных регионов России и Беларуси были чувствительны к большинству используемых против них фунгицидов. В некоторых областях были обнаружены штаммы с высокой устойчивостью к металаксилу.

4. В пораженных листьях картофеля и томата с помощью молекулярно-генетического анализа выявлены виды A. solani, A. infectoria и комплекс мелкоспоровых видов. Мелкоспоровые виды, выделяемые по результатам морфологического анализа (A. alternata, A. tenuissima, A. arborescens), по структуре исследованных участков генома не разделяются.

5. Лаборатрная оценка устойчивости к фунгицидам изолятов Alternaría sp., выделенных с картофеля и томата, показала, что наибольшим фунгицидным эффектом отличались дифеноконазол и флудиоксонил, хороший эффект также отмечен у манкоцеба и флуазинама. Манкоцеб значительно сильнее действовал на A. solani, чем на мелкоспоровые виды. Азоксистробин и хлороталонил проявили самую низкую эффективность.

6. Мутации G143A, обусловливающей устойчивость мелкоспоровых видов рода Alternaría к азоксистробину в странах Европы и в США, у российских мелкоспоровых устойчивых изолятов не было выявлено.

Личный вклад автора. В настоящей работе приведены результаты, полученные лично автором, при выполнении работ под его руководством или в рамках совместной деятельности. Автором осуществлялась постановка проблемы и методическая разработка путей ее решения, планирование и проведение исследований, обработка, систематизация и интерпретация полученных данных, апробация и публикация результатов. Доля личного участия в публикациях, выполненных в соавторстве, пропорциональна числу соавторов.

Апробация работы. Основные положения и материалы работы были представлены и обсуждены на региональных, всероссийских и международных конференциях, совещаниях и съездах, среди которых: Международная конференция «Современные проблемы микологии, альгологии и фитопатологии» (Москва, 1998), Международная конференция «Микология и криптогамная ботаника в России» (С.-Петербург, 2000), Научно-практическая конференция «Научное обеспечение картофелеводства России: состояние, проблемы» (Москва, 2001), Первый съезд микологов России (Москва, 2002), The 7-th International Mycological Congress (Oslo, 2002), The 7th International Congress

6

on Aerobiology (Montreal, 2002), Первый всероссийский конгресс по медицинской микологии (Москва, 2003), Первая всероссийская конференция по иммунитету растений к болезням и вредителям (С.-Петербург, 2002), Международная научная конференция «Биология, систематика и экология грибов в природных экосистемах и агрофитоценозах» (Минск, 2004), III съезд ВОГиС «Генетика в 21 веке: современное состояние и проблемы развития» (Москва, 2004), Международная конференция «Грибы в природных и антропогенных экосистемах» (С.-Петербург, 2005), Международная конференция «Грибы и водоросли в биоценозах - 2006» (Москва, 2006), Международный конгресс «Картофель. Россия. 2007» (Москва, 2007), XV Congress of European Mycologists (С.-Петербург, 2007), Второй съезд микологов России (Москва, 2008), Вторая Всероссийская конференция «Современные проблемы иммунитета растений к вредным организмам» (С.-Петербург, 2008), Научно-практическая конференция «Актуальные проблемы современной индустрии производства картофеля (Картофель-2010)» (Чебоксары, 2010), Международная научно-практическая конференция «Теоретические и прикладные аспекты современной фитопатологии и иммунитета растений» (Минск, 2011), 13-th Euroblight workshop (С.-Петербург, 2011) и другие.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 109 печатных работ, из них 18 статей в журналах из перечня, рекомендованного ВАК, 28 - в других периодических изданиях и сборниках, 1 патент, 1 методические указания, 2 - соавторство в монографиях, 59 - тезисы и материалы конференций.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 325 страницах, содержит 46 рисунков и 76 таблиц и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и обсуждения собственных исследований, заключения, выводов, списка публикаций автора по теме диссертации и списка цитированной литературы. Библиография включает 238 литературных источников, из них 164 -иностранных.

Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность проф. Ю.Т.Дьякову за консультации, всестороннюю поддержку, помощь на всех этапах выполнения и написания работы, а также проф. А.Н.Лихачеву, проф. А.Н.Смирнову, проф. W.E.Fry и к.б.н. А.В.Филиппову за помощь в работе, организации исследований, освоении технологий и интерпретации данных. Отдельная благодарность сотрудникам, студентам и аспирантам биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова, РГАУ-МСХА им. К.А.Тимирязева, ВНИИ фитопатологии, ВНИИ картофельного хозяйства имени А.Г.Лорха, ВНИИ овощеводства и других организаций, в разное время принимавших

7

участие в совместных работах по теме диссертации: М.А.Побединской, Л.Ю.Кокаевой, Е.Д.Мыце, А.В.Долговой, С.Ф.Багировой, C.Smart, M.D.Coffey,

A.B. Александровой, Ф.Б.Ганнибалу, О.ИЛавровой, А.С.Кравцову, Е.В.Морозовой, Б.Н.Козловскому, И.Н.Козловской, Т.И.Сметаниной, С.Ю.Спиглазовой, Т.А.Терешонковой, Н.В.Стацюк, М.А.Кузнецовой, М.К.Деревягиной, В.Н.Зейруку, К.А.Пшеченкову, С.А.Кузнецову,

B.П.Апрышко, Ф.Х.Аматхановой, Д.И.Милютиной, Я.В.Петруниной,

C.А.Шеину, П.Н.Плуталову. За помощь в сборе образцов автор благодарит А.В.Николаева, З.З.Салихову, З.Сташевски, Ш.Б.Байрамбекова, К.О.Бутенко, А.В.Биткова, Ю.А.Чикина, Л.М. и В.В.Водневых.

Глава 1. Обзор литературы.

В обзоре литературы представлено описание цикла развития возбудителя фитофтороза, проведен сравнительный анализ маркеров, применяемых для популяционных исследований, обобщены исследования динамики генотипического состава популяций P.infestans. Отдельный раздел главы 1 посвящен исследованиям возбудителя альтернариоза. В нем обсуждается систематика рода и проблемы, возникающие при классификации видов рода Alternaría, паразитирующих на картофеле и томате. Описано развитие заболевания на картофеле и томате и биологические особенности вызывающих его видов гриба. Проанализированы возможности использования молекулярных методов исследований в таксономии рода Alternaría. Особое внимание уделено методам борьбы с фитофторозом и альтернариозом, используемым для борьбы с ними химическим фунгицидам, механизмам возникновения устойчивости к препаратам.

Глава 2. Материалы и методы.

Сбор пораженных образцов и выделение изолятов в чистую культуру.

Пораженные фитофторозом и альтернариозом образцы собирали с растений (1-2 образца на одно растение), отстоящих друг от друга на расстояние не менее 1 (огороды) или 3 м (крупные поля). Выделение изолятов в чистую культуру проводили с использованием влажных камер. После появления спороношения на поверхности пораженного органа его просматривали под бинокулярным микроскопом и остро заточенной препаровальной иглой, смоченной в агаризованной среде, переносили конидии, отличающиеся по морфологии, на агаризованную овсяную среду (для выделения Alternaría использовали также сусло-агар) с добавлением пенициллина (1000 ед/мл) и инкубировали до тех пор, пока диаметр колонии не достигал 4-5 см, после чего кусочек мицелия с края колонии пересевали на другую чашку со средой.

8

За период с 1991 по 2011 годы в чистую культуру были выделены 3358 изолятов Р. infestans из 210 полевых популяций России и Беларуси. Изоляты из Сахалина, Ленинградской, Тульской, Новгородской, Мурманской, Брянской, Ярославской областей были переданы сотрудниками Лаборатории грибных болезней картофеля и овощных культур ВНИИ фитопатологии, Белорусские штаммы - Центром картофелеводства и плодоовощеводства республики Беларусь. В сборе пораженных образцов и выделении изолятов в чистую культуру принимали участие М.А. Побединская, А.В. Филиппов, А.В. Долгова, Т.И. Уланова, В.П. Апрышко, А.Н. Смирнов, А.С. Кравцов, Ф.Х. Аматханова, С.А. Кузнецов, Я.В. Петрунина, Д.И. Милютина, С.Ф. Багирова, А.В. Николаев, Ш.Б. Байрамбеков, 3. Сташевски, 3.3. Салихова, Л.Ю. Кокаева и другие. Выделение изолятов в 1991 - 1994 годах было проведено А.Н. Смирновым.

Изоляты возбудителей альтернариоза были выделены из образцов, собранных в 2007-2010 годах в Ленинградской, Московской, Астраханской, Костромской, Смоленской областях, в Марий Эл и Татарстане. Изоляты из Ставропольского края были переданы сотрудниками Лаборатории грибных болезней картофеля и овощных культур ВНИИ фитопатологии; штаммы А. sotaní, собранные на Дальнем Востоке, часть штаммов из Ленинградской области, а также референтные штаммы, необходимые для уточнения идентификации видов, - сотрудниками Лаборатории микологии и фитопатологии ВНИИ защиты растений. Всего в работе использовано 311 изолятов Alternaría из разных регионов.

Оценка устойчивости к фунгицидам проводипась на агаризованной овсяной (сусло-агар - для Alternaría) среде с добавлением фунгицида в концентрациях 0,1; 1; 10; 100 и 1000 мкг/мл и на среде без фунгицида (контроль). Эксперименты проводили в трёх повторностях, результаты которых усредняли. Для каждого изолята определяли показатель ЕС50 (50% эффективной концентрации), т.е. концентрацию фунгицида, необходимую для замедления скорости радиального прироста колонии в 2 раза относительно бесфунгицидного контроля.

Определение типов спаривания у Р. infestans проводили методом попарного сращивания исследуемых изолятов на овсяной агаризованной среде с тестерными штаммами с известными типами спаривания. Чашки инкубировали в темноте при 18°С в течение 14 дней, после чего определяли наличие или отсутствие ооспор в месте контакта гиф между штаммами с помощью светового микроскопа. Если исследуемый изолят образовывал ооспоры с тестером А2 и не образовывал их с тестером Al, то его относили к типу спаривания Al, если наоборот - то к А2. Штаммы, образующие ооспоры с обоими тестерами, относили к группе AlА2, а не образующие ни с одним - к группе 00.

9

Оценка вирулентности изолятов. Для идентификации генов вирулентности P. infestans использовали тест-набор, полученный из Международного картофельного центра (CIP, Перу). Листовые пластинки из среднего яруса помещали во влажные камеры нижней стороной вверх и инокулировали суспензией зооспорангиев с концентрацией 0,5-1,5х105 шт/мл, после чего листья инкубировали при температуре 18°С и фотопериодизме свет/темнота=16ч/8ч. Результаты учитывали через 5-6 дней после инокуляции. В каждом эксперименте в качестве контроля использовали не имеющую R-генов линию картофеля 702514. В качестве положительного результата учитывали только спорулирующие пятна диаметром более 5 мм. Если штамм давал на тестируемых листьях очень мелкие пятна или некрозы без спороношения, либо не проявлял видимых симптомов заражения, результат считали отрицательным. Все эксперименты проводили в 3-х повторностях. Эксперимент считали удачным только в том случае, если при заражении линии 702514 были также получены положительные результаты.

Морфологическое определение видовой принадлежности изолятов Alternaría проводили по методике, предложенной Симмонсом (Simmons, 1992, 2007). При определении учитывались следующие признаки: наличие и тип ветвления конидий (у апекса и у основания), поверхность спор и др. Изоляты выращивали в стеклянных чашках Петри на картофельно-морковном агаре (КМА) при 25°С и естественном фотопериодизме. На 7-10 день роста колонии микроскопировали, описывали особенности формирования конидиальных цепочек и морфологию спор.

В случае отсутствия конидиальных спороношений у A. solani колонии подвергали воздействию УФ-излучения в течение 180 сек. (лампа Mineralight (2x30 Вт), модель CS-215, производство Ultra-Violet Products, Inc.; длина волны 260 нм, расстояние от ламп до культуры 7 см.). После этого чашки инкубировали при комнатной температуре в течение 3-5 суток в условиях естественного освещения.

Исследование спектра изоферментов пептидазы и глюкозо-6-фосфат изомеразы. Мицелий наращивали в чашках Петри с жидкой гороховой средой. Спектр изоферментов определяли на целлюлозоацетатных гелях согласно рекомендации производителя Helena Laboratories Inc. (Hebert, Beaton, 1993).

Выделение ДНК. Мицелий, выращенный в чашках с жидкой гороховой средой, растирали в жидком азоте, после чего лизировали в СТДВ-буфсре. Очистку от белков проводили с использованием хлороформа. После выделения ДНК из пораженной растительной ткани проводили определение концентрации ДНК в растворе на спектрофотометре «Specord 50» (фирмы "Analyticjena",

Германия), после чего ее доводили до 4 нг/мкл. Хранили выделенную ДНК в деионизованной воде при -20°С.

Гаплотипы митохондриальной ДНК идентифицировали согласно методике, разработанной Griffith и Shaw (1998). Продукты амплификации разделяли в 0,8% агарозном геле, продукты рестрикции - в 1,5%. Гели готовили на трис-боратном буфере с добавлением бромистого этидия.

Проведение ПЦР для амплификации региона, предназначенного для секвенирования. Амплификацию проводили в амплификаторе «Biometra Т1» по следующей программе: 95°С, 3 мин.; 25 циклов: 94°С, 40 сек., температура отжига указанная в таблице 1, 40 сек., 72°С , 60 сек.; конечная элонгация 72°С, 3 мин. Для амплификации специфичных участков ДНК использовали праймеры, приведенные в таблице 1.

Конечный объем реакционной смеси составлял 25 мкл и содержал 2,5 мкл 10х PCR buffer (Helicon), 2 мкл 25mM MgCl2, 0,5 мкл Taq-полимеразы (5 ед/мкл), 2 мкл dNTP mix (содержащей по 0,2 mM каждого dNTP), по 4пмоль каждого праймера, 1 мкл раствора ДНК. Объем смеси доводили деионизированной водой до 25 мкл.

Таблица 1.

Праймеры, использованные в работе.

Название Последовательность ДНК Ссылка Температура отжига, °C

Регион ядерных рибосомных генов (для P. infestans)

ITS6 ITS4 5'-GAGGGACTTTTGGGTAATCA 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC Cooke et al., 2000 White et al., 1990 55

Регион ядерных рнбосомпых генов (для Alternaría sp.)

ITS 5 ITS4 5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC White et al., 1990 White et al., 1990 58

Регион болынои субъеднница (mt LSU) мнтохондриальных рибосомных генов (для Alternaría sp.)

ML1 MLR1 5'-GTACTTTTGCATAATGGGTCAGC 5-GCCCTTCCGAGAGCAAATAC White et al., 1990 Peever et al., 2004 52

Секвенирование. После электрофоретического разделения ПЦР-продукт вырезали из геля (1,2% агарозы на TBE буфере) и выделяли его с использованием набора «Цитокин». Секвенирование ДНК проводилось компанией «Евроген» с помощью набора реактивов BigDye®Terminator v3.1 Cycle Sequencing, с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе ДНК Applied Biosystems 3730 xl. Для секвенирования использовались те же праймеры, по которым проводилась амплификация исследуемого участка. Чтение каждой последовательности проводили 2 раза - с прямого и обратного праймеров.

Проведение интер-SINE-nUP. Праймер (100 пмоль) метили с помощью [у32Р]-АТР (ШБк) и полинуклеотидкиназы. ПЦР проводили в объеме 20 мкл реакционной смеси, содержащей стандартный Год-буфер (50 mM КС1, 10 тМ буферТп5-НС1, рН 8,3, 2,5 mM MgCl2 и 0,001% желатин), 0,2 mM dNTP, 4пмоль праймера, 1 ед. Год-полимеразы и 25 нг геномной ДНК. Программа ПЦР: денатурация - 95°С, 1 мин.; отжиг - 48°С, 1 мин.; синтез - 72°С, 1 мин. Число циклов - 30. Предварительная денатурация продолжалась 5 мин. при 95°С; конечный синтез - 5 мин. при 72°С. Эксперименты выполняли на термоциклере Biometra TI. Продукты ПЦР денатурировали и разделяли с помощью электрофореза в 6%-ом полиакриламидном геле размером 50x28x0,4мм, содержащем 0,089 М трис-боратный буфер и 8 М мочевину. Электрофорез проводили в течение 7 часов при постоянной мощности тока 75 Вт. Радиоавтографию проводили, экспонируя высушенный гель с рентгеновской пленкой RETINA в течение 16 ч.

Глава 3. Систематическое положение возбудителя фитофтороза картофеля и томата.

Для уточнения видовой принадлежности российских изолятов возбудителей фитофтороза картофеля и томата совместно с профессором Калифорнийского университета M.D.Coffey было проведено секвенирование участка ДНК, амплифицируемого с помощью пары праймеров ITS6-ITS4. Этот участок включает внутренний транскрибируемый спейсер ITS1, участок, кодирующий 5,8S субъединицу рибосомы, а также регион 1TS2. Были исследованы 57 изолятов из 17 регионов России. Результаты работы показали, что все исследованные изоляты имели практически идентичные последовательности нуклеотидов, совпадающие с типичными для P. infestans (Cooke et al., 2000). Некоторые штаммы имели незначительные отличия, вызванные ограниченным числом нуклеотидных замен. Таким образом, по данным анализа региона 1TS6-ITS4 показано, что все исследованные изоляты принадлежат к виду Р. infestans. В пользу этого свидетельствуют морфологические исследования и данные других проведенных анализов: изучения гаплотипов митохондриальной ДНК, анализа спектров изоферментов пептидазы и глюкозо-6-фосфат изомеразы.

Глава 4. Анализ независимых маркерных признаков Р. infestans.

4.1. Изучение типов спаривания

За период с 1991 по 2011 годы тип спаривания был определен у 3203 изолятов из 166 полевых популяций. По соотношению штаммов с разными типами спаривания популяции разделились на 2 группы: популяции сибирско-

12

дальневосточного типа, представленные штаммами какого-либо одного типа спаривания, и популяции европейские, в состав которых, как правило, входили штаммы с разными типами спаривания. Эта тенденция прослеживалась и на картофеле, и на томате.

Очень высоким генотипическим разнообразием и распределением типов спаривания близким к 1:1 отличались популяции Московской области, Северного Кавказа и Беларуси, а также многие популяции европейской части России. В некоторых популяциях были встречены отдельные изоляты, которые образовывали ооспоры с обоими тестерами (группа А1А2) или не образовывали ни с одним из тестеров.

Изучение соотношения штаммов Р. infestans с разными типами спаривания на одном и том же поле в течение вегетационного сезона показало, что общей тенденцией был рост частоты типа спаривания, соответствующего преобладающему типу спаривания первичного инокулюма, в начальный период эпифитотии, и ее падение в более поздний период с приближением соотношения AI:А2 к 1:1.

Самофертильные штаммы. Существуют штаммы Р. infestans, которые при анализе типа спаривания ведут себя как AI или А2, но через некоторое время хранения на агаризованной среде в монокультуре (обычно около 2-х месяцев) начинают самопроизвольно образовывать ооспоры. Такие изоляты мы называли самофертильными (СФ). Доля таких штаммов различалась год от года; в 1997, 2003 и 2004 годах их доля в популяциях составляла от 21 до 34 %, в 1998, 1999, 2001 и 2006 годах - менее 10%. При сращивании с тестерными штаммами СФ в большинстве случаев вели себя как А2 (табл. 2). После хранения на косяках с овсяным агаром при +4°С и нескольких пересевов большая часть изолятов теряла способность образовывать ооспоры в монокультуре.

Таблица 2.

Доли самофертильных штаммов среди определенных как AI, А2 и А1А2 в пробах с тестерами.

Год Проверено изолятов Доля самофертильных штаммов среди, %:

AI А2 А1А2

1997 183 6 80

2003 387 9 56 100

2004 279 27 39

Прим.: * «-» в 1997 и 2004 годах штаммов группы А1Л2 не было.

4.2. Изоферментный анализ.

