Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изменчивость возбудителя сетчатой пятнистости ячменя при бесполовом размножении

ВАК РФ 03.00.24, Микология

Автореферат диссертации по теме "Изменчивость возбудителя сетчатой пятнистости ячменя при бесполовом размножении"



ВСЕСОЮЗНАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК им. В. И. ЛЕНIIНА

ВСЕСОЮЗНЫЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЗАЩИТЫ РАСТЕНИИ

На правах рукописи

КОНОВАЛОВА Галина Сергеевна

ИЗМЕНЧИВОСТЬ ВОЗБУДИТЕЛЯ СЕТЧАТОЙ ПЯТНИСТОСТИ ЯЧМЕНЯ ПРИ БЕСПОЛОМ РАЗМНОЖЕНИИ

Специальность: 03.00.24 — микология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ЛЕНИНГРАД 1991

Диссертационная работа выполнена во Всесоюзном ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательском институте защиты растении.

Научный руководитель — доктор биологических паук, профессор Л1. Л1. Левитин.

Официальные оппоненты — доктор биологических наук В. Л. Л\ель-ник; кандидат биологических наук Л. А. Михайлова.

Ведущее учреждение — Всесоюзный научно-исследовательский институт фитопатологии.

Защита состоится «» С^с-(.-а,/..!. 199К-г. в А? часов на заседании Специализированного совета, шифр Д-020.01.01 при Всесоюзном ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательском институте защиты растений по адресу: 189620. г. Ленинград—Пушкнн-8, шоссе Подбельского, 3, ВИЗР.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всесоюзного Ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательского института защиты растений.

Автореферат разослан «/<?»^^¿¿Се^С 1991 г.

Ученый секретарь

Специализированного совета Г. А. Наседкина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность теми. Сетчатая пятнистость ячменя, возбудителем кото-торой; является несовершенный гриб Drechslera teres, считается од-яйм из"*самых вредоносных заболеваний ячменя. Борьба с этой болезнью-осложняется чрезвычайной изменчивостью этого патогена,приводя-цей к возникновению новых рас гриба и, соответственно, к потери устойчивости сортов ячменя. В связи с этим, изучение механизмов из-ленчивости D.teres представляет собой не только теоретический, но i практический интерес. Поскольку в жизненном цикле гриба паразити-шской является несовершенная стадия - D.teres, а половой процесс ттруднен ив природе встречается крайне редко, можно предположить эещагацую роль мутаций и соматической гибридизации в изменчивости ¡того гриба. Предварительные исследования по гетерокариозу D.teres [Коновалова и др.,1981) позголяют сделать вывод о наличии у этого ■риба вегетативной несовместимости. В связи с этим, возникла необ-:одимость поиск? новых методов проведения генетического анализа •риба D.teres. Нам представляется, что метод слияния протопластов, :ироко применяемый для гибридизации грибов, во многом облегчит ра-оту по изучению наследования и изменчивости наиболее важных при-наков этого патогена, таких как вирулентность и агрессивность, ез знания причин появления которых немыслим научно-обоснованный одход к созданию устойчивых к возбудителю сортов ячменя. ель и задачи работы, основной целью данного исследования было зученме изменчивости гриба D.teres при соматической гибридизации: олучение гибридных штаммов с использованием генетически маркиро-анных линий и анализ наследования морфологических и физиолого-био-имических свойств патогена. В нашей работе были поставлены следу-лие задачи:

).Изучить летальное и мутагенное действие УФ-лучей и химического утагена 6-гидроксиламинопурина (ГАП). и

).Получить коллекцию маркированных штаммов гриба. ).Разработать методы получения, регенерации и слияния протоплас-зв гриба. . . •

(.Получить гибридные штаммы гриба методом анастомозировакия гиф слияния протопластов.

I.Провести генетический анализ соматических гибридов, получершх результате анастомозов гиф и слияния протопластов.

Изучить паразитические свойства индуцированных мутантов к гиб-[дных штампов гриба. ' '

Цаучная новизна. Впервые изучено летальное и мутагенное действие УФ-лучей и ГАП на грибе D.teres и получена коллекция морфэлогичер-ких и ауксотрофных мутантов. При получеши гетерокарионов D.teres обнаружена вегетативная несовместимость, выражающаяся в неспособности некоторых'штаммов гриба формировать гетерокарионы при совместном росте на минимальной среде. Впервые разработан метод получения, регенерации и слияния протопластов, который значительно облегчает соматическую гибридизацию .у этого гриба и способствует преодолению вегетативной несовместимости. Впервые методами соматической гибридизации получены гибридные штаммы и проанализированы их генетические свойства. Проведено испытание вирулентности индуцированных мутантов и гибридов, получензшх в результате слияния гиф и слияния протопластов.

Практическая ценность и.теоретическое значение работы. Проведенные исследования показали широкую вариабельность гриба D.teres. Установлено, что важным фактором изменчивости является мутационный процесс. Гетерокариоз и парасексуалышй процесс также вносят значительный вклад в изменчивость' этого гриба, т.к. в результате пересортировки ядер при бесполом размножении многоядерного'мицелия могут возникать новые формы. Отработанные методы получения, регенерации и слияния протопластов могут быть использованы при работе с другими представителями р.Drechslers. Показана возможность использования слияния протопластов для преодоления барьеров вегетативной несовместимости у D.teres и конструирования штаммов для использованш в фитоиммунологических работах при создании болезнеустойчивых сортов.

