Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ооспорообразование в природных популяциях Phytophthora infestans

ВАК РФ 03.02.12, Микология

Автореферат диссертации по теме "Ооспорообразование в природных популяциях Phytophthora infestans"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. Ломоносова Биологический факультет

Ои

На правах рукописи

АПРЫШКО ВАЛЕНТИНА ПЕТРОВНА

ООСПОРООБРАЗОВАНИЕ В ПРИРОДНЫХ ПОПУЛЯЦИЯХ

рнуторнтноиа трЕятлт (мот.) эе бляу

Специальность 03.02.12 - микология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

О 4 ОКТ 2012

Москва - 2012

005052686

Работа выполнена на кафедре микологии и альгологии биологического факультета Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова

Научный руководитель: доктор биологических наук

профессор Дьяков Юрий Таричанович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Терехова Вера Александровна

кандидат биологических наук Деревягина Марина Константиновна

Ведущая организация: Татарский НИИ Сельского Хозяйства

Россельхозакадемии, г. Казань

Защита диссертации состоится 26 ноября 2012 г. в 15.30 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.46 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, Биологический ф-т, тел./факс (495) 939-39-70.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета

Автореферат разослан «_»_2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, ___.

кандидат биологических наук М.А. Гусаковская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Оомицет Phytophthora infestons является возбудителем широко распространенного заболевания растений -фитофтороза, которое представляет серьезную опасность для картофеля и томата. Потери урожая картофеля в России вследствие заболевания фитофторозом превышают 4 млн. тонн, что составляет более 10% урожая.

Борьба с фитофторозом затруднена из-за высокой вариабельности возбудителя, его легкой адаптации к выращиваемым сортам растений и появления устойчивых к фунгицидам штаммов. Появление генетически разнообразных штаммов патогена с высоким потенциалом адаптивности к условиям среды, отличающихся повышенной агрессивностью и способностью вызывать раннее наступление болезни, может быть обусловлено, в частности половой рекомбинацией. В результате полового процесса образуются ооспоры, способные выживать при неблагоприятных условиях и служить первичным инокулюмом при возобновлении эпифитотий.

Наиболее интенсивно ооспоры образуются при встрече мицелиев разного типа спаривания. Поэтому предпринятое нами изучение распределения штаммов с разными типами спаривания в популяциях разных регионов важно с точки зрения потенциальной возможности образования ооспор и гибридизации в пораженных фитофторозом образцах. Изучение встречаемости ооспор в разных органах растений, в образцах с одним и несколькими очагами болезни может позволить лучше понять основные закономерности ооспорообразования в российских популяциях и его взаимосвязь с интенсивностью развития болезни, растениями-хозяевами, распределением в популяции штаммов с разными типами спаривания.

Цель работы: изучение ооспорообразования в природных популяциях и роли полового процесса в жизненном цикле P. infestons. Для выполнения этой цели были поставлены и решены следующие задачи:

1. Выделение изолятов P. infestans в чистую культуру и создание

коллекции штаммов.

2. Изучение распределения изолятов P. infestans разных типов спаривания в разных органах картофеля и томата в разные периоды эпифитотии. Сравнительный анализ агрессивности изолятов разного типа спаривания.

3. Изучение ооспорообразования в различных органах картофеля и томата в природных популяциях P. infestans.

4. Изучение распространения самофертильных штаммов в полевых популяциях P. infestans и оценка образования ооспор в природных образцах картофеля и томата с одним очагом заболевания и с самофертильным мицелием P. infestans.

5. Проверка возможности образования гибридных ооспор штаммами P. infestans популяций Московской области in vitro и анализ гибридности их моноооспоровых потомков.

Научная новизна.

Впервые на большом фактическом материале исследовано наличие ооспор в пораженных фитофторозом органах картофеля и томата из разных регионов, с разным количеством очагов заболевания; проведено сравнение наличия ооспор в образце с типом спаривания выделенных из него штаммов; исследована зависимость присутствия образцов с ооспорами от распределения штаммов разного типа спаривания в популяции; разработан оригинальный метод получения моноооспоровых изолятов, отличающийся от аналогов меньшей трудоемкостью в применении и позволяющий исключить прорастание других структур мицелия, кроме ооспор.

Практическая значимость работы.

Возможность ооспорообразования и гибридизации в полевых популяциях обязательно следует учитывать при планировании защитных мероприятий. Поэтому предпринятое нами изучение присутствия ооспор в пораженных фитофторозом образцах картофеля и томата из разных регионов

и связь ооспорообразования с распределением штаммов разных типов спаривания в популяции имеет высокую практическую значимость.

Апробация работы.

Основные положения работы обсуждались на Научно-практической конференции "Научное обеспечение картофелеводства России: состояние, проблемы" (Москва, 2001), Международном симпозиуме "Проблемы изучения и охраны биоразнообразия и природных ландшафтов Европы" (Пенза, 2001), Международной научной конференции "Биология, систематика и экология грибов в природных экосистемах и агрофитоценозах" (Минск, 2004), Втором съезде микологов России (Москва, 2008).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе 1 в изданиях по перечню, рекомендованному ВАК РФ.

Объем и структура диссертации.

Работа изложена на 152 страницах машинописного текста, содержит 22 таблицы и 25 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы, содержащего 206 отечественных и зарубежных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1. Обзор литературы

В обзоре литературы приведены сведения по систематике, биологии, вредоносности возбудителя фитофтороза, особенностях полового процесса и образования ооспор P. infestons в природе и in vitro. Приведен обзор работ по анализу некоторых маркеров, применяемых для популяционных исследований P. infestons.

Глава 2. Материалы и методы исследований

Сбор пораженных фитофторозом образцов проводили в 1999-2006 годах в различных районах России. С одного растения брали не более одного

образца, по возможности на поле выбирали растения, отстоящие друг от друга не менее чем на 10 м.

Выделение изолятов Р. т/юЮт производили в лабораторных условиях из пораженных фитофторозом органов растений (листьев, плодов, стеблей, клубней) с использованием метода влажных камер.

Определение типов спаривания проводили методом попарного культивирования исследуемого изолята с тестерными штаммами с известными типами спаривания (А1 либо А2) на агаризованной овсяной среде. Если исследуемый изолят образовывал ооспоры только с тестером А2 типа спаривания и не образовывал их с А1, то его относили к типу совместимости А1. Если исследуемый щтамм образовывал обильные ооспоры с А1 и не образовывал их с А2, то его относили к типу совместимости А2. В случае, если исследуемый штамм образовывал ооспоры с обоими тестерами, его учитывали как А1А2, если не образовывал ооспоры ни с одним тестером, то его считали стерильным (00).

Определение встречаемости ооспор в пораженных образцах. Пораженные фитофторозом листья и стебли обесцвечивали с использованием хлорсодержащих препаратов. Плоды и клубни разрезали, срезы с фитофторозными пятнами оставляли во влажных камерах до их сшивания. Образцы микроскопировали.

Оценка образования ооспор Р. т/^апя в монокультуре. Изоляты Р. т/евШт инкубировали в монокультуре 2 месяца на агаризованной овсяной среде при комнатной температуре, затем микроскопировали. Штаммы, образовавшие ооспоры, считали самофертильными.

Оценку агрессивности изолятов Р. т/е$1ат проводили на клубнях двух сортов картофеля с разным уровнем неспецифической устойчивости к фитофторозу: Луговской и Сантэ. Индекс агрессивности патогена вычисляли

по формуле х = Х Ь', где Х- индекс агрессивности; а, - средняя величина

л

поражения, мм; Ь,- средняя интенсивность спороношения, балл; п-

количество заражений по методу, разработанному во ВНИИ Фитопатологии (Filippov et al, 2000).

Определение устойчивости к металаксилу проводили на овсяной агаризованной среде. Чувствительность изолятов оценивали по скорости радиального роста колонии на среде с фунгицидом металаксилом и без него. Чувствительность изолятов оценивали по скорости радиального роста колонии на среде, содержащей 10 мкг/мл фунгицида, и без него. Изолят считался чувствительным (S), слабоустойчивым (SR) или устойчивым (R), если относительная скорость роста его колонии на среде с фунгицидом в сравнении со средой без фунгицида была менее 0,1; от 0,1 до 0,4 или более 0,4, соответственно. При этом устойчивые штаммы должны были расти на среде с концентрацией действующего вещества 100 мкг/мл. Для каждого изолята тест повторяли трижды.

Получение ооспор P. infestans проводили путем попарного скрещивания изолятов, различающихся по типу спаривания и по изоферментам локуса 2 пептидазы, на агаризованной овсяной среде с добавлением лецитина. Пары культивировали 14-30 суток при 18°С в темноте, в другом варианте в темноте 15 суток, затем 30 суток под голубым флюоресцентным светом лампы «Black light fluorescent F20T12/BLB», Philips. Для созревания ооспор культуры выдерживали 1-Л недели при 4°С. Затем из чашек вырезали содержащие ооспоры агаровые блоки и гомогенизировали их. Суспензию фильтровали через нейлоновое сито, центрифугировали, супернатант отделяли.

Анализ жизнеспособности ооспор Р. infestans проводили по методу окрашивания метилтиазолилдифенил-тетразолиума бромидом (МТТ) (Medina, Platt, 1999).

Получение моноооспоровых потомков Р. infestans. Предварительно сравнили несколько методов стимуляции прорастания ооспор и уничтожения вегетативных структур Р.infestans, описанных в литературе (Turkensteen et al., 2000, Rastas et al., 2006, Аникина, 1994; Багирова, Дьяков, 1998) и

разработанных нами. Наилучшие результаты показал разработанный нами метод, заключающийся в обработке ооспор коммерческой смесью ферментов, обладающих ß-глюканолитической, целлюлозолитической, протеолитической и хитинолитической активность, Lising Enzymes from Trichoderma harzianum, Novozyme Corp., Sigma #L1412. В концентрации 1,7% в течение 12 часов раствор Lising Enzymes уничтожал все вегетативные структуры P. infestons. Все анализируемые в нашей работе потомки получены с использованием данного метода.

Проращивание ооспор. Обработанную вышеуказанным методом суспензию ооспор распределяли с помощью шпателя по поверхности тонкого слоя голодного агар-агара. Ооспоры инкубировали 14-30 дней при 15°С под голубым флюоресцентным светом с фотопериодом 16 часов. Чашки просматривали через каждые 24 часа под микроскопом. Вырезали агаровые блочки с одной проросшей ооспорой, помещали на агаризованную овсяную среду, культивировали при 18°С в темноте.

Спектр изоферментов определяли методом электрофореза на целлюлозоацетатных гелях согласно рекомендации производителя Helena Laboratories Inc. (Hebert, Beaton, 1993) с небольшими модификациями (Elansky, Smirnov, 2003).

Статистическую обработку данных проводили при помощи электронных пакетов программы Excel.

Глава 3. Результаты и обсуждение Встречаемость изолятов P. infestons с типами спаривания AI и А2

Тип спаривания определяли у изолятов, собранных в течение восьми лет. Всего протестировано 2000 изолятов, из них: Московская область - 1638 (из картофеля и томата), прочие регионы - 362.