Традиционно используемые при анализе популяций изоферментные маркеры - локус 1 пептидазы и локус 1 глюкозо-6-фосфат изомеразы -оказались малопригодными для исследования российских популяций P. infeslans из-за низкой вариабельности. Локус 1 глюкозо-6-фосфат изомеразы (GP11), традиционно используемый в популяционных исследованиях, был исследован у 129 изолятов сборов 1997-1998 годов (Elansky et al, 2001) и у 38 изолятов 20002001 годов. Все исследованные штаммы имели один и тот же генотип 100/100 по этому локусу. Встречавшаяся ранее аллель 86, характерная для широко распространенного до начала 90-х годов 20 века клона US 1, после 1993 года не выявлялась.

С целью поиска новых изоферментных маркеров была проанализирована вариабельность малик-энзима, малатдегидрогеназы, супероксиддисмутазы (для каждого фермента проанализировали выборку из 20 изолятов из разных региональных популяций). Спектры изоферментов этих белков также были мономорфны, что совпадает и с результатами, полученными другими исследователями (Tooley et al., 1985). Достаточно высокий полиморфизм был отмечен у аллозимов второго локуса пептидазы. При электрофорезе на целлюлозоацетатных гелях локус 2 прокрашивается одновременно с локусом 1, что делает этот маркер удобным в работе и недорогим в применении.

Спектр изоферментов пептидазы был исследован у 1195 изолятов, представляющих 99 полевых популяций. В исследуемых популяциях локус пептидазы 1 (Рер-1) был представлен двумя аллелями 92 и 100, локус 2 (Рер-2) -аллелями 100 и 112. Генотип Рер-1 92/92 был обнаружен за все время исследований только 2 раза: у изолята, выделенного в 1997 г из картофеля в Москве, и у изолята, выделенного в 2007 году в Беларуси. Чаще всего встречался генотип 100/100, 92/100-значительно реже.

Больший полиморфизм отмечен у второго локуса пептидазы (Рер-2). В полевых популяциях встречаются часто как гомозиготы 100/100, 112/112, так и гетерозиготы 100/112. Локус 2 пептидазы оказался существенно более информативным, чем локус 1. Так, многие популяции по спектру изоферментов Рер-1 были мономорфны, тогда как анализ Рер-2 позволил выделить в этих популяциях определенные группы. Гетерозигота 100/112 не была выявлена в Костромской области, хотя там были отмечены штаммы как типа спаривания А2 с генотипом 100/100, так и типа спаривания А1 с генотипом 112/112. Это может свидетельствовать об отсутствии полового процесса и гибридизации на исследуемых полях.

В Московской области популяции на картофеле были мономорфны по локусу Рер-1 до 1996 года, а также в 2000 и 2001 годах. В остальные годы (1997,

14

1998, 2003, 2006, 2008) в подмосковных популяциях наблюдалось разнообразие, связанное с присутствием гетерозиготы 92/100. Усредненные данные за весь период наблюдений (1991 - 2008 годы) показывают, что и на картофеле, и на томате генотип 92/100 присутствовал в 11% образцов. Разнообразие популяций Московской области по локусу Рер-2 было отмечено во все годы наблюдений (1999-2008). Если обратиться к усредненным многолетним данным за все годы наблюдений, то заметны различия в соотношениях генотипов локуса Рер-2 на картофеле и томате. Соотношение генотипов Рер-2 100/100:100/112:112/112 на картофеле было 69/24/7, а на томате - 24/68/8, соответственно.

Очень высоким разнообразием по всем исследованным маркерным признакам отличались популяции Северного Кавказа. По локусу Рер-2 обнаружены все три возможных аллельных состояния. Анализ соотношения частот аллелей локуса Рер-2 показал, что в популяциях из Кисловодска, Северной Осетии и Ингушетии они находятся в равновесном состоянии, удовлетворяющем уравнению Харди - Вайнберга, что свидетельствует в пользу панмиксной структуры этих популяций.

4.3. Анализ гаплотипов митохондриалыюй ДНК.

Гаплотипы мтДНК были исследованы у 899 изолятов из 86 полевых популяций. На территории России и Беларуси были выявлены штаммы с двумя гаплотипами мтДНК: 1а и На. Других гаплотипов не было выявлено, хотя на присутствие Ib и IIb были протестированы 120 штаммов из разных регионов, собранные в 1999-2007 годах. Гаплотип Ib, характерный для клональной линии US-1, последний раз обнаруживали в 1993 году на листьях томата. Соотношение гаплотипов 1а и На в разных популяциях сильно варьировало. Были обнаружены как популяции, представленные штаммами с обоими гаплотипами в разных соотношениях (таких большинство), так и содержащие изоляты только с гаплотипом 1а, либо только с Па. Усредненые данные за весь период наблюдений (1991 - 2008 годы) в Московской области показали, что соотношение la/IIa на картофеле составило 62/38, а на томате 61/39.

4.4. Изучение гетероплазмоза у Р. infesíans.

Основным отличием гаплотипа II мтДНК от I является присутствие вставки размером 1881 пн. К фрагменту этой вставки длиной 709 пн с помощью программы Oligo были сконструированы праймеры VSFor (5-GCAGCCCAAATATCTCGAAA) и VSRev (5' G С A ATG GCGC АТС A ATT ATT). Условия амплификации и состав реакционной смеси - как при определении гаплотипов мтДНК, температура отжига - 52°С. Если в геноме штамма, имеющего тип mtDNA la согласно пробе PCR-RFLP, обнаруживали фрагмент

15

вставки, то штамм считали гетероплазматическим, в противном случае -гомоплазматическим.

Для доказательства гетероплазматической природы штаммов, несущих вставку, изолят ЭМОБТЛ139, содержащий вставку и имеющий 1а тип шЮЫА согласно пробе РСЯ-ЯРЬР, был расклонирован на 4 монозооспоровых клона. Все они содержали вставку. Далее один из клонов был еще раз расклонирован на 16 изолятов (К1-К16). Все монозооспорвые клоны и родительский штамм показали тип 1а при тестировании методом РСК-11РЬР. Анализ вставки выявил различия в количестве ПЦР-продукта (рис. 1), причем один клон (9) не содержал вставки. Вероятно, в процессе монозооспорового клонирования в этот изолят попали только митохондрии с геномом типа 1а.

Рис. 1. Амплификация вставки (709 пи) у монозооспорового потомства штамма ЗМОБТЛ139. Прим.: 1-16 - монозооспоровые потомки штамма ЗМОБТЛ139.

Наличие гетероплазмонов может затруднить интерпретацию результатов стандартных тестов, проводимых по методу PCR-RFLP. С другой стороны, митохондриальный геном выполняет ряд жизненно важных функций, гетероплазматическое состояние может иметь значение в адаптациях оомицетов.

Глава 5. Генотипический анализ популяций.

5.1. Анализ на основании независимых маркерных признаков (тип спаривания, спектр изоферментов пептидазы, тип митохондриальной ДНК).

Анализ взаимного влияния изучаемых маркеров (тип спаривания. Pep 1, Pep 2, тип MtDNA) методом у2 не выявил взаимосвязи между этими признаками (р>0,05) (Пляхневич, Еланский, 2008). Независимость исследуемых маркерных признаков позволила провести генотипический анализ изучаемых изолятов.

Для оценки генотипического разнообразия использовали популяции, в которых достаточно большое число штаммов было одновременно исследовано по всем маркерным признакам. Мультилокусные генотипы были определены у 567 изолятов из 19 полевых популяций, выделенных в 2000-2009 годах из пораженных фитофторозом образцов, собранных в разных регионах

Европейской части России, а также 78 изолятов, выделенных в 2006-2007 годах в Беларуси.

В большинстве исследуемых популяций встречались штаммы обоих типов спаривания, разные генотипы по локусам Рер-1 и Рер-2, два гаплотипа митохондриальной ДНК 1а и На и было отмечено высокое генотипическое разнообразие. Наиболее высоким генотипическим разнообразием отличались популяции из Ставропольского края (13 генотипов), Марий Эл (12), Беларуси (12), Московской области (8), Северной Осетии (7). Генетически однородными и, по-видимому, моноклональными, были популяции из Тульской, Ленинградской и Астраханской областей. Остальные популяции (выделенные из образцов, собранных в Вологодской, Рязанской, Костромской, Смоленской областях, в республиках Мордовия и Ингушетия) были представлены штаммами 2-4 генотипов и, вероятно, поликлональны. Высокое число генотипов штаммов из Беларуси может объясняться тем, что белорусские штаммы были выделены из образцов, собранных в разных точках республики, в то время как все остальные региональные популяции состояли из штаммов, выделенных на одном поле или на нескольких соседствующих частных огородах. Наиболее часто встречающиеся генотипы включали AI или А2 тип спаривания, 1а или На тип митохондриальной ДНК, генотипы 100/100 по локусу Рер-1 и 100/100 или 100/112 по Рер-2.

Максимальное число генотипов отмечалось в популяциях, в которых соотношение типов спаривания было близко к 1:1. Ранее проведенные исследования (Еланский и др., 1999) также показали увеличение в популяциях генетического разнообразия, вычисленного по изоферментным маркерам, с приближением соотношения А1:А2 к 1:1. Эти данные свидетельствуют о высокой вероятности скрещивания и гибридизации в полевых популяциях Европейской части России.

5.2. Оценка генотипического разнообразия с использованием INTER-SINE PCR.

Работами некоторых авторов была показана возможность использования коротких диспергированных ядерных элементов (Short Interspersed Nuclear Elements, SINEs) в качестве генетических маркеров (Банникова и др., 2002, Kaukinen, Varvio, 1992, Buntjer, 1997). Это возможно благодаря содержанию внутри SINEs консервативных участков ДНК, к которым можно подобрать ПЦР-праймер. При ПЦР такого типа происходит амплификация фрагментов, расположенных между копиями SINEs. Поскольку SINEs в геноме ориентированы в обоих направлениях, то для анализа достаточно одного праймера на консервативную часть.

В задачи предлагаемой работы, проводимой совместно с О.ИЛавровой, входило проведение HHTep-SINE-ПЦР с целью сравнительного анализа изолятов P. infestans из удаленных регионов: Тульская, Рязанская, Московская, Брянская области, республики Марий Эл, Ингушетия, Северная Осетия, о. Сахалин, Беларусь, а также из коллекции Scotland Crop Research Institute - из Аргентины, Эквадора, Мексики, Дании. В работе использовали праймер revSINE: 5' - GGGATCGAACCAGAAGTGACTACGG. ПЦР продукт амплификации тотальной ДНК P. infestans с праймером RevSINE был представлен большим числом полос разного размера. Кластерный анализ бинарных матриц, соответствующих фингерпринтам ДНК, не выявил групп изолятов ни по признаку географического происхождения, ни по растению-хозяину. Достоверно выделялся один изолят из Сахалина, который отличался и по другим характеристикам - имел самую высокую агрессивность к картофелю, максимально возможное число генов вирулентности к сортам картофеля, уникальный генотип по RG 57 (Elansky et al, 2001).

Аналогичные результаты были получены при применении этого метода для сравнительного анализа штаммов гриба Stachybotrys chartarum (Еланский и др., 2004). В результате исследований также не было показано кластеризации штаммов с одинаковых субстратов или из близких местообитаний и отмечены отдельные сильно выделяющиеся изоляты, отличающиеся и по другим маркерным признакам.

5.3. Исследования генотипического разнообразия в Московской области, в Сибири и на Дальнем Востоке с использованием гибридизационной пробы RG57.

В 1997-1998 годах были исследованы изоляты P. infestans, выделенные из образцов, собранных A.B. Долговой и A.B. Филипповым вдоль Транссибирской железнодорожной магистрали (Екатеринбург, Омск, Красноярск, Иркутск, Улан-Уде, Чита, Биробиджан, Хабаровск, Владивосток), на острове Сахалин, а также выделенные нами изоляты из Московской области, г. Москва, и Томской области. Все изоляты были проанализированы на набор признаков, традиционно используемых при идентификации клональных линий: тип спаривания, спектр изоферментов пептидазы и глюкозо-6-фосфат изомеразы, тип митохондриальной ДНК, фингерпринтинг с гибридизационной пробой RG 57 (25 локусов, Goodwin et al., 1992). Анализ RG57 проводился совместно с С. Smart и W.E. Fiy по протоколу, принятому в лаборатории W.E. Fry в Корнельском Университете, (http://www.plantpath.cornell.edu/Fry/Protocols.html).

Таблица 3.

Мультилокусиые генотипы исследованных изолятов.

Клональна линия я Место сбор образцов ТС GPI Pep I RG 57 фингерпринт Mt DN, Число изолятов

Изоляты, BI •■деленные с картофеля

SIB 1 *> А1 100/100 100/100 1000100011001101000110011 Па 31

SIB2 Хабаровск А2 100/100 100/100 1000100001001101000110011 Па 5

SIB3 Владивосто А1 100/100 100/100 1100101010001101000110011 Па 1

МО 1 Ml*2 (97) А2 100/100 100/100 1000100011001101000110011 На 1

МО 2 Ml (97) А2 100/100 100/100 1000100001001101000110011 1а 1

МОЗ Ml (97) А1 100/100 100/100 1010100001001101000110011 На 1

МО 4 Ml (97) А1 100/100 92/100 1010111011001101000110011 На

МО 5 M2 (97) А1 100/100 100/100 1000101001001101010110011 На 1

МО 6 M2 (97) А1 100/100 100/100 1010101001001101000110011 1а I

МО 7 М4 (97) А1 100/100 92/100 1000100011001100000110011 Па 1

МО 8 М4 (97) А1 100/100 92/92 1010110001001100000110011 На 1

МО 9 Ml (98) А1 100/100 92/100 1000100001001101000110011 На 1

МО 10 М2 (98) А1 100/100 100/100 1010110000001100000110011 1а 1

МО 11 МЗ (98) А1 100/100 92/100 1010101001001100000110011 1а 1

МО 12 МЗ (98) А2 100/100 100/100 1010101001001101000110011 1а 1

изоляты, выделенные с томата

SIB2 Биробиджан А2 100/100 100/100 1000100001001101000110011 На

МО 13 М2 (97) AI 100/100 100/100 101010100000U01000110011 1а 1

МО 14 МЗ (98) А1 100/100 100/100 0010101001001100000110011 1а 1

МО 15 МЗ (98) А1 100/100 100/100 0110111001001100010110011 1а 1

МО 16 МЗ (98) А1 100/100 100/100 1000100000001101000110011 На 1

Изоляты из с тары* коллекций

US 1 МЗ (93) А1 86/100 92/100 1010101011001101000110011 lb 2

SIB 1 А1 100/100 100/100 1000100011001101000110011 На 5

МО 17 МЗ (93) А1 86/100 100/100 1010101011001101000110011 lb 1

МО 18 МЗ (93) А1 100/100 100/100 1010111001001101000010011 На 1

МО 19 МЗ (93) А1 100/100 100/100 1010101000001101010110011 На 1

МО 20 МЗ (93) А2 100/100 100/100 101010100000 U010001100I1 Па 1

МО 21 П МЗ (93) А2 100/100 100/100 1010101000001100010110011 Па 1

Прим.: * - генотип Sib I был обнаружен у изолятов из окрестностей городов Омск, Красноярск, Иркутск, Чита, Екатеринбург, Владивосток, с острова Сахалин и из старых сборов (1993 г.) с картофеля в Московской области.

Анализ генотипов по всему комплексу независимых маркерных признаков был сделан у 70 изолятов. В результате проведенной работы были выявлены сильные различия в структуре популяций сибирско-дальневосточного региона и Московской области. Большинство популяций вдоль Транссибирской железнодорожной магистрали (Екатеринбург, Омск, Томск, Красноярск, Иркутск, Чита) и с острова Сахалин были представлены штаммами одной клональной линии (табл. 3). Во Владивостоке популяция была

биклональной, сложенной из штаммов клональных линий 81Ы и 81ЬЗ. В окрестностях Биробиджана и Хабаровска популяции были также моноклональными, но представлены штаммами другой клональной линии, 8'|Ь2. Штаммы с генотипом 81Ь2 были отмечены как на картофеле, так и на томате. Все выявленные в азиатской части России штаммы имели гаплотип митохондриальной ДНК На.

Популяции Московской области, напротив, отличались очень высоким генотипическим разнообразием. Из 27 протестированных изолятов, собранных в Московской области в 1993-1998 годах, 25 имели уникальные мультилокусные генотипы. Штаммы клональной линии и8-1, ранее широко распространенные по всему Земному шару, последний раз были выявлены в 1993 году на листьях томата в Одинцовском р-не Московской области (Смирнов и др., 1996, Е1апБку е! а1., 2001). Интересна клональная линия МОП, мультилокусный генотип которой практически идентичен 1181, но имеются отличия в структуре изоферментов первого локуса пептидазы. Вероятно, это объясняется произошедшей мутацией. Штаммы клональной линии 81Ы также выявлялись в значительном числе на полях Московской области в 1993 году, причем все они имели очень высокий уровень устойчивости к металаксилу.

Если сравнить фенотипические признаки штаммов (вирулентность к сортам картофеля и устойчивость к металаксилу), то заметны сильные вариации этих признаков у штаммов одной клональной линии. Так, среди изолятов с мультилокусным генотипом 8Пэ1 наблюдалась вариабельность как средней вирулентности (от максимально возможной, равной 10, у штаммов Сахалинской популяции, до 6,2 в Омске и 6,4 в Чите), так и устойчивости к металаксилу. По-видимому, на проявления устойчивости и вирулентности сильно влияют применение на конкретных полях фунгицидов и наличие генов резистентности у возделываемых сортов картофеля.

Глава 6. Изучение ооспорообразования в природных популяциях Р. ш/еэЮт

Ооспоры имеют большое значение в инфекционном цикле Р. т/е$Шп$ как на картофеле, так и на томате. Они могут служить источником первичной инфекции, способствовать повышению генетической изменчивости и появлению новых форм гриба, в том числе высокопатогенных. Целью настоящего исследования, в котором участвовали А.Н. Смирнов, С.А. Кузнецов, В.П. Апрышко, Ф.Х. Аматханова, было изучение закономерностей образования ооспор в полевых популяциях Р. т/езгат.

Всего на наличие ооспор исследованы 2695 фитофторозных образцов из 73 полевых популяции. Сборы проведены в 1997, 1999, 2000, 2001, 2003, 2006 и 2007 годах. Ооспоры были обнаружены в пораженных фитофторозом образцах

листьев, стеблей и клубней картофеля, листьев и плодов томата, собранных в Московской области, республиках Северного Кавказа, Ставропольском крае, Астраханской области и в Марий Эл. Максимальная доля содержащих ооспоры образцов была выявлена среди пораженных плодов томата, меньшая - среди листьев томата и минимальная - среди листьев картофеля (табл. 4).

Таблица 4.

Встречаемость ооспор в пораженных фитофторозом образцах разных органов растений-хозяев (суммарные данные за весь период исследований).

Орган растення Общее число протестированных образцов за 1997-2006 года Число образцов с ооспорами.

Листья картофеля 1815 115(6,3%)

Листья томата 255 49 (19,2%)

Плоды томата 360 119 (33%)

Исключительно благоприятные для развития фитофтороза погодные условия 2003 года позволили провести специальное исследование, посвященное изучению встречаемости ооспор в пораженных образцах с одним и несколькими очагами фитофтороза. Было показано, что 31% образцов листьев картофеля с двумя и более пятнами содержал ооспоры, в то время как среди образцов с 1 пятном содержали ооспоры лишь 12%. Это свидетельствует в пользу того, что при сильном развитии фитофтороза, когда на листовой пластинке образуется несколько пятен, значительная часть ооспор имеет гибридную природу.

Ооспоры в образцах листьев с одним очагом фитофтороза встречались как в тех полевых популяциях, в которых были выявлены изоляты только одного типа спаривания, так и в тех, из которых выделяли изоляты обоих типов спаривания. Ооспоры были отмечены как в образцах с мицелием Р. т/ехШпз А1 типа спаривания (13% образцов содержали ооспоры), так и в образцах с мицелием А2 (15%). Преимущества в образовании ооспор мицелием какого-либо типа спаривания не было обнаружено. Это представляется интересным фактом, поскольку на агаризованной среде штаммы типа спаривания А2 значительно чаще образовывали ооспоры в монокультуре, чем штаммы А1 (см. раздел 4.1).

