Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генотипический состав популяций и устойчивость к некоторым фунгицидам штаммов Phytophthora infestans (Mont.) de Bary из Республики Марий Эл и Московской области

ВАК РФ 03.00.24, Микология

Автореферат диссертации по теме "Генотипический состав популяций и устойчивость к некоторым фунгицидам штаммов Phytophthora infestans (Mont.) de Bary из Республики Марий Эл и Московской области"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М. В. ЛОМОНОСОВА Биологический факультет

На правах рукописи

00344В^и

Милютина Дарья Игоревна

ГЕНОТШШЧЕСКИЙ СОСТАВ ПОПУЛЯЦИЙ И УСТОЙЧИВОСТЬ К НЕКОТОРЫМ ФУНГИЦИДАМ ШТАММОВ PHYTOPHTHORAINFESTANS (MONT.) de BARY ИЗ РЕСПУБЛИКИ МАРИЙ ЭЛ И МОСКОВСКОЙ ОБЛАСТИ

Специальность 03.00.24 - Микология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 6 ОКТ 2008

Москва 2008

003448340

Работа выполнена на кафедре микологии и альгологии Биологического факультета Московского Государственного Университета имени М. В. Ломоносова в 2004-2008 годах.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

кандидат биологических наук Еланский Сергей Николаевич

доктор биологических наук Ткаченко Олег Борисович

кандидат биологических наук Зейрук Владимир Николаевич

ГНУ Всероссийский научно исследовательский институт овощеводства РАСХН, г. Москва

Защита диссертации состоится 31 октября 2008 г. в 15 часов 30 мин. на заседании Диссертационного совета Д.053.05.65 Биологического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова по адресу: 119899 Москва Воробьевы горы, МГУ, Биологический факультет, аудитория М 1. Факс (495) 939-39-70.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова.

Автореферат разослан 30 сентября 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, к.б.н.

м. А. Гусаковская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Оомицет Phytophthora infestons (Mont.) de Вагу — возбудитель фитофтороза картофеля и томата — уже более полутора столетий привлекает пристальное внимание исследователей из разных стран. Внезапно появившись в Европе в середине XLX столетия, он вызвал эпифитотию картофеля, оставшуюся в памяти многих поколений. Но и по прошествии 150 лет проблема фитофтороза во всем мире далека от разрешения. Чтобы меры борьбы оставались эффективными, необходимо всестороннее изучение возбудителя фитофтороза, эпидемиологии заболевания, проведение постоянного мониторинга изменений, происходящих в его популяциях.

На территории России фитофтороз встречается практически во всех регионах, занимающихся производством картофеля и томата, причем структура популяций возбудителя фитофтороза в них различается. Популяции, распространенные на территории сибирской и дальневосточной частей России, состоят из ограниченного числа клонов, генетические обмены между которыми крайне редки. Популяции европейской части России отличаются очень высоким генотипическим разнообразием: практически каждый штамм имеет свой уникальный генотип. Популяции P. infestons исследованы на территории Центрального, СевероКавказского, Северо-Западного и некоторых других регионов европейской части России, в то же время практически нет данных о структуре популяций в среднем и нижнем Поволжье..

Цель и задачи. Целью предлагаемой работы было исследование генотипической структуры популяций и устойчивости к фунгицидам штаммов Р. infestans из Республики Марий Эл в сравнении с Московской областью и другими регионами России. Для выполнения поставленной цели были сформулированы следующие задачи исследований:

1. Выделение изолятов в чистую культуру. Создание коллекции штаммов.

2. Тестирование независимых маркерных признаков: тип спаривания, спектр изоферментов пептидазы, гаплотип мигохондриальной ДНК (далее мтДНК), структура микросателлитных повторов.

3. Сравнение структуры популяций в Республике Марий Эл и в Московской области на основе исследованных независимых признаков.

4. Изучение устойчивости штаммов к фунгицидам металаксил и манкоцеб.

5. Исследование возможности присутствия генетически различных митохондрий в мицелии одного штамма (гетероплазмоз) и их распространения в природных популяциях Р. infestans.

Научная новизна. Подобран удобный набор независимых маркерных признаков для оценки генотипического разнообразия популяций. На основании комплекса вышеуказанных признаков впервые охарактеризованы популяции из Республики Марий Эл и Московской области. Обнаружены изоляты, различающиеся по устойчивости к фунгициду манкоцеб. Впервые сделано предположение и доказано экспериментально присутствие в мицелии одного штамма генетически различающихся митохондрий, получены данные о распространении гетероплазмонов среди российских популяций Р. \nfestans.

Практическая значимость. Информация о генотипической структуре популяций Р. т/ез1ат, о происходящих в них изменениях, а также знание внешних факторов, влияющих на внутри - и межпопуляциошше перестройки, могут внести существенный вклад в лучшее понимание эпидемиологии фитофтороза и, в конечном итоге, сократить потери урожая. Полученные данные об устойчивости штаммов к фунгицидам металаксил и манкоцеб могут быть использованы при разработке схем химической защиты картофеля и томата от фитофтороза.

Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на конференции молодых ученых «Ломоносов-2005» (Москва, 2005), на международной конференции «Грибы и водоросли в биоценозах - 2006» (Москва, 2006), на Международном конгрессе «Картофель. Россия. 2007» (Москва, 2007), на 15 конгрессе Европейских микологов (Санкт-Петербург, 2007), на 2 съезде микологов России (Москва, 2008), а также на заседании кафедры микологии и альгологии Биологического факультета МГУ (Москва, 2007).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ.

Структура н объем диссертации. Диссертационная работа изложена на -110 страницах, состоит из введения, обзора литературы, глав «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», выводов, списка литературы, включающего источника, и приложения. Работа содержит рисунков и ÏQ таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Обзор литературы. В этой главе содержатся сведения о биологических особенностях и вредоносности возбудителя фитофтороза, мерах борьбы с заболеванием, о фунгицидных препаратах, приведен обзор работ по изучению генотипической структуры популяций и анализу маркеров, применяемых для популяционных исследований P.infestans.

2. Материалы и методы.

Сбор пораженных фитофторозом образцов проводился в 2004-2007 годах в Москве, Московской области и Республике Марий Эл. С одного растения брали не более одного образца, по возможности на поле выбирали растения, отстоящие друг от друга не менее, чем на 10 м.

Выделение изолятов P. infestons производилось в лабораторных условиях из пораженных фитофторозом органов растений (листьев, плодов, стеблей, клубней) с использованием метода влажных камер.

Определение типов спаривания проводили методом попарного сращивания исследуемого изолята с тестерными штаммами с известными типами спаривания (А1 либо А2) на агаризованной овсяной среде.

Спектр изоферментов определяли на целлюлозоацетатных гелях согласно рекомендации производителя Helena Laboratories inc. (Hebert, Beaton, 1993) с небольшими модификациями (Elansky, Smirnov, 2003).

Гаплотнпы митохондриальной ДНК идентифицировали согласно методике разработанной Griffith и Shaw (1998). Для выявления гетероплазмонов амплифицировали генную вставку размером 709 пн, характерную для 2 типа мтДНК в штаммах, определенных по традиционному тесту PCR-RFLP как имеющие 1 тип МтДНК. Для амплификации вставки использовали праймеры VSFor: 5'

ОСаЪсССАААТАТСТСОААА 3' и УЖеу: 5' ОСААТСОСОСАТСААТТАТТ 3'. Продукты амплификации разделяли в 0,8% агарозном геле, продукты рестрикции - в 1,5%, приготовленном на трис-боратном буфере с добавлением бромистого этидия.

Анализ микросаттелитных повторов (8811) проводили с помощью двух групп праймеров на локусы Р14В и Р140 соответственно: И: 5' - ААААТАААСССТГГСОТТСА и Я: 5'- <ЗСААССОАООТТГОТАОАТТ Р: 5'- СССГСТСТСОАТОАСААСТА и Я: 5'- ТССАССТСАСАТАССАССТА

После э'лектрофоретического разделения продуктов амплификации исследованных образцов выявлялись несколько фрагментов различной длины. Для анализа в настоящей работе были выбраны 2 фрагмента, четко видимые и легко идентифицируемые при анализе ПЦР-фрагментов всех исследуемых изолятов. Первый фрагмент длиной около 160 пн был обозначен как Ь, а второй (около 295 пн) - как Н. Среди исследованных штаммов были выявлены как несущие оба фрагмента (генотип ЬН), так и один из фрагментов (генотипы Ь и Н).

Определение устойчивости к металаксилу проводили на овсяной агаризованной среде с добавлением фунгицида. Чувствительность изолятов оценивалась по скорости радиального роста колонии на среде с фунгицидом и без него. Изолят считался чувствительным (8), если относительная скорость роста его колонии на среде с фунгицидом (при концентрации действующего вещества 10 ррт (мкг/мл)) в сравнении со средой без фунгицида была менее 0,1; слабоустойчивым (811) — при относительной скорости роста от 0,1 до 0,4; и устойчивым (И.) - более 0,4, причем устойчивые штаммы должны были расти на среде с концентрацией действующего вещества 100 ррт. Тест проводился в трех повторностях для каждого изолята. Для изучения устойчивости к манкоцебу тест проводили также на овсяной агаризованной среде с добавление фунгицида в концентрациях 1, 10 и 50 ррт. На основании полученных данных по относительной скорости роста вычисляли показатель ЕС50 — концентрацию фунгицида, ингибирующую рост мицелия анализируемого изолята на 50%. При исследовании штаммов из Марий Эл показатель ЕС5о вычисляли также и для металаксила.

Для получения монозооспоровых потомков молодой мицелий наращивали в чашках Петри, затем делали смывы, которые помешали на 2-4 часа в холодильник

для стимуляции выхода зооспор из зооспорангиев. Суспензию зооспор высевали на голодный агар в чашки Петри или на жидкую силыюразбавленнуто среду в колбу, инкубировали в течении 1-3 дней. Проросшие зооспоры отбирали (просматривая в поле микроскопа или бинокуляра) при помощи стерильной иглы и высаживали на чашки Петри с овсяным агаром.