Апробация работы. Результаты исследований доложены на конференции молодых ученых ЕИЗР (1980), на микологической секции ВБО (1983), на 3-ей Всесоюзной конференции "Грибы в биогеоценозах" (Ташкент, 1985), на семинарах лаборатории электронной микроскопии ВНИИСХМ (1989 - 1990Г).

Объем раЗоты. Диссертация изложена на Л5"-5~страницах машинописного текста и состоит из введения,'обзора литературы, раздела "Материалы и методы", 4-х глав, содержащих результаты экспериментальной работы, заключения и выводов. В работе Я9 таблиц, •?- рисунков. Список литературы включает Л9? наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ . .

Глава I. Обзор литературы.

Приведены данные о биологии гриба D.teres, о, симптомах и вре

^сносности заболевания. Дана характеристика основных механизмов изменчивости грибов: мутаций, полового и парасексуального процессов. Основное внимание уделено описанию соматической гибридизации г представителей разных классов грибов, ее значению в изменчивости 1 барьерам, препятствующим соматической гибридизации. Представ-тени литературные сведения о генетической изменчивости гриба 3.teres, а также данные о роли факторов внешней среды в изменчивости этого гриба.

■Глава 2. Материалы и методы. • Цтаммы. В работе использованы природные изоляты D.teres: 844,727, Ю.21.33, выделенные с пораженных посевов ячменя в Ленинградской >бласти. Из них под действием УФ-лучей и химического мутагена !ГАП) получены мутанты, маркированные ауксотрофностью, окраской «щелия, топографией колоний и скоростью роста. 1итательные среды. Все использованные в работе штаммы выращивали m минимальной (М) и полной (П) средах. М среда содержала (г/л): Ш2Г04-2, MgS04-I, (ГО^)2Б04-1, глюкоза-20, агар-20. П среда содержала все компоненты М среды + дрожжевой экстракт (1г) и пептон ;юг).Для регенерации протопластов использовали жидкую М и П среды, юдержащие 0,2% агар.

(етоды. Выделение изолятов D.teres, культивирование их на гштате-!ьных средах и клонирование проводилось по методике ВИЗР (Левитин [ др.,1981). Изучение летального и мутагенного действия УФ-лучей [ ГАП выполнялось .в соответствии с методическими рекомендациями [.Л.Захарова и др. (1984). Получение гетерокарионов осуществляли го методу Пухала и Мэйфилда (Puhalla, Mayiield, 19Т4). При разра-1отке методов получения, регенеращш и слияния протопластов I.tere3 основывались на имеющиеся в литературе материалы по [ругим грибам (Яковлев, Джавахия, 1981; Кожина,Чепурная, 1980)-. 'естирование гриба по вирулентности проводилось по детодике О.С. фанасенко и др. (1976).

Результаты и обсуждение Глава 3. Создание коллекции генетически маркированных штаммов D.teres.

Под действием УФ-лучей была определена зависимость выживаемо-ти кгашдий гриба и частоты индуцированных морфологических му^ан-ое от Зозы УФ-лучей. С повышением дозы облучения число мутантов всличивалось до определенного уровня, а затем снижалось.'Максима-ьнчя частота морфологических мутантов 0,483^ из которых мутанты,

накапливающие красный пигмент, составляли 0,31%, наблюдалась при выживаемости гриба 3.8%. Среди индуцированных матантов были обнаружены пигментные: красные, оранжевые, коричневые, цвета слоновой кости и с измененной топографией: морщинистые и дрожжеподобные. Ауксотрофше мутанты прд действием УФ-света получены не были.

Наряду с УФ-лучами было испытано действие химического мутагена ГАП, который на фитопатогенных грибах ранее не использовался. При обработке гриба ГАПом были получены разнообразные морфологические мутанты, различающие по скорости роста, интенсивности споро-ношения, по форме, структуре и окраске колоний (белые, черные, коричневые, красные, зеленые, желтые). Так же, как и при использовании УФ-лучей, чаще всего встречалились мутанты, накапливающие красный пигмент (10%). Кроме морфологических мутантов были выделены ауксотрофше, но частота их появления была очень низкой - 0,02%. Однако сравнивать по частоте мутаций эффективность УФ-лучей и ГАПа, вероятно, нельзя, т.к. мутагенез проходил при разной выживаемости гриба. ГАП по отношению к D.teres' проявил себя малотоксичным, т.е. выживаемость конидий составляла 80% по отношению к контролю. Тем не менее, спектр мутаций, полученных с использованием ГАПа, был значительно шире, чем при облучении УФ-светом.

Таким образом, с использованием мутагенных факторов впервые была получена коллекция, состоящая из 28 морфологических и ауксот-рофных мутантов D.teres.

Глава 4. Соматическая гибридизация гриба в результате гифового слияния.