Глава 7. Устойчивость к фунгицидам.

В 2007-2009 годах была исследована устойчивость к некоторым фунгицидам штаммов Р. т/еэгат, выделенных с посадок картофеля и томата в разных регионах европейской части России и Беларуси (табл. 5). Изучение устойчивости к манкоцебу показало, что во всех изученных популяциях преобладали чувствительные штаммы. Штаммов с ЕС5о, превышающим 31 мкг/мл, не было выявлено, хотя в нескольких популяциях были представлены штаммы с близкими значениями этого показателя. Возможно, это пороговое значение, и штаммы с более высокой устойчивостью оказываются нежизнеспособны или неконкурентоспособны в агроценозах. К хлороталонилу все исследованные изоляты были чувствительны, показатель ЕС50 не превышал 10 мкг/мл (за исключением одного изолята из Минской области с ЕС50 равным 16,75 мкг/мл). Не было выявлено и изолятов, устойчивых к флуазинаму. Самый устойчивый штамм имел показатель ЕС5о равный 30,1 мкг/мл; в большинстве же популяций не выявлялись изоляты с ЕС50 более 7 мкг/мл. Все проверенные изоляты были высокочувствительны к диметоморфу (ЕС50 не более 0,1 мкг/мл) и азоксистробину (ЕС50 не превышал 0,1 мкг/мл).

Во всех протестированных популяциях были обнаружены только высокочувствительные к азоксистробину изоляты, хотя по литературным данным риск появления устойчивости к азоксистробину оценивается как высокий (ВагИей е! а!., 2002). Возможно, это связано с редким применением Квадриса в Европейской части России. Мы специально исследовали штаммы, выделенные с коммерческих полей томата в Астраханской области, где применяют азоксистробин и другой стробилуриновый фунгицид крезоксим-метил. Однако и там были обнаружены только высокочувствительные изоляты. По-видимому, появление устойчивости к азоксистробину у Р. т/е.чШп.ч является крайне редким событием.

Исследование устойчивости к металаксилу показало, что в большинстве исследованных популяций преобладали чувствительные штаммы. Среди изолятов, выделенных из образцов, собранных в Астраханской, Ленинградской областях и в Марий Эл не было найдено ни одного с ЕС50 более 5 мкг/мл. Однако в некоторых областях были выявлены и высокоустойчивые изоляты. В популяции из Московской области из 31 исследованного изолята у 8 показатель ЕС50 превышал 100 мкг/мл, хотя образцы были собраны с необрабатываемого фунгицидами поля. Среди изолятов, выделенных из Белорусских образцов, таких штаммов было два. Наибольшей долей высокоустойчивых изолятов отличалась популяция из Смоленской области (32 изолята из 48 исследованных).

Таблица 5.

Устойчивости к фунгицидам штаммов из разных регионов России и Беларуси.

Фунги

-цид

X

ч

е

Регион сбора образцов

Московская

Ленинградская

Смоленская

Костромская

Астраханская

Марий Эл

Беларусь

Кол-во протестированных изолятов

23

19

25

20

45

Московская

Ленинградская

Смоленская

Костромская

Астраханская

Марий Эл

Беларусь

Московская

Ленинградская

Смоленская

57

31

12

48

52

25

47

64

15

10

Костромская

Астраханская

10

14

Марий Эл

Беларусь

Московская

Ленинградская

Смоленская

Костромская

Астраханская

Марий Эл

Беларусь

Московская

Ленинградская

Смоленская

Костромская

Астраханская

Марий Эл

Беларусь

Московская

Ленинградская

Смоленская

Костромская

Астраханская

Марий Эл

Беларусь

10

10

27

10

23

21

9

34

Вариабельность ЕС5(1, мкг/мл

0,6-22,4

0,98 - 26

0,5 - 25,6

0,6-18,6

0.5-27

0,64 - 30,8

0,52 - 398

0,54 - 4,7

0,51 -380,0

0,51-38,75

0,51 -2,85

0,5-4

0,5-151,5

0,05-0,07

<0,05

<0,05

0,05 - 0,07

<0,05

<0.05

<0,05

0,51-0,79

Среднее

ЕСйя, мкг/мл

Число штаммов с различными ЕС»):

<1

5,51

10,9

6,48

5,31

3,42

10,2

100,0

2,0

168,9

1,67

1-10

16

10

20

14

14

0,85

0,76

44

22

5,5

0,05

<0,05

<0,05

0,05

<0,05

<0,05

<0,05

0,53 - 5,5

0,64-4,95

0,81 - 11,5

0,55 - 5,5

1,82-3,45

0,69-16,75

0,53 - 5,24

0,59 - 5,34

0,52 - 6,83

0,53 - 5,99

0,6

3,0

2,17

42

55

15

10

10

30

31

14

10

10

27

4,48

3,18

2,67

4,85

2,03

2,36

19

2,48

0,75 - 4,26

4,21-8,43

0,5-30,12

0,05 - 0,09

0,05 - 0,07

<0,05

0,05 - 0,06

0,05 - 0,09

0,05 - 0,06

<0,05

Прим.:— исследования не проводились.

1,7

1,92

5,51

6,98

0,06

0,06

<0,05

0,05

0,06

0,06

<0,05

34

14

10-100

13

20

12

>100

32

Устойчивость к диметоморфу была дополнительно исследована у 240 изолятов Р. infesíans, выделенных в 1993-2003 г.г. из пораженных фитофторозом растений картофеля и томата в 12 регионах России. В опыты были включены изоляты с картофельных полей на о. Сахалин и в Костромской области, где применяли содержащий диметоморф препарат Акробат-МЦ. Исследования проводились совместно с М.К. Деревягиной и Б.Е. Козловским. Все исследованные изоляты были высокочувствительны к диметоморфу, показатель ЕС50 не превышал 0,2 мкг/мл (Деревягина и др. 1999, Еланский и др., 2007, 2012).

В целом, как показывают полученные результаты, популяции возбудителя фитофтороза состоят преимущественно из чувствительных к наиболее популярным фунгицидам штаммов, и устойчивость даже самых резистентных изолятов будет с успехом преодолена рекомендованной концентрацией фунгицида в рабочей жидкости. Исключение составляют только изоляты, устойчивые к металаксилу, контроль которых с помощью фениламидных фунгицидов в некоторых регионах может не принести желаемых результатов.

Отдельная работа по изучению мутаций устойчивости к диметоморфу была проведена совместно с С.Ф. Багировой и А. Цзян Ли. С помощью обработки суспензии цистоспор 0,005% раствором нитрозометилмочевины (НММ) были получены мутанты с повышенной устойчивостью к диметоморфу. Летальная концентрация мутантных штаммов выросла с 2 мкг/мл у дикого типа до 6 мкг/мл, показатель ЕС50 - с 0,3 мкг/мл до 2,0 мкг/мл. Полученные мутанты по морфологии колоний, структур мицелия и скорости роста на агаризованной среде не отличались от дикого типа. После повторной обработки раствором НММ были получены 4 мутантных изолята, способных расти на среде с концентрацией диметоморфа до 8 мкг/мл. Приобретение устойчивости у этих штаммов сопровождалось нарушением частоты ветвления гиф и редким образованием зооспорангиев неправильной формы (Bagirova et al., 2001).

Через два года культивирования на среде без добавления диметоморфа изоляты с одним мутантным локусом полностью утратили устойчивость. Летальная концентрация двух из четырех двойных мутантов, первоначально способных расти на концентрации 8 мкг/мл, понизилась до 4 мкг/мл, одного -до 3 мкг/мл, а еще один полностью утратил устойчивость. Изучение скорости роста на овсяном агаре без фунгицида показало, что утративший резистентность мутант не отличался по скорости роста от чувствительного дикого типа, а сохранившие устойчивость мутанты росли значительно медленнее дикого типа.

Таким образом, было показано, что устойчивость к диметоморфу является полигенной и аддитивной и не отличается стабильностью. Вероятно,

устойчивые изоляты отличаются низкой конкурентоспособностью и после снижения фунгицидного пресса исчезают из популяции.

Глава 8. Вирулентность к сортам картофеля и томата.

8.1. Картофельные расы.

В 1991-2003 г. гены вирулентности были исследованы у 750 изолятов. В определении генов вирулентности в разные года участвовали И.Н. Козловская, Т.И. Сметанина, Е.В. Морозова, А.Н. Смирнов, С.А. Кузнецов, Ф.Х. Аматханова, С.Ф. Багирова.

Популяция P. infestans на территории России представлена, в основном, сложными расами, содержащими 5-10 генов вирулентности. В разных популяциях их содержание составляло от 50 до 70 %, и выше. Чаще встречались гены вирулентности 1-4, 7, 8, 10, 11; редко - 5, 6, 9. Самая сложная раса 1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11, включающая 11 генов, была идентифицирована в 7 областях РФ (Брянская, Тульская, Тамбовская, Ленинградская, Мурманская области, Мордовия и Сахалин), при этом в Тульской и Брянской областях ее содержание достигало 50-57 %, на Сахалине - 100 %. Относительно простые расы идентифицированы только в двух областях - в Ярославской (раса 3.4) и в Костромской (раса 4.10). Исследование, проведенное на Сахалине позднее (2003 г) показало снижение числа генов вирулентности на изолят. Это совпало и с повышением генотипического разнообразия: популяция в 2003 году уже не была моноклональной.

8.2. Вирулентность к сортам томата

Вирулентность к тестерным сортам томата Талалихин (PhO, заражается штаммами P. infestans без генов вирулентности и с геном Т1), и Оттава (Phi, штаммами без гена Т1 не заражаются) определена у 521 изолята P. infestans, выделенных из картофеля и томата в 1991-2003 годах. В разные годы в тестировании томатных рас участвовали А.Н. Смирнов, Т.И. Уланова и Т.А. Терешонкова. Доля штаммов с геном Т1 (усредненные по годам данные) среди выделенных из томата изменялась в промежутке от 34 до 95%, среди выделенных из картофеля - от 0 до 30%. В популяциях, выделенных с картофеля в других регионах, доля штаммов расы Т1 тоже сильно варьировала - от 0 до 97%. Очень высокая доля Т1 (более 90%) отмечена среди изолятов из Тульской области и с о. Сахалин, причем эти популяции были наиболее агрессивны к картофелю.

Глава 9. Оценка агрессивности при реципрокных заражениях картофеля и томата в лабораторных условиях.

В задачи наших опытов входило изучение селекции патогенных свойств изолятов Р. т/евгат в течение нескольких вегетативных генераций на листьях картофеля и томата. Работа проводилась совместно с О.И. Лавровой (Лаврова и др., 2003). Для опыта использовали монозооспоровые штаммы двух изолятов, выделенных из картофеля (раса ТО) и томата (Т1) в Тульской и Московской областях. Суспензией цистоспор обоих изолятов одинакового титра опрыскивали газоны из листьев картофеля (сорт Санте) и томата (сорт Талалихин). После инкубации с одного из листьев производили смыв зооспорангиев, получали зооспоры, которые опять распыляли на листья растения того же вида (с картофельных - на картофельный газон, с томатных -на томатный). После 4-х пассажей из очагов фитофтороза на листьях были выделены в чистую культуру изоляты Р. \nfestans. Их характеристики не отличались от характеристик соответствующих исходных изолятов, что показывает отсутствие перезаражения в процессе пассажей.

Таблица 6.

Номера пересевов ТО из картофеля Т1 из томата

на картофеле на томате на картофеле на томате

I 75 120 150 92

II 200 213 254 235

II 308 155 265 280

IV 310 245 275 335

Из таблицы 6 видно, что раса ТО из картофеля исходно (в 1-м пассаже) образовала больше пятен на листьях томата, чем на листьях картофеля, а раса Т1 из томата исходно образовала больше пятен на листьях картофеля, чем на листьях томата. Однако в дальнейшем все стало на свои места: скорость роста агрессивности была значительно более высокой на своем хозяине, нежели на чужом. После 4-х пассажей раса из картофеля стала более агрессивной для картофеля, чем для томата, а раса из томата - более агрессивной для томата, чем для картофеля. Изоляты, полученные в результате пассажей «томатного» изолята на листьях томата и «картофельного» на листьях картофеля по агрессивности и скорости роста на искусственной среде значительно превышали результаты пассажей «томатного» на листьях картофеля и «картофельного» на листьях томата.

Глава 10. Развитие P. infestons на диких Licopersicon hirsutum в Московской области

В 2000 году M.D.Coffey передал нам семена диких высокорослых Licopersicon hirsutum из Южной Америки (Перу), используемых в качестве доноров устойчивости при селекции томата на фитофтороустойчивость в США. Благодаря этому нам представилась возможность изучить поражаемость диких Lycopersicon российскими штаммами возбудителя фитофтороза и, с другой стороны, исследовать штаммы, отселектированные на L. hirsutum в полевых условиях, когда он выращивался среди посадок картофеля и томата. Пораженные фитофторозом образцы L. hirsutum, L. esculentum и S. tuberosum с экспериментального поля были исследованы на присутствие ооспор. В работе, проведенной совместно с Т.Н. Улановой, использовали 8 линий диких L. hirsutum.

Тестируемые образцы диких пасленовых показали высокий уровень устойчивости к фитофторозу, который, однако, сопровождался сильным запаздыванием фаз развития по сравнению с культурными томатами. Выделенные с них изоляты P. infestans уступали по агрессивности (к картофелю) «томатным», но превосходили картофельные. По вирулентности к сортам картофеля и томата, а также по встречаемости ооспор в листьях, изоляты, выделенные с разных растений-хозяев, не имели существенных отличий.

Глава 11. Возможные механизмы изменчивости популяций P. infestans

Практически все изученные популяции возбудителя фитофтороза в Европейской части России отличались более или менее значительным разнообразием. В этом разделе разобраны механизмы (мутационный процесс, миграции, половая и парасексуальная рекомбинации, интрогрессии генов), которые могли оказать влияние на сложившееся распределение генотипов в Российских популяциях.

Глава 12. Особенности развития фитофтороза в России.

В данной главе рассматривается ситуация с развитием фитофтороза в России, влияние на развитие заболевания первичного инокулюма, сортов растений-хозяев и химических обработок на приусадебных огородах и на полях крупных производителей. Отмечено, что частные огороды являются глобальным «плавильным котлом», в котором в результате обмена генетическим материалом перерабатываются существующие генотипы и появляются абсолютно новые. При этом их селекция проходит в условиях, сильно отличающихся от создаваемых для картофеля в крупных хозяйствах:

27

отсутствие фунгицидного пресса, сортовой выравненное™ посадок, преобладание растений, пораженных разными формами вирусной и бактериальной инфекции, соседство с томатами и дикими пасленовыми, активное скрещивание и ооспорообразование, возможность для ооспор вызывать возобновление заболевания на следующий год. Все это приводит к очень высокому генотипическому разнообразию приусадебных популяций Р. infestons. В условиях эпифитотии на огородах происходит быстрое распространение фитофтороза и выброс огромных количеств спор, перелетающих на близлежащие коммерческие посадки. Однако, попав на коммерческие поля с правильной системой агротехники и химзащиты, прилетевшие споры практически не имеют возможности к инициации тяжелой эпидемии на поле, что связано с отсутствием устойчивых к фунгицидам и специализированных к выращиваемому сорту клональных линий патогена.

Глава 13. Видовой состав возбудителей альтернариоза картофеля и томата.

Для идентификации видового состава по структуре отдельных участков генома были взяты образцы ДНК 7 крупноспоровых и 25 мелкоспоровых штаммов, выделенные из картофеля и томата в разных регионах России. Для сравнительного изучения была отобрана последовательность ядерной рДНК, ограниченная праймерами ITS5 и ITS4 (рис. 2). Этот участок исследован у многих видов живых организмов и широко используется для анализа таксономических взаимоотношений.

В результате работы были определены нуклеотидные последовательности исследуемого участка (ITS5-ITS4) длиной 595 пн для мелкоспоровых, 605 пи для A. solani и 627 пн для A. infectoria.

Рис. 2. Взаиморасположение генов и межгенных последовательностей ядерной рДНК и локализация внутри него праймеров ГГЯэ и 1Т84.

Исследуемые штаммы распределились на 3 группы (рис. 3).

В первую группу вошли представители всех исследованных мелкоспоровых изолятов, за исключением А. ЩесЮпа, включая типовые штаммы А. агЬоге^сеп* и А. (спирта (их последовательности взяты из банка генов, http://wvwv.ncbi.nlm.nih.gov).

Вторая группа содержала все исследованные крупноспоровые изоляты, включая взятые из банка генов последовательности типовых штаммов А. tomatophyla и A. solani. Однако штамм A. tomatophyla заметно отличался от других штаммов своей группы. По-видимому, исследованные крупноспоровые штаммы, выделенные с томата, являются не A. tomatophyla, a A. solani (что подтверждается и результатами морфологической диагностики), хотя это и противоречит мнению Симмонса (Simmons, 2007), утверждающего отсутствие вида A. solani на томате. Небольшие отличия имели штаммы A. solani, выделенные с картофеля и томата на Дальнем Востоке.

Tatars (an PL 21 A. ALT Tatarstar» PL 18a A. TEN Tatars tan PL GO A. ALT Tatarstan PL 61 A. ALT Kostromskaya PL Ю A TEN Kostromskaya PL e A. TEN Kostromskaya PL 15 A. ALT Kostromskaya PL 11a A. ALT Kostromskaya PL ЗЬ A. ALT Kostromskaya PL64a A. ALT Koatromskaya PL9 A. TEN Far East TL 106-021 A ARB Ft* East TL 14в-021 A. ALT. Moskouskaya PL Oö-З A. TEN Moskovekaya PL 03/1 A. ALT Moskovskaya PL A. ALT Many f=l TL 49<2)A ALT Many El TL 12b A. TEN Astrakhanskaya TF 1g A. ALT Leningrad Sk ay a KL 44 A. TEN Leningradskaya PL A. TEN Leningradskaya PL 23 A.ALT Miihegorodskaya PL 5 A. ALT Kavkaz PL A ALT

A. artwresccns STE-U4244 (Gcnbank) A. tenuissima EGS_34-01 5 (Genbank)

,_a. tomatophiia_CBS 10Э156 (Genbank)

■ Far Fast TF 104-031 A. SOL - I I Гаг East TL 043-021 A SOL

,_f ar East PL 044-011 A. SOL

A.solani CBSJ 11 44{Genbank) Astrakhanskaya TF 11 a A. SOL Astrakhanskaya TL 14e/2 A. SOL Astrakhanskaya TL 125 A. SOL. Far East Tl. 104-021 A. SOL

E" . infectoria EGS_27-193 (Genbank)

USA Suffolk 492-01 1 A. INF. ..oslKKiisktivH PL 5 A. INF

0 01

Рис. 3. Дендрограмма, построенная с помощью метода максимального правдоподобия по структуре участка ITS5-ITS4.

Обозначения: Видовая принадлежность по результатам морфологического изучения: A.ALT -А. alternata, A.TEN. -А. tenuissima, A. ARB -A. arborescens, A.SOL -A. solani, A.INF -A. infectoria. Органы растений, с которых проводилось выделение: PL-листья картофеля, TL - листья томата, TF - плоды томата.

В третью группу попали изолят A. infectoria, выделенный в Костромской области, типовой изолят из США, переданный сотрудниками лаборатории микологии и фитопатологии ВНИИ защиты растений, а также последовательность типового штамма из банка генов.

Видовая принадлежность используемых в работе изолятов была определена также и по морфологическим признакам. В результате проведенной работы были выявлены штаммы четырёх мелкоспоровых видов: A. alternata, А. tenuissima, A. arborescens и A. infectoria, и одного крупноспорового - A. solani. При исследовании последовательностей ДНК A. solani и A. infectoria попали в соответствующие отдельные группы. Морфологические виды A. alternata, А. tenuissima, A. arborescens различий по структуре генома не имели, в результате чего все они попали в одну группу вместе с типовыми A. arborescens и А. tenuissima.