Большинство протестированных полевых популяций P. infestons Московской области представлены изолятами обоих типов спаривания. В среднем за период измерений соотношение типов спаривания AI и А2 составило 52% и 48%, соответственно. Изоляты, образующие ооспоры с

тестерами обоих типов спаривания (далее А1А2), встречались редко и в картофельных, и в томатных популяциях. В группе изолятов Р. т]е$1ат Московской области, выделенных из картофеля, все типы спаривания присутствовали приблизительно в равном соотношении: А1 : А2 : А1А2 = 1 : 1,08 : 0,01, а на томате А1 тип спаривания слегка преобладал над А2 -А1 : А2 : А1А2 = 1 : 0,68 : 0,006.

Разница встречаемости изолятов Р. ¡п/е,иат А2 типа спаривания на картофеле и томате была статистически значима (коэффициент Стьюдента, I = 3,9,1о,о^2бз =1,97).

Изучение типа спаривания изолятов Р. т/евгат, выделенных из разных органов картофеля и томата (листья, стебли, плоды и клубни). На участках, удаленных от прочих посадок картофеля и томата, были заложены в непосредственной близости друг от друга делянки картофеля сорта Синеглазка и томата сорта Талалихин - 186. Органотропной специализации у изолятов Р. т^Ьапв разных типов спаривания не было выявлено. В целом по Московской области встречаемость изолятов Р. т]е$1ат А2 типа спаривания была спаривания была приблизительно одинакова в группах изолятов, выделенных с листьев картофеля и томата, плодов томата и клубней картофеля. Выявленные различия в долях изолятов А2 типа спаривания были статистически недостоверны (Рис. 1).

100 -

-

56

52 -146

-

КЛ ТЛ ТП КК КС *

Сокращения в рисунке: кп - листья картофеля, тл - листья томата, тп - плоды томата, кк -клубни картофеля, кс - стебли картофеля.

* Для данных по типу спаривания изолятов P. infestons, выделенных из стеблей картофеля, стандартная ошибка не вычислялась, так как эта группа представлена всего одной популяцией.

Рисунок 1.

Встречаемость изолятов P. infestons А2 типа спаривания на органах картофеля и томата за 1999 - 2006 гг, Московская обл. 9

Тип спаривания изолятов Р. /и/е$*аи5, собранных в разные периоды эпифитотии. На тестовых участках постоянного мониторинга (Московская обл.) сбор пораженных образцов проводили несколько раз за сезон. На всех участках в течение эпифитотии отмечены значительные изменения доли изолятов Р. \nfestans А2 типа спаривания, что выразилось как в увеличении доли изолятов с типом спаривания А2 на одних делянках, так и в ее уменьшении на других (рис. 2). В большинстве популяций присутствуют изоляты обоих типов спаривания. Полученные данные свидетельствуют о возможности полового процесса Р. Ь^еБгат в течение длительного периода эпифитотии. Значимых изменений в распределении типов спаривания в течение болезни не выявлено.

—♦— МОХА, кл —•— ЗБС, кл

--ВНИИСОК, тл

—Бсгт. сад 2004 г., кл

Ж Шаховская, кл —•—Троицкое, кл —I— Бот. сад 2006 г., кл

точки времени сбора образцов

Рисунок 2

Динамика частоты встречаемости изолятов Р. т/ея1апз А2 типа спаривания в течение эпифитотии

Для изучения годовой динамики соотношений типов спаривания в полевых популяциях Р. т/еяют Московской обл. усреднены данные по всем обследованным популяциям за соответствующий год.

Во всех фуппах изолятов выявлено присутствие обоих типов спаривания. Различия в доле изолятов А2 типа спаривания в разные годы выявлены только между группами изолятов, выделенных из органов картофеля. В томатных популяциях различий не выявлено (Рис. 3).

При сравнении встречаемости изолятов Р. infestans А2 типа спаривания на картофеле и томате значимых различий не обнаружено (коэффициент Стьюдента, t <1,9, min to,os;v45 = 2,01). При сравнении данных за отдельные годы статистически достоверных отличий также не обнаружено (рис. 3).

Рисунок 3

Доли штаммов с типом спаривания А2 на картофеле и томате

Встречаемость А2 типа спаривания в группах изолятов Р. ш/ел7аил-, выделенных из томата, колеблется по годам от 31% до 60%, однако эти различия статистически не достоверны из-за высокой вариабельности в отдельных полевых популяциях (рис. 3).

Сравнение паразитических свойств изолятов, имеющих тип спаривания А1 и А2 проведено на 46 изолятах Р. 1п]е$1апз, выделенных из листьев картофеля в 6 удаленных точках Московской области в 2004 г. Различий по степени агрессивности между изолятами разных типов спаривания с обоих сортов картофеля не выявлено (табл. 1).

Таблица 1

Результаты анализа агрессивности изолятов А2 и А1 типа спаривания

Тип спаривания Количество протестированных изолятов Индекс агрессивности, Сантэ* Индекс агрессивности, Луговской**

AI 21 47,57 20,79

А2 25 46,95 22,16

*Среднее по всем изолятам из популяции, протестированным на ломтиках картофеля сорта Сантэ ** Среднее по всем изолятам из популяции протестированным на ломтиках картофеля сорта Луговской

Изучение ооспорообразования в природных популяциях Р. т/еШм

Результаты мониторинга ооспор в полевых популяциях Р. ш/ейа/ю.

Для оценки встречаемости ооспор в природе в разных органах картофеля и томатов с мицелиями Р. т/еяют разных типов спаривания и с различным числом фитофторозных пятен изучено присутствие ооспор в 1055 образцах органов картофеля и томата.

Ооспоры Р. т/еягаж обнаружены в образцах пораженных фитофторозом листьев картофеля и томата, стеблей картофеля, клубней картофеля и плодов томата в большинстве исследованных полевых популяций (рис. 4). Не найдено ооспор в стеблях томата, возможно, в связи с малым числом исследованных образцов. В листьях и плодах томата ооспоры встречались значительно чаще, чем в остальных исследованных группах образцов. Различий в частоте встречаемости ооспор в разных органах картофеля не обнаружено (табл. 2).

Сокращения в рисунке: кл - листья картофеля., тл - листья томата, тп - плоды томата, тс - стебли томата, кк - клубни картофеля.

Рисунок 4

Частоты ( %) встречаемости ооспор Р. /я/ау/аш в органах картофеля и

томата

Таблица 2

Достоверность различий между частотами встречаемости ооспор в разных органах картофеля и томата

Сравниваемые группы образцов Коэффициент Стьюдента, t Критическое значение коэффициента Стьюдента

Картофель листья — томаты листья 5,8 t0,05;v22 = 2,07

Картофель листья — томаты плоды 8,0 to,05;v24 = 2,06

Картофель листья — картофель клубни 1,4 t<),05;vl8= 2,1

Картофель листья — картофель стебли 0,78 t0,05;v!8= 2,1

Томаты листья - томаты плоды 2,06 t<),05;vl4= 2,1

Томаты листья - картофель клубни 1,08 t<),05;v7 = 2,4

Томаты листья - картофель стебли 2,3 t0,05;v7 = 2,4

Томаты плоды - картофель клубни 2,2 t<),05;v9 = 2,2

Томаты плоды — картофель стебли 3,7 t(),05,v9 = 2,2

Картофель клубни - картофель стебли 0,9 t0,05;v3 =3,2

Картофель (листья+клубни+стебли) - томаты листья 3 t0,05;v24 = 2,06

Картофель (листья+клубни+стебли) - томаты плоды 4,9 t0,05;v26 = 2,06

Результаты показывают, что в плодах томата ооспоры образуются чаще всего. Возможно, разница в частотах встречаемости ооспор в картофеле и плодах томатов связана с различным содержанием в них Р-ситостерола (в плодах томата p-ситостерола содержится примерно в пять раз больше, чем в листьях картофеля), который P. infestans не способен самостоятельно синтезировать и от которого зависят процессы ее бесполого и полового размножения (Marshall et al., 2001).

За время исследований выявлена заметная межгодовая динамика встречаемости образцов с ооспорами (рис. 5).

Общие закономерности годового тренда встречаемости ооспор, отмеченные нами суммарно для всех популяций Московской области,

сохраняются и для отдельных популяций. Данные по встречаемости образцов с ооспорами на картофеле для двух популяций из Одинцовского района приведены на рис. 6. К сожалению, оценить динамику встречаемости ооспор внутри одной природной популяции томата не представилось возможным за недостаточностью данных.

100 90 80 70 60 В 50 Я 40 1 30 £ 20 10 О

1997 1999 2003 2006

год

Сокращения в рисунке: КЛ - литься картофеля, ТЛ - листья томата, ТП - плоды томата.

Рисунок 5

Годовая динамика встречаемости ооспор в органах картофеля и томата 1997, 1999, 2003, 2006 годов

Сокращения в рисунке: Голицыне - Одинцовский р-н МО, пос. Голицыне, ЗБС -Одинцовский р-н МО, ЗБС.

Рисунок 6

Годовая динамика встречаемости ооспор в листьях картофеля внутри одной популяции

Многие исследователи отмечают влияние температуры и уровня влажности окружающей среды на образование ооспор Р. ¡п/ез1ап5. В листьях картофеля в природных условиях ооспоры Р. 1^е$1апз образуются при температуре 5-25°С (оптимум 8-10°С) и влажности более 80%. Можно предположить, что межгодовые различия во встречаемости ооспор в органах картофеля и томата связаны с погодными условиями в Московской области. Сборы образцов органов картофеля и томата проводились в августе и в меньшем объеме в сентябре. Отмечается связь между количеством осадков, средней минимальной температурой и встречаемостью образцов листьев картофеля с ооспорами. Наиболее приближенными к идеальным условиям для образования ооспор были погодные условия 2003 года (табл. 3, рис. 6).

Таблица 3

Средняя температура воздуха, °С и среднее количество осадков, мм в Москве

(http://шeteo.infospace.ru/win/wcarch/html/r_sel_stn.sht?adm=596)

Год % образцов с ооспорами, КЛ Август Сентябрь

Мин. темп ,°С Макс, темп. °С Средн. темп. °С Осадки, мм Мин. темп. °С Макс, темп. °С Средн. темп. °С Осад ки, мм

1997 8,4 6,7 28,4 17,1 62 -3 21 8,5 54

1999 3 6,1 27,5 16,4 86 1,6 25,6 7,4 48

2003 20 8,6 29,6 16,9 145 1 23 11,3 100

2006 7 7,2 27,4 17,5 129 2,1 22,8 13,3 60

Особое внимание уделялось исследованию ооспорообразования в образцах с одним фитофторозным очагом. Перед исследованием материала на наличие ооспор из образцов выделяли изоляты Р. /и/еуГали и определяли тип спаривания.

Ооспоры в образцах с одним очагом фитофтороза встречались как в тех полевых популяциях, в которых были выявлены изоляты только одного типа спаривания, так и в тех, из которых были выделены изоляты обоих типов спаривания в сравнимых соотношениях.

Проведено сравнение присутствия ооспор в образцах с одним очагом заболевания и типом спаривания штамма, выделенного из этого очага. Преимуществ в образовании ооспор мицелием какого-либо типа спаривания не обнаружено.