Статистическую обработку данных проводили при помощи электронных пакетов программ Excel, RCEXACT, STAT1ST1CA. Для выявления статистически достоверных отличий признаков вычисляли коэффициент ранговой корреляции Спирмена, для выявления гетерогенности маркерных признаков в пойуляциях вычисляли X2. Поиск гомологий полиморфных регионов ДНК проводили на основании данных Genbank и программы BLAST.

Кодировка генотипов проводилась в двоичной системе с учетом порядка следования признаков.

1 и 2 знаки - тип спаривания: 10-А1, 01-А2.

3 и 4 знаки - генотипы локуса пептидазы Pepl: 00- 100/100,10-92/100.

5 и 6 знаки - генотипы локуса пептидазы Рер2: 00 - 100/100, 01 - 100/112, 11112/112.

7 и 8 знаки - генотипы SSR: 10 - L, 01 - Н, 11 - LH.

9 и 10 знаки - гаплотип митохондриальной ДНК. 10 - 1а, 01 - 2а.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3. Характеристика маркерных признаков штаммов P. infestans

Тип спаривания. За период с 2003 по 2007 годы тип спаривания был изучен у 932 изолятов, собранных с плодов и листьев томата и листьев и клубней картофеля в Московской области (808 изолятов) и в Республике Марий Эл (124). Штаммы с разными типами спаривания были найдены практически во всех обследованных популяциях (таблица 1). Изоляты группы Al А2 были выявлены только в 2003 году в 5 разных полевых популяциях. Наибольшее их число обнаружено среди штаммов, выделенных на поле ВНИИ фитопатологии в Голицыно.

Таблица 1.

Доли штаммов с разными типами спаривания в полевых популяциях

Популяция Растение орган Кол-во проанал-г штаммов Доля штаммов с ТС (%)

А1А2 А1 А2

2003

Одинцовский р-н, ВНИИССОК ТЛ* 30 3 40 57

Воскресенский р-н тп 29 0 0 100

Воскресенский р-н кл 12 0 100 0

Одинцовский р-н, Голицыне, ВНИИФ кл 51 12 6 82

Одинцовский р-н, Голицыно, ВНИИФ кк 7 0 86 14

Одинцовский р-н, Голицыно, ВНИИФ лхл 31 3 97 0

Одинцовский р-н, ЗБС кл 87 1 75 24

Одинцовский р-н, ЗБС ТЛ 36 2 90 8

2004

Москва, БотсадМГУ, сорт Санте кл 58 0 50 50

Москва, БотсадМГУ, сорт Луговской кл 31 0 7 93

Одинцовский р-н, ЗБС, сорт Санте кл 27 0 19 81

Одинцовский р-н, ЗБС, сорт Луговской кл 39 0 49 51

Одинцовский р-н, ВНИИССОК кл 25 • 0 68 32

Одинцовский р-н, Троицкое кл 32 0 34 66

Шаховской р-н, Лобанове кл 24 0 33 67

Одинцовский р-н, Волково ТЛ 8 0 25 75

Одинцовский р-н, Волково кл 16 0 19 81

Одинцовский р-н, Голицино тп 13 0 85 15

Одинцовский р-н, Голицино кл 25 0 60 40

Марий Эл, г. Йошкар-Ола тп 17 0 35 65

2005

Одинцовский р-н, ЗБС кл 21 0 5 95

2006

Одинцовский р-н, ЗБС кл 73 0 95 5

Одинцовский р-н, ЗБС кк 13 0 100 0

Одинцовский р-н, Голицино кл 49 0 2 98

Москва, Ботсад МГУ кл 67 0 39 61

2007

Марий Эл, г. Йошкар-Ола КЛ 20 0 25 75

Марий Эл, г. Йошкар-Ола ТП 87 0 43 57

Одинцовский р-н, Волково КЛ 4 0 75 25

Всего проанализировано 932 изолята

Прим. * - КЛ - листья картофеля, ТЛ - листья томата, ТП - плоды томата, КК - клубни картофеля, ЛХЛ - листья диких Ьусорегнсоп ЫпиШт.

В нескольких случаях отмечены разные соотношения типов спаривания штаммов, выделенных с разных органов растений или с разных растений на одной и той же делянке. Так, среди штаммов, выделенных из листьев картофеля на поле ВНИИФ, преобладали изоляты с типом спаривания А2, в то время как среди выделенных из клубней на этом же поле преобладал А1 (строки 4 и 5). Существенная разница долей типов спаривания среди штаммов, выделенных с картофеля и томата на одной делянке, отмечена в Воскресенском районе (строки 2 и 3), в Одинцовском районе (строки 7 и 8, 18 и 19) В 2004 году на делянке в Москве были выявлены различия в распределении типов спаривания среди изолятов, выделенных с картофеля разных сортов на одной делянке (строки 9 и 10). Выявленные закономерности свидетельствуют в пользу селекции генотипов при заражении разных растений - хозяев и даже разных органов и разных сортов одних и тех же растений.

Спектр изоферментов пептидазы. При сравнительном генотипическом анализе традиционно используются спектры изоферментов (генотипы) глюкозо-6-фосфат изомеразы (вР1) и пептидазы (РЕР). При анализе российских популяций выяснилось, что по ОР1 все российские штаммы имеют только один генотип -100/100. Также низким полиморфизмом отличается и первый локус пептидазы Рер1, традиционно используемый в сравнительном анализе. Более высокий полиморфизм отмечен у изозимов второго локуса пептидазы Рер2. При электрофорезе на целлюлозоацетатных гелях локус Рер2 прокрашивается одновременно с локусом Рер1. Поэтому при выполнении настоящей работы мы отказались от изучения спектра изоферментов вР!, и определяли только изоферменты локусов Рер1 и Рер2.

Спектр изоферментов пептидазы изучен у 337 изолятов, выделенных в 20032007 годах. Покус Рер1 был представлен двумя генотипами: 100/100 и 92/100, причем 92/100 встречался достаточно редко. Генотип 92/92 среди исследованных штаммов не был обнаружен. Локус Рер2 был представлен тремя генотипами: 100/100, 100/112 и 112/112, причём значительно чаще встречались штаммы с генотипами 100/100 и 100/112. Результаты тестирования приведены в таблице 2.

Таблица 2

Доли штаммов с разными генотипами по локусам Рер1 и Рер2

Популяция Раст. орган Кол-во нроан-х штаммов Рер1 Рер2

92/100 100/100 100/100 100/112 112/112

2003

Одинцовский р-н, ВНИИССОК ТЛ 14 0 100 14 36 50

Воскресенский р-н кл 5 60 40 100 0 0

Одинцовский р-н, Голицыне, ВНИИФ кл 14 0 100 0 100 0

Одинцовский р-н, Голицыно, ВНИИФ кк 5 0 100 60 40 0

Одинцовский р-н, Голицыно, ВНИИФ лхл 9 0 100 11 89 0

Одинцовский р-н, ЗБС к 32 28 72 90 10 0

Одинцовский р-н, ЗБС т 11 9 91 100 0 0

2005

Одинцовский р-н, ЗБС к 19 0 100 100 0 0

2006

Одинцовский р-н, ЗБС кл 62 0 100 100 0 0

Одинцовский р-н, ЗБС кк 11 0 100 100 0 0

Одинцовский р-н, Голицино кл 29 34 66 36 32 32

Шаховской р-н, Лобаново тп 5 20 80 40 40 20

Москва, Ботсад МГУ кл 52 4 96 52 , 48 0

2007

Марий Эл, г. Йошкар-Ола кл 15 7 93 60 40 0

Марий Эл, г. Йошкар-Ола тп 51 0 100 48 9 43

Одинцовский р-н, Волково кл 3 0 100 67 33 0

Всего проанализировано 337 изолятов

Гаплотип мнтохондриальной ДНК определен у 241 изоляха. Используемый в работе метод последовательной амплификации двух фрагментов митохондриалыюй ДНК позволяет идентифицировать 4 гаплотипа: Ia, IIa, Ib, IIb. Однако среди протестированных штаммов отмечались только гаплотипы 1а и IIa В большинстве исследованных популяций встречены штаммы с обоими гаплотипами (таблица 3).

Таблица 3.

Доли штаммов с разными гаплотипами МтДНК

Популяция Растение оргап Количество проанализ-х штаммов Доля штаммов с мтДНК (%)

1а IIa

2004

Москва, БотсадМГУ КЛ 25 20 80

Одинцовский р-н, Одинцово тл 9 78 22

Одинцовский р-н, Троицкое КЛ 8 25 75

Шаховской р-н, Лобаново КЛ И 82 18

Одинцовский р-н, Голицино тп 8 63 37

Одинцовский р-н, Голицино КЛ 7 86 14

Одинцовский р-н, ЗБС ТЛ 5 0 100

Одинцовский р-н, ЗБС КЛ 16 0 100

2005

Одинцовский р-н, ЗБС КЛ 22 100 0

2006

Одинцовский р-н, ЗБС КЛ 25 24 76

Одинцовский р-н, ЗБС, перез.кл. к 12 83 17

Одинцовский р-н, Голицино к 13 31 69

Москва, Ботсад МГУ к 25 52 48

2007

Респ. Марий Эл, г. Йошкар-Ола кп 44 89 11

Респ. Марий Эл, г. Йошкар-Ола тп И 18 82

Всего проанализирован 241 изолят

Геиотипический состав популяций по 3 маркерным признакам (тип спаривания, генотипы локусов Рер1 и Рер2) определен для 195 изолятов из Московской области и для 57 изолятов из Марий Эл. Набольшее генотипическое разнообразие отмечено в популяциях 9 и 10 (по 6 различных генотипов! а также в

популяциях 1 и 5 (по 4 генотипа) из Московской области. В популяциях из Марий Эл также отмечено высокое генотипическое разнообразие: популяция, выделенная с листьев картофеля, представлена 5-ю различными генотипами, а популяция с листьев томата - 6-ю. В разных популяциях наиболее часто встречались генотипы 100000 (в 8 популяциях), 010001 (в 7), 010000 (в 7), 100001 (в 6) (таблица 4).

Таблица 4.