Сравнение штаммов проводили и по структуре последовательностей ДНК большой субъединицы митохондриальных рибосомальных генов (mtLSU). Дендрограмма, построенная по полученным данным, также позволила разделить проанализированные изоляты на две группы: первая группа - мелкоспоровые штаммы, включая А. infectoria; вторая группа -А. solani. Внутри групп штаммы были практически идентичны.

Таким образом, анализ отдельных участков генома Alternaria показал разделение исследуемых штаммов на три клады: А. solani, A. infectoria и мелкоспоровые. Объединение мелкоспоровых штаммов в одну кладу и их отличие от А. infectoria совпадает с результатами исследований, проведенных на других растениях-хозяевах (Pryor and Lichailides, 2002, Hoog and Horre, 2002).

Глава 14. Устойчивость возбудителей альтернариоза к фунгицидам

В работе изучены изоляты возбудителей альтернариоза картофеля и томата, выделенные в 2007-2010 годах в Ленинградской, Московской, Астраханской, Костромской, Смоленской областях, в Марий Эл и Татарстане. Всего было выделено в чистую культуру и исследовано 285 изолятов.

Исследование устойчивости изолятов (табл. 7, 8) показало, что они наиболее чувствительны к фунгицидам флуазинам и дифеноконазол (показатель ЕС50 менее 1 мкг/мл). Несколько менее эффективным оказался флудиоксонил (ЕС50 не более 10 мкг/мл). Достаточно эффективным фунгицидом показал себя манкоцеб, устойчивость к которому варьировала для разных изолятов в пределах 6,7-604 мкг/мл. При этом уровни устойчивости к манкоцебу существенно различались для мелкоспоровых видов и A. solani. Согласно данным, представленным в таблицах 9 и 10, среднее значение ECS0 для мелкоспоровых видов равнялось 128,4 мкг/мл, в то время как для Л. solani - 15,5

30

мкг/мл. Статистическая достоверность отличий подтверждается Т-тестом при уровне значимости 0,01 (р=2,35х106). Различия в эффективности воздействия других фунгицидов (кроме манкоцеба) на А. $о1ат и мелкоспоровые виды были статистически недостоверны.

Таблица 7.

Устойчивость мелкоспоровых изолятов А1/егпаг/а к фунгицидам

Кол—во Число штаммов с различными

Регион сбора образцов протес- Вариабель- Среднее ЕС50, мкг/мл

тированных изолятов ность ес50, мкг/мл ЕС50, мкг/мл < 1 1-10 10100 1001000 > 1000

Манкоцеб

Костромская 24 7,1 -237,0 71,1 0 3 18 3 0

Марий Эл 35 7,3 - 604 80,4 0 4 27 4 0

Астраханская 43 6,7-596,2 145,4 0 3 24 16 0

Ленинградская 21 29,6-421,6 152,3 0 1 11 9 0

Татарстан 20 9,6-588,8 193,0 0 2 8 10 0

Все регионы 143 6,7-604 128,4 0 13 88 42 0

Азоксистробип

Костромская 21 8-4600 1057,8 0 7 3 3 8

Марий Эл 24 9,3 - 2800 747,4 0 2 8 8 6

Астраханская 32 8,7-6175 1072,7 0 0 13 8 11

Ленинградская 17 7,9 - 2800 1106,4 0 2 4 5 6

Татарстан 18 9,5 - 2500 867,6 0 3 3 5 7

Все регионы 112 7,9-6175 970,4 0 14 31 29 38

Флудиоксонил

Костромская 19 0,1 -4,2 0,86 15 4 0 0 0

Марий Эл 18 0,5-1,3 0,7 16 2 0 0 0

Астраханская 28 0,5-45,3 2,3 26 1 1 0 0

Ленинградская 17 0,5- 1,5 0,7 14 3 0 0 0

Татарстан 19 0,5 - 5,3 1,3 15 4 0 0 0

Все регионы 101 0,5-45,3 1,2 86 14 1 0 0

Хлороталоннл

Костромская 12 64- 1900 864,8 0 0 2 6 4

Марий Эл 11 9,4 - 2050 632,8 0 2 3 3 3

Астраханская 12 9,7 - 2200 634,9 0 2 3 3 4

Ленинградская 11 25- 1450 611,5 0 1 3 5 2

Татарстан 14 8,5- 1250 396,9 0 2 5 5 2

Все регионы 60 6,4 - 2050 628,2 0 7 16 22 15

Дифеноконазол

Все регионы 1 45 0,05 - 0,2 0,08 45 0 0 о

Флуазинам

Все регионы 49 0,51-0,78 0,62 49 0 0 о 0

Выявленное отличие в уровнях устойчивости к манкоцебу имеет важное практическое значение, т.к. этот фунгицицид является самым популярным в России и входит в состав многих смесевых препаратов. Возможно, именно применение содержащих манкоцеб препаратов привело к наблюдающемуся в настоящее время практически повсеместному преобладанию мелкоспоровых видов на картофеле и томате.

Слабым фунгицидным эффектом по отношению как к мелкоспоровым видам, так и к А. $о1ат, отличались хлороталонил и азоксистробин. Среди всех исследованных видов из разных региональных популяций (за исключением А. яо1ат из Марий Эл) были выявлены изоляты с ЕС50 более 1000 мкг/мл.

Таблица 8.

Устойчивость изолятов A. solani к фунгицидам

Регион сбора образцов Кол-во протести- Вариабельность ЕС5о, Среднее Число штаммов с различными ЕС50, мкг/мл

рованных изолятов мкг/мл мкг/мл <1 1-10 10100 1001000 > 1000

Манкоцеб

Марий Эл 16 6,9-20,1 8,7 0 15 1 0 0

Астраханская 14 5,9-85,3 28,9 0 5 9 0 0

Приморский край 9 6,7 - 9,2 7,5 0 9 0 0 0

Все регионы 39 5,9-85,3 15,5 0 29 10 0 0

Азоксистробин

Марий Эл 10 6,4 - 700 103,2 0 3 6 1 0

Астраханская 10 5,5-3812 1075,4 0 2 3 1 4

Приморский край 9 8,2 - 2350 530,2 0 1 5 1 2

Все регионы 29 5,5-3812 562 0 6 14 3 6

Флудиоксонил

Марий Эл 10 0,6-4,1 1,5 7 3 0 0 0

Астраханская 11 0,6-7 1,7 9 2 0 0 0

Приморский край 9 0,54-0,7 0,6 9 0 0 0 0

Все регионы 30 0,54 - 7 1,26 25 5 0 0 0

Дифеноконазол

Все регионы | 23 | 0,05-0,42 [ 0,09 | 23 I 0 I 0 1 0 1 0

Хлороталонил

осе регионы j 17 | 5,8 - 1440 | 486,8 | 0 I 5 1 4 1 5 I 3

Флуазинам

Все регионы | 19 | 0,51 -0,63 | 0,54 | 19 | 0 | 0 | 0 1 0

Азоксистробин, по оценке коллектива экспертов (Bradshaw, 2007), признан одним из лучших фунгицидов против альтернариоза. Однако при лабораторной

оценке он показал крайне низкую фунгицидную активность в отношении всех исследованных видов возбудителей альтернариоза картофеля и томата. Чем же может быть вызвано подобное несоответствие?

Мутации устойчивости к стробилуриновым фунгицидам хорошо известны и описаны в литературе (Bartlett et al., 2002, Pashe et al., 2005, Grasso et al., 2006, Peters et al, 2008, Ishii, 2009). В Европе и США выявлена мутация G143A гена цитохрома Ь, вызывающая устойчивость мелкоспоровых Alternaría. Генотипически она проявляется в виде однонуклеотидной замены (G у дикого штамма и С - у мутанта) в 143 кодоне гена цитохрома Ь.

Проведенные нами эксперименты по аллель-специфичной ПЦР-идентификации этой мутации показали её отсутствие у 33 исследованных изолятов с разными уровнями устойчивости к азоксистробину, выделенными из пораженных образцов картофеля и томата в разных регионах России. Определение последовательности нуклеотидов гена цитохрома b (сиквенирование) было проведено у 6 изолятов мелкоспоровых видов из Костромской, Астраханской, Ленинградской областей, Марий Эл и Татарстана. Показатель устойчивости ЕС50 у этих штаммов варьировал от 10 до 6170 мкг/мл. Однако ни в одном случае мутации G143A выявлено не было. По-видимому, устойчивость российских штаммов обусловлена другими механизмами.

С другой стороны, устойчивость мицелия к азоксистробину может и не быть решающим фактором эффективного воздействия на патогена при полевом применении. Возможно, азоксистробин более эффективно воздействует на прорастающие конидии возбудителей, а не непосредственно на рост мицелия. Для проверки этого предположения мы (совместно с П.Н. Плуталовым) изучили прорастаемость конидий и ветвление ростковых гиф 39 изолятов разных видов мелкоспоровых возбудителей альтернариоза и 5 изолятов A. sotaní при разных концентрациях азоксистробина (табл. 9 и 10).

Таблица 9.

Прорастаемость конидий разных видов рода Alternaría при разных концентрациях азоксистробина.

Вид Доля проросших конидий при разных концентрациях азоксистробина, %

1 мкг/мл 10 мкг/мл 100 мкг/мл

Мелкоспоровые виды 41/80* 27/66 21/63

A. sotaní 53/58 32/41 21/43

Прим.:* - данные приведены в виде х/у, где: х - процент проросших конидий относительно бесфунгицидного контроля через 5 часов инкубации, у - через 20 часов инкубации в темноте при 25°С.

В таблице 10 представлена доля ветвящихся ростковых гиф среди всех проросших конидий при учёте через 20 часов после нанесения суспензии конидий на среду. В присутствии азоксистробина интенсивность ветвления молодых гиф падала.

В присутствии азоксистробина прорастание конидий не было подавлено полностью, но было замедлено. Доля проросших конидий на среде с фунгицидом, измеренная через 20 часов, была в 2-3 раза выше, чем измеренная через 4 часа. Следует также отметить, что конидия считалась проросшей, если длина ростковых гиф превышала длину самой конидии. Через 20 часов экспозиции наблюдалась значительная доля конидий с меньшими проростками. Возможно, через некоторое время эти конидии тоже можно будет считать проросшими. Учета через 36 часов инкубации провести не удалось, т.к. гифы достигли значительной длины, переплелись между собой и затруднили просмотр.

Таблица 10.

Доля ветвящихся ростковых гиф разных видов рода Alternaría на среде с разными концентрациями азоксистробина

Вид Доля ветвящихся ростковых гиф при разных концентрациях азоксистробина, %

0 мкг/мл 1 мкг/мл 10 мкг/мл 100 мкг/мл

Мелкоспоровые виды 45,3* 5,5 3,2 0,6

A. solani 45 3 0 0

_ -----------------------------а^итлщил^я ристкивых гиф относительно

общего числа проросших конидий через 20 часов инкубации в темноте при 25°С.

Защитные мероприятия могут быть эффективны только в том случае, если концентрация фунгицида в рабочей жидкости в несколько раз превосходит максимальные выявленные показатели устойчивости штаммов. Рекомендованная концентрация фунгицида в рабочей жидкости более чем в 100 раз превосходит максимальный выявленный показатель ЕС50 для флуазинама, дифеноконазола и флудиоксонила и в 2-8 раз - для манкоцеба. Такая концентрация позволит успешно контролировать развитие альтернариоза с помощью этих препаратов. Концентрация хлороталонила в рабочей жидкости примерно равна максимально выявленному ЕС50. В этом случае при использовании фунгицида для обработок во время вегетации устойчивые штаммы могут сохранить жизнеспособность и развиваться на растении даже после контакта с препаратом. Концентрация азоксистробина в рабочей

жидкости в 24-35 раз ниже, чем выявленный показатель ЕС50 наиболее устойчивых изолятов. Это будет препятствовать лечебному действию азоксистробина, но защитная активность может сохраниться за счет фунгистатического действия.

Глава 15. Разработка праймеров, позволяющих дифференцировать разные виды рода Alternaría.

Разделение групп мелко- и крупноспоровых видов имеет высокую практическую значимость, т.к. виды из этих групп имеют разную устойчивость к фунгицидам (Побединская и др., 2011, Kapsa, 2008), вирулентность к сортам растений, разные температурные оптимумы роста (Иванюк и др., 2005).

Обнаруженные различия в секвенированных последовательностях ядерных рибосомных генов (ITS5-ITS4) (см. главу 13) позволили нам подобрать специфичные праймеры для избирательной амплификации участков генома мелкоспоровых Alternaría, A. solani и A. infectoria (табл. 11, рис. 4).

Таблица 11.

Последовательности диагностических ПЦР-праймеров.

Название праймеров Нуклеотидная последовательность

Прямой праймер (1ТБ5) 5' - GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG

Обратный праймер для мелкоспоровых (МК) 5' - GACCTTTGCTGATAGAGAGTG

Обратный для крупноспоровых (8К) 5' -CTTGGGGCTGGAAGAGAGCGC

Обратный праймер для А. ш/есшпа (1пШЬг.) 5' - GACACCCCCCGCTGGGGCACTGC

Прямой праймер для А. ¡п/ес1ог1а (Inf.Fr) 5' - GGTTGGTCCTGAGGGCGGGCGA

18 S rDNA ITS 5,8 S ITS 26 S rDNA

Inf.Pr. Inf.Obr.

Рис. 4. Места посадки праймеров для амплификации A. solani (ITS5-SR), мелкоспоровых видов (ITS 5 - MR) и A. infectoria (Inf.Pr - Inf.Obr).

После амплификации с подобранными парами праймеров A. solani, мелкоспоровым штаммам и A. infectoria соответствовали фрагменты длиной 505, 516 и 123 пн соответственно.

При практическом использовании метода наибольшие трудности вызывает выделение изолятов в чистую культуру. Провести выделение сразу после сбора образцов, как правило, невозможно. В практике часто используют засушивание собранных образцов после сбора, транспортировку в лабораторию, помещение во влажные камеры и последующее выделение изолятов в чистую культуру. Однако при подобном методе выделения высока вероятность контаминации вторичной микобиотой, в т.ч. и мелкоспоровыми видами Alternaría.

В нашей работе была предпринята попытка диагностики видового состава в образцах листьев, фиксированных сразу после сбора в 70% растворе этилового спирта. ДНК выделяли из целой листовой пластинки с несколькими некрозами.

Исследование образцов пораженных альтернариозом листьев картофеля из Московской и Костромской областей, а также из Монголии (всего исследовано 70 образцов) показало присутствие во всех исследованных регионах штаммов А. solani, A. infectoria и мелкоспоровых (табл. 12). Данные, полученные с помощью ПЦР-диагностики законсервированных в спирте образцов, отличались от результатов морфологической диагностики выделенных в чистую культуру штаммов. Во всех трех регионах в чистую культуру выделялись только мелкоспоровые изоляты, лишь в Костромской области был изолирован единственный штамм A. infectoria.

Таблица 12.

Идентификации видов в законсервированных образцах с помощью ПЦР.

Виды Количество образцов, содержащих видоспецифичные участки ДНК

Московская обл Костромская обл Монголия

Только А. эо1ат 15 2 I

Только мелкоспоровые 12 10 2

Только Л. ¡п/еаопа 4 3 1

А.хо1ат ^Алп/ес1опа 2 2 _

А. 5о1ат+ мелкоспоровые 6 I 1

Мелкоспоровые+ А.^есЮпа 2 2 _

Все 3 группы 3 1 _

Всего образцов исследовано 44 21 5

Подобранные праймеры могут быть использованы для специфичной амплификации видов Alternaría и способствовать успешному определению

данных видов в случаях, когда их идентификация по морфологическим признакам вызывает затруднения.

Заключение

Проведенные исследования вывели Россию в ряд стран с наиболее исследованными популяциями P. infestons. На территории России выявлены самые разные типы популяций - от моно- и поликлональных до панмиксных. В большинстве популяций наблюдается высокое генотипическое разнообразие, присутствуют штаммы обоих типов спаривания, различающиеся по устойчивости к фунгицидам, в пораженных образцах часто образуются ооспоры. Высокое генотипическое разнообразие позволяет нам не опасаться завоза из-за рубежа особо опасных клональных линий, поскольку их генотипы будут вовлечены в половой процесс и переработаны на менее опасные комбинации генов. Половой процесс и образование ооспор идут, преимущественно, на участках без интенсивного применения фунгицидов, с плохой агротехникой, высоким разнообразием сортов и со слабым контролем семенного материала. В России такие условия создаются на частных огородах, где выращивается основная часть картофеля. Таким образом, частные огороды играют буферную роль, не позволяя массово развиваться высокоагрессивным и устойчивым к фунгицидам штаммам.

Длительный период исследований показал изменения, произошедшие в популяциях P. infestons. Прежде всего, это касается особенностей развития популяций на разных растениях-хозяевах: картофеле и томате. Если в конце 1980-х годов инициатором заражения томата всегда выступал картофель, то в последние годы стали нередки случаи, когда наоборот, пораженная рассада томата заражала картофель. Эпифитотии стали начинаться раньше, в посадках картофеля увеличилась доля расы Т1, повысилось разнообразие популяций. Самые агрессивные популяции на картофеле состояли исключительно из штаммов расы Т1, причем штаммы были одинаково агрессивны и к картофелю, и к томату. Штаммы, выделенные из томата, перестали отличаться от штаммов из картофеля по вирулентности и агрессивности к обоим растениям-хозяевам.

Изменения эти связаны, вероятно, с появлением в популяциях P. infestons штаммов разных типов спаривания, половым процессом, повышением роли ооспор как источника первичного инокулюма. В целом, по-видимому, произошла конвергенция популяций - возникновение единой популяции на двух растениях-хозяевах с одинаково высокой агрессивностью к обоим видам.

Изучение видового состава возбудителей альтернариоза показало, что и на картофеле, и на томате заболевание чаще вызывается мелкоспоровыми видами. Это указывает на изменения в популяциях возбудителей альтернариоза, т.к. в

37

1960-70-х годах многими авторами было показано преобладание A. solani, а мелкоспоровые виды встречались, преимущественно, как вторичная инфекция. Повышение роли мелкоспоровых видов связано, возможно, с повсеместным применением фунгицида манкоцеб, обладающего значительно более высокой эффективностью против A. solani, а также с массовым возделыванием восприимчивых к альтернариозу сортов.

В ближайшем будущем следует, видимо, ожидать дальнейшего роста агрессивности мелкоспоровых видов по отношению к возделываемым сортам картофеля и томата, появления устойчивых к фунгицидам штаммов. Существенную роль в этом может сыграть завоз штаммов из Европы вместе с партиями семенного и продовольственного картофеля.

Роль полового процесса у возбудителей альтернариоза до сих пор не ясна, поэтому судьба завозных генотипов не очень понятна. По-видимому, они продолжат существовать в виде клональных линий, которые будут претерпевать изменения и приспосабливаться к выращиваемым сортам и используемым фунгицидам благодаря мутациям и парасексуальному процессу.

Исследования популяций возбудителей фитофтороза и альтернариоза необходимо продолжать, т.к. только постоянный мониторинг популяционной структуры может помочь в разработке оптимальных способов борьбы с этими заболеваниями.

Выводы.

1. На территории Европейской части России преобладают популяции Р. infestans с высоким генотипическим разнообразием, в Сибири и на Дальнем Востоке - моно- или биклональные.

2. Широко распространенная в прошлом клональная линия US-1 к середине 90-х годов 20 века полностью исчезла из российских популяций. Последний раз штаммы линии US-1 были выявлены в 1993 году на листьях томата в Московской области.

3. Присутствие в популяциях штаммов с разными типами спаривания и ооспор в пораженных фитофторозом растительных образцах свидетельствует в пользу прохождения полового процесса в популяциях. Отмечаемое практически повсеместно в Европейской части России высокое генотипическое разнообразие популяций может объясняться гибридизацией при половом процессе.