Для популяций P. infestons на листьях картофеля не удалось выявить корреляции между частотой встречаемости образцов с ооспорами и долей А2 типа спаривания (коэффициент корреляции 0,117±0,009), обнаружена отрицательная корреляция между долей А2 типа спаривания и частотой встречаемости листьев томата с ооспорами (коэффициент корреляции -0,5712±0,15), а в популяциях на плодах томата эта корреляция существовала (коэффициент корреляции 0,720347±0,04).

Встречаемость ооспор в образцах листьев картофеля и томата с разным числом очагов фитофтороза. Исследовано присутствие ооспор в собранных в 2003 году образцах с несколькими очагами фитофтороза на одной листовой пластинке. Показано, что образцы листьев картофеля с двумя и более пятнами значительно чаще содержат ооспоры, чем образцы с одним пятном (рис. 7), данные статистически достоверны (t = 2,32; t0.95:6o = 2,0). Это свидетельствует в пользу того, что при интенсивном развитии фитофтороза значительная часть ооспор может иметь гибридную природу.

SO ? 45

Сокращения в рисунке: кл - листья картофеля, тл - листья томата, 1 пятно - образцы с одним фитофторозным пятном, 2 пятна - образцы с множественными фитофторозными пятнами.

Рисунок 7

Встречаемость ооспор в листьях картофеля и томатов с различным числом

очагов фитофтороза 16

На результаты анализа встречаемости ооспор в органах картофеля и томата может влиять методика выполнения анализа. Так, при микроскопировании образцов плодов томата выявлен факт очагового образования ооспор. Следственно, даже при анализе встречаемости ооспор в большом количестве полей зрения можно получить недостоверную информацию.

При изучении особенностей развития Р. infestans на листьях картофеля установлено, что на образование ооспор может влиять влажность, положение листа растения-хозяина над землей, контакт листа с почвой и водой, сорт растения-хозяина (Колесар, 2008; Cohen et al., 1997; Cohen et al., 1999; Cohen et al., 2000). Также может влиять дата сбора образцов, т.к. при более длительном культивировании Р. infestans образуется больше ооспор. Учитывая эти факторы, требуется разработка унифицированного метода оценки встречаемости ооспор Р. infestans в природе.

Распространение самофертильных штаммов в полевых популяциях Р. infestans и образование ооспор в природных образцах картофеля и томата с самофертильным мицелием Р. infestans проанализированы на 846 изолятах из различных органов картофеля и томата, собранных в разных районах Подмосковья.

Ооспоры образовывались в монокультурах изолятов Р. infestans, выделенных из большинства изученных популяций Московской области. Преимущества образования ооспор в монокультуре изолятами, выделенными из органов картофеля или томата, не выявлено.

Не обнаружено разницы образования ооспор в монокультуре изолятами, выделенными из плодов и листьев томата.

Самофертильность отмечена у штаммов из всех трех групп типов спаривания. Самофертильными были все изоляты, принадлежащие к группе А1А2; штаммы с типом спаривания А2 были способны образовывать ооспоры в монокультуре чаще, чем штаммы с типом спаривания Al (табл. 4).

Таблица 4

Доли штаммов, определенных как А1, А2 и А1А2 в пробах с тестерами, образовавших ооспоры в монокультуре

Год Тип спаривания

А1 А2 А1А2

2003 9 56 100

2004 27 39 -

2006 4 9 -

Интересно, что в этих условиях самофертильными оказались преимущественно штаммы с мицелиями А2 типа спаривания. Максимальное число самофертильных изолятов отмечалось в тех популяциях, где преобладали штаммы с типом спаривания А2 (табл. 5). Известно, что изоляты P. parasitica, P. cinnamomi, P. palmivora А2 типа спаривания способны образовывать ооспоры в монокультуре, при том, что изоляты данных видов А1 типа спаривания не образовывали ооспоры в монокультуре. Нами отмечена слабая связь между выборками % самофертильных штаммов в популяции и % штаммов с типом спаривания А2, (коэфф. корреляции = 0,463± 0,041) и между выборками % самофертильных штаммов в популяции и % штаммов с типом спаривания A1А2, (коэфф. корреляции = 0,345± 0,023).

Таблица 5

Распределение штаммов разного типа спаривания 2003,2004 и 2006 годов

Год Проба с тестерами Образовали ооспоры в монокультуре (%)

%А1 %А2 %А1А2

2003 53 43 4 27

2004 38 62 0 34

2006 45 55 0 11

Для оценки эпидемиологического значения самофертильных штаммов изучали образование ооспор самофертильными изолятами из природных образцов с одним фитофторозным пятном. Показано, что связь между

самофертильностью и ооспорообразованием в природных условиях практически отсутствует. Достоверной корреляции между выборками во встречаемости самофертильных штаммов в популяции и образцов с ооспорами не выявлено (коэфф. корреляции = 0,023± 0,0001).

Скрещивание изолятов P. infestans, выделенных из тканей картофеля и томата, in vitro и анализ их моноооспоровых потомков. Присутствие штаммов P. infestans обоих типов спаривания делает возможным протекание полового процесса в природных условиях Московской области, в результате чего образуются гибридные ооспоры. Однако присутствие обоих типов спаривания не всегда приводит к половой рекомбинации. Так, в Японии и Бразилии встречаются оба типа спаривания, но в этих странах обнаружены только клональные популяции P. infestans.

Исследована возможность образования гибридных ооспор штаммами P. infestans из природных популяций Московской области, оценена продуктивность образования и жизнеспособность ооспор, изучены маркерные фенотипические признаки монооспоровых потомков отобранных пар штаммов P. infestans.

Получение монооспоровых изолятов P. infestans. Для скрещивания были отобраны 9 штаммов P. infestans с известными характеристиками (тип спаривания, устойчивость к фунгициду металаксилу, спектр изоферментов второго локуса пептидазы) из коллекции кафедры микологии и альгологии Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова и нашей коллекции (табл. 6), из которых были составлены 8 пар.

Родительские штаммы в каждой паре различались по типу спаривания и спектру изоферментов второго локуса пептидазы. Изоферментные маркеры обычно не зависимы от внешних условий, показывают менделевское наследование и являются кодоминантными, позволяя различать гомо- и гетерозиготы.

Характеристика штаммов, использовавшихся для скрещивания

Штамм Дата выделения, год Орган растения хозяина Устойчивость к мета-лаксилу Тип спаривания Изофер-менты локуса 1 пепти-дазы Изофер-менты локуса 2 пепти-дазы

7СК49 1997 лист картофеля Я А1 100/100 100/100

ЗМОБТС 1 2003 стебель томата Б А2 100/100 112/112

6МОБТП16 1996 плод томата ЭЯ А1 100/100 100/100

ОбМШаТПІ 2006 Плод томата Б А1 100/100 112/112

06МШаТП5 2006 Плод томата БЯ А2 100/100 100/100

ОбМШаТШ 2006 Плод томата Б А1 92/100 112/112

06МШаТП4 2006 Плод томата Б А2 100/100 100/100

06МЗКЛ22*/1 2006 Лист картофеля 5 А2 100/100 100/100

06МБКС366 2006 Лист картофеля БЯ А2 100/100 100/100

Из этих штаммов были составлены родительские пары: 7СК49 х ЗМОБТС1, ЗМОБТС1 х 6МОБТП16, 06МШатп1 х 06МШаТП5, ОбМШаТГО х 06МШаТП4, 06МШаТП1 х 06МЗКЛ22*/1, 06МШаТП1 х 06МБКС366, 6МШаТП2 л: 06МЗКЛ22*/1, 06МШаТП2 х 06МБКС366

Всего проведено по 200 скрещиваний каждой пары. Все изоляты росли хорошо и формировали ооспоры. Отобранные пары штаммов при скрещивании образовывали разное число ооспор - от 324 до 925 на мм2 (среднее на 200 скрещиваний). Пары изолятов, выделенных из томата, образовывали больше ооспор, чем выделенных из разных растений. Жизнеспособность полученных ооспор существенно различалась между парами штаммов. У смешанных пар (штамм Р. ¡п/ез1апз, выделенный из картофеля, х штамм Р. /и/ё^/аш, выделенный из томата) процент жизнеспособных ооспор был ниже, чем у пар штаммов, выделенных из томата (табл. 7).

Обнаружена связь между интенсивностью образования ооспор и их жизнеспособностью (до стимуляции прорастания/ Процент жизнеспособных ооспор был ниже у тех пар, которые образовывали меньшее количество ооспор (табл. 7). Это наблюдение может свидетельствовать о половой несовместимости штаммов Р. іп/еяіат или присутствии каких-либо факторов, приводящих к образованию недоразвитых или нежизнеспособных ооспор.

Таблица 7

Продуктивность формирования ооспор и оценка жизнеспособности ооспор

до и после обработки раствором Lising Enzymes

Исследуемая пара Количество ооспор на 1 ммг (среднее на 200 скрещиваний) % жизнеспособных ооспор до обработки % жизнеспособных ооспор после обработки

ЗМОБТС1 х 7СК49 556 13 5

ЗМОБТС1 х 6МОБТП16 324 9 3

ОбМШаТПІ х 06МШаТП5 847 20 20

ОбМШаТГО * 06МШаТП4 926 71 71

ОбМШаТПІ х 06МЗКЛ22*/1 428 18 7

ОбМШаТПІ л 06МБКС366 533 17 13

ОбМШаТШ х 06M3KJI22*/1 489 14 10

ОбМШаТГОдг 06МБКС366 358 15 4

После обработки ооспор раствором ферментов оценивали их жизнеспособность. Процент жизнеспособных ооспор снижался во всех парах, кроме одной, однако во всех парах сохранялись жизнеспособные ооспоры.

Процент проросших ооспор был очень низким во всех парах (в половине пар он был нулевым). Ооспоры, образовавшиеся в результате скрещивания томатных штаммов, прорастали гораздо чаще. Однако ни одного потомка от этих ооспор не было получено, при переносе проросших ооспор на овсяный агар-агар роста мицелия не было (табл. 8).

Результаты проращивания ооспор P. infestons in vitro

Родительская пара Число исследованных ооспор Число и доля (в процентах) проросших ооспор Число и доля (в процентах) полученных потомков

ЗМОБТС1 х 6МОБТП16 400 2 (0,5%) 1 (0,25%)

ЗМОБТС 1 * 7СК49 584 7 (1,2%) 4 (0,7%)

ОбМШаТШ л 06МІШТП5 601 18(3%) 0

ОбМШаТШ дг 06МІШТП4 658 • 31 (5%) 0

ОбМШаТШ л 06МЗКЛ22*/1 452 0 0

ОбМШаТГП х 06МБКС366 412 0 0

ОбМШаТШ х 06МЗКЛ22*/1 508 0 0

ОбМШаТШ х 06МБКС366 258 0 0

Анализ моноооспоровых потомков Р. infestans. В результате скрещивания отобранных пар штаммов Р. ¡^езШт получено только пять моноооспоровых потомков. Все потомки получены от штаммов, выделенных из разных органов растений.

У полученных потомков было обнаружено разделение по всем исследованным маркерным фенотипическим признакам (тип спаривания, устойчивость к фунгициду металаксилу, спектр изоферментов второго локуса пептидазы) (табл 9).