Гетерокарионы были получены с использованием морфологических и ауксотрофных штаммов гриба. Морфологические мутанты во всех возможных сочетаниях были скрещены на М среде. Из 210 комбинаций скрещиваний, только в 8 случаях образовывались гетерокарионы, отбор которых проводился по цвету и структуре колоний. Гетерокарионы характеризовались неправильной формой колоний с неровными, изрезанными краями, мозаичным по цвету видом и более обильным по сравнению с родительскими штаммами спороношением.' Подобная морфо- • логия била описана Тинлайном у гриба C.satlvus (Т1п11пе,1962). Отобранные по фенотипу колонии были проанализированы на расщепление. Из .таблицы I видно, что соотношение родительских маркеров при расщеплении резко сдвинуто в сторону одного из родительских штам-Mofe. Такое неравное соотношение родительских компонентов в гетеро-карионе свидетельствует о неслучайном распределении ядер в кониди-

Анализ расщепления гетерокарионов Drechslera teres, полученных слиянием гиф

п Комбинации скрещиваний Число клонов родит.типа в расщеплении Соотношение ядер в гете-рокарионе • Морфология геторокарйона

844+lvo 0:1023 •0:1023 колония неправил, формы.края погружены в среду.Возд мицелий темный, спороношение обильное, споры белые.

blk-1+lvo - 21:423 1:20,1 Колония неправил, формы с темными выростами субстр. мицелия. Споры белые.

red-4+ivo 31:576 1:18,6 Колония темно-красного цвета с белыми островками спор на поверхнос ти.

1 red-2+ivo 236:162 1,46:1 Колонии красного цвета, неправил. Форш с белыми и красными островками спор.

) blk-l+wth-3 321:564 1:1,76 Колония черного цвета с белым островками.Споро ношение обильное . споры черные.

э blk-1 +red-4 321:440 1:1,37 Колония красно-" черного цвета, непрарлл.формы с мицел. темными выростами,обилие спор.

Г blk-Ured-2 23:305 • 1:13,3 Колония черно-красного цвета с темными спорами в центре. •

8 red-2+gre-1 263:26 10,1:1 Колония красно-сброго цвета, мозаичная,центр колонии темный.

9 met-1+arg-2 gre blR '22n:Iraet:74arg 66n:2met:52arg 1:74 1:26 Колония черного цвета с неровными краями,в центре скопление спор ~И|( II и "

I3n:4met:7arg 1:1,8 "* »1 II ~ II и "*

10 arg-2+arg-3 bJR rea 7Iarg:3IIarg blR rea 2n:7Iarg:93arg:4arg blk blk red blk-ret 1:4,3 1:1,3 Колония черно-красного цвета с неровными краями, лозаичная, споро-ношение обильное. — м — (1ii —

2n:I00ai 3:I35arg 1:1,35 ■ — н и — иii —

blk blk red '

Примечание: п - прототрофи;

Ivo - цвет слоновой кости; blk - черный цвет; red -красный цвет; wht - (Зелий цвет; gre - серый цвет; met - ауксотроф по метиошшу; arg - ауксотроф по аргинину .

ях-D.teres, что может Сыть связано с преимущественным делением ядер 1-го типа по сравнению с другим или селективным преимуществом мицелия, имеющего определенный тип ядер. Эти дашше согласуются с результатами расщеплеция гетерокарионов c.satlvus, у которого соотношения ядер варьировало от 1:1 до.1:18 (Tlnline,1962). На спо-. собность образовывать гетерокарионы была проверена также коллекция ауксотрофных мутантов. Из 21 комбинации скрещиваний рост на М среде наблюдался только в 2-х случаях (Табл.1), Гетерокарионы отличались от родительских штаммов по внешнему виду и развитию. Гетеро-карион arg-2+arg-3 выщеплял клоны обоих родительских штаммов и прототрофные'клоны черного и красно-черного (секторные) цвета, которые в дальнейшем также расщеплялись на родительские и гетерокари-отические компоненты. Гетерокарион met-l+arg-2 преимущественно выщеплял клоны одного родительского штамма и прототрофные клоны. Анализ расщепления нескольких прототрофных колоний, полученных слиянием йзух ауксотрофных штаммов, обнаружил, что доля того или

иного класса' варьирует в определенных пределах. Например, у гете-рокариона arg-2+arg-3 соотношение родительских компонентов изменилось от 1:4 до 1:1, а % гетерокариотических спор от 0 до 3,5 соответственно.

Анализ расщепления прототрофного сегреганта met-1+arg-2, отличающегося однообразным сильным ростом и правильными краями колоний, обнаружил кроме клонов родительского типа и большого числа прототрофов (94,4%), два клона с маркерами обоих родительских штаммов, метионинзависимие клоны, имеющие черную окраску.колоний, а также ауксотрофы неродитольского типа. Появление этих рекомби-нантов свидетельствует о диплоидной природе прототрофного сегре-ганта. Замеры спор диплоидных и гаплоидных штаммов' не могут быть использованы в качестве критерия диплоидности у многоядерных и многоклеточных грибов, так как споры различны не- только по числу ядер в клетке, но и количеству клеток в конидии (1-4).

Глава 5. Соматическая гибридизация гриба D.teres при слиянии протопластов.