4. Практически все исследованные в работе штаммы имели близкое к максимальному число генов вирулентности к сортам картофеля. В конце 90-х годов 20 века отмечено резкое возрастание агрессивности и вирулентности штаммов, выделенных из томата, что, возможно, обусловлено повышением роли ооспор как источника первичной инфекции томата.

38

5. Исследованные изоляты P. infestans с картофеля и томата из разных регионов России и Беларуси чувствительны к большинству применяемых против них фунгицидов, из которых наиболее эффективны азоксистробин и диметоморф.

6. В Московской, Смоленской, Тульской областях, в Сибири и на Дальнем Востоке выявлены штаммы с высокой устойчивостью к металаксилу. Изоляты со средним уровнем устойчивости были обнаружены в большинстве популяций Европейской части России и Беларуси.

7. Исследование возбудителей альтернариоза показало присутствие в пораженных листьях картофеля и томата видов A. sotaní, A. infectoria и комплекса мелкоспоровых видов. Мелкоспоровые виды, выделяемые по результатам морфологического анализа (A. altérnala, A. tenuissima, А. arborescens), по структуре исследованных участков генома не разделяются.

8. На основании полученных данных по строению участков генома А. solani, A. infectoria и комплекса мелкоспоровых видов были созданы наборы для их диагностики с помощью ПЦР. ПЦР-идентификация показала, что заражение листовых пластинок может быть вызвано разными видами, которые могут присутствовать одновременно в одном простом листе. Морфологических различий в симптомах поражения разными видами не обнаружено.

9. Оценка устойчивости изолятов рода Alternaría, выделенных с картофеля и томата, к фунгицидам, показала, что наиболее эффективны были дифеноконазол и флудиоксонил. Хороший фунгицидный эффект был также отмечен у манкоцеба и флуазинама, причем манкоцеб действовал значительно лучше в отношении A. solani, чем мелкоспоровых видов. Слабой эффективностью отличались азоксистробин и хлороталонил.

10. Мутации G143A, обусловливающей устойчивость мелкоспоровых видов Alternaría к азоксистробину в странах Европы и в США, у российских мелкоспоровых устойчивых изолятов не выявлено.

Список публикаций автора по теме диссертации.

Публикации в журналах из перечня ВАК

1. Смирнов А.Н., Еланский С.Н., Долгова А.В. Ооспоры Phytophthora infestans в плодах томатов в Московской области//Защита и карантин растений. - 1998.-№5,-С. 41.

2. Еланский С.Н., Лекомцева С.Н. Встречаемость спор грибов различных систематических групп в приземном слое атмосферы средних широт России// Микология и фитопатология. - 1998. — Т.32. - В.1. — С. 37-43.

3. Еланский С.Н., Рыжкин Д.В. Концентрация спор грибов в атмосфере Москвы в связи с метеопараметрами // Микология и фитопатология. - 1999. -Т.ЗЗ.-В.З,-С. 188-192.

4. Деревягина М.К., Еланский С.Н., Дьяков Ю.Т. Резистентность Phytophthora infestons к фунгициду диметоморфу// Микология и фитопатология.

- 1999.-Т.ЗЗ.-В.З.-С. 208-213.

5. Еланский С.Н., Долгова А.В., Смирнов А.Н., Дьяков Ю.Т. Популяции Phytophthora infestons в Московской области. 1. Системы размножения. //Микология и фитопатология. - 1999. - Т.ЗЗ. - В.5. - С. 346-352.

6. Еланский С.Н., Багирова С.Ф., Смирнов А.Н., Дьяков Ю.Т. Популяции Phytophthora infestons в Московской области. 2. Сравнение популяций, паразитирующих на картофеле и томатах// Микология и фитопатология. - 1999.

- Т.ЗЗ.-В.5.-С. 353-359.

7. Смирнов А.Н., Еланский С.Н. Образование ооспор в полевых популяциях Phytophthora infestons в Московской области // Микология и фитопатология. - 1999. - Т.ЗЗ. - В.6. - С. 421-425.

8. Смирнов А.Н., Кузнецов С.А., Еланский С.Н. Изучение биологии возбудителя фитофтороза картофеля// Доклады ТСХА. - 2001. - В.273. - 4.1. -С. 226-232.

9. Апрышко В.П., Лихачев А.Н., Еланский С.Н. Биология и культурально-морфологические признаки российских штаммов Stachybotrys chartaruml'/Доклады ТСХА. - 2001. - В. 273. - Ч. 1. - С. 215-221.

10. Еланский С.Н., Петрунина Я.В., Лаврова О.И., Лихачев А.Н. Сравнительный анализ российских штаммов Stachybotrys chartarumll Микробиология. - 2004. - Т.73. - В.1. - С. 73-79.

11. Аматханова Ф.Х., Дьяков Ю.Т., Петрунина Я.В., Побединская М.А., Еланский С.Н., Козловская И.Н., Козловский Б.Е., Морозова Е.В., Смирнов

A.Н. Популяции Phytophthora infestons на Северном Кавказе// Микология и фитопатология. - 2004. - Т.38. - В.З. - С. 71-78.

12. Еланский С.Н., Апрышко В.П., Милютина Д.И., Козловский Б.Е. Устойчивость российских штаммов Phytophthora infestons к фунгицидам металаксил и диметоморф// Вестник московского университета. Серия 16. Биология.-2007.-№1,-С. 14-18.

13. Еланский С.Н., Милютина Д.И. Гетероплазмоз у Phytophthora infestons //Генетика. -2007. - T. 43. -№3. - С. 333-336.

14. С. А. Шеин, Д. И. Милютина, И. Н. Козловская, Е. В. Морозова, М. А. Побединская, С. Н. Еланский. Генотипическое разнообразие Phytophthora infestons в республике Марий Эл// Микология и фитопатология. - 2009. - Т.43. -

B.4.-С. 358-363.

15. Еланский С.Н., Побединская М.А., Романова С.С., Александрова A.B., Пляхневич М.П. Устойчивость возбудителей фитофтороза и альтернариоза картофеля и томата к некоторым фунгицидам // Иммунопатология. Аллергология. Инфектология. - 2010. -№1. - С. 234-235.

16. С.Н. Еланский, М.А. Побединская, Е.Д. Мыца, М.П. Пляхневич Устойчивость возбудителя фитофтороза картофеля и томата к фунгицидам// Микология и фитопатология. - 2012. - Т.46. - В.5. - С. 340-344.

17. М.А. Побединская, П.Н. Плуталов, С.С. Романова, Л.Ю. Кокаева, A.B. Николаев, A.B. Александрова, С.Н. Еланский Устойчивость возбудителей альтернариоза картофеля и томата к фунгицидам// Микология и фитопатология. - 2012. - (в печати.)

18. S. Elansky, A. Smirnov, Y. Dyakov, A. Dolgova, A. Filippov, В. Kozlovsky, I. Kozlovskaya, P. Russo, C. Smart, W. Fry Genotypic analysis of Russian isolates of Phytophthora infestans from the Moscow region, Siberia and Far East//J. Phytopathology. - 2001. - V. 149 (10). - P. 605-611.

Патенты

19. Шевелев C.A., Дутов М.Д., Попков C.B., Еланский С.Н., Кокуркина Г.В., Побединская М.А. Замещенные 2-фенилиндолы, способ их получения и фунгицидные композиции на их основе// Патент РФ № 2440339

Методические указания

20. Г.Г. Онищенко, М.П. Кирпичников, К.Г. Скрябин, В.А. Тутельян, С.Н. Еланский и др. Порядок биологической оценки действия наноматериалов на растения по морфологическим признакам: Методические указания. // М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора. -2012.-39 с.

Соавторство в монографиях

21. Пшеченков К. А., Зейрук В.Н., Еланский С.Н., Мальцев C.B. Технологии хранения картофеля // М.: Картофелевод, 2007. - 192 с.

22. Б. В. Анисимов, Г. Л. Белов, Ю. А. Варицев, С. Н. Еланский, Г. К. Журомский, С. К. Завриев, В. Н. Зейрук, В. Г. Ивашок, М. А. Кузнецова, М. П. Пляхневич, К. А. Пшеченков, Е. А. Симаков, Н. П. Склярова, 3. Сташевски, А. И. Усков, И. М. Яшина. Защита картофеля от болезней, вредителей и сорняков. // М.: Картофелевод, 2009. - 272 с.

23. N.F. Elansky, I.B. Belikov, С.А.М. Brenninkmeijer, P.J. Crutzen, S.N. Elansky, et al. Atmospheric composition observations over Northern Eurasia using the mobile laboratory. TROICA experiments// M.:Agrospas, 2009.- 72p.

Статьи в других периодических изданиях и сборниках

24. Рыжкин Д.В., Еланский С.Н., Желтикова Т.М. Мониторинг концентрации спор грибов Cladosporium и Alternaría в атмосферном воздухе г. Москвы//Атмосфера. Пульманология и аллергология. - 2002. - №2. - С.30-31.

25. Еланский С.Н., Рыжкин Д.В. Распределение основных групп грибных спор в приземном воздухе Москвы. 1999 г.// Летопись погоды, климата и экологии Москвы. М.: Издательство МГУ, 2000. - В.1. - С. 65-67.

26. Еланский С.Н., Рыжкин Д.В. Распределение основных групп грибных спор в приземном воздухе Москвы. 2000 г.//Летопись климата, погоды и экологии Москвы, Вып. 2. М.: Издательство МГУ, 2002. - В.2. - С. 86-89.

27. Лаврова О.И., С.Н. Еланский, Ю.Т. Дьяков Селекция штаммов Phytophtora infestans в бесполых генерациях// Журнал российского фитопатологического общества. - 2003. - Т.4. - С. 1-7.

28. Уланова Т.И., Еланский С.Н., Филиппов А.В., Козловский Б.Е., Дьяков Ю.Т., Апрышко В.П., Смирнов А.Н., Коффей М.Д. Устойчивость к фитофторозу некоторых перспективных линий диких Lycopersicon hirsutumll Журнал Российского фитопатологического общества. - 2003. - Т.4. - С. 9-15.

29. Лаврова О.И., С.Н. Еланский Идентификация SINE-подобных элементов в геноме Phytophthora infestans и оценка возможности их применения для сравнительного анализа штаммов// Журнал Российского фитопатологического общества. - 2004. - Т.4. - С. 39-45.

30. Дьяков Ю.Т., Еланский С.Н. Популяционная генетика Phytophthora infestans. В кн.: Микология сегодня. Т. 1. / Под ред. Дьякова Ю.Т., Сергеева Ю.В. М.: Национальная академия микологии, 2007. - С. 107-139.

31. Кокаева Л.Ю., Кокаева З.Г., Березов Ю.И., Еланскнй С.Н. Молекулярно - генетические подходы к исследованию фитопатогенного оомицета Phytophthora infestans // Защита картофеля. - 2011. - В. 2(3). - С. 2-9.

32. С.Н. Еланский, М.А. Побединская, П.Н. Плуталов, С.С. Романова, Л.Ю. Кокаева, А.В. Александрова. Устойчивость российских штаммов возбудителей альтернариоза картофеля и томата к азоксистробину// Защита картофеля. -2011. - В. 2(3). - С. 14-19.

33. Зейрук В. М., Пшеченков К. А., Еланский С. Н., Давыденкова О. Н., Мальцев С. В. Пути повышения качества свежего столового картофеля и картофелепродуктов в Центральном регионе России. // Картофелеводство. -2007.-Т. 13.-С. 197-205.

34. Симаков Е.А., Анисимов Б.В., Склярова Н.П., Яшина И.М., Еланский С.Н. Сорта картофеля, возделываемые в России. Каталог 2005 г.// М.: Картофелевод, 2005. - 112 с.

35. Симаков Е.А., Анисимов Б.В., Еланский С.Н. Сорта картофеля, возделываемые в России. Каталог 2007 г.// М.: Картофелевод. 2007. - 80 с.

36. Симаков Е.А., Анисимов Б.В., Еланский С.Н. Сорта картофеля, возделываемые в России. Каталог 2008 г.// М.: Картофелевод. 2008. - 88 с.

37. Симаков Е.А., Анисимов Б.В., Склярова Н.П., Яшина И.М., Еланский С.Н. Сорта картофеля, возделываемые в России. Каталог 2009 г.// М.: Агроспас, 2009. - 92 с.

38. С.Н. Еланский, М.А. Побединская П.Н. Плуталов, С.С. Романова, А.В. Николаев, Л.Ю. Кокаева, А.В. Александрова. Устойчивость возбудителей альтернариоза картофеля и томата к азоксистробину // Картофелеводство. -2011. —Т.19.-С. 277-286.

39. Л.Ю. Кокаева, М.А. Побединская, А.В. Николаев, А.В. Александрова, С.Н. Еланский. Видовой состав возбудителей альтернариоза картофеля и томата // Картофелеводство. - 2011. - Т.19. - С. 333-342.

40. Bagirova S.F., An Zsan Li, Dolgova A.V., Elansky S.N., Shaw D.S., Dyakov Y.T. Mutants of Phytophthora infestans resistant to dimethomorph fungicide//.!. Russian Phytopathol. Soc. - 2001. - V.2. - P. 19-25.

41. Elansky S.N. Analysis оf Phytophthora infestans isolates from Siberian, Far Eastern and the Moscow Regions populations / in: Cornell-Eastern Europe-Mexico International Collaborative project in Potato Late Blight Control. Progress report, July 1999.

42. Elansky S.N., Petrunina Ya.V., Likhachev A.N. Growth of Stachybotrys chartarum (Ehrenb.) Hughes strains on natural and artificial substrates //Botanica Lithuanica. - 2003. - V.9(2). - P.171-177.

43. Elansky S. N., Smirnov A. N. Second locus of Peptidase as a marker for genetic investigations of Phytophthora infestans //Botanica Lithuanica. - 2003. -V.9(3). - P. 275-283.

44. S.N. Elansky, Yu.T. Dyakov, D.I. Milyutina, V.P. Apryshko, M.A. Pobedinskaya, A.V. Filippov, B.E. Kozlovsky, M.A. Kuznetsova, A.N. Rogozhin, N.V. Statsyuk Late blight of potato in Russia// Potato production and innovative technologies. Ed. A.J. Havenkort, B.V. Anisimov. The Netherlands: Wageningen Academic Publishers, 2007. - P. 262-273.

45. Zeyruk V.N., Pshechenkov K.A., Elansky S.N., Davydenkova O.N., Maltsev S.V. Influence of potato growth and storage conditions on the quality of fresh table potato and potato products in the central part of Russia// Potato production and innovative technologies. Ed. A.J. Havenkort, B.V. Anisimov. The Netherlands: Wageningen Academic Publishers. - 2007. - P. 130-134.

46. N.V. Statsyuk, M.A. Kuznetsova, I.N. Kozlovskaya, B.E. Kozlovsky, S.N. Elansky, E.V. Morozova, E.V. Valeva, and A.V. Filippov Characteristics of the

43

Phytophthora infestons population in Russia// PPO-Special Report no. 14. - P 247254.

47. Elansky S., Pobedinskaya M., Kokaeva L., Statsyuk N., Alexandrova A. Molecular identification of the species composition of Russian isolâtes of pathogens, causing early blight of potato and tomato// PPO-Special Report no. 15. - P. 151-156.

48. M. Pobedinskaya, S. Elansky, N. Statsyuk, M. Plyakhnevich Fungicide Résistance of Russian Phytophthora infestons strains// PPO-Special Report no. 15. -P. 243-247.

Избранные тезисы и материалы конференций

49. Долгова А.В., Смирнов А.Н., Еланский С.Н., Багирова С.Ф., Малеева Ю.В., Дьяков Ю.Т. Структура и динамика генотипического состава популяций Phytophthora infestons на территории бывшего СССР // Сборник трудов международной конференции «Современные проблемы микологии, альгологии и фитопатологии». М.: Муравей, 1998. - С. 35-37.

50. Смирнов А.Н., Еланский С.Н., Дьяков Ю.Т. Роль ооспорообразования в изменчивости подмосковных популяций Phytophthora infestons // Сборник трудов международной конференции «Современные проблемы микологии, альгологии и фитопатологии». М.: Муравей, 1998. - С. 109-111.

51. Еланский С.Н. Изменения в подмосковной популяции Phytophthora infestons в 1991-1999 годах// Тезисы международной конференции «Микология и криптогамная ботаника в России». С.-Пб., 2000. - С. 118.

52. М.К. Деревягина, С.Ф. Багирова, С.Н. Еланский, Ю.Т. Дьяков Влияние фунгицидов на популяции фитопатогенных грибов // Материалы докладов международной научно-практической конференции "Биологизация защиты растений: состояние и перспективы. Краснодар, 2001. - С. 95-96.

53. Смирнов А.Н., Кравцов А.С., Кузнецов С.А., Апрышко В.П., Еланский С.Н. Встречаемость и возможное происхождение ооспор Phytophthora infestons в Московской обл. в 1999 г. // Материалы научной конференции «Памяти Грегора Менделя». М.: Изд. МСХА, 2001. - С. 122-123.

54. А.Н. Смирнов, С.А. Кузнецов, А.С. Кравцов, В.П. Апрышко, С.Н. Еланский Распространение и возможное происхождение ооспор Phytophthora infestons в Московской области//Материалы научно-практической конференции «Научное обеспечение картофелеводства России: состояние, проблемы». М., ВНИИКХ 2001.-С. 313-324.

55. Еланский С.Н., Смирнов А.Н., Кравцов А.С., Апрышко В.П., Дьяков Ю.Т. Популяции Phytophthora infestons в Московской области // Тезисы докладов первого съезда микологов. М.:, 2002. - С. 179.

56. Смирнов А.Н, Кузнецов С.А., Побединская М.А., Кравцов A.C., Еланский С.Н. Встречаемость, морфологические особенности и возможное происхождение ооспор Phytophlhora infestans в Московской области// Современная микология в России. Тезисы докладов первого съезда микологов. М.: Национальная академия микологии, 2002. — С. 207.

57. Еланский С.Н., Смирнов А.Н., Кравцов A.C., Дьяков Ю.Т., Козловская И.Н., Козловский Б.Е., Морозова Е.В., Аматханова Ф.Х. Популяции Phytophlhora infestans в европейской части России// Первая всероссийская конференция по иммунитету растений к болезням и вредителям. Научные материалы. С-Пб., 2002. - С. 81-82.

58. Апрышко В.П., Петрунина Я.В., Побединская М.А., Еланский С.Н. Ооспоры Phytophthora infestans в природных очагах фитофтороза в Московской области в 2003 году// Сб. материалов юбилейной конференции Микология и альгология 2004. М.: Прометей, 2004. - С. 21-22.

59. Лаврова О.И., Еланский С.Н. Идентификация SlNE-подобных элементов в геноме Phytophlhora infestans и оценка возможности применения INTER-SINE-ПЦР для сравнительного анализа штаммов// Сб. материалов юбилейной конференции Микология и альгология 2004. М.: Прометей, 2004. -С. 85-86.

60. Еланский С.Н., Смирнов А.Н., Кузнецов С.А., Апрышко В.П., Дьяков Ю.Т. Возможные причины изменения структуры популяций Phytophlhora infestans в европейской части России на рубеже 20-21 веков// Материалы международной научной конференции «Биология, систематика и экология грибов в природных экосистемах и агрофитоценозах». Минск, 2004. - С. 96-100.

61. Лаврова О.И., Еланский С.Н. Идентификация SINE-подобных элементов в геноме Phytophlhora infestans и применение INTER-SINE-ПЦР для сравнительного анализа штаммов грибов// Сб. материалов III съезда ВОГиС «Генетика в 21 веке: современное состояние и проблемы развития». М., 2004. -С. 359.

62. Еланский С.Н., Апрышко В.П. Самофертильные штаммы Phytophlhora infestans в природных популяциях// Труды международной конференции «Грибы в природных и антропогенных экосистемах». С.-Пб. 2005. С. 189-189.

63. Еланский С.Н., Апрышко В.П., Милютина Д.И., Козловский Б.Е. Устойчивость российских штаммов Phytophlhora infestans к системным фунгицидам // Материалы международной конференции «Грибы и водоросли в биоценозах - 2006». М.: МАКСпресс, 2006. - С. 56-58.