Таблица 9

Результаты анализа монооспоровых потомков

Родительская пара Тип спаривания Устойчивость к металаксилу Изоферменты локуса 2 пептидазы

ЗМОБТС1 х 6МОБТП16 А1 S 100/112

ЗМОБТС 1 х 7СК49 А2 S 100/112

ЗМОБТС 1 х 7СК49 А2 SR 112/112

ЗМОБТС 1 л 7СК49 А2 S 112/112

К сожалению, полученных данных недостаточно для исследования распределения частот данных признаков. Однако тот факт, что у двух потомков обнаружена гетерозигота 100/112, может свидетельствовать об их гибридном происхождении. Хотя в наших экспериментах процент

прорастания ооспор был низким, в естественных условиях он может быть гораздо выше.

В результате работы получены данные, свидетельствующие как о возможности протекания полового размножения в подмосковных популяциях P. infestons с образованием гибридных ооспор, что может повышать генетическое разнообразие популяции, так и об образовании ооспор самофертильными изолятами P. infestons в подмосковных популяциях, что может служить механизмом выживания при неблагоприятных условиях и механизмом распространения патогена без участия полового размножения.

ВЫВОДЫ

1. Большинство популяций P. infestons представлено изолятами обоих типов спаривания. Соотношение изолятов AI и А2 типов спаривания в различных регионах и даже популяциях не постоянно и подвержено колебаниям; отмечается сезонная динамика распределения типов спаривания. Изоляты А1А2 типа спаривания встречаются редко как среди картофельных, так и томатных популяций.

2. Различий в агрессивности между исследованными изолятами с типами спаривания AI и А2 не выявлено.

3. Ооспоры P. infestons обнаружены в листьях картофеля и томата, стеблях картофеля, плодах томата в полевых популяциях P. infestons Московской области. В органах томата ооспоры встречались чаще, чем в органах картофеля, в плодах томата ооспоры встречались чаще, чем в листьях.

4. Изучение образцов с одним очагом фитофтороза показало, что преимущества в образовании ооспор мицелием какого-либо типа спаривания не обнаружено. В образцах листьев картофеля и томата с несколькими очагами фитофтороза ооспоры встречались чаще, чем в образцах листьев с одним фитофторозным пятном, что может свидетельствовать об их гибридном происхождении.

5. В популяциях P. infestons Московской области обнаружены самофертильные изоляты, способные образовывать ооспоры в монокультуре. Не обнаружено связи между встречаемостью ооспор P. infestons в монокультуре штаммов P. infestons и встречаемостью ооспор в природных образцах органов картофеля и томата, из которых были выделены эти штаммы.

6. Отработан метод получения монооспоровых потомков P. infestons. По результатам наших экспериментов, для прорастания ооспор требуется стимуляция, без обработки ферментами ооспоры не прорастали. У двух потомков обнаружена гетерозигота 100/112 по изоферментам локуса 2 пептидазы, что свидетельствует об их гибридном происхождении.

Список публикаций по теме диссертации

Статьи в журналах, рекомендованных ВАК для публикации основных положений по теме диссертации

1. Еланский С.Н., Апрышко В.П., Милютина Д.И., Козловский Б.Е. Устойчивость российских штаммов Phytophthora infestons к фунгицидам металаксил и диметоморф // Вестник Московского университета. Серия 16: Биология.-2007.-№ 1.-С. 14-18.

Прочие статьи

2. Уланова Т.Н., Еланский С.Н., Филиппов А.В., Козловский Б.Е., Дьяков Ю.Т., Апрышко В.П., Смирнов А.Н., Коффей М.Д. Устойчивость к фитофторозу некоторых перспективных линий диких Lycopersicon hirsutum //Журнал Российского фитопатологического общества, 2003,4, с. 9-15.

3. Elansky S.N., Dyakov Yu.T., Milyutina D.I., Apryshko V.P., Pobedinskaya M.A., Filippov A.V., Kozlovsky B.E., Kuznetsova M.A., Rogozhin A.N., Statsyuk N.V. Late blight of potato in Russia // Potato production and innovative technologies. Ed. A.J. Havenkort, B.V. Anisimov, Wageningen Academic Publishers, The Netherlands. - 2007. - P. 262-274.

24

Материалы конференций, тезисы

4. Смирнов А.Н., Кузнецов С.А., Кравцов A.C., Апрышко В.П., Еланский С.Н. Распространение и возможное происхождение ооспор Phytophthora infestons в Московской области // Материалы научно-практической конференции "Научное обеспечение картофелеводства России: состояние, проблемы", Москва, 2001. - С. 313-324.

5. Смирнов А.Н., Кравцов A.C., Кузнецов С.А., Апрышко В.П., Еланский С.Н. Встречаемость и возможное происхождение ооспор Phytophthora infestans в Московской обл. в 1999 г. // Материалы научной конференции "Памяти Грегора Менделя", Москва, изд. МСХА, 2001. - С. 122-123.

6. Смирнов А.Н., Кузнецов С.А., Кравцов A.C., Апрышко В.П., Побединская М.А., Еланский С.Н. Происхождение ооспор Phytophthora infestans в пораженных фитофторозом образцах в Подмосковье // Международный симпозиум "Проблемы изучения и охраны биоразнообразия и природных ландшафтов Европы" Сборник материалов. Пенза, 2001, с. 135.

7. Еланский С.Н., Смирнов А.Н., Кравцов A.C., Апрышко В.П., Дьяков Ю.Т. Популяции Phytophthora infestans в Московской области // Современная микология в России. Тезисы докладов первого съезда микологов, Москва, 2002. - С. 179.

8. Еланский С.Н., Смирнов А.Н., Кузнецов С.А., Апрышко В.П., Дьяков Ю.Т. Возможные причины изменения структуры популяций Phytophthora infestans в европейской части России на рубеже 20-21 веков // Материалы международной научной конференции "Биология, систематика и экология грибов в природных экосистемах и агрофитоценозах", Минск, 2004. — С. 96-100.

9. Апрышко В.П., Петрунина Я.В., Побединская М.А., Еланский С.Н. Ооспоры Phytophthora infestans в природных очагах фитофтороза в Московской области в 2003 у // Сб. материалов юбилейной конференции Микология и альгология 2004, М., Прометей, 2004. - С. 21-22.

Ю.Еланский С.Н., Апрышко В.П. Самофертильные штаммы Phytophthora infestons в природных популяциях // Труды конференции "Грибы в природных и антропогенных экосистемах", С. Петербург, 2005. - С. 186189.

П.Еланский С.Н., Апрышко В.П., Милютина Д.И., Козловский Б.Е.

Устойчивость российских штаммов Phytophthora infestons к фунгицидам Металаксил и Диметоморф // Материалы конференции "Грибы и водоросли в биоценозах", М., 2006. - С. 56-58. 12.Милютина Д.И., Шеин С.А., Апрышко В.П., Еланский С.Н. Популяции Phytophtora infestons в республике Марий Эл // Современная микология в России. Том 2. Тезисы докладов второго съезда микологов, М., 2008. - С. 193-194.

Автор работы выражает глубокую благодарность научному руководителю д. б. н. профессору Дьякову Ю. Т. и ведущему научному сотруднику каф. микологии и альгологии к. б. н. Еланскому С. Н. за неоценимую помощь при выполнении и написании работы, д. б. н. профессору Смирнову А. Н. и младшему научному сотруднику каф. микологии и альгологии Побединской М. А. за консультации и помощь в совместных исследованиях; сотрудникам каф. микологии и альгологии к. б. н. Инсаровой И. Д., к. б. н. Гололобовой М. А., к. б. н. Благовещенской Е. Ю., к. б. н. Ворониной Е. Ю. за ценные советы при подготовке диссертационной работы, научному сотруднику каф. микробиологии Шестакову А. И. за техническую помощь в выполнении некоторых экспериментов.

Формат 60x90/16. Заказ 1585. Тираж 100 экз. Усл.-печ. л. 1,2.

Печать офсетная. Бумага для множительных аппаратов.

Отпечатано в ООО "ФЭД+", Москва, Ленинский пр. 42, тел. (495)774-26-96

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Апрышко, Валентина Петровна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Систематическое положение РкуЮрЫЬога т/е81ат.

1.2. Краткое описание болезни.

1.3. Морфология и жизненный цикл РЬуЩЫкога т/еБ1ап5.

1.4. Регуляция полового процесса у Рку1орЫкога infestans.

1.4.1. Типы спаривания РкуЩЫЬога т/ез1апз.

1.4.2. Самофертильность и образование ооспор Рку^рЫкога infestans в чистых культурах.

1.4.3. Встречаемость ооспор РНу^рЫЬога т/е51а№ в природных популяциях.

1.4.4. Факторы, влияющие на образование ооспор Рку1орШИога т/езгат.

1.5. Жизнеспособность ооспор РЬу^рЫЬога infestans.

1.6. Прорастание ооспор РкугорЫкога т/ез1ат.

1.7. Инфекционная роль ооспор РИуШрШкога т/е51апз.

1.8. Оценка происхождения ооспор Рку1орШНога т/ез1а№.

1.9. Краткие описания некоторых методов сравнительного исследования штаммов РкуЮрЫкога infestans.

1.9.1. Анализ устойчивости к металаксилу.

1.9.2. Агрессивность.

1.9.3. ДНК-полиморфизмы и спектр изоферментов.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Выделение и культивирование изолятов РИу^рШкога т/ез1а№.

2.1.1. Приготовление питательных сред.

2.1.2. Места сбора пораженных образцов для выделения изолятов в чистую культуру.

2.2. Определение типа спаривания.

2.3. Определение встречаемости ооспор в пораженных образцах.

2.4 Оценка образования ооспор РЬуЩЫЬога т/ез1аю в монокультуре.

2.5. Оценка агрессивности изолятов Рку^рЫкога [г^езгат.

2.6. Определение устойчивости изолятов к фунгициду металаксилу.

2.7. Анализ жизнеспособности ооспор РкуЩЫкога т/е$1ат.

2.8. Получение моноооспоровых потомков РЬу^рЫЬога т/ез1ат.

2.8.1. Получение ооспор РЬуЮрЫкога т/ез1ап5.

2.8.2. Стимуляция прорастания ооспор и уничтожение вегетативных структур Рку^рЫкога т/езгат.

2.8.3. Проращивание ооспор.

2.9. Изоферментный анализ.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Изучение типа спаривания изолятов РЬу№рЫЬога т/ез1апз.

3.2. Изучение типа спаривания изолятов Рку1орЫкога т/ез1ат, выделенных из разных органов картофеля и томатов.

3.3. Тип спаривания изолятов Рку(орЫИога ш/еяШпз, собранных в разные периоды эпифитотии.

3.4. Тип спаривания изолятов РкуЮрЫкога infestans, собранных в Московской области в 1999-2006 годах.

3.5. Анализ паразитических свойств изолятов А2 типа спаривания, собранных в Московской области.

3.6. Изучение ооспорообразования в природных популяциях РкугорЫЬога infestans.

3.6.1. Результаты мониторинга ооспор в полевых популяциях Рку^рЫкога т/ез1ап

3.6.2. Встречаемость ооспор в образцах листьев картофеля и томата с разным числом очагов фитофтороза.

3.6.3. Распространение самофертильных штаммов в полевых популяциях Phytophthora infestans и оценка образования ооспор в природных образцах картофеля и томатов с самофертильным мицелием Phytophthora infestans.