Генотипический состав популяций по 3 маркерным признакам

Популяция Растение орган Кол-во проанал-х изолятов Генотипы (доля в%)

2003

1. Одинцовский р-н, ВНИИССОК ТЛ 14 100001 (28%), 010001 (7%), 010000 (15%), 010011 (50%)

2. Одинцовский р-н, Голицыно, ВНИИФ кл 8 010001 (100%)

3. Одинцовский р-н, Голицыно, ВНИИФ кк 5 100000 (60%), 100001 (20%), 010001 (20%)

4. Одинцовский р-н, Голицыно, ВНИИФ лхл 9 100000 (11%), 100001 (89)

5. Одинцовский р-н, ЗБС кл 31 100000(31), 101000 (16%), 101001 (10%), 011000(3%)

2005

6. Одинцовский р-н, ЗБС К 14 010000 (100%)

2006

7. Одинцовский р-н, ЗБС кл 55 100000 (93), 010000 (7%)

8. Одинцовский р-н, ЗБС кк 8 100000 (100%)

9. Одинцовский р-н, Голицино кл 25 010001 (28%), 010000 (12%), 010011 (24%), 011000 (24%), 011001 (4%), 011011 (8%)

10. Москва, Ботсад МГУ кл 26 100000 (20%), 100001 (38%), 010000 (31%), 010001 (8%), 011000 (4%), 011001 (4%)

2007

11. Респ. Марий Эл, г. Йошкар-Ола тп 44 100000 (9%), 100001 (2%), 010001 (7%), 100011 (39%), 010000 (39%), 010011 (4%)

12. Респ. Марий Эл, г. Йошкар-Ола кл 13 100000 (8%), 100001 (8%), 010001 (38%), 010000 (38%), 011000 (8%)

Сравнив генотипы всех исследованных изолятов в 2003-2007 гг с ранее

изученными в 1999 - 2002 годах (таблица 5) видим, что в обоих случаях наиболее часто встречались штаммы с генотипами 100000, 010000, 010001 и 100011, причем бесспорное лидерство принадлежит генотипу 100000. Остальные встречались

достаточно редко. В Марий Эл чаще других встречались генотипы 010000 и 100011, причем последний не был выявлен в Московской области в 2003-2007 годах, но проявлялся в более ранних сборах.

Таблица 5

Сравнение генотипов в популяциях Московской области и Марий Эл

Генотип Всего С 2003 по 2007 Всего с 1999 по 2002

Московская область Марий Эл Московская область

юоооо 90* 9 59

010000 32 18 49

010001 27 8 20

100001 23 3 31

100011 0 17 11

010011 13 2 3

011000 8 1 1

101000 5 0 2

101001 3 0 0

011001 2 0 1

011011 2 0 0

101011 1 0 1

всего 206 58 177

Прим. * - количество изолятов, у которых был идентифицирован данный генотип.

Устойчивость к металаксплу. Все выделенные изоляты тестировались на устойчивость к фунгициду металаксил. Всего за период исследований протестированы 894 изолята. Среди изолятов, выделенных на делянках ЗБС, преобладали чувствительные к металаксилу, а среди выделенных на опытном поле ВНИИФ и в Ботаническом саду МГУ — устойчивые и слабоустойчивые (таблица 6). Ни на одной из исследуемых делянок металаксилсодержащие препараты не применяли. При сравнении популяций 2003-2007 годов по степени устойчивости к металаксилу была выявлена высокая гетерогенность (X2 = 611,2 при и=52). По предварительным расчетам их можно объединить в 6 групп, внутри которых наблюдается закономерное, более или менее ровное распределение соотношений Б, БЯ и II штаммов. Группы между собой гетерогенны (X2 = 345,23 при 1>=10). В первую группу вошли 6 популяции, представленные только 8 штаммами, либо с низким процентным соотношением Б Я. Это томатные популяции 2003 года, а так же

Таблица 6

Доли штаммов с разной степенью устойчивости к металаксилу

Популяция Растение орган Количество проааал-х штаммов Доли штаммов (%):

8* К

2003

Одинц. р-н, ВНИИССОК ТЛ 23 100 0 0

Воскресенский р-н ТП 28 100 0 0

Воскресенский р-н КЛ 13 92,3 7,7 0

Одинцовский р-н, ВНИИФ кл 62 51,6 40,3 8,1

Одинцовский р-н, ВНИИФ ЛХЛ 25 84 16 0

Одинцовский р-н, ЗБС кл 72 62,5 37,5 0

Одинцовс:сий р-н, ЗБС ТЛ 25 12 88 0

2004

Москва, БотсадМГУ кл 86 50 27,9 22,1

Одинцовский р-н, ЗБС ТЛ,ТП 17 52,9 41,2 5,9

Одинцовский р-н, ЗБС кл 57 56,1 19,3 24,6

Одинцовский р-и, ЗБС кк** 8 50 50 0

Одинц. р-н, ВНИИССОК ТЛ,ТП 31 67,7 19,4 12,9

Одинц. р-я, Троицкое кл 27 59,3 29,6 11,1

Шаховской р-н, Лобанове кл 22 36,4 18,2 45,4

Одинцовский р-н, Волкове ТЛ 13 76,9 7,7 15,4

Одинцовский р-н, Волково кл 11 72,7 0 27,3

Одинц. р-н, Голицино ТП 17 29,4 52,9 17,7

Одинц р-н, Голицино кл 33 45,5 33,3 21,2

Марий Эл, г. Йошкар-Ола ТП 14 71,4 21,4 7,1

2005

Одинцовский р-н, ЗБС кл 22 81,8 18,2 0

2006

Одинцовский р-н, ЗБС кл 50 98 2 0

Одинцовский р-н, ЗБС кл** 51 100 0 0

Одинц. р-н, Голицино кл 50 36 40 24

Шаховской р-н, Лобанове ТП 5 0 80 20

Москва, Ботсад МГУ кл 70 14,3 37,1 48,6

2007

Марий Эл, г. Йошкар-Ола кл 14 78,6 21,4 0

Марий Эл, г Йошкар-Ола ТП 48 31,25 31,25 37,5

Прим. * - Б - чувствительные, БЯ - слабоустойчивые, К - устойчивые. ** - из перезимовавших клубней.

картофельные с ЗБС 2006 г. Во вторую попали 6 популяций с более или менее равномерно представленными соотношениями штаммов S, SR, R (популяции 2004 и 2006 г.г. из Шаховского района и п. Голицино). Группа 3, включает в себя 9 популяций, где S изоляты имеют значительное преимущество, но R и SR в них тоже присутствуют (картофельные популяции 2004 с ЗБС, Волково, Троицкое, Ботсада, 2005г. с ЗБС и 2007 г. из Марий Эл, томатные 2004 г. из ВНИИСОК, Волково и Марий Эл,). Группа 4 - доли S, SR, и R, распределены равномерно снижаясь от большего к меньшему (2003 г. ВНИИФ и ЗБС на картофеле и 2004 ЗБСна томате). В отдельные группы выделяются: популяция с листьев томата (ЗБС 2003г), где преобладают SR штаммы, и с листьев картофеля (Ботсад МГУ 2006) с преобладанием R и SR изолятов.

Сильные различия долей устойчивых и чувствительных изолятов наблюдаются между популяциями P. infestans на крупных коммерческих полях и на частных огородах (ЛПХ). Устойчивые и слабоустойчивые штаммы встречаются в ЛПХ значительно реже. По-видимому, это связано с тем, что Ридомил МЦ до 2007 года не продавался в мелких фасовках и практически не применял в ЛПХ. Если учесть, что в ЛПХ производится более 90% урожая картофеля в России, то частные огороды можно рассматривать как существенный ресурс чувствительных генотипов.

Рост количества крупных хозяйств, занимающихся производством картофеля и практикующих систематическое применение фениламидных фунгицидов, а также начало реализации препарата Ридоми Голд МЦ в мелкой фасовке (для ЛПХ), вызвало в последнее время рост устойчивых штаммов.

Популяции в Республике Марий Эл. Представляемая работа является первым исследованием структуры популяций возбудителя фитофтороза в Республике. Поэтому изоляты, выделенные в окрестностях города Йошкар-Олы с картофеля и томата, были проанализированы наиболее подробно. В работе использовался набор независимых маркерных признаков, включающий тип спаривания, генотипы локусов Pep 1 и Pep 2, гаплотип митохондриальной ДНК и анализ микросателлитных повторов. Это позволило определить генотипический состав

популяций по пяти маркерным признакам. Кроме того, все изученные изоляты были протестированы на устойчивость к 2-м фунгицидам - металаксилу и манкоцебу, для них определён показатель ЕС50.

У штаммов, выделенных с плодов томата, соотношение типов спаривания было близким к 1:1: А1:А2=43:57, а у выделенных с листьев картофеля доля типа спаривания А2 была значительно больше - 75%, а А1 - 25%. Штаммов, образующих оослоры с обоими тестерными штаммами (А1А2) не было выявлено. Три изолята не образовали ооспор ни с одним из тестерных штаммов.

Изучение изоферментов пептндазы показало, что по локусу Рер1 все марийские изоляты были 100/100, кроме одного, выделенного с картофеля, который имел генотип 92/100. По локусу Рер2 разнообразие оказалось шире: 26 изолятов имели спектр 100/100 (50%); 9 изолятов были 100/112 (17%); и 17 изолятов -112/112 (33%). Интересно, что среди штаммов, выделенных с картофеля, не было выявлено ни одного с генотипом по Рер 2 112/112, в то время как изолятов с таким генотипом было довольно много среди «томатных».

Анализ микросателлитных повторов марийских изолятов показал присутствие в популяции 3-х различающихся по этому признаку типов штаммов, несущих генотипы Ь, Ъ+Н, и Н. В популяциях из Республики Марий Эл доля штаммов с генотипом Ь составляет 100% на картофеле и 65% на томате, доля Н составляет 29% на томате, Ь+Н - 6% на томате.

Доля изолятов с гаплотипом митохондриалъной ДНК 1а составила 89% среди выделенных с картофеля и 18% среди выделенных с томата, На - 11% и 82% соответственно. Таким образом, применение этого маркера показало существенные различия между «картофельной» и «томатной» популяциями.