64. Еланский С.Н., Дьяков Ю.Т., Милютина Д.И., Апрышко В.П., Побединская М.А., Филиппов A.B., Козловский Б.Е., Кузнецова М.А., Рогожин А.Н., Стацюк Н.В. Популяции возбудителя фитофтороза в России//

45

Картофелеводство России. Актуальные проблемы науки и практики. Материалы Международного конгресса «Картофель. Россия. 2007» М., 2007. - С. 211-222.

65. Еланский С.Н., Пляхневич М.П., Романова С.С., Шеин С.А. Александрова А.В., Милютина Д.И. Устойчивость к манкоцебу штаммов Phytophthora infestans и Alternarla sp. из России и Беларуси// Современная микология в России. Том 2. Материалы 2-го съезда микологов России. М.: Национальная академия микологии, 2008. - С. 290-291.

66. Милютина Д.И., Шеин С. А., Апрышко В.П., Еланский С.Н. Популяции Phytophthora infestans в республике Марий Эл// Современная микология в России. Том 2. Материалы 2-го съезда микологов России. М.: Национальная академия микологии, 2008. - С. 193-194.

67. Пляхневич М.П., Еланский С.Н. Генотипический анализ белорусских штаммов возбудителя фитофтороза картофеля// Вторая Всероссийская конференция «Современные проблемы иммунитета растений к вредным организмам» С.-Пб., 2008. - С. 79-83.

68. С.Н. Еланский, М.П. Пляхневич Генотипический анализ штаммов возбудителя фитофтороза картофеля из Беларуси и Марий Эл// Сборник материалов научно-практической конференции «Перспективы инновационного развития картофелеводства». Чебоксары, 2009. - С. 74-76.

69. С.Н. Еланский, М.А. Побединская, Л.Ю. Кокаева, Ю.Т. Дьяков, М.П. Пляхневич Устойчивость Phytophtora infestans, возбудителя фитофтороза картофеля и томата, к некоторым фунгицидам. // Материалы научно-практической конференции «Актуальные проблемы современной индустрии производства картофеля». Чебоксары, 2011. С. 157-162.

70. Кузнецова М.А., Стацюк Н.В., Филиппов А.В., Еланский С.Н. и др. Популяции возбудителя фитофтороза картофеля на европейской территории РФ // Материалы международной конференции «Иммуногенетическая защита сельско-хозяйственных культур от болезней: теория и практика». Московская обл., Большие Вяземы, 2012.-С. 89-100.

71. Smirnov A.N., Kuznetsov S.A., Elansky S.N. Investigations of Phytophthora infestans oospores in Moscow region// The 7-th International Mycological Congress, Book of abstracts. Oslo, 2002. - P.268.

72. Elansky, S., Ryzhkin D. Airborne fungal spores in the atmosphere of Moscow city// The 7th International Congress on Aerobiology. Abstracts. Canada, Montreal, 2002.-P. 169.

73. S.N. Elansky, D.I. Milyutina Mitochondrial haplotypes of Russian Phytophthora infestans strains // XV Congress of European Mycologists. Book of Abstracts. S.-Pb., 2007. - P. 245.

Подписано в печать 26.09.2012 Формат 60x88 1/16. Объем 1.0 п.л. Тираж 120 экз. Заказ № 1243 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119991 г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к. А-102

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Еланский, Сергей Николаевич

Введение

Часть 1.

Глава 1. Обзор литературы

Часть 2.

Глава 2. Материалы и методы

Часть 3. Результаты и их обсуждение

Глава 3. Систематическое положение возбудителя фитофтороза картофеля и томата

Глава 4. Анализ независимых маркерных признаков Р. infestans.

Глава 5. Генотипический анализ популяций

Глава 6. Изучение ооспорообразования в природных популяциях Р. infestans

Глава 7. Устойчивость к фунгицидам

Глава 8. Вирулентность к сортам картофеля и томата

Глава 9. Оценка агрессивности при реципрокных заражениях картофеля и томата в лабораторных условиях.

Глава 10. Развитие Р. infestans на диких Licopersicon hirsutum в Московской области

Глава 11. Возможные механизмы изменчивости популяций Р. infestans

Глава 12. Особенности развития фитофтороза

В России

Глава 13. Видовой состав возбудителей альтернариоза

Глава 14. Устойчивость возбудителей альтернариоза к фунгицидам

Глава 15. Разработка праймеров, позволяющих дифференцировать разные виды рода Alternaría

Введение Диссертация по биологии, на тему "Видовой состав и структура популяций возбудителей фитофтороза и альтернариоза картофеля и томата"

Картофель - одна из наиболее распространенных столовых и технических культур в мире. В России по потреблению на душу населения картофель обгоняет другие культуры, включая зерновые. Кроме прямого потребления в пищу в виде вареных, печеных и жареных клубней, употребляются и продукты его переработки в виде картофельной муки, пюре и чипсов. Картофельная мука, обогащенная витаминами и специфическими биодобавками используется как основа для детского, диетического и лечебного питания, является одним из основных компонентов популярной в наше время безглютеновой диеты; широко применяется она и в производстве кормов для домашних животных. Существуют сорта с повышенным содержанием белка, перспективные для производства кормов для животных; сорта с окрашенной мякотью, из которых получают природные красители, обладающие антиоксидантными свойствами. Одним из основных направлений использования картофеля является его переработка на спирт, используемый, прежде всего, для моторного топлива, и крахмал, также имеющий очень широкую область применения в пищевой, бумажной, фармакологической, нефтегазовой отраслях промышленности. Имеется опыт использования картофеля для получения съедобных вакцин. Картофель может сорбировать из почвы разнообразные вещества, в том числе находящиеся в крайне малых концентрациях. Его используют также для получения некоторых витаминов.

К настоящему времени накоплен большой опыт возделывания картофеля в самых разных агроклиматических зонах. При этом практически повсеместно признается, что наибольшие сложности в работе с картофелем создают патогенные организмы и паразиты, вредящие картофелю как во время вегетации, так и при хранении. Возбудители болезней не только снижают урожай, ухудшают внешний вид, лёжкость и вкус клубней, но и изменяют их биохимический состав, что делает клубни малопригодными для технической переработки. Поэтому при возделывании продовольственного, и, особенно, технического картофеля, вопросы защиты выходят на первый план.

Для российских производителей картофеля эти вопросы стоят особенно остро. Основная часть регионов с интенсивным производством картофеля (так называемый «Картофельный пояс России») находятся в зоне активного развития многих патогенов и паразитов картофеля. Незначительные на первый взгляд ошибки в планировании и проведении защитных мероприятий существенно снижают урожай и сильно портят внешний вид и биохимический состав клубней. Ситуацию усугубляет и то, что идя вслед за требованиями рынка производители переходят к производству зарубежных сортов, созданных для других агроклиматических условий и крайне восприимчивых к расам отечественных патогенов. Поэтому в ряде случаев от правильно проведенной защиты напрямую зависит выживаемость сельхозпредприятий на рынке.

Наша работа посвящена изучению наиболее вредоносных на территории России и Европы возбудителей листовых пятнистостей картофеля: возбудителя фитофтороза картофеля и томата Phytophthora infestans (Mont.) de Вагу и группы видов рода Alternaría — возбудителей альтернариоза картофеля и томата. Эти патогены отличаются высокой вредоносностью, т.к. при определенных погодных условиях способны массово развиваться и вызывать большие потери урожая, а также сильной изменчивостью, что позволяет им быстро преодолевать устойчивость сортов и токсичное действие фунгицидных препаратов. К настоящему времени не создано сортов картофеля и томата, полностью устойчивых к этим патогенам. Поэтому единственным вариантом защиты от них остается правильное использование химических средств защиты растений.

Структура картофелеводства России и развитых зарубежных стран имеет сильные отличия. Так, в условиях России большая часть картофеля производится на дачных огородах; при посадке, как правило, используется семенной материал низкого качества. Отличаются и условия окружающей среды, спектр возделываемых сортов, используются отличные от европейских композиции фунгицидов в коммерческих препаратах. Все это накладывает свой отпечаток на эпидемиологию и другие особенности развития листовых пятнистостей.

Вслед за европейскими сортами и зарубежной техникой на отечественный рынок пришли и зарубежные технологии возделывания, и, что особенно важно, защиты картофеля. Ряд европейских компаний предлагает свои услуги по планированию защитных мероприятий, что называется, не выходя из своего европейского офиса. Рекомендации по проведению обработок, с указанием срока, композиции пестицидов и т.д. составляются только на основании метеорологических параметров и прогнозов людьми, не имеющими опыта практической работы с картофелем в России. Зачастую это приводит к досадным накладкам даже при выращивании продовольственного картофеля. При выращивании технического картофеля, который высоко восприимчив к патогенам, такая схема работы совершенно неприемлема. Системы помощи в принятии решений (СППР) должны быть адаптированы к условиям конкретных регионов выращивания, учитывать особенности российского картофелеводства, семенного материала, возделываемых сортов.

Европейские технологии «заточены» под европейские условия выращивания, под европейских патогенов и паразитов картофеля, под европейские закономерности их развития, сохранения в зимний период, инициации эпифитотий. Да, мы много знаем про европейские популяции возбудителей листовых пятнистостей, про эпидемиологию их болезней. Но в России другие условия. Другие популяции. Другие закономерности. Только зная особенности наших, отечественных патогенов мы сможем защищать наш картофель и томат так же эффективно, как это делается в передовых хозяйствах Европы. Тогда и урожаи в российских сельхозпредприятиях будут не ниже европейских, а рентабельность, несомненно, выше.

В начале 90-х годов исследование популяций P. infestans перешло к изучению генотипического состава на основе ислледования независимых маркерных признаков вместо практиковавшегося ранее изучения генов вирулентности к сортам картофеля (картофельных pac)(Goodwin et al., 1992). Картофельные расы потеряли свое маркерное значение из-за повсеместного распространения штаммов с числом генов вирулентности, близким к максимальному. Изучение независимых маркерных признаков у штаммов из коллекций, собранных в разных странах мира в 1980-х годах, выявило практически повсеместное присутствие штаммов одной клональной линии - US-1 (Goodwin et al., 1994). Единичные исследования были проведены и в России, и также показали присутствие US-1. С середины 80-х годов в популяциях многих стран мира были отмечены глобальные изменения, связанные, прежде всего, с появлением штаммов типа спаривания А2 и с другими генотипами клональных линий. Появились штаммы, устойчивые к широко распространенному и новому на тот период фунгициду металаксил. В то же время генотипических исследований российских популяций не проводилось, они оставались совершенно неизученными объектами. С 1990-го года на кафедре микологии и альгологии по инициативе профессора Ю.Т. Дьякова было начато изучение структуры популяций P. infestans. Первоначально в этой работе участвовали сотрудники и аспиранты каф. Микологии и альгологии Биологического факультета МГУ А.В. Долгова, А.Н. Смирнов, С.Ф. Багирова, сотрудники каф. Молекулярной биологии Ю.В. Малеева, А.А Колесников и студент Д.Г. Наумов. В 1993-1995гг. был организован совместный проект каф. Микологии и альгологии и каф. Молекулярной биологии с Университетом Северного Уэльса. Впоследствии в работе принимали участие сотрудники, студенты и аспиранты нашей кафедры, ВНИИ фитопатологии Россельхозакадемии, МСХА имени К.А. Тимирязева.

С 1991 года был начат систематический сбор пораженных фитофторозом образцов и анализ их маркерных признаков. Автор данной работы подключился к исследованиям с 1995 года, но участвовал в анализе штаммов, выделенных в период с 1991 по 1995 годы. В настоящей работе приведены результаты, полученные лично автором, выполненные под его руководством или в рамках совместной деятельности.

Целью работы было изучение видового состава и структуры популяций возбудителей фитофтороза и альтернариоза картофеля и томата в России.

В качестве основных задач были определены следующие: изучение генотипического состава популяций Р. infestans на основе независимых маркерных признаков: тип спаривания, спектр изоферментов пептидазы, гаплотипы митохондриальной ДНК, структура отдельных участков генома; оценка хозяйственно-важных биологических показателей штаммов Р. infestans: устойчивость к фунгицидам и вирулентность к сортам картофеля и томата; исследование закономерностей образования ооспор Р. infestans в агроценозах на разных растениях-хозяевах; определение видового состава возбудителей альтернариоза картофеля и томата, разработка метода экспресс-идентификации наиболее распространенных видов, изучение устойчивости изолятов Alternaría sp. к фунгицидам.

Заключение Диссертация по теме "Микология", Еланский, Сергей Николаевич

Заключение

Проведенные исследования вывели Россию в ряд стран с наиболее исследованными популяциями Р. infestans. На территории России выявлены самые разные типы популяций - от моно- и поликлональных до панмиксных. В большинстве популяций наблюдается высокое генотипическое разнообразие, присутствуют штаммы обоих типов спаривания, различающиеся по устойчивости к фунгицидам, в пораженных образцах часто образуются ооспоры. Высокое генотипическое разнообразие позволяет нам не опасаться завоза из-за рубежа особо опасных клональных линий, поскольку их генотипы будут вовлечены в половой процесс и переработаны на менее опасные комбинации генов. Половой процесс и образование ооспор идут, преимущественно, на участках без интенсивного применения фунгицидов, с плохой агротехникой, высоким разнообразием сортов и со слабым контролем семенного материала. В России такие условия создаются на частных огородах, где выращивается основная часть картофеля. Таким образом, частные огороды играют буферную роль, не позволяя массово развиваться высокоагрессивным и устойчивым к фунгицидам штаммам.

Длительный период исследований показал изменения, произошедшие в популяциях Р. infestans. Прежде всего, это касается особенностей развития популяций на разных растениях-хозяевах: картофеле и томате. Если в конце 1980-х годов инициатором заражения томата всегда выступал картофель, то в последние годы стали нередки случаи, когда наоборот, пораженная рассада томата заражала картофель. Эпифитотии стали начинаться раньше, в посадках картофеля увеличилась доля расы Т1, повысилось разнообразие популяций. Самые агрессивные популяции на картофеле состояли исключительно из штаммов расы Т1, причем штаммы были одинаково агрессивны и к картофелю, и к томату. Штаммы, выделенные из томата, перестали отличаться от штаммов из картофеля по вирулентности и агрессивности к обоим растениям-хозяевам.

Изменения эти связаны, вероятно, с появлением в популяциях Р. т/е81ат штаммов разных типов спаривания, половым процессом, повышением роли ооспор как источника первичного инокулюма. В целом, по-видимому, произошла конвергенция популяций - возникновение единой популяции на двух растениях-хозяевах с одинаково высокой агрессивностью к обоим видам.

Изучение видового состава возбудителей альтернариоза показало, что и на картофеле, и на томате заболевание чаще вызывается мелкоспоровыми видами. Это указывает на изменения в популяциях возбудителей альтернариоза, т.к. в 1960-70-х годах многими авторами было показано преобладание А. Бо1ат, а мелкоспоровые виды встречались, преимущественно, как вторичная инфекция. Повышение роли мелкоспоровых видов связано, возможно, с повсеместным применением фунгицида манкоцеб, обладающего значительно более высокой эффективностью против А. 8о1ат, а также с массовым возделыванием восприимчивых к альтернариозу сортов.

В ближайшем будущем следует, видимо, ожидать дальнейшего роста агрессивности мелкоспоровых видов по отношению к возделываемым сортам картофеля и томата, появления устойчивых к фунгицидам штаммов. Существенную роль в этом может сыграть завоз штаммов из Европы вместе с партиями семенного и продовольственного картофеля.

Роль полового процесса у возбудителей альтернариоза до сих пор не ясна, поэтому судьба завозных генотипов не очень понятна. По-видимому, они продолжат существовать в виде клональных линий, которые будут претерпевать изменения и приспосабливаться к выращиваемым сортам и используемым фунгицидам благодаря мутациям и парасексуальному процессу.

Исследования популяций возбудителей фитофтороза и альтернариоза необходимо продолжать, т.к. только постоянный мониторинг популяционной структуры может помочь в разработке оптимальных способов борьбы с этими заболеваниями.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Еланский, Сергей Николаевич, Москва

1. Аникина М.И., Савенкова JI.B., Дьяков Ю.Т. Взаимодействия между штаммами Phytophthora infestans (Mont.)deBy. // Микология и фитопатология. 1997. - Т.31. - С. 33-38.

2. Апрышко В.П., Петрунина Я.В., Побединская М.А., Еланский С.Н. Ооспоры Phytophthora infestans в природных очагах фитофтороза в Московской области в 2003 г.// Материалы Юбилейной конференции «Микология и альгология 2004». М.: Прометей, 2004. С. 21-22.

3. Багирова С.Ф., Ан Цзянь Ли, Дьяков Ю.Т. Механизмы генетической изоляции специфических патогенных форм Phytophthora infestans в половых и бесполых популяциях // Микология и фитопатология. 1998. - Т.32. - В4. -С. 47-50.

4. Багирова С.Ф., Дьяков Ю.Т. Роль ооспор в возобновлении первичной инфекции фитофтороза томата // С-Х биология. 1998. - №3. - С.67-71.

5. Балашова H.H. Фитофтороустойчивость рода Lycopersicon Tourn. и методы использования ее в селекции томата // Кишинев: "Штиница". — 1979.

6. Белякова Г.А. Грибы родов Alternaria NEES EX FR., Stemphyllium WALLROTH и Ulocladium PREUS., вызывающие пятнистости хлопчатника // Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Москва, 1990. 20 с.

7. Богуславская Н.В., Филиппов А.В. Распространение возбудителя фитофтороза в почве // Микология и фитопатология. 1976. - Т. 10. - С. 316—317.

8. Борисенок А.Б. Расовый состав Phytophthora infestans в годы, различающиеся метеорологическими условиями // Тр. V Всес. Совещ. по иммунитету растений. Киев, 1969. Т.4.- В.8. - С 83-88.

9. Воробьева Ю.В., Гриднев В.В. Генетика фитофторовых грибов. Сообщ.2. //Генетика. 1983. - Т. 19. - С. 1786-1789.

10. Галлегли М.Е., Нидерхаузер Дж.С. Генетическое регулирование взаимодействий хозяина и паразита при фитофторозе картофеля. // В сб."Проблемы и достижения фитопатологии". М.: Сельхозиздат, 1962. С. 193-211.

11. Ганнибал Ф. Б. Видовой состав, таксономия и номенклатура возбудителей альтернариоза листьев картофеля// Лаборатория микологии и фитопатологии им. А.А. Ячевского ВИЗР. История и современность. Под ред. А.П.Дмитриева. СПб. ВИЗР. 2007. - С. 142-148.

12. Ганнибал Ф. Б. Мелкоспоровые виды рода Alternaría на злаках// Микология и фитопатология. Т.38. - В.З. - 2004. - С.19-28.

13. Ганнибал Ф.Б. Филогенетическая система рода Alternariall Микология сегодня. -Т.2. 2011. (В печати).

14. Глотов Н.В., Животовский А.А., Хованов Н.В., Хромов-Борисов Н.Н. Биометрия: // Учеб. пособие под ред. Тихомировой. Л., 1982. - 264 с.

15. Горбунова Е.В., Багирова С.Ф., Долгова А.В., Дьяков Ю.Т. Вегетативная несовместимость у фитопатогенного гриба Phytophthora infestans //. ДАН СССР. 1989. - Т.104. - С. 1245-1248.

16. Государственный каталог пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории Российской Федерации. М.: 2008.

17. Деревягина М. К. Резистентность Phytophthora infestans (Mont.) de Вагу к фунгицидам и пути ее преодоления // Диссертация на соискание ученой степени к. б. н. МГУ. 1991.

18. Деревягина М.К., Долгова A.B., Дьяков Ю.Т. Мутанты Phytophthora infestans, резистентные к фениламидным фунгицидам // Микология и фитопатология. 1993. - Т.27. - В.З. - С.57-61.

19. Деревягина М.К., Дьяков Ю.Т. Влияние системных и контактных фунгицидов на поражение листьев картофеля фитофторозом // Микология и фитопатология. 1990. - Т. 24. - С. 252-256.