3.7. Скрещивание изолятов Phytophthora infestans, выделенных из тканей картофеля и томата in vitro, и анализ их моноооспоровых потомков.

3.7.1. Получение моноооспоровых изолятов Phytophthora infestans.

3.7.2. Анализ моноооспоровых потомков Phytophthora infestans.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Ооспорообразование в природных популяциях Phytophthora infestans"

Оомицет Phytophthora infestans (Mont.) de Вагу является возбудителем широко распространенного заболевания растений — фитофтороза. Этот вид представляет серьезную опасность для растений из семейства Solanaceae, главным образом, картофеля (Solarium tuberosum L.) и томата (Lycopersicon esculentum Mill) (Fry, 2000).

Фитофтороз вызывает значительные потери урожая картофеля во всех картофелепроизводящих странах мира. При благоприятных погодных условиях болезнь проявляется в виде эпифитотий, нанося за один вегетационный период огромный ущерб производству. Так, в период 2002-2004 годов в Нидерландах в условиях органического производства без применения химических средств защиты средние потери урожая от фитофтороза для большинства распространенных сортов картофеля достигали 45% (Allefs et al., 2005). Фитофтороз является одним из самых распространенных и опасных заболеваний картофеля в России. По самым скромным оценкам ежегодные потери урожая картофеля в России вследствие заболевания фитофторозом приближаются к 4 миллионам тонн, что составляет более 10% урожая. Без проведения соответствующих обработок продуктивность восприимчивых к заболеванию сортов может снижаться в 1,5-2 раза.

Развитие болезни происходит в поле и в период хранения клубней. Степень снижения урожайности от фитофтороза определяется степенью поврежденности ботвы, приводящей к уменьшению интенсивности фотосинтеза и сокращению срока вегетации. При очень сильном поражении происходит полная дефолиация в отдельных очагах или даже на всем поле. Дальнейшие обработки фунгицидами в таких случаях не дают необходимого положительного эффекта. Клубни заражаются спорами, попадающими с листьев в почву, особенно при уборке, если они соприкасаются с зараженной ботвой.

Значительные экономические убытки приносит также фитофтороз томатов. Заболевание может полностью уничтожить культуру в годы эпифитотий. Р. т/е8(ат способна поражать плоды при их дозревании, а также семенной материал. Вредное действие паразита, проявляющееся снижением качества плодов и гибелью отдельных растений, обусловлено глубоким изменением физиологических процессов (дисфункция проводящей системы и водный дефицит, нарушение дыхания и минерального питания, снижение ассимиляции), вследствие чего начинается раннее старение растения. Попадая в ткани растения, возбудитель фитофтороза томата снижает содержание хлорофилла в листьях, что приводит к ослаблению фотосинтеза, способствует усилению транспирации листа и процесса диссимиляции, накопление питательных веществ в плодах тормозится. Все эти изменения приводят к ослаблению растения, к снижению урожайности. При сильном поражении плодов урожай снижается на 70-80%, а иногда плодоношение полностью отсутствует (Марков, 2010).

Возбудитель фитофтороза обладает высокой генетической изменчивостью, определяющей его способность усиливать патогенность и преодолевать барьеры устойчивости возделываемых сортов. За последние 30 лет вредоносность Р. infestans значительно повысилась в связи с эволюционными изменениями, которые произошли в ее естественных популяциях. В 80-е годы прошлого столетия почти одновременно во всех картофелевыращивающих странах, в том числе и в России, произошла замена старых популяций паразита новыми. В них дополнительно к типу совместимости А1, определяющему возможность полового процесса с образованием ооспор, распространился тип А2, который ранее отмечался только в Мексике. Предполагается, что причиной этого является вывоз семенного картофеля из Мексики, экспортом которого эта страна занимается с 70-х годов прошлого столетия. Теперь для полевых популяций характерно наличие двух типов совместимости - А1 и А2, определяющих возможность полового процесса.

Образующиеся в результате полового процесса ооспоры представляют собой новый опасный источник инфекции (Дьяков, 2002). Ооспоры играют важную роль в биологии большинства оомицетов, так как они способны выживать в почве при неблагоприятных условиях, например, в условиях заморозков или засухи, и способны противостоять воздействию микроорганизмов. Считается, что половое размножение Р. infestans возможно только при встрече штаммов разных типов спаривания, однако, встречаются и самофертильные изоляты, способные образовывать ооспоры в монокультуре (АпёегзБОп, 2007).

В результате половой рекомбинации Р. т/е81ат во всех странах отмечается появление генетически разнообразных штаммов патогена с высоким потенциалом адаптивности к условиям среды, отличающихся повышенной агрессивностью и способностью вызывать раннее наступление болезни при сильном поражении стеблей. Наиболее пагубным итогом изменения генетической структуры полевых популяций паразита явилось распространение штаммов, устойчивых к фунгицидам системного действия (1^и*оуа е! а1., 2001).

Целью настоящей работы было изучение ооспорообразования в природных популяциях и роли полового процесса в жизненном цикле Р. т/е81ат.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи исследований:

1. Получение чистых культур изолятов Р. т/ез(апз и создание коллекции штаммов.

2. Изучение распределения изолятов Р. infestans разных типов спаривания в различных органах картофеля и томатов в разные периоды эпифитотии с последующим анализом их агрессивности.

3. Изучение ооспорообразования в природных популяциях Р. infestans, вегетирующих в различных органах картофеля и томата.

4. Изучение распространения самофертильных штаммов в полевых популяциях P. infestans и оценка образования ооспор в природных образцах картофеля и томатов с самофертильным мицелием P. infestans.

5. Проверка возможности образования гибридных ооспор штаммами P. infestans популяций из Московской области in vitro и анализ гибридности их моноооспоровых потомков.

Заключение Диссертация по теме "Микология", Апрышко, Валентина Петровна

ВЫВОДЫ

1. Большинство популяций Р. infestans представлено изолятами обоих типов спаривания. Соотношение изолятов А1 и А2 типов спаривания в различных регионах и даже популяциях не постоянно и подвержено колебаниям; отмечается сезонная динамика распределения типов спаривания. Изоляты А1А2 типа спаривания встречаются редко как среди картофельных, так и томатных популяций.

2. Различий в агрессивности между исследованными изолятами с типами спаривания А1 и А2 не выявлено.

3. Ооспоры Р. т/ез1ат обнаружены в листьях картофеля и томата, стеблях картофеля, плодах томата в полевых популяциях Р. т/езКтя Московской области. В органах томата ооспоры встречались чаще, чем в органах картофеля, в плодах томата ооспоры встречались чаще, чем в листьях.

4. Изучение образцов с одним очагом фитофтороза показало, что преимущества в образовании ооспор мицелием какого-либо типа спаривания не обнаружено. В образцах листьев картофеля и томата с несколькими очагами фитофтороза ооспоры встречались чаще, чем в образцах листьев с одним фитофторозным пятном, что может свидетельствовать об их гибридном происхождении.

5. В популяциях Р. т/е51ат Московской области обнаружены самофертильные изоляты, способные образовывать ооспоры в монокультуре. Не обнаружено связи между встречаемостью ооспор Р. infestans в монокультуре штаммов Р. т/е8(ат и встречаемостью ооспор в природных образцах органов картофеля и томата, из которых были выделены эти штаммы.

6. Отработан метод получения моноооспоровых потомков Р. т/е8(ат. По результатам наших экспериментов, для прорастания ооспор требуется стимуляция, без обработки ферментами ооспоры не прорастали. У двух потомков обнаружена гетерозигота 100/112 по изоферментам локуса 2 пептидазы, что свидетельствует об их гибридном происхождении.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Апрышко, Валентина Петровна, Москва

1. Алтухов Ю. П. Генетические процессы в популяциях. М.: Наука, 1983. -279 с.

2. Аникина М. И. Исследование вегетативной несовместимости Phytophthora infestans (Mont.) de Вагу: Дис. . канд. биол. наук / М. И. Аникина. М., 1994.- 110 с.

3. Багирова С. Ф. Грибы рода Phytophthora de Вагу, поражающие томат в защищенном грунте: Дис. . канд. биол. наук / С. Ф. Багирова. М., 1993. -139 с.

4. Багирова С. Ф., Дьяков Ю. Т. Об участии ооспор Phytophthora infestans в весеннем возобновлении инфекции фитофтороза томата // С.-х. биология. -1998. -№3.- С. 69-71.

5. Бессмельцев В. И. Итоги и задачи в изучении грибных болезней пшеницы и картофеля // Матер, юбилейного заседания ученого совета СКНИИФ, посвященного 30-летию создания института. Проблемы защиты растений для Северного Кавказа. Краснодар, 1991. - С. 69-70.

6. Бордукова М. В. Зимовка Phytophthora infestans D. В. в условиях Московской области // Вест. с.-х. науки. 1940. - № 3. - С. 13-19.

7. Бордукова М. В. Прорастание партеногенетических ооспор Phytophthora infestans (Mont.) de Вагу в чистой культуре // Микология и фитопатология. -1983. Т. 17. - №. 3. - С. 206-210.

8. Воробьева Ю. В., Гриднев В. В., Кваснюк Н. Я. Изменение состава популяций возбудителя фитофтороза картофеля // Защита растений. 1991. -№ 1.-С 23-24.

9. Воробьева Ю. В., Шемякина В. П., Кваснюк Н. Я. Наследование резистентности к Ридомилу при половом размножении Phytophthora infestans //Генетика. 1992. - Т. 28. - С. 99-106.

10. Воробьева Ю. В., Морозова Е. В., Гриднев В. В. Встречаемость самофертильных изолятов в природных популяциях Phytophthora infestans (Mont.) d By // Микология и фитопатология. 1994. - Т. 28. - № 6. - С. 5760.

11. Горбунова Е. В., Багирова С. Ф., Долгова А. В., Дьяков Ю. Т. Изучение вегетативной несовместимости у Phytophthora infestans (Mont.) de Вагу // Доклады Академии Наук СССР. 1989. - Т. 304. - № 5. - С. 1245-1248.

12. Гриднев В. В., Кваснюк Н. Я. Методика получения и длительного хранения ооспор Phytophthora infestans Н Вестник РАСХН. 1998. - № 5. - С. 36-37.

13. Гриднев В. В., Кваснюк Н. Я. Формообразовательные процессы в популяциях Phytophthora infestans (Mont.) de Вагу в связи с появлением половой стадии // Доклады Россельхозакадемии. 2000. - № 2. - С. 18-19.

14. Гуркина JI. К. Исходный материал для селекции томата на устойчивость к фитофторозу и другим листовым пятнистостям в условиях Нечерноземной зоны России: Автореф. дис. канд. биол. наук. М., 1998. 33 с.

15. Долгова А. В., Дьяков Ю. Т. Генетика устойчивости возбудителя фитофтороза картофеля Phytophthora infestans (Mont.) d Ву к фунгициду металаксилу // Генетика. 1986. - Т. 22. - № 10. - С. 2423-2429.

16. Долгова А.В., Смирнов А. Н., Дьяков Ю. Т. Популяции Phytophthora infestans (Mont) de Вагу в России и некоторых странах бывшего СССР // Микология и фитопатология. 1996. - Т. 30. - № 3. - С. 55-60.