Для проведения соматической гибридизации необходимо было разработать метод получения, регенерации и слияния протопластов. Для получения протопластов была проверена литическая активность многих препаратов: целлюлазы, хитиназы, протеазы, лизоцима, бета-глхкоро-нидазы, хеликазы, культуральной жидкости Trichoderma harzianum, пи-цеварительного сока улитки Helix pomatla (ПСУ) и дрожжелитина Г10Х. ,реди испытанных ферментов только Г10Х и ПСУ разрушали клеточные • зтенки. Совместное применение этих ферментов приводило к значительному увеличению частоты появления протопластов. Кроме фермента яв выход протопластов большое влияние оказывает кислотность среды, з которой производится обработка мицелия литическим ферментом и ¡аличие в среде осмотического стабилизатора, в.качестве которых 5ыли использованы растворы неорганических солей и Сахаров. В ре-(ультате серии экспериментов мы пришли к выводу, что протопласты ).teres можйо поручить, обрабатывая 1-1,5 суточный мицелий смесью грепарата ГЮХ(ЗЖ) и ПСУ(1%). Литическуга смесь необходимо готовить | р-ре О,IM Na-фосфатного буфера с рН= 6,0-7,0. В качестве осмоти-:еского стабилизатора лучше использовать 0,4M р-р KCl. .

Процесс образования протопластов контролировали в электрсшом панирующем микроскопе JSM-T200 по методике В.К.Лебского (1981). од действием литических ферментов уже через.30 минут наблюдалось тончегаю перетяжек между клетками гиф. В течение 'следующего часа

мицелий становился пористым и рыхлым, обеспечевая тем самым выход протопластов. Протопласты могут появляться или яз кончиков гиф,-или через разрывы, возникающие в стенках мицелия под действием литического фермента. Протопласты имеют сферическую форму, слегка морщинистую поЬерхность, их размер колеблется в пределах 2-8 мкм.

Существенное влияние на процесс регенерации оказывает осмотический стабилизатор'и консистентность среды. Исследования показали, что регенерация происходит на среде любой консистентности (жидкая,полужидкая,твердая) как при глубинном,так и поверхностном культивировании. Однако наилучшими условиями является культивирование протопластов на поверхности полужидкой среды (0,2% агар),на которой число регенерированных протопластов достигало 34%. При проведении регенерации был испытан широкий набор осмотических стабилизаторов. Наиболее эффективными оказались растворы 0.8N КС1, 0.8М сахарозы и 0.4-0.8М мальтозы. Мйкроскопирование показало, что регенерация начинается примерно через 14 часов. Вокруг протопласта образуется оболочка, а затем формируется.гифовый росток. На 3-й сутки на среде вырастает колония гриба,.

В основе метода слияния протопластов лежит их способность агглютинироваться в растворе полиэтиленгликоля (ПЭГ). В работе использовали 30% ПЭГ с М.в.3000 ед. Среду для слияния готовили на основе 0,4М р-ра КС1 в 0,1М Ná-фосфатном буфере в присутствии ионов Са*'. Смесь протопластов двух штаммов (по ШОвпрот./мл) отмывали от литического фермента в буфере последующим центрифугированием при 3x10е в течение б минут. Осадок ресуспензировали в I мл смеси для слияния протопластов и инкубировали 30 минут при комнатной температуре. Затем смесь протопластов переносили в среду для получения регенерантов, содержащую в качестве осмотического стабилизатора Q.8M сахарозу. Для сдаяния протопластов использовали штаммы, различающиеся по цвету колоний и ауксотрофности. О появлении продуктов слияния судили по росту регенерированных колоний на М среде .■ Частота образования гибридных клонов была достаточно низкой 0,002-0,25*, при этом частота появления внутриштаммовых гибридов была значительно выше, чем при скрещивании ауксотрофов, полученных из двух разных штаммов; Скрещивания ауксотрофных штаммов с одинаковыми потребностями (met-1 х met-2, arg-2 х arg-3, arg-1 х arg-3, leu-1 x leu-2) можно рассматривать как комплемен-ткщонные тесты. Во всех этих скрещиваниях были получены цротот-рофные гийрида. Следовательно, потребность в мотионине у штаммов

met-1, met-2'и в лейцине - у штаммов leu-1, leu-2 обусловлена двумя разными мутациями, а потребность в аргинине у штаммов arg-1, arg-2 и arg-3 - 3-мя разными мутациями.

Все продукты слияния по морфологии резко отличались от родительских форм (измененная топография, цвет колоний, слабое споро-ношение) и были крайне нестабильными, т.е. выщепляли прототрофные клони, рекомбинанты и клоны родительских генотипов, причем почти всегда в потомстве большинства гибридных клонов преобладал генотип одного из родительских штаммов (Табл.2). Возможно, эти продукты слияния возникли в результате слияния нескольких протопластов, причем протопластов одного родителя могло быть больше, чем другого что и повлияло на расщепление. Среди прототрофных колоний были найдены такие, которые выщепляли сектора, что является внешним проявлением их генетической неоднородности. При дальнейшем анализе эти секторные колонии расщеплялись подобно исходным прототроф-ным клонам. Прекрасным призером является характер расщепления продуктов слияния штаммов, arg-1 и leu-2. Из рисунка I видно, что прототрофные колонии JH4 и 13 являются гетерокарионами, т.к. в их . потомстве присутствовали в разных соотношениях как прототрофные, так и ауксотрофные колонии родительского типа, а прототроф Л 10 -гетерозиготным диплоидом, поскольку в его расщеплении обнаружены диауксотрофные рекомбинанты. Образование рекомбинантов служило доказательством обмена генетическим материалом между исходными

родительскими штаммами.