20. Деревягина М.К., Еланский С.Н., Дьяков Ю.Т. Резистентность Phytophthora infestans к фунгициду диметоморфу// Микология и фитопатология. 1999 - Т.ЗЗ. - В.З. - С. 208-213.

21. Долгова A.B., Дьяков Ю.Т. Генетика устойчивости возбудителя фитофтороза картофеля Phytophthora infestans (Mont.) D Ву к фунгициду металаксилу // Генетика. 1986. - Т. 22. - № 10. - С. 2423-2429.

22. Долгова A.B., Смирнов А.Н., Дьяков Ю.Т. Популяции Phytophthora infestans (Mont.) D BY. В России и некоторых странах бывшего СССР // Микология и фитопатология. 1996. - Т. 30. - В.З. - С. 55-60.

23. Дорожкин H.A., Вельская С.И. Болезни картофеля// Минск: Наука и техника. 1979. - 248 с.

24. Дьяков Ю. Т., Долгова А. В., Рыбакова И. Н., Багирова С. Ф. Дивергенция популяций фитопатогенного гриба Phytophthora infestans (Mont.) de Вагу в связи со специализацией к растениям-хозяевам // Журнал общей биологии. 1994. - Т. 55. - С. 179-188.

25. Дьяков Ю.Т. Популяционная биология фитопатогенных грибов // М.: Изд. Дом «Муравей». 1998. - 381 с.

26. Дьяков Ю.Т., Ащайе А., Вайнштейн В.М. О статусе "томатных" рас Phytophthora infestans //Микология и фитопатология. 1975.-Т.9. - В.4. - С. 277-282.

27. Дьяков Ю.Т., Еланский С.Н. Популяционная генетика Phytophthora infestans IIВ кн.: Микология сегодня. Т. 1. Под ред. Дьякова Ю.Т., Сергеева Ю.В. М.: Национальная академия микологии, 2007. С. 107-139.

28. Дьяков Ю.Т., Кузовникова Т.А. Гетерокариоз у Phytophthora infestans. II. Генетические исследования // Микология и фитопатология. 1974. - Т.8. -В.2. - С. 81-89.

29. Дьяков Ю.Т., Лекомцева С.Н. О симпатрическом видообразовании у грибов // Биол. науки. 1984. - № 11. - С. 5-16.

30. Дьяков Ю.Т., Супрун Л.М. Вероятностный метод расчета частот генов вирулентности и его применение для анализа популяций возбудителя фитофтороза картофеля Phytophthora infestans // Сельскохозяйственная биология. 1984. - №3. - С. 111-118.

31. Дьяков Ю.Т., Озерецковская О.Л., Джавахия В.Г., Багирова С.Ф. Общая и молекулярная фитопатология // М.: Общество фитопатологов, 2001. -301с.

32. Дьяков Ю.Т., Шнырева А.В. Сергеев Ю.В. Введение в генетику грибов: учеб. пособие для студ. ВУЗов // М.: Изд. центр «Академия», 2005. — 304 с.

33. Еланский С. Н. Популяции Phytophthora infestans на территории России // Диссертация на соискание ученой степени к.б.н. МГУ, Москва, 1998. -110с.

34. Еланский С.Н., Петрунина Я.В., Лаврова О.И., Лихачев А.Н. Сравнительный анализ российских штаммов Stachybotrys chartarum II Микробиология. 2004. - T.73- В. 1. - С. 73-79.

35. Жимулев И.Ф. Общая и молекулярная генетика: Учеб.пособие.// 2-е изд., исп. и доп. Новосибирск: Сиб. унив. изд-во, 2003. - 479 с.

36. Иванюк В.Г., Банадысев С.А., Журомский Г.К. Защита картофеля от болезней, вредителей и сорняков. Минск: Белпринт, 2005. 696 с.

37. Иванюк В.Г., Журомский Г.К., Авдей О.В. Микроэволюция Phytophthora infestans в условиях Белоруссии // Микология и фитопатология. 2002. - Т.36. - В.6. - С. 81-90.

38. Иванюк В.Г., Журомский Г.К., Авдей О.В. Структура популяции Phytophthora infestans возбудителя фитофтороза картофеля в Беларуси // Известия НАН Беларуси. Серия аграрных наук. - 2002. - №4. - С.29-34.

39. Квитко К.В. Относительная роль мутаций и отбора в микробных популяциях // Успехи совр. генетики. 1974. - Т.5. - С.101-113.

40. Козловский Б. Е., Филиппов А. В. Альтернариоз картофеля // Защита и карантин растений. 2007. -№5. - С. 27-29.

41. Кулиш В.Б., Дьяков Ю.Т., Ерохина С.А. Гетерокариоз у Phytophthora infestans. 3. Фитопатологические исследования // Микология и фитопатология. 1978. - Т. 12. - №5. С.406-409.

42. Кулиш В.Б., Дьяков Ю.Т. Выделение диплоидных штаммов из смешанных культур двух физиологических рас Phytophthora infestans // ДАН. 1979. - Т. 244. -№3. - С. 435-438.

43. Лаврова О. И. Короткие ретропозоны в геноме Phytophthora infestans (Mont.) De Вагу и их использование для изучения меж- и внутриштаммовой изменчивости. // Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Москва, 2004. 112 с.

44. Лаврова О.И., С.Н. Еланский Идентификация SINE-подобных элементов в геноме Phytophthora infestans и оценка возможности их применения для сравнительного анализа штаммов // Журнал Российского фитопатологического общества. 2003 - Т.4. - С. 39-45.

45. Левкина Л.М. Род Alternaría Nees.// Новое в систематике и номенклатуре грибов. М.: Национальная академия микологии. 2003. -С.276-304.

46. Маглакелидзе А.И. Изучение особенностей развития фитофтороза томата и обоснование мер борьбы с ним в Западной Грузии. // Автореферат кандидатской диссертации, 1971. 24с.

47. Майр Э. Популяции, виды и эволюция.// М.: «Мир», 1974. 457 с.

48. Малеева Ю.В. Вариабельность митохондриального генома Phytophthora infestans (Mont) de Вагу и структурная перестройка современных популяций гриба на территории России.// Автореф. дис. на соискание ученой степени к.б.н. М.: МГУ. - 1996. - 16 с.

49. Методические указания по селекции сортов и гибридов томата для открытого и защищенного грунта. Москва, 1986. — 32 с.

50. Мюллер Э., Леффлер В. Микология // М.: Мир, 1995. 345 с.

51. Орина А.С., Ганнибал Ф.Б. Внутривидовой полиморфизм фитопатогенного гриба Alternaría solani по морфологическим и молекулярным маркерам// Иммунопатология, аллергология, инфектология. -2010.-№ 1.-С.10-11.

52. Орина А. С., Ганнибал Ф. Б., Левитин М. М. Видовое разнообразие, биологические особенности и география грибов рода Alternaría, ассоциированных с растениями семейства Solanaceaea II Микология и фитопатология. 2010. - Т. 44. - В. 2. - С. 150-159.

53. Пляхневич М.П., Еланский С.Н. Генотипический анализ белорусских штаммов возбудителя фитофтороза картофеля// Вторая Всероссийская конференция «Современные проблемы иммунитета растений к вредным организмам» С.-Пб., 29 сентября 2 октября 2008 г. - С. 79-83

54. Поединок Н.Л., Дьяков Ю.Т. Обнаружение вегетативной несовместимости у фитопатогенного гриба Phytophthora infestans // Микология и фитопатология. 1981. - Т. 15. - №4. - С. 275-279.

55. Поединок Н.Л., Долгова А.В., Дьяков Ю.Т. Парасексуальный процесс фитопатогенного гриба Phytophthora infestans // Генетика. 1982. - Т. 18. -С. 1423-1428.

56. Пшедецкая Л.И., Козубова И.А. Изучение сезонной динамики расового состава гриба Phytophthora infestans на различных сортах картофеля // Труды Всес. Совещ. по иммунитету растений. Киев, 1964. Т.4. - В.8. - С. 38-41.

57. Рыбакова И. Н., Дьяков Ю. Т. Циклические изменения генотипического состава популяций фитопатогенных грибов на примере возбудителя фитофтороза картофеля//Журн. общ. биол. 1990. -Т.51. С. 651-660.

58. Рыбакова И.Н. Изменение агрессивности и вирулентности в популяциях Phytophthora infestans (Mont.)de By возбудителя фитофтороза картофеля и томата // Автореферат канд. дисс. М, 1988. - 23 с.

59. Рыбакова И.Н., Супрун Л.М., Дьяков Ю.Т. Динамика генотипов в популяциях фитопатогенного гриба Phytophthora infestans (Mont.)de Вагу I I Докл. АН СССР. 1987. - Т.294. - С. 696-698.

60. Смирнов А.Н. Популяционная структура фитопатогенного гриба Phytophthora infestans в Московской области в 1991-1996 гг. //Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. МГУ, Москва, 1996.

61. Смирнов А.Н. Популяционная структура фитопатогенного гриба Phytophthora infestans в Московской области в 1991-1996 гг. // Автореферат канд. дисс. М., 1996. 24 с.

62. Смирнов А.Н., Еланский С.Н. Образование ооспор в полевых популяциях Phytophthora infestans в Московской области // Микология и фитопатология. 1999. Т.ЗЗ. -В.6. - С. 421-425.

63. Смирнов А.Н., Еланский С.Н., Долгова A.B. Ооспоры Phytophthora infestans в плодах томата в Московской области // Защита и карантин растений. 1998. -№5. - С. 41.

64. Смирнов А. Н., Кузнецов С. А. Встречаемость и морфология ооспор, обнаруженных в природных популяциях Phytophthora infestans в Московской области в 1999 году // Известия ТСХА. 2001. - Вып 4. - С. 116-133.

65. Трус С. М., Козловский Б. Е. Влияние температуры на характер прорастания спорангиев изолятов Phytophthora infestans (Mont) d By., различающихся по чувствительности к металаксилу // Микология и фитопатология. 1994. - Т. 28. - В.2. - С. 54-58.

66. Уланова Т. И., М. А. Кузнецова, А. Н. Рогожин, Т. И. Сметанина, А. В. Филиппов. Значение ооспор для перезимовки и ежегодного возобновления развития возбудителя фитофтороза на томате и картофеле // Защита картофеля. 2010. - № 1. - С. 16-21.

67. Abu-El Samen F.M., Secor G.A., Gudmestad N.C. Genetic variation among asexual progeny of Phytophthora infestans detected with RAPD and AFLP markers // Plant Pathology. 2003. - V.52. - P. 314-325.

68. Adachi Y., Watanabe H., Tanabe K., Doke N., Nishimura S., Tsuge T. Nuclear ribosomal DNA as a probe for genetic variability in the Japanese pear pathotype of Alternaria alternatall Applied and Enviromental Microbiology. -1993. V.59. — P. 3197-3205

69. Andrivon D. Biology, ecology, and epidemiology of the potato late blight pathogen Phytophthora infestans in soil // Phytopathology. 1995. - V.85. - P. 1053-1056.

70. Bagirova S.F., An Zsan Li, Dolgova A.V., Elansky S.N., Shaw D.S., Dyakov Y.T. Mutants of Phytophthora infestans resistant to dimethomorph fiingicide//J. Russian Phytopathol. Soc. 2001. - V.2. - P. 19-25.

71. Bartlett D.W., Clough J.M., Godwin J.R., Hall A.A., Hamer M., Parr-Dobrzanski B. The strobilurin fungicides // Pest Manag. Sci. 2002. - V.58. P. 649-642.

72. Basnayake S., Maclean D., Whisson S., Drenth A. Identification and occurrence of the LTR-Copia-like retrotranspason, PSCR and other Copia-like elements in the genome of Phytophthora sojae II Curr Genet. 2009. - V.55. - P. 521-536.

73. Black W. A. & Gallegly M. E. Screening of Solanum species for resistance to physiological races of Phytophthora infestans II Amer. Pot. J. — 1957. V.34. -№5.-P. 273-281.

74. Black W. A. Late blight resistance work in Scotland // Amer. Pot. J. 1954., -V.31.- №2.-P. 93-100.

75. Black W. A., Mastenbroek C., Mills W. R., Peterson L. C. A proposal for an international nomenclature of races of Phytophthora infestans and of genes controlling immunity in Solanum demissum derivatives // Euphytica. 1953 -V.2.-P. 173-179.

76. Brasier C.M., Cooke D.E.L., Duncan J.M. Origin of a new Phytophthora pathogen through interspecific hybridization // Proc. Natl. Acad Sci. USA. -1999. V.96. - P. 5878-5883.

77. Brack R. I., Fry W. E & Apple A.E. Effect of metalaxyl an acylalanine fungicide on developmental stages of Phytophthora infestans II Phytopathology. -1980. V.70.-P. 597-601.

78. Carlisle D.J., Cooke L.R., Brown A.E. Phenotypic and genotypic characterization of Northern Ireland isolates of Phytophthora infestans II Europ. J. of Plant Pathology. 2001. - V.107. - №3. - P. 291-303.

79. Carson M.L. Relationship between parasitic and saprophytic fitness in Cochliobolus heterostrophus, cause leaf blight of maize // In "Durability of Disease Resistance". The Netherlands: Kluver Acad. Publ., 1993. 285 p.

80. Carter D.A. PhD Thesis, University of Wales. 1990.

81. Carter D.A., Buck K.W., Archer S.A., Van der Lee T., Shattock R.C., Shaw D.S. The detection of nonhybrid, trisomic, and triploid offspring in sexual progeny of mating of Phytophthora infestans II Fungal Genet, and Biol. 1999. -V.26.-P. 198-208.

82. Cherepennikova-Anikina M.I., Savenkova L.V., Dolgova A.V., Shaw D.S., Dyakov Yu.T. Vegetative incompatibility of Phytophthora infestans // J. Russ. Phytopathol. Soc. 2002. - V.3. - P. 19-32.

83. Cohen Y., Baider A., Cohen B. Dimethomorph activity against oomycete fungal plant pathogens // Phytopathology. 1995. - V.85. - № 12.

84. Cohen Y., Farkash S., Reshit Z., Baider A. Oospore production of Phytophthora infestans in potato and tomato leaves // Phytopathology. 1997. -V.87.-P. 191-196.

85. Cohen Y., Reuveni M., Eyal H. T. The systemic antifungal activity of ridomil against Phytophthora infestans on tomato plants // Phytopathology. -1979.-V.69.-P. 645-649.

86. Cooke D.E.L., Forster J.W., Jenkins P.D., Jones D.G. & Lewis D.M. Analysis of intraspecific and interspecific variation in the genus Alternaría by the use of RAPD-PCR// Annals Applied Biology. 1998. - V.132. - P. 197-209.

87. Cooke D. E. L., A. Drenth, J. M. Duncan, G. Wagels, and C. M. Brasier A Molecular Phylogeny of Phytophthora and Related Oomycetes// Fungal Genetics and Biology. 2000. - V.30. - P. 17-32.

88. Cooke D.E.L., Lees A.K. Markers, old and new, for examining Phytophthora infestans diversity // Plant pathology. 2004. - №53. - P. 692-704.

89. Davidse L. C. Resistance to acylalanines in Phytophthora infestans in the Netherlands // Bulletin OEPP/EPPO Bulletin. 1985. - V.15. - P. 403-409.

90. Davidse L. C., Danial D. L. & Van Westen C. J. Resistance to metalaxyl in Phytophthora infestans in The Netherlands // Netherlands Journal of Plant Pathology. 1983. - V.89. - P. 1-20.

91. Davidse L. C., Van den Berg-Velthuis, Mantel B. C. & Jespers A. B. K. Phenylamides and Phytophthora II in Phytophthora, chapter 23 . J. A. Lucas, R. C. Shattock, D. S. Shaw, L. C. Cooke, eds, Cambridge: Camridge Univ. Press, 1991.-P. 234-241.

92. Day J. P., Shattock R. C. Pathogenicity and fitness of 'old' and 'new' isolates of Phytohthora infestans II In: Phytophthora infestans -150. Eds L. J. Dowley et al. Dublin: Bool Press Ltd., 1995. P. 361-362.

93. Deahl K.L., De Muth S.P., Fry W.E. Genetic and phenotypic diversity in population of Phytophthora infestans in the United States of America // In: Phytophthora infestans -150. Eds L. J. Dowley et al. Dublin: Bool Press Ltd., 1995.

94. Dolgova A.V., Dyakov Yu. T., Smirnov A. Distribution of mating types and vegetative compatibility groups in populations of Phytophthora infestans from Russia, Belorussia and Estonia // Phytophthora newsletter. 1992. - № 18. - P. 4-5.

95. Dorrance A.E., Inglis D.A., Derie M.L., Brown C.R., Goodwin S.B., Fry W.E. Characterization of Phytophthora infestans populations in Western Washington // Phytopathology. 1999. - V.89. - P. 423-428.

96. Dowley L. J. & O' Sullivan E. Metalaxyl-resistant strains of Phytophthora infestans (Mont.) de Baiy in Ireland // Potato Research, 1981. V.24. - P. 417421.

97. Dowley L. J., O'Sullivan E. Sporulation of Phytophthora infestans (Mont.) de Bary on the surface of diseasedpotatoes and tuber to tuber spread during handling // Potato Research. 1991. - V.34. - P. 295-296.

98. Drenth A., Janssen E.M., Govers F. Formation and survival of oospores of Phytophthora infestans under natural conditions // Plant Pathol. 1995. - V.44. -P. 86-94.

99. Drenth A., Jansson E.M., Govers F. Formation and survival of oospores of Phytophthora infestans under natural conditions // Plant Pathology. 1995. -V.44.-P. 86-94.

100. Dyakov Yu.T., Derevjahina M.K. Late blight of potato and its control in Russia // Pesticide Outlook. 2000. - V.l 1. - P. 230-232.

101. Elansky S. N., Smirnov A. N. Second locus of Peptidase as a marker for genetic investigations of Phytophthora infestans II Botanica Lithuanica. 2003. -V.9(3). - P. 275-283.

102. Erwin, D. C., and Ribeiro, O. K. Phytophthora Diseases Worldwide.// APS Press, Am. Phytopathol. Soc., St. Paul. 1996.

103. Feschotte C., Jiang N. and Wessler S. R. Plant transposable elements: where genetics meets genomics // Nat. Rev. Genet. 2002. - V.3. - №5. - P 329-341.

104. Flier W.G., Kessel G.J.T., Schepers H.T.A.M. The impact of oospores of Phytophthora infestans on late blight epidemics // Plant dreeding and seed science. 2004. - V. 50. - P. 5-13.

105. Folkerstsma R. T., Shattock R. C. & Shaw D. S. Genotypes of Phytophthora infestans from Gwynedd, Wales, 1978, 1982, 1987 // Phytoph. newsl. V.18. -1992.

106. Forbes G.A., Oyarzun P.J., Pozo A., Ordonez M.E. Host specificity of late blight pathogen on potato and tomato in Ecuador.// Program Report 1995-1996. Internat. Potato Center. 1997. - P. 138-143.

107. Fry W. E., Bruck R. I. & Mundt C. C. Retardation of potato late blight epidemics by fungicides with eradicant and protection properties // Plant Disease Reporter. 1979. - V. 63. P. 970-974.

108. Fry W.E., Goodwin S.B. Recent migrations of Phytophthora infestans // Phytophthora infestans -150. Eds L. J. Dowley et al. Ireland, Dublin, Bool Press Ltd, 1995.-P. 89—95.

109. Fry W.E., Goodwin S.B. Recent migrations of Phytophthora infestans // Phytophthora infestans -150. Eds L. J. Dowley et al. Ireland, Dublin, Bool Press Ltd, 1995.-P. 89—95.

110. Fry W.E., Goodwin S.P., Matuszak J.M., Spielman L.J., Milgroom M.G. Population genetics and interconinental migrations of Phytopthora infestans // Ann. Rev. Phytopathol. 1992. - V.30. - P. 107-129.