17. Дьяков Ю. Т. Основные задачи работ по генетике иммунитета растений // С.-х. биология. 1969. - Т. 4. - № 5. - С. 689-693.

18. Дьяков Ю. Т. Популяционная биология фитопатогенных грибов. М.: Муравей, 1998.-377 с.

19. Дьяков Ю. Т. Фитофтороз глобальные и внутрироссийские проблемы // Природа. - 2002. - № 1. - С. 33-39.

20. Дьяков Ю. Т., Еланский С. Н. Популяционная генетика Phytophthora infestans // Микология сегодня. Ю. Т. Дьяков, Ю. В. Сергеев, ред. - М.: Национальная академия микологии, 2007. - С. 107-139.

21. Еланский С. Н. Популяции фитопатогенного гриба Phytophthora infestans (Mont.) de Вагу на территории России: Дис. . канд. биол. наук / С. Н. Еланский. М., 1998. - 122 с.

22. Еланский С. Н., Апрышко В. П. Самофертильные штаммы Phytophthora infestans в природных популяциях // Труды конференции "Грибы в природных и антропогенных экосистемах", С.-Петербург, 2005. С. 186— 189.

23. Еланский С. Н., Смирнов А. Н., Долгова А. В., Дьяков Ю. Т. Популяции Phytophthora infestans в Московской области. // Микология и фитопатология. 1999. - Т. 33. - №. 5. - С. 346-359.

24. Иванюк В. Г., Банадысев С. А., Журомский Г. К. Защита картофеля от болезней, вредителей и сорняков. Минск: Белпринт, 2005. - 695 с.

25. Кокаева JI. Ю., Кокаева 3. Г., Березов Ю. И., Еланский. С. Н. Молекулярно-генетические подходы к исследованию фитопатогенного оомицета Phytophthora infestans //Защита картофеля. 2011. - № 2. - С. 2-8.

26. Колесар В. А. Особенности развития патогенных микромицетов листьев картофеля и влияние на них иммунизаторов растений: Автореф. дис. канд. биол. наук. Самара, 2008. 24 с.

27. Левонтин Р. Генетические основы эволюции. М.: Мир, 1978. - 351 с.

28. Маленев Ф. Е. К вопросу о партеногенетическом образовании ооспор у гриба Phytophthora infestans D. В. // Записки Ленинградского сельхоз. института. 1962. -Т. 87. - С. 104-108.

29. Марков И. Фитофтороз томата и меры по ограничению его развития // Овощеводство. Киев: ООО "Юнивест Маркетинг". 2010. - № 7. - С.50-54.

30. Мюллер Э., Лёффлер В. Микология. М.: Мир, 1995. - 345 с.

31. Наумова Н. А. Фитофтора картофеля. Л.-М.: Издательство сельскохозяйственной литературы, журналов и плакатов, 1961. - 181 с.

32. Никифорова Н. А. Фитофтороз картофеля в условиях Сахалина. М.: Издательство АН СССР, 1958. - 71 с.

33. Новотельнова Н. С. Фитофторовые грибы. Л.: Наука, 1974. - 205 с.

34. Плешков Б.М. Биохимия сельскохозяйственных растений. М.: Колос, 1987. -493 с.

35. Попкова К. В. Фитофтора картофеля. М.: Колос, 1972. - 176 с.

36. Смирнов А. Н. Популяционная структура фитопатогенного гриба Phytophthora infestans (Mont.) de Вагу в Московской области в 1991-1996 годах: Дис. . канд. биол. наук / А. Н. Смирнов. М., 1996. - 217 с.

37. Смирнов А. Н., Еланский С. Н. Образование ооспор в полевых популяциях гриба Phytophthora infestans в Московской области // Микология и фитопатология. 1999. - Т. 33. - № 6. - С.421-425.

38. Смирнов А. Н., Еланский С. Н., Долгова А. В. Ооспоры Phytophthora infestans в плодах томатов в Московской области // Защита и карантин растений. 1998. -№ 5. - С. 41.

39. Смирнов А. Н., Кузнецов С. А. Встречаемость и морфология ооспор, обнаруженных в природных популяциях Phytophthora infestans в Московской области в 1999 году // Известия ТСХА. 2001. - Вып 4. - С. 116-133.

40. Смирнов А. Н., Кузнецов С. А. Фитофгороз томата // Защита и карантин растений. 2006. - № 3. - С. 20-23.

41. Спиглазова С. Ю. Вредоносность и патогенные свойства возбудителя фитофтороза картофеля {Phytophthora infestans (Mont.) dBy) в различных регионах Российской Федерации: дис. . канд. биол. наук / С. Ю Спиглазова. Большие Вяземы, 2004. - 137 с.

42. Сулимова Г. Е., Удина И. Г., Зинченко В. В. Анализ полиморфизма ДНК с использованием метода полимеразной цепной реакции. М.: МАКС Пресс, 2006.-77 с.

43. Ainsworth J., Bisby Н. Dictionary of the fungi. New-York - London, 1995. -616 pp.

44. Alexopoulos C. J., Mims C. W., Blackwell M. Introductory Mycology 4th edition. - New York: John Wiley & Sons, Inc., 1996. - 869 pp.

45. Andersson B. Sexual reproduction in Phytophthora infestans: epidemiological consequences. Doctoral thesis. Swedish University of Agricultural Sciences, Uppsala, 2007.-31 pp.

46. Andersson B., Sandstrom M., Stromberg A. Indications of soil borne inoculum of Phytophthora infestans I I Potato Research. 1998. - V. 41. - № 4. - P. 305-310.

47. Andrivon D. Inhibition by aluminum of mycelial growth and of sporangial production and germination in Phytophthora infestans II Eur. J. PI. Path. 1995. -V. 101.-P. 527-533.

48. Ann P. J., Ko W. I. Effect of chloroneb and ethazol on mating type of Phytophthora parasitica and P. cinnamomi II Bot. Bull. Acad. Sin. 1989. - V. 30.-P. 207-210.

49. Ashby S. F. The production of sexual organs in pure cultures of Phytophthora cinnamoni Rands and Blepharospora cambivora Petri II Trans. Br. Mycol. Soc. -1929-V. 14-P. 260-263.

50. Bagirova S. F., Jian-Li, Dolgova A. V., Elansky S. N., Show D. S., Dyakov Yu. T. Mutants of Phytophthora infestans resistant to dimethomorph fungicide // J. Russian Phytopathol. Soc. 2001. - V. 2. - P. 19-23.

51. Berg A. Tomato late blight and its relation to late blight of potato // W. Va. Agric. Exp. Stn. Bull. 1926. -V. 205. - 31 pp.

52. Brasier C. M. Induction of sexual reproduction in single A2 isolates of Phytophthora species by Trichoderma viride II Nature (London) New Biol. -1971.-V. 231.-P. 283.

53. Brasier C. M. Observations on the sexual mechanism in Phytophthora palmivora and related species II Trans. Br. Mycol. Soc. 1972. - V. 58 - P. 237-251.

54. Brasier C. M. Evolutionary biology of Phytophthora. Part I: Genetic system, sexuality and the generation of variation // Annu. Rev. Phytopathol. 1992. - V. 30.-P. 153-172.

55. Brack R. I., Fry W. E , Apple A. E. Effect of metalaxyl, an acylalanine fungicide, on developmental stages of Phytophthora infestans I I Phytopathology. 1980. -V. 70.-P. 597-601.

56. Carlisle D. J., Cook L. R., Watson S., Brown A. E. Foliar aggressiveness of Northern Ireland isolates of Phytophthora infestans on detached leaflets of three potato cultivars // Plant Pathology. 2002. - V. 51. - P. 424-434.

57. Carter D. A., Buck K. W., Archer S. A., Van der Lee T., Shattock R. C., Shaw D. S. The detection of nonhybrid, trisomic, and triploid offspring in sexual progeny of mating of Phytophthora infestans //Fungal Genet, and Biol. 1999. -V. 26.-P. 198—208.

58. Chang T. T., Ko W. H. Effect of metalaxyl on mating type of Phytophthora infestans II Ann. Phytopathol. Soc. Jpn. 1990. - V. 56. - P. 194-198.

59. Chang T. T, Ko W. H. Factors affecting germination of oospores of Phytophthora infestans II J. Phytopathology. 1991. -V. 133. - P. 29-35.

60. Chow E .T. S., Jen J. J. Phytosterol biosynthesis in ripening tomatoes // J. of food science. 1978. - V. 43. - № 5. - P. 1424-1426.

61. Clinton G. P. Oospores of potato late blight. Phytophthora infestans // Conn. Agric. Exp. Stn. Biemi. Rep. 1909-1910. 1911. - Part 10. - P. 753-774.

62. Cohen Y. Populations of Phytophthora infestans in Israel underwent three major genetic changes during 1983 to 2000 // Phytopathology. 2002. - V. 92. - P. 300-307.

63. Cohen Y., Coffey M. D. Systemic fungicides and the control of Oomycetes // Annu. Rev. Phytopathol. 1986. - V. 24. - P. 311-338.

64. Cohen Y., Farkash S., Baider A. Oospore formation of Phytophthora infestans in field-grown potatoes and their role in the epidemiology of late blight // Phytoparasitica. 1999. - V. 27. - P. 137.

65. Cohen Y., Farkash S., Baider A., Shaw D. S. Sprinkling irrigation enhances production of oospores of Phytophthora infestans in field-grown crops of potato // Phytopathology. -2000. V. 90. - P. 1105-1 111.

66. Cohen Y., Farkash S., Reshit Z., Baider A. Oospore production of Phytophthora infestans in potato and tomato leaves // Phytopathology. 1997. - V. 87. - P. 191-196.

67. Cooke D. E. L., Lees A. K. Markers, old and new, for examining Phytophthora infestans diversity // Plant Pathology. 2004. - V. 53. - P. 692-704.

68. Daggett S. S., Götz E, Therrien C. D. Phenotypic changes in populations of Phytophthora infestans from Eastern Germany // Phytopathology. 1993. - V.83. -№3.-P. 319-323.

69. Davidse L. C., Van den Berg,Velthius G. C. M., Mantel B. C., Jespers A. B. K. Phenylamides and Phytophthora / In: Phytophthora, chapter 23. Ed. J. A. Lucas, R. C. Shattock, D. S. Shaw, L. C. Cooke- Cambridge: Cambridge Univ. Press, 1991.-P. 349-360.

70. De Bruyn H. L. G. The overwintering of Phytophthora infestans H Phytopathology. 1926. - V. 16. - P. 121-140.

71. Dick M. W. Straminipilous fungi: Systematics of the peronosporomycetes, including accounts of the marine straminipilous protists, the plasmodiophorids, and similar organisms. The Netherlands, Dordrecht: Kluwer Academic Publisher, 2001. - 660 pp.

72. Dolgova A. V., Dyakov Yu. T., Smirnov A. N. Distribution of mating types and vegetative compatibility groups in populations of Phytophthora infestans from Russia, Belorussia and Estonia // Phytophthora newsletter. 1992. - № 18. - P. 4-5.

73. Dowley L. J., O'Sullivan E. Changes in the distribution of phenylamide-resistant strains of Phytophthora infestans (Mont.) de Bary in Ireland 1985-89 I I Potato Res. 1991. - V. 34. - P. 67-69.