При расщеплении некоторых продуктов слияния (табл.2,JJ6,7) в потомстве были обнаружены только ауксотрофные клоны неродительского типа. Среди них были представлены как клоны с родительской окраской колоний, так и с неродительской (черные, розовые), некоторые из них погибли при пересевах., неспособность образовывать ауксотрофные монокарионы родительского типа была тапже обнаружена у продуктов слияния С.albicans (Weber, Sazachek,1986). Авторы объясняют это по.ерей части генетического материала или ухудшением сегрегации ядер.

Таким образом,полученные результаты позволяют предположить, что продукты слияния являются нестабильными ди(поли-)плоидннми ге-терозиготами, содержащими полные или частичные геномы обоих родительских штаммов.'

Сравнение количества гетерокарионов, полученных методом слияния протопластов и гифового анастомозиса позволяет . сделать вывод,

Расщеплеще в потомстве гибридов D.teres,, полученных слиянием протопластов.

JM im :Комбинации скрещивании Фенотипы сегреган-тов наедаемых в потомстве Количество клонов, их цвет

1гиб-рид 2гиб-рид Згиб-рид 4ГИ6-рид 5гиб-рид. бгиб-рид

I arg-1+met-1 gre gre met+arg? met'arg^ met arg серый 2wht 77wht Iwht - - - -

2 leu-2+met-3 gre red leu+tr,et+ leuTmet leu met leu~met серый 52wht Iwht серый 2wht 30wht светлосерый 3gre 48gre [ 1gre | - - -

3 met-1+arg-3 gre rea met+arg+ met~arg+ met+arg~ met arg красный iros-gre T4ros-gre 4ros I I i Í -

4 arg-1+leu-2 gre gre arg+leu+ arg~leu+ arg+leu~ arg~leu" серый 6wht ; 45wht ; 1wht темно-! серый 1wht ; 1v»ht 23wht 1wht серый 5wht 3wht T1wht 1wht серий 6wht-gre 7wht-gre 65wht-gre серый 5grei 4gre ■ 43gre -

5 leu-2+¿rg-3 gre rea leu+arg+ leu~arg+ leu arg" leu arg" AHT зерый 1wht SOwht 1wht красный 1red 48red 1red черно-бурый 72red-blR 2wht ired 3red серый 135gre: :3red серый 157gre; 3d

6 arg-gre 1+ars rea t3 arg+arg+ argTarg^ arg arg ar|arg черный 36red 32gre черный 1blk- 24§red 41 gre темно- серый 12gre 350red 52gre черный 2blk lOOred 44gre черный 13blk 307red 33gre черный 33red: :l8gre :1rog

7 arg-blk ■2+ar¿ rec r3 arg^arg* arg,arg ar^arg черный 4blk 839red черный 98b lk 449red крас- !ШЙ 169red: :41wht - - • -

8 met-blk -2+arf rec f"3 • ъ «V met+arg+ met~arg+ met arg met arg AHT красный с черным центром 11 red 39red 2red черно-красный,Mo-заич-ный 64red-blk 3blk Tred Iblk 3red-blk черно-красный. 63red-blk 8red 1blk 3red-blk черно-красный, Mo-заич-ный 24blk Iblk 1red L -

9 mat-gre -1 +arí MÍ 5-2 met+arg1; met"arg met+árg~ mefarg-AHT серый 180gre 22gre, 1blk серый 45gre Igre 2blk Igre Igre серо-бурый зщ: серо-бурый 24gre: 2blk - -

Примечание: ros - розовый цвет;- leu - ауксотроф по лейцину; АНТ - ауксотрофы неродительского типа.

что слияние протопластов значительно расширяет возможности скрещивания и в какой-то степени способствует преодолению вегетативной несовместимости штаммов. Имея приблизительно одинаковый набор ауксотрофнпх штаммов и используя все допустимые сочетания скреии-ваний, методом слияния протопластов удалось получить 16 гибридных штаммов в противовес двум, полученным при анастомозах гиф. Возмок-

ной причиной полученных результатов является большая разрешающая способность метода слияния протопластов, при котором одновременно могут участвовать миллионы клеток.

Рис Л

Характер расщепления продукта слияния аггН.вге х 1еи-2,^

arg-1 * leu-2

Глава 6. Паразитические свойства' индуцированных мутантов и соматических гибридов D.teres.

Возбудитель сетчатой пятнистости ячменя характеризуется значительной изменчивостью.вирулентных свойств. Для изучения изменчивости паразитических свойств использовали набор сортов-дифференциаторов ячменя (Афанасенко,Левитин,1979), гибриделогический анализ которого выявил полигецность сортов по. признаку устойчивости (Афп-насенко, Коновалова и др.,1988). Вся коллекция морфологических и ауксотрофных штаммов была проанализирована на вирулентность '(табл.3). Из данных таблицы видно, что у большинства морфологичес-

Вирулентность ауксотрофшх и Морфологических мутантов Drechslera teres.

JU Шифр исходного Тип реакции на сортах-дифференциаторах

пп штамма,морфоло- ячменя

гического и аук- 6 Тиркка

сотрофного мута- I 2 3 4 5

нтов.

I 844(исход.) I I I I I I Нз

2 red-1 I I I I I I I .