111. Galindo J. & Gallegly M. E., The nature of sexuality in Phytophthora infestans II Phytopathology. 1960. - V. 50. - P. 123-128.

112. Gallegly M. E. & Marvell M. E. Inheritance of resistance to tomato race TO of Phytophthora infestans II Phytopathology. 1955. - V. 45. - P. 103-109.

113. Gallegly M.E. Physiological races of tomato late blight fungus // Phytopathology. 1952. - V.42. - P. 461-462.

114. Gisi U, Cohen Y. Resistance to phenilamide fungicides: a case study with Phytophthora infestans involving mating type and race structure // Annu. Rev. Phytopathol. 1996. - V.34. - P. 549-572.

115. Glulow S. A., Stewart H. E. & Wastie R. L. Effect of tuberplane bacteria on susceptibility of potato tubers to late blight // Phytophthora. infestans -150. Eds L. J. Dowley et al. Ireland, Dublin, Bool Press Ltd, 1995. P.325 - 332.

116. Goodwin S. B. DNA polymorphism in Phytophthora infestans: the Cornell experience // in: Phytophthora. J. A. Lucas, R. C. Shattock, D. S. Shaw, L. C. Cooke, eds. Cambridge: Camridge Univ. Press, 1990. P. 234-241.

117. Goodwin S. В., Cohen B. A. & Fry W. E. Panglobal distribution of a single clonal lineage of the Irish potato famine fungus // Proc. Natl. Acad. Sci. United States.-1994.- V.91.-P. 11591-11595.

118. Goodwin S. В., Sujkovski L. C., Dyer А. Т., Fry B. A. & Fry В. E. Direct detection of gene flow and probable sexual reproduction of Phytophthora infestans in northern North America // Phytopathology. 1995. - V.85. - P. 473479.

119. Goodwin S. В., Sujkovski L. C., Fry В. E. Rapid evoluation of pathogenicity within clonal lineages of the potato late blight disease fungus // Phytopathology. -1995.-V.85.-P. 669-676.

120. Goodwin S.B. The population genetics of Phytophthora II Phytopathology. -1997. V.87. - №4. - P. 462-473.

121. Goodwin S.B., Cohen B.A., Fry W.E. Panglobal distributin of single clonal lineage of the Irish potato famine fungus // Proc. Natl. Acad Sci. USA. 1994. -V.91.-P. 11591-11595.

122. Goodwin S.B., Fry W.E. Genetic analysis of of interspecific hybrids between Phytophthora infestans and Phytopthora mirabilis // Exp. Mycol. 1994. - V.18. -P. 20-32.

123. Goodwin S.B., Drenth A., Fry W.E. Cloning and genetic analysis of two highly polymorphic, moderately repetitive nuclear DNAs from Phytophthora infestans II Current Genetics. 1992. - V.22(2). - P. 107-115.

124. Goodwin S.B., Sujkowski L.S., Fry W.E. Rapid evolution of pathogenicity within clonal lineage of the potato late blight disease fungus // Phytopathology. -1995.-V.85.-P. 669-676.

125. Grasso V., Palermo S., Sierotzki H., Garibaldi A., Gisi U. Cytochrome b gene structure and consequences for resistance to Qo inhibitor fungicides in plant pathogens // Pest Management Science. 2006. - № 62. - P.465-472.

126. Griffith G.W., Shaw D.S. Polymorfism in Phytophthora infestans: four mitochondrial haplotypes are detected after PCR amplification of DNA from pure culture or from host lesion // Applied and Env. Microbiol. 1998. - V.64. - № 10.-P. 4007-4014.

127. Grinberger M., Kadish D.,Cohen Y. Infectivity of metalaxyl-sensitive and resistant isolates of Phytophthora infestans to whole potato tubers as affected by tuber ageing and storage // Phytoparasitica. 1995. - V.23. P. 165-175.

128. Gudmestad N., Pasche J. Role of Fenamidone in the Management of Potato Early Blight // PPO-Special Report. 2007. - №12. - P. 175-182.

129. Haas B. J., Kamoun S., Zody M. C. Genome sequence and analysis of the Irish potato famine pathogen Phytophthora infestans II Nature. 2009. - V.461. — P. 393-398.

130. Hadders J. Alternaría control in the USA and Egypt// PPO-Special Report no. 10.-2004.-P. 119-123.

131. Hadders J. Alternaría: a review of potato fields around the world// PPO-Special Report no. 11. 2006. - P. 57-68

132. Hanson K., Shattock R.C. Formation of oospores of Phytophthora infestans in cultivars with different levels of race-nonspecific resistance I I Plant Pathology. -1998.-V.47.-P. 123-129.

133. Harrison B. J. The genetics of Phytophthora infestans II Ph. D. thesis, Univ. of North Wales, Bangor, 1991.

134. Hausladen H. Potato early blight (Alternaria ssp.) in Germany// PPO-Special Report no. 11.-2006.-P.313-318.

135. Hausladen H., Bassler E., Asensio N. Early blight of potato // PPO-Special Report. 10.-2004.-P. 173-177.

136. Hermansen A., B. Nordskog & M.B. Brurberg Studies on formation and survival of oospores of Phytophthora infestans in Norway // PPO-Special Report no. 8.-2002.-P. 77-80.

137. Hirst J.M., Stedman OJ. The epidemiology of Phytophthora infestans. II. The source of inoculum // Ann. App. Biol. 1960. - V.48. - P. 489-517.

138. James C. A manual of assessment keys for plant diseases // Can. Dept. Agric.- 1971. Publication No. 1458.

139. Jiang R. H., Dawe A. L., Weide R., van Staveren M., Peters S., Nuss D. L., Govers F. Elisitin genes in Phytophthora infestans are clustered and interpresed with various transpason-like elements // Mol Genet Genomics. 2005. - V. 273. -№ 1. — P. 20-32.

140. Jmour W. and Hamada W. First report of A2 mating type of Phytophthora infestans in Tunisia using molecular markers and some observations on itsmetalaxyl resistance // Tunisian Journal of Plant Protection. 2006. - V.l. - P. 85-91.

141. Judelson H.S., L.J. Spielman, and R.C. Shattock. Genetic mapping and non-Mendelian segregation of mating-tpye loci in the oomycete, Phytophthora infestans//Genetics. 1995. - V.141. -P. 503-512.

142. Judelson H.S., Ge Yang. Recombination pathways in Phytophthora infestans: polyploidy resulting from aberrant sexual development and zoosporemediated heterokaryosis // Mycol. Res. 1998. - V.102. - P. 1245-1253.

143. Judelson H.S., Roberts, S. Multiple loci determining insensitivity to phenilamide fungicides in Phytophthora infestans II Phytopathology. 1999. -V.89. -№ 9. - P. 754-760.

144. Kadish D. & Cohen Y. Competition between metalaxyl-sensitive and metalaxyl-resistant isolates of Phytophthora infestans in the absence of metalaxyl // Plant Path. 1988. - V.37 - P. 558-564.

145. Kadish D., Cohen Y. Overseasoning of metalaxyl-sensitive and metalaxyl-resistant isolates of Phytophthora infestans in potato tubers // Phytopathology. -1992.-V.82.-P. 887-889.

146. Kapsa J. Effectiveness of some fungicides in control of Alternaría alternata and Alternaría solani II PPO-Special Report no. 13. 2009. - P. 127-134.

147. Kapsa J., Osowski J. Occurrence of early blight {Alternaría ssp.) at potato crops and results of its chemical control in Polish experiments// PPO-Special Report no. 10.-2004.-P. 101-107.

148. Kato M., Mizubuti E.S., Goodwin S.B., Fry W.E. Sensitvity to protectant fungicides and pathogenic fitness of clonal lineage of Phytophthora infestans in the United States // Phytopathology. 1997. - 87. - P. 973-978.

149. Kato M., Sato N., Takahashi K., Shimaniki T. Yearly change of frequency and geographic diatribution of A2 mating type isolates of Phytophthora infestans in Japan from 1987 to 1993 I I Ann. Phytopathol. Soc. Japan. 1999. - V.64. - P. 168-174.

150. Kelly C., R.A. Bain and J-L. The significance of seed tuber-borne blight in two growing seasons // PPO-Special Report no. 10. 2004. - P. 101-107.

151. Kessel G.J.T., L.J. Turkensteen, H.T.A.M Schepers, P.J. van Bekkum and W.G. Flier P. infestans oospores in the Netherlands: occurrence and effects of cultivars and fungicides II PPO-Special Report no. 8. 2002. - P. 203-210.

152. Kim K.J., Lee Y.S. Genetic DNA Marker for A2 mating type in Phytophthora infestans //The Journal of Microbiology. 2002. - V. 40. - №. 4. -P. 254-259.

153. Klimczak L.J., Prell H.H. Isolation and characterization of mitochondrial DNK of the oomycetous fungus Phytophthora infestans II Current Genetics. -1984. V.8. - P. 323-326.

154. Knapova G., Gisi U. Phenotypic and genotypic structure of Phytophthora infestans population on potato and tomato in France and Switzerland // Plant Pathol. -2002. -V.51. P. 641-553.

155. Knapova G., Schlenzig A., Gisi U. Crosses between isolates of Phytophthora infestans from potato and tomato and characterization of F1 and F2 progeny for phenotypic and molecular markers I I Plant Pathol. 2002. - V.51. -P. 698-709.

156. Knapova, G, Tenzer, I., Gessler, G., Gisi, U. Characterization of Phytophthora infestans from potato and tomato with moleculare markers // Proceedings of the 5th congress of the European Foundation for Plant Pathology. Taormina, Italy. 2001. - P. 6-9.

157. Ko W. H. Hormonal regulation of sexual reproduction in Phytophthora II J. Gen. Microb. 1980. - V. 116. - P. 459^163.

158. Ko W. H. Reversible change of mating type in Phytophthora infestans II J. Gen. Microbiol. 1981. - V.125. -P. 451-454.

159. Ko W.H. An alternative possible origin of the A2 mating type of Phytophthora infestans outside Mexico // Phytopathology. 1994. - V. 84. P. 1224-1227.

160. Ko W.H. Heterothallic Phytophthora. Evidence for hormonal regulation of sexual reproduction // J. Gener. Microbiol. 1978. - V.107. - P. 15-18.

161. Koh Y. J., Goodwin S. B., Dyer A. T., Cohen B. A., Ogoshi A., Sato N. & Fry W. E. Migration and displacements of Phytophthora infestans populations in East Asian countries // Phytopathology. 1994. - V. 84. - P. 922-927.

162. Kusaba M., and Tsuge T. Phylogeny oí Alternaría fungi known to produce host-specific toxins on the basis of variation in internal transcribed spacers of ribosomal DNA// Current Genetics. 1995. - V.28. - P. 491-498

163. Malcolmson J. F. & Black W. New R-genes in Solarium demissum Lindl. and their complementary races of Phytophthora infestans (Mont.) de Bary // Euphytica. 1966. - V. 15.-№2.-P. 199-203.

164. Malcolmson J. F. Vegetative hybridity in Phytophthora infestans II Nature. -1970.-V. 225.-P. 971-972.

165. Mazakova J., Taborsky V., Zouhar M., Rysanek P., Hausvater E., Dolezal P. Occurrence and distribution of mating types A1 and A2 of Phytophthora infestans (Mont.) de Bary in the Czech Republic. // Plant Protect. Sci. 2006. -V.42. - P. 41-48.

166. Mueller U.G., Wolfenbarger L.L. AFLP genotyping and fingerprinting // TREE. 1999. - V.14. - №10. - P. 389-394.

167. Oliva R.F., Erselius L.J., Adler N.E., Forbes G.A. Potential of sexual reproduction among host-adapted populations of Phytophthora infestans sensu lato in Ecuador // Plant Pathol. 2002. - V.51. - P. 710-719.

168. Oyarzun P.J., Pozo A., Ordonez M.E., Doucett K., Forbes G.A. Host specificity of Phytophthora infestans on tomato and potato in Ecuador // Phytopathology. 1998. - V.88. - P. 265-271.

169. Pasche, J. S., Wharam, C. M., Gudmestad, N. C. Shift in sensitivity of Alternaria solani in response to Qol fungicides // Plant Disease. 2004. - V.88. -P. 181-187.

170. Pasche J. S., Piche L. M., Gudmestad N. C. Effect of the F129L Mutation in Alternaría solani on fungicides affecting mitochondrial respiration // Plant Disease. V.89. - №3. - 2005. - P. 269-278.

171. Peever T.L., Su G, Carpenter-Boggs L., Timmer L.W. Molecular systematics of citrus-associated Alternaría species// Mycologia. 2004. — V.96. -№1. - P. 119-134.

172. Petrunak and Christ B.J. Isozyme variability in Alternaría solani and Alternaría alternatall Phytopathology. 1992. - V.82. - P. 1343-1347.

173. Pryor B. M., and Michailides T. J. Morphological, pathogenic, and molecular characterization of Alternaría isolates associated with Alternaría late blight of pistachio// Phytopathology. 2002. - V.92. - P. 406-416.

174. Ristaino J.B., Groves C.T., Parra G.R. PCR amplification of the Irish potato famine pathogen from historic specimens // Nature. 2001. - V. 411. - P. 695697.

175. Ristaino J.B. Tracking the evolutionary history of the potato blight pathogen with historical collections// Outlooks in Pest Management. 2006. - V. 17-P. 228-231.

176. Ritch D.L., Daggett S.S. Nuclear DNA content and chromosome number in German isolates of Phytophthora infestans II Mycologia. 1995. - V.87. - P. 579-581.

177. Rubin E., Baider A., Cohen Y. Phytophthora infestans produced oospores in fruits and seeds of tomato // Phytopathology. 2001. - V.91.-P. 1074-1080.

178. Sansome E. Reciprocal translocation, heterozygosity in heterothallic species of Phytophthora and its significance // Trans. Brit. Mycol. Soc. 1980. - V. 84. -P. 87-93.

179. Sansome E., Brasier C.M., Hamm P.B. Phytophthora meadii may be a species hybrid // Mycol. Res. 1991. - V.95. - P. 273-277.

180. Savelkoul P.H., Aarts H.J.M., de Haas J., Dijkshoorn L., Duim B., Otsen M., Rademaker J.L.W., Schouls L., Lenstra J.A. Amplified Fragment Lenth Polymorphism analisys: the State of the Art // Journal of Clinical Microbiology. -Oct. 1999.-P. 3083-3091.

181. Schober-Butin B., Knapova G., Knipfelberg I. & Niepold F. Phytophthora infestans in Germany: population dynamics and modern methods in diagnosis // Phytophthora infestans -150. Eds L. J. Dowley et al., Dublin: Bool Press Ltd, 1995.-P. 96-101.

182. Schulman A. H. Molecular markers to assess genetic diversity // Euphytica on-line.-2006.-P. 1-9.

183. Shaw D. S. Genetics // in: Advances in Plant Pathology. Phytophthora infestans the cause of late blight of potato, edited by D. S Ingram & P. H. Williams, London: Academic Press, 1991. V. 7. - P. 131-170.

184. Shattock R.C., Shaw D.S. Novel phenotypes of Phytophthora infestans from mixed cultures of antibiotic resistant mutants // Transact. British Mycol. Soc. -1976.-V.67.-P. 201-206.

185. Simmons E.G. Alternaría taxonomy: current status, viewpoints, challenge// Alternaría: Biology, Plant Diseases and Metabolites. Chelkowski J., Visconti A. (Eds.), Amsterdam. Elsevier. 1992. - P. 1-36.

186. Simmons E. Alternaría. An Identification Manual. Utrecht. CBS Fungal Biodiversity Centre. 2007. - 780 p.

187. Spielman L. J. Isozymes and the population genetics of Phytophthora infestans I I in Phytophthora. J. A. Lucas, R. C. Shattock, D. S. Shaw, L. C. Cooke, eds. Cambridge: Camridge Univ. Press, 1991. P. 234-241.

188. Staub T., Dahmen H. & Schwinn F. J. Biological characterisation of uptake and translocation of fungicidual acylalanines in grape and tomato plants // Z. Phlanzenschultz. 1978. - V. 85. - P. 162-168.

189. Stem J.M., Kirk W.W. The generation and quantification of resistance to dimethomorph in Phytophthora infestans // Plant Disease. 2004. - V.88. - P. 930-934.

190. Stromberg A. Experiences of oospore germination and formation in potato cultivars with different levels of resistance to leaf late blight // PPO-Special Report no. 5. 1999. - P. 205-209.

191. Stromberg, A, U Bostrom and N Hallenberg,. Oospore germination and formation by the late blight pathogen Phytophthora infestans in vitro and under field conditions // J. of Phytopathology. 2001. - V.149. - P. 659-664.

192. Suassuna N.D., Maffia I.A., Mizubuti F. S.G. Aggressiveness and host specificity of Brasilian isolates of Phytophthora infestans // Plant Pathol. 2004. -V.53.-P. 405-413.

193. Sujkovski L. S., Goodwin S. B., Dyer A. T., Fry W. E. Increased genotypic diversity via migration and possible occurence of sexual reproduction of Phytophthora infestans in Poland // Phytopathology. 1994. - V.84. - P. 201207.

194. Therrien C.D., Daggett S.S., Ritch D.L., Sato N., Spielman L.J., Tolley P.N. Mating type, nuclear DNA content, and isozyme composition of thirty-three isolates of Phytophthora infestans from Japan // Phytopathology. 1990. - V.80. -P. 124.

195. Therrien C.D., Ritch D.L., Davidse L.C., Jespers B.K., Spielman L.J. Nuclear DNA content, mating type, and metalaxyl sensitivity of eighty-three isolates of Phytophthora infestans from the Netherlands // Mycol. Res. 1989. -V.92.-P. 140-146.

196. Thomas A, Albert G, Schlosser E. Use of video-microscope systems to stady the mode of action of dimethomorph on Phytophthora infestans II Med. Fac. Landbouww. Univ. Gent. 1992. - P. 57.

197. Toolley P. W., Garfinkel D. G., Presence of Tyl-copia group retrotransposon sequences in the potato late blight pathogen Phytophthora infestans II Mol Plant Microbe Interact. 1996. - V. 9. - №4. - P. 305-314.

198. Tooley P. W., Fry W. E., Villareal-Gonzalez M. J. Isozyme characterization of sexual and asexual Phytophthora infestans populations // J. Hered. 1985. -V. 76.-P. 431-435.

199. Vartanian V. G. & Endo R. M. Overwintering hosts, compatibility types and races of Phytophthora infestans on tomato in Southern California I I Plant Disease.- 1985. V. 69.-P. 516-520.

200. Vergnes D. M., Renard M.-E., Duveiller E.and Maraite H. Identification of Alternaría spp. on wheat by pathogenicity assays and sequencing// Plant Pathology. 2006. - V. 55. - P. 485-493.

201. Walker A.S.L., Cooke L.R. The survival of phenilamide resistant strains of Phytophthora infestans in potato tubers // Proc. Br. Crop Prot. Conf. 1988. -V.l.-P. 353-358.

202. Walker A.S.L., Cooke L.R. The survival of Phytophthora infestans in potato tuber the influence of phenilamide resistance // Proc. Br. Crop Prot. Conf.1990. — V.3. P. 1109-1114.

203. Weingartner D.P., Tombolato D. Temporal, geographic and host distribution of Phytophthora infestans genotypeas in Florida // Amer. Potato J. 2004. -V.81.-P. 94-95.

204. Weir T.L., Huff D.R., Christ B.J. & Romaine C.P. RAPD-PCR analysis of genetic variation among isolates of Alternaria solani and Alternaria alternata from potato and tomato// Mycologia. 1998. - V.90. - P. 813-821.

205. White T.J., Bruns T., Lee S. Taylor J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics// PCR Protocols: A Guide to Methodes and Applications. Academic press. 1990. - P. 315-322.

206. Whittaker S. L., Assinder S. J. & Shaw D. S. Inheritance of mitochondrial DNA in Phytophthora infestans II Mycol. Res. 1994. - V. 98 (5). - P. 569-575.

207. Wiik L. Potato early blight in Sweden: Results from recent field trials // PPO-Special Report no. 10. 2004. - P. 109-118.