74. Drenth A. Janssen E. M., Govers F. Formation and survival of oospores of Phytophthora infestans under natural conditions // Plant Pathology. 1995. - V. 44. - P. 86-94.

75. Drenth A., Turkensteen L. J., Govers F. The occurrence of the A2 mating type of P. infestans in the Netherlands; significance and consequences // Neth. J. of PL Pathol. 1993. - V. 99. - № 3. - P. 57-67

76. Drenth A., Tas I. C. Q., Govers F. DNA fingerprinting uncovers a new sexually reproducing population of Phytophthora infestans in the Netherlands // Eur. J. of Plant Pathology. 1994. - V. 100. - P. 97-107.

77. Elansky S. N., Smirnov A. N. Second locus of Peptidase as a marker for genetic investigations of Phytophthora infestans II Botanica Lithuanica. 2003. - V. 9. -P. 275-283.

78. Erwin D. C., Ribeiro O. K. // Phytophthora diseases worldwide. St. Paul, Minnesota: APS Press, 1996. - 562 pp.

79. Fabritius A. L., Cvitanich C., Judelson H. S. Stage specific gene expression duringsexual development in Phytophthora infestans II Molecular Microbiology. 2002. i-V.45.-P. 1057-1066.

80. Fay J. C., Fry W. E. Effects of cold and hot temperatures on the survival of oospores produced by United States strains of Phytophthora infestans II Am. Pot. J. 1997. - V. 74. - P. 315-323.

81. Femández-Pavía S. P., Griinwald N. J., Diaz-Valasis M., Gadena-Hinojosa M., Fry W. E. Soilborne oospores of Phytophthora infestans in Central Mexico survive winter fallow and infect potato plants in the field // Plant Disease. 2004. -V. 88.-P. 29-33.

82. Flier W. G., Kessel G. J. T., Shepers H. T .A. M. The impact of oospores of Phytophthora infestans on late blight epidemics // Plant breeding and seed science. 2004. - V. 50. - P. 5-13.

83. Flier W. G., Turkensteen L. J. Foliar aggressiveness of Phytophthora infestans in three potato-growing regions in the Netherlands // Eur. J. of Plant Pathology. -1999.-V. 105.-P. 381-388.

84. Flier W. G., Griinwald N. J., Fry W. E., Turkensteen L. J. Formation, production and viability of oospores of Phytophthora infestans from potato and Solanum demissum in the Toluca Valley, central Mexico // Mycol. Res. 2001. - V. 105. -P. 998-1006.

85. Frinking H. D., Davidse L. C., Limburg H. Oospore formation by Phytophthora infestans in host tissue after inoculation with isolates of opposite mating type found in the Netherlands // Neth. J. Plant Pathology. 1987. - V. 93. - P. 14 -149.

86. Fry W. E. Phytophthora infestans. Encyclopedia of Microbiology. San Diego, Ca: Academic Press, 2000. - V. 3. - P. 633-639.

87. Fry W. E. Phytophihora infestans: the plant (and R gene) destroyer // Molecular Plant Pathology. 2008. - V. 9. - P. 385-402.

88. Fry W. E., Spielman L. J. Population biology // in: Advances in Plant Pathology. Phytophihora infestans, the cause of late blight of potato, ed. Ingram D. S., Williams P. London: Academic Press, 1991. - V. 7. - P. 171-192.

89. Fry W. E., Goodwin S. B., Matutszak J. M., Spielman L. J., Milgroom M. G., Drenth A. Population genetics and intercontinental migrations of Phytophihora infestans II Annu. Rev. Phytopathol. 1992. - V. 30 - P. 107-129.

90. Fyfe A. M., Shaw D. S. An analysis of self-fertility in field isolates o£ Phytophihora infeslans II Mycol. Res. 1992. - V. 96. - P. 390-394.

91. Galindo J., Gallegly M. E. The nature of sexuality in Phytophihora infestans II Phytopathology. 1960. - V. 50. - P. 123-128.

92. Gallegly M. E. Genetics of pathogenicity of Phytophihora infestans // Ann. Rev. of Phytopathology. 1968. - V. 48. - P. 375-396.

93. Gallegly M. E., Galindo J. Mating types and oospores of Phytophihora infestans in nature in Mexico // Phytopathology. 1958. - V. 48. - P. 274-277.

94. Ghimire S. R., Hyde K. D., Hodgkiss I. J., Liew E. C. Y. Phenotypes of Phytophihora infestans in Nepal: mating type and metalaxyl sensitivity // Potato Res. 2001. - V. 44. - P. 337-347.

95. Gisi U, Cohen Y. Resistance to phenilamide fungicides: a case study with Phytophihora infestans involving mating type and race structure. //Annu. Rev. Phytopathol. 1996. - V. 34. - P. 549-572.

96. Goodwin S. B., Cohen B. A., Fry W. E. Panglobal distribution of a single clonal lineage of the Irish potato famine fungus // Proc. Natl. Acad. Sci. United States. 1994. - V. 91. - P. 11591-11595.

97. Goodwin S. B., Drenth A. Origin of the A2 mating type of Phytophihora infestans outside Mexico // Phytopathology. 1997. - V. 87. - P. 992-999.

98. Grenville-Briggs L. J., van West P. The biotrophic stages of oomycete-plant interactions // Advances in applied microbiology. 2005. - V. 57. - P 217-242.

99. Grinberger M., Kadish D., Cohen Y. Occurence of the A2 mating type and oospores of Phytophthora infestans in potato crops in Israel // Phytoparasitica. -1989. -V. 17.-P. 197-204

100. Groves C. T., Ristaino J. B. Commercial fungicide formulations induce in vitro oospore formation and phenotypic change in mating type in Phytophthora infestans II Phytopathology. 2000. - V. 90. - P. 1209-1216.

101. Griinwald N. J., Flier W. G. The biology of Phytophthora infestans at its center of origin //Annu. Rev. Phytopathol. -2005. V. 43. - P. 171-190.

102. Hanson K., Shattock R. C. Effect of metalaxyl on formation and germination of oospores of Phytophthora infestans II Plant Pathology. 1998. - V. 47. - P. 116122

103. Harrison B. J. The genetics of Phytophthora infestans. U.C.N. W., Bangor: University of Wales, 1991.-234 pp.

104. Harrison J. G. Effects of the aerial environment on late blight of potato foliage—a review // Plant Pathology. 1992. - V. 41. - № 4. - P. 384^16.

105. Hazel W. J., Bean G. A., Goth R. W. Relationship of potato leaf sterols to development of potato late blight caused by Phytophthora infestans on U.S. potato clones and breeding lines // Plant disease. 1988. - V. 72. - P. 203-205.

106. Hebert P. D. N., Beaton M. J. Methodologies for allozyme analysis using cellulose acetate electrophoresis. A practical handbook. - Guelph, Ontario, Canada, 1993.-31 pp.

107. Hemmes D. E. Cytology of Phytophthora. In: Phytophthora. Its Biology, taxonomy, ecology and pathology. Erwin D. C., BartnikiGarcia S., Tsao P. H., ed. - St. Paul, MN, USA: APS Press, 1983. - P. 9-40.

108. Hermansen A., Hannnukkala A., Naerstad R. H., Brurberg M. B. Variations in populations of Phytophthora infestans in Finland and Norway: mating type,metalaxyl resistance and virulence phenotype // Plant Pathology. 2000. - V. 49. -P. 11-22.

109. Howard K. Oospore types in the Saprolegniaceae // Mycologia. 1971. — № 63.-P. 679-686.

110. Jiang J., Erwin D. C. Morphology, plasmolysis, and tetrazolium bromide stain as criteria for determining viability of Phytophthora infestans II Mycologia. -1990.-V. 82.-P. 107-113.

111. Jones L. R. Resting spores of the potato fungus // Science. 1909. - V. 30. - P. 813-814.

112. Judelson H. S., Spielman L. J., Shattock R. C. Genetic mapping and non-mendelian segregation of mating type loci in the Oomycete, Phytophthora infestans II Genetics. 1995. - № 141. - P. 503-512.

113. Judelson H. S., Blanco A. B. The spores of Phytophthora: Weapons of the plant destroyer // Microbiology. 2005. - V. 3. - P. 47-58.

114. Kessel G. J. T., Turkensteen L. J., Schepers H. T. A. M., Van Bekkum P. J., Flier W. G. Phytophthora infestans oospores in the Netherlands: occurence and effects of cultivars and fungicides // PPO-Special Report. 2002. - № 8. - P. 203-209.

115. Knapova G., Gisi U. Phenotypic and genotypic structure of Phytophthora infestans populations on potato and tomato in France and Switzerland // Plant Pathology.-2002.-V. 51.-P. 641-653.

116. Knapova G., Schlenzig A., Gisi U. Crosses between isolates of Phytophthora infestans from potato and tomato and characterization of F1 and F2 progeny for phenotypic and molecular markers // Plant Pathology. 2002. - V. 51. - P. 698709.

117. Ko W. H. Hormonal regulation of sexual reproduction in Phytophthora 11 J. Gen. Microbiol. 1980. - V. 116. - P. 459-463.

118. Ko W. H. Reversible change of mating type in Phytophthora infestans 11 J. Gen. Microbiol. 1981. - V. 125. - P. 451-454.

119. Ko W. H. Hormonal heterothallism and homothallism in Phytophthora II Annu. Rev. Phytopathol. 1988. - V. 26. - P. 57-73.

120. Ko W. H. An alternative possible origin of the A2 mating of Phytophthora infestans outside Mexico // Phytopathology. 1994. - V. 84. - P. 1124-1127.

121. Lamour K. H., Win J., Kamoun S. Oomycete genomics: new insights and future directions // FEMS Microbiol Lett. 2007. - Vol. 274. - P. 1-8.

122. Lehtinen A., Hartnukkala A. Oospores of Phytophthora infestans in soil provide an important new source of primary inoculum in Finland // Agricultural and Food Science. 2004.-V. 13.-P. 399^10.

123. Levin A., Baider A., Rubin E., Gisi U., and Cohen Y. Oospore formation by Phytophthora infestans in potato tubers // Phytopathology. 2001. - V. 91. - P. 579585.

124. Marshall J. A., Dennis A. L., Kumazawa T., Haynes A. M., Nes W. D. Soybean sterol composition and utilization by Phytophthora sojae II Phytochemistry.- 2001.-V. 58. № 3. - P. 423-428.

125. Medina M. V., Piatt H. W. Viability of oospores of Phytophthora infestans under field conditions in Northeastern North America // Can J. Plant Pathol. -1999.-V. 21.-P. 137-143.

126. Miller J. S., Johnson D. A. Competitive fitness of Phytophthora infestans isolates under semiarid field conditions // Phytopathology. 2000. - V. 90, № 3. -P. 220-227.

127. Mitchell D. J., Zentmyer G. A. Effect of oxygen and carbon dioxide tensions on sporangium and oospore formation by Phytophthora spp. // Phytopathology. -1971.-V. 61.-P. 807-812.

128. Mizubuti E. S. G., Fry W. Potato late Blight In: The epidemiology of Plant diseases. Cooke B. M., Jones D. G., Kaye B (eds.). Springer, 2006. - P. 445471.