3 red-5 I 1 I I 1 I 3

4 Г Г; 1-6 0 0 0 0 0 0 0

5 red-8 0 0 0 0 0 0 0

6 gre-1 I I I I I I I

7 gre-2 I I I I I I • I

8 Dlk-1 I I 1 I 1:2.3 i:2, £ 1:2,3

9 Ык-2 I I I I i I i

10 arg-1 I I I I I I I '

II arg-2(blk-1) 0 0 . 0 0 0 0 0

12 met-2(blk-1\ 0 0 0 0 0 0 0

13 arg-3(blk-1) 0 0 0 0 0;I o;i on

14 60-11(исход.) 3 I I I I. I 3

15 red-3 3 I I I i 3

IS wht-1 ' I I I I I I I

17 wht-2 I I I I i I

18 727(исход.) 3 3 I 3 a 3

19 red-2 I I I I I 1 3

20 red-4 I 3 I I 3 i 3

21 yel-t 0 0 o. 0 0

22 M-6 I I I I i I

23 Ivo 3 3 I I 3 3 3

24 brn-1 (Ivo) 3 3 I I 3 3 3

25 red-7(ivo) I I I I I I 3

26 wht-3(lvo+M6) I . I I I I I I

27 met-1 2;2,3 2,3 I 3 3 3

28 met-3(met-1+arg-2) I f I I I I I

29 20(исход.) 3 3 1:3 3 3 3 3

30 leu-1 I I 1 i:2 I I i:3

31 21(исход.) 1:2 I I . i:2 I 1:3 3

32 leu-2 i I I i IJ3 i 3

33 33(исход.) i;2 3 ' I 2 3 3 3

34 leu-3 i I I I . I I I

Примечание: уе1 - желтый цвет; Ъгп - коричневый цвет; Мб - мозаичная колония с оранжевыми и зелеными секторами; О - реакция непроникновения в растение; 1;1,2;2 - реакция устойчивости 2,3 - промежуточная рекция 3 - реакция восприимчивости сорт ячменя: I(к-25270), 2(к-25282), 3(К-25275), 4(К-8755), 5(К-19282), 6(к-18474)

ких и ауксотрофных мутантов вирулентность уменьшилась по сравнению с исходными штаммами, а некоторые (arg-2, arg-3, met-2, red-б, red-8, yel-1) даже стали неспособными к заражению ячменя. Вирулентность мутантов Ivo, red-3, red-5, arg-1 и met-1 была сходна с родительской и только у штамма blk-1 наблюдалось незначительное увеличение вирулентности. Вероятно, изменения вирулентности этих штаммов не связаны с мутациями в генах, контролирующих вирулентность, а скорее вызваны неспособностью этих мутантов (в результате нарушений в синтезе метаболитов) проникать и размножаться в растении. В противном случае, трудно объяснить вероятность возникновения мутации, приводящей одновременно к авирулентности на шести сортах-дифференциаторах, что наблюдается на примере ауксотрофа ■ leu-1. Таким образом, потеря вирулентности морфологических и аук-сотрофных мутантов может быть обусловлена как плейотропным действием мутаций, приводящих к изменению морфологии и ауксотрофности,

так и независимыми дополнительными мутациями.

Вирулентность гетерокарионов, полученных с использованием морфологических мутантов, не увеличивалась и в большинстве случаев соответствовала вирулентности одного из родителей (табл.4). Как показали результаты, вирулентность зависила от соотношения родительских компонентов в гетерокарионе. Если при расщеплении в гетерока-рио'не преобладали ядра Солее вирулентного родительского штамма, то его вирулентность была сходна с этим штаммом. Вирулентность гетерокарионов red-2+ivo и red-4+blk-1, у которых соотношение родительских компонентов составляло приблизительно 1:1, соответствовала более вирулентному родительскому штамму. У гетерокарионов, полученных с использованием ауксотрофных штаммов arg-2, arg-З (Табл.4), наблюдалось незначительное увеличение вирулентности по сравнению с родительскими штаммами. Она была сходна с вирулентностью штамма blk-1, из которого были получены два независимых ауксотрофа:arg-2, arg-З, утративших способность заражать растение. Увеличение вирулентности этого гетерокариона обусловлено или"взаимодействием по типу сверхдоминирования,' либо комплементацией мутаций ауксотрофности, в результате чего восстанавливается исходный,патогенный фенотип штамма Ык-1. Вирулентность гетерокариона arg-2-tmet-1 соот-•ветствовала штамму arg-2, неспособному проникать в растение. Поскольку, гетерокарион состоит из гетерокариотических и гомокарис-тических гифов и конидий, то его вирулентность должна зависеть от

Табл.4

Вирулентность родительских штаммов и 1'етерокарионов, получешшх в результате гифового слияния.

Л» пп Родительские штаммы и ге-терокарионы Тип реакции на сортах-дифференщаторах ячменя

I 2 3 4 б 6 Пиркка

I 844 1уо 844+ 1уо I 2,3;3 I I ' 3 3 I I I I I 1 ■• 3 I 3 3 3. 3 ' 3

II 170 ь1и 1уо+Ык-1 2,3;3 I 3 3 I 3 I I I I I I 3 1;2,з 3 3 1:2,3 3 3 . 1:2,3 3

III гей-4 1уо гес!-4+1уо I 2,3;3 I.. . 3 3 3 I I. I I I 3 3 3 1:2 3 2,3:3 3 3 3

VI гей-2 1уо гей-2+1Уо I 2,3;3 I I 3 2,3;3 I I I I I I 3 3 I 3 3 3 3 . ■ 3 ■

V гей-4 Ык-1 гес1-4+Ык-1 I I I •з I 3 I I I ' I I 3 1;2,з 2 1:2 1:2,з £;3 3 1:2,з 3