Анализ популяций по 5 маркерным признакам выявил высокое генотипическое разнообразие в популяциях Р. тУЫат, выделенных в Марий Эл как с картофеля, так и с томата. Среди штаммов, выделенных с картофеля, идентифицировано 5 генотипов (проверено 10 изолятов), а среди выделенных с томата - 12 генотипов (проверено 34 изолятов). Всего же среди штаммов, выделенных в Марий Эл, было выявлено 13 генотипов (таблица 7). Большее

разнообразие «томатной» популяции объясняется, видимо, большим объёмом выборки. Так, генотипы N 2, 4, 8, 10, 11 и 12 отмеченные у единичных «томатных» изолятов, не обнаружены на «картофельных». Однако интересно, что генотип N 5, выявленный у 8 томатных изолятов, не обнаружен у «картофельных», а генотип N 13, найденный у 4 из 10 «картофельных», не обнаружен у «томатных».

Таблица 7

Генютилический состав популяций из Марий Эл по 5 маркерным признакам

№ Кодировка Доля штаммов с данным генотипом в популяции (%)

па картофеле на томате

1 1000000110 10 3

2 1000001110 0 3

3 1000010101 10 3

4 1000110101 0 3

5 1000111010 0 23

6 1000111110 0 6

7 0100000110 10 44

8 0100010110 0 3

9 0100010101 30 3

10 0100011001 0 3

11 0100110101 0 3

12 0100111010 0 3

13 0100000101 40 0

Всего проанализировано изолятов 10 34

Все изоляты из Марий Эл отличались низкой устойчивостью к металаксилу, показатель ЕС50 .варьировал от 0,5 ррт до 4 ррт, причем у большинства штаммов он не превышал 1 ррт (рис. 1).

Устойчивость штаммов Р. к мапкоцебу варьировала почти в 50 раз:

значения показателя ЕС5о для разных образцов различались от 0.527 до 27 ррт (рис.1). Сильные вариации значения ЕС5о были выявлены как среди «картофельных», так и среди «томатных» штаммов, хотя большая часть изолятов с повышенным уровнем устойчивости была выделена в Республике Марий Эл с плодов томата. Сравнительный корреляционный анализ значений ЕС30 по

металаксилу и по манкоцебу, взаимосвязи двух этих параметров не выявил (г5 = 0,0686, при Р=0,6256, для п=53).

Средняя устойчивость к манкоцебу для групп штаммов с разными мультилокусными генотипами варьировала от 2,5 до 27 ррт (таблица 8). Для большинства генотипов ЕС50 не превышал 10 ррт. Только у двух генотипов наблюдался высокий уровень устойчивости: N 2 - 27 ррт, и N 5 - 14,3 ррт. Однако если к первому генотипу принадлежал только один исследованный изолят (самый устойчивый из всех проверенных), то ко второму - 8 штаммов, большинство из которых обладали высоким уровнем устойчивости. Уровень устойчивости к металаксилу для всех генотипов был ниже, чем к манкоцебу, в большинстве случаев показатель ЕС50 не превышал 1,0 ррт. Только у 3 генотипов ЕС10 был больше 1: N 1 -1,3 ррт, N 8 -1,1 ррт и N 11 - 2,5 ррт.

Присутствие штаммов с высоким значением ЕС50, вероятно, связано с интенсивным применением манкоцеба в сельскохозяйственных областях страны. Поскольку резистентность к мультисайтовым препаратам контролируется большим числом слабо экспрессивных генов, приобретение устойчивости происходит постепенно, а не скачкообразно, что подтверждают данные этого исследования.

рЭО 25

20 15 10 5

;0

Рис 1. Уровни устойчивости (ЕС5о) штаммов из Марий Эл к фунгицидам.

Вероятно, у устойчивых штаммов постепенно происходило накопление мутаций и шел отбор на механизмы, обеспечивающие устойчивость к манкоцебу.

Таблица 8

Устойчивость штаммов с различными генотипами к манкоцебу и металаксилу

№ Кодировка Уровень устойчивости ЕС50 (ррш)

ЕС5о (манкоцеб) ЕС50 (металаксил)

1 1000000110 2,5 1,3

2 1000001110 27 0,6

3 1000010101 6,3 0,6

4 1000110101 6,8 0,6

5 1000111010 14,3 0,6

6 1000111110 7,7 0,6

7 0100000110 4,5 0,7

8 0100010110 6,5 1,1

9 0100010101 3,7 0,5

10 0100011001 н/д 0,5

И 0100110101 4,4 2,5

12 0100111010 5,3 0,5

13 0100000101 7,1 0,6

Среднее для всех 7,3 0,7

генотипов

Изучение гетероплазмоза у Р. Ьг{е$1ам. В процессе работы по изучению гаплотипов митохондриальной ДНК были обнаружены штаммы, при разделении продуктов рестрикции которых в агарозном геле были визуально заметны слабые полосы, соответствующие другому типу митохондриальной ДНК (рис. 2). Поэтому было решено провести дополнительное исследование, касающееся изучения возможности одновременного присутствия в одном мицелии генетически разных митохондрий. Второй тип митохондриальной ДНК отличается от типа I присутствием вставки размером 1881 пн и другим расположением сайтов рестрикции в регионах Р2 и Р4.

К фрагменту вставки длиной 709 пн (рис. 3) были сконструированы праймеры УББог и У811еу. Если в геноме штамма, имеющего тип пШЖА 1а согласно пробе РС^КРЬР, обнаруживали фрагмент вставки, то штамм считали гетероплазматическим, в противном случае - гомоплазматическим.

Рис. 2. Продукты рестрикции после электрофоретического разделения.

1 - контрольный штамм с гаплотипом Па, 2 и 4 - штаммы, содержащие гаплотипы 1а и Па, 3 -штамм с гаплотипом 1а (без вставки).

5195 дсадсс сааа1а<:<Л.с gaaatcttat

5221 aatttcactt ддадаа1;(^а ttgatgttgt tgttgtaaat ggaatagtcg gtattattga

5281 acgcattata ас1;ссасс1а tagggggtaa acccattgaa cttaatgcca 1адаасс1аа

5341 аа1ассаасс ссс1:са1ааа сЬадЬсЬЬсд tctatttaaa gaaattctag aatcaatttc

5401 ссЛа^ааас tcatcaactc tttgttgaag ctgttcttca ttaactaatc даа-Ъ^да^

54 61 taaatattca tcataattat с±ас1:1дад1 а1:№аааа№ gaaaaaattt aattattatt

5521 а1ааас1асс attgattttc tcatattttg aataaagtct cttataacta а1:1:са1;сЪа1

5581 а1сЛааа^а gatctagtat ataaaaatat attacctatt cgatataagt cttcttctga

5641 tatatttaaa tcattcgaag а^даа^аа taaatcatgt aaatatgtcc taacttgtaa

5701 tgaactattt cttattagta ataaactaat ttcctgatta ttttgataat 1;1аааа1д1:1

5761 ttgcattaac tctatacgtt cttcagatga ад^с^аИа ttaatattaa taacaccttc

5821 асЛа1;сЛааа acttcagtat ttcccatttg ttctacccat ggaatcctat atcgagttga

5881 atgtaataat tgatgcgcca ttgc

Рис.3. Последовательность нуклеотидов фрагмента МтДНК гаплотипа Па (51955904), амплифнцируемого праймерами УБЖог и (подчеркнуты) (по данным СепЬапк)

Для доказательства гетероплазматической природы штаммов, несущих вставку, изолят ЗМОБТЛ139, содержащий вставку и имеющий 1а тип тгБЫА согласно пробе РСК-ЛРЬР, был расклонирован на 4 монозооспоровых клона. Все они содержали вставку. Далее один из клонов был еще раз расклонирован на 16 изолятов (К1 - К16). Все монозооспорвые клоны и родительский штамм показали тип 1а при тестировании методом РСК-КРЬР. Анализ вставки выявил различия в количестве ПЦР-продукта (рис. 4), причем один клон (9) не содержал вставки. Вероятно, в процессе монозооспорового клонирования в этот изолят попали только митохондрии с геномом типа 1а.

1 2 3 4 Б 6 7 5 9101112 13141516

Рис. 4. Амплификация вставки (709 пн) у монозооспорового потомства штамма ЭМОБТЛ139. Прим.: 1-16-монозооспоровые потомки штамма ЗМОБТЛ139.

Исследование штаммов, выделенных в природных очагах фитофтороза и имеющих тип митохондриальной ДНК 1а, показало, что большинство из них являются гетероплазмонами (таблица 9).

Таблица 9.

Гетероплазматические штаммы в природных популяциях

Место выделения Год выделения Растение-хозяин Кол-во протестированных изолятов Содержали вставку -гетероплазмон ы

Одинцовский р-н 2003 КЛ 11 10

Одинцовский р-н 2003 тл 4 4

Одинцовский р-н 2004 кл 10 10

Одинцовский р-н 2004 тл 9 8

Одинцовский р-н 2004 тп 8 8

Шаховской р-н 2004 кл 9 9

г. Москва 2004 кл 2 2

Респ. Марий-Эл 2004 кл 1 1

г. Москва 2005 кл 20 19

Итого: — — 73 71

Интерпретация результатов стандартных тестов, проводимых по методу РС11-М^ЪР, может быть затруднена, если в одном мицелии присутствуют генетически различные митохондрии. С другой стороны известно, что митохондриальный геном выполняет ряд жизненно важных функций, поэтому гетероплазматическое состояние может иметь значение в адаптациях грибов, в частности, в изменении патогенных свойств и реакции на применение фунгицидов. Возможно, массовое появление гетероплазмонов в полевых популяциях - это еще одно звено в цепи глобальных изменений, происходящих в популяциях возбудителя фитофтороза, и связано оно с появлением полового процесса и ооспорообразования в полевых популяциях европейской части России.

выводы

1. В большинстве исследованных полевых популяций отмечено высокое генотипическое разнообразие, присутствуют штаммы обоих типов спаривания, выявлены два гаплотипа митохондриальной ДНК, разные генотипы локусов Рер1 и Рер2, причём наибольшее разнообразие выявлено у локуса Рер2.

2. Устойчивость к металаксилу штаммов, выделенных на частных огородах, была практически всегда ниже, чем у выделенных с крупных коммерческих полей, где применяли этот фунгицид. Однако не всегда прослеживается связь между применением металаксила и устойчивостью. По-видимому, устойчивость, накопленная в процессе непосредственного контакта с препаратом, может сохраняться в течение длительного времени и при отсутствии обработок.