129. Mooney S. M., Muller H. J., Fisher R. A. On the evolutionary significance of sex // J. Hist. Biol. 1995. - V. 28. - P. 133-149.

130. Mosa A. A., Kato M., Sato N., Kobayashi K., Ogoshi A. Occurrence of the A2 mating type of Phytophthora infestans on potato in Japan // Annals of the Phytopathological Society of Japan. 1989. - V. 55. - P. 615-670.

131. Mosa A. A., Kobayashi K., Ogoshi A., Kato M., Sato N. Formation of oospores by Phytophthora infestans in inoculated potato tissues // Annals of the Phytopathological Society of Japan. 1991. - V. 37. - P. 334-338.

132. Mosa A. A., Kobayashi K., Ogoshi A., Kato M, Sato N. Isoenzyme polymorphism and segregation in isolates of Phytophthora infestans from Japan // Plant Pathology. 1993. - V. 42. - P. 26-34.

133. Muckeijee N., Roy A. B. Microbial influence on the formation of oospores in culture by Phytophthora parasitica var. sabdariffae //Phytopathology. 1962. -V. 52. - P. 583-584.

134. Mueller G. M., Bills G. F., Foster M. C. (eds.). Biodiversity of Fungi. Inventory and monitoring methods. Elsevier Academic Press, 2004. - 777 pp.

135. Niederhauser J. S. The blight, the blighter and the blighted // Trans. N. Y. Acad. Sci. 1956. - V. 19. - P. 55-63.

136. Niederhauser J. S. Phytophthora infestans: the Mexican connection. In Phytophthora / Eds.: J. A. Lucas, R. C. Shattock, D. S. Shaw , L. R. Cooke. -Cambridge: Cambridge university press, 1991. P. 25-45.

137. Noon J. P., Hickman C. J. Oospore production by a single isolate of Phytophthora capsici in the presence of chloroneb // Can. J. Bot. 1974. - V. 52. -P. 1591-1595.

138. Oliva R. F., Erselius L. J., Adler N. E., Forbes G. A. Potential of sexual reproduction among host-adapted populations of Phytophthora infestans sensu lato in Ecuador // Plant Pathology. 2002. - V. 51. - P. 710-719.

139. Perches S., Galindo A. J. Superviviencia del Phytophthora infestans (Mont.) de Bary, causante del tizon tardio de la papa y jitomate // Agrociencia. 1969. - V. 5.-P. 92-98.

140. Perez W., Gamboa S., Falcon Y. V., Coca M., Raymundo R. M., Nelson R. J. Genetic structure of Peruvian populations of Phytophthora infestans II Phytopathology. 2001. - V. 91. - P. 956-965.

141. Peters R. D., Piatt (Bud) H. W., Hall R. Characterization of changes in populations of Phytophthora infestans in Canada using mating type and metalaxyl sensitivity markers I I Canadian Journal of Plant Pathology. 1998. - V. 20. - P. 259-273.

142. Pethybridge G. H., Murphy P. A. On pure cultures of Phytophthora infestans de Bary and development of oospores // Sci. Proc. R. Dublin Soc. -1913.-V. 13. -P. 556-588.

143. Pittis J. E., Shattock R. C. Viability, germination and infection potential of oospores of Phytophthora infestans II Plant Pathology. 1994. - V. 43. - P. 387396.

144. Rastas M., Lehtinen A., Hannukkala A. Production and extraction of oospores of Phytophthora infestans / Ninth Workshop of an European Network for development of an Integrated Control Strategy of potato late blight. Tallinn

145. Estonia), 19-23 October, 2005 // PPO-Spccial Report. 2006. -№ 11. - P. 269275.

146. Reeves R. J., Jackson R. M. Stimulation of sexual reproduction in Phytophthora by damage // Gen. Microbiol. 1974. -V. 84. - P. 303-310.

147. Ribeiro O. K. A Source book of the Genus Phytophthora. -Vaduz, Liechtenstein, 1978. 417 pp.

148. Rubin E., Baider A., Cohen Y. Phytophthora infestans produces oospores in fruits and seeds of tomato // Phytopathology. 2001. - V. 91. - P. 1074-1080.

149. Saiki R. Amplification of genomic DNA. In: M. A. Innis. D. H. Gelfand, J. J. Sninsky and T. J. White (eds.) PCR protocols. -San Diego, USA: Academic Press, 1990.-P. 13-20.

150. Sansome E. Reciprocal translocation, heterozygosity in heterothallic species of Phytophthora and its significance // Trans. Brit. Mycol. Soc. 1980 - V. 84. - P. 87-93.

151. Sansome E., Brasier C. M. Diploidy and chromosomal structural hybridity in Phytophthora infestans //Nature. 1973. - V. 241. - P. 344-345.

152. Sandstróm M., Hallenberg N., Usoltseva M. Studies of populations of Phytophthora infestans in Sweden // Vaxtskyddsnotiser. 2001. - № 2. - P. 2731.

153. Savage E. J., Clayton C. W., Hunter J. H., Brenneman J. A., Laviola C., Gallegly M. E. Homothallism, heterothallism and interspecific hybridization n the genus Phytophthora //Phytopathology. 1968. - V. 58. - P. 1004-1021.

154. Savenkova L. V., Cherepennikova-Anikina M. I. Effect of metalaxyl and N-nitrosomethylurea on mating type of Phytophthora infestans II Journal of Russian Phytopathologic Society. 2002. - V. 3. - P. 33-38.

155. Schoeber B., Rullich G. Oosporenbildung von Phytophthora infestans (Mont.) de Bary // Potato Res. 1986. - V. 29. - P. 395-398.

156. Shaw D. S. The breeding system of Phytophthora infestans: the role of the A2 mating type// In: Genetics and patogenesis. Day P. R., Jellis G. J. (eds.) Oxford: Blackwell Scientific Publications, 1987. P. 161-164.

157. Shaw D. S. Phytophthora infestans, the cause of late blight of potato // Advances in Plant Pathology. 1991. - V. 7. - P. 131-170.

158. Singh B. P., Birhman R. K. Laboratory Estimation of Field Resistance of Potato to Late Blight // Journal of Phytopathology. 1994. - V. 140. - № 1. -P. 71-76.

159. Sliwka J., Sobkoviak S., Lebecka R., Avendano-Côrcoles J., Zimnoch-Guzowska E. Mating type, virulence, aggressiveness and metalaxyl resistance of isolates of Phytophthora infestans in Poland // Potato Res. 2006. - V. 49. - P. 155-166.

160. Smart C. D., Willmann M. R., Mayton H., Mizubuti E. S. G., Sandrok R. W., Muldoon A. E., Fry W. E. Self-fertility in two clonal lineages of Phytophthora infestans II Fungal Genet. Biol. 1998. - V.25 - P. 134-142.

161. Smart C. D., Mayton H., Mizubuti E. S., Willmann M. R., Fry W. E. Environmental and Genetic Factors Influencing Self-Fertility in Phytophthora infestans II Phytopathology. 2000. - V. 90. - № 9. - P. 987-994.

162. Smirnov A. N., Kuznetsov S. A., Kvasnyuk N. Ya., Deahl K. L. Formation and germination of Phytophthora infeslans oospores in different regions of Russia // Comm. Appl. Biol. Sci. 2008. - V. 73. - № 2. - P. 109-118.

163. Smoot J. J., Gouph F. J., Lamey H. A., Eichenmuller J. J. Production and germination of oospores of Phytophthora infestans II Phytopathology. 1958. -V. 48.-P. 165-171.

164. Sozzi D., Schwinn F. J., Gisi U. Determination of the sensitivity of Phytophthora infestans to phenylamides: a leaf disc method // EPPO Bull. 1992. - V. 22. - № 2. - P. 306-309.

165. Sphicalla J. P., Desborough S. I. Fatty-acid, membrane-permeability and sugars of stored potato-tubers // Plant Physiol. 1990. - V. 94. - P. 1207-1213.

166. Stromberg A., Bostrom U., Hallenberg N. Oospore germination and formation by the late blight pathogen Phytophthora infestans in vitro and under field conditions 11 J. of Phytopathology. 2001. - V. 149. - P. 659-664.

167. Stromberg A., Persson L., Wikstrom M. Infection of potatoes by oospores of Phytophthora infestans in soil // Plant Dis. 1999. - V. 83. - P. 876.

168. Sujkovski L. S., Goodwin S. В., Dyer А. Т., Fry W. E. // Increased genotypic diversity via migration and possible occurence of sexual reproduction of Phytophthora infestans in Poland // Phytopathology. 1994. - V. 84. - P. 201207.

169. Sutherland E. D., Cohen S. D. Evaluation of Tetrazolium Bromide as a vital stain for fungal oospores // J. of Phytopathology. 1983. -V. 73. - P. 1532-1535.

170. Tombolato D. С. M. Characterization of isolates of Phytophthora infestans collected in Florida in 1999 and 2001 // Thesis/dissertation, Gainesville, Univ. of Florida, 2002. Сайт доступа http://etd.fcla.edu/UF/UFE1001187/Tombolato D.pdf.

171. Tooley P. W. Variation in resistance to Phytophthora infestans among 21 Solanum verrucosum plant introductions // American Potato Journal. 1990. - V. 67.-P. 491-498.

172. Tooley P. W., Fry W. E., Villareal-Gonzalez M. J. Isozyme characterization of sexual and asexual Phytophthora infestans populations // J. Hered. 1985. - V. 76.-P. 431-435.

173. Trout C. L., Ristaino J. B. Fungicides affect mating behavior in Phytophthora infestans //Phytopathology. 1997. - V. 87 (suppl.). - S98.

174. Trout C. L., Ristaino J. B. Fungicides and mating type change in Phytophthora infestans //Phytopathology. 1998. - V. 88 (suppl.). - S90

175. Tsao P. H., Ugale R., Hobbs S., Farih A. C Control of homothallic oospore formation in Phytophthora parasitica by culture manipulation // Trans. Br. Mycol. Soc. 1980 - V. 75 - P. 153-156.

176. Turkensteen L. J., Flier W. G., Wanningen R., Mulder A. Production, survival and infectivity of oospores of Phytophthora infestans II Plant Pathology. 2000. -V. 49.-P. 688-696.

177. Umareus V., Lihnell D. A laboratory method for measuring the degree of attack by Phytophthora infestans II Potato Res. 1976. - V. 19. - P. 91-107.

178. Van der Plank J. E. Genetic and Molecular Basis of Plant Pathogenesis. Berlin: Springer-Verlag, 1978. 167 pp.

179. Vartanian V. G., Endo R. M. Overwintering hosts, compatibility types and races of Phytophthora infestans on tomato in Southern California // Plant Disease. 1985. - V. 69.-P. 516-520.

180. Whittaker S. L., Assinder S. J., Shaw D. S. Inheritance of mitochondrial DNA in Phytophthora infestans II Mycol. Res. 1994. - V. 98. - №5. - P. 569-575.

181. Wuethrich B. Why sex? Putting theory to the test // Science. 1998. - V. 281. -P. 1980-1982.

182. Zarzycka H., Sobkowiak S. Formation and survival of Phytophthora infestans oospores and their role as a primary infection source of the pathogen // Plant Breed. Seed Sei. 1997. - V. 41. - P. 27-38.