VI гей-2 Ык-1 гес1-2+Ык-1 I I I I I I I I I I I I I 1|2,3 I 1:2,з 2,3 3 1;2,з 2,3

VII ге<1-2 еге-1 геа-2+^е-1 I I I I 1 2 . I I I I I I I 1 2 I I I 3 I 3

VIII а^-2 аг§-3 а^-2+агк-3 (прототрофн. сегрегант) 0 . 0 I • о;1 0 0 о;1 I 0 0 т 0 0 о? 0 о;1 о;1 1;2 0 о;1 1 2 0 0 ^

IX агн-2 те£-1 а^-2+те1;-1 аг^-2+шег-1 (прототрофн. сегрегант) 0' 2,3 0 0 0 2,3 0 0 0 . I 0 0 0 I 0 0 0 3 0 0 0 3 0 0 0 3 0 0

соотношения прототрофных и ауксотрофных компонентов в гетерокарио-не. Потеря вирулентности гетерокарионом ш^^те!;-!, который на

20-60% состоял из прототрофшх элементов, возможно, связана либо с преобладанием в гетерокарионе штамма arg-2, либо с доминированием аллели авирулентности над вирулентностью, что является менее

вероятным.

Результаты тестирования по вирулентности продуктов слияния также показали различия в вирулентности продуктов слияния по.сравнению с родительскими штаммами. У одних гибридных штаммов: 1,11, 1V вирулентность соответствовала одному из родительских штаммов, 'у других: 111,V,VI наблюдалось промежуточное значоние вирулентности, .т.е. гибриды были более патогенны, чем один из составляющих компонентов и чуть менее патогенные, чем другой компонент. Анализ вирулентности остальных продуктов слияния обнаружил незначительное увеличение или уменьшение вирулентности по сравнению с родительскими мутантами (Табл.5).

Увеличениё вирулентности у продуктов слияния met-2+arg-3, arg-2+arg-3 до уровня штамма blk-1, вероятно, обусловлено комплементацией рецессивных дефектов, вызванных мутацией ауксотрофнос-ти. Эти данные полностью согласуются с результатами анализа вирулентности гетерокариона arg-2+arg-3, полученного традиционным путем. Аналогичные результаты были получены у гриба Plasmopara vitícola (LI Hua et al.,1986). Вирулентность гибридного штамма arg-2+met-l (табл.5) была несколько ниже, чем у.родительского штамма me t-1. Эти результаты противоречат данным по тестированию вирулентности гетерокариона arg-2+met-l, полученного через она -стомозы гиф. Возможной причиной несоответствия вирулентности этого гибрида, полученного разными способами, является преобладание разных родительских штаммов в расщеплении.-у гибрида, синтезированного в результате анастомозов гиф, в потомстве превалировал авирулэнтный штамм arg-2,а у гибрида., полученного методом слияния протопластов,- вирулентный штамм met-1. Поскольку продукты слияния D.teres крайне нестабильны и постоянно расщепляются, то при тестировании их по вирулентности мы имеем дело с популяцией различных ядер: прототрофных и ауксотрофных родительского и неродительского типа и соотношение их в потомстве при растеплении постоянно меняется, так как гетерокариотическое состояние может возникать и исчезать в процессе роста'и развития гибридной колонии. Все это не может не отражаться на вирулентности гибридов, которая зависит м меняется от состояния ядер. На основании наших данных по тестированию вирулентности гибридных штаммов, полученных в результате

Табл.Б.

Вирулентность родительских штаммов и продуктов слияния Drehslera teres.

Л» Родительские' Тип реакции на сортах-дифференциаторах ячменя

дукты слияния I 2 ■ 3 4 5 6 Пиркка

arg-1 I I I I I I I

met-1 2,3 " 2,3 I I 3 ,0 3 3 .

I arg-1 +met-1 I I I I I 2 i;2:i,2

leu-2 I I I I 1:3 I 3

met-3 I I I I I I 1 •

тт. leu-2+met-3 I I I I I I i:2

)Ю П I I I I I I 1:2

met-1 2,3 2,3 I I 3 3 3 '

arg-3 О 0 0 0 0:1 o;i 0

ш met-1+arg-3 т.. I I I I 2,3 2,3

arg-1 I I I I I I I

leu-2 I I I I 1:з I 3

IV arg-1+leu-2 о;1 I I 0 0 I I

JHO П 1;0 I I 0:1 I I I

M3 П I ' I I I I i;i,2 I

leu-2 I I I I 1:з I 3

arg-3 0 0 0 0 o;i Oil 0

V leu-2+arg-3 I 1;о i:o 0 0 I i:o

красно-черн. I

leu-2+arg-3 0 i:o I 0 i;u I

белый

JH7 П I I I . 1:2 1 I 1:1,2

arg-1 I I . I I 1 I I

arg-3 0 0 0 0 o;i o;i 0

VI arg-T-i arg-3 i;o 1:0 0 0 I I.