3. Анализ устойчивости к манкоцебу в популяциях из Марий Эл показал сильное варьирование показателя ЕС50 (более, чем в 50 раз). В популяциях из Московской области и Беларуси (данные не приведены) различия штаммов по устойчивости были менее выражены.

4. Выявлены штаммы, имеющие генетически разные митохондрии в одном мицелии (гетероплазмоны). Гетероплазмоны были обнаружены в большинстве популяций Европейской части России.

5. Генотипирование популяций по трем маркерным признакам, позволило выявить 12 генотипов. Наиболее часто встречались штаммы с четырьмя генотипами. Остальные генотипы встречались достаточно редко.

6. Популяции, выделенные в Республике Марий Эл как с картофеля, так и с томата, имели высокое генотипическое разнообразие. Генотипирование на основании 5 независимых маркерных признаков позволило выявить как общие для «картофельных» и «томатных» популяций генотипы, так и специфические, часто встречающиеся среди «картофельных» штаммов и отсутствующие на «томатных», и наоборот.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Апрышко В.П., Милютина Д.И. Популяции Phytophthora infestons на картофеле и томате //Материалы докладов XII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов», М.: СП "Мысль", 2005. - С. 235.

2. Еланский С.Н., Апрышко В.П., Милютина Д.И., Козловский Б.Е. Устойчивость российских штаммов Phytophthora infestons к Системным фунгицидам //Материалы международной конференции «Грибы и водоросли в биоценозах -2006», М., МАКСпресс, 2006. - С. 56-58.

3. Еланский С.Н., Апрышко В.П., Милютина Д.И., Козловский Б.Е. Устойчивость российских штаммов Phytophthora infestons к фунгицидам металаксил и диметоморф //Вестник московского университета, серия 16. Биология, 2007, N 1. -С. 14-18.

4. Еланский С.Н., Милютина Д.И. Гетероплазмоз у Phytophthora infestons //Генетика, 2007, т. 43, N 3. - С. 333-336.

5. Еланский С.Н., Дьяков Ю.Т., Милютина Д.И., Апрышко В.П., Побединская М.А., Филиппов А.В., Козловский Б.Е., Кузнецова М.А., Рогожин А.Н., Стацюк Н.В. Популяции возбудителя фитофтороза в России// Картофелеводство России. Актуальные проблемы науки и практики. Материалы Международного конгресса «Картофель. Россия. 2007», М. 2007. - С. 211-222. •

6. S.N. Elansky, Yu.T. Dyakov, D.I. Milyutina, V.P. Apryshko, M.A. Pobedinskaya, A.V. Filippov, B.E. Kozlovsky, M.A. Kuznetsova, A.N. Rogozhin, N.V. Statsyuk Late blight of potato in Russia //Potato production and innovative technologies. Ed. AJ. Haverkort, B.V. Anisimov, Wageningen Academic Publishers, The Netherlands, 2007. -P. 262-274.

7. S.N. Elansky, D.I. Milyutina Mitochondrial haplotypes of Russian Phytophthora infestons strains //XV Congress of European Mycologists. S.-Pb., Russia, September 16-21,2007. Book of Abstracts. -P. 245.

8. Милютина Д.И., Шеин C.A., Апрышко В.П., Еланский С.Н. Популяции Phytophthora infestons в Республике Марий Эл //Современная микология в

России. Том 2. Материалы 2-го Съезда микологов России. М.: Национальная академия микологии, 2008. - С. 193.

9. Еланский С.Н., Пляхневич М.П., Шеин С.А., Романова С.С., Александрова А.В., Милютина Д.И. Устойчивость к манкоцебу штаммов Phytophthora infestans и Alternaría sp. из России и Беларуси //Современная микология в России. Том 2. Материалы 2-го Съезда микологов России. М.: Национальная академия микологии, 2008. - С. 290.

Автор выражает глубокую благодарность и признательность своему научному руководителю Еланскому Сергею Николаевичу за полученные знания и помощь на всех этапах выполнения работы, заведующему кафедрой микологии и альгологии профессору Дьякову Юрию Таричановичу за ценные советы, всестороннюю поддержку и интерес к работе, Побединской Марине Александровне, Апрышко Валентине, Шеину Сергею, Пляхневичу Михаилу за помощь в выполнении экспериментов, а также всему коллективу кафедры за поддержку и создание дружественной атмосферы.

Огромное спасибо Глотову Николаю Васильевичу за полученные знания, помощь в статистической обработке данных и ценные советы.

Хочется выразить особую благодарность заведующей отделом аспирантуры биологического факультета Семиной Татьяне Ксенофонтовне и моим родителям Милютину Игорю Федоровичу и Милютиной Наталии Николаевне за неоценимую помощь и всестороннюю поддержку.

БЛАГОДАРНОСТИ

Подпись

(Д.И. Милютина)

Подписано в печать 26.09.2008 г. Формат 60x84/16. Усл.печ.л. 1,3. Тираж 100. Заказ К1/871.

Отпечатано с готового оригинал-макета

в копицентре «ЬА1ЧРОКТ» 424001, г.Йошкар-Ола, пр. Гагарина, 2.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Милютина, Дарья Игоревна

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1 Обзор литературы

1.1. Систематическое положение, биологические особенности и эпидемиология РкуррЫкога \nfestans

1.2. Меры борьбы с фитофторозом и фунгицидные препараты

1.3. Методы генетического и генотипического анализа популяций и штаммов Р. т/е$1ат

1.4. Теории существующего распределения генотипов

Глава 2 Материалы и методы

2.1. Места сбора образцов

2.2. Выделение в чистую культуру

2.3. Питательные среды

2.4. Определение типа спаривания

2.5. Изоферментный анализ

2.6. Определение гаплотипов митохондриальной ДНК

2.7. Определение наличия вставки в митохондриальном геноме

2.8. Анализ микросателитных повторов

2.9. Определение устойчивости к фунгицидам

2.10. Получение монозооспоровых изолятов

2.11. Статистический анализ данных

2.12. Генотирпирование

Глава 3. Результаты и обсуждение

3.1 Характеристика маркерных признаков штаммов Р. /я/е^от

3.2 Генотипический состав популяций

3.3 Устойчивость к металаксилу

3.4 Популяции Р. infestans в Республике Марий Эл

3.5 Изучение гетероплазмонов 100 ВЫВОДЫ 104 БЛАГОДАРНОСТИ 105 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 106 ПРИЛОЖЕНИЯ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Генотипический состав популяций и устойчивость к некоторым фунгицидам штаммов Phytophthora infestans (Mont.) de Bary из Республики Марий Эл и Московской области"

Оомицет Phytophthora infestans (Mont.) deBary — возбудитель фитофтороза картофеля и томата — уже более полутора столетий привлекает пристальное внимание исследователей из разных стран. Внезапно появившись в Европе в середине XIX столетия, он вызвал эпифитотию картофеля, оставшуюся в памяти многих поколений (Дьяков, Еланский, 2007). Но и по прошествии 150 лет проблема фитофтороза во всем мире далека от разрешения.

За это время созданы новые высокоэффективные фунгициды, системы прогнозирования эпифитотий, выведены устойчивые сорта культурных растений, разработаны технологические приёмы, позволяющие минимизировать потери от фитофтороза. Однако очень высокая изменчивость гриба сводит на нет многие усилия специалистов по защите растений. Появляются мутации устойчивости к фунгицидным препаратам, не влияющие на конкурентоспособность штамма в агроценозе. Параллельно происходит преодоление генов горизонтальной и вертикальной устойчивости. В результате агрессивность P.infestans возвращается на прежний уровень или даже усиливается.

Чтобы разработанные меры борьбы оставались эффективными, необходимо всестороннее изучение возбудителя фитофтороза, эпидемиологии заболевания, проведение постоянного мониторинга изменений, происходящих в его популяциях (Лаврова, Еланский, 2003).

На территории России фитофтороз встречается практически во всех регионах, занимающихся производством картофеля и томата. Причем структура популяций возбудителя фитофтороза в них различается.

Популяции, распространенные на территории сибирской и дальневосточной частей России, состоят из ограниченного числа клонов, генетические обмены между которыми крайне редки (Elansky et al., 2001). Это указывает на отсутствие рекомбинации или на ее незначительный вклад в популяционную структуру. С другой стороны, популяции европейской части России отличаются очень высоким генотипическим разнообразием: практически каждый штамм имеет свой уникальный генотип, что свидетельствует в пользу активного полового процесса и интенсивной гибридизации. В популяциях этого типа наиболее вероятно появление высокоагрессивных и устойчивых к фунгицидам штаммов.

Популяции Р. infestans исследованы на территории Центрального, Северо-Кавказского, Северо-Западного и некоторых других регионов европейской части России, в то же время практически нет данных о структуре популяций в среднем и нижнем Поволжье.

Целью предлагаемой работы было исследование генотипической структуры популяций и устойчивости к фунгицидам штаммов Р. infestans из Республики Марий Эл в сравнении с Московской областью и другими регионами России.

Для выполнения поставленной цели были сформулированы следующие задачи исследований:

1. Выделение изолятов в чистую культуру. Создание коллекции штаммов.

2. Тестирование независимых маркерных признаков: тип спаривания, спектр изоферментов пептидазы, гаплотип митохондриальной ДНК, структура микросателлитных повторов.

3. Изучение устойчивости штаммов к фунгицидам металаксил и манкоцеб.

4. Исследование возможности присутствия генетически различных митохондрий в мицелии одного штамма (гетероплазмоз) и их распространения в природных популяциях Р. infestan.

5. Сравнение структуры популяций в Республике Марий Эл и в других регионах России.

Заключение Диссертация по теме "Микология", Милютина, Дарья Игоревна

Выводы

1. В большинстве исследованных полевых популяций отмечено высокое генотипическое разнообразие, присутствуют штаммы обоих типов спаривания, выявлены два гаплотипа митохондриальной ДНК, разные генотипы локусов Рер1 и Рер2, причём наибольшее разнообразие выявлено у локуса Рер2.

2. Устойчивость к металаксилу штаммов, выделенных на частных огородах, была практически всегда ниже, чем у выделенных с крупных коммерческих полей, где применяли этот фунгицид. Однако не всегда прослеживается связь между применением металаксила и устойчивостью. По-видимому, устойчивость, накопленная в процессе непосредственного контакта с препаратом, может сохраняться в течение длительного времени и при отсутствии обработок.

3. Анализ устойчивости к манкоцебу в популяциях из Марий Эл показал сильное варьирование показателя ЕС5о (более, чем в 50 раз). В популяциях из Московской области и Беларуси (данные не приведены) различия штаммов по устойчивости были менее выражены.

4. Выявлены штаммы, имеющие генетически разные митохондрии в одном мицелии (гетероплазмоны). Гетероплазмоны были обнаружены в большинстве популяций Европейской части России.

5. Генотипирование популяций по трем маркерным признакам позволило выявить 12 генотипов. Наиболее часто встречались штаммы с четырьмя генотипами. Остальные генотипы встречались достаточно редко.

6. Популяции, выделенные в Республике Марий Эл как с картофеля, так и с томата, имели высокое генотипическое разнообразие. Генотипирование на основании 5 независимых маркерных признаков позволило выявить как общие для «картофельных» и «томатных» популяций генотипы, так и специфические, часто встречающиеся среди «картофельных» штаммов и отсутствующие на «томатных», и наоборот.

Благодарности

Автор выражает глубокую благодарность и признательность: своему научному руководителю Еланскому Сергею Николаевичу за полученные знания и помощь на всех этапах выполнения работы, заведующему кафедрой микологии и альгологии Дьякову Юрию Таричановичу за ценные советы, всестороннюю поддержку и интерес к работе, Побединской Марине Александровне, Апрышко Валентине, Шеину Сергею, Пляхневичу Михаилу за помощь в выполнении экспериментов и приобретенные навыки, а также всему коллективу кафедры за поддержку и создание дружественной атмосферы.

Огромное спасибо Глотову Николаю Васильевичу за полученные знания, помощь в статистической обработке данных и ценные советы.

Хочется выразить особую благодарность заведующей отделом аспирантуры биологического факультета Семиной Татьяне Ксенофонтовне и моим родителям Милютину Игорю Федоровичу и Милютиной Наталии Николаевне за неоценимую помощь и всестороннюю поддержку.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Милютина, Дарья Игоревна, Москва

1. Аникина М.И., Савенкова JI.B., Дьяков Ю.Т. Самофертильные изоляты Phytophthora infestans (Mont.) de Вагу // серия Биология/ Изд. АН СССР. 1997. №4. -С.414-418.

2. Ань Цзянли. Мутанты Phytophthora infestans (Mont/) de Вагу, устойчивые к диметоморфу.// Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Москва, 1996.

3. Аматханова Ф.Х., Дьяков Ю.Т., Петрунина Я.В., Побединская М.А., Еланский С.Н., Козловская И.Н., Козловский Б.Е., Морозова Е.В., Смирнов А.Н. Популяции Phytophthora infestans на Северном Кавказе // Микология и фитопатология, 2004, т. 38, в. 3, с. 71-78.

4. Багирова С.Ф. Phytophthora-. диагностика, идентификация, таксономическое положение // Новое в систематике и номенклатуре грибов. М.: Национальная академия микологии- медицина для всех,-2003.-293с.

5. Бардов В.Г., Омельчук С.Т., Седокур Л.К., Сасинович Л.М., Омельчук С.А., Гиренко Д.Б., Кириченко А.В. Токсикологическая характеристика и гигиеническое нормирование металаксила-м в продуктах питания и объектах окружающей среды // Интернет-ресурс

6. Воробьева Ю.В., Гриднев В.В., Кваснюк Н.Я. и др. Изменение состава популяций возбудителя фитофтороза картофеля // Защита растений, 1991, N 1, стр. 23-24.

7. Воробьева Ю.В., Кваснюк Н.Я., Гриднев В.В., Шемякина Е.П., Морозова Е.В., Кузнецова JÏ.H. Защита картофеля от фитофтороза в системе семеноводства // Защита растений. 1991. N5. С. 17—20.

8. Гаузе Г.Г. Митохондриальная ДНК. М., «Наука», 1997. 244 с.

9. Глотов Н.В., Животовский A.A., Хованов Н.В., Хромов-Борисов H.H. Биометрия: // Учеб. пособие под ред. Тихомировой. Д., 1982. - 264 с.

10. ГОСТ 12.1.007-76 Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности. М., 1976.

11. Государственный каталог пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории Российской Федерации, М., 2008.

12. Деревягина М. К. Резистентность Phytophthora infestans (Mont.) de Вагу к фунгицидам и пути ее преодоления // Диссертация на соискание ученой степени к. б. н. МГУ: М.,- 1991.

13. Деревягина М.К., Воловик A.C., Дьяков Ю.Т. Изменение чувствительности к ридомилу в жизненном цикле возбудителя фитофтороза картофеля Phytophthora infestnas и целесообразность весенних опрыскиваний //Микол. и фитопатол. 1991. Т. 25. С. 426—436.

14. Деревягина М.К., Дьяков Ю.Т. Влияние системных и контактных фунгицидов на поражение листьев картофеля фитофторозом // Микол. и фитопатол. 1990. Т. 24. С. 252—256.

15. Деревягина М.К., Долгова A.B., Дьяков Ю.Т. Мутанты Phytophthora infestans (Mont.) de Вагу, резистентные к фениламидным фунгицидам//Микология и фитопатология.- 1993.- Т.27, в. 3.

16. Долгова A.B., Дьяков Ю.Т. Генетика устойчивости возьудителя фитофтороза картофеля Phytophthora infestans (Mont.) de Вагу к фунгициду металаксилу //Генетика.- 1986.- Т. 22, № 10.

17. Дудка И. А., Бурдюкова JI. И. "Флора грибов Украины. Фитофторовые и альбуговые грибы // Киев. Наукова Думка, 1996.

18. Дьяков Ю. Т., Долгова А. В., Рыбакова И.Н. оценка резистентности возбудителя фитофтороза картофеля к фунгициду металаксилу// С-х. биология.-1988ю-№ 1.- С.-135-139.

19. Дьяков Ю.Т. Популяционная биология фитопатогенных грибов. М.: Изд. Дом «Муравей»,- 1998.- 381 с.

20. Дьяков Ю.Т., Озерецковская О.Д., Джавахия В.Г., Багирова С.Ф. Общая и молекулярная фитопатология // М., Общество фитопатологов, 2001, 301 с

21. Дьяков Ю.Т., Шнырева A.B. Сергеев Ю.В. Введение в генетику грибов: учеб. пособие для студ. ВУЗов // М.: изд. центр «Академия», 2005. -304 с.

22. Дьяков Ю.Т., Еланский С.Н. Популяционная генетика Phytophthora infestans. В кн.: Микология сегодня. Т. 1. Под ред. Дьякова Ю.Т., Сергеева Ю.В. М.: Национальная академия микологии, 2007, с. 107-139.

23. Еланский С. Н. Популяции Phytophthora infestans на территории России // Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук, МГУ, Москва, 1998, 110 с.

24. Еланский С.Н., Долгова A.B., Смирнов А.Н., Дьяков Ю.Т. Популяции Phytophthora infestans в Московской области. 1. Системы размножения. // Микология и фитопатология, 1999, т. 33, в.5, с. 346-352.

25. Еланский С.Н., Багирова С.Ф., Смирнов А.Н., Дьяков Ю.Т. Популяции Phytophthora infestans в Московской области. 2. Сравнение популяций, паразитирующих на картофеле и томатах // Микология и фитопатология, 1999, т. 33, в.5, с. 353-359.

26. Еланский С.Н., Апрышко В.П., Милютина Д.И., Козловский Б.Е. Устойчивость российских штаммов Phytophthora infestans к фунгицидам металаксил и диметоморф // Вестник Московского Университета. Сер. 16. Биология. 2007. N1. С. 14-18.

27. Жизнь растений, под ред. Горленко М.В. М.: Просвещение, 1976. -Т.2.-479 с.

28. Жимулев И.Ф. Общая и молекулярная генетика: Учеб.пособие. 2-е изд., исп. и доп. - Новосибирск: Сиб.унив. изд-во, 2003. - 479 с.

29. Иванюк В.Г., Журомский Г.К., Авдей О.В. Микроэволюция Phytophthora infestans в условиях Белоруссии. // Микология и фитопатология, 2002, т.36, с. 81-90.

30. Иванюк В.Г., Банадысев С.А., Журомский Т.К. Защита картофеля от болезней, вредителей и сорняков. Минск, Белпринт, 2005, 696с

31. Лаврова О.И., С.Н. Еланский Идентификация SINE-подобных элементов в геноме Phytophthora infestans и оценка возможности их применения для сравнительного анализа штаммов//Журнал Российского фитопатологического общества, 2003, т.4, с. 39-45.

32. Лихачёв А.Н. Мониторинг основа рационального применения фунгицидов // Защита растений, 1991, №11, с.13-14

33. Малеева Ю.В. Вариабельность митохондриального генома Phytophthora infestons (Mont) de Вагу и структурная перестройка современных популяций гриба на территории России.// Автореф. дис. на соискание ученой степени к.б.н., МГУ: М., 1996.-16 с.

34. Мюллер Э., Леффлер В. Микология.- М.: Мир, 1995, 345 с.

35. Симаков Е.А., Анисимов Б.В., Склярова Н.П., Яшина И.М., Еланский С.Н. Сорта картофеля, возделываемые в России-2005. Каталог.// М., Картофелевод, 2005, 112 с.

36. Симаков Е.А., Анисимов Б.В., Еланский С.Н. Сорта картофеля, возделываемые в России: ежегодное справочное издание. — М., 2008. 88 с.

37. Смирнов А.Н. Популяционная структура фитопатогенного гриба Phytophthora infestans в Московской области в 1991-1996 гг. // Автореф. дис. на соискание ученой степени к.б.н., МГУ: М., 1996. —24 с.

38. Смирнов А.Н., Кузнецов С.А., Еланский С.Н. Изучение биологии возбудителя фитофтороза картофеля // Доклады ТСХА, вып. 273, ч. 1, с. 226-232.