arg-2 о ■ 0 0 0 0 0 0

arg-3 0 0 0 0 o;i o;i 0

VII arg-2+arg-3 I o:i о:1 o:i o:i ' I 1:2:1,2

met-2 D 0 0 0 0 0 0

arg-3 0 0 0 0 0 0 0

VIII met-2+arg-3 I i:i,2 I Oi1 1 i;i,2 I

ЯЗ П I 1 I 6 I I I

JHO П I I I o:i I 1,2:2 I

met-1 2,3 2,3 I I 3 3 3

arg-2 0 . 0 0 0 o;i 0:1 0

IX rr.et-T+arg-2- 1;2;2,3 1:2; 2,3 o:i I 2;2,3 2:2,3 2,3

Примечание: П - прототрофный сегрегант

анастомозов гиф и методом слияния протопластов, мы пришли к выводу, что вирулентность в большей степени зависит от соотношения родительски! компонентов в гибридах. Выводы:

1. С использованием мутагенных факторов УФ-лучей и 6-гидроксилами нопурина были получены разнообразные морфологические и ауксотроф-ные мутанты, определена зависимость выживаемости конидий гриба и частоты мутаций от дозы мутагена. Среди морфологических мутантов чаще всего встречались красные пигментные мутанты (10%). Частота возникновения ауксотрофных мутантов была очень низкой (0,02%).

2. 'С использованием морфологических и ауксотрофных мутантов получены гетерокариош методом слияния гиф. Показано существование'у гриба вегетативной несовместимости. Соотношение компонентов при

, расщоплении готерокарионов в болбшинстве случаев было сдвинуто в сторону одного родителя.

3. Разработан метод получения, регенерации и слияния протопластов D.tere3. В основу метода положено получение протопластов с исполь зованием смеси ферментов ГЮХ (3%) и улиточного сока (I%), приготовленного в растворе О,IM Na-фосфзтного буфера с рН=6,0-7,0. В качестве осмотического стабилизатора рекомендуется О,4M р-р KCl, для слияния протопластов - 30% ПЭГ с М.в.3000 ед.

4. Методом слияния протопластов получены гибриды между ауксотроф-ными штаммами гриба, включая комбинации штаммов, которые не скрещивались в результате анастомозов гиф, что позволяет предположить значительно большие возможности метода слияния протопластов в ггре одолении барьеров вегетативной несовместимости D.teres. Частота образования гибридных клонов была достаточно низкой 0,002-0,2,5%, при этом частота появления внутриштаммовых гибридов была значительно выше, чем при скрещивании ауксотрофов, полученных из разных штаммов.

5. Результаты генетического анализа гибридов позволяют предположить, что продукты слияния являются нестабильными ли(поли-)пло-идными гетерозиготами,' содержащими полные или частичные геномы обоих родительских штаммов. Ауксотрофность по аргинину у штаммов arg-1 ,arg-2 и arg-3 обусловлена тремя разными комплементарными му

_тациями. Мутации,приводящие к ле'Ицинзависимости у штаммов leu-i и leu-2, контролируются 2-мя разными генами.Ауксотрофность по мети-онину у штаммов raet-1 и met-2 контролируется 2-мя разними генами. G. Проведен анализ вирулентности индуцированных мутантов гриба и

гибридов, полученных методом слияния протопластов и анастомозов гиф. Показаны существенные различия в вирулентности мутантов по сравнению с исходными штаммами. Изменения вирулентности мутантов, по-видимому, не связаны с мутациями генов, контролирующих вирулентность гриба, а обусловлены плейотрошшм действием генов, приводящих к изменению ауксотрофности и морфологии. Вирулентность большинства гетерокарионов и продуктов слияния была сходна с родительской и зависала от соотношения в гибридах родительских компонентов. 7. Результаты проведенных исследований позволяют считать, что основными механизмами изменчивости D.teres являются мутационный процесс и гетерокариоз. Мутации постоянно приводят гриб к гетеро-кариотическому состоянию, а гетерокариоз обуславливает нестабильность свойств гриба и вшцеплекиа особей с самыми разными морфоло-' го-культуральными и физиолого-биохшическими свойствами По теме диссертации опубликованы следующие работы: Х.Афанасенко O.e., Клювалова Г.С., Мироненко Н.В., Петрова А.Н.. . Изучение популяций возбудителя сетчатой пятнистости ячменя и генетических механизмов их изменчивости.//Тез.1V съезд ВОГиС им.Н.И. Вавилова. Кишинев, 1-5 февраля, I98I.C.283'.

2.Коновалова Г.С., Левитин М.М., Мироненко П.В. Естественная и мндуцироватшя изменчивость возбудителя сетчатой пятнистости ячменя.// В кн.: Устойчивые к болезням сорта сельскохозяйственных растений в условиях концентрации и специализации производства. Л.,1981. С.56-63.

3.Левитин М.М., Коновалова Г.С., Лебский В.К. Получение, регенерация и слияние протопластов Drechslera teres Ito.// Микология и фитопатология. 1984. Т.18. №4. С.276-280.

4.Левитин М.М., Коновалова Г.С. Протопласты мицелиальных грибов. //Микология и фитопатология. 1985. Т.19. J£4. С.366. •5.Афанасеико O.e., Коновалова Г.С., Войлоков A.B., Воронова М.О. Проблемы дифференциации популяций возбудителя сетчатой пятнистости ячменя.// Теоретические основы иммунитета растений к болезням, ням! Сб. научных .трудов ВИЗР. 1988. С.39-45.