39. Справочник пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории Российской Федерации (2007) // М.: Агрорус.

40. Трус С. М., Козловский Б. Е. Влияние температуры на характер прорастания спорангиев изолятов Phytophthora infestans (Mont) d By., различающихся по чувствительности к металаксилу.- 1994.- Т. 28, вып. 2.- С. 54-58.

41. Филиппов А. В., Рогожин А. Н., Кузнецова М. А., Спиглазова С. Ю., Дьяков Ю. Т. Защита картофеля от фитофтороза. Рекомендации. // М. «Общество фитопатологов», 2001.

42. Abu-El Samen F.M., Secor G.A., Gudmestad N.C. Genetic variation among asexual progeny of Phytophthora infestans detected with RAPD and AFLP markers // Plant Pathology. 2003. V.52, P. 314—325.

43. Ainsworth J, Bisby, H. Dictionary of the fimgy // 8-th edition, New-York, London, 1995

44. Baider and Y. Cohen. Synergistic Interaction between BABA and Mancozeb in Controlling Phytophthora infestans in Potato and Tomato and Pseudoperonospora cubensis in Cucumber// Phytoparasitica 2003. 31(4) P. 399409

45. Bruck R. I., Fry W. E , Apple A.E. Effect of metalaxyl an acylalanine fungicide on developmental stages of Phytophthora infestans II Phytopathology, 1980, v. 70, pp. 597- 601.

46. Carlisle D.J., Cooke L.R., Brown A.E. Phenotypic and genotypic characterization of Northern Ireland isolates of Phytophthora infestans // Europ. J. of Plant Pathology. 2001. V. 107, N 3. P. 291—303

47. Carter D. A., Archer S. A., Buck K. W., Shaw D. S., Shattock R. C. Restriction fragment length polymorphisms of mitochondrial DNA of Phytophthora infestans // Mycological Research.- 1990.- Vol. 94,- P. 1123-1128.

48. Cohen, Y. E -aminobutyric acid-induced resistance against plant pathogens // Plant Dis. 2002. V.86 P.448-457.

49. Cohen Y., Reuveni M., Eyal H. T. The systemic antifungal activity of ridomil against Phytophthora infestans on tomato plants // Phytopathology, 1979, v. 69, pp. 645 649.

50. Cohen Y., Baider A., Cohen B. Dimethomorph activity against oomycete fungal plant pathogens //Phytopathology.- 1995.- Vol.85, № 12.

51. Cohen Y., Farkash S., Reshit Z., Baider A. Oospore production of Phytophthora infestans in potato and tomato leaves // Phytopathology. 1997. — V. 87.-P. 191-196.

52. Cohen Y., Reuveni M., Eyal H. T. The systemic antifungal activity of ridomil against Phytophthora infestans on tomato plants // Phytopathology, 1979, v. 69, pp. 645 649.

53. Daggett S. S. & Gotz E. Mating type, metalaxyl sensitivity and allozyme phenotypes of Phytophthora infestans from Germany // Phyt. newsl., 1991, № 17.

54. Davidse L. C. Resistance to acylalanines in Phytophthora infestans in the Netherlands // OEPP/EPPO Bulletin.- 1985.- Vol. 15. P. 403 409.

55. Davidse L. C., Looyen D., Turkensteen L. J. & Van der Wal D. Occurence of metalaxyl-resistant strains of Phytophthora infestans in Dutch potato fields // Netherlands Journal of Plant Pathology, 1981, v. 87, pp. 65 68.

56. Davidse L. C., Danial D. L., Van Westen C. J. Resistance to metalaxyl in Phytophthora infestans in The Netherlands // Netherlands Journal of Plant Pathology.- 1983.- Vol. 89.- P. 1 20.

57. Davidse L. C., Van den Berg-Velthuis, Mantel B. C., Jespers A. B. K. Phenylamides and Phytophthora // Phytophthora, chapter 23/ Eds.: J. A. Lucas, R. C. Shattock, D. S. Shaw, L. C. Cooke.- Camridge: Univ. Press, 1991.- P. 234 -241.

58. Dolgova A.V., Dyakov Yu. T., Smirnov A. Distribution of mating types and vegetative compatibility groups in populations of Phytophthora infestans from Russia, Belorussia and Estonia // Phytophthora newsletter, 1992, № 18, pp. 4-5.

59. Dowley L. J. Factors affecting the survival of metalaxyl-resistant strains of Phytophthora infestans (Mont.) de Bary in Ireland. //Potato Res., 1987, 30, 473-75.

60. Dowley L. J., O'Sullivan E. Sporulation of Phytophthora infestans (Mont.) de Bary on the surface of diseasedpotatoes and tuber to tuber spread during handling //Potato Research.- 1991.-Vol. 34.- P. 295-296.

61. Dowley L. J., O'Sullivan E. Sporulation of Phytophthora infestans (Mont.) de Bary on the surface of diseasedpotatoes and tuber to tuber spread during handling // Potato Research.- 1991.-Vol. 34,- P. 295-296.

62. Eckert J.W. Historical development of fungicide resistance in plant pathogens. In: Fungicide Resistance in North America. (C.J. Delp ed.)// American Phytopathological Society. 1988. St. Paul. MN, USA. P. 1-3.

63. Elansky S. N., Smirnov A. N. Second locus of Peptidase as a marker for genetic investigations of Phytophthora infestans 11 Botanica Lithuanica, 2003, 9(3), 275-283.

64. Flier W. G., Griinwald N. J, Fry W. E., Turkensteen L. J. Formation, production and viability of oospores of Phytophthora infestans from potato and Solanum demissum in the Toluca Valley, central Mexico II Mycol. Res. 2001. -Vol. 105 (8).-P. 998-1006

65. Flier W.G., Kessel G.J.T., Shepers H.T.A.M. The impact of oospores of Phytophthora infestans on late blight epidemics // Plant dreeding and seed science. 2004. V. 50. P. 5—13.

66. Folkerstsma R. T., Shattock R. C. & Shaw D. S. Genotypes of Phytophthora infestans from Gwynedd, Wales, 1978, 1982, 1987 // Phytoph. newsl., 1992, 18

67. FRAC methods for monitoring fungicide resistence. Bull.OEPP. Oxford etc., 1991, v.21, №2, p.291-354.

68. Fry W.E., Bruck R. I. , Mundt C.C. Retardation of potato late blight epidemics by fungicides with eradicant and protection properties // Plant Disease Reporter.- 1979.- Vol. 63.- P. 970 974

69. Fry W.E., Spielman L.J. Population biology // in: Advances in Plant Pathology. Phytophthora infestans the cause of late blight of potato, edited by D. S. Ingram , P. . Williams, Academic Press, London, 1991, v. 7, pp. 171 192.

70. Fry W.E., Goodwin S.B., Matutszak J.M., Spielman L.J., Milgroom M.G., Drenth, A. Population genetics and intercontinental migrations of Phytophthora infestans II Annu. Rev. Phytopathol., 1992, v. 30, pp. 107 129.

71. Fry W. E., Goodwin S. B., Dyer A. T., Matutzak J.M., Drenth A., Tooley P. W., Sujkowski L. S., Koh Y. J., Cohen B. A., Spielman L. J., Deahl K. L., Inglis114

72. D. A. , Sandlan K. P. Historical and recent migrations of Phytophthora infestans: chronology, pathways and implications // Plant Disease, 1993, v. 77, pp. 653 661

73. Fry W.E., Goodwin S.B. Recent migrations of Phytophthora infestans //In "Phytophthora infestans 150". L. T. Dowly et al. editors. Dublin, Ireland. 1995. P. 89—95.

74. Galindo J. & Gallegly M. E., The nature of sexuality in Phytophthora infestans II Phytopathology, 1960, v. 50, pp. 123-128.

75. Gisi U., Binder H., Rimbach E. Sinergistic interactions of fungicides with different modes of action.//Trans. Br. Mycol. Soc., 1985, 85, pp. 299-306.

76. Gisi, U. Synergistic interaction of fungicides in mixtures// Phytopathology 86. 1996. P.1273-1279.

77. Gisi, U., and Cohen, Y. Resistance to phenylamide fungicides: A case study with Phytophthora infestans involving mating type and race structure. Annu. Rev. Phytopathol. 1996. V.34 P.549-572.

78. Goodwin S.B. DNA polymorphism in Phytophthora infestans: the Cornell experience // Phytophthora/ Ed.: J. A. Lucas, R. C. Shattock, D. S. Shaw, L. C. Cooke.- Cambridge: Univ. Press.- 1990.- P. 234 -241.

79. Goodwin S. B., Spielman L. J., Matuszak J. M., Bergeron S. N., Fry W. E. Clonal diversity and genetic differentiation of Phytophthora infestans populations in northern and central Mexico // Phytopathology, 1992, v. 82, pp. 955 -961.

80. Goodwin S. B., Cohen B. A. & Fry W. E. Panglobal distribution of a single clonal lineage of the Irish potato famine fungus // Proc. Natl. Acad. Sci. United States.- 1994.-vol. 91.-P. 11591-11595

81. Goodwin S. B., Sujkovski L. C., Fry B. E. Rapid evoluation of pathogenicity within clonal lineages of the potato late blight disease fungus // Phytopathology.- 1995.- Vol. 85.- P. 669 676.

82. Goodwin S.B., Drenth A. Origin of the A2 mating type of Phytophthora infestans outside Mxico // Phytopathology.- 1997.- Vol. 87.- P. 992-999.

83. Griffith G.W., Shaw D.S. Polymorfism in Phytophthora infestans: four mitochondrial haplotypes are detected after PCR amplification of DNA from pure115culture or from host lesion // Applied and Env. Microbiol. 1998. Vol.64, № 10. P. 4007—4014.

84. Grinberger M., Kadish D.,Cohen Y. Infectivity of metalaxyl-sensitive and resistant isolates of Phytophthora infestans to whole potato tubers as affected by tuber ageing and storage. //Phytoparasitica, 1995, 23, pp. 165-75.

85. Harrison B. J. The genetics of Phytophthora infestans 11 Ph. D. thesis, Univ. of North Wales, Bangor, 1991.

86. Hebert P.D.N., Beaton M.J.: Methodologies for allozyme analysis using cellulose acetate electrophoresis. A practical handbook. Guelph, Ontario. An educational service of Helena laboratories.-1993.

87. Holmes S. J. I. Chemical control of late blight of potatoes // Proceedings of Crop Protection in Northern Britain.- 1981.- P. 119 124.

88. Hori M. Survey of potato late blight pathogen {Phytophthora infestans) at various locations in Japan // Ann. Phytopathol. Soc. Jpn., 1938, v. 8, pp. 66-67.

89. Judelson H.S., Roberts, S. Multiple loci determining insensitivity to phenilamide fungicides in Phytophthora infestans II Phytopathology. 1999. V. 89, N 9. P. 754-760.

90. Kable P.F., Jeffery H. Selektion for tolerance in organisms exposed to sprays of biocide mixtures: A theoretical model // Phytopathology, 1980, v. 70, p. 8-12.

91. Kadish D., Cohen Y. Fitness of Phytophthora infestans isolates from metalaxyl-sensitive and resistant populations // Phytopathology,- 1988.- Vol. 78,-P. 912-915.

92. Kadish D., Cohen Y. Overseasoning of metalaxyl-sensitive and metalaxyl-resistant isolates of Phytophthora infestans in potato tubers // Phytopathology. 1992. V.82.P. 887—889.

93. Kato M., Mizubuti E.S., Goodwin S.B., Fry W.E. Sensitvity to protectant fungicides and pathogenic fitness of clonal lineage of

94. Phytophthora infestans in the United States // Phytopathology. 1997. 87. P. 973—978.

95. Kato M., Sato N., Takahashi K., Shimaniki T. Yearly change of frequency and geographic diatribution of A2 mating type isolates of Phytophthora infestans in Japan from 1987 to 1993 11 Ann. Phytopathol. Soc. Japan. 1999. V.64. P. 168—174.

96. Kessel G.J.T., Turkensteen L.J., Schepers H.T.A.M., Van Bekkum P.J., Flier W.G. P. infestans oospores in the Netherlands: occurence and effects of cultivars and fungicides. PPO-Special Report. - 2002. - № 8. -P. 203-209.

97. Klimczak L.J., Prell H.H. Isolation and characterization of mitochondrial DNK of the oomycetous fungus Phytophthora infestans // Current Genetics.-1984,- Vol. 8,-P. 323-326.

98. Knapova, G, Tenzer, I., Gessler, G., Gisi, U. Characterization of Phytophthora infestans from potato and tomato with moleculare markers // Proceedings of the 5th congress of the European Foundation for Plant Pathology. Taormina, Italy. 2001. P. 6—9.

99. Knapova G., Gisi U. Phenotypic and genotypic structure of Phytophthora infestans population on potato and tomato in France and Switzerland // Plant Pathol. 2002. V.51. P. 641—553.

100. Ko W.H. Heterothallic Phytophthora. Evidence for hormonal regulation of sexual reproduction // J. Gener / Microbiol. 1978. Vol. 107.-P. 15-18.

101. Ko W. H. Hormonal regulation of sexual reproduction in Phytophthora II J. Gen. Microb., 1980. V. 116. P. 459-463.

102. Ko W. H. Reversible change of mating type in Phytophthora infestans II J. Gen. Microbiol. 1981. V. 125. P. 451-454.

103. Ko W.H. An alternative possible origin of the A2 mating type of Phytophthora infestans outside Mexico // Phytopathology. 1994. V. 84. P. 12241227.

104. Koh, Y. J., Goodwin, S. B., Dyer, A. T., Cohen, B. A., Ogoshi, A., Sato, N., and Fry, W. E. Migrations and displacements of Phytophthora infestans populations in East Asian countries// Phytopathology. 1994 V.84 P. 922-927.

105. Leberton L., Andrivon D. French isolates of Phytophthora infestans from potato and tomato differ in phenotype and genotype // Phytopathology. 1998. V. 88. P. 583—594

106. Mueller U.G., Wolfenbarger L.L. AFLP genotyping and fingerprinting // TREE. 1999. V.14, N. 10. P. 389-394.

107. Miller J.S., Hamm P.B., Johnson D.A. Characterization of the Phytopththora infestans populations in the Columbia basin of Oregon and Washington from 1992 to 1995 // Phytopathology. 1997. V.87. P. 656—660.

108. Niederhauser J.S. International cooperation in potato research and development//Ann. Rev. Phytopathol. 1993. V.31. P. 1—21.

109. Oostendorp, M., Kunz, W., Dietrich, B. and Staub, T. Induced disease resistance in plants by chemicals//Eur. J. Plant Pathol. 2001. V.107 P.19-28.

110. Perez T., Albornoz J., Dominguez A. An evaluation of RAPD fragment reproducibility and nature // Mol.Ecol. 1998. V.7. P. 1347 1358.

111. Perez, W. G., Gamboa, J. S., Falcon, Y. V., Coca, M., Raymundo, R. M., and Nelson, R. J. Genetic structure of Peruvian populations of Phytophthora infestans!I Phytopathology. 2001 V. 91 P. 956-965.

112. Ristanio J.B., Groves C.T., Parra G.R. PCR amplification of the irish faminepathogen from historic speciments // Nature. 2001. - Vol.411. — P. 695— 697.

113. Rubin E., Baider A., Cohen Y. Phytophthora infestans produced oospores in fruits and seeds of tomato //Phytopathology. 2001. V.91. P. 1074-1080.

114. Sansome E., Brasier C.M., Hamm P.B. Phytophthora meadii may be a species hybrid // Mycol. Res. 1991. V.95. P. 273-277.

115. Samoucha Y., Cohen Y. Phytopathology, 1984, 74, p.811.

116. Samoucha, Y., Cohen Y. Synergy between metalaxyl and mancozeb in controlling downy mildew in cucumbers// Phytopathology/ 1984. V.74 P. 14341437.

117. Samoucha, Y., Cohen Y. Synergistic interactions of cymoxanil mixtures in the control of metalaxyl-resistant Phytophthora infestans of potato// Phytopathology. 1988. V.78 P. 636-640.

118. Samoucha, Y., Levy, R.S. and Cohen, Y. Efficacy over time of cymoxanil mixtures in controlling late blight in potatoes incited by a phenylamide-resistant isolate of Phytophthora infestansll Crop Prot. 1988. V.7 P. 210-215.

119. Sansome E. Reciprocal translocation, heterozygosity in heterothallic species of Phytophthora and its significance // Trans. Brit. Mycol. Soc., 1980, v. 84, pp. 87-93.

120. Savelkoul P.H., Aarts H.J.M., de Haas J., Dijkshoorn L., Duim B., Otsen M., Rademaker J.L.W., Schouls L., Lenstra J.A. Amplified Fragment Lenth Polymorphism analisys: the State of the Art // Journal of Clinical Microbiology. Oct. 1999. P. 3083—3091.

121. Schwinn F.J., Staub T. Biological properties of metalaxyl. In "System Fungizides and Antifimgale Verbindungen" // 6 Internat. Symp. Abh. Akad. Wiss. DDR. 1980. P. 123—133.

122. Schwinn F.J., Margot, P. Control with chemicals.//In: Advances in Plant Pathology, v.7,pp.225-265.

123. Shattock R.C., Shaw D.S. Novel phenotypes of Phytophthora infestans from mixed cultures of antibiotic resistant mutants // Transact. British Mycol. Soc. 1976. V.67. P. 201—206.

124. Shattock R. C. Studies on the inheritance of resistance to metalaxyl in Phytophthora infestans II Plant Pathology. 1988. - V. 37. - P 4 - 11.

125. Shaw D.S. The breeding system of Phytophthora infestans: the role of the A2 mating type// In: Genetics and patogénesis. Day P.R., Jellis G.J. eds. Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1987, p. 161-164

126. Shaw D. S. Genetics // in: Advances in Plant Pathology. Phytophthora infestans the cause of late blight of potato, edited by D. S Ingram , P. H. Williams, Academic Press, London, 1991, v. 7, pp. 131 170.

127. Smith J. M. The use of metalaxyl for the control of downy mildew diseases Proceedings, 1979, British Crop Protection Conference, Pests and Diseases, v. 1, pp. 331 339.

128. Spielman L. J. Isozymes and the population genetics of Phytophthora infestans II in Phytophthora. J. A. Lucas, R. C. Shattock, D. S. Shaw, L. C. Cooke, eds, Camridge Univ. Press, Cambridge, 1991, pp. 234 -241.

129. Staub T., Dahmen H., Schwinn F. J. Biological characterisation of uptake and translocation of fimgicidual acylalanines in grape and tomato plants // Z. Phlanzenschultz, 1978, v. 85, pp. 162 168.

130. Staub T., Dahmen H., Schwinn F. J. Effect of ridomil on their host plants (Abstr.) II In: Abstacts of Papers of 3rd Int. Cong. Plant Pathol., 1978, Munchen, Germany.

131. Sujkovski L. S., Goodwin S. B., Dyer A. T., Fry W. E. Increased genotypic diversity via migration and possible occurence of sexual reproduction of Phytophthora infestans in Poland // Phytopathology. 1994. V.84. P. 201—207.

132. M. C. Teixeira, T. Simoes, P. M. Santos, P. J. Dias and I. Sá-Correia Global analysis of the mechanisms underlying yeast resistance and response to the fungicide mancozeb //Nucleic Acids Research. 2006. V.34 P.446-451

133. Thomas A, Albert G, Schlosser E. Use of video-microscope systems to stady the mode of action of dimethomorph on Phytophthora infestans.il Med. Fac. Landbouww. Univ. Gent. 1992, 57/2a.

134. Tomlin C.D.S. The Pesticide Manual, 12th edition// British Crop Protection Council, Surrey UK. 2000. P. 578-580.

135. Walker A.S.L., Cooke L.R. The survival of phenilamide resistant strains of Phytophthora infestans in potato tubers//Proc. Br. Crop Prot. Conf., 1988, 1, 35358.

136. Walker A.S.L., Cooke L.R. The survival of Phytophthora infestans in potato tuber the influence of phenilamide resistance. //Proc. Br. Crop Prot. Conf., 1990,3, 1109